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BC 2011/12
Observao de mitose em pices radiculares de Allium cepa. Observao de meiose em anteras de Aloe sp. Espectrofotometria. Pedir planeamento do trabalho da fermentao. Pscoa Preparao de solues e correo das tabelas fermentao. Elaborao de um relatrio/artigo cientfico. Fermentao alcolica em leveduras. 25 abril 4a Fluxo de protes em tilacoides isolados I Semana Acadmica Fluxo de protes II Dvidas / discusso de resultados. Ultraestrutura celular. Entrega de relatrio (3valores). 2a 3a 9 10 h Avaliao TP Bioqumica 4a 14 15 h T1* 15.30 - 16.30h T2* Avaliao TP Biologia 5a 6a
N de aulas previstas: 11 aulas + avaliao. Limite de faltas : 3 * T1 Turno 1 Alunos at Jos Miguel Alves Peixoto (inclusive). T2 Turno 2 A partir de Jos Miguel Morim Rocha (inclusive). Exames: poca normal 19 de Junho (3 feira), poca de recurso 9 de Julho (2 feira). 2
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lentes oculares
tubo
coluna
Microscopia ptica-2
restato
Ampliao total do microscpio = ampliao da objetiva x ampliao da ocular A qualidade final da imagem ampliada vai depender da resoluo do microscpio, ou seja, da sua capacidade para distinguir pontos muito prximos. O poder resolvente de um microscpio depende das caractersticas do seu sistema de lentes. O limite de resoluo a menor distncia a que devem estar dois pontos do objeto para que eles apaream individualizados na imagem. O limite de resoluo (d) quantificado pela equao de Abbe:
d=k
AN
- comprimento de onda da luz incidente AN - abertura numrica da objetiva (AN = n sen ) n - ndice de refrao do meio entre o objeto e a objetiva sen - seno do semi ngulo de abertura da objetiva k = 0,61 4
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Micrmetro da objetiva uma lmina de vidro com uma escala gravada de forma extremamente precisa. utilizada para determinar o fator de converso entre as divises do micrmetro da ocular e a dimenso real gravada na lmina, para cada ampliao.
100x0.01mm = 1 mm)
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no se altera com a mudana de objetiva, sempre observada na totalidade, e no se move quando os parafusos de movimentao da preparao so acionados. Identifique-a na figura abaixo. 2. Colocar o micrmetro da objetiva na platina e focar a escala gravada no seu centro utilizando a objetiva de menor ampliao (4x). A escala do micrmetro da objetiva vai aumentando de tamanho com a ampliao utilizada e apenas observada parcialmente nas ampliaes maiores. Esta escala desloca-se quando os parafusos de movimentao da preparao so acionados. Identifique-a na figura abaixo. 3. Rodar a ocular de forma a que a escalas dos dois micrmetros fiquem paralelas. Movimentar a escala do micrmetro da objetiva at que esta fique parcialmente sobreposta escala do micrmetro da ocular e com o incio coincidente. escala do micrmetro __________________
4. 5.
Contar as divises de cada micrmetro desde o incio at ao ponto onde as duas Considerando que cada diviso do micrmetro da objetiva corresponde a 0,01 mm, ou
escalas voltam a ser coincidentes. Registar os valores na Tabela I.1. seja, 10 m, calcular a dimenso real correspondente a 1 diviso do micrmetro da ocular para a objetiva de 4x. 6. Repetir para as objetivas de 10x, 40x e 100x.
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Tabela I.1 Calibrao do micrmetro da ocular para as diferentes ampliaes. N de divises micr. ocular N de divises correspondentes do micr. objetiva Dimenso de 1 diviso do micr. objetiva (m) 10 10 10 10 Dimenso de 1 diviso do micr. ocular (m)
Objetiva
5x 4x
10x 40x 100x Clculos:
2,5 1 100 10
5 1 25 1
20 10 2,5 1
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Material biolgico
Esquema
Ampliao objetiva
Medies
Allium cepa
Elodea
Cortia
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Material biolgico
Esquema
Ampliao objetiva
Medies
Fgado
Bactrias do iogurte
Anabaena sp.
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Unidade I Autoavaliao
1 Qual a relao (aumenta, diminui ou no afetado) entre o poder resolvente de um microscpio tico de campo claro e os seguintes parmetros:
Diminui comprimentos de onda ______________________________________________________ Aumenta ngulo de abertura da objetiva________________________________________________ Aumenta utilizao de leo de imerso entre a preparao e a objetiva _______________________
2 Calcule o dimetro de uma das clulas observadas na figura 1 em m sabendo que, para a objetiva utilizada, 1 diviso do micrmetro da ocular = 2 divises do micrmetro da objetiva e que 1 diviso do micrmetro da objetiva igual a 0,01mm.
Figura I.2 Imagem de clulas animais em cultura, obtida num microscpio ptico de campo claro utilizando uma objetiva de baixa ampliao. A ocular tinha acoplado um micrmetro.
40 micrmetros
3 Durante as aulas observou diferentes tipos de clulas ao microscpio ptico de campo claro. Preencha a tabela utilizando os conhecimentos adquiridos. Material biolgico Clulas de Allium cepa Clulas encontradas no iogurte Clulas de fgado Anabaena Clulas de Elodea Padro de organizao celular Organelos observados Tamanho relativo*
5 1 3 2 4
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Figura II.1 - Ciclo celular de uma clula eucaritica superior (Alberts et al. 2005).
Error!
Coifa
Figura II.2 Imagem de razes do bolbo de Allium cepa e corte longitudinal do pice radicular.
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Mitose
Objetivo: Observar a mitose em clulas vegetais e identificar as diferentes fases mitticas: profase, prometafase, metafase, anafase e telofase. Executar preparaes utilizando tcnicas de colorao especfica para os cromossomas. Observar as preparaes com o microscpio ptico de campo claro. Material Biolgico: pices radiculares de Allium cepa (cebola)
Anafase
Telofase
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Meiose
A Meiose ocorre em clulas diplides especializadas e em determinadas fases do ciclo de vida dos organismos. Atravs deste processo de diviso nuclear uma clula diplide origina quatro clulas haplides.
Flor de Lillium
epiderme
feixe vascular
tapete
saco polnico
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Meiose
Objectivo: Observar meiose em clulas vegetais e identificar as diferentes fases meiticas: profase I (leptteno, zigteno, paquteno, diplteno, diacinese), metafase I, anafase I, telofase I, profase II, metafase II, anafase II e telofase II. Executar preparaes extemporneas. Observar preparaes extemporneas e definitivas em microscpio tico de campo claro. Material Biolgico: Anteras de Aloe sp.
Carmim Actico Dissolver 0,5 g de carmim puro em 100 ml de cido actico 45% levando ebulio, pelo menos durante 1 hora. A dissoluo deve ser feita em matraz com sistema de refrigerao associado para evitar alterao da concentrao, por evaporao. Deixar arrefecer e filtrar. Este corante de longa durao e pode ser usado diretamente ou aps diluio em cido actico 45%. Orcena Actica Dissolver 1 g de orcena em 45 ml de cido actico glacial, quase temperatura de ebulio. Deixar arrefecer, adicionar 55 ml de gua destilada e filtrar.
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Profase I - Diplteno
Profase I - Diacinese
Diviso I
Metafase I
Anafase I
Telofase I*
Profase II*
Metafase II
Diviso II
Anafase II
Telofase I
* Por vezes no material vegetal no possvel distinguir estas duas fases e nessas situaes a fase de transio designa-se INTERCINESE
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Unidade II - Autoavaliao
Porque selecionou o pice radicular para observao de ncleos em diviso?
Porque uma zona em constante crescimento e portanto as clulas __________________________________________________________________________ dividem-se mais rpido e frequentemente.
__________________________________________________________________________ Porque que a zona do pice com clulas em diviso apresenta cor leitosa mais opaca do que o resto da raiz?
desenvolvidos e grandes com as clulas j "matutadas", como o volume __________________________________________________________________________ destas clulas maioritariamente citosol este menos transparente.
Qual o objetivo do tratamento das razes com lcool clordrico?
Porque estas clulas no constituem um tecido rgido e j se __________________________________________________________________________ encontram mais ou menos separadas para que possam facilmente __________________________________________________________________________ espalhar-se para a polinizao.
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A absoro de energia por uma molcula apenas pode ocorrer quando a energia do foto incidente igual diferena de energia entre dois nveis eletrnicos, promovendo assim a transio de um eletro de um nvel de energia baixo para um mais elevado. Antes que um outro foto possa ser absorvido, o estado excitado deve perder esta energia e reverter ao estado de energia inicial.
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Um espectrofotmetro um aparelho concebido para medir a quantidade de energia radiante absorvida por molculas em soluo. Os componentes bsicos de um espectrofotmetro so (Fig. III.2): i) uma fonte de luz policromtica, normalmente de tungstnio, para comprimentos de onda entre 350-900 nm, ou de deutrio para a regio dos UV (200-400 nm). ii) um prisma que decompe a luz e um filtro tico que permite selecionar os comprimentos de onda desejados. iii) um compartimento para alojar a amostra. iv) um detetor, normalmente um tubo fotoeltrico ou um dodo de silicone, que mede a intensidade de luz transmitida pela amostra.
A razo entre a intensidade de luz transmitida depois de atravessar uma soluo colocada no aparelho - It - e a intensidade de luz na ausncia de amostra - I0 chama-se transmitncia (T):
I0
It
T = It / I0
A transmitncia pode ter um valor entre 0 e 1 e frequentemente multiplicada por 100 sendo assim indicada como uma percentagem. A absorvncia traduz a quantidade de luz absorvida pela substncia em soluo.
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Leis da Absoro
Lei de Lambert Para uma concentrao baixa de soluto e para qualquer comprimento de onda de luz considerado, a absorvncia da soluo diretamente proporcional espessura do compartimento que contm a soluo trajeto tico da luz na amostra = l (expresso em cm).
A = k l
Lei de Beer Para uma concentrao baixa de soluto e para qualquer comprimento de onda de luz considerado, a absorvncia da soluo diretamente proporcional concentrao do soluto = c.
A = kc
Lei de Lambert - Beer Combinando as duas leis, a equao fundamental para a absoro da luz passa a ser: A=klc Em que a constante de proporcionalidade k constitui o chamado coeficiente de extino e por isso representada por E: A=Elc A absorvncia - no tem unidades pois uma razo entre valores diferentes do mesmo parmetro (intensidade luminosa). l trajeto ptico da luz - representado em cm, corresponde largura da cuvete utilizada para a medio de absorvncia que sempre igual a 1cm . E coeficiente de extino - as suas unidades tero que ser o recproco da concentrao e o recproco do comprimento: - se a concentrao for expressa em g L-1, E vem expresso em L g-1cm-1. - se a concentrao for expressa em molaridade (mol L-1) o coeficiente de extino representado por e designa-se coeficiente de extino molar. vir expresso em L mol-1 cm-1. 21
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O coeficiente de extino uma constante caracterstica de cada espcie qumica dissolvida num determinado solvente e depende do comprimento de onda da radiao incidente e da temperatura. O coeficiente de extino mais vulgarmente utilizado o coeficiente de extino molar - . Neste caso a lei de Lambert-Beer corresponde a : A=lc Olhando para esta expresso pode verificar-se que o coeficiente de extino molar de uma substncia, para um determinado , corresponde absorvncia de uma soluo com a concentrao 1M: l = 1cm, c = 1M ento A = x 1 x 1 ou seja A = O coeficiente de extino molar pode ser consultado em tabelas para inmeras substncias e assim, a partir da absorvncia de solues de concentrao desconhecida, pode-se determinar facilmente a respetiva concentrao utilizando a lei de Lambert-Beer. Em determinadas situaes no conveniente a expresso da concentrao em molaridade e no possvel recorrer a um pre determinado: - para molculas polimricas de tamanho varivel ou de peso molecular indefinido - caso de cadeias de DNA ou de polissacardeos - quando se deseja determinar a concentrao, no de uma espcie qumica, mas de uma classe de compostos (por exemplo todos os lpidos presentes numa amostra) - quando se pretende medir uma concentrao indiretamente atravs de uma reao colorimtrica Nestes casos, a constante de proporcionalidade k tem que ser determinada para cada situao. necessrio construir a reta que representa a lei de Lambert-Beer a partir dos valores de absorvncia obtidos para solues preparadas no laboratrio com concentraes conhecidas da substncia em estudo. Esta reta designada reta padro e a sua equao corresponde lei de Lambert Beer para essa situao. O declive da reta corresponde obviamente constante de proporcionalidade k. Para construir uma reta padro so, portanto, necessrias solues com concentraes conhecidas - normalmente designadas solues padro, e necessrio obter os respetivos valores de absorvncia. Estes valores so colocados num grfico no qual o eixo das abcissas representa a concentrao - varivel independente - e o eixo das ordenadas a absorvncia varivel dependente. Desenha-se ento a melhor reta que traduz a nuvem de pontos tomando como ponto fixo a origem das coordenadas (Fig. III.3). Alternativamente pode determinar-se a equao da melhor reta representada pelo conjunto de pontos atravs dum mtodo estatstico de regresso linear.
Absorvncia
Figura III.3 Recta padro para o doseamento de uma substncia de concentrao desconhecida. Aps ler o valor de absorvncia da soluo de concentrao desconhecida, pode ler-se na reta a concentrao respetiva.
Concentrao
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Aplicaes da espectrofotometria
As aplicaes da espectrofotometria podem ser divididas em duas categorias: a) medio da absorvncia a um determinado comprimento de onda. Exemplo: utilizao do coeficiente de extino molar ou construo de uma reta padro para a determinao da concentrao de um determinado composto em soluo. b) medio da variao da absorvncia num intervalo de comprimentos de onda. Exemplo: obteno de um espectro de absoro para identificao de biomolculas. O espectro de absoro de um composto obtido medindo a absorvncia a vrios comprimentos de onda e registando a absorvncia em funo do comprimento de onda (ver Fig. III.4).
Figura III.4 - Espectro de absoro da clorofila a, clorofila b e carotenoides (em cima). Espectro de ao da fotossntese (em baixo). http://en.wikipedia.org/wiki/File:Par_action_spectrum.gif 23
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9 Explique como poder ter sido determinado o coeficiente de extino fornecido para as clorofilas.
coeficiente de extino.
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Absorvncia de um extracto acetnico de folhas de Tabela III.1 _____________________________________________________________ espinafre para diferentes comprimentos de onda
(nm)
400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 652 675 700
Absorvncia
0,335 0,482 0,351 0,261 0,062 0,027 0,029 0,046 0,055 0,075 0,138 0,153 0,182 0,009
Absorvancia
0,500 0,400 0,300 0,200 0,100 Comprimento de onda (nm) Espectro de absoro de um extracto acetnico de folha Figura III.5_________________________________________________________________ espinafre.
___________________________________________________________________________ 25
450
500
650
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O ensaio a "branco" numa anlise espectrofotomtrica (assinalar a opo correta) a) no tem forosamente de obedecer lei de Lambert-Beer. b) feito sempre com gua destilada, num volume igual s amostras. c) difere das amostras apenas pela falta da substncia a testar. d) difere das amostras por possuir uma quantidade exata de soluo padro e) difere das amostras apenas pela falta do reagente de cor
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Aspetos a tomar em considerao Volume dos tubos = 17 mL (VERIFICAR) Mximo de 5 tubos por grupo, incluindo controlos Incubao de 45 min Quantidade de leveduras = 0,12g Concentrao final de substrato = 2% (exceto se a varivel a testar for a concentrao de substrato) Substrato = sacarose (exceto se a varivel a testar for o tipo de substrato) Incubao a 37C (exceto se a varivel a testar for a temperatura) 27
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Planeamento
1. Liste parmetros/variveis cuja influncia sobre a fermentao alcolica ache pertinente testar (por ex. concentrao inicial de substrato X). Escolha, conjuntamente com os colegas de grupo, qual dessas variveis pretende testar experimentalmente e indique-a na sua lista.
3.2 Determine as diferentes condies que pretende estudar para a varivel que escolheu (um mximo de 5 tubos por grupo). No se esquea de prever os controlos necessrios.
Influencia da concentrao de substracto na fermentao alcolica de leveduras Ver tabela da pagina seguinte...
Tubos de ensaio, suporte de tubos de ensaio, balana, pipetas, gobeles, garrafa de esguicho, papel de aluminio, esptula, estufa, farafilme
3.4. Indique as solues que necessita de preparar inclua as concentraes e os respectivos volumes.
Preparar 17mL de solues de sacarose com diferentes concentraes de acordo com o indicado na tabela da pagina seguinte.
3.5. Elabore uma tabela completa de trabalho, incluindo nmero de tubos, composio de cada tubo, condies experimentais, etc. (pgina seguinte). Coloque um ttulo na tabela.
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Material e Mtodos: Elabore uma tabela com a composio dos tubos a utilizar na experincia que planeou. Registe tambm a composio dos tubos das experincias dos outros grupos. Tome em ateno que o n de colunas depende da varivel a estudar.
Composicao dos tubos para testar a concentrao de Tabela IV.1_________________________________________________________________ sacarose na fermentao alcolica de leveduras ___________________________________________________________________________ Sacarose 20% Concentrao Volume total Leveduras (g) Tubos (mL)
(mL) de sacarose (%)
1 (controlo) 2 3 4 5
0 1 2 4 8
Composicao dos tubos para testar a o efeito da Tabela IV.2 ________________________________________________________________ temperatura na fermentao alcolica de leveduras ___________________________________________________________________________ Tubos Leveduras (g) Sacarose 20% Temperatura de Volume total incubao (*C)
(mL)
1 (controlo) 2 3 4 5
(mL)
45 4 22 45 70
Composicao dos tubos para testar o tipo de substracto na Tabela IV.3_________________________________________________________________ fermentao alcolica de leveduras ___________________________________________________________________________ Lactose Sacarose (20%) Leveduras (g) Glucose Maltose Tipo de Tubos
1 (controlo) 2 3 4 5
substracto
(20%) (mL) (mL)
1,7
(20%) (mL)
(20%) (mL)
1,7 -
1,7 -
1,7 -
1,7
17,0
Tabela IV.4_________________________________________________________________ Composicao dos tubos para testar o volume de etanol na ___________________________________________________________________________ fermentao alcolica de leveduras Volume total Sacarose 20% Volume Etanol (%) Tubos Leveduras (g)
etanol (mL) (mL) (mL)
1 (controlo) 2 3 4 5
0,12
17,0 1,7
0 6 12 18 24
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Figura IV.1 - Montagem que permite medir a actividade da fermentao alcolica atravs da deteco da quantidade de CO2 libertado que se vai acumular no topo do tubo invertido contendo a levedura na presena do substrato.
1 - Medir a capacidade total dos tubos graduados e registar o valor que dever ser utilizado para a preparao das solues. 2 - Pesar e colocar em cada tubo 0,12 g de levedura. Ressuspender as leveduras num pouco de gua ou da soluo a utilizar. 3 - Adicionar as solues de acordo com as tabelas de composio dos tubos. 4 - Preencher o tubo at ao topo com gua ou com a soluo a utilizar, colocar parafilme e inverter, imediatamente antes do passo seguinte. 5 Retirar o parafilme, sobrepor ao tubo graduado um outro maior de cerca de 25 ml, virado para baixo, at o tubo graduado tocar o fundo. 6 Mantendo presso sobre o tubo graduado, rodar o conjunto dos dois tubos 180 . 7 - Ler e anotar de imediato o volume do espao vazio no cimo do tubo invertido (Vi volume inicial) nas tabelas da pgina seguinte. Registar a hora exata (t0). Incubar temperatura pretendida durante 45 min. 8 - O CO2 libertado acumular-se- no topo do tubo, formando uma bolha de gs cujo tamanho pode ser medido em ml na escala do tubo, aps o tempo de incubao. Ler a anotar o volume do espao vazio no cimo de cada tubo (Vf volume final). Vf Vi = volume de CO2 libertado. 30
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Resultados
Registe os resultados da sua experincia e das experincias dos restantes grupos da sua turma numa tabela adequada. Coloque um ttulo na tabela. Tabela IV.5_________________________________________________________________ Tubos 1 (controlo) 2 3 4 5 Tabela IV.6_________________________________________________________________ Tubos 1 (controlo) 2 3 4 5 Tabela IV.7_________________________________________________________________ Tubos 1 (controlo) 2 3 4 5 Tabela IV.8_________________________________________________________________ Tubos 1 (controlo) 2 3 4 5 31 Vol. inicial (mL) Vol. final (mL) CO2 libertado (mL) Vol. inicial (mL) Vol. final (mL) CO2 libertado (mL) Vol. inicial (mL) Vol. final (mL) CO2 libertado (mL) Vol. inicial (mL) Vol. final (mL) CO2 libertado (mL)
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Discusso
1. Os resultados obtidos suportam a hiptese por si formulada anteriormente? 2. Explique os seus resultados. 3. Como poderia seguir o decorrer da fermentao alcolica por um processo diferente do que utilizou neste trabalho?
Destilar a mistura e medir o volume de etanol ou recorrer a mtodos de quantificao dos acares presentes na mistura.
4. Que alimentos fermentados conhece?
Unidade IV Autoavaliao
No trabalho prtico sobre fermentao alcolica em leveduras testou o efeito de diferentes substratos na quantidade de CO2 libertado. A quantidade de CO2 libertado quando utilizou lactose foi superior ou inferior ao libertado quando utilizou a sacarose? Porqu?
Porque pode no ser utilizada na permutao ou nem sequer transportada para o interior da clula.
No trabalho prtico sobre fermentao alcolica em leveduras testou o efeito de diferentes concentraes de etanol na quantidade de CO2 libertado. Admitindo que o volume de CO2 libertado para uma concentrao de etanol de 5% foi de 1,0 ml, preencha a tabela seguinte, com valores teoricamente aceitveis.
Tabela IV.9 Quantidade de CO2 libertado durante a fermentao alcolica em leveduras, na presena de sacarose e de diferentes concentraes de etanol.
% etanol (v/v) 0 5 10 20
2,5/3/4
1,0
0,5 0,125/0
Sabendo que a capacidade dos tubos que utilizou na experincia era 15 mL, calcule o volume de etanol 60% (v/v) necessrio para preparar os 4 tubos com as concentraes indicadas na tabela. Apresente os clculos necessrios sua preparao.
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I. Isolamento de cloroplastos de espinafre-da-Nova-Zelndia (Tetragonia expansa) 1 - Pesar 10 g de folhas de espinafres sem nervura mediana. Rasgar as folhas em pequenos pedaos. 2 - Homogeneizar as folhas em 40 mL de tampo* de homogenizao frio (cerca de 4 C) e manter em gelo. No ligar o homogeneizador por mais que 5 s seguidos. 3 - Passar o homogeneizado atravs de oito camadas de gaze. Espremer bem todo o lquido. Manter o filtrado em gelo. 4 - Centrifugar o filtrado em 1 tubos Falcon de 50 mL em centrfuga refrigerada, a 900 g durante 2 min. 5 - Transferir o sobrenadante para tubos frios e centrifugar a 1800 g durante 10 min. 6 - Decantar o sobrenadante at ltima gota, inverter o tubo e secar com papel absorvente as gotas aderentes borda do tubo. Ressuspender o sedimento de cloroplastos em 4 mL (2 mL por tubo) de meio de isolamento frio** 7 - Guardar a suspenso de tilacides em gelo. Permanecer estvel por 2-4 horas. Inverter suavemente imediatamente antes de retirar uma amostra. **O invlucro cloroplastidial rebenta. Porqu? II. Determinao da concentrao de clorofila e ajuste da concentrao da suspenso de tilacides 1 - Adicionar 9,9 mL de acetona a 80% (v/v) a 0,1 mL de suspenso de tilacides inverter suavemente a suspenso de tilacides imediatamente antes de pipetar os 0,1 mL. 2 - Aguardar aproximadamente 1 min. Filtrar o extrato atravs de papel de filtro. 3 - Transferir o filtrado para uma cuvete de vidro e ler a Abs. a 652 nm usando acetona a 80% como branco (E652 clorofilas = 34,5 mL mg-1cm-1). 4 - Calcule a concentrao de clorofila na suspenso de tilacides. Note que a suspenso foi diluda de 100 x. 5 - Diluir a suspenso de tilacides com meio de isolamento de modo a que a concentrao final de clorofila seja de 150 g mL-1. * para compreender o que uma soluo tampo estude o Tutorial 1 sobre pH e o Tutorial 2 sobre solues tampo (final do guia). 33
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III. Medio do Transporte de Protes 1 - Termine a montagem experimental de acordo com a figura. Mantenha a suspenso de tilacides sempre na obscuridade.
registador grfico
Figura V.1 - Montagem experimental para medir o fluxo de protes em tilacides isolados (Boyer, 1986).
2 - Manter a temperatura do banho de CuSO4 1% (p/v) a 10 C, adicionando gelo (o CuSO4 absorve a radiao de infra-vermelhos que provoca aquecimento). O tubo dever conter o eltrodo de pH e 20-30 mL de suspenso de tilacides. Colocar as barras magnticas como indicado na figura. 3 - Ligar o agitador a baixa velocidade e confirmar que a barra magntica no afeta o eltrodo. Aumentar um pouco a velocidade do agitador para obter boa homogenizao na vizinhana do eltrodo. Se necessrio: Ajustar o pH da mistura para 6-6,2 com HCl 0,01 M ou NaOH 0,01 M. Adicionar o cido ou a base lentamente (alteraes bruscas de pH podem danificar as membranas). 4 - Esperar cerca de 1 min para estabilizar a leitura de pH e ler o pH inicial (pode ser necessrio ajustar o pH aps cada diferente condio experimental). 5 - Ligar a fonte de luz (projetor de diapositivos ou lmpada de 500 W) e registar a variao de pH durante 1 min das duas maneiras seguintes: i) no registador automtico ou ii) lendo o pH no eltrodo de 10 em 10 segundos e registando os valores. 6 - Desligar a luz e registar o pH durante 1 min. 7 - Repetir os passos 5 e 6 duas vezes. ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------Tampo de Homogenizao: Sacarose 0,4 M; NaCl 0,01 M; Tris 0,02 M; MgCl2 0,005 M; pH 8 Meio de Isolamento: Sacarose 0,1 M; NaCl 0,01 M; MgCl2 0,005 M; pH 6-7
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Resultados
Coloque aqui o registo obtido.
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Unidade V - Autoavaliao
Como varia o pH do meio quando ilumina a suspenso de tilacides?
O pH aumenta.
Como explica essa variao? A cadeia transportadora de electres bomba protes para dentro das vesculas de tilareis diminuindo a concentrao no meio e aumentando assim o pH da soluo. Como varia o pH do meio quando coloca a suspenso de tilacides na obscuridade? O pH diminui. Como explica essa variao?
A ATPsintase bomba protes para a soluo (produzindo ATP caso exista ADP) o que aumenta a concentrao no meio e consequentemente diminui o pH. Os protes movem-se a favor do gradiente criado no perodo de luz.
Imagine que executava a experincia incluindo no meio ADP e Pi. Como iria variar o pH com os ciclos de luz/obscuridade?
Faa a legenda da figura. 1 Vacolo 2 Membrana do vacolo (tonoplasto) 3 Tilacide (granum) 4 Estroma 5 Gro de amido 6 Gotas lipidica (plastoglbulos) 7 Invlucro do cloroplasto 8 Lamela estromtica ( tilacoides 9 10 Lamela mediana 11 Membrana celular 12 Membrana do vacolo
intergrnicos) Parede celular
___________________________________________________________________________ 36
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ATP sintetase
PSI
Fotossistema I
PSII
Transportadores de eletres
Fotossistema II
Figura V.4 Esquema geral da fotossntese em cloroplastos e relao entre o espectro de ao da fotossntese e o espectro de absoro dos principais pigmentos envolvidos (retirado de Raven, P. H., Evert, R. F. and Eichhorn, S. E. 1999. Biology of Plants 6th edition. W. H. Freeman and Company, New York, USA. www.whfreeman.com/raven/index.htm) 37
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Procariontes
Parede celular
Parede celular
Ribossomas
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Ncleo MNI MNE Matriz mitocondria l Gros de glicognio Mitocndria MMI MME
Poro nuclear
Peroxissoma
Clula animal
Poro nuclear
Peroxissoma
Golgi
Clula animal
Mitocndria
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Peroxissoma
Desmossomas
Clula animal
Eucromatina Heterocromatina
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Lisossoma secundrio
Clula animal
Poliribossomas
Clula animal
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Vacolo
Ncleo
Cloroplasto Plasmodesmo
Clula vegetal
Vacolo
Mitocndria
Clula vegetal
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Proplastdeo
Clula vegetal
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DNA mitocondrial
Clula vegetal
Parede celular
Proplastdeo
Clula vegetal
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Peroxissoma
Microtbulos
Plasmodesmo
Desmotbulo
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Membrana celular
Desmossonas
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Clula animal
Microtbulos
Parede celular
Lamela mediana
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Retculo endoplasmatico
Golgi
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A 25 C
[H+] x [OH-] = 10-14 M2
A escala de pH varia de 0 a 14. Numa soluo aquosa pura [H+] = 10-7 M, logo pH = log 10-7 = 7 , a soluo diz-se neutra ([H+] = [OH-] ). Valores de pH inferiores a 7 indicam uma soluo cida ([H+] > [OH-] ) e valores de pH superiores a 7 indicam uma soluo bsica ou alcalina ([H+] < [OH-] ).
Tabela 8 Escala de pH e exemplos com diferentes valores de pH (adaptado de Loddish et al. 2000).
Concentrao de H+
(M) 10-0 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10 10-11 10-12 10-13 10-14
pH
Exemplo
Acidez crescente
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Fludos gstricos Sumo de limo Vinagre Solos cidos Lisossomas e Vacolos Citoplasma de msculo em contraco gua pura e citoplasma gua do mar Solos alcalinos Lagos alcalinos Detergentes com amnia Cal (soluo saturada)
Neutro
Basicidade crescente
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Mtodo colorimtrico Este mtodo utiliza compostos designados indicadores de pH compostos que apresentam uma cor diferente consoante o valor de pH da soluo em que se encontram. Um indicador universal uma mistura de indicadores de pH que assumem um leque de cores diferentes consoante o valor de pH. Utiliza-se sob a forma de uma tira de papel, impregnada com a mistura de indicadores, que acompanhada de uma escala de cor e correspondentes valores de pH. Figura T1.1 Cores assumidas por vrios indicadores de pH ao longo da escala de pH.
O aparelho de pH constitudo por um voltmetro que mede as diferenas de potencial entre um eltrodo de referncia e um eltrodo indicador (de vidro) associados numa s pea eltrodo combinado. O eltrodo indicador sensvel concentrao de H+ da soluo na qual se encontra submerso, desenvolvendo-se uma diferena de potencial diretamente proporcional concentrao de H+. A calibrao do aparelho com solues padro de pH conhecido permite ao aparelho efetuar a converso da voltagem medida em valores de pH. Figura T2.2 Imagem de um aparelho de pH. O eltrodo encontra-se submerso numa soluo. 49
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Aplicando a funo logaritmo a ambos os lados da equao e arranjando o resultado possvel derivar uma relao muito importante designada equao de Henderson Hasselbalch:
log Ka = log [H+] x [ A-] a [HA] log Ka = log [H+] + log _[ A-] a [HA] - log [H+] = - log Ka + log _[ A-] a [HA]
substituindo - log [H+] por pH e - log Ka por pKa temos a equao de Henderson Hasselbalch
pH = pKa + log _[ A-]_ [HA]
O pKa de um cido igual ao valor de pH para o qual [HA] = [ A-], ou seja, o pH para o qual o cido e a sua base conjugada esto presentes em concentraes iguais. No intervalo de pH igual a pKa1 a pKa+1 o par conjugado confere capacidade tamponante soluo como ilustra a curva de titulao. pH 8
6 Zona tamponante (pKa + 1) pH 3,75 a 5,75 pKa = 4,75 4 Zona tamponante = pKa + 1 (3,75 5,75) 2
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Tabela T2.1
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Para preparar uma soluo tampo podem utilizar-se dois mtodos: 1) Dissolver a quantidade necessria do cido ou base fraca do tampo num volume inferior ao volume final e adicionar NaOH ou HCl at obter o pH desejado detetado por monitorizao continua com o eltrodo de pH. 2) Preparar duas solues com a concentrao desejada para o tampo, uma da base e outra do cido conjugados que formam o sistema tampo. Depois, partindo de uma das solues vai-se adicionando a outra at obter o pH desejado. A tabela 11 indica os volumes a utilizar para a preparao de tampo fosfato por este mtodo.
Tabela 11 - Preparao de tampo fosfato 0,1M. Na H2 PO4 0,1M (mL) 9,7 9,5 9,0 8,0 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,5 Na2 HPO4 0,1M (mL) 0,3 0,5 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 9,5 pH 5,30 5,59 5,91 6,24 6,47 6,64 6,81 6,98 7,17 7,38 7,73 8,04
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e problemas tcnicos encontrados. A discusso deve ser feita com clareza e objetividade para que o leitor possa distinguir entre as concluses provenientes da execuo do trabalho e as inferncias resultantes da combinao dos dados experimentais obtidos com informaes colhidas em leituras. Esta seco deve terminar com um pargrafo que resume os pontos principais das concluses do trabalho, e faz normalmente uma ligao para o futuro, ou referindo o trabalho que ser feito a seguir, ou levantando novas questes. BIBLIOGRAFIA Na bibliografia devero ser includas as referncias a todos os artigos, livros ou outros elementos utilizados. Exemplo: Gimnez-Abin MI, F Panzera, JF Lpez-Sez, JF Gimnez-Abin, C de la Torre and G Gimnez-Martn, 1998. Immediate disruption of spindle poles and induction of additional microtubule-organizing centres by a phenylcarbamate, during plant mitosis. Protoplasma 204: 119-127. (referncia a um artigo publicado numa revista) Lodish H, A Berk, SL Zipursky, P Matsudaira, D Baltimore and JE Darnell, 2000. Molecular Cell Biology. W. H. Freeman and Company, New York. (referncia a um livro de texto) Cada vez que utilizada, no texto, informao recolhida de uma referncia bibliogrfica deve ser feita a sua meno no final da frase respetiva. Esta meno no texto pode ser feita utilizando um nmero ex.: (1), (2) etc. e depois numerando as respetivas referncias na bibliografia, ou pode ser feita mencionando o nome do autor e o ano ex.: (Lodish et al*. 2000) e organizando depois as referncias bibliogrficas por ordem alfabtica * usa-se normalmente a abreviatura et al. (abreviatura de et alia), que significa e outros, quando uma referncia tem mais de dois autores, na meno resumida que feita no texto.
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