Cromatografia

Universidade Federal de Pernambuco

Departamento de Qumica Fundamental
Qumica Analtica
Universidade Federal de Pernambuco
Departamento de Qumica Fundamental
Qumica Analtica
Introduo
Cromatografia
Tcnica de separao e anlise de misturas por interao
dos seus componentes entre uma fase estacionria
e uma fase mvel
M.Tswett (1903), 1 experimento de Cromatografia
com plantas para separar seus pigmentos.

fase estacionria inulina (carboidrato)
CaCO
3
ou a sacarose (mais tarde)
fase mvel hidrocarboneto

A separao em bandas coloridas fez a tcnica chamar-se
de cromatografia.
cromatos (grego) significa cor
Classificao dos Mtodos Cromatogrficos
Classificao Geral Mtodo
Especfico
Fase estacionria Tipo de Equilbrio
Cromatografia lquida (CL)
(fase mvel:lquido)
Lquido-lquido ou
partio
Lquido adsorvido em um slido Partio entre lquidos
imiscveis
Fase lquido-ligado Espcies orgnicas ligadas a uma
superfcie slida
Partio entre lquidos e
superfcie ligada
Lquido-slido ou
adsoro
Slido Adsoro
Troca inica Resina de troca inica Troca inica
Excluso por
tamanho
Lquido em interstcios de slido
polimrico
Partio/filtrao
Cromatografia gasosa (CG)
(fase mvel:gs)
Gs-lquido Lquido adsorvido em um slido Partio entre gs e lquido
Fase gs-ligado Espcies orgnicas ligadas a uma
superfcie slida
Partio entre lquidos e
superfcie ligada
Gs-slido Slido Adsoro
Cromatografia com fluido
supercrtico(CFS)
(fase mvel:fluido supercrtico)
Espcies orgnicas ligadas a uma
superfcie slida
Partio entre fluido
supercrtico e superfcie
ligada
Principais tipos de Equilbrio
soluto adsorvido
na superfcie da
fase estacionria
Adsoro
Partio
Troca inica
Excluso
molecular
Afinidade
Seo transversal
de uma coluna capilar
soluto dissolvido
na fase lquida
ligada superfcie
da coluna
As molculas
maiores so
excludas
As molculas
pequenas penetram
nos poros das partculas
Um tipo de molcula na mistura
complexa torna-se ligada molcula
que est covalentemente
ligada fase estacionria
Todas as outras
molculas
so simplesmente
descartadas
nions mveis mantm
perto de si, ctions que esto
covalentemente ligados
fase estacionria
Resina de troca inica;
apenas os nions so
Atrados para ela
A+B
B
A
B
A
B
A B
amostra fase mvel
coluna
empacotada
detector
t
0
t
1
t
2
t
3
t
4
S
i
n
a
l

d
o

d
e
t
e
c
t
o
r
Tempo
A+B
B
A
B
A
B
A B
amostra fase mvel
coluna
empacotada
detector
A+B
B
A
B
A
B
A B
amostra fase mvel
coluna
empacotada
detector
t
0
t
1
t
2
t
3
t
4
S
i
n
a
l

d
o

d
e
t
e
c
t
o
r
Tempo
t
0
t
1
t
2
t
3
t
4
S
i
n
a
l

d
o

d
e
t
e
c
t
o
r
t
0
t
1
t
2
t
3
t
4
S
i
n
a
l

d
o

d
e
t
e
c
t
o
r
Tempo
Eluio cromatogrfica em coluna
A amostra transportada por uma fase mvel
Ex.: gs, lquido ou fluido supercrtico
A fase mvel forada atravs de uma
fase estacionria imiscvel fixa, colocada
na coluna ou em uma superfcie slida
Os componentes que so mais fortemente retidos
na fase estacionria movem-se muito lentamente
no fluxo da fase mvel, enquanto que aqueles
que se ligam mais fracamente, movem-se
mais rapidamente
Os componentes da amostra se separam em bandas
ou zonas discretas que podem ser analisados
qualitativamente e/ou quantitativamente
Eluente = fase mvel
Eluato = espcie que sai da coluna (A e B)
Fase estacionria
(coluna empacotada)
Velocidade de Migrao de Solutos
Constantes de Distribuio

Tempo de Reteno

Fator de reteno (Velocidades de Migrao do soluto)

Fator de separao (Velocidades Relativas de Migrao)

A eficincia de uma coluna cromatogrfica depende das
velocidades relativas nas quais as duas espcies eluem.
Constante de Distribuio (K)
A
mvel
A
estacionria
K
C
E
concentrao molar do soluto na fase estacionria
C
M
concentrao molar do soluto na fase mvel
Tempo de Reteno (t
R
)
Tempo que a amostra leva para
chegar ao detector
espcie
no retida
espcie
retida
M
t
L
u =
R
t
L
= v
velocidade de
migrao das
espcies no retidas
velocidade mdia
de deslocamento
das molculas na
fase mvel
M
E
C
C
K =
Tempo Morto(t
M
)
Tempo que a amostra leva para passar
pela coluna
Velocidade de Migrao de Solutos
Fator de Reteno (k)
2 < k < 10
M
M R
t
t t
k

=
'
Fator de Separao (o )
( )
( )
M A R
M B R
t t
t t

= o
A
B
K
K
= o
Alargamento da Zona Cromatogrfica
e Eficincia da Coluna
Alargamento da Zona cromatogrfica

Eficincia de uma coluna

Variveis cinticas que afetam eficincia da coluna

Fatores que influenciam no Alargamento da Zona
O tempo gasto em uma fase irregular
(depende do ganho acidental de energia trmica)
O tempo de residncia em uma fase (curto ou longo)
A velocidade de movimento das molculas varia consideravelmente
Algumas molculas viajam rapidamente devido a incluso
acidental na fase mvel
Algumas molculas podem ser incorporadas na fase
estacionria por um tempo acima da mdia
flui mvel fase a qual na velocidade
coluna na residncia de tempo
banda uma de Largura =
Eficincia de uma coluna
A eficincia da coluna aumenta medida que o nmero de
pratos (N) torna-se maior e a altura do prato diminui.
H
L
N =
Onde,
H = Altura equivalente a um prato terico
N = Nmero de pratos tericos
L = Comprimento da coluna empacotada
De onde vm os termos nmero de pratos
tericos e altura do prato ?
De um estudo terico feito por Martin e Synge no qual trataram
uma coluna cromatogrfica como uma coluna de destilao
soluto
(fase mvel)
soluto
(fase estacionria)

O movimento do soluto coluna abaixo tratado como
uma transferncia em passos da fase mvel em
equilbrio, de um prato para o prximo
pratos discretos pratos tericos
Nmero de Pratos Tericos (N)
Altura do Prato (H)
As zonas ou bandas cromatogrficas
possuem o formato de uma curva
Gaussiana onde a largura est
diretamente ligada com a variana o
2

ou desvio-padro o
A altura do prato o comprimento da coluna que contm
uma frao do analito entre Lo e L (34% do analito)
L
H
2
o
=
N

m
e
r
o

d
e

m
o
l

c
u
l
a
s
L
(L-1o) (L+1o)
Perfil do analito no
final da fase estacionria
Distncia percorrida
Fase estacionria
L
Entrada da amostra Detector
34 % do analito
N

m
e
r
o

d
e

m
o
l

c
u
l
a
s
L
(L-1o) (L+1o)
Perfil do analito no
final da fase estacionria
Distncia percorrida
Fase estacionria
L
Entrada da amostra Detector
Distncia percorrida
Fase estacionria
L
Entrada da amostra Detector
34 % do analito
Variveis Cinticas que afetam o
Alargamento da Zona
Varivel Smbolo Unidades
Usuais
Velocidade linear da fase mvel u cm.s
-1
Coeficiente de difuso na fase mvel D
M
cm
2
.s
-1
Coeficiente de difuso na fase estacionria D
E
cm
2
.s
-1

Fator de reteno k adimensional
Dimetro da partcula da fase estacionria d
p
cm
Espessura da camada de lquido que recobre
a fase estacionria
d
f
cm
Cu u B A H + + =
( )u C C u B A H
M E
+ + + =
Difuso longitudinal (B/u) Difuso do soluto do centro concentrado de uma zona para
regies mais diludas, a frente e atrs do centro da zona (na regio paralela e oposta ao
fluxo da fase mvel)
Caminhos mltiplos (A) mltiplos caminhos que a a molcula ou on pode encontrar
atravs da fase estacionria
Coeficiente de transferncia de massa (Cu) O equilbrio entre a fase estacionria e a
fase mvel estabelecido to lentamente que uma coluna cromatogrfica opera sempre
sob condies de no-equilbrio.
C
E
u = freqncia mdia com que as molculas do analito alcanam a interface na qual pode
ocorrer a transferncia para a fase mvel
C
M
u= freqncia mdia com que as molculas do analito alcanam a interface na qual pode
ocorrer a transferncia para a fase estacionria
Equao de van Deemter
Processo
Caminhos mltiplos de fluxo
Difuso longitudinal
Transferncia de massa para e
da fase lquida estacionria
Transferncia de massa na fase
mvel
Relao entre Altura do Prato e o tipo de coluna
Cu u B A H + + =
Otimizao da Eficincia da Coluna
Reduo do alargamento da zona

Alterao das velocidades relativas de migrao dos
componentes
Uma separao cromatogrfica otimizada com a variao
das condies experimentais at que os componentes de uma
mistura sejam claramente separados com o consumo mnimo
de tempo
Os experimentos visam:
Variveis que afetam a Resoluo da Coluna

Variao de N

Variao de H

Variao do fator de reteno

Variao do fator de separao
Resoluo da Coluna R
E
Fornece uma medida quantitativa da sua
habilidade de separar dois analitos
B A
R R
E
W W
t t
R
+

=
A B
) ( ) (
Efeito da Reteno sobre a Resoluo
4 ' 1
' '
B
A B
N
k
k k
R
E

+

=
2 2
2
)
'
' 1
( )
1
( 16
B
B
E
k
k
R N
+

=
o
o
Efeito do Fator de Separao
sobre a Resoluo
Fornece apenas uma pea de informao qualitativa
acerca de cada espcie em uma amostra (presena ou
ausncia).

Exige confirmao por outros mtodos.

Dados adicionais podem ser obtidos com diferentes fases
mvel e estacionria.

um precursor crucial de anlises espectroscpicas
qualitativas
Anlise Qualitativa
Aplicao da Cromatografia

Anlise baseada em Altura de Pico
(H
pico
o 1/L
pico
)

Anlise baseada em reas de Picos
(integradores, planmetros ou recorte da rea)

(A
pico
independe L
pico
)

Calibrao e Padres
(curva de calibrao de padres de composio prxima a da amostra)

Mtodo do Padro Interno
(injeo de padro junto com a amostra e compara as reas)

Mtodo da Normalizao da rea
(compara-se a rea total de todos os picos eludos e corrigidos de acordo
com as suas diferentes respostas no detector, com a rea individual do
pico do analito)
Anlise Quantitativa
Aplicaes Prticas da Cromatografia

QUMICA:
Determinao de antioxidantes, nutrientes ou contaminantes
em alimentos
SADE:
Anlises dos constituintes do sangue
Anlise forense
AMBIENTE:
Determinao de resduos de pesticidas em produtos
alimentares, guas ou esgotos
Determinao de gases e solventes orgnicos na atmosfera,
solos ou rios
Cromatografia Gasosa
Universidade Federal de Pernambuco
Departamento de Qumica Fundamental
Qumica Analtica
Separao de componentes de uma amostra por partio entre uma
fase mvel, gasosa, e uma fase estacionria, filme de lquido no voltil,
dispersa superfcie de um suporte slido
Cromatografia Gasosa
Cromatografia gs-lquido
Cromatografia gs-slido
Na cromatografia gasosa a fase mvel um gs inerte. A fase mvel no
interage com o analito. Sua nica funo transport-lo atravs da
coluna
Separao de componentes de uma amostra por partio entre uma
fase mvel, gasosa, e uma fase estacionria, absorvente slido
Ela aplicvel a substncias volteis (ou substncias que
facilmente se podem transformar em substncias volteis)
Princpios da Cromatografia Gasosa
Volume de Reteno
Para se levar em conta os efeitos da presso e da temperatura til
se considerar os volumes de reteno em vez do tempo de reteno
F t V
R R
= F t V
M M
=
F = a vazo volumtrica mdia dentro da coluna
V e t = so os volumes e o tempo de reteno
R e M = espcies retida e no-retida pela coluna
Medida da vazo volumtrica mdia do gs dentro da coluna (F)
( )
P
P P
T
T
F F
O H
C
m
2

=
T
C
= temperatura da coluna em Kelvin
T = temperatura do medidor(T ambiente)
F
m
= velocidade do fluxo medida
P = presso do gs no final da coluna(P ambiente)
Princpios da Cromatografia Gasosa
( )
C
M R
g
T W
t t jF
V
273

=
Volume de Reteno Especfico (V
g
)
Como a presso dentro da coluna uma funo no linear ento
os volumes de reteno devem ser corrigidos por um fator de
correo da queda de presso j
V
g
= volume do gs
W = massa da fase estacionria
T
c
= Temperatura em Kelvin
Relao entre V
g
e K
C E
g
T
K
V
273
=

E
= densidade do lquido que compe a
fase estacionria
k = fator de reteno
Cromatografia Gasosa
A amostra injetada (injetor da amostra) e arrastada pela fase mvel (gs
de arraste) atravs da coluna que contm a fase estacionria (coluna CG
aquecida), onde ocorre a separao da mistura. As substncias separadas
saem da coluna dissolvidas na fase mvel e passam por um detector que
gera um sinal eltrico proporcional quantidade de material separado.

Escolha dos Gases
Devem ser quimicamente inertes
A escolha pode ser em funo do detector
Devem ser eficazes em fazer avanar os analitos na coluna
Devem proteger a coluna de oxignio e gua
Ar ,
Splitter (divisor de amostra)
Possibilidade de rejeitar parte da amostra. Evita a saturao da coluna
(a capacidade de separao das colunas capilares baixa)
Pequeno volume e tempo curto, sem decomposio e sem
alterar as condies da coluna
A injeo exige um elevado grau de preciso
Para uma evaporao total dos componentes da amostra a temperatura do injetor
deve estar a cerca de 50C acima do composto menos voltil. A amostra tem que
estar em forma de vapor ao entrar na coluna (exceto nos injetores on-column)
Sistema de Injeo da amostra
A rapidez da evaporao essencial para evitar a discriminao
Amostras de 0,01 a 50 L (vlvula / seringa)
Universais / splitless / on-column / head-space / autoinjetores
Injetores
Ponta da agulha da
micro-seringa introduzida
no incio da coluna.
Volume injetado depende da coluna, do detector e
do estado fsico da amostra
Amostra injetada
vaporizada instantaneamente
no incio da coluna

Amostra vaporizada
forada pelo gs de arraste
a fluir pela coluna.
Injeo da Amostra
Considerando os dois componentes de separao mais difcil
As colunas empacotadas esto caindo em desuso
Avaliao da qualidade de uma coluna cromatogrfica
Colunas empacotadas e colunas capilares
Colunas
Poder de separao
Capacidade de carga
A determinao destes fatores deve ser rotineira
A resoluo uma boa medida da qualidade
Seletividade
Peso mximo em mg para o qual a coluna mantm 90% do
seu poder de separao
Nmero de pratos tericos por metro
Colunas Empacotadas
Vidro / ao / Teflon - 2 a 6 mm de dimetro interno e de
1 a 3 m de comprimento 500 a 1000 pratos/m
GL - suporte inerte revestido de uma fase lquida no
voltil
Terra de diatomceas - resduos de plantas unicelulares / SiOH
Polmeros porosos - Porapak e Chromosorb (250 C mx.)
GS - suportes slidos adsorventes (crivos moleculares)
Baixa volatilidade
Quimicamente inertes
Colunas Capilares
Slica (revestida com uma fina camada de fase estacionria)
com 0,1 a 0,53 mm DI e 25 a 100 m de comprimento Gs-slido(GS)
Filme lquido (fase estacionria) reveste o interior da coluna
(filmes de 0,1 a 5 m) Gs-lquido(GL)
Tubos capilares (ao, Al,
Cu, plstico, vidro) revestidos
interiormente com um filme
(0,1 e 5 m) de fase
estacionria
(FSOT)
Tubo de slica purificada
(contedo mn. de xidos
metlicos)
Filme (~30m) de suporte
slido (ex. diatomita) e
fase estacionria
Tipo de Colunas Capilares
Filmes espessos so usados para amostras muito volteis (retm solutos
durante mais tempo / melhor separao)
Filmes mais finos so usados para amostras menos volteis
Filme de suporte slido
poroso (ex. polmeros
porosos) e fase
estacionria
Caractersticas das colunas

Capilar Empacotada
Dimetro

Comprimento

Material

Fase
estacionria
0.10 a 0.50 mm

5 a 100 m

Vidro, ao

depositada como filme,
aplicado diretamente s
paredes do tubo
3 a 6 mm

0.5 a 5 m

Vidro ou metal

depositada como filme,
sobre partculas de um
suporte adequado
VANTAGENS DESVANTAGENS
E
m
p
a
c
o
t
a
d
a

Mais econmica

Maior capacidade de carga

Maior quantidade de amostra


Se o material de enchimento no for
colocado na coluna de forma
compacta e uniforme, os espaos
vazios resultantes funcionaro como
cmaras de diluio da amostra.

Menor eficincia

Anlise mais lenta
C
a
p
i
l
a
r
e
s


Maior comprimento maior
eficincia

Separao de misturas complexas

Anlise mais rpida

Maior separao
Capacidade de processamento da
amostra inferior. Satura rapidamente.

Menor quantidade de amostra
Colunas

Cromatogramas Tpicos em Colunas Tubulares Abertas
(tipo WCOT ou PLOT)
Fase Estacionria
a= polidimetil-siloxano
b= fenilmetildimetil-siloxano 5%
c= fenilmetildimetil-siloxano 50%
d= poli(trifuorpropil-dimetil-
siloxano 50%
e= polietilenoglicol
f= poli(cianopropil-dimetil) -
siloxano 50%
Aquecimento da coluna
Faixa de temperatura entre 50 a 450 C
Depende do p.e. da amostra e do grau de separao necessrio
O aumento de temperatura diminui a separao mas diminui
drasticamente o tempo de eluio
Para amostras onde observa-se grande variao de pontos de ebulio deve usar-se
um programa de temperaturas
Rampa por
patamares
Rampa contnua
Isotrmica
Programa de temperaturas
Programa de temperaturas
Isotrmica a 45 C
Isotrmica a 145 C
Temperatura programada: 30 -180C
Caractersticas prximas das dos solutos a serem separados

Selectividade, deve ser um bom solvente diferencial dos componentes
da amostra

Quimicamente inerte relativamente amostra

Pouco viscosa
Pura

Volatilidade baixa (ponto de ebulio 200C acima da temperatura
mxima a utilizar)

Estabilidade trmica

Caractersticas de uma Fase Estacionria
Colunas no polares (BP1; OV1; SE30)
Colunas mediamente polares (BP5; OV-3; SE52)
Colunas polares (BP20; carbowax20M, DBwax)
Fases Estacionrias
Fases Estacionrias
Polaridade de Solutos
til para a separao de substncias no retidas nas colunas Gs-Lquido
(partio) tal como os componentes do ar, sulfeto de hidrognio, dissulfeto
de carbono, xidos de nitrognio, monxido de carbono, dixido de carbono
e gases raros
Cromatografia Gs-Slido (GS)
Adsoro de substncias gasosas sobre superfcies slidas
Podem ser usadas colunas empacotadas ou tubulares abertas (camada
fina de adsorvente fixada na parede interna do capilar)
Polmeros Porosos
Leitos de polmeros porosos (de tamanho de poro uniforme) so fabricados
a partir de estireno com ligaes cruzadas com divinilbenzeno
(Bom para espcies gasosas polares)
Peneiras moleculares
Trocadores de ons de silicato de alumnio cujo tamanho de poro
depende do tipo de ction presente (40/60 at 100/120 mesh)
PLOT
Peneiras moleculares versus Polmeros porosos
Pr-coluna gs-lquido
para separao do CO
2
Coluna de peneira
molecular

Cromatografia Gs-Slido (GS)
Examinam continuamente o material, gerando um sinal na passagem de
substncias que no o gs de arraste
Dispositivo que indica e quantifica os componentes
separados pela coluna.
Detectores
Resposta linear que se estenda por vrias ordens de grandeza

Um intervalo de temperatura que abranja desde a temperatura ambiente at
pelo menos 400C

Resposta rpida independentemente da vazo

Confiabilidade e de fcil uso

Ser altamente sensvel

No ser destrutivo

Boa estabilidade e reprodutibilidade durante grandes intervalos de tempo

Responder a uma grande variedade de compostos com similaridade de
resposta






Caractersticas do Detector Ideal
Universais Geram um sinal para qualquer composto
Seletivos Geram um sinal apenas para compostos com
determinadas caractersticas
Especficos Geram um sinal para compostos que
tenham um determinado elemento na sua estrutura
Classificao dos Detectores
Tipos de Detectores
Condutividade Trmica
Universal
Detecta matria
orgnica e inorgnica
O gs de arraste tem uma condutividade trmica
conhecida.

A resistncia do filamento muda com a condutividade
do gs.

A presena de analitos altera a condutividade trmica
do gs de arraste (H ou He).

A sensibilidade aumenta com a diminuio da
temperatura, do fluxo e da corrente.

Os filamentos queimam na presena de oxignio.
Baseia-se na alterao da condutividade trmica de um fluxo de gs na
presena da amostra
Detector de Ionizao de Chama
O efluente da coluna (amostra+gs de arraste)
misturado com hidrognio e ar e entra em ignio
eletricamente produzindo ons e eltrons que conduzem
eletricidade atravs da chama.

Um potencial de centenas de volts aplicado no eletrodo
coletor gerando uma corrente (sinal).

O nmero de ons grosseiramente proporcional ao
nmero de tomos de carbono reduzidos na chama.

No sensvel a H
2
O, CO
2
, SO
2
e NOx.
Bom para determinar poluentes orgnicos em amostras
de guas naturais.
Quase Universal
Tem uso mais geral sendo til para a anlise
da maioria das amostras orgnicas incluindo
contaminadas por gua e xidos de nitrognio e
enxofre. destrutivo
Detector Terminico
Seletivo com relao a compostos orgnicos com P e N
So detectores por ionizao que utilizam sais de metais alcalinos em
um plasma gerado pela aplicao de um potencial eltrico adequado
em um fluxo de ar e hidrognio.
CsBr, Rb
2
SO
4
queimador
Catalisador
de compostos
contendo N ou P
Detector de Captura de Eltrons
Seletivo
Aplica-se na separao de halogenetos orgnicos, aldedos conjugados,
nitrilas, nitratos e organometlicos (timo para pesticidas)
Gs de arraste ionizado
produzindo eltrons
(N
2
)
de
3
H e
63
Ni
e-
e-
e-
e-
e-
e-
e-
Molculas eluidas da coluna
capturam os eltrons
produzidos pela ionizao
do gs de arraste
Os eltrons so coletados no
anodo gerando uma corrente
amplificada no eletrmetro
Detector de Emisso Atmica
Seletivo
O eluente introduzido em um plasma de hlio energizado por
microondas acoplado a um espectrmetro de emisso ptica
Conjunto
de diodos
O plasma atomiza e excita
todos os elementos da amostra
emisso
Detector de Espectrometria de Massa (GC/MS)
Alguns Detectores de Massa
Detector de massa
Registro tpico de um GC/MS
benzeno
1- ar
2- gua
3- HCN
4-desconhecido
5-acetaldedo
6-etanol
7- acetonitrila
8-acetona
8b-desconhecido
9-CS
2
10-desconhecido
11-desconhecido
12-benzeno
13- tolueno
14- xileno
Aplicaes Prticas
Quimica:
Determinao de antioxidantes, nutrientes ou contaminante
em alimentos
Indstria:
Monitoramento de processos industriais
Sade:
Anlises dos constituintes do sangue
Anlise forense
Ambiente:
Determinao de resduos de pesticidas em produtos
alimentares, guas ou esgotos
Determinao de gases e solventes orgnicos na atmosfera,
solos ou rios

Concluso
A importncia principal deste mtodo a de conseguir
obter separao de misturas complexas

Para uma anlise quantitativa ou qualitativa deve-se
associar a este mtodo outro mtodo analtico como por
exemplo:

Espectrometria de massa
Espectrometria por absoro no infravermelho
Espectrometria de emisso atmica