ANÁLISES

BROMATOLÓGICAS

PROTEÍNAS
EM ALIMENTOS

Profa. Ionara F. R. Vieira

PROTEÍNAS
DEFINIÇÃO
 Substâncias orgânicas complexas (C, H, O, N, S, P,
Fe, Cu, Zn).
 Polímero de alto peso molecular
 Unidade básica: aminoácidos

IMPORTÂNCIA
• nutricional
• propriedades 2
sensoriais
PROTEÍNAS
AMINOÁCIDOS (aa)
 Unidades estruturais básicas das proteínas

3
 AMINOÁCIDOS (AA)

 Cada aminoácido tem uma cadeia lateral (R)

característica, que influencia suas propriedades
físico-químicas.
 Diferenças: tamanho, estrutura e carga elétrica.
 Arranjo tetraédrico  atividade ótica  isômero
LeD
 Só os aminoácidos L são constituintes de proteínas
naturais.
4
 AMINOÁCIDOS (AA)

Apolares ou hidrofóbicas, exemplos:

                                
leucina fenilalanina
alanina

5
valina triptofano metionina
 AMINOÁCIDOS (AA)

Polares ou hidrofílicos, exemplos:

tirosina

serina  ácido aspártico ácido glutâmico

6
asparagina glicina
histidina
PROTEÍNAS

7
PROTEÍNAS

 São polímeros de aminoácidos.

 Vinte tipos de aminoácidos ocorrem naturalmente
nas proteínas.
 Diferem com o tipo, número e seqüência de
aminoácidos na cadeia polimérica, conformação
molecular tridimensional.
 Apresentam 50-55% de C, 20-23 % de O, 14-18
8

% de N,
N 6-8% de H, 0-4 % de S.
PROTEÍNAS
ESTRUTURA DAS PROTEÍNAS

ESTRUTURA PRIMÁRIA
 Seqüência linear de aminoácidos

 Nível estrutural mais importante, dele deriva

todo o arranjo espacial da molécula

 Varia em 3 aspectos: número, seqüência e

natureza dos AA
9
10
PROTEÍNAS
ESTRUTURA SECUNDÁRIA

 Disposição espacial adotada pela cadeia polipeptídica

 Estrutura helicoidal (-hélice) – interações H intra-

moleculares
 Estrutura foliar (folhas pregueadas) – interações H
inter-moleculares

11
PROTEÍNAS
ESTRUTURA TERCIÁRIA

 Organização tridimensional da cadeia polipeptídica

contendo ou não zonas de estrutura secundária
definidas
 Estabilização:
 Ligações dissulfeto (Cys + Cys = cistina)
 interações de hidrogênio
 Interações eletrostáticas
 Interações dipolares
 Interações hidrofóbicas
 Forças de Van der Waals
 Grupos hidrofóbicos dispostos no interior da molécula 12
PROTEÍNAS
ESTRUTURA QUATERNÁRIA

 Resultado de associações não covalentes de unidades

protéicas iguais ou diferentes
 Estas subunidades se mantém unidas por forças
covalentes, como pontes dissulfeto, e ligações não
covalentes, como pontes de hidrogênio, interações
hidrofóbicas, etc.

13
 PROTEÍNAS NO ALIMENTO

 Fonte de aminoácidos na dieta e de energia.

 Aminoácidos essências (lisina, triptofano, metionina,

leucina, isoleucina e valina) não podem ser sintetizados pelo

organismo humano.

 Proteínas alimentares são digeríveis, não tóxicas e

palatáveis. Têm diferentes estruturas moleculares,

atributos nutricionais e propriedades físico-químicas.

14
 PROTEÍNAS
 Responsáveis por compostos aromáticos e substâncias
coloridas formadas por reações térmicas ou
enzimáticas ocorridas durante obtenção, preparação e
armazenamento dos alimentos.

 Componentes estruturais de muitos alimentos

naturais, freqüentemente determinam sua textura, por
exemplo, tenderness de produtos de carne e peixe.
15
 PROTEÍNAS
 Isoladas são usadas nos alimentos como ingredientes
devidos a suas propriedades funcionais, p.e., sua
capacidade de atribuir aparência, textura ou
estabilidade desejáveis ao produto: agentes
gelificantes, emulsionantes, espumantes e
espessantes.

 Alergias e intolerâncias – proteínas de leite, ovos,

castanhas, etc.; celíacos, fenilcetunúricos.
16
MÉTODOS FISICO-QUÍMICOS DE
DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS EM ALIMENTOS

IMPORTÂNCIA

 Conhecer o valor nutritivo

 Determinação da composição centesimal de um
alimento e análise para rotulagem
 Estimar rendimento industrial

 Avaliar a qualidade (ex.: glúten  qualidade da

farinha)
 Avaliar a influência nas propriedades sensoriais 17
 MÉTODOS DE DETERMINAÇÃO

A. Métodos que utilizam a determinação de Nitrogênio:

 Kjeldahl **
 Dumas **
 Destilação direta
 Métodos que utilizam técnicas nucleares: ativação por nêutrons; ativação
por prótons

B. Métodos químicos e físicos

 Reação do Biureto **
 Interação proteína-corante (Dye-binding) **
 Método do Reagente de Folin-Ciocalteau ou Método do fenol reagente **
 Titulação com formol
 Espectroscopia no IV ou no UV **
 Refratometria
 Turbidimetria **
 Espectroscopia eletrônica
 Polarografia 18
Análise de nitrogênio
É a determinação mais utilizada.

Considera que as proteínas têm, em média, 16% de

nitrogênio.

Fator geral (F) na transformação de nitrogênio para

proteínas é de 6,25%.

%Proteinas = F x %N

Fatores de conversão específicos: trigo-5,70; leite-

6,38; gelatina- 5,55. 19
 Proteínas - Kjeldahl
Desenvolvido em 1883 por Johann Kjeldahl.

Não mede proteínas diretamente. A quantidade de

proteínas presentes é calculada a partir da
concentração de N no alimento.

Necessita de um fator de conversão (F) para

converter a medida de N para proteínas.

F = 6,25 (equivalente a 0,16gN/ g proteína) é usado

para muitas aplicações, existem outros fatores de
conversão. 20
KJELDAHL

É o principal método para determinação de

proteínas em alimentos - é padrão e largamente
usado.

Tem alta precisão e boa reprodutibilidade.

O método Kjeldahl é dividido em três etapas:

digestão, destilação e titulação.
21
 MÉTODO KJELDAHL
1a etapa: Digestão
O alimento é colocado no frasco de digestão e então digerido pelo
aquecimento na presença de ácido sulfúrico (um agente oxidante
que digere alimentos), e um catalisador (cobre, selênio, titânio ou
mercúrio).
A digestão converte o N do alimento (ou outro na forma de
nitratos ou nitritos) em amônio, e a matéria orgânica em C02 e
H20. O gás amônia não é liberado numa solução ácida porque a
amônia está na forma de íon (NH4+) que se liga ao íon sulfato
(SO42-) e assim permanece na solução:

CHON (alimento)  (NH4)2SO4 + C02(g) + H20 (g) (1) 22

 MÉTODO KJELDAHL
2a etapa: Neutralização e DESTILAÇÃO
Depois da digestão o frasco de digestão é conectado no destilador de
nitrogênio. Adiciona-se hidróxido de sódio, que converte o sulfato de
amônio em gás amônia:

(NH4)2SO4 + 2 NaOH  2NH3 + 2H2O + Na2SO4 (2)

A amônia formada é liberada da solução. Por destilação por arraste a

vapor a NH3 é transferida do frasco de digestão para um erlenmeyer
contendo ácido bórico em excesso.

NH3 + H3BO3  NH4+ + H2BO3- (íon borato) (3)

23
 DESTILADOR
NaOH

DIGESTOR

Água de
arraste
Erlenmeyer com
solução de H3BO3
Amostra

24
 MÉTODO KJELDAHL
3a etapa: Titulação
O conteúdo de N é estimado por titulação do borato de amônio
com ácido sulfúrico ou clorídrico.
H2BO3- + H+  H3BO3 (4)

A concentração dos íons H+ gastos na titulação equivalem à

concentração do nitrogênio.
O conteúdo de N é então convertido em proteínas usando um
fator apropriado:
%Protein = F x %N 25
 Falhas do processo (Kjeldahl):
1. Não é uma medida ‘verdadeira’ de proteínas, dosa todo N -
protéico e não protéico (purinas, piridinas, vitaminas, uréia,
aminas, amidas, etc.).
Pode melhorar a técnica precipitando a proteína e
separando com lavagem (retira o N não protéico), mas, no
entanto pode carregar peptídeos e aminoácidos.
3. F dá erros quando o conteúdo em N é muito diferente de
16%. Diferentes proteínas necessitam de diferentes fatores
de correção pois tem diferentes seqüências de aminoácidos
5. Desvantagem: utiliza substâncias corrosivas/muito
oxidantes
26
 DESTILAÇÃO DIRETA
 Modificação do método de kjeldahl.
 Sem digestão.
 Amostra + NaOH/Na2SO4  NH3

 Mistura-se com H3BO3 e titula-se com ácido.

 Necessita de curva de calibração.
É usado como rotina em alguns alimentos,
produtos crus (no qual o tempo é mais
27
importante que a exatidão).
MÉTODO DUMAS (1831)
Também determina N total.

Princípio: Combustão a 700-900°C – produz CO2, H2O e N2.

Combustão da amostra Medição do

(700º-800ºC) N gasoso

O N2 liberado é analisado volumetricamente ou por técnica

instrumental.

N2 pode ser medido quando passa através de uma coluna que

tem um detector de condutividade térmica no final.

28
 MÉTODO DUMAS
Necessário converter o teor de N na amostra para teor
de proteínas - F.

Problemas: sujeita à erros  pequena qtde de amostra

– amostra pode ser não representativa.

Equipamento
- melhora precisão;

- mais rápido, uns 4-10 minutos por medida,

comparado com 4-6 horas para Kjeldahl;

-- não necessita de reagentes ou catalisador.

TURBIMÉTRICO
 Fundamento: medida da turbidez causada pela
proteína precipitada. Agentes precipitantes:
ác.tricloroacético, ferricianeto de potássio, ácido
Sulfosalicílico.
Precipitante + proteína  turbidez
 Mede-se o grau de turbidez.
 Rápido, simples (proteínas líquidas).
 Desvantagens: não é usado p/sólidos; depende da
proteína; depende de padrões; precipitação de 30
interferentes.
 MÉTODOS
ESPECTROFOTOMÉTRICOS
 Asprincipais diferentes entre os testes são os grupos
químicos responsáveis pela absorção da radiação,
exemplo: ligações peptídicas, grupos aromáticos,
grupos básicos proteínas agregadas.

A concentração de proteínas é determinada a partir da

curva de calibração.

 Ascurvas de calibração de absorbância (ou turbidez)

versus concentração proteínas é preparada usando
uma série de soluções de concentração conhecida.
31
 MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS UV E
VISÍVEL

 Desvantagens: é necessário que as proteínas estejam

diluídas em soluções transparentes, e que não
contenham substâncias que absorvam no mesmo
comprimento de onda que as proteínas.
 Preparação de alimentos exigem muitas etapas:
homogeneização, extração por solventes,
centrifugação, filtração, que podem consumir muito
tempo e trabalho.
 Absorbância depende do tipo de proteína.
32
 Teste do Biureto (Riegler,
( 1914)

 Princípio - Sais de Cu+2 em soluções alcalinas

produzem cor violeta ou roxa quando interagem com
ligações peptídicas.
 Medida feita em um Colorímetro ou
espectrofotômetro.
 Faz-se a reação e após uns 15-20 minutos lê-se a
absorbância a 540 nm.
 Determina proteínas. 33
 Cor formada depende de cada proteína e a intensidade
é proporcional à quantidade.

34
 B. Teste do Fenol (Follin-Ciocalteau-Lowry)
Follin-Ciocalteau-

 Reação das proteínas com reagente de fenol Folin-

Ciocalteau e reagente de Biureto (Cu+2 em condições
alcalinas).
 Oxidação de aminoácidos aromáticos - tirosina e
triptofano - com aparecimento de uma coloração azul.
 Cor azul  colorímetro (500 a 750 nm)  curva
padrão.

35
B. Teste do Fenol (Follin-Ciocalteau-Lowry)
Follin-Ciocalteau-

Desvantagens:
É lento: operações múltiplas e período de incubação
 Necessita de uma curva padrão com proteína conhecida
 Intensidade da cor depende de cada proteína.

36
 C. Métodos Espectofotométricos UV
 Princípio- proteínas possuem absorção UV em 280nm
(aminoácidos aromáticos: tirosina, triptofano,
fenilalanina.

 Rápido, simples, não usa reagentes e não destrutivo.

 Pouco exato - depende da composição dos aminoácidos.
 Ácidos nucléicos podem interferir.
37
 Método Dye-binding
 Corantes que reagem quantitativamente com proteínas.
 Lisina, histidina e arginina reagem com -SO3H.
 Corante + proteína  complexo insolúvel.
 Mede-se o excesso de corante colorimetricamente.
 A quantidade de proteína :
Corante ligado = corante inicial – corante livre.

 Corantes: Laranja G, laranja 12, vermelho A, preto

búfalo e preto amino 10B.
38
DYE-BINDING

Fundamento:
Amostra Formação de Separação
+ um complexo (centrifugação
corante insolúvel ou filtração)
(exc.)

Mede o excesso
 Boa correlação com o Kjeldahl. de corante que
não reagiu
 Rápido, simples, exato, econômico.

Desvantagens:
 Aquisição do equipamento Por diferença obtém-
se a quantidade de39
proteína
 SEPARAÇÃO DE PROTEÍNAS

 Solubilidade

 Cromatografia:

- tamanho,
- carga,
- adsorção.

40
 ANÁLISE DE AMINOÁCIDOS
 Determinar a composição de aminoácidos nas
proteínas.
A proteína é hidrolisada  usando um ácido forte ou
enzimas  libera aminoácidos.
 Cromatografias separam os aminoácidos  troca
iônica, afinidade ou por absorção.

41
42
43