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Principais etapas envolvidas na expressão de um gene

Figure 6-21 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)


Genes podem ser expressos
mediante diferentes eficiências
Figure 6-3 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
“Um dos princípios da biologia molecular é
que as principais propriedades de cada tipo
celular estão diretamente correlacionadas ao
seu padrão de expressão gênico.”

 O que define os tipos e quantidades dos


vários produtos da expressão de genes que
caracterizam um tipo particular de célula?

 Como um organismo pode responder às


mudanças em seu meio?

Expressão diferencial de genes e diferentes


eficiências na expressão de genes
Nos procariotos, a regulação da expressão gênica
pode ocorrer em vários níveis

DNA Regulação através de recombinação

ão iniciação; atenuação; ≠s σ
Transcrição:

Regulação através de anti-terminação


RNA Regulação na estabilidade do mRNA

Regulação da Síntese protéica

Modificação Covalente
Proteína Alosteria
Degradação
TRANSCRIÇÃO EM PROCARIOTOS
 principais elementos estruturais e funcionais

• Promotor e Fator σ
Controle da expressão gênica
(Nível da Transcrição)
 Expressão constitutiva

 Expressão regulada
– Induzível
– Reprimida

 Reguladores
– Fatores específicos
– Repressores (Regulação negativa)
– Ativadores (Regulação positiva)
PRINCÍPIOS DA REGULAÇÃO
TRANSCRICIONAL
Sinais extracelulares  Controle da
expressão de genes

Proteínas Ativadoras

Proteínas Regulatórias
(Proteínas que se ligam ao DNA)
Proteínas Repressoras
Ativação pelo recrutamento da RNA Polimerase (RNA Pol)

PROCARIOTOS

Na ausência de repressor e ativador, a


RNA Pol ocasionalmente liga-se ao
promotor  nível basal de transcrição

A ligação do repressor ao operador 


bloqueio da ligação da RNA Pol ao
promotor  inibição da transcrição

A ligação do ativador à sequência


ativadora recruta a RNA Pol (ligação
cooperativa)  altos níveis de
Mostrando o transcrição
complexo
fechado
Watson, J.D et al (2008), Molecular Biology of the Gene, 6th edition, Pearson Benjamin Cummings
Ativação alostérica da RNA polimerase

complexo fechado estável

ativador – RNA Pol:


dispara a transição para o
complexo aberto

Watson, J.D et al (2008), Molecular Biology of the Gene, 6th edition, Pearson Benjamin Cummings
Interações entre
proteínas ligadas ao
DNA

a) Ligação
cooperativa a sítios
adjacentes

b) Ligação cooperativa
a sítios separados

Watson, J.D et al (2008), Molecular


Biology of the Gene, 6th edition,
Pearson Benjamin Cummings
Uma proteína que dobra o DNA em uma orientação
favorável facilita a interação entre proteína ativadora e a
DNA Pol  ativação da transcrição

Watson, J.D et al (2008), Molecular Biology of the Gene, 6th edition, Pearson Benjamin Cummings
Bases Moleculares da Interação DNA-Proteína
Figure 7-6 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Figure 7-7 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Figure 7-8 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Bases Moleculares da Interação DNA-Proteína

Grupos no DNA acessíveis para a ligação de proteínas. Os grupos


funcionais sobre as bases são mostradas nas cavidades maior e menor
do DNA.

Os grupos assinalados em vermelho são aqueles que podem


ser usados para o reconhecimento pelas proteínas, de um
modo base-específico.
Adaptado de Nelson, D. and Cox, M., M. (2000). Lehninger Principles of Biochemistry, 3nd edition, Worth Publishers.
Interação Proteína - DNA

Dois exemplos da interação específica entre aminoácidos, na proteína,


e pares de bases, no DNA.

Adaptado de Nelson, D. and Cox, M., M. (2000). Lehninger Principles of Biochemistry, 3nd edition, Worth Publishers.
Figure 7-9 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Table 7-1 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Fatores de Transcrição

 Classificação em famílias
 Domínios:
– de ligação ao DNA
– de trans-ativação (Ativação ou
Repressão)
– de interação proteína-proteína
3 importantes famílias de fatores de transcrição
são descritas quanto ao tipo de domínio de
ligação ao DNA

1) Hélice-Volta-Hélice

2) Dedos de Zinco

3) Leucine Zipper
Vários tipos de motivos de ligação ao DNA são
encontrados em proteínas regulatórias
(DNA-binding proteins)
Helix-turn-helix: o domínio de Repressor Lac completo: domínio de
ligação ao DNA do repressor Lac é ligação ao DNA é mostrado em azul e
mostrado em vermelho e laranja as α-hélices de tetramerização em
vermelho

Adaptado de Nelson, D. and Cox, M., M. (2000). Lehninger Principles of Biochemistry, 3nd edition, Worth Publishers.
Homeodomínios
Hélice-volta-hélice

Uma das α-hélices pode


ser vista projetando-se
dentro do sulco maior do
DNA

Adaptado de Nelson, D. and Cox, M., M. (2000). Lehninger Principles of Biochemistry, 3nd edition, Worth Publishers.

Comun em vários reguladores transcricionais envolvidos no


desenvolvimento.
desenvolvimento Este domínio de 60 resíduos de aminoácidos (codificado
por uma seqüência de DNA chamada homeobox) foi descoberto em genes
homeóticos – genes que regulam o desenvolvimento do padrão do corpo
Dedos de Zinco
3 Dedos de Zinco
C2H2: o mais comun motivo
(cinza) da proteína
de ligação ao DNA; 3 ou +
regulatória de
dedos de Zn; ligam como
camundongo Zif
monômero
268, complexada
com o DNA (azul e
C4: geralmente apenas 2
branco). Cada zinco
dedos de Zn e ligam ao DNA
(marrom) coordena
como homo ou heterodímero
com 2 resíduos de
Cys e His.

Adaptado de Nelson, D. and Cox, M., M. (2000). Lehninger Principles of Biochemistry, 3nd edition, Worth Publishers.

Cerca de 30 resíduos de aminoácidos


4 Cys (C4) ou 2 Cys e 2 His (C2H2) coordenam um íon de zinco
Várias cadeias laterais hidrofóbicas no “core” da estrutura contribuem para sua
estabilidade
Sequência de
aminoácidos do
receptor de estrogênio
(os resíduos mostrados em
negrito são comuns a
todos os receptores de
hormônio esteróide)

Receptores de hormônio esteróide (família C4). Três domínios funcionais: sítio de


ligação para o hormônio, sítio de ligação ao DNA (altamente conservado) e uma
região que ativa a trancrição de genes regulados. O domínio de ligação ao DNA
apresenta dois motivos do tipo dedo de zinco.

Adaptado de Nelson, D. and Cox, M., M. (2000). Lehninger Principles of Biochemistry, 3nd edition, Worth Publishers.
“Zipper” de Leucina

Leucine zipper: α-hélice anfipática com


uma série de resíduos de aminoácidos
hidrofóbicos concentrados de um lado,
com a superfície hidrofóbica formando
a área de contato entre os 2
polipeptídeos do dímero

Adaptado de Nelson, D. and Cox, M., M. (2000). Lehninger Principles of Biochemistry, 3nd edition, Worth Publishers.
Adaptado de Nelson, D. and Cox, M., M. (2000). Lehninger Principles of Biochemistry, 3nd edition, Worth Publishers.

Observar os resíduos de Leu ocorrendo a cada sétima posição na região


do zipper e o número de resíduos de Lys e Arg na região de ligação ao
DNA (interagem com os fosfatos carregados negativamente do DNA
“backbone”)
Adaptado de Nelson, D. and Cox, M., M. (2000). Lehninger Principles of Biochemistry, 3nd edition, Worth Publishers.
OPERON

Adaptado de Nelson, D. and Cox, M., M. (2000). Lehninger Principles of Biochemistry, 3 nd edition, Worth Publishers.

 QUAL A DEFINIÇÃO
DE UM OPERON

3 genes estruturais: lacZ, lacY e lacA


OPERON – 2 modelos de estudo
Tortora et al. (2003). Microbiology: An Introduction, 8th ed. Benjamin-Cummings Pub. Co.

Figure 8.14.1

Catabolismo – Operon Lactose (Lac)

Biossíntese – Operon Triptofano (Trp)


Regulation of Gene Expression

Expressão
constitutiva

Proteína Repressora Ativa:


Repressão do Operon

Figure 8.14.2
Tortora et al. (2003). Microbiology: An Introduction, 8th ed. Benjamin-Cummings Pub. Co.
Expressão Tortora et al. (2003).
constitutiva Microbiology: An
Introduction, 8th ed.
Benjamin-
Cummings Pub. Co.

Inativação da Proteína
Repressora: Ativação
do Operon

Figure 8.14.4
A posição do operador é
variável com relação ao
promotor

Adaptado de Lewin, B. (2000) Genes VII/Benjamin Lewin; trad. Henriue Ferreira ... [et al.]. - Porto Alegre: Artmed Editora, 2001.
Metabolismo da
lactose em E. coli

β-galactosidase - 2 reações:
-reação principal: metabolismo
- reação secundária: indutor do
operon lactose (operon lac)

Adaptado de Nelson, D. and Cox, M., M. (2000). Lehninger Principles of Biochemistry, 3nd edition, Worth Publishers.
Adaptado de Nelson, D. and Cox, M., M. (2000). Lehninger
Principles of Biochemistry, 3nd edition, Worth Publishers.

Operon Lac

mRNA policistrônico

I: repressor lac, gene constitutivo (próximo ao operon lac)


PI: promotor do gene I
Z, Y, A: β-galactosidase, galactosídeo permease,
tiogalactosídeo transacetilase (elimina da célula tiogalactosídeos
tóxicos que também entram pela permease)
P: promotor dos genes lac;
O1: Operador principal
O2 e O3: sítios operadores secundários (pseudooperadores)
Watson, J.D et al (2008), Molecular Biology of the Gene, 6th edition, Pearson Benjamin Cummings
proteína (cinza)
curtos e descontínuos segmentos de DNA (azul)

Adaptado de Nelson, D. and Cox, M., M. (2000). Lehninger Principles of Biochemistry, 3nd edition, Worth Publishers.

O repressor Lac liga-se ao operador principal e a um dos pseudo-


operadores, aparentemente formando um “loop” no DNA.
Nelson, D. and Cox, M., M. (2000). Lehninger Principles of Biochemistry, 3rd edition, Worth Publishers

Ο β-galactosídeo IPTG, estruturalmente relacionado à


alolactose, é um indutor artificial e não metabolizável
do operon lac
Adaptado de Nelson, D. and Cox, M., M. (2000). Lehninger Principles of Biochemistry, 3nd edition, Worth Publishers.

Mudança conformacional do repressor Lac causada pela ligação


do indutor artificial IPTG. O repressor tetramérico é mostrado sem a
ligação do IPTG (imagem transparente) e com a ligação do IPTG
(imagem sólida sobreposta).
PERGUNTA
 Como o operon Lac é regulado?
1) Qual a condição número 1 para ativar este operon ?
2) Como este operon é regulado na ausência de IPTG ?
qual o papel dessa molécula ?
3) e na presença de IPTG ? explique porque?

Na presença de IPTG o operon SERÁ TRANSCRITO


pois a proteína repressora NÃO se liga ao sítio operador
OUTROS FATORES ALÉM DA LACTOSE AFETAM
A EXPRESSÃO DO OPERON LAC

Adaptado de Nelson, D. and Cox, M., M. (2000). Lehninger Principles of Biochemistry, 3nd edition, Worth Publishers.

CRP (cAMP response protein) = proteína responsiva a cAMP


ou
CAP (catabolite activated protein) = proteína ativada por catabólito.

Proteína ativadora: o complexo [cAMP•CRP] liga-se ao sítio CRP e


ativa a transcrição do operon
Uma proteína ativadora e outra
repressora controlam os genes lac

Proteína CAP (liga-se ao DNA como um dímero) – níveis


de Glicose
Proteína Repressora (liga-se ao DNA como um tetrâmero) –
níveis de Lactose (alolactose)

 Glicose –  cAMP
 Glicose –  cAMP cAMP•CAP
Watson, J.D et al (2008), Molecular Biology of the Gene, 6th edition, Pearson Benjamin Cummings
Quando glicose está ausente
 cAMP), CAP•cAMP liga-
(
se ao promotor e estimula a
transcrição do RNA em cerca
de 50 vezes. Sendo, portanto,
um regulador positivo
responsivo aos níveis de
glicose, enquanto o repressor
Lac é um regulador negativo
responsivo à lactose.

Adaptado de Lewin, B. (2000) Genes VII/Benjamin Lewin; trad. Henrique Ferreira ... [et al.]. - Porto Alegre: Artmed Editora, 2001.
Revisando a regulação do Operon Lac

Lodish et al. (2004). Molelcular Cell Biology (5ª edição), cap 4.


Revisando a regulação do Operon Lac
(continuação)

Lodish et al. (2004). Molelcular Cell Biology (5ª edição), cap 4.


Curva de crescimento de E. coli, em presença de
diferentes fontes de carbono
(2 diferentes açúcares: glicose, lactose ou ambos simultaneamente)

Tortora - Figure 8.15

Tortora et al. (2003). Microbiology: An Introduction, 8th ed. Benjamin-Cummings Pub. Co.
PERGUNTA PARA A
PRÓXIMA AULA

 Defina o que é atenuação?


 Quais os elementos de regulação existentes na região de
controle do operon Triptofano?
 Qual a importância das estruturas secundárias
alternativas observadas na extremidade 5’ do
mRNA policistrônico do operon triptofano?
A regulação da expressão gênica pode ocorrer em
vários níveis: 2 pontos serão abordados

DNA

Transcrição: iniciação; atenuação; ≠s σ

RNA

Regulação da Síntese protéica: Iniciação

Proteína
Regulação pelo mecanismo de
ATENUAÇÃO

Operon trp – modelo de estudo

A indução do operon ocorre quando o suprimento de


aminoácido for inadequado aos requerimentos da célula
Operon Triptofano (Trp) – Biossintético
síntese das enzimas envolvidas na biossíntese de Trp

2 mecanismos de regulação: sensoriamento de 2 moléculas


diferentes permitindo um ajuste fino da biossíntese de Trp para
manter uma adequada taxa de síntese de proteínas

 Repressão - circuito Repressor/Operador: Regulação pelos


níveis de Trp livre

 Atenuação Transcricional – resposta aos níveis celulares de


tRNA-Trp (carregado)

responde diretamente à necessidade da célula por Trp para a


síntese protéica.
Operon trp
Os 20 aminoácidos padrão são requeridos em grandes
quantidades para a síntese protéica de E. coli, que pode
sintetizar todos eles.
Os respectivos genes estão geralmente agrupados em
operons  indução da expressão toda vez que o
suprimento de aminoácido for inadequado aos
requerimentos da célula
O operon trp de E. coli é um dos operons mais bem
estudados
A meia vida do mRNA do operon trp é de cerca de
somente 3 minutos  a célula pode responder
rapidamente às mudanças no suprimento de
aminoácidos
Organização geral do Operon Trp

Nelson, D. and Cox, M., M. (2000). Lehninger Principles of Biochemistry, 3rd edition, Worth Publishers
Repressão
- circuito
Repressor/
Operador:
Regulação
pelos níveis
de Trp
livre
Proteína
Repressora
Inativa:
Operon
Induzido

Tortora et al. (2003).


Microbiology: An
Introduction, 8th ed.
Benjamin-
Figure 8.14.3 Cummings Pub. Co.
Repressão
- circuito
Repressor/
Operador:
Regulação
pelos níveis
de Trp
livre
Ativação da Proteína
Repressora pelo Co-
Repressor: Repressão
do Operon

Operon Trp em
resposta a elevados
níveis de Trp
Tortora et al. (2003).
Microbiology: An
Introduction, 8th ed.
Figure 8.14.5
Benjamin-
Cummings Pub. Co.
O repressor triptofano (repressor Trp)
O repressor é um homodímero com ambas as subunidades de cerca de 107
resíduos de aminoácidos (cinza e azul) ligando ao DNA por meio dos motivos
hélice-volta-hélice.

Em vermelho é
mostrado as
moléculas de trp
ligadas ao repressor
Nelson, D. and Cox, M., M. (2000). Lehninger Principles of Biochemistry, 3rd edition, Worth Publishers
Atenuação é o segundo mecanismo de
controle da expressão do operon trp e
envolve a terminação precoce da
transcrição
baseado em estruturas secundárias alternativas (grampo)
na região 5’ líder do RNA situada a montante dos genes
estruturais

resposta aos níveis celulares de tRNA-Trp (carregado)


processo acoplado com a tradução
Acoplamento da transcrição e tradução
em procariotos
O mRNA é traduzido pelos ribossomos enquanto ainda está sendo
sintetisado pela RNA Polimerase a partir do DNA

O acoplamento
da transcrição
com a tradução
é crucial na
regulação por
atenuação
(síntese do
peptídeo líder) Ribossomo MM=2,7x106 Da
RNA Polimerase MM= 3,9x105
Da
Nelson, D. and Cox, M., M. (2000).
Lehninger Principles of Biochemistry,
3rd edition, Worth Publishers
Organização da região lider

Genes
estruturais

Qual estrutura será formada?


O que regula este evento?
O princípio da atenuação é que algum
evento externo controla a formação de um
grampo necessário para a terminção
intrínseca.

Se há a formação do grampo de terminação, este impede a


RNA polimerase de transcrever os genes estruturais – a
transcrição é abortada

Se o grampo não é formado, a RNA polimerase elonga além


do terminador e os genes são expressos.

Diferentes tipos de mecanismos são empregados em


diferentes sistemas para o controle da estrutura do RNA.
Atenuação Transcricional no Operon Trp
• Diferentes [Trp]: variação na taxa de síntese de suas
enzimas biossintéticas em até 700 vezes  combinação dos
mecanismos de controle pelo circuito repressor-operador e
pela atenuação

• Liberada a repressão, a atenuação regula o operon em


resposta à disponibilidade de tRNA-Trp carregado

Nelson, D. and Cox, M., M. (2000). Lehninger Principles of Biochemistry, 3rd edition, Worth Publishers
Operon Triptofano
5 genes estruturais contíguos precedidos por uma região de
controle que inclui: P, O, ORFpeptídeo líder, Atenuador

Nelson, D. and Cox, M., M. (2000). Lehninger Principles of Biochemistry, 3rd edition, Worth Publishers
Organização da região lider

Esta estrutura de
Genes
pausa é estruturais
responsável pelo
acoplamento da
trasncrição e
tradução - controle
da atenuação
O pareamento das regiões 1 e 2 da sequência lider faz com
que a RNA polimerase pause em um sítio logo após estas
regiões
A pausa é longa o suficiente para o início da tradução pelo
ribossomo que sintetisa o peptídeo líder seguindo logo
atrás da RNA polimerase
Um atenuador (A) controla a progressão da RNA Polimerase até os genes trp.

Lewin, B. (2000) Genes VII. Trad. Henrique Ferreira et al. 2001, Ed. Artmed, Porto Alegre/RS

Dependendo dos níveis de tRNA-Trp e da velocidade de tradução do


peptídeo líder  formação de estruturas terminadoras ou
antiterminadoras
Escassez de Trp
Disponibilidade de TRP
Nelson, D. and Cox, M., M. (2000). Lehninger Principles of Biochemistry, 3rd edition, Worth Publishers
Outros aminoácidos