Aula 1

Imunologia-Virologia
Apresentao Introduo Virologia: Perspectiva histrica Caractersticas gerais dos vrus Principais tcnicas de diagnstico virolgico e serolgico

Docente (Virologia): Slvia Barros E-mail: silvia.santosbarros@lniv.min-agricultura.pt silviacsbarros@yahoo.com

Avaliao
Nota = 50% prtica + 50% terica (25% Vir. + 25% Imunologia) Mas: Nota mnima de cada frequncia de imunologia e virologia de 9,5 valores.

Bibliografia aconselhada
Veterinary Virology Murphy, Gibbs, Horzinck e Studders 3rd Edition (ou mais antigas) Editor: Elsevier ISBN: 978-0-12-511340-3

Introduo histrica

Antony van Leeuwenhoek (1632-1723)

Observao de microrganismos pequenos animais em gotas de gua, saliva, fezes.

Louis Pausteur (1822-1895)

Pasteurizao Germ theory of disease: Os micrbios so responsveis por vrias doenas. Pasteur demonstra que os microrganismos no nascem de gerao espontnea Aco dos microrganismos na fermentao do vinho Imunizao (vacinao-Raiva) 4

Experincia de Pasteur: Princpio da Vacinao

Cultura velha (Vibrio cholerae)

Vacina da raiva

Vacinas
Edward Jenner: 1 vacina: smallpox- Vrus da varola Em 1796 o mdico rural Ingls Edward Jenner usou o vrus cowpox (retirado de uma pstula do brao da trabalhadora rural Sarah Nemes) para vacinar uma criana de 8 anos e demonstrou que esta ficou imunizada contra o vrus humano-smallpox.

Poxvrus

Os poxvirus so antigenicamente idnticos, sendo capazes de induzir anticorpos especficos assim como de formar reaces cruzadas com anticorpos no-especficos, facto este que est na base de se poder vacinar contra uma doena com outro vrus.
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THE EDWARD JENNER MUSEUM THE CHANTRY, CHURCH LANE BERKELEY GL13 9BN UNITED KINGDOM

Robert Koch (1843-1910)

1876
Isolamento do Bacillus anthracis. Demonstrao de que este organismo era o agente causador do carbnculo

1882
Descoberta do agente causador da tuberculose Mycobacterium tuberculosis

1883
Descoberta do agente causador da clera Vibrio cholerae

1890
Publicao dos Postulados de Koch

Postulados de Koch
Critrios necessrios para se provar que determinado microrganismo responsvel por determinada doena
1. O microrganismo tem de estar presente em cada caso de doena 2. O microrganismo tem de ser isolado do hospedeiro doente e crescer em cultura pura

3. Quando o microrganismo introduzido num hospedeiro saudvel susceptvel, a doena tem de ser reproduzida
4. O microrganismo tem de ser isolado a partir do hospedeiro infectado experimentalmente Os postulados de Koch tm sido gradualmente alterados (p.e. os microrganismos causadores de doena nem sempre so cultivveis nos meios laboratoriais).

Dmitri Ivanovski (1864-1920)

Identificou os vrus responsveis pela doena do mosaico do tabaco (organismos mais pequenos que as bactrias).

Hierglifo 1400 A.C. Poliomielite (Paralisia)

Ramss 1196 A.C. Varola (smallpox)

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Are viruses alive?"

Viruses, "At the Edge of Life"
Microrganismos unicelulares Clamdias Protozorios Fungos Bactrias Ricketsias So clulas

Micoplasmas

Vrus
No so clulas; no possuem organelos; esto completamente dependentes da clula hospedeira nos processos energticos e na sntese de macromolculas

Vrus bola 11 (Filoviridae)

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Propriedades dos microrganismos unicelulares e dos vrus

Propriedades
>300nma Crescimento em meios artificiaisb Fisso Binria DNA e RNA Genoma infeccioso Ribossomas Metabolismo Sensibilidade aos antibiticos
a b

Bactrias Ricketsias Micoplasmas Clamdias Vrus

+ + + + -

+ + + + +

+ + + +

+ + + + +

+ + + +

+c -

-d

Alguns Micoplasmas e Clamdias tm dimenses inferiores a 300 nm . As Clamdias e a maioria das ricketsias so parasitas intracelulares obrigatrios c Nem todos os vrus d Existem muito poucas excepes (a rifampicina inibe a replicao dos poxvrus)

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Definio
Vrus (do latim veneno) constitudo por um cido nucleico (DNA ou RNA) envolto por protenas (cpside proteica). Alguns podem possuir uma membrana lipdica de origem celular (invlucro/envelope). Muitos responsveis por enfermidades.

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Caractersticas dos vrus

Parasitas intracelulares obrigatrios porque:
No possuem :

Ribossomas

Mitocndrias

Constitudos por um nico tipo de cido nucleico (RNA ou DNA) e nunca ambos!

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A origem dos vrus ??? Teoria 1: Vrus so bactrias defectivas que perderam a maioria das suas funes celulares. Teoria 2: So genes eucariotas evadidos das clulas, i.e., cidos nucleicos com capacidade de sobrevivncia fora do ambiente celular. Por exemplo; os viriides das plantas so cpias de RNAs, sem cpside, com capacidade de se autoreplicarem, e no sintetizam protenas.
(Potato Spindle Tuber Viroid)

Alguns genes dos poxvrus so semelhantes a genes eucariotas.

Formas lineares e circulares dos viriides
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Vias de entrada dos vrus

- Tracto respiratrio - Tracto gastrointestinal - Fissuras na pele - Tracto genital

Vias de sada dos vrus

Mais comuns

- Tracto respiratrio (Influenza A) - Tracto gastrointestinal (Rotavrus)

- Sangue; smen (HIV)

- Leite (Retrovrus) - Tracto urinrio (Cytomegalovrus) - Tracto genital (Hepatite B) - Saliva (vrus da raiva) - Clulas germinais (Oncovrus) 16
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Factores que determinam a gama de hospedeiros

- Capacidade que o vrus possui de entrar na clula Susceptibilidade da clula. - J no interior da clula, a capacidade do vrus replicar e produzir descendncia - Permissividade da clula - Capacidade que o vrus tem de sair da clula e ir infectar novas clulas. Infeco viral produtiva

Clulas susceptveis e permissivas entrada e multiplicao dos vrus (produo de descendncia viral). Tropismo celular: Especificidade celular

Classificao e Taxonomia dos vrus

ICTV-International Committee on Taxonomy Viruses

www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/
Nomenclatura: Famlias: -viridae; subfamilias: -virinae; gnero: -virus; espcie; estirpe, sertipos, gentipos, subtipos. Simetria: Icosadrica ou helicoidal. Genoma viral: DNA ou RNA, de cadeia simples ou dupla, nica ou segmentado, linear ou circular. Sequncia nucleotdica: genes, tipos de protenas sintetizadas e suas actividades. Estratgia de replicao
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Caractersticas gerais dos vrus de RNA

- Os vrus de RNA possuem genoma linear, que pode ser simples ou segmentado.

- Em geral, os vrus de RNA de cadeia negativa tm invlucro e transportam na cpside uma RNA polimerase (replicase) responsvel pela sntese da cadeia de RNA+.
- Nos vrus de RNA+, ocorre inicialmente a traduo do RNA, com a sntese da RNA polimerase viral (polimerase/replicase), responsvel pela replicao do genoma viral. - Nos vrus RNA+ o genoma infeccioso.

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Propriedades dos vrus de RNA

Famlia Dimetro Invlucro Simetria (nm) Picornaviridae ~30 icosadrica Caliciviridae ~40 icosadrica Togaviridaee ~70 + icosadrica Flaviviridae ~50 + icosadrica Coronaviridae 75-160 + helicoidal Paramyxoviridae 150-300 + helicoidal Rhabdoviridae 180 x 75 + helicoidal Orthomyxoviridae ~100 + helicoidal Arenaviridae ~120 + helicoidal Bunyaviridae ~120 + helicoidal Reoviridae ~80 + icosadrica Birnaviridae ~60 icosadrica Retroviridae ~90 icosadrica Genoma ss(+),~8.5kb ss(+), 8kb ss(+), 12kb ss(+), 10kb ss(+),~30kb ss(-),~19kb ss(-),~15kb ss(-),13.6kb ss(-),~12kb ss(-),~17kb ds,~22kpb ds, 7kpb ss,~9

Nota: Os vrus com invlucro so sensveis aos solventes orgnicos.

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Propriedades dos vrus de DNA

Famlia Dimetro Invlucro Simetria Genoma (nm) Hepadnaviridae 42 icosadrica ds, circulara,3.2kpb ds, circular, Circoviridae Parvoviridae 20 icosadrica ss(-), linear, 5kb Papovaviridae 45b /55c icosadrica ds, circular, 5/8kpb Adenoviridae 70 icosadrica ds, linear, 35kpb Herpesviridae 150 + icosadrica ds, linear, 180kpb Iridoviridae 210 + icosadrica ds, linear, 150kpb Asfarviridae 220 + icosadrica ds, linear, 150kpb Poxviridae 210 + complexa ds, linear, 205kpb a Com excepo de uma nica regio, a maior parte da molcula de cadeia dupla. b/c Polyomavirus e Papillomavirus, respectivamente.

21 21

Ciclo de Replicao viral

1- Entrada do vrus na clula/ Adsoro (ligao aos receptores) e penetrao. 2- Descapsidao - necessrio para que ocorra a replicao do genoma (excepo: reovrus).
5

3- Expresso do genoma viral (sntese das protenas e replicao do genoma)

2 genoma 1 traduo 3

4- Morfognese dos novos viries (assembly)

5- Extruso dos novos vrus das clulas (Lise da clula ou gemulao)
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Entrada dos vrus na clula

Vrus com invlucro
O invlucro tem origem celular (geralmente membrana citoplasmtica da clula), com espculas mais ou menos proeminentes constituas por glicoprotenas Endocitose
Fuso

Ex: Vrus Influenza A

Entrada atravs do endossoma. A fuso da membrana do endossoma com o invlucro viral s ocorre a valores de pH baixo (cido). 23

Entrada dos vrus na clula

Vrus sem invlucro

Cont.

O genoma viral atravessa a membrana directamente

Translocao

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Diagnstico Virolgico Mtodo directo: Deteco de partculas virais, antignios ou sequncias genmicas virais (Diagnstico virolgico). Mtodo Indirecto: Deteco de anticorpos especficos (Diagnstico serolgico). Ac da doena vs Ac vacinao (vacinas delectadas). O.I.E. OFFICE INTERNATIONAL DES EPIZOOTIES/ WORLD ORGANISATION FOR ANIMAL HEALTH

(RING TESTS)
25

25

Principais Tcnicas de diagnstico serolgico

Tcnica ELISA Fundamentos Ligao antignio-anticorpo; adio de anti-IgG (antiespcie) marcados com enzimas (exemplo peroxidade)reaco colorimtrica.
gp135

WesternImmunoblotting

p24

Separao electrofortica das protenas virais em gel de poliacrilamida, e electrotransferncia para membrana (ex. nitrocelulose), incubao com o anti-soro, visualizao por ligao do anti-IgG especfico marcado (peroxidase).

p16 14

Agar gel Imunodifuso Seroneutralizao

Os anticorpos vrus, com inibio citopatogeneicidade.

Reaco antignioanticorpo neutralizam o

da

I munofluorescncia

Os anticorpos ligam-se aos antignios em clulas fixadas; Adio de anti-IgG marcados com fluorescena, visualizao ao microscpio de fluorescncia.
26 26

Inibio da hemaglutinao Os anticorpos inibem a hemaglutinao

Esquema representativo da metodologia da ELISA-Bloqueio

Fevereiro, M., Barros, S., Fagulha, T. (1999). Development of a monoclonal antibody blocking-ELISA for detection of antibodies against Maedi-Visna virus. J. Virol. Methods 81, 101108.

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Principais Tcnicas de diagnstico Virolgico

Tcnica Fundamentos Isolamento de vrus Cultura de clulas (efeito citopatognico-CPE) Ovos embrionados Microscopia Electrnica Visualizao de partculas virais

ELISA-Ag Imunocitoqumica

Imunofluorescncia

Ligao anticorpo-antignio Os anticorpos ligam-se aos antignios em clulas fixadas; Adio de anti-IgG marcados com biotina/ peroxidase, revelao por adio de substracto cromognio Os anticorpos ligam-se aos antignios em clulas fixadas; Adio de anti-IgG marcados com fluorescena, visualizao ao microscpio de fluorescncia.
Aco da hemaglutinina viral

Hemaglutinao PCR/RT-PCR/real-time PCR

Deteco de cidos nucleicos virais

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Efeito citopatognico (CPE)

Alteraes morfolgicas observadas nas clulas infectadas, por aco do vrus (circularizao das clulas; destacamento, aparecimento de corpos de incluso, morte celular, sinccios, etc)

Sinccios

A fuso do invlucro viral com a membrana da clula hospedeira, faz que a protena viral de fuso fique exposta na membrana da clula e assim possa induzir a fuso com outras clulas
29 29

Reaco de PCR
5 3 3 5

Reaco de RT-PCR
RNA
cDNA
1

1- Desnaturao (94C)

5 3

3 5

2- Ligao dos primers 5

3 5

3 5 5

3- Reaco de sntese 5 ou extenso do primer

3

2261 pb

4571 pb 2986 pb

2261 pb

30 30

Real-time PCR

31

Sequenciao
A C G T

32

32