SEQUÊNCIAS DE GENE

MITOCONDRIAL PARA IDENTIFICAÇÃO

DE ESPÉCIES ANIMAIS
OLIVEIRA, J. A.; CRISPIM, B. A.; MARTINS, N. M.; SILVA, A. O.; DOURADO, P. L. R.; ROCHA, M. P.; GRISOLIA, A. B.
 Introdução

Marcadores moleculares.

Gene mitocondrial citocromo oxidase I.

 O diagnostico de similaridade dos seres vivos pode ser realizado pela análise

genômica do RNA ribossômico 16S.

Esquema do genoma mitocondrial, em destaque a região 16S.
 Material e Método

Técnicas utilizadas para determinar o grau de similaridade genético

05 ovinos

Extração DNA da nadadeira

Animais 04 bovinos

Extração DNA do
04 peixes
sangue
 Material e Método (sangue)

Microtubo de 2mL

• 300 µL Mat. Biológico

• Proteinase
• SDS
60°C banho maria • Clorofórmio
• Homogeização vortex
1h30min • Agitação vortex

• Sol. Precipitação proteica

• Homogeização vortex

Agitador tipo vortex

• Centrifugação 14.000 10’

• 1 mL etanol 100% (gelado)

• Homogeização vortex (formação de

precipitado 30” a 60”)

• Centrifugação 14.000 5’

• Desprezar sobrenadante

• + 1mL etanol 70%

• Homogeização vortex

• Centrifugação 14.000 2’

• Desprezar sobrenadante
 • 100 µL TE pH 8,7 com RNAse (10µg por
• Secagem (10’ a 15’) mL de amostra)

• Homogeização lenta vortex

• Incubado 37°c 60’

• Armazenado em freezer a-20°C

Material e Método (nadadeira)

• Fragmentos nadadeiras

• 200 µL chelex 5%
Transferiu sobrenadante • Armazenado em freezer a-20°C

• Termociclador 95° 15’ p/ outro microtubo

• Centrigugação 2’

Termociclador
• Próximas etapas
• Quantificação e qualificação do material
• Amplificação (região 16S do DNA mitocondrial)
• PCR
• Purificação (protocolo fenol/clorofórmio)
• Sequenciamento
• Análise dos dados

PCR
• 7,0 µL água ultra pura
• 1,5 µL primer (10pmolares)
• 12,5 µL PCR máster mix
• 2,5 µL de DNA
• Termocilcador: desnaturação 95°C -5’, 35 ciclos de 95ºC – 30” e 57ºC

em 30 e 72°C em 10” e extensão final em 72°C em 5’

• Total final 25 µL
PURIFICAÇÃO

Protocolo fenol/clorofórmio (1:1)

• 12 µL produto PCR
• 12 µL mistura fenol/clorofórmio
• Agitação 1’ vortex
• Centrifugação 3’ a 14.000rpm
• Fase aquosa recuperada
• Adição de 250 µL clorofórmio
• Agitação 1’ vortex (novamente)
• Centrifugação 3’ a 14.000rpm
• Fase aquosa recuperada 1/10 1,25 µL de acetato de sódio pH 5,2 a 3M
• 30 µL de etanol 95%
• Mantida a -20° C overnight
• Centrifugação a 4°C em 15’ a 14.000rpm
•
SEQUENCIAMENTO

• Produto Amplificado

• Água ultra pura final= 10ngµL

• Amostras em dois poços: 1 primer forward e outro primer reverse

• 3 µL solução tampão

• 1 µL 1 primer forward ou primer reverse

• 1 µL Big Dye Terminator Cycle Sequencing

• Termocilcador 4 hs.: ciclo de 96°C por 1’, 39 ciclos de 96ºC por 15”, 60º C por 15” e 60° C por 4’

• Protocolo de lavagem

• Selagem com alumínio

• Descando (decandatação) e Centrifugação, descarte sobrenadante com add. De etanol 70% ( 2 x)

• Spin invertido
 Resultados

Eletroforese em gel de agarose 2% do produto da PCR do gene 16S mitocondrial.

Linha 1: marcador de peso molecular de 100pb; Linhas 2 a 5: amostras de Salmonella ssp.; Linhas 6 a 9: amostras de peixes; Linhas 10 a 13: amostras de bovinos;

Linha 14 a 18: amostras de ovinos.

 Resultados

Árvore filogenética baseada nas sequências parciais do gene 16S rRNA construído pelo método de Tamura-Nei (TAMURA E NEI, 1993). Valores de bootstrap estão

indicados na árvore.
 Discussão

 A extração de DNA implicou em qualidade e quantidade de material suficiente para se realizar

as reações de amplificação.

 O sequenciamento realizado no presente estudo resultou em sequências com 490 pb em boa

qualidade, de uma região de 650 pb do gene 16S rRNA portanto concluiu-se que a qualidade

do sequenciamento foi suficiente para se realizar as análises filogenéticas apresentadas.