Tcnicas em Imunologia

Parte I Mtodos Laboratoriais em Imunologia

Prof.Doutor Jos Cabeda

Tcnicas de Imunologia

Colheitas

Utilizar o tubo correcto Sangue /plasma Anticoagulante apropriado EDTA Citrato heparina Soro Com activador da coagulao Com activador da coagulao e gel separador do cogulo e soro
Prof. Doutor Jos Cabeda Tcnicas de Imunologia

Soro

Coagulao deve ser completa Cerca de 30 a 60 minutos em tubo sem anticoagulante Cerca de 15 a 30 minutos em tubo com activador da coagulao Mais se o indivduo estiver com hipocoagulao natural ou induzida Centrifugar os tubos 10 min a 1,000-1,200g-22C Guardar a 4C excepto para CH50 e crioglobulinas

Prof. Doutor Jos Cabeda Tcnicas de Imunologia

Que tubo utilizar?

Preparao de leuccitos Habitualmente utilizar anticoagulante (qual depende do teste) Purificar as clulas Preservar as clulas Fenotipagem 4C Cultura/estudos funcionais Transportar o sangue a RT rpidamente Preparar as clulas rpidamente Cultivar/testar de imediato
Prof. Doutor Jos Cabeda Tcnicas de Imunologia

Outros tipos de Amostra (I)

Urina (muito raro) CSF Saliva Liquidos de: Sinovial, pleura, pericrdio, peritoneu, BAL

Utilizar Tubo c/ EDTA ou sem anticoagulante

Prof. Doutor Jos Cabeda

Tcnicas de Imunologia

Outros tipos de Amostra (II)

Bipsias (aspirados por agulha fina) Ndulos linfticos Medula ssea Tumores etc
Utilizar Tubo c/ EDTA

ou
Com heparina
Prof. Doutor Jos Cabeda Tcnicas de Imunologia

Amostras que necessitam de processamento especial

Complemento

Congelar a 20C at 2 horas aps colheita

Crioglobulinas Colhido em tubo morno, estril e sem anticoagulante Mantido a 37C at ser testado

Prof. Doutor Jos Cabeda

Tcnicas de Imunologia

O que deve acompanhar a amostra

Identificao completa do doente no tubo e na requisio (ou cdigo claro e unvoco) Sexo, data de nascimento Exame requisitado Patologia suspeita Tipo de amostra Data e hora da colheita Nome,cdigo e assinatura do Mdico requisitante

Prof. Doutor Jos Cabeda

Tcnicas de Imunologia

Razes de rejeio de amostras

Colheita inapropriada

Tubo errado Condies de manuteno/transporte incorrectas Informao incorrecta/ilegvel no tubo Informao no tubo discordante da requisio Hemlise Volume insuficiente Amostra coagulada (em tubo com anticoagulante)

Prof. Doutor Jos Cabeda

Tcnicas de Imunologia

Tcnicas baseadas em Imunoglobulinas

Ligao dos anticorpos especfica Anticorpos podem ser conjugados com um vasto leque de enzimas e marcadores

Constituem excelentes reagentes para a identificao sensvel e especfica de ligandos Permitem o estudo do historial imunolgico de um ndivduo

Prof. Doutor Jos Cabeda Tcnicas de Imunologia

Anticorpos como reagentes

Preparao de Anticorpos policlonais Inoculao/estimulao de animais Adjuvantes Que animal Que via de inoculao/estimulao Colheita, preparao e teste do soro Estimulao repetida leva a uma maturao da especificidade do Ab
Prof. Doutor Jos Cabeda Tcnicas de Imunologia

Anticorpos como reagentes

Preparao de anticorpos monoclonais Estimular animais como anteriormente Colher Linfoblastos B Fazer experincias de diluio limite Preparar hibridomas com estas clulas Fazer experincias de diluio limite dos hibridomas Testar cada clone para especificidade
Prof. Doutor Jos Cabeda Tcnicas de Imunologia

Tcnicas em Imunologia
Parte I Mtodos Laboratoriais em Imunologia

Prof.Doutor Jos Cabeda

Tcnicas de Imunologia

Tcnicas baseadas em imunoglobulinas

Ensaios Liqudos (ensaios homogneos)

Ensaios Slidos (ensaios heterogneos)

Difrao da luz Nefelometria turbidimetria Outros ensaios liquidos EMIT CEDIA Imunofluorescncia Aglutinao Quimioluminescncia

ELISA Competitivo No-competitivo indirecto RIA

Prof. Doutor Jos Cabeda

Tcnicas de Imunologia

Tcnicas baseadas na difraco da luz

Nefelometria

Imunoturbidimetria

Baseada na reaco de imunoprecipitao Mede a quantidade de luz difractada devido presena de complexos imunolgicos O ngulo de difraco e o comprimento de onda so aspectos importantes 31 permite melhor razo sinal/rudo

Baseada na reaco de imunoprecipitao Mede a diminuio de luz que consegue atravessar uma soluo na presena de complexos imunolgicos O detector est sempre alinhado com a fonte de luz (0), pelo que a medida no da luz difractada, mas da no difractada

Prof. Doutor Jos Cabeda

Tcnicas de Imunologia

Curva de imunoprecipitao

Assumindo: Ig pelo menos bivalentes IgG Antignio com pelo menos 2 epitopes Se Ab em excesso, um aumento de Ag implica um aumento da reaco Se Antignio em excesso, um aumento de antignio diminui a probabilidade de um Ab ligar 2 antignios, o que diminui a precipitao A quantificao s possvel se o anticorpo estiver em excesso

Prof. Doutor Jos Cabeda

Tcnicas de Imunologia

Cintica da Curva de imunoprecipitao

A reaco inicia-se imediatamente, sendo visivel 20s aps a adio do antignio A reaco prossegue de modo aproximadamente linear at que a precipitao dos complexos origina uma aparente diminuio da reaco

Prof. Doutor Jos Cabeda

Tcnicas de Imunologia

Rate Nephelometry

[Ab] constante Aumento progressivo da [antignio] Deve ser realizada na zona de excesso de Ab Em nefelmetros automticos deste tipo, 2 [antig] so inicialmente ensaiadas. Dependendo do resultado: So testadas novas [] testada o excesso de antig

Prof. Doutor Jos Cabeda

Tcnicas de Imunologia

End-point nephelometers

Medida no ponto mximo da reaco Medida de branco ou no inicio da reaco Valor intrapolado de uma curva de calibrao Variaes Particle enhanced
Tcnicas de Imunologia

Prof. Doutor Jos Cabeda

Particle enhanced nephelometry

So utilizadas particulas de latex conjugadas com anticorpo ou antignio competidor Aumento de sensibilidade

Prof. Doutor Jos Cabeda

Tcnicas de Imunologia

Ensaios

Requisitos Qualquer fluido Soro Plasma Urina CSF Deve ser diludo (para no interferir na leitura) Amostras ricas em lipdios devem ser clarificadas por filtrao ou ultracentrifugao Amostras ictricas ou hemolisadas No afectam a nefelometria Afectam a turbidimetria
Prof. Doutor Jos Cabeda Tcnicas de Imunologia

Outro ensaios homogneos

CEDIA (Cloned enzyme donor assay) b-galactosidade em 2 fragmentos inactivos enzyme donnor Enzyme acceptor A reaco imune junta-os activando a enzima. Se no houver antignio o anticorpo liga-se enzima inactivando-a

EMIT (Enzyme multiplied immunoassay technique) Aumento ou diminuio da actividade enzimatica com a reaco Ag-Ab

Prof. Doutor Jos Cabeda

Tcnicas de Imunologia

Imunofluorescncia

Anticorpos conjugados com compostos fluorescentes Conjugado utilizado como revelador directo Aumento de 10 a 1000 vezes na sensibilidade Grande aumento na rapidez de deteco Vantagens relativamente RIA: To sensivel Reagentes mais estveis Mais fcil de implementar

Prof. Doutor Jos Cabeda

Tcnicas de Imunologia

Principais fluorocromos utilizados

Prof. Doutor Jos Cabeda

Tcnicas de Imunologia

Tcnicas de imunofluorescncia (I)

Directas Anticorpo directamente conjugado Indirectas Anticorpo secundrio conjugado Acopladas Duas reaces acopladas Fluorescence polarization immunoassay Baseia-se no aumento na polarizao da luz emitida quando um antignio-FITC forma complexos imunes, o que se deve s restries ao movimento rotacional do antignio no complexo
Prof. Doutor Jos Cabeda Tcnicas de Imunologia

Tcnicas de imunofluorescncia (II)

Fluorescent Quenching assay Mtodo competitivo directo que utiliza [ab] fixa Competio para o ab entre o antignio marcado e o no marcado (a testar) A fluorescncia absorvida (quenched) quando o antignio marcado se liga ao anticorpo A intensidade de fluorescncia uma medida da quantidade de antignio no marcado que competiu para o anticorpo Mtodo indirecto

Prof. Doutor Jos Cabeda

Tcnicas de Imunologia

Tcnicas de imunofluorescncia (III)

Substrate labelled Fluorescent immunoassay Mtodo indirecto Analito ligado a um modulador que influencia o sinal gerado Actividade do modulador influenciada pela ligao do Ab

Prof. Doutor Jos Cabeda

Tcnicas de Imunologia

Tcnicas de imunofluorescncia (IV)

Fluorescent energy transfer immunoassay Mtodo competitivo Analito conjugado com FITC Anticorpo ligado a Rodamina Se o analito conjugado ligar ao anticorpo, por ressonncia a energia do FITC excita a rodamina Se por competio, o analito impedir o anticorpo de se ligar ao conjugado, no haver excitao da rodamina

Prof. Doutor Jos Cabeda

Tcnicas de Imunologia

Problemas da imunofluorescncia

Autofluorescencia Proteinas do soro (320350nm) Bilirubina (430-470nm) Urina apresenta elevada linha de base Para obviar a estes problemas pode-se Tratar a amostra com Enzimas proteoliticas Agentes oxidantes Agentes desnaturantes

Quenching Bilirrubina Hemoglobina Fotodestruio Diminuio da fluorescncia ao longo da excitao

Prof. Doutor Jos Cabeda

Tcnicas de Imunologia

Aglutinao

Baseada na reaco ag-ab Observada visualmente Tipos: Directa (ABO) IgM aglutina vrias RBC IgG necessita de reagente de Coombs (anti-human-ab) para fazer a ponte Indirecta ou passiva Antignio ligado a subtncia inerte Reversa Anticorpo ligado a substncia inerte
Tcnicas de Imunologia

Prof. Doutor Jos Cabeda

Aglutinao de partculas

Mais sensiveis que a aglutinao Mensurvel por nefelometria, turbidimetria, contagem de particulas Anticorpo ou antigneo conjugado com particulas de ltex Reaco ag-ab aglutina as particulas que saem de soluo A medida das partculas em soluo inversamente proporcional ao titulo a determinar
Prof. Doutor Jos Cabeda Tcnicas de Imunologia

Ensaio quimioluminescente

Produo de luz por uma reaco quimica, habitualmente uma reaco de oxidao-reduo O modo mais sensvel de deteco em imunoensaios (atomole=10-18 a zeptomole=10-21) Compostos utilizados: Esteres de acridina (deteco do NaOH e H2O2) Limite de deteco de 0.5 atomoles Derivados do isoluminol (deteco com H2O2 e um catalizador) Limite de deteco de 50 atomoles

Prof. Doutor Jos Cabeda

Tcnicas de Imunologia

Enzimas utilizadas em ensaios quimioluminescentes

Prof. Doutor Jos Cabeda

Tcnicas de Imunologia

Ensaios em fase slida

ELISA Competitivo

No competitivo-indirecto

Prof. Doutor Jos Cabeda

Tcnicas de Imunologia

Ensaios em fase slida

ELISA Sandwich ou de captura

Prof. Doutor Jos Cabeda

Tcnicas de Imunologia

Resolver problemas do ELISA

Prof. Doutor Jos Cabeda

Tcnicas de Imunologia

Electroforese de Imunoglobulinas
Electroforese em agarose de alta resoluo Imunofixao Imunosubtraco Electroforese capilar

Prof. Doutor Jos Cabeda

Tcnicas de Imunologia

Electroforese de Ig em agarose

Electroforese + Corar com Ponceau S e secar

Prof. Doutor Jos Cabeda

Tcnicas de Imunologia

Imunofixao

Electroforese Aplicao de tira de acetato decelulose com anticorpo monoespecifico para cada cadeia de Ig. Forma-se um precipitado onde houver Ig correspondente Proteinas no pp so lavadas Corar os pp com amido black nigrosin

Prof. Doutor Jos Cabeda

Tcnicas de Imunologia

Imunosubtraco

Prof. Doutor Jos Cabeda

Tcnicas de Imunologia

Crioglobulinas (I)

Tipo I Monoclonal (IgG, IgM, IgA, raramente c.leves) Tipo II Mistas (2 ou mais Ig, sendo uma monoclonal) Tipo III Policlonal

Prof. Doutor Jos Cabeda

Tcnicas de Imunologia

Crioglobulinas (II)

Prof. Doutor Jos Cabeda

Tcnicas de Imunologia