Iniciao de Proximal-Distal Padronizao no membro vertebrado por sinais e crescimento

Duas

grandes classes de modelos tm sido propostas para explicar a padronizao da proximal e distal eixo do membro vertebrado (do ombro para as pontas do dgito).

Demonstramos que cedo membro mesnquima no pintinho mantida inicialmente em um estado capaz de gerar todos os segmentos do membro atravs da exposio a uma combinao de proximal e sinais distais. Como cresce o broto do membro, o membro proximal estabelecido atravs de continuo exposio a sinais derivados de flanco.

sistema que desenvolvemos, combinando cultura in vitro e in vivo, abre a porta para um novo nvel de anlise de padronizao mecanismos no membro.

 De

maneira geral, os modelos de proximal distal Padronizao (PD) pode ser dividida em duas classes gerais. Um, exemplificado pelo progresso zona de modelo (1), postula a distalizao progressiva do membro padro, baseado em uma mecanismo inerente para o indiferenciado clulas de mesenquimais.

 Os

segundo postulado, que esto programadas instrutivas de tecidos circundantes responsvel por especificar os segmentos de PD (2, 3).

 Aqui

ns tentamos enderear esta questo, centrandose sobre a criao do segmento mais proximal, como distintas o membro mais distal.

 Para

clarificar as funes dos sinais jogar na padronizao de PD, ns temos aproveitado das condies descritas recentemente que permitem que um membro germine clulas a serem mantidos e manipulados em um estado indiferenciado in vitro.

expresso de marcadores de PD em estas cultivadas clulas no foi examinado. Considerando que nenhum dos conhecidos segmentares marcadores so eles prprios necessrios para a especificao de PD em fases posteriores, durante o desenvolvimento in vivo, Meis1, Hoxa11 e Hoxa13 respectivamente.

 Usamos

a transcrio reversa quantitativa reao em cadeia da polimerase (RT-PCR) para detectar estas desenvolve expressa marcadores de membro nas clulas cultivadas in vitro (8). Tem sido proposto que clulas caindo fora do alcance de sinais distais no broto de membro tornam-se fixos em seu padro de PD como eles comeam a diferenciar

Quando primeiro colocado em cultura com soro sozinho, mantida este perfil no incio da diferenciao como Sox9foi acima-regulada, antes da formao da cartilagem ndulos. Em contraste, que encontramos sobre clulas de tempo cultivadas com Wnt3a e FGF8 perdeu expresso do marcador proximal, Meis1, e expresso acima-regulada do Hoxa11, um marcador de o segmento de membro mdio, seguido por um distal marcador, Hoxa13, semelhante a um perfil de expresso clulas distais de um broto de membro intacto.

FIG. 1. W NT3A, FGF8 E RA AGIREM EM CONJUNTO PARA MANTER OS MARCADORES DE INCIO MESNQUIMA MEMBRO NA CULTURA. DISSOCIADO FRESCO HH18 CLULAS DO BROTO DE MEMBRO DISTAL FORAM CULTIVADAS COM SORO SOMENTE (SORO), SORO W NT3A E FGF8 (WF), OU SORO W NT3A, FGF8 E RA (ADR) PARA AUMENTAR A QUANTIDADE DE TEMPO. (A) SOX9, (B) MEIS1,(C) HOXA11 E OS NVEIS DE EXPRESSO DE HOXA13 (D) FORAM MEDIDOS POR PCR QUANTITATIVO E NORMALIZADOS PARA EXPRESSO DE B-ACTINA.

Clulas do broto de membro in vivo, no incio tambm esto expostas.a RA de flanco alm de FGF and Wnt atividade. RA foi mostrado anteriormente, para induzir Expresso Meis1 e tem sido proposto para agircomo um sinal de padronizao proximal (2, 3). Quando as clulas do membro primrio foram cultivadas com todos os trs fatores e, portanto, expostos a uma sinalizao comparvel ao que visto por mesnquima de broto de membro precoce, Meis1 expresso foi mantida e Hoxa11 e Hoxa13No foram acimaregulada (Fig. 1).

 Em

contraste, as clulas cultivadas com Wnt3a, FGF8 e RA permanecem indiferenciadas enquanto a expresso de genes caracterstica a mesnquima precoce do membro mantida. Em doses mais elevadas, FGF8 aparenta superar o efeito da RA de forma limitada,o que resulta em uma diminuio parcial da expresso Meis1e um aumento concomitante no Hoxa11expresso (fig. S1).

Para avaliar diretamente o potencial do desenvolvimento de culturas de clulas primrias aps a exposio a vrias combinaes de sinais, fizemos uso de um clssico tcnica referida como construir um Membros recombinantes, feitos de mesnquima membro cultivadas sob diferentes condies, foram pela primeira vez avaliados 3 dias aps a enxertia para determinar como expresso dos marcadores de segmentar resolvido em Essa configurao in vivo.

FIG. 2. EXPRESSO DE MEIS1, HOXA11 E HOXA13 DELINEAR DOMNIOS SEGMENTARES EM MEMBROS RECOMBINANTES. TODA A MONTAGEM HIBRIDAO IN SITU COM MEIS1, HOXA11 E HOXA13 SONDAS DE 72 HORAS APS A ENXERTIA. (A PARA C) RECOMBINANTS USANDO RECENTEMENTE DISSOCIADO HH18 MEMBRO POSTERIOR CLULAS. (D A F) RECOMBINANTS USANDO HH18 MEMBRO POSTERIOR CLULAS CULTIVADAS POR 36 HORAS EM WNT3A E FGF8. (G I) RECOMBINANTS USANDO CLULAS DE MEMBRO POSTERIOR DE HH18 CULTIVADAS POR 36 HORAS NA PRESENA OFW NT3A, FGF8 E RA BARRAS DE ESCALA: 500 MMIN (A) A (C) E 800 MM EM (D) PARA (I).

Assim, um membro mesnquima cultivadas sem RA desliga Meis1 expresso in vitro e no reativar sua expresso quando reexposto para flanquear os sinais em vivo. No entanto, recombinantes feita a partir de clulas expostas a Wnt3a,FGF8 e RA em cultura continuam a expressarMeis1 proximalmente, Hoxa11 centralmente e Hoxa13distalmente recombinantes comparveis ao fresco de (Fig. 2, G a I),e os botes de membro normal.

Em contraste, primrio clulas de membro cultivadas por 36 horas withWnt3a,FGF8 e RA e depois analisada em recombinante Membros deram origem a vrios segmentos bem formados,semelhantes aos produzidos em recombinantes feitas com fresco HH18 mesnquima, embora normalmente menor em tamanho e, muitas vezes, exibindo uma curva ou ruptura no ponto mais fino no meio da segundo segmento esqueltico (Fig. 3B e tabela S1).

FIG. 3. W NT3A, FGF8, E RA MANTER JUNTOS O POTENCIAL DAS CLULAS PARA FORMAR O EIXO COMPLETO DO PD. (A). DISSOCIADA NA HORA HH18 MEMBRO POSTERIOR CLULAS FORMARAM TRS SEGMENTOS DISTINTOS MEMBRO 14 DIAS APS A ENXERTIA. EMBORA NO MOSTRADO, PROXIMAL E SEGMENTOS MDIOS FORAM COBERTOS COM PENAS, E DGITOS COM GARRAS TERMINAIS FORAM COBERTOS POR ESCAMAS. (C E D) CLULAS CULTIVADAS PARA 36 HORAS NA PRESENA DE W NT3A E FGF8 (WF) PERDEU A CAPACIDADE PARA FORMAR TODOS OS MAS UMA NICA ESCALACOBERTO DGITO, ESTENDENDO-SE DESDE UMA CARTILAGEM NDULO INCORPORADONO FLANCO (N25 DE 28 COM UM SEGMENTO). (B E E A H) CLULAS CULTIVADAS 36 HORAS EM W NT3A, FGF8, ANDRA (ADR) FORMADO UMA ALONGADA FEATHERCOVERED SEGMENTO PROXIMAL, UMA PENA CURTACOVEREDMIDDLE SEGMENTO E UM SCALECOVERED DGITO COM UM TERMINAL GARRA (N 13 FORA DE 24WITH TRS SEGMENTOS). F, FMUR; TF, TBIA E FBULA; M,METATARSO; 36D, DGITOS. ESCALA BARES: 5 MM EM (A) E (E), 2,5 MM EM (B) E (C), 1,6 MM EM (D) E 1 MM EM (F) E (H).

Da mesma forma, os membros recombinantes gerados do mesnquima de perna recm dissocia da HH18 formaram de elementos proximais coberto de penas e coberto de escala ps com garras, outro dgito especfico estrutura. Os elementos que identificamos como dgitos noos recombinants feitas aps cultura com Wnt3ae FGF8 invariavelmente estavam cobertos por escamas e terminou em garras (Fig. 3D). Da mesma forma, o multi segmented recombinantes produzidos por clulas cultivadas em Wnt3a, FGF8 e RA exibidos escalas apenas sobre os elementos distais que identificamos como dgitos,tambm terminando em garras (Fig. 3, E a H).

Embora Esta abordagem identifica o mais distal elemento como dgito, ambos os segmentos proximais de recombinants feitas com clulas cultivadas em todos os trs fatores so exclusivamente cobertos de penas.Seo in situ deteo de Meis1 em torno da cartilagem proximala maioria de recombinants colhidas Depois de 4 dias no ovo delineia claramente este elemento como stylopod (fig. S4).

FIG. 4. POTENCIAL

PD RESTRITA PELO TEMPO GASTO PARA FORA A INFLUNCIA DE R. (A) RECOMBINANTS FEITA DE HH24 MEMBRO POSTERIOR CLULAS. (B) RECOMBINANTS DISTAL HH24 CLULAS CULTIVADAS PARA 36 HORAS EM WNT3A, FGF8 E RA (ADR) (N. 8). (C E D) RECOMBINANTS DE HH18 CLULAS CULTIVADAS PARA 18 SEGUIRAM DE HORAS NA PRESENA DE TODOS OS TRS FATORES EM 18 HORAS, COM W NT3A E FGF8 (WF) QUE SE ASSEMELHAVA RECOMBINANTS ENXERTADOS IMEDIATAMENTE DEPOIS DA CULTURA EM W NT3A E FGF8 PARA N 18 HORAS (C) 28; (D) N 12. (E E F) HH18 CLULAS CULTIVADAS POR 12 HORAS EM TODOS OS TRS FATORES SEGUIRAM POR 24 HORAS EM W NT3A E RECOMBINANTS FGF8 FORMADA QUE SE ASSEMELHASSE A AQUELES CULTIVADAS POR 24 HORAS NA SOZINHO DOIS FATORES (E) N 12. O; (F) N 9. BARRAS DE ESCALA: 1,5 MM EM (A) E (B) E 1 MM EM (C) A (F).
DE RECM DISSOCIADA DISTAL

 Na

verdade as clulas cultivadas em qualquer Wnt3a e FGF8 ou Wnt3a, FGF8 e RA Divida com um tempo de ciclo celular de ~ 11 horas (11.43 T1.4 horas e 10.82 T 1,25 horas, respectivamente)(filme S1), comparvel ao que tem sido relatado para incio dos membros mesnquima in vivo (17, 18).

 Embora

a combinao de Wnt3a, FGF8,e RA no pode reverter uma vez especificao de dgito comea, nossos dados indicam que esses fatores so suficiente para manter as primeiras mesenquimais membro em um estado capaz de dar aumento para o padro completo de PD.

Propomos que o gatilho para iniciar a processo de especificao do zeugopod eautopod a cessao (devido ao deslocamento) deExposio de RA. Se este modelo est correto, em seguida, clulas inicialmente cultivadas com Wnt3a, FGF8 e RA,e, portanto, realizada em um membro cedo mesnquima-comoEstado, deve comear a perder a capacidade para formar in vitro, assim como RA proximais estruturas removidos da mdia. Na verdade, achamos que primria mesnquima de broto de perna HH18 cultivada para18 horas em todos os trs fatores e, em seguida, por 18 horas em apenas Wnt3a e FGF8 desenvolveram dois segmentos,comparveis para as clulas primrias analisadas imediatamente depois da cultura para 18 horas inWnt3a eFGF8 .

Da mesma forma, um HH18 membro clulas cultivadas por 12 horas em todos os trs fatores, seguidos de inWnt3a 24 horas e sozinho FGF8 formaram um dgito com um mais curto elemento proximal semelhante aos analisada aps cultura em Wnt3a e FGF8 por 24 horas.

CONCLUSO

Esses dados sugerem fortemente que a exposio ao combinado de atividades ofWnt3a, FGF8 e RAno incio boto membro ou na cultura mantm o potencial para formar estruturas proximais e distais.Como o membro broto cresce, as clulas proximais cair fora do alcance de sinais distais que agem, em parte,para manter as clulas indiferenciadas (7). Clulas mais pertopara o flanco, portanto, diferenciar e formar proximal estruturas sob a influncia de proximal sinais.