2.

A tcnica da clonagem O procedimento para a produo de indivduos geneticamente idnticos em larga escala se baseia na tcnica de Transferncia Nuclear descrita por Willadsen (1986). Segundo Miglino (2004), os recentes resultados de clonagem por transferncia nuclear tm encorajado os pesquisadores cada vez mais a elucidarem alguns aspectos ainda obscuros relativos a essa tcnica. Esta tcnica possui as seguintes etapas: produo de citoplasmas receptores, preparo das clulas doadoras de ncleo, reconstruo do embries, ativao e desenvolvimento in vitro dos embries. A produo de citoplasmas receptores a partir da metodologia descrita por Willadsen (1986), utiliza como fonte de citoplasma receptor, ocitos maturados in vivo, que estejam na Metfase II. Para ocitos maturados in vitro, Prather et al. (1987), tambm obtiveram sucesso, porm os primeiros relatos desta tcnica em mamferos apontam para o uso de zigotos em estdio pr-nuclear (ROBL et al, 1987). Para que ocorram os citoplasmas receptores, necessrio que os cromossomos destes sejam removidos (enucleao), processo que em geral, faz-se utilizando micropipetas e micromanipulador, e que pode tambm ocorrer atravs da biseco de ocitos, que consiste no descarte da metade que contm a placa metafsica, ocorrendo perca de 50% do citoplasma, enquanto que no primeiro processo, segundo Westhusin et al. (1996), as perdas variam de 5 a 50%. Aps a remoo do material gentico do ncleo receptor, a clula doadora de ncleo colocada sob a membrana pelcida do ocito enucleado e fusionada com estmulo eltrico. Como mtodo alternativo, pode-se injetar o ncleo da clula doadora diretamente no citoplasma receptor (MELLO, 2003). Em condies normais o ocito ativado pelo espermatozide no momento da fecundao, estimulando a retomada da meiose e o incio do desenvolvimento embrionrio. No caso da transferncia nuclear, necessrio que se faa a ativao do complexo citoplasma receptor ncleo doador e pode ser induzida por uma srie de agentes fsicos e qumicos (LOI et al, 1998). Dentre

estes pode-se citar os estmulos eltricos, ionforos e soluo de etanol a 7% (PRATHER et al, 1999). Em seguida, o citoplasma de ocitos maturos promove a quebra da vescula germinativa, a condensao da cromatina, o deslocamento de protenas citoplasmticas para o ncleo e a reprogramao do genoma. Este desenvolvimento depende fundamentalmente da compatibilidade entre o ncleo doador e o citoplasma receptor (ZAKHARTCHENKO et al, 1997). O estgio do ciclo celular de ambas as clulas no momento da eletrofuso tem um efeito substancial no desenvolvimento do embrio reconstrudo. Outros fatores determinantes so: a totipotncia do ncleo, reprogramao nuclear, competncia do citoplasma receptor para direcionar desenvolvimento (diz respeito maturao do ovcito), ativao artificial e condies de cultivo do embrio (RUMPF et al., 2002). Ncleos em estado quiescente (fase G0), assemelha-se s clulas espermticas no momento da fecundao, sendo este fato importante para o estabelecimento da correta ploidia do embrio reconstrudo (MELLO, 2003). Os embries reconstitudos herdam componentes do ocito receptor que contribuem, de modo majoritrio ou total, com a herana citoplasmtica, incluindo o DNA mitocondrial (mtDNA) (TAKEDA et al., 2003; MEIRELLES et al., 2001). Sendo assim, importante ressaltar que clones so cpias genticas nucleares, com possveis variaes epigenticas, fenotpicas (SMITH e MURPHY, 2004). Segundo Meirelles et al. (2007), A tcnica de clonagem gera uma cpia que pode diferir do animal original (doador de ncleo) essencialmente em dois pontos: i) alteraes na cromatina (epigenticas); e ii) modificaes na gentica citoplasmtica. O primeiro ponto gera modificaes no desenvolvimento embrionrio, na placentao, e conseqentemente, maiores riscos de aborto e dificuldade para a adaptao vida extra-uterina (BERTOLINI et al., 2007). No que diz respeito gentica citoplasmtica, a qual envolve o mtDNA, o modelo zebuno mostrou-se adequado para estudar o mecanismo de herana mitocondrial nos clones (MEIRELLES et al., 2001). Esse trabalho, juntamente com outros, vem mostrando que clones perdem o mtDNA de origem somtica, citoplasmticas e

ou seja, proveniente da clula do animal clonado, para abrigar somente ou majoritariamente, modificao o mtDNA indica do que ocito clones doador no de citoplasma. so cpias Essa gentica genticas

exatamente idnticas, e, embora nunca provado, h uma possibilidade de que a substituio do mtDNA tenha efeitos na produo animal. As gestaes desses animais so problemticas, com freqente presena de distrbios placentrios responsveis por elevadas perdas neste perodo. O parto e os cuidados neonatais tambm so, no raramente, frustrantes (BERTOLINI E ANDERSON 2002; PANARACE et al., 2007). Segundo Rumpf et al. (2002), os altos ndices de perdas fetais durante a gestao esto associados a deficincias no processo de transferncia nuclear ou aos sistemas in vitro de maturao e cultivo de embries e de clulas doadoras. Estes e outros fatores podem levar a um padro inapropriado da expresso de genes em algum ponto-chave do desenvolvimento embrionrio, fetal ou placentrio. Em seguida, encontra-se um esquema representativo do processo de transferncia nuclear.

Fonte:

3. Clonagem em sunos A aplicao de tcnicas de Biotecnologia Reprodutiva suinocultura tem o intuito acelerar o melhoramento gentico dos rebanhos. realizado, atravs de biotcnicas como a clonagem, xenotransplante e o uso de marcadores moleculares. A produo de clones de grande interesse no s para o melhoramento gentico, mas tambm para a biotecnologia, para a biomedicina, bem como para diversas reas da pesquisa fundamental (GURDON & COLMAN, 1999; KIKYO & WOLFFE, 2000). Atualmente, esto sendo realizados estudos onde atravs de tcnicas de clonagem procura-se obter clones de sunos sem a alfa-galactosil-transferase. Os tecidos destes animais, no desencadearia ao homem problemas de rejeio e seriam ideais para transplantes renais e cardacos. Outra promessa a produo rpida de animais com defeitos genticos que simulem doenas humanas como a fibrose cstica, o que dinamizaria os testes de novos medicamentos (SERRET et al, 2007). Segundo Camargo (2007), os sunos so a espcie preferida pelos pesquisadores para cederem rgos para os seres humanos, tanto do ponto de vista cientfico como tico. Mas o principal problema encontrado nesse tipo de procedimento cirrgico a rejeio pelo sistema imune do receptor. A clonagem de animais, aponta um caminho para superar as eventuais causas da rejeio. Isso porque permitiria o desenvolvimento de um "estoque" de animais transgnicos com as modificaes genticas necessrios para reduzir o problema da rejeio (CAMARGO, 2007). Outra vantagem est mais ligada diretamente a cadeia produtiva da suinocultura, onde problemas como atraso gentico e dificuldades de seleo para cruzamentos, seriam amenizados com a disseminao dessa tecnologia, possibilitando, com isso, um intercmbio gentico de animais de linhagens superiores, eficiente utilizao dos gametas e gerao de novos produtos (Visscher et al., 2000). Nos Estados Unidos, existe a criao de sunos com interesses comerciais, porm, a falta de regulamentao do FDA (Food and Drug Adiministration) Isso pode ser transgnese,

gera a necessidade de regras a serem seguidas e tambm afasta possveis investidores. Segundo Pollack (2007), Cecil Forsberg, professor da Universidade de Guelph, em Ontrio, Canad, que ajudou a desenvolver o "enviropig", um suno com esterco menos poluente, afirma que as empresas com as quais tm contato, optaram pelo caminho orgnico, e esto preocupadas, pelo menos no momento, em que seus nomes sejam associados ao rtulo OGM. E que os crticos dizem que alterar os genes dos animais pode conduzir a mudanas potencialmente perigosas na composio da carne, como a introduo de uma protena capaz de causar reaes alrgicas. Segundo a PPL Therapeutics (conhecida mundialmente pela clonagem da ovela Dolly, juntamente com o Roslin Institute), as experimentaes clnicas resultantes da clonagem suna poderiam comear dentro de quatro a cinco anos (CAMARGO, 2007). A FDA considera que os clones sejam menos geneticamente radicais do que os animais criados por engenharia gentica - os quais, em lugar de serem apenas rplicas de animais que ocorrem naturalmente, recebem pores de DNA que lhes so estranhas, algumas oriundas de outras espcies (POLLACK, 2007).