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Aula 1 Imunologia-Virologia Apresentação Introdução à Virologia: Perspectiva histórica Características gerais
Aula 1
Imunologia-Virologia
Apresentação
Introdução à Virologia: Perspectiva histórica
Características gerais dos vírus
Principais técnicas de diagnóstico virológico e
serológico
Docente (Virologia): Sílvia Barros E-mail: silvia.santosbarros@lniv.min-agricultura.pt silviacsbarros@yahoo.com
Docente (Virologia): Sílvia Barros
E-mail:
silvia.santosbarros@lniv.min-agricultura.pt
silviacsbarros@yahoo.com
Avaliação
Nota = 50% prática + 50% teórica (25% Vir. + 25% Imunologia)
Mas: Nota mínima de cada frequência de imunologia e virologia
é de 9,5 valores.
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Bibliografia aconselhada Veterinary Virology Murphy, Gibbs, Horzinck e Studders 3 rd Edition (ou mais antigas)
Bibliografia aconselhada
Veterinary Virology
Murphy, Gibbs, Horzinck e Studders
3 rd Edition (ou mais antigas)
Editor: Elsevier
ISBN: 978-0-12-511340-3

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Introdução histórica

 Antony van Leeuwenhoek (1632-1723) Observação de microrganismos “pequenos animais” em gotas de água,
 Antony van Leeuwenhoek (1632-1723)
Observação
de
microrganismos
“pequenos
animais”
em
gotas
de
água,
saliva, fezes.
 Louis Pausteur (1822-1895)
Pasteurização
“Germ theory of disease”: Os micróbios são responsáveis
por várias doenças. Pasteur demonstra que os
microrganismos não nascem de “geração espontânea”
Acção dos microrganismos na fermentação do vinho
Imunização (vacinação-Raiva)
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Experiência de Pasteur: Cultura velha (Vibrio cholerae) Princípio da Vacinação Vacina da raiva 5
Experiência de Pasteur:
Cultura velha
(Vibrio cholerae)
Princípio da Vacinação
Vacina da raiva
5
Vacinas Edward Jenner: 1ª vacina: smallpox- Vírus da varíola Em 1796 o médico rural Inglês
Vacinas
Edward Jenner: 1ª vacina: smallpox- Vírus da varíola
Em 1796 o médico rural Inglês Edward Jenner usou o vírus cowpox
(retirado de uma pústula do braço da trabalhadora rural Sarah Nemes)
para vacinar uma criança de 8 anos e demonstrou que esta ficou
imunizada contra o vírus humano-smallpox.
Poxvírus
Os poxvirus são antigenicamente idênticos, sendo capazes de induzir
anticorpos específicos assim como de formar reacções cruzadas com
anticorpos não-específicos, facto este que está na base de se poder
vacinar contra uma doença com outro vírus.
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THE EDWARD JENNER MUSEUM THE CHANTRY, CHURCH LANE BERKELEY GL13 9BN UNITED KINGDOM 7
THE EDWARD JENNER
MUSEUM
THE CHANTRY, CHURCH
LANE
BERKELEY
GL13 9BN
UNITED KINGDOM
7
 Robert Koch (1843-1910) 1876 Isolamento do Bacillus anthracis. Demonstração de que este organismo era
 Robert Koch (1843-1910)
1876
Isolamento do Bacillus anthracis.
Demonstração de que este organismo era o agente causador do
carbúnculo
1882
Descoberta do agente causador da
tuberculose – Mycobacterium tuberculosis
1883
Descoberta do agente causador da cólera
– Vibrio cholerae
1890
Publicação dos Postulados de Koch
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Postulados de Koch Critérios necessários para se provar que determinado microrganismo é responsável por determinada
Postulados de Koch
Critérios necessários para se provar que determinado
microrganismo é responsável por determinada doença
1. O microrganismo tem de estar presente em cada caso de
doença
2. O microrganismo tem de ser isolado do hospedeiro doente e
crescer em cultura pura
3. Quando o microrganismo é introduzido num hospedeiro
saudável susceptível, a doença tem de ser reproduzida
4. O microrganismo tem de ser isolado a partir do hospedeiro
infectado experimentalmente
Os postulados de Koch têm sido gradualmente alterados
(p.e. os microrganismos causadores de doença nem sempre são
cultiváveis nos meios laboratoriais).
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Dmitri Ivanovski (1864-1920) Identificou os vírus responsáveis pela doença do mosaico do tabaco (organismos mais
Dmitri Ivanovski (1864-1920)
Identificou os vírus responsáveis pela doença do mosaico
do tabaco (organismos mais pequenos que as bactérias).
Ramsés 1196 A.C.
Hieróglifo 1400 A.C.
Poliomielite (Paralisia)
Varíola (smallpox)
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Are viruses alive?"

Viruses, "At the Edge of Life" Microrganismos unicelulares Clamídias São células Protozoários Fungos
Viruses, "At the Edge of Life"
Microrganismos
unicelulares
Clamídias
São células
Protozoários
Fungos
Bactérias
Ricketsias
Micoplasmas
Vírus
Não são células; não possuem organelos;
estão completamente dependentes da
célula hospedeira nos processos
energéticos e na síntese de
macromoléculas
Vírus Ébola
(Filoviridae )
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11
Propriedades dos microrganismos unicelulares e dos vírus Propriedades Bactérias Ricketsias Micoplasmas Clamídias
Propriedades dos microrganismos unicelulares e dos vírus
Propriedades
Bactérias
Ricketsias
Micoplasmas
Clamídias
Vírus
>300nm a
+
+
+
+
-
Crescimento em
meios artificiais b
+
-
+
-
-
Fissão Binária
+
+
+
+
-
DNA e RNA
+
+
+
+
-
c
Genoma infeccioso
-
-
-
-
+
Ribossomas
+
+
+
+
-
Metabolismo
+
+
+
+
-
Sensibilidade aos
antibióticos
+
+
+
+
d
-
a
Alguns Mic oplasmas e Clamídias têm dimensões inferiores a 300 nm .
b As Clamídias e a maioria das ricketsias são parasitas intracelulares obrigat órios
c Nem todos os v írus
d Existem muito poucas excepç ões (a rifampicina inibe a replicação dos poxv írus)
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Definição Vírus (do latim veneno) é constituído por um ácido nucleico (DNA ou RNA) envolto
Definição
Vírus (do latim veneno) é constituído por um ácido
nucleico (DNA ou RNA) envolto por proteínas (cápside
proteica). Alguns podem possuir uma membrana
lipídica de origem celular (invólucro/envelope). Muitos
responsáveis por enfermidades.
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Características dos vírus Parasitas intracelulares obrigatórios porque: Não possuem : Ribossomas Mitocôndrias
Características dos vírus
Parasitas intracelulares obrigatórios porque:
Não possuem :
Ribossomas
Mitocôndrias
Constituídos por um único tipo de ácido
nucleico (RNA ou DNA) e nunca ambos!
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A origem dos vírus ??? Teoria 1: Vírus são bactérias defectivas que perderam a maioria
A origem dos vírus ???
Teoria 1:
Vírus são bactérias
defectivas que perderam a maioria
das suas funções celulares.
Teoria 2: São genes eucariotas evadidos das células, i.e., ácidos
nucleicos com capacidade de sobrevivência fora do
ambiente celular. Por exemplo; os virióides das plantas são
cópias de RNAs, sem cápside, com capacidade de se auto-
replicarem, e não sintetizam proteínas.
(Potato Spindle Tuber Viroid)
Alguns genes dos
poxvírus são
semelhantes a
genes eucariotas.
Formas lineares e
circulares dos virióides
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15
Vias de entrada dos vírus - Tracto respiratório - Tracto gastrointestinal - Fissuras na pele
Vias de entrada dos vírus
- Tracto respiratório
- Tracto gastrointestinal
- Fissuras na pele
- Tracto genital
Vias de saída dos vírus
- Tracto respiratório (Influenza A)
Mais comuns
- Tracto gastrointestinal (Rotavírus)
- Sangue; sémen (HIV)
- Leite (Retrovírus)
- Tracto urinário (Cytomegalovírus)
- Tracto genital (Hepatite B)
- Saliva (vírus da raiva)
- Células germinais (Oncovírus)
16
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Factores que determinam a gama de hospedeiros - Capacidade que o vírus possui de entrar
Factores que determinam a gama de hospedeiros
- Capacidade que o vírus possui de entrar na célula -
Susceptibilidade da célula.
- Já no interior da célula, a capacidade do vírus replicar e produzir
descendência - Permissividade da célula
- Capacidade que o vírus tem de sair da célula e ir infectar novas
células.
Infecção viral produtiva
Células susceptíveis e permissivas à entrada e multiplicação dos vírus
(produção de descendência viral).
Tropismo celular: Especificidade celular
Classificação e Taxonomia dos vírus ICTV-International Committee on Taxonomy Viruses www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/
Classificação e Taxonomia dos vírus
ICTV-International Committee on Taxonomy Viruses
www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/
Nomenclatura:
Famílias: -viridae; subfamilias: -virinae; género: -virus;
espécie; estirpe, serótipos, genótipos, subtipos.
Simetria: Icosaédrica ou helicoidal.
Genoma viral: DNA ou RNA, de cadeia simples ou dupla, única ou
segmentado, linear ou circular.
Sequência nucleotídica: genes, tipos de proteínas sintetizadas e suas
actividades.
Estratégia de replicação
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Características gerais dos vírus de RNA

- Os vírus de RNA possuem genoma linear, que pode ser simples ou segmentado. -
- Os vírus de RNA possuem genoma linear, que pode ser simples ou
segmentado.
- Em geral, os vírus de RNA de cadeia negativa têm invólucro e
transportam na cápside uma RNA polimerase (replicase) responsável pela
síntese da cadeia de RNA+.
- Nos vírus de RNA+, ocorre
inicialmente a tradução do
RNA, com a síntese da RNA
polimerase viral
(polimerase/replicase),
responsável pela replicação
do genoma viral.
- Nos vírus RNA+ o
genoma é infeccioso.
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19
Propriedades dos vírus de RNA Família Diâmetro Invólucro Simetria Genoma (nm) Picornaviridae ~30 -
Propriedades dos vírus de RNA
Família
Diâmetro
Invólucro
Simetria
Genoma
(nm)
Picornaviridae
~30
- icosaédrica
ss(+),~8.5kb
ss(+), 8kb
Caliciviridae
~40
- icosaédrica
ss(+), 12kb
Togaviridaee
~70
+ icosaédrica
ss(+), 10kb
Flaviviridae
~50
+ icosaédrica
ss(+),~30kb
Coronaviridae
75-160
+ helicoidal
ss(-),~19kb
Paramyxoviridae
150-300
+ helicoidal
ss(-),~15kb
Rhabdoviridae
180 x 75
+ helicoidal
ss(-),13.6kb
Orthomyxoviridae
~100
+ helicoidal
ss(-),~12kb
Arenaviridae
~120
+ helicoidal
ss(-),~17kb
Bunyaviridae
~120
+ helicoidal
ds,~22kpb
Reoviridae
~80
+ icosaédrica
ds, 7kpb
Birnaviridae
~60
- icosaédrica
ss,~9
Retroviridae
~90
- icosaédrica
Nota: Os vírus com invólucro são sensíveis aos solventes orgânicos.
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20
Propriedades dos vírus de DNA Família Diâmetro Invólucro Simetria Genoma (nm) Hepadnaviridae 42 -
Propriedades dos vírus de DNA
Família
Diâmetro
Invólucro
Simetria
Genoma
(nm)
Hepadnaviridae
42
- icosaédrica
ds, circular a ,3.2kpb
ds, circular,
Circoviridae
ss(-), linear, 5kb
Parvoviridae
20
- icosaédrica
ds, circular, 5/8kpb
Papovaviridae
45 b /55 c
- icosaédrica
ds, linear, 35kpb
Adenoviridae
70
- icosaédrica
ds, linear, 180kpb
Herpesviridae
150
+ icosaédrica
ds, linear, 150kpb
Iridoviridae
210
+ icosaédrica
ds, linear, 150kpb
Asfarviridae
220
+ icosaédrica
ds, linear, 205kpb
Poxviridae
210
+ complexa
a Com excepção de uma única região, a maior parte da
molécula é de cadeia dupla.
b/c Polyomavirus e Papillomavirus, respectivamente.
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21
Ciclo de Replicação viral 1- Entrada do vírus na célula/ Adsorção (ligação aos receptores) e
Ciclo de Replicação viral
1- Entrada do vírus na célula/
Adsorção (ligação aos receptores)
e penetração.
2- Descapsidação - necessário
para que ocorra a replicação do
genoma (excepção: reovírus).
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3- Expressão do genoma viral
(síntese das proteínas e
replicação do genoma)
2 genoma
4- Morfogénese dos novos viriões
(assembly)
11 tradução
5- Extrusão dos novos vírus das
3
células (Lise da célula
gemulação)
ou
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Entrada dos vírus na célula Vírus com invólucro O invólucro tem origem celular (geralmente membrana
Entrada dos vírus na célula
Vírus com invólucro
O invólucro tem origem celular (geralmente membrana citoplasmática
da célula), com espículas mais ou menos proeminentes constituías por
glicoproteínas
Endocitose
Fusão
Ex: Vírus Influenza A
Entrada através do endossoma. A
fusão da membrana do endossoma
com o invólucro viral só ocorre a
valores de pH baixo (ácido).
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Entrada dos vírus na célula Cont. Vírus sem invólucro O genoma viral atravessa a membrana
Entrada dos vírus na célula
Cont.
Vírus sem invólucro
O genoma viral atravessa a membrana directamente
Translocação
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Diagnóstico Virológico Método directo: Detecção de partículas virais, antigénios ou sequências genómicas virais
Diagnóstico Virológico
Método directo: Detecção de partículas virais,
antigénios ou sequências genómicas virais
(Diagnóstico virológico).
Método Indirecto: Detecção de anticorpos
específicos (Diagnóstico serológico). Ac da doença
vs Ac vacinação (vacinas delectadas).
O.I.E. OFFICE INTERNATIONAL DES
EPIZOOTIES/ WORLD ORGANISATION FOR
ANIMAL HEALTH
(RING TESTS)
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25

Principais Técnicas de diagnóstico serológico

Técnica Fundamentos ELISA Ligação antigénio-anticorpo; adição de anti-IgG (anti- espécie) marcados com
Técnica
Fundamentos
ELISA
Ligação
antigénio-anticorpo;
adição
de
anti-IgG
(anti-
espécie)
marcados
com
enzimas
(exemplo
peroxidade)-
reacção colorimétrica.
Separação electroforética das proteínas virais em gel de
Western-
gp135
Immunoblotting
poliacrilamida, e electrotransferência para membrana (ex.
nitrocelulose), incubação com o anti-soro, visualização por
ligação do anti-IgG específico marcado (peroxidase).
p24
p 16
16
16 16
14 14
14
14
Agar gel Imunodifusão
Reacção antigénio-
anticorpo
Seroneutralização
Os
anticorpos
neutralizam
o
vírus,
com
inibição
da
citopatogeneicidade.
I munofluorescência
Os anticorpos ligam-se aos antigénios em células fixadas;
Adição de anti-IgG marcados com fluoresceína, visualização
ao microscópio de fluorescência.
Inibição da hemaglutinação
Os anticorpos inibem a hemaglutinação
26
26
Esquema representativo da metodologia da ELISA-Bloqueio Fevereiro, M., Barros, S., Fagulha, T. (1999). Development of
Esquema representativo da metodologia da ELISA-Bloqueio
Fevereiro, M., Barros, S.,
Fagulha, T. (1999). Development
of a monoclonal antibody
blocking-ELISA for detection of
antibodies against Maedi-Visna
virus. J. Virol. Methods 81, 101-
108.
27
27
Principais Técnicas de diagnóstico Virológico Técnica Fundamentos Isolamento de vírus (efeito
Principais Técnicas de diagnóstico Virológico
Técnica
Fundamentos
Isolamento de vírus
(efeito citopatogénico-CPE)
Cultura de células
Ovos embrionados
Microscopia Electrónica
Visualização de partículas virais
ELISA-Ag
Ligação anticorpo-antigénio
Imunocitoquímica
Os anticorpos ligam-se aos antigénios em células
fixadas; Adição de anti-IgG marcados com biotina/
peroxidase, revelação por adição de substracto
cromogénio
Imunofluorescência
Os anticorpos ligam-se aos antigénios em células
fixadas; Adição de anti-IgG marcados com
fluoresceína, visualização ao
fluorescência.
microscópio de
Hemaglutinação
Acção da hemaglutinina viral
PCR/RT-PCR/real-time
Detecção de ácidos nucleicos virais
PCR
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28
Efeito citopatogénico (CPE) Alterações morfológicas observadas nas células infectadas, por acção do vírus
Efeito citopatogénico (CPE)
Alterações morfológicas observadas nas células infectadas,
por acção do vírus (circularização das células;
destacamento, aparecimento de corpos de inclusão, morte
celular, sincícios, etc)
Sincícios
A fusão do invólucro viral com a membrana da célula hospedeira,
faz que a proteína viral de fusão fique exposta na membrana da
célula e assim possa induzir a fusão com outras células
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29
Reacção de PCR Reacção de RT-PCR 5’ 3’ 3’ 5’ RNA 1 cDNA 3’ 1-
Reacção de PCR
Reacção de RT-PCR
5’
3’
3’
5’
RNA
1
cDNA
3’
1-
Desnaturação (94ºC) 5’
3’
5’
2
5’
3’
2- Ligação dos primers
5’
3’
5’
5’
3
3- Reacção de síntese
5’
3’
ou extensão do primer
3’
5’
1
2
3
4
5
6
4
4571 pb
2986 pb
2261 pb
2261 pb
30
30
Real-time PCR 31
Real-time
PCR
31
Sequenciação A C G T 32 32
Sequenciação
A
C
G
T
32
32