FACULDADE DE ARACRUZ

DEPARTAMENTO DE ENG. QUÍMICA

ENGENHARIA BIOQUÍMICA

Biomoléculas – Parte 4
Enzimas e Cinética Enzimática

Prof. Paulo W.P. Antunes

2012-02
ENZIMAS
 ENZIMAS
Condições Fundamentais para a Vida:
1. Auto – duplicação
2. Catálise eficiente e seletiva das reações químicas

C6H12O6 + O2
ENZIMAS
→ CO2 + H 2O + Energia
 ENZIMAS

→ Definição: Catalisadores biológicos

→ Função: Viabilizar as reações químicas em condições fisiológicas

→ Características gerais

- Toda Enzima é uma proteína (exceto alguns RNAS catalíticos)

- Biomolécula com  especificidade

- Regulação de toda via metabólica: Catabolismo e Anabolismo

- Função “turnover” → desempenho da mesma função n vezes

- Não são consumidas no processo

- Atuam em  concentrações

-  eficiência catalítica: >>> catalisadores sintéticos ou inorgânicos

 ENZIMAS

→ Catalisadores biológicos eficientes:

H2O2 → H 2O + O 2
catalase
Decomposição do H2O2

Condições da Reação Energia livre de Ativação Velocidade

KJ/mol Kcal/mol Relativa

Sem catalisador 75,2 18,0 1

Platina 48,9 11,7 2,77 x 104

Enzima Catalase 23,0 5,5 6,51 x 108

 ENZIMAS

→ Catalisadores biológicos eficientes:

Reação  Enzima Vc/V(1)

CO2 + H2O → HCO3- + H+  Anidrase Carbônica 107 
 Dihidroxiacetona fosfato ↔ Gliceraldeído-3-  Triose fosfato 109 
fosfato isomerase
 Glicose + ATP ↔ Glicose-6-fosfato + ADP + H+  Hexoquinase 1010
 Glicose-6-fosfato ↔ Glicose-1-fosfato  Fosfoglicomutase 1012
 Uréia + H2O ↔ 2 NH3 + CO2  Urease 1014 
(1)
Vc = velocidade da reação catalisada; V = velocidade da reação não catalisada
 ENZIMAS

→ Catalisadores biológicos eficientes:

H2O2 → H 2O + O 2
catalase
Decomposição do H2O2

- 1 molécula de Catalase: 5 x 106 moléculas de H2O2/min em pH = 6,8

- “tunover” → número de renovação: n° de moléculas de substrato

convertidas em produto por uma única molécula de enzima em uma dada

unidade de tempo.
 ENZIMAS

→ Características gerais

- Resíduos de aminoácidos → Estrutura → Conformação nativa

Ativa Inativa
 ENZIMAS

→ Características gerais

- Resíduos de aminoácidos + Grupo Prostético

- Co-fatores: íons orgânicos (Fe2+; Mg2+; Mn2+ ou Zn2+)

- Coenzima: molécula orgânica complexa ou metalorgânica

ENZIMAS

Vitaminas
 ENZIMAS

→ Nomecaltura:

- Adição do sufixo -ase ao nome do substrato da enzima ou uma

expressão que descreva a ação enzimática

Amilase - Mesma enzima: dois ou + nomes

- Enzimas ǂs: único nome
Urease
-  N0 de novas enzimas descobertas
DNA polimerase

Tripsina
Nomecaltura: Comissão de Enzimas
Pepsina (número E.C.)

Urease: E.C. 3.5.1.5

 ENZIMAS

→ Nomecaltura:

Nome não oficial: ATP-Glicose Fosfotransferase

Molecula aceptora - Glicose

E.C.2 . 7 . 1 . 1

Grupo aceptor - OH

Subclasse (grupo transferido) - fosfato

Classe - transferase
ENZIMAS
PROPRIEDADE DAS ENZIMAS
 ENZIMAS
→ Sítio Ativo e Especificidade:
- Substrato: estável ambiente celular
- Reações: improváveis neste ambiente

ENZIMA - AMBIENTE ESPECÍFICO

(reação termodinamicamente favorável)

SITIO ATIVO
(arranjo tridimensional especial dos
aminoácidos de uma determinada região da
molécula)

ESPECIFICIDADE
 ENZIMAS
→ Energética da Reação Enzimática:
- Equilíbrio da Reação X Velocidade da Reação

S ↔ P

- Equilíbrio:
Degradação de Substrato = Síntese de Produtos Keq = [P]
[S]

- Velocidade: v = d[S]
dt

- Energia de ativação (Eat): energia mínima necessária para o início da

reação química:
 ENZIMAS
→ Energética da Reação Enzimática
- Energia de ativação (Eat) X Velocidade da Reação
- Alinhamentos de grupos químicos
v α 1_
- Formação de cargas transientes instáveL
Eat
- Rearranjo e transformações para a reação

Eat: S → P
Eat: P → S

∆ Energia livre padrão

∆ < 0: energeticamente favorável

S ↔ P
 ENZIMAS
→ Energética da Reação Enzimática
E + S ↔ ES ↔ EP ↔ E + P

-  Eat →  Velocidade da Reação

- Não altera o estado de equilíbrio → Keq não é afetada

- Não apresenta efeito termodinâmico global → G’0 não é afetado

∆G’0
 ENZIMAS
→ Energética da Reação Enzimática
 ENZIMAS

DE ONDE VEM A ENERGIA PARA  EA?

REAÇÕES “S” e GRUPOS FUNCIONAIS DA “E”
(cadeia lateral de aa, coenzimas, íons)

ES

- LIGAÇÕES COVALENTES “S”– rompimento

- Pontes de hidrogênio: grupos “S” e resíduos aa
- Interações não covalentes: - Hidrofóbicas
- Iônicas
- V. der Walls

LIBERAÇÃO DE ENERGIA
(ENERGIA DE LIGAÇÃO)

CATÁLISE ESPECIFICIDADE
EA
 ENZIMAS
→ Energética da Reação Enzimática

- Modelos procuram explicar a especificidade substrato/enzima e Eat:

- Chave/Fechadura
- Substrato completar ao estado de transição
- Ajuste Induzido
 ENZIMAS
- Chave/Fechadura

- Substrato completar ao estado de transição

 ENZIMAS
- Ajuste Induzido

- Alterações conformacionais na ENZIMA induzidas pelas multíplas

interações fracas com o substrato
CINÉTICA ENZIMÁTICA
 CINÉTICA ENZIMÁTICA
→ Definição:
- Estudo da velocidade de uma reação química que ocorre na presença
de uma enzima, permitindo um maior conhecimento sobre:
- Mecanismos catalíticos das enzimas
- Papel das enzimas na regulação do metabolismo
- Controle das atividades biológicas diversas
- Mecanismos de inibição
→ Fatores que afetam a atividade enzimática:
- Concentração do substrato ([S])
- Concentração da enzima ([E])
- Concentração de inibidores ([I]) ou ativadores
- pH
- Temperatura
EFEITO DO pH E DA TEMPERATURA
 CINÉTICA ENZIMÁTICA
→ Influência do pH
- O efeito do pH sobre a enzima deve-se às variações no estado de
ionização dos componentes do sistema à medida que o pH varia
- Enzimas  grupos ionizáveis, existem em ≠ estados de ionização.
 CINÉTICA ENZIMÁTICA
→ Influência da Temperatura:
-  temperatura dois efeitos ocorrem:
- A taxa de reação aumenta, como se observa na maioria das
reações químicas
- A estabilidade da proteína decresce devido a desativação térmica.

Termoestabilidade  período
de tempo que a enzima mantém
a sua atividade cte quando
submetido à temperatura ótima
CONCENTRAÇÃO DO SUBSTRATO E DA
ENZIMA
 CINÉTICA ENZIMÁTICA

→ Victor Henri (1903)

- Passo obrigatório da reação: E se liga ao S para formar ES
→ Michaelis-Mente (1913)
- Teoria Geral da ação enzimática:
- E combina-se reverssivelmente
k com S → ES
1

K-1
E + S ↔ ES (1)
- ES rompe para formar kE e P
2

K-2
ES ↔ E + P (2)
- Qualquer instante da reação: E e ES
- Reação (2) + lenta: limita a velocidade da reação → α [ES]
- Velocidade máxima (Vmax): Toda E está na forma ES → E saturada
 CINÉTICA ENZIMÁTICA
→ Estado pré – estacionário:  S →  ES (período inicial) → V0 α [S]
→ Estado estacionário: [ES] = cte
 CINÉTICA ENZIMÁTICA
→ Equação de Michaelis-Mente
- Expressão quantitativa da relação S x velocidade da reação
ETAPA 1. Ligação do substrato (S) a uma enzima (E) → ES (intermediário)

Etapa 1
k1 k2
E + S ↔ ES ↔ E + P
K-1

Etapa 2

ETAPA 2. Formação do produto (P) a partir do complexo ES, com

recuperação da forma livre da enzima (E)

V0 = _Vmax.[S]_
- Definir a equação de Michaelis-Menten
Km + [S]
 CINÉTICA ENZIMÁTICA
→ Equação de Michaelis-Mente
- Relação quantitativa entre V0, Vmax e [S] relacionadas atráves de Km

-  [S] → Km >>[S]: [S] insignificante → V0 dependente linear de [S]

-  [S] → Km <<[S]: Km insignificante → V0 = Vmax

 CINÉTICA ENZIMÁTICA
→ Km – Constante de Michaelis:
- Concentração do substrato V0 = Vmax, depende de:
2

- Aspectos específicos do mecanismo de reação, como número e as

velocidades relativas dos passos individuais da reação
- Considerando a reação em 2 passos:

k1 k2 Km = K1 + K2
E + S ↔ ES ↔ E + P
K-1 K-1

- Km: afinidade da enzima pelo substrato.

-  Km =  afinidade
-  Km =  afinidade.
CINÉTICA ENZIMÁTICA
 CINÉTICA ENZIMÁTICA
→ Gráfico dos duplos recíprocos:
- Transformação matemática da equação de Michaelis-Menten →
cálculo direto de Km e Vmax
- Lineweaver-Burk
- Eadies-Hanes
- Eadie-Scatchard
- Woolf-Augstinsson-Hofstee

Buscam uma relação linear entre [S] e V0

 CINÉTICA ENZIMÁTICA
→ Lineweaver-Burk:
V0 = _Vmax.[S]_
- Equação de Michaelis-Menten:
Km + [S]

- Lineweaver-Burk:
=a
_1_ = _Km + [S]_
V0 Vmax . [S]

_1_ = Km + [S]___
V0 Vmax . [S] Vmax . [S]

_1_ = Km . 1 + 1__
V0 Vmax [S] Vmax

y = ax + b, onde: =b
 CINÉTICA ENZIMÁTICA
→ Experimento de cinética enzimática:

ρ-nitrofenol fosfato ρ-nitrofenol

 [S] →  A410nm → [P]
- Relação [S] X V0:
Fosfatase
[p-nitrofenol-fosfato] X [p-nitrofenol]/min
[S] [P]
incolor amarelo
 CINÉTICA ENZIMÁTICA
→ Experimento de cinética enzimática:

[s] (M) 0,30 0,50 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 10,0
V0 (m/min) 0,17 0,27 0,43 0,65 0,73 0,78 0,79 0,79

Gráfico de Michaelis-Menten
0,90

0,80

0,70

0,60

0,50
Vo

0,40

0,30

0,20

0,10

0,00
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00

[S]
 CINÉTICA ENZIMÁTICA
→ Experimento de cinética enzimática:
Gráfico de Lineweaver-Burk
7

1_ 1_
6
[S] Vo
y = 1,4542x + 0,9265
R2 = 0,9955

5
3,33 5,88
4
2,00 3,70
1/Vo

3
1,00 2,33
2
0,50 1,54
1
0,33 1,37
0
0,25 1,28 -1,00 -0,50 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00

1/[S]
0,20 1,27
0,10 1,27 Eq. Reta: y = 1,4542x + 0,9265 R2 = 0,9955

_1_ = Km . 1 + 1__ Vmáx = 1/0,9265 → Vmáx = 1,08

V0 Vmax [S] Vmax Km = Vmax * 1,4542 → Km = 1,57
PRESENÇA DE INIBIDORES
 CINÉTICA ENZIMÁTICA

→ Inibidores enzimáticos:
- Toda substância que reduza a velocidade de uma reação enzimática
- Reversível: - Competitivo
- Incompetitivo
- Misto
- Irreversível
 CINÉTICA ENZIMÁTICA
→ Inibidores enzimáticos:
- Inibição Competitiva
- Forma estrutural = substrato → competição pelo sítio ativo
- Porcentual de inibição → concentrações ([S] e [I]) e afinidade da E

Succinato-desidrogenase
Inibição
competitiva
 CINÉTICA ENZIMÁTICA
→ Experimento:
- 10 → [S] e [E] cte
- 20 → [S], [E] cte e [I] crescentes

- Não altera o valor de Vmax

-  Km
 CINÉTICA ENZIMÁTICA
→ Inibidores enzimáticos:
- Inibição Incompetitiva
- 2 sítios ativos → I se fixa no complexo ES → bloqueio
- ESI não permite a formação de P
 CINÉTICA ENZIMÁTICA
→ Experimento:
- 10 → [S] e [E] cte
- 20 → [S], [E] cte e [I] crescentes

-  Vmax → E indisponível
-  Km
 CINÉTICA ENZIMÁTICA
→ Inibidores enzimáticos:
- Inibição Mista
- Inibidor ocupa outro sítio ativo
-  [S] não torna a E produtiva
 CINÉTICA ENZIMÁTICA
→ Experimento:
- 10 → [S] e [E] cte
- 20 → [S], [E] cte e [I] crescentes

-  Vmax → E indisponível
-  Km
 CINÉTICA ENZIMÁTICA
→ Inibidores enzimáticos:
- Inibição Irreversível
- Combina-se com o grupo funcional → destruição
- Inibidor e enzima → união covalente
- Não seguem a cinética de Michaelis-Menten → EI e ESI irrevesíveis

→ Exemplo: Metais tóxicos presentes em resíduos e efluentes de indústrias

podem contaminar o solo e os alimentos
- Os metais pesados se complexam com as enzimas sulfídricas e formam
mercaptídeos inativos
Ag+, Hg+
Enzima-SH Enzima-S-Ag (enzima inativa)
(protease, papaína, Bromelina)
ENZIMAS – APLICAÇÕES
 APLICAÇÕES
→ Origem de enzimas:
- Origem vegetal – papaína, xinalase etc.
- Origem animal – pepsina, amilase etc.
- Origem microbiana – protease (Bacillus), glucoamilase, amilase
fúngica, proetase fúngica, coalho microbiano, lipase fúngica, etc.

→ Formas enzimáticas:
- Líquida
- Concentrada
- Pó
- Liofilizada
- Imobilizada
 APLICAÇÕES
→ Enzimas Livres X Enzimas Imobilizadas

- Enzimas Livres
- Instabilidade
- Rápida perda da atividade catalítica
- Não podem ser recuperadas

- Enzimas Imobilizadas
- Reutilização
- Maior estabilidade (faixas mais amplas de pH e temperatura)
- Menor interferência de inibidores e/ou ativadores
 APLICAÇÕES

→ Alimentícios – protease (leite, vinhos, queijo, etc); lactase (sorvetes,

ração, etc)
→ Tratamentos de efluentes – lipase (Penicillium P4 para remoção do
teor de DQO de efluentes de óleo de oliva)
→ Indústria de álcool – processos fermentativos
→ Indústria de detergentes
→ Indústria têxtil
→ Indústria de papel e celulose
→ Curtumes
→ Bioremediação – de polímeros, de hidrocarbonetos e clorados.