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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINRIA E ZOOTECNIA

AVALIAO DO TRATAMENTO EXPERIMENTAL DE CES NATURALMENTE INFECTADOS COM O VRUS DA CINOMOSE NA FASE NEUROLGICA COM RIBAVIRINA, PREDNISONA E DMSO ATRAVS DA RT-PCR

SIMONE HENRIQUES MANGIA

BOTUCATU SP 2011

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINRIA E ZOOTECNIA

AVALIAO DO TRATAMENTO EXPERIMENTAL DE CES NATURALMENTE INFECTADOS COM O VRUS DA CINOMOSE NA FASE NEUROLGICA COM RIBAVIRINA, PREDNISONA E DMSO ATRAVS DA RT-PCR

SIMONE HENRIQUES MANGIA

Tese apresentada junto ao Programa de Ps-Graduao em Medicina Veterinria para obteno de ttulo de Doutor.

Orientador: Prof. Dr. Antonio Carlos Paes

FICHA CATALOGRFICA ELABORADA PELA SEO DE AQUIS. E TRAT. DA INFORMAO DIVISO TCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECRIA RESPONSVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE

Mangia, Simone Henriques. Avaliao do tratamento experimental de ces naturalmente infectados com vrus da cinomose com ribavirina, DMSO e prednisona atravs da RT-PCR / Simone Henriques Mangia. Botucatu : [s.n.], 2011 Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia Orientador: Antonio Carlos Paes Capes: 50502034 1. Co Doenas. 2. Encefalite - Tratamento. 3. Virologia veterinria.

Palavras-chave: Antiviral; Corticide; Encefalite; hn-PCR; Morbillivirus; Teraputica.

Nome do Autor: Simone Henriques Mangia Ttulo: AVALIAO DO TRATAMENTO EXPERIMENTAL DE CES

NATURALMENTE INFECTADOS COM O VRUS DA CINOMOSE NA FASE NEUROLGICA COM RIBAVIRINA, PREDNISONA E DMSO ATRAVS DA RT-PCR. COMISSO EXAMINADORA Prof. Dr. Antonio Carlos Paes Presidente e Orientador Departamento de Higiene Veterinria e Sade Pblica FMVZ UNESP Botucatu Prof.Dr. Mrcio Garcia Ribeiro Membro Departamento de Higiene Veterinria e Sade Pblica FMVZ UNESP Botucatu Profa. Titular Dr. Hlio Langoni Membro Departamento de Higiene Veterinria e Sade Pblica FMVZ UNESP Botucatu Prof. Dr. Christian Hirsch Membro Departamento de Medicina Veterinria Universidade Federal de Lavras - UFLA Prof. Dr. Osimar de Carvalho Sanches Membro Departamento de Patologia Animal Faculdade de Cincias Agrrias da Universidade do Oeste Paulista UNOESTE

Data da Defesa: 16 de dezembro de 2011.

Dedicatria

Dedico esta pesquisa a todos os ces que participaram e a todos os outros que sofrem com a cinomose. Dedico a todos os proprietrios que perderam ou que lutaram contra a cinomose, que por algum motivo cruzaram com a minha vida e me fizeram ter foras para seguir em frente no trabalho. Esta dedicatria serve como agradecimento por todo o carinho que venho recebendo.

Dedico esta pesquisa ao meu orientador, Prof. Dr. Antonio Carlos Paes que foi o grande idealizador do estudo e que sonhou ao meu lado em fazer um trabalho como este, me apoiando e guiando frente as dificuldades.

Agradecimentos
Agradeo a Deus pela oportunidade de enriquecer meus conhecimentos nesta inestimvel universidade. Agradeo a minha me Sandra da Cunha Henriques pelo apoio que recebi desde o incio quando cheguei em Botucatu, pelos valores que me ensinou, pelo amor e dedicao, alm de toda compreenso pela minha ausncia. Obrigada por toda ajuda que me deu nesse perodo, permitindo terminar mais uma fase da minha vida. Agradeo ao Prof. Dr. Antonio Carlos Paes no s pela orientao profissional, mas tambm por se tornar um grande amigo, que me apoiou em todos os momentos que precisei aqui em Botucatu. Agradeo ao meu namorado Leonardo Simes Pinho pelo apoio, carinho e compreenso pelos momentos de ausncia. Obrigada por estar do meu lado neste momento to importante para mim, pela sua dedicao no trmino da tese e por me trazer momentos de alegria e paz, quando parecia ser to difcil, e que foram fundamentais na reta final. Agradeo aos Pretos, Loiro e Marrom, Nina, Holly, Lut, Skol e Johnnie a companhia para escrever a tese e por serem a minha inspirao do dia-a-dia. Agradeo a todos os ces e proprietrios que colaboraram com a pesquisa e foram de fundamental importncia para a concluso de mais uma fase da minha vida. Agradeo a todas as pessoas que desejaram que o trabalho no atingisse os seus objetivos e que dificultaram sua realizao, pois estas dificuldades me fizeram uma pessoa mais forte para as tormentas da vida. Agradeo a toda minha famlia por estarem sempre por perto nos momentos mais importantes da minha vida, pelos ensinamentos e amor que sempre recebi. Obrigada pela compreenso pela minha ausncia nos momentos que tambm so importantes para vocs. Agradeo s minhas amigas eternas, Danielle, Mrian e Cheryl pelo apoio que recebi durante todo esse perodo, pelos maravilhosos e inesquecveis momentos de diverso e pelo apoio nas horas tristes. Obrigada

pela compreenso pela minha ausncia nos momentos que foram importantes e eu no pude estar l. Agradeo s minhas amigas Leila e Marlia por estarem sempre presentes na minha vida de forma to agradvel, pelos momentos de diverso e desabafo. Agradeo s residentes e amigas, Anna Paula e Isabella por transformarem os momentos de tenso e trabalho em momentos to alegres e divertidos; foi maravilhoso conhecer e trabalhar com vocs. Espero que nossa amizade continue por muito tempo. Agradeo Profa. Regina Kiomi Takahira, Lvia e residentes do Laboratrio Clnico Veterinrio da UNESP Botucatu, pela realizao dos exames complementares da pesquisa, trabalhos cientficos e pela boa convivncia. Agradeo Profa. Jane Megid por disponibilizar o Laboratrio de Biologia Molecular da Disciplina de Enfermidades Infecciosas dos Animais da UNESP Botucatu para a realizao das reaes de PCR. Agradeo ao Clvis pelo auxlio e dedicao para a realizao destas tcnicas que foram fundamentais na execuo da pesquisa. Aos professores, Hlio Langoni, Mrcio Garcia Ribeiro, Jane Megid, Rafael Modolo, Paulo Francisco Domingues, Cassiano Victria, agradeo pelos ensinamentos, por me receberem no Departamento e por me apoiarem nessa pesquisa. Agradeo a todos os ps-graduandos do Departamento pela

colaborao e auxlio na realizao da pesquisa. Agradeo a todos os residentes da Disciplina de Enfermidades Infecciosas dos Animais que colaboraram com o desenvolvimento da pesquisa. Agradeo aos funcionrios Adilson e Roberto por toda ajuda que ofereceram para melhor execuo da pesquisa; sem vocs no teria conseguido concluir o experimento. Aos residentes da Disciplina de Zoonoses e ao Prof. Dr. Hlio Langoni, obrigada pela ajuda e orientao no diagnstico de toxoplasmose. Aos funcionrios do Departamento de Higiene Veterinria e Sade Pblica e da FMVZ UNESP Botucatu, obrigada pela inestimvel ajuda.

Agradeo ao Prof. Dr. Aristeu Vieira da Silva a contribuio para a realizao e interpretao das anlises estatsticas desta pesquisa. Agradeo a Blausigel Farmacutica por fornecer o medicamento antiviral no preo acessvel para a realizao da pesquisa. Agradeo a CAPES pelo apoio financeiro e fundamental para a estadia na cidade de Botucatu. Agradeo ao CNPq pelo auxlio financeiro para a realizao da pesquisa. A todos aqueles que me ajudaram e por um lapso de memria no citei, muito obrigada!

Epgrafe
Nosso Mundo Baro Vermelho Compositor: Maurcio Barros e Guto Goffi

Se eu ainda soubesse Como mudar o mundo Se eu ainda pudesse Saber um pouco de tudo Eu voltaria atrs do tempo Eu no te deixaria Presa no passado E arrumaria um jeito Pra voc estar ao meu lado de novo Eu voltaria no tempo

Pra voltar pra ontem Sem temer o futuro E olhar pra hoje Cheio de orgulho Eu voltaria atrs do tempo Eu voltaria atrs Atrs do tempo Os nossos erros Seriam apagados Nossos primeiros desejos Ressuscitados E de novo eu voltaria no tempo Eu no te deixaria desistir to fcil E no te negaria nenhum abrao De novo Eu voltaria no tempo

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...Eu andarei vestido e armado, com as armas de So Jorge. Para que meus inimigos tendo ps no me alcancem, tendo mos no me peguem, tendo olhos no me enxerguem e nem pensamentos eles possam ter, para me fazerem mal... (Orao de So Jorge)

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LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Descrio da sequncia de nucleotdeos iniciadores utilizados na reao de RT-PCR e hn-PCR no diagnstico da cinomose em ces. Botucatu, SP, 2011......................... 77 Tabela 2 - Frequncia de ces machos e fmeas com cinomose includos nos respectivos grupos experimentais. Botucatu, SP, 2011.............................................................................. 79 Tabela 3 - Mdia, desvio padro, mediana das idades em meses dos ces com cinomose includos na pesquisa, divididos nos diferentes grupos. Botucatu, SP, 2011................................ 80 Tabela 4 - Mdia, desvio padro e mediana dos dias de evoluo dos sinais clnicos neurolgicos dos ces com cinomose nos diferentes grupos. Botucatu, SP, 2011......................... 81 Tabela 5 - Frequncia dos sinais oculares em ces com cinomose nos diferentes grupos experimentais. Botucatu, SP, 2011.. 82 Tabela 6 - Frequncia dos sinais respiratrios em ces com cinomose nos diferentes grupos experimentais. Botucatu, 83 SP, 2011.............................................................................. Tabela 7 - Frequncia dos sinais gastroentricos em ces com cinomose nos diferentes grupos experimentais. Botucatu, SP, 2011.............................................................................. 84 Tabela 8 - Frequncia dos sinais neurolgicos nos ces com cinomose includos na pesquisa nos diferentes grupos experimentais. Botucatu, SP, 2011..................................... 85 Tabela 9 - Frequncia da vacinao dos ces com cinomose includos na pesquisa, segundo o grupo experimental. Botucatu, SP, 2011.............................................................. 88 Tabela 10 - Mdia, desvio padro, mediana do tempo de tratamento dos ces com cinomose para cada grupo experimental. Botucatu, SP, 2011.............................................................. 90 Tabela 11 - Avaliao do tratamento experimental segundo a sobrevida dos ces com cinomose nos diferentes grupos. Botucatu, SP, 2011.............................................................. 91 Tabela 12 - Avaliao do tratamento experimental atravs da sobrevida dos ces com cinomose includos nos grupos 1, 2 e 3. Botucatu, SP, 2011.................................................... 92

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Tabela 13 - Avaliao do tratamento experimental atravs da sobrevida dos ces com cinomose includos nos grupos 3, 4, 5 e 6. Botucatu, SP, 2011................................................ 93 Tabela 14 - Avaliao da sobrevida dos ces com cinomose frente ao histrico de vacinao independente do grupo experimental. Botucatu, SP, 2011....................................... 94 Tabela 15 - Avaliao da sobrevida dos ces com cinomose em cada grupo experimental frente ao histrico de vacinao. Botucatu, SP, 2011.............................................................. 98 Tabela 16 - Mdia, desvio padro e mediana da idade dos ces com cinomose em relao sobrevida, independente do grupo experimental. Botucatu, SP, 2011....................................... 99 Tabela 17 - Mdia, desvio padro e mediana da idade dos ces com cinomose nos grupos experimentais frente evoluo clnica. Botucatu, SP, 2011.................................................. 100 Tabela 18 - Frequncia de acometimento ocular dos ces com cinomose em relao sobrevida. Botucatu, SP, 2011...... 101 Tabela 19 - Frequncia dos sinais oculares em relao sobrevida dos ces com cinomose em cada grupo experimental. Botucatu, SP, 2011.............................................................. 102 Tabela 20 - Frequncia dos sinais gastroentricos em relao sobrevida dos ces com cinomose. Botucatu, SP, 2011..... 103 Tabela 21 - Frequncia dos sinais gastroentricos em relao sobrevida dos ces com cinomose nos grupos experimentais. Botucatu, SP, 2011..................................... 104 Tabela 22 - Frequncia dos sinais respiratrios em relao sobrevida dos ces com cinomose. Botucatu, SP, 2011..... 105 Tabela 23 - Frequncia dos sinais respiratrios em relao sobrevida dos ces com cinomose nos grupos experimentais. Botucatu, SP, 2011..................................... 106 Tabela 24 - Mdia, desvio padro, mediana e percentis da quantidade de sinais neurolgicos nos ces com cinomose includos na pesquisa em relao sobrevida. Botucatu, SP, 2011.. 107 Tabela 25 - Mdia, desvio padro, mediana e percentis da soma dos sinais neurolgicos nos ces com cinomose em cada grupo experimental em relao evoluo clnica. Botucatu, SP, 2011............................................................. 108

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Tabela 26 - Frequncia da soma de sinais neurolgicos em relao evoluo clnica dos ces com cinomose independente do grupo experimental. Botucatu, SP, 2011............................. 111 Tabela 27 - Frequncia da soma de sinais neurolgicos nos ces com cinomose em relao evoluo clnica nos diferentes grupos experimentais. Botucatu, SP, 2011......................... 112 Tabela 28 - Frequncia dos sinais neurolgicos nos ces com cinomose em relao evoluo clnica, independente dos grupos experimentais. Botucatu, SP, 2011................... 115 Tabela 29 - Valor absoluto de linfcitos do hemograma dos ces com cinomose em mdia, desvio padro, mediana e percentis no dcimo quinto dia nos diferentes grupos. Botucatu, SP, 2011..................................................................................... 123 Tabela 30 - Mediana e percentis em escores da dosagem de bilirrubina na urina dos ces com cinomose nos diferentes grupos experimentais, no dcimo dia de tratamento. Botucatu, SP, 2011.............................................................. 142 Tabela 31 - Mediana e percentis em escores da dosagem de bilirrubina na urina dos ces com cinomose nos diferentes grupos experimentais, no dcimo quinto dia de tratamento. Botucatu, SP, 2011........................................... 142 Tabela 32 - Mediana e percentis da dosagem de protena no lquor dos ces com cinomose nos diferentes grupos experimentais no primeiro momento. Botucatu, SP, 2011.. 150 Tabela 33 - Mediana e percentis da dosagem de protena no lquor dos ces com cinomose nos diferentes grupos experimentais aps o tratamento. Botucatu, SP, 2011....... 151 Tabela 34 - Mediana e percentis em escore do teste de Pandy no lquor dos ces com cinomose nos diferentes grupos experimentais aps o tratamento. Botucatu, SP, 2011....... 154 Tabela 35 - Mediana e percentis da contagem de clulas nucleadas do lquor dos ces com cinomose nos diferentes grupos experimentais no primeiro momento de colheita de material. Botucatu, SP, 2011............................................... 156 Tabela 36 - Mediana e percentis da contagem de clulas nucleadas no lquor dos ces com cinomose nos diferentes grupos experimentais aps o tratamento. Botucatu, SP, 2011....... 157

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Tabela 37 - Mediana e percentis da porcentagem e do valor absoluto de linfcitos na citologia liqurica dos ces com cinomose nos diferentes grupos experimentais antes do tratamento. Botucatu, SP, 2011.............................................................. 159 Tabela 38 - Mediana e percentis da porcentagem e do valor absoluto de linfcitos na citologia liqurica dos ces com cinomose nos diferentes grupos experimentais aps o tratamento. Botucatu, SP, 2011.............................................................. 160 Tabela 39 - Mediana e percentis da porcentagem e do valor absoluto de clulas mononucleares na citologia liqurica dos ces com cinomose nos diferentes grupos experimentais no primeiro momento de colheita de material. Botucatu, SP, 2011..................................................................................... 162 Tabela 40 - Mediana e percentis da porcentagem e do valor absoluto de clulas mononucleares na citologia liqurica dos ces com cinomose nos diferentes grupos aps o tratamento experimental. Botucatu, SP, 2011....................................... 163 Tabela 41 - Relao das amostras positivas e negativas na PCR no diagnstico da cinomose em ces antes do tratamento experimental, independente do grupo. Botucatu, SP, 2011..................................................................................... 164 Tabela 42 - Relao das amostras positivas e negativas de ces na RT-PCR aps o tratamento experimental, independente do grupo. Botucatu, SP, 2011.............................................. 165 Tabela 43 - Resultados positivos e negativos da RT-PCR para deteco do vrus da cinomose do lquor dos ces nos diferentes grupos, aps o tratamento experimental. Botucatu, SP, 2011.............................................................. 166 Tabela 44 - Resultados positivos e negativos da hn-PCR para deteco do vrus da cinomose de amostras de ces nos diferentes grupos experimentais independente do momento de colheita do material. Botucatu, SP, 2011........ 169 Tabela 45 - Relao dos resultados positivos e negativos da hn-PCR para deteco do vrus da cinomose em relao ao tipo de amostra de ces, independente do grupo experimental. Botucatu, SP, 2011.............................................................. 170 Tabela 46 - Relao dos resultados da hn-PCR para deteco do vrus da cinomose em cada tipo de amostra de ces nos diferentes grupos experimentais. Botucatu, SP, 2011......... 172

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Tabela 47 - Relao dos resultados positivos e negativos da hn-PCR para deteco do vrus da cinomose de amostras de ces, realizadas antes e aps o tratamento experimental independente do grupo. Botucatu, SP, 2011....................... 173 Tabela 48 - Resultados da hn-PCR para deteco do vrus da cinomose de amostras de ces, antes e aps o tratamento nos diferentes grupos experimentais. Botucatu, SP, 2011.............................................................. 174

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LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Representao grfica da avaliao do tratamento experimental segundo a sobrevida dos ces com cinomose nos diferentes grupos. Botucatu, SP, 2011............................. 92 Figura 2 - Representao grfica dos valores de mediana da soma de sinais neurolgicos dos ces com cinomose em relao evoluo clnica em cada grupo experiemental. Botucatu, SP, 2011................................................................................. 110 Figura 3 - Representao grfica das medianas da contagem de hemcias dos ces com cinomose em cada momento de colheita de material nos grupos experimentais. Botucatu, SP, 2011................................................................................. 118 Figura 4 - Representao grfica das medianas da dosagem de hemoglobina dos ces com cinomose em cada momento de colheita de material nos grupos experimentais. Botucatu, SP, 2011................................................................................. 119 Figura 5 - Representao grfica das medianas do volume globular das hemcias de ces com cinomose em cada momento de colheita de material nos grupos experimentais. Botucatu, SP, 2011................................................................................. 120 Figura 6 - Representao grfica das medianas da contagem total de leuccitos dos ces com cinomose nos momentos de colheita de material. Botucatu, SP, 2011................................ 122 Figura 7 - Representao grfica da mediana dos valores absolutos de linfcitos no hemograma dos ces com cinomose de cada grupo nos momentos de colheita de material. Botucatu, SP, 2011................................................................. 124 Figura 8 - Representao grfica do nmero de ces com cinomose que apresentaram moncitos ativados no hemograma nos diferentes momentos de colheita de material. Botucatu, SP, 2011........................................................................................ 127 Figura 9 - Representao grfica das medianas das dosagens de uria srica dos ces com cinomose nos diferentes grupos experimentais nos momentos de colheita de material. Botucatu, SP, 2011................................................................. 130

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Figura 10 - Representao grfica das medianas da dosagem de creatinina dos ces com cinomose nos grupos experimentais e nos momentos de colheita de material. Botucatu, SP, 2011................................................................. 131 Figura 11 - Representao grfica das medianas da dosagem de fosfatase alcalina (FA) dos ces com cinomose nos grupos e nos diferentes momentos de colheita de material. Botucatu, SP, 2011................................................................. 133 Figura 12 - Representao grfica das medianas da dosagem de gamaglutamiltransferase (GGT) dos ces com cinomose nos grupos e nos diferentes momentos de colheita de material. Botucatu, SP, 2011................................................................. 134 Figura 13 - Representao grfica das medianas da dosagem de protenas totais sricas dos ces com cinomose nos grupos experimentais e nos momentos de colheita de material. Botucatu, SP, 2011................................................................. 135 Figura 14 - Representao grfica das medianas da dosagem de albumina srica dos ces com cinomose nos grupos experimentais nos diferentes momentos de colheita de material. Botucatu, SP, 2011.................................................. 137 Figura 15 - Representao grfica das medianas da dosagem de globulina srica dos ces com cinomose nos grupos experimentais nos diferentes momentos de colheita de material. Botucatu, SP, 2011.................................................. 138 Figura 16 - Representao grfica das medianas da dosagem de protenas no lquor dos ces com cinomose includos na pesquisa, antes e aps o tratamento experimental. Botucatu, SP, 2011................................................................. 152 Figura 17 - Representao grfica dos valores de medianas da contagem de clulas nucleadas do lquor dos ces com cinomose, antes e aps o tratamento experimental.Botucatu, SP, 2011............................................ 158 Figura 18 - Representao grfica das medianas de valores absolutos de linfcitos no lquor dos ces com cinomsoe, nos diferentes grupos, antes e aps o tratamento experimental. Botucatu, SP, 2011............................................................... 161

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Figura 19 - Representao grfica dos resultados positivos para o vrus da cinomose nas diferentes amostras de ces, antes e aps o tratamento, independente do grupo experimental. Botucatu, SP, 2011................................................................. 167 Figura 20 - Eletroforese aps RT-PCR para deteco do vrus da cinomose de amostras de sangue, medula ssea e lquor de ces. Botucatu, SP, 2011........................................................ 168 Figura 21 - Eletroforese aps hn-PCR para deteco do vrus da cinomose de amostras de sangue e medula ssea de ces. Botucatu, SP, 2011................................................................. 169 Figura 22 - Representao grfica dos valores percentuais dos resultados positivos da hn-PCR para deteco do vrus da cinomose em amostras de ces, antes e aps o tratamento nos diferentes grupos experimentais. Botucatu, SP, 2011..... 175

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LISTA DE ABREVIATURAS E SMBOLOS

% - porcentagem C graus Celsius < - menor que > - maior que L microlitro mg miligramas mL - mililitros dL - decilitro - marca registrada alfa - beta A+ - amostra positiva A- - amostra negativa ALT alanina-aminotransferase ATP adenosina trifosfato C+ - controle positivo C- - controle negativo CPK creatinina fosfo-quinase CDV vrus da cinomose (Canine Distemper Virus) COX cicloxigenase CSD depresso cortical difusa cDNA cpias de DNA DDT Dicloro-Difenil-Tricloroetano DL 50 dose letal 50 DMSO Dimetil Sulfxido DMSO2 dimetil sulfone DMS dimetil sulfide dNTP desoxirribonucleotdeos fosfatados DUSP fosfatase de especificidade dupla EDTA cido etilenodiaminotetractico

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ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay et al. - colaboradores EUA Estados Unidos da Amrica F protena de fuso FA fosfatase alcalina Fc receptor de anticorpos de alta afinidade de macrfagos FDA Food and Drug Administration GABA cido gama-aminobutrico gama G1 grupo 1 G2 grupo 2 G3 grupo 3 G4 grupo 4 G5 grupo 5 G6 grupo 6 GGT gama-glutamiltransferase GTP guanosina tri-fosfato g/dL gramar por decilitro g/Kg gramas por quilo g/dia gramas por dia H - hemaglutinina HIV vrus da imunodeficincia humana hn-PCR Hemi-nested PCR HSV Herpes Simplex Vrus IFN interferon IgG imunoglobulina G IgG1 imunoglobulina G1 IgG2 imunoglobulina G2 IgM imunoglobulina M IL interleucina IMP inosina mono-fosfato IMPDH inosina-monofosfato desidrogenase IND Investigated new drugs ITPA inosina trifosfato

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JNK c-Jun N-terminal quinase L polimerase ou grande LCR lquido cefalorraquidiano MAPK protena quinase ativada por mitgeno (mitogen-activated protein kinase) mg/dL miligrama por decilitro mg/Kg miligramas por quilo L microlitros mL militros mM - milimolar g/mL microgramas por militro MgCl2 cloreto de magnsio M protena de matrix ou marcador (loading foto do gel de eletroforese) MHC Complexo de histocompatibilidade principal M-MLV Moloney Murine Leukemia Virus mRNA RNA mensageiro n nmero de animais N ou NP nucleoprotena g/L nanograma por microlitro P fosfoprotena pb pares de bases P25 percentil 25 P75 percentil 75 PCR reao em cadeia pela polimerase PGE2 prostaglandina E2 PLA - fosfolipase pH presso de hidrognio recCDV ou rD vacina recombinante contra a cinomose ROS radicais livres de oxignio RT-PCR reao em cadeia pela polimerase precedida de transcrio reversa rpm rotao por minuto SHV sem histrico vacinal SNC Sistema nervoso central spp. espcie

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SRD sem raa definida SSPE paencefalite subaguda esclerosante SV sem vacinao U.S. United States Th1 clula T helper 1 Th2 clula T helper 2 TNF fator de necrose tumoral UI/L unidades internacionais por litro VI Vacinao incompleta VSO vacinao sem orientao veterinria WHO Organizao Mundial da Sade (Word Health Organization) * Em virtude do uso consagrado na literatura tcnica, algumas abreviaturas seguem sua grafia no ingls.

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SUMRIO
RESUMO................................................................................................... 1 ABSTRACT ............................................................................................... INTRODUO.......................................................................................... REVISO DE LITERATURA.................................................................... 1 2 3 CINOMOSE................................................................. RT-PCR........................................................................... TRATAMENTO DE CES COM CINOMOSE E PROFILAXIA................................................................... 4 5 RIBAVIRINA.................................................................... APLICAES DA RIBAVIRINA NA MEDICINA VETERINRIA................................................................. 43 6 7 PREDNISONA................................................................. 44 DIMETIL-SULFXIDO (DMSO)...................................... 54 62 64 65 65 66 66 67 68 27 31 2 3 6 7 25

OBJETIVOS.............................................................................................. MATERIAIS E MTODOS........................................................................ 1 ANIMAIS.................................. 1.1 Critrios de incluso 1.2 Critrios de excluso.. 2 3 4 GRUPOS EXPERIMENTAIS.......................................... FRMACOS EXPERIMENTAIS...................................... AMBIENTE E ALIMENTAO DOS CES....................

COLHEITA DE MATERIAL E EXAMES COMPLEMENTARES..................................................... 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 Colheita de lquor................................................. 69 69

Exame do lquor. 70 Colheita de sangue e urina.................................. 71

Hemograma........................................ 72 Anlises bioqumicas 73

Exame de urina tipo I.... 73 Colheita de medula ssea... 74 74

TCNICA DE BIOLOGIA MOLECULAR..............

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6.1 6.2 6.3 6.4 7

Extrao do RNA 74 Converso para cDNA.. 75

RT-PCR 76 Hemi-Nested RT-PCR... 76 77

ANLISE ESTATSTICA.................................................

RESULTADOS.......................................................................................... 78 1 2 ANIMAIS E DADOS EPIDEMIOLGICOS.............. DADOS RELACIONADOS COM A EVOLUO CLNICA.......................................................................... 3 EXAMES COMPLEMENTARES..................................... 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 4 Hemograma......................................................... Outras alteraes hematolgicas........................ 89 117 117 126 79

Dosagens bioqumicas......................................... 129 Exame de urina tipo I.......................................... 139

Exame do lquor................................................... 148 164 178 211

BIOLOGIA MOLECULAR................................................

DISCUSSO............................................................................................. CONCLUSES.........................................................................................

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS......................................................... 214 ARTIGO PARA PUBLICAO 1............................................................. ARTIGO PARA PUBLICAO 2............................................................. ANEXO 1 241 260 280

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MANGIA, S. H. Avaliao do tratamento experimental de ces naturalmente infectados com o vrus da cinomose com ribavirina, DMSO e prednisona atravs da RT-PCR. Botucatu, 2011. 282 p. Tese (Doutorado) Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia, Campus Botucatu, Universidade Estadual Paulista, SP. RESUMO O estudo objetivou identificar efeitos do tratamento com ribavirina, prednisona e DMSO na cinomose; identificar a presena viral no sangue, medula ssea e lquor antes e aps o tratamento, os efeitos colaterais dos frmacos experimentais e associaes. Foram utilizados 60 ces apresentando sinais neurolgicos da cinomose com evoluo de dez dias. Animais foram internados para tratamento de suporte; avaliados diariamente e submetidos ao hemograma e dosagens bioqumicas. Os grupos 1 e 2 foram tratados com ribavirina associada ao DMSO; os grupos 3 e 4 foram tratados com DMSO e prednisona e os grupos 5 e 6 foram tratados com ribavirina e prednisona, ribavirina, prednisona e DMSO. Os animais foram anestesiados e colhidos lquor, medula ssea e sangue, antes e aps o tratamento e realizada a RTPCR das amostras; as negativas foram analisadas pela tcnica de hn-PCR. O vrus foi encontrado em 95% das amostras de sangue, 90% de medula ssea e 53,3% de lquor pr-tratamento. O efeito adverso da ribavirina quando associada com a prednisona foi anemia. A prednisona na dose imunossupressora causou aumento da dosagem de protena e diminuio da celularidade liqurica, leucocitose. J a dose antinflamatria causou diminuio de protena no lquor. Baseado nos ndices de sobrevida e melhora clnica, o tratamento mais efetivo foi o G2 (80%); seguido do G1, G5 e G3 (70%); o G6 (60%); o G4 com o pior ndice (30%). Ps-tratamento, a frequncia viral foi 97,7% no sangue, 86,4% na medula ssea e 27,3% no lquor. PALAVRAS-CHAVE: encefalite, Morbillivirus, antiviral, hn-PCR, teraputica, corticide.

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MANGIA, S. H. The RT-PCR based assessment of experimental treatment of dogs naturally infected with canine distemper vrus by the use of ribavirin, DMSO and prednisone. Botucatu, 2011. 282 p. Thesis (Doctorate) College of Veterinary Medicine and Animal Science, Campus of Botucatu, So Paulo State University, SP. ABSTRACT The present study aims at the identification of ribavirin, prednisone and DMSOs treatment effects in dogs with canine distemper, at the identification of the viral presence in the blood, bone marrow and cerebrospinal fluid (CSF) before and after the treatment and also at the identification of side effects of the experimental drugs and its combinations. Sixty dogs presenting canine distemper with neurological signs about ten days evolution were observed. The animals were hospitalized for the support treatment, assessed on daily basis and subjected to blood cells count and biochemical analysis. Groups 1 and 2 were treated with ribavirin and its combination with DMSO; Groups 3 and 4 treated with prednisone and DMSO, Group 5 treated with ribavirin and prednisone, while Group 6 with ribavirin, prednisone and DMSO. The animals were anesthetized for the cerebrospinal fluid, bone marrow and blood samples collection before and after the treatment, then the RT-PCR of the samples was proceeded. The negative were analysed according to the hn-PCR technique. The canine distemper virus were found in 95% of blood samples, 90% of bone marrow and 53,3% of CSF before the treatment. The adverse effect of ribavirin and its association with prednisone was anemia. Prednisone, at its immunosuppressive dose, led to the increase of protein and decrease of cellularity in CSF, and increase of leukocytes blood count. The antiinflammatory dose led to the CSF protei n concentrations decrease. Considering the survival and clinical improvement rates, the most successful treatment was the one applied to the G2 (80%); followed by G1 (70%); G5 (70%) and G3 (70%); G6 (60%); and the lowest rate G4 (30%). After the treatment, the virus frequency was 97,7% in the blood, 86,4% in the bone marrow and 27,3% in the CSF. KEY-WORDS: Encephalitis, Morbillivirus, antiviral, hn-PCR, therapeutic, corticosteroids.

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Introduo

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A cinomose uma doena viral antiga que afeta ces e outros carnvoros em todo o mundo. Mesmo com uso de estratgias vacinais, ela ainda uma doena importante na populao canina, apresentando a maior taxa de mortalidade depois da raiva (SUMMERS & APPEL, 1994). uma enfermidade infectocontagiosa, causada por RNA vrus da ordem Mononegavirales, famlia Paramyxovirus, subfamlia Paramyxovirinae, gnero Morbillivirus. Possui trs formas de apresentao clnica: aguda, subaguda e crnica, com manifestaes gastroentricas, respiratrias e neurolgicas. So descritas basicamente trs formas de encefalite causada pelo vrus da cinomose: encefalite dos ces jovens, encefalite em ces adultos e encefalite do co velho (CORRA & CORRA, 1992). Embora a vacinao contra a cinomose venha sendo utilizada amplamente por vrias dcadas, a doena ainda prevalente e surtos foram recentemente relatados em vrios pases como Dinamarca, Estados Unidos, Japo, Finlndia e Alemanha (JZWIK & FRYMUS, 2005; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005). No Brasil, alguns relatos clnico-patolgicos e sorolgicos indicam a elevada ocorrncia da infeco na populao canina (HEADLEY & GRAA, 2000; SILVA et al., 2004). Alguns fatores como a contaminao do ambiente e em animais portadores, o aparecimento de novas cepas e o desenvolvimento de infeco e doena mesmo em animais vacinados tm contribudo para a manuteno do carter enzotico da enfermidade com ocorrncia ocasional de surtos (BHM et al., 2004). A ribavirina vem sendo considerada como frmaco no tratamento da cinomose, aps o referido trabalho de Elia et al. (2008), que testou a mesma frente o vrus da cinomose in vitro. Segundo os autores a ribavirina causa mutaes no vrus da cinomose e estas levam a um erro catastrfico no RNA do genoma viral. Os corticoesterides so utilizados na cinomose por causa da imunopatologia das leses neuronais e para reduzir o edema cerebral causados pelo vrus, mantendo a terapia com doses antinflamatrias (TIPOLD et al., 1992; GREENE, 2006). Os glicocorticides ainda so considerados como um dos mais potentes antinflamatrios, podendo ser utilizados no tratamento de doenas nas quais estejam envolvidos mecanismos imunes e inflamatrios (CROXTALL et al., 2002; LONGUI, 2007). A solubilizao de nucleotdeos em solventes orgnicos importante para a entrada de drogas nucleotdeas em membranas celulares. Pelos estudos de West et al. (1994), a base guanosina hidrofbica e sua interao com DMSO pode torn-la permevel a substncia lipoflicas, indicando que este pode servir como veculo de transporte de drogas nucleotdeas por membranas celulares . O presente estudo tem como objetivo criar novos protocolos de tratamento para a referida enfermidade utilizando-se dos frmacos supracitados. Com a caracterstica de doena re-emergente o tratamento da cinomose deve ser considerado em novas pesquisas e o atual estudo refere-se ao tratamento de ces com encefalite, a forma mais agressiva da enfermidade, naturalmente infectados com o vrus da cinomose.

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Reviso de Literatura

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1. Cinomose Durante sculos, as infeces pelo Morbillivirus tm tido imenso impacto na vida de humanos e animais. Entre os carnvoros, o vrus da cinomose causa sria doena em vrias espcies, selvagens e domsticas. Mesmo sendo controlada com vacinao em ces domsticos e animais de cativeiro, a cinomose uma doena de difcil erradicao j que o vrus possui distribuio global e ampla variedade de hospedeiros (BARRETT, 1999). Enfermidade que afeta animais das famlias Canidae, Mustelidae, Hyaenidae, Procyonidae, Ailuridae, Viverridae, Felidae, Ursidae, Phocidae, Tayassuidae e Cercopithecidae . A patogenia da infeco pelo vrus da cinomose varia de acordo com a espcie e pode resultar em infeces inaparentes ou causar alta mortalidade (TIPOLD et al., 1992; SUMMERS et al., 1995; van MOLL et al., 1995; HEADLEY & GRAA, 2000; GEBARA et al., 2004; CHO & PARK, 2005). A ocorrncia da enfermidade em ces vacinados corretamente bastante citada na literatura, conforme mostram os estudos a seguir. Amude (2005) encontrou quatro ces positivos, dentre 20 selecionados, que foram corretamente vacinados com vacina de vrus vivo modificado. O autor utilizou das tcnicas de RT-PCR e histologia do encfalo para confirmao dos casos de cinomose. Em 2002, numerosos casos de cinomose foram relatados em Windhoek, capital da Namibia, onde cerca de 100 ces foram eutanasiados. Em abril do mesmo ano, veterinrios da costa de Swakopmund, no mesmo pas, reportaram o surto de cinomose com 50 ou mais animais tratados, acima de 100 ces eutanasiados e estima-se cerca de 200 casos no confirmados. Neste mesmo ms um chacal apresentou sinais clnicos, bem como vrios outros animais selvagens. Em algumas localizaes a prevalncia em ces domsticos foi de 72%, e destes 91% eram ces sintomticos. A sequncia encontrada da cepa viral na Namibia foi similar encontrada nos lees africanos (GOWTAGE-SEQUEIRA et al., 2009). O vrus da cinomose foi responsvel pela infeco e mortalidade de ces domsticos e chacais na costa da Namibia entre 2001 e 2003. Este estudo foi a primeira descrio do surto de cinomose em Canis mesomelas (Black-backed Jackals) e a primeira descrio da clnica e achados histopatolgicos nestas espcies (GOWTAGE-SEQUEIRA et al., 2009). Em um surto ocorrido na Finlndia, amostras de clulas epiteliais de 3649 ces foram testadas e 865 casos foram confirmados por testes indiretos de anticorpos fluorescentes. Os sinais clnicos variaram de conjuntivite, febre e anorexia aos sinais respiratrios e gastrintestinais, com estimativa de letalidade de 30% dos ces acometidos. Dos casos confirmados, 631 (73%) tinham entre trs e 24 meses de idade. Destes, 487 tinham sido vacinados pelo menos uma vez e 351 (41%) tinham uma histria completa de vacinao (EK-KOMMONEN et al., 1997). Foi relatado neurite ptica pelo vrus da cinomose em co vacinado, com nove anos de idade, fmea, da raa Jack Russell terrier, onde a apresentao clnica foi o surgimento de sinais neurolgicos de caractersticas agudas e progressivas, apresentando positividade na marcao pela imunoistoqumica do encfalo. Este relato ocorreu em novembro de 2007, em Ontrio, Canad e

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pode estar relacionado com os surtos de cinomose em guaxinim que ocorre periodicamente na regio (RICHARDS et al., 2011). Outro caso relatado foi de um bulldog francs, macho, de oito anos de idade, somente com apresentao neurolgica, animal vacinado (cepa Rockborn), no Texas, EUA. Os pesquisadores realizaram PCR e sequenciamento para identificao do vrus da cinomose e comprovaram seu resultado pela imunoistoqumica pela marcao do vrus em neurnios no encfalo do animal. Foi descartada a doena ps-vacinal porque o animal apresentou sinais clnicos aps trs meses da vacinao e os achados histopatolgicos no foram compatveis com a encefalite ps-vacinal. Sugerese que o animal no desenvolveu resposta imune adequada vacinao, j que no sequenciamento foi detectada cepa selvagem do vrus da cinomose, embora os autores no exclussem possvel mutao na cepa vacinal (SCHATZBERG et al., 2009). Evidncias sugerem que existam diferenas antignicas em reas geogrficas distintas, entre os tipos virais selvagens com relao s cepas vacinais, responsveis pelo ressurgimento da doena. O sequenciamento gentico e anlise filogentica so mtodos que indicam a relao evolucionria entre linhagens coletadas em diversas regies geogrficas e ajudam a entender as diferenas antignicas entre cepas biolgicamente distintas (CASTILLO et al., 2007). O vrus tambm afetar mamferos marinhos da ordem Pinnipedia e Famlia Phocidae (focas), bem como animais da ordem Artiodactyla (Famlia Tayasssuidae) como o caititu e primatas da Famlia Cercopithecidae (van MOLL et al., 1995; HARDER & OSTERHAUS, 1997; FORSYTH et al., 1998). Gatos domsticos e sunos so suscetveis ao vrus, porm nestas espcies no h o desenvolvimento da doena clnica (GASKIN, 1974). Para o vrus da cinomose foi demonstrado que a adaptao molecular ao receptor celular ocorre por alterao no gene H (hemaglutinina) levando a disseminao do vrus para novos hospedeiros no candeos no ambiente selvagem (McCARTHY et al., 2007). Surto de doena respiratria foi descrito em macacos rhesus ( Macaca mulatta) causado pelo vrus da cinomose. Em 2006, doena respiratria em macacos rhesus ocorreu em uma fazenda no sudeste da China. Aproximadamente 10.000 macacos contraram a doena e 4.250 morreram. A morbidade em macacos jovens chegou a 60%, com taxa de letalidade de 30%. Em adultos, a taxa de morbidade foi de 25% e letalidade de 5%. No ano de 2007, os macacos foram vacinados com cepa inativada de pulmes e fgados de macacos mortos. Aps esta vacinao, entre 2007 e 2008 o nmero de casos diminuiu para aproximadamente 100 a 200 casos por ano (QIU et al., 2011). A cinomose se espalhou pela China, particularmente em animais experimentais em Wuhan, Kunming e Beijing (SUN et al., 2010). A doena tambm foi introduzida em pequenos zoolgicos na China. A doena foi descoberta pela sorologia de macacos adultos que sobreviveram doena. Aps esta descoberta, os macacos passaram a ser vacinados com vacina viva atenuada para o vrus da cinomose em 2009. O nmero de casos chegou a aproximadamente 130 em 2009 e reduziu para 20 a 30 em 2010 (QIU et al., 2011).

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A doena clnica foi parecida com sarampo em humanos, incluindo sinais respiratrios, anorexia, febre, erupo de pele por todo o corpo, vermelhido e inchao dos coxins, conjuntivite e descarga nasal mucide espessa, com coma precedendo a morte. Aps a identificao com o sarampo foi realizada reao em cadeia pela polimerase precedida da transcrio reversa (RT-PCR) para o vrus do sarampo e para o vrus da cinomose. Amostras de pulmo foram utilizadas para o diagnstico, sendo que foram negativas para o vrus do sarampo e positivas para o vrus da cinomose. O genoma encontrado foi sequenciado e os resultados mostraram grande similaridade com isolados de ferret e racoons nos EUA (QIU et al., 2011). Os autores no conseguiram achar explicaes para a epidemia na China, pode ter sido pelo contato com guaxinim, ou pelo contato com macacos selvagens, sendo outra possibilidade o contato com grande massa antignica de vrus de ces que sofreram adaptao para novos hospedeiros. Concluram que, embora a vacinao seja amplamente utilizada e a cinomose encontre-se controlada pela vacina viva atenuada. Casos espordicos ainda ocorrem e grande nmero de mutaes so encontradas no vrus tornando futuras transmisses imprevisveis. Portanto, a vigilncia para cinomose deve ser considerada na populao de macacos e nos humanos que entram em contato direto com ces (QIU et al., 2011). O vrus da cinomose pantrpico. Porm, existem diversas cepas, algumas mais neurotrpicas e virulentas que outras. As mais patognicas so a Snyder Hill e R252, que so altamente neurotrpicas e imunossupressoras (CORRA & CORRA, 1992; MORO & VASCONCELOS, 1998; ALVES et al., 2006). Todos os vrus isolados pertencem a um mesmo sorotipo. As vrias cepas isoladas produzem afeces com durao e sinais clnicos distintos: algumas causam enfermidade de mediana patogenicidade, enquanto outras causam enfermidade aguda, altamente mortal, com ou sem encefalite aguda. Outras, ainda, causam encefalite tardia, aps doena branda, ou mesmo aps a recuperao da forma aguda. H ainda cepas que levam muito tempo para exteriorizar seus efeitos encefalitognicos, como o que ocorre na encefalite do co velho ou na hard pad disease ( CORRA & CORRA, 1992). As estirpes Onderstepoort e Rockborn so as mais utilizadas em todo o mundo para a elaborao de vacinas contra o vrus da cinomose (MOCHIZUKI et al., 2002).Devido ao grande potencial neurotrpico, a cepa Snyder Hill a mais utilizada em experimentos de inoculao intraenceflica, tanto em estudos da patognese viral quanto em desafios ps-vacinais (NEGRO et al., 2006 apud SLATER, 1970). A cinomose pode ocorrer em qualquer poca do ano, mas no inverno h elevao na ocorrncia da enfermidade. O co representa o principal reservatrio para o vrus da cinomose e serve como fonte de infeco para animais selvagens. No h diferena de susceptibilidade da infeco entre machos e fmeas. No entanto, ces das raas dolicoceflicas so mais afetados que os braquioceflicos (CORRA & CORRA, 1992; GRANCHER et al., 2004; GREENE, 2006). A idade de maior incidncia da cinomose nos ces coincide com a poca em que diminui a taxa de anticorpos maternos transmitidos passivamente pelo colostro, entre 60 e 90 dias de idade, demonstrando a relao entre susceptibilidade e a idade. No entanto, o vrus pode acometer animais de todas

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as idades (CORRA & CORRA, 1992; BIAZZONO et al., 2001; GEBARA et al., 2004). Sonne (2008) encontrou 78,5% dos ces acometidos pelo vrus da cinomose em animais cuja idade variava de dois a seis meses. No Rio Grande do Sul, de 3.659 necropsias de caninos realizadas, em 582 (16%) o diagnstico foi de doenas virais e, entre estas, a cinomose foi responsvel por 39% (227/582) dos diagnsticos (SONNE, 2008). Mais de 50% das infeces nos ces so subclnicas ou com sinais clnicos moderados (SILVA et al., 2007), ou seja, a taxa de infeco maior do que o nmero dos animais que manifestam a enfermidade, estimando-se em at 75% de ces suscetveis que eliminam o vrus sem qualquer sinal clnico da doena (CORRA & CORRA, 1992; GEBARA et al., 2004). Acima de 30% dos ces exibem sinais de envolvimento neurolgico durante ou aps a infeco sistmica pelo vrus da cinomose e a maior parte dos carnvoros selvagens que morrem pela doena possuem evidncias de infeco no sistema nervoso central (SNC) (RUDD et al., 2006). A transmisso ocorre principalmente por aerossis e gotculas contaminadas com partculas virais em secrees respiratrias, e tambm pelas fezes e urina (CORRA & CORRA, 1992). Durante a exposio natural, o vrus da cinomose se propaga por gotas de aerossis e entra em contato com o epitlio do trato respiratrio superior. No perodo de 24 horas, as partculas virais se replicam nos macrfagos e se disseminam pela via linftica local, para as tonsilas e linfonodos bronquiais (TIPOLD et al., 1992; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 1995; MORO & VASCONCELOS, 1998; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005; GREENE, 2006). Entre 2 a 4 dias ps-infeco, o nmero de partculas virais aumenta nas tonsilas, linfonodos retrofarngeos e bronquiais, mas nmero baixo de clulas mononucleares infectadas encontrado em outros rgos linfides. No perodo de quatro a seis dias ocorre a replicao viral no sistema linfide, medula ssea, timo, bao, linfonodos mesentricos, placas de Peyer, clulas estomacais, clulas de Kupffer e clulas mononucleares ao redor dos vasos pulmonares e bronquiais. A ampla proliferao viral nos rgos linfides induz um aumento inicial na temperatura corporal, entre o segundo e o sexto dia, determinando leucopenia, causada por danos virais nas clulas linfides, afetando as clulas T e B (CORRA & CORRA, 1992; TIPOLD et al., 1992; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 1995; MORO & VASCONCELOS, 1998; GREENE, 2006). A disseminao do vrus no epitlio e no tecido nervoso ocorre entre 8 a 10 dias ps-infeco, por via hematgena e/ou pelo lquor dependendo da resposta imune humoral ou celular do animal (TIPOLD et al., 1992; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 1995; JONES et al., 2000; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005; GREENE, 2006). Ttulos intermedirios de anticorpos podem proteger o animal da doena sistmica, mas no so suficientes para bloquear a infeco do SNC (TIPOLD et al., 1992). Nos ces com nveis intermedirios de resposta imune mediada por clulas e com ttulos de anticorpos que aparecem tardiamente aps 9 a 14 dias, o vrus se dissemina pelos tecidos. Os sinais clnicos podem desaparecer com o aumento da titulao de anticorpos e o vrus eliminado da maioria dos tecidos, assim que os ttulos de anticorpos aumentam, mas podem persistir por

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longos perodos em tecidos uveais, e em neurnios e tegumentos, como nos coxins plantares. A recuperao da infeco est associada com a imunidade a longo prazo e interrupo da replicao viral. A proteo pode ser comprometida se o co for exposto cepa altamente virulenta, dose infectante elevada e/ou sofrer imunossupresso (CORRA & CORRA, 1992; GREENE, 2006). Sugere-se que a infeco do SNC ocorre precocemente na fase sistmica da doena. Neste caso, a cinomose progride da doena sistmica para neurolgica, aparentemente por falha do sistema imune em conter a invaso viral no crebro e na medula espinhal (TIPOLD et al., 1992; SUMMERS et al, 1995; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 1995). Os sinais neurolgicos da cinomose quando acomete o SNC so polimrficos. O curso clnico e neuropatolgico da encefalomielite est relacionado com a variedade da cepa viral e a idade do animal afetado (TIPOLD et al., 1992; SUMMERS et al, 1995; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 1995). Silva et al. (2007) afirmaram que a diferena entre o tipo de leso desenvolvida por filhotes e adultos pode ser tnue, e que embora possa haver maior frequncia de desmielinizao em filhotes, deve-se levar em considerao que os mesmos tambm desenvolvem leses mais crnicas, assim como ces adultos podem desenvolver leses agudas. A difuso viral depende do grau de resposta imune sistmica do hospedeiro e a presena de anticorpos antivirais. Alm disso, a deposio de imunocomplexos pode facilitar a difuso no endotlio vascular do SNC. Livre ou associado s plaquetas ou linfcitos, o vrus penetra nas clulas endoteliais vasculares das meninges, nas clulas do plexo coride do quarto ventrculo e nas clulas ependimrias lineares do sistema ventricular (GREENE, 2006). A ocorrncia frequente de leses periventriculares e subpiais, e o fato do vrus ser encontrado facilmente nas clulas do plexo coride e do epndima, sugerem que penetre nos tecidos cerebrais pelo lquor. Neste, o agente pode ser encontrado em clulas mononucleares fundidas com clulas ependimrias (VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 1995). Em contraste, Rudd et al. (2006) encontraram evidncias de que o vrus invade o SNC pelo bulbo olfatrio nos casos de infeco por via aergena. Quando resposta imune antiviral neutralizante est ausente na fase aguda da cinomose, imunoglobulinas da classe IgM anti-vrus aparecem nas duas primeiras semanas da infeco. Apesar da ausncia de manguitos perivasculares, numerosas clulas CD8+ so encontradas nas leses agudas desmielinizantes e tambm distribudas difusamente no parnquima cerebral, sendo que estas clulas no esto correlacionadas com reas de infeco viral. No lquor destes animais altos ttulos de IL-8 foram encontrados, sugerindo que a ativao inicial das clulas da micrglia serve como precursora da invaso de clulas T no SNC (VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005). A encefalite aguda, que ocorre inicialmente no curso da infeco em animais jovens ou imunossuprimidos, caracterizada por injria viral direta (SUMMERS et al., 1995; GEBARA et al., 2004; GREENE, 2006). O vrus causa leso multifocal nas substncias cinzenta e branca. Leses na substncia cinzenta so resultados de infeco neuronal e necrose, e podem levar a uma poliencefalomalcia. Leses na substncia branca so caracterizadas por danos mielnicos e esto associadas com replicao viral nas clulas da glia.

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Mudanas inflamatrias so mnimas devido imunodeficincia resultante de imaturidade fisiolgica do sistema imune e/ou da imunossupresso viral induzida (VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 1995; GEBARA et al., 2004; GREENE, 2006). Durante a fase inicial da encefalite a expresso de RNAs mensageiros (mRNAs) e das protenas virais so elevadas nas reas afetadas e uma possvel consequncia o aumento da produo do Fator de Necrose Tumoral (TNF) pelos astrcitos. A progresso das leses cerebrais tambm sustentada pela abundncia do vrus na forma imunorreativa presente nas leses no inflamatrias, que se caracterizam pela desmielinizao. O TNF tem sido evidenciado como causador da destruio de oligodendrcitos e perda de mielina em ces com cinomose (GRNE et al., 2000). Vandevelde & Zurbriggen (1995) sugerem que o fenmeno de desmielinizao,decorre da infeco de oligodendrcitos, que so clulas produtoras de mielina. Porm, outros autores observaram que a maioria das clulas infectadas so astrcitos. Estudos de microscopia eletrnica por estes autores revelaram que a infeco de oligodentrcitos rara na cinomose, propondo que o vrus causa infeco discreta nos oligodentrcitos, mas que mesmo assim pode ser responsvel pelo fenmeno de desmielinizao. Estudo ultra-estrutural revelou microvacuolizao e perda de organelas e degenerao de oligodentrcitos. As mudanas morfolgicas so precedidas por disfunes metablicas nestas clulas, com a diminuio drstica da atividade da cerebrosdeo sulfo-transferase (uma enzima especfica de oligodentrcitos) aps infeco do vrus. possvel que a transcrio do vrus interfira nas funes especializadas destas clulas, que so necessrias para a manuteno das membranas mielnicas (VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 1995; VANDEVELDE, 2004; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005). Nos achados de Stein et al. (2004), o vrus induziu a ativao das clulas da micrglia, que podem ter relevncia na patognese da desmielinizao aguda na cinomose, devido ao aumento difuso da regulao do MHC na substncia branca. A ativao destas clulas libera fatores txicos que podem induzir a destruio da mielina (MIAO et al., 2003; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005; STEIN et al., 2006). A formao de radicais livres de oxignio (ROS) pela micrglia pode alterar a transmisso sinptica e destruir diretamente os neurnios. Esta formao de ROS pode ser considerada responsvel pela atividade convulsiva em alguns animais (STEIN et al., 2006). A encefalite multifocal em ces adultos acomete frequentemente animais entre 4 e 6 anos, com curso crnico. A doena no precedida nem coincide com os sinais sistmicos que so observados nos ces jovens (CORRA & CORRA, 1992). O antgeno viral fica restrito a poucos astrcitos. A expresso do MHC classe II proeminente em todas as clulas da micrglia, sendo responsvel pela desmielinizao contnua e disseminada infiltrao mononuclear perivascular. As alteraes se iniciam com hiperplasia dos astrcitos e proliferao microglial em estruturas subpiais e subependimrias na substncia branca. Esta forma tambm est associada com a concentrao elevada de anticorpos antimielnicos, uma provvel reao secundria ao processo inflamatrio. Anticorpos contra o vrus interagem com macrfagos infectados em leses no SNC, causando sua ativao com liberao de radicais livres de oxignio. Esta atividade por sua vez pode levar destruio

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de oligodendrcitos e da bainha de mielina (TIPOLD et al., 1992; SUMMERS et al., 1995; GEBARA et al., 2004; GREENE, 2006; STEIN et al., 2006). A IL-1 importante na patognese de todos os tipos de leses neurolgicas causadas pelo vrus da cinomose. responsvel por estimular a proliferao de astrcitos, que podem iniciar as leses, como as encontradas na cinomose no inflamatria subaguda, que evidenciam frequentemente astrogliose reativa. Encontrada principalmente nos espaos perivasculares da inflamao subaguda e nas leses crnicas, a IL-1 age de forma importante na evoluo da doena (GRNE et al., 2000). Brge et al. (1989) demonstrou que os anticorpos antivirais estimulam a produo de radicais livres de oxignio (ROS) em culturas de clulas cerebrais de ces infectadas com o vrus da cinomose. O mecanismo de produo de ROS depende da expresso do antgeno viral na superfcie de clulas infectadas marcadas com receptores Fc (receptor de anticorpos de alta afinidade) nos macrfagos. Os ROS fazem degradao de fosfolipdios na parte cortical do crebro, destruindo protenas da bainha de mielina, interferindo na produo da mesma. Nesta fase da doena, nos infiltrados perivasculares do SNC so encontradas clulas CD8+, CD4+ e linfcitos B, e citocinas pro-inflamatrias, IL-1, IL-6 e IL-12, indicando resposta imune-mediada (WNSCHMANN et al., 1999; MARKUS et al., 2002). A produo de TNF e tambm de IL-1 e IL-6 pelas clulas locais resulta na induo de molculas de adeso endotelial, como pr-requisito para a migrao de clulas inflamatrias para o SNC e a progresso das leses no estgio crnico, caracterizado por inflamao intensa. Alm disso, a produo de TNF por clulas inflamatrias no responsvel apenas pelo processo de desmielinizao, pela destruio direta de oligodendrcitos resultando na perda de mielina, mas pode levar, tambm, ao recrutamento de mais leuccitos (GRNE et al., 2000). A desmielinizao crnica coincide com a recuperao do sistema imune, entre 6 a 7 semanas ps-infeco, que se apresentam inicialmente nas leses induzidas pelo vrus no crebro como manguitos perivasculares linfocitrios, plasmcitos e moncitos. A resposta inflamatria nas leses desmielinizantes pode levar a progresso da destruio tecidual. Citocinas pr-inflamatrias esto aumentadas, mas as citocinas antinflamatrias permanecem em nveis normais. possvel que astrcitos, o primeiro alvo do vrus, participem da amplificao da resposta imune (VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005). Leses crnicas desmielinizantes so caracterizadas pela reduo ou possvel perda das protenas virais no tecido nervoso, com aumento da regulao do MHC e infiltrao massiva de clulas CD8+, CD4+ e clulas B (MIAO et al., 2003; VANDEVELDE, 2004). O estgio crnico da doena caracterizado por complicaes imunolgicas. A inflamao est associada com a sntese de anticorpos citotxicos-dependentes, que podem induzir a desmielinizao por ao dos anticorpos anti-mielina. Vandevelde & Zurbriggen (1995) concluram que as reaes auto-imunes na cinomose so provavelmente um epifenmeno e que no so primrias no processo de desmielinizao (TIPOLD et al., 1992; VANDEVELDE, 2004). Anticorpos antivirais destinados a superfcies de clulas infectadas com o vrus interagem com os receptores Fc de macrfagos e essa interao resulta

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numa exploso respiratria dos mesmos que liberam ROS. Esses radicais podem ser responsveis pela destruio de oligodendrcitos e compartimentos de mielina. Quimicamente a produo de ROS no sistema xantina/xantinaoxidase, destri seletivamente culturas de oligodendrcitos (VANDEVELDE, 2004; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005). Evidncias experimentais apontam que o vrus induz alteraes nas funes de macrfagos, que esto em grande nmero nas leses de cinomose e possuem papel importante na patogenia da enfermidade. A fagocitose, dependente ou independente de receptores Fc, assim como a habilidade de liberar ROS e a atividade procoagulante dos macrfagos tambm so alteradas aps a infeco. Considerando a relao entre o sistema de coagulao e funes inflamatrias, essas observaes mostram que a infeco pelo vrus da cinomose pode desencadear um potencial destrutivo dos macrfagos e, alm disso, suportar a hiptese de que a desmielinizao espectadora ocorra na cinomose crnica (VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 1995). Os ces clinicamente acometidos encontram-se com as seguintes caractersticas: falta de vacinao ou doses incompletas, vacinas inapropriadas, colostro da me com ttulos inadequados de anticorpos ou a falta do mesmo, imunossupresso e histria de exposio a ces infectados (GREENE, 2006). Aps perodo de incubao de seis dias ou mais, surge a primeira fase clnica da doena, que corresponde ao pico febril e localizao nos rgos linfides, culminando com hipertermia at 41C, anorexia, congesto conjuntival discreta e corrimento seroso ocular e nasal, sendo que geralmente esta fase passa despercebida ao proprietrio. Aps 2 a 3 dias, se houver progresso do vrus por falta de anticorpos, haver disseminao viral para as clulas epiteliais e o segundo pico febril, com sinais caractersticos (CORRA & CORRA, 1992). Podero ocorrer sinais clnicos digestrios, respiratrios ou neurolgicos isoladamente, conjuntamente ou alternadamente. Ocasionalmente surgem sinais neurolgicos aps 1 a 2 semanas do incio dos sinais sistmicos (CORRA & CORRA, 1992; GREENE, 2006; AMUDE et al., 2007). As alteraes neurolgicas podem ter incio aps 3 a 4 meses, ao final dos sinais sistmicos (AMUDE, 2008). De acordo com Tipold et al. (1992) o envolvimento sistmico acontece em um tero dos casos com alteraes neurolgicas, e a mioclonia encontrada em apenas metade desses. Ao contrrio, Amude (2005) encontrou 40% dos ces com apresentao neurolgica sem mioclonias e sem apresentao sistmica, no momento do atendimento hospitalar, em encefalites causadas pelo vrus da cinomose. Os principais sinais oculares e no sistema respiratrio so rinite, conjuntivite, descarga nasocular serosa e mucopurulenta, pneumonia intersticial no incio e posterior evoluo para broncopneumonia devido infeco secundria, caracterizada por tosse mida e produtiva, alm de crepitaes na auscultao (CORRA & CORRA, 1992; GREENE, 2006). No sistema gastrintestinal h ocorrncia de vmitos intermitentes, anorexia, diarria pastosa a lquida, escura, com ou sem presena de sangue, podendo levar a sinais de desidratao nos animais (CORRA & CORRA, 1992; GREENE, 2006). Podem ser observadas pstulas na pele do abdomen e, em alguns casos, hiperqueratose dos coxins digitais (GREENE, 2006).

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Os sinais neurolgicos so mltiplos, decorrentes da replicao viral em neurnios e clulas gliais, refletindo, desta forma, a distribuio do vrus e das leses no SNC (TIPOLD et al., 1992; GREENE, 2006). Animais com apresentao clnica neurolgica focal, no diagnstico pos mortem tiveram uma avaliao neuropatolgica com leses multifocais difusas em vrios stios neuroanatmicos. Em contraste, ces com sinais multifocais tinham leses focais em apenas um stio neuroanatmico (AMUDE, 2008). Independente da ocorrncia de leses neuropatolgicas, a infeco do sistema nervoso pelo vrus da cinomose pode levar a uma variedade de sinais neurolgicos. A infeco pelo vrus determina disfuno molecular dos neurotransmissores nas clulas nervosas, que pode ser responsvel por alguns sinais neurolgicos em ces com cinomose, mesmo que as leses correspondentes em stios neuroanatmicos estejam ausentes ( DINTINO et al., 2006; AMUDE et al., 2010a). A cinomose em ces jovens a forma de apresentao mais comum e caracterizada por convulses, sem mioclonias (THOMAS et al., 1993). Em ces adultos com cinomose a convulso menos frequente que outros sinais clnicos (THOMAS et al., 1993; AMUDE et al., 2007). Convulses e mioclonias so sinais tpicos de leses da substncia cinzenta do SNC, ao passo que dficits visuais e dificuldades motoras, so sinais de leses na substncia branca (GREENE, 2006). Hiperestesia e rigidez cervical e para-espinhal podem ser encontradas em ces como resultado de inflamao das meninges. Entretanto, sinais de leses enceflicas so predominantes em relao aos sinais meningeais (GREENE, 2006). O vrus da cinomose tem predileo pelo ngulo pontinocerebelo e so observados dficits cerebelares e vestibulares. Esses sinais so observados isoladamente ou associados no mesmo animal. No entanto, a combinao dos sinais mais frequente (AMUDE et al., 2006; AMUDE et al., 2007; AMUDE, 2008). Os sinais cerebelares e vestibulares podem representar disfuno na camada cinzenta ou na substncia branca. As regies ndulo e flculo do cerebelo possuem relao com o vestbulo, e os sinais vestibulares podem ocorrer por leses na substncia branca dos pednculos cerebelares, que fazem a conexo entre essas duas reas (AMUDE, 2008; DEWEY, 2006). Quando h acometimento da medula espinhal, a paresia e incordenao de membros so os nicos sinais neurolgicos. As manifestaes comuns incluem a doena vestibular com movimento de cabea, nistagmo, dficits em outros nervos cranianos e da propriocepo. Na doena cerebelar aparecem ataxia com hipermetria e cabea pendente. Cegueira uni ou bilateral e midrase ocorrem tambm devido ao envolvimento do trato e nervo pticos. Atrofia muscular generalizada rara como apresentao clnica de leso focal no crtex (CORRA & CORRA, 1992; TIPOLD et al., 1992; GREENE, 2006). Podem ocorrer convulses parciais ou generalizadas. Porm, a convulso do tipo goma de mascar, classicamente associada com a infeco pelo vrus da cinomose, ocorre frequentemente em ces que desenvolvem poliencefalomalcea dos lobos temporais (GREENE, 2006). Outros sinais neurolgicos incluem: apatia, estupor, alteraes de comportamento, reflexos espinhais anormais, hiperestesia, mioclonias e incontinncia urinria (MORO et al., 2003).

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As mioclonias ou contraes tnico-clnicas so sinais comuns na cinomose e podem estar presentes quando no h outros sinais neurolgicos. Acometem um msculo ou grupo de msculos, como auriculares, temporais, retro-abdominal e flexores dos membros (CORRA & CORRA, 1992; TIPOLD et al., 1992; SUMMERS et al., 1995; GREENE, 2006). O mecanismo neural para as mioclonias se origina pela irritao local de neurnios motores da medula espinhal ou de ncleos de nervos cranianos. considerado um sinal caracterstico da cinomose. Porm, tambm pode ser observada em outras doenas inflamatrias do sistema nervoso dos ces (TIPOLD et al., 1992; GREENE, 2006). A resposta hematolgica na cinomose varia entre os ces, de acordo com a fase da infeco viral (SILVA et al., 2005). A anemia pode ser atribuda ao aumento da destruio dos eritrcitos ou pela diminuio de sua produo. A destruio determinada pela presena do vrus em eritrcitos ou pela deposio de imunocomplexos na membrana destas clulas. A queda da produo pode ser atribuda falncia da medula ssea devido ao estresse desencadeado pela doena. Na maioria dos casos, os eritrcitos apresentamse normocticos e normocrmicos e no h sinais de regenerao medular, como hemcias nucleadas, policromasia, anisocitose ou corpsculos de Howell-Jolly (SILVA et al., 2005). Os achados hematolgicos frequentes na cinomose em ces so linfopenia, em combinao com leucopenia ou leucocitose, anemia, monocitose e raramente trombocitopenia (TIPOLD et al., 1992). O leucograma mais varivel e as infeces bacterianas oportunistas no trato digestrio e respiratrio determinam leucocitose por neutrofilia e o desvio a esquerda (SILVA et al., 2005). A linfopenia uma caracterstica consistente, mas pode estar ausente em alguns casos. Silva et al. (2005) observaram que ces jovens infectados experimentalmente com o vrus da cinomose desenvolveram marcada linfopenia. Segundo Corra & Corra (1992) a linfopenia absoluta causada pela depleo dos tecidos linfides e depende da caracterstica imunossupressora da cepa viral. Silva et al. (2005) referiram que a trombocitopenia achado frequente na doena em ces. Sugerem que na infeco pelo Morbillivirus ocorre aumento de anticorpos antiplaquetas e a trombocitopenia imunomediada com remoo das plaquetas pelo sistema reticuloendotelial. As incluses citoplasmticas denominadas corpsculo de Lentz ou de Sinigaglia-Lentz, que aparecem em algumas clulas do sangue, em pequeno nmero nos linfcitos, neutrfilos e hemcias, possuem particular relevncia no diagnstico clnico da cinomose. A ocorrncia dessas incluses em leuccitos evidencia a presena do vrus, mas quando no encontradas possuem pouco valor na determinao da ausncia do vrus, j que so observadas somente na fase virmica da doena (CORRA & CORRA, 1992; JONES et al., 2000). No exame bioqumico os achados no so especficos na cinomose, porm pode ocorrer hipoalbuminemia ou hiperglobulinemia. Evidente hipoglobulinemia encontrada em filhotes infectados antes de nascer ou neonatos com imunossupresso persistente causada pelo vrus (TIPOLD et al., 1992; GREENE, 2006).

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A anlise do lquido cefalorraquidiano (LCR) um dos melhores mtodos de diagnstico das afeces do encfalo e da medula espinhal. O exame do LCR indicado em todo animal com doena neurolgica na qual no h diagnstico conclusivo, incluindo casos com suspeita de afeco intracraniana (PELLEGRINO et al., 2003). Segundo Gama et al. (2005), as caractersticas fsico-qumicas do lquor tais como, colorao, aspecto, densidade, pH e glicose no indicam qualquer anormalidade liqurica nas diferentes fases da cinomose. Por outro lado, o componente protico e a celularidade liqurica mostraram alteraes significativas na presena de sinais neurolgicos. Porm, na ausncia destas alteraes, no adicionam informaes suficientes para a deteco precoce de leses do SNC. Durante o estgio de desmielinizao aguda no ocorrem reaes inflamatrias e, consequentemente, as protenas e as clulas do lquor podem estar normais (TIPOLD et al., 1992; GREENE, 2006). No estgio crnico da cinomose, a inflamao determina aumento de protena (> 25 mg/dL), principalmente representado por IgG-antivrus e aumento da celularidade (> 10/l), com predomnio de linfcitos (CORRA & CORRA, 1992; TIPOLD et al., 1992; SUMMERS et al., 1995; GREENE, 2006). O aumento dos anticorpos antivrus no lquor oferece evidncia da encefalite pela cinomose, pois estes anticorpos so produzidos no local, e este aumento no encontrado em animais vacinados ou na cinomose sistmica sem alteraes neurolgicas (GREENE, 2006). O prognstico da doena reservado na fase sistmica, pois pode progredir para a fase neurolgica. Nesta fase torna-se desfavorvel, pois comumente progressiva, raramente estacionando, levando morte em curso agudo ou crnico. Os animais que se recuperam podem ficar com sequelas inabilitantes (CORRA & CORRA, 1992). Segundo Kim et al. (2006), a combinao de alguns sinais como inflamao conjuntival, secreo respiratria, diarria e sinais nervosos e curso da doena com trs semanas ou mais sugerem diagnstico presuntivo da cinomose. Em regies endmicas para cinomose, a mesma deve sempre ser considerada no diagnstico de ces com alteraes neurolgicas, independente do tipo, curso, extenso e natureza da doena (AMUDE et al., 2010a). Vrios testes foram avaliados em todo mundo para o diagnstico do vrus da cinomose, como reao de imunofluorescncia indireta, isolamento viral, teste de soro neutralizao, reao em cadeia pela polimerase e ELISA. Os mtodos sorolgicos, que mensuram em amostras de soro IgG ou IgM especficos para o vrus, so indicados quando o animal est na fase aguda da doena (KIM et al., 2006; LATHA et al., 2007). No entanto, segundo Greene (2006), o aumento dos ttulos de IgM e de IgG no soro so ambguos e podem, ambos, indicar infeces anteriores e recentes em ces com ou sem vacinao para cinomose. J a anlise dos nveis de IgG especfica no lquor pode ser usado para mensurar anticorpos na fase crnica da infeco do SNC. No intuito de oferecer novas tcnicas de diagnstico, Latha et al. (2007) identificaram uma nucleoprotena que aparece nos estgios iniciais da infeco nas clulas hospedeiras e em infeces naturais h produo de anticorpos diretos. Ento, o desenvolvimento de ELISA com nucleoprotena recombinante

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se mostrou superior a outros mtodos sorolgicos, oferecendo alta reprodutibilidade, ausncia de reaes cruzadas, facilidade de realizao em relao deteco de anticorpos pela imunofluorescncia indireta, alm disso, esse mtodo no requer o cultivo viral. Pode ser utilizado para detectar o aumento do ttulo de IgG ou nveis de IgM especficos visando monitorar a eficcia do programa de vacinao. No SNC o vrus causa leses caracterizadas por reas de necrose bem delimitadas, desmielinizao e incluses intranucleares principalmente em astrcitos. A observao dessas leses em cortes histolgicos confirma o diagnstico da infeco pelo vrus (SUMMERS et al., 1995; JONES et al., 2000; GEBARA et al., 2004; GREENE, 2006). O estudo de Damin et al. (2005) mostrou que a imunoistoqumica mais sensvel que a histopatologia de corpsculos de incluso, considerada complemento do diagnstico histopatolgico. Sonne (2008) analisou o encfalo de 54 ces e observou que 29 deles apresentavam alguma leso microscpica. Na marcao imunoistoqumica dos 54 animais utilizados, 51 ces apresentaram marcao positiva em pelo menos um rgo, demonstrando que 94,4% dos animais com diagnstico macroscpico e microscpico de cinomose tiveram marcao positiva na imunoistoqumica. importante ressaltar que, no mesmo estudo, foram encontrados dois animais que no apresentaram alteraes microscpicas no crebro, porm o antgeno viral foi visualizado por teste imunoistoqumico. No diagnstico post-mortem a imunoistoqumica tem sido utilizada para detectar o gene da protena do nucleocapsdeo, que uma protena interna e mais transcrita em clulas infectadas, considerado bom indicador de infeco (SHIN et al., 1995). Os astrcitos so as principais clulas marcadas pela imunoistoqumica para detectar o vrus da cinomose, chegando a 95% de clulas infectadas (MUTINELLI et al., 1998). Haines et al. (1999) detectaram o antgeno no epitlio da mucosa nasal, dos coxins digitais e da pele, sugerindo a utilizao da tcnica de imunoistoqumica para o diagnstico ante-mortem da cinomose. Na cinomose aguda, com leses no inflamatrias, encontra-se grande quantidade de antgeno viral no centro das leses. A medida que a resposta imune comea a agir nas leses crnicas mais difcil de encontrar o antgeno viral, podendo resultar em marcao negativa na imunoistoqumica (VANDEVELDE et al., 1985; BOLLO et al., 1986; BAUMGRTNER et al., 1989; MULLER et al., 1995). A tcnica de isolamento viral em cultivo celular altamente especfica, porm demorada e pode resultar em falso-negativo se o animal no estiver na fase aguda da doena. O sucesso da replicao viral ocorre durante o cultivo direto de tecidos infectados do hospedeiro. Culturas de macrfagos detectam o vrus entre 24 a 48 horas, porm foram substitudas pela cultura de linfcitos caninos para o isolamento do vrus. A formao de clulas gigantes, considerada citoptica do vrus da cinomose em vrias culturas de tecido, detectada com dois a cinco dias (BARRETT, 1999; GEBARA et al., 2004). O diagnstico de rotina do vrus da cinomose pela imunfluorescncia aplicado em vrias amostras, conjuntival, nasal e vaginal, usando anticorpos policlonais ou monoclonais. Este teste pouco sensvel e detecta o antgeno viral somente em infeces com trs semanas, quando o vrus est presente em clulas epiteliais (ELIA et al., 2008 apud APPEL, 1987).

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O uso do imunoensaio cromatogrfico para pesquisa de antgenos da cinomose foi descrito por Santos (2008). Neste estudo foram utilizados 38 animais saudveis, sendo que apenas um apresentou positividade no teste rpido. O diagnstico da cinomose pode ser realizado de forma rpida e especfica utilizando kit comercial de imunoensaio cromatogrfico para pesquisa do antgeno do vrus da cinomose na mucosa nasal, saliva, conjuntiva, urina, soro e plasma. Afirma-se que este teste atinja 98,8% de sensibilidade e 97,7% de especificidade, no causando reao cruzada com outras infeces (Antigen Rapid CDV Ag Test Kit, Bioesay). A maior desvantagem deste teste a possibilidade de falso negativo, j que a amostra selecionada pode no conter o antgeno, sendo esta evidncia encontrada quando relacionada com a fase da enfermidade, ocorrendo comumente na fase neurolgica. Este mtodo no detecta o vrus vacinal, pela baixa titulao nas vacinas, do 1 ao 14 dia aps a vacinao (Antigen Rapid CDV Ag Test Kit, Bioesay). O antgeno viral pode ser difcil de detectar em outros tecidos em casos de cinomose em fase nervosa, sem sinais sistmicos, mas pode ser detectado nas clulas do lquor com o teste de imunofluorescncia indireta usando anticorpos antivrus (TIPOLD et al., 1992; GREENE, 2006). Atualmente, a tcnica da reao em cadeia pela polimerase precedida de transcrio reversa (RT-PCR) vem sendo empregada com sucesso na deteco do vrus da cinomose em diferentes tipos de amostras biolgicas provenientes de ces com sinais clnicos sistmicos e neurolgicos (BARRETT, 1999; GEBARA et al., 2004). Segundo Gebara et al. (2004) possvel detectar o cido nuclico do vrus em urina de ces, tanto com encefalite aguda quanto crnica. Estes resultados demonstram que a tcnica de RT-PCR um mtodo eficiente para realizao do diagnstico rpido, precoce e in vivo (SAITO et al., 2006; SATO et al., 2006; ELIA et al., 2008). 2. RT-PCR Segundo Frisk et al. (1999), o RT-PCR um mtodo rpido, sensvel e especfico para o diagnstico da infeco pelo vrus da cinomose em ces. Nos seus resultados, foi detectado o RNA viral pelo RT-PCR em 86% das amostras de soro sanguneo e 88% de sangue circulante e lquor de ces com cinomose confirmado pela imunoistoqumica. O RNA viral no foi encontrado na imunoistoqumica em animais antgeno-negativo ou em ces vacinados, sugerindo previamente que a vacinao no causa resultados falso-positivos. A degradao autoltica do RNA viral causada por RNAases endgenas deve ser considerada na possibilidade de resultado falso-negativo. No entanto, Sato et al. (2006) afirmam que o soro e o sangue perifrico no so boas amostras para a deteco do vrus da cinomose pela RT-PCR quando o co apresentar apenas distrbios neurolgicos sem envolvimento sistmico da doena. A baixa celularidade do lquor pode ser insuficiente para a preparao da amostra, que pode causar inadequado isolamento do RNA viral. A sensibilidade da tcnica da PCR pode variar com a seleo dos primers, mtodo de extrao do RNA e amostra clnica analisada (AMUDE, 2005). A sequncia de genes do vrus da cinomose no sentido 3 a 5 pela protena do nucleocapsdeo (N), fosfoprotena (P), protena de matrix (M),

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protena de fuso (F), hemaglutinina (H) e protena grande (L) (AMUDE et al., 2010b). A escolha do iniciador (primer) gene-especfico requer cuidado e conhecimento sobre a replicao dos Paramyxovirus. Genes distais (L, H e F) so os ltimos a serem transcritos durante a replicao e genes das protenas do ncleo (N e P) possuem maior frequncia na transcrio. O gene-alvo para a amplificao na RT-PCR deve ser preferencialmente do ncleo para evitar ou minimizar os resultados falso-negativos (AMUDE et al., 2010b). O sequenciamento dos genes amplificados pela RT-PCR pode levar a classificao das cepas virais do vrus da cinomose e na diferenciao das cepas selvagens ou vacinais (HEADLEY et al., 2009; SCHATZBERG et al., 2009). A maior vantagem da PCR em tempo real a habilidade de quantificar partculas virais em amostras clnicas, ao contrrio da RT-PCR convencional que uma anlise qualitativa. Alta carga viral foi demonstrada em tecidos linfides, como tonsilas, bao, linfonodos mesentricos; vsceras e urina. No SNC, no lobo frontal foi encontrada alta concentrao viral, sugerindo ser a rea mais sensvel para diagnstico (ELIA et al., 2008). As amostras de sangue perifrico, swab conjuntival, secreo nasal, urina, lquor, e swab vaginal, tecido pulmonar, estomacal, intestinal e urinrio, podem ser utilizadas para o diagnstico de cinomose pela tcnica RT-PCR. Entretanto, o swab conjuntival o mais apropriado para o diagnstico in vivo da cinomose (KIM et al., 2006). Shin et al. (2004) levantaram a hiptese de utilizao do nested PCR para diagnstico da cinomose. A efetividade da tcnica foi demonstrada em amostras de sangue, urina, swab nasal e saliva. Sendo um mtodo ideal para deteco do vrus da cinomose em amostras clnicas, apresentou alta sensibilidade e consistncia no desempenho laboratorial. Comparativamente RT-PCR, mostrou positividade em todas as amostras testadas (JZWIK & FRYMUS, 2005). Segundo Jzwik & Frymus (2005), o resultado de ambos RT-PCR e reao de imunofluorescncia direta foram positivos em animais poucos dias aps a vacinao, e confirmou que ambos os mtodos podem levar ao diagnstico falso-positivo de cinomose em ces vacinados com vacina de vrus vivo modificado. Portanto, o tempo mnimo entre vacinao e o exame em ces doentes deve ser de seis semanas para excluir o resultado falso-positivo. Em seus resultados sugerem que a sensibilidade do teste de imunofluorescncia 50% menor que o nested PCR. Contudo, RT-PCR combinado com o nested PCR mostrou-se o mais especfico e sensvel mtodo para diagnstico antemortem da cinomose, especialmente nas formas subagudas e crnicas, quando o vrus no se encontra mais em epitlios e a reao de imunofluorescncia foi negativa. 3. Tratamento de ces com cinomose e Profilaxia Ainda no existe tratamento efetivo para a cinomose, o que explica a importncia dessa enfermidade em medicina veterinria (TIPOLD et al., 1992; CORRA & CORRA, 1992; KAJITA et al., 2006). Apesar de no existirem muitos estudos atuais sobre o assunto, Corra & Corra (1992) recomendavam a administrao de soro hiperimune (gama globulinas especficas) distribuindo-o em vrios locais por via subcutnea, em

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dose nica. A ao do soro hiperimune , fundamentalmente, de soroneutralizao de todos os vrus livres, e que se libertam eventualmente dos tecidos. O soro homlogo permanece ativo no animal por 15 a 30 dias, baixando seu ttulo gradualmente, formando complexos antgeno-anticorpo com o vrus, por metabolizao e eliminao progressiva. No entanto, quando h alteraes do sistema nervoso, o soro hiperimune pode no impedir o avano da doena, pois apenas neutraliza os vrus circulantes, no atuando sobre as partculas virais que ultrapassaram a barreira hematoenceflica. Se o animal j foi vacinado pelo menos uma vez, aplicar uma dose de vacina, que poder estimular clulas-memria e rapidamente produzir imunidade ativa (CORRA & CORRA, 1992). Animais com infeco no trato respiratrio superior ou pneumonia, que frequentemente causada por complicaes bacterianas secundrias, devem ser tratados com antimicrobianos de amplo espectro, ativos principalmente contra Bordetella bronchiseptica, Staphylococcus spp. e Streptococcus spp. Os frmacos mais utilizados so amoxicilina, cloranfenicol, florfenicol, cefalosporinas, fluorquinolonas e aminoglicosdeos. A terapia antimicrobiana pode ser alterada quando realizado antibiograma de lavado transtraqueal ou quando no h resposta ao antimicrobiano de escolha. Podem ser utilizados tambm expectorantes ou nebulizao (CORRA & CORRA, 1992; GREENE, 2006). A hidratao dos animais com soluo de Ringer, para hidratar e ao mesmo tempo manter o equilbrio eletroltico. Pode-se adicionar 2,5 a 5% de glicose ao Ringer e administrar glicose como fonte energtica para animais anorxicos (CORRA & CORRA, 1992; GREENE, 2006). Anticonvulsionantes devem ser utilizados, como o fenobarbital na dose de 2 mg/Kg pelas vias intravenosa, intramuscular ou oral, a cada 12 horas. Corticosterides, como a dexametasona na dose de 2,2 mg/Kg, por via intravenosa, podem ser utilizados devido a base imunopatolgica das leses neuronais e para reduzir o edema cerebral, mantendo a terapia com doses antinflamatrias, posteriormente, reduzindo a dose at o final do tratamento. A imunossupresso causada pelos esterides a principal desvantagem, porque a resposta inflamatria responsvel pela retirada do vrus. Na encefalite multifocal progressiva causadora de tetraplegia, semicoma e incapacitao a eutansia recomendada (TIPOLD et al., 1992; GREENE, 2006). A mioclonia irreversvel (GREENE, 2006). Como os macrfagos e seus produtos, especialmente radicais livres de oxignio, so importantes na induo da destruio do tecido nervoso na cinomose, antioxidantes como vitamina E e vitamina C podem ser utilizados terapeuticamente (TIPOLD et al., 1992). O cido ascrbico no s considerado um simples anti-oxidante, mas tambm neuromodulador do sistema nervoso central (GRNEWALD, 1993; REBEC & PIERCE, 1994). Matsumoto et al. (2010) comprovaram que a quantidade de cido ascrbico no crebro aumenta em resposta ao excesso de glutamato, que encontrado em diversos modelos de destruio tecidual, incluindo convulses induzidas. Outras medidas teraputicas apropriadas podem ser recomendadas ou executadas, conforme a gravidade da doena: vitamina A para a proteo e regenerao de epitlios, vitamina C como fator trfico dos tecidos mesenquimais, do retculoendotlio e indiretamente do sistema imunopoitico,

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vitaminas do complexo B como tnicas e regeneradoras da fisiologia nervosa, para antialgia e mielopoiese e estimulante de apetite (CORRA & CORRA, 1992; GREENE, 2006). No incio do sculo XX as vacinas inativadas eram amplamente utilizadas, porm a cinomose ainda ocorria em ces e animais de zoolgico (APPEL & SUMMERS, 1995). A partir dos anos 60, com as vacinas atenuadas houve diminuio considervel na incidncia da cinomose em todo mundo (LAN et al., 2006; RIKULA et al., 2007). Vacinas preparadas a partir de passagens em cultura de clulas de aves e embrio de galinha, ou em clulas de ces, foram amplamente utilizadas. As vacinas preparadas em cultivo de clulas de ces induzem imunidade em quase 100% dos ces vacinados (APPEL & SUMMERS, 1995; PARDO et al., 2007). A utilizao de vacinas recombinantes (recCDV ou rD) tem sido realizada nos Estados Unidos da Amrica desde 1997, tendo como benefcio a no ocorrncia de encefalite ps-vacinal (PARDO et al., 2007). Vacinas produzidas com as amostras do vrus da cinomose, isoladas de ces naturalmente infectados, como as amostras Snyder Hill, Rockborn, Onderstepoort, adequadamente atenuadas em culturas de clulas, so eficientes em induzir o estado de imunidade dos animais vacinados, protegendo-os contra a infeco natural (BIAZZONO et al., 2001). Estas cepas, atualmente so consideradas velhas, chamadas de old CDV e as cepas novas, chamadas de new CDV de v rias partes do mundo, possuem o gene e a protena H com caractersticas diferentes (MOCHIZUKI et al., 2002). A atual estratgia vacinal baseada em mltiplas doses de vacinas, administradas a intervalos de trs a quatro semanas, devido s dificuldades de mensurar os ttulos de anticorpos do filhote de forma rotineira. Aps a administrao da primeira dose de vacina, os ces j apresentam ttulos de anticorpos em nveis protetores e, aps a revacinao anual, os ttulos perduram por mais de 12 meses, no indicando a necessidade de reforo imediatamente aps um ano (BIAZZONO et al., 2001). Segundo Chappuis (1995) a via intravenosa no recomendada para a vacinao. O uso por esta via deve ser com vacinas que possuem apenas o antgeno de cinomose e possvel observar uma completa proteo aps 48 horas da aplicao, em relao aplicao subcutnea que tem uma resposta aps cinco dias. Porm, a vacinao intravenosa pode ser necessria nos casos emergenciais, como a infeco de um filhote antes da primeira dose de vacina. A epidemiologia molecular tem sido utilizada para investigar a origem das cepas virais e a dinmica de circulao do vrus em animais susceptveis. Segundo Martella et al. (2007), a variao de aminocidos entre as linhagens do vrus da cinomose foi maior que 4 %, em relao a todos os outros genotipos do vrus da cinomose. A maior variao (> 8 %) foi observada nas cepas de Amrica-1, usadas no desenvolvimento de vacinas vivas modificadas atualmente comercializadas. A variao gentica e antignica na protena H entre as cepas novas e velhas, causa dvidas na eficcia das vacinas atuais (IWATSUKI et al., 2000). A partir da demonstrao da variao antignica, pode-se questionar a efetividade das vacinas utilizadas nos ces, que so protetoras por uma forte e ativa resposta imune encontrada aps administraes repetidas. possvel, entretanto, que a substituio de aminocidos em certas pores da protena H

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de cepas circulantes passa permitir falha na resposta de anticorpos maternais em filhotes no vacinados (MARTELLA et al., 2007). Negro et al. (2006) referiu que as falhas vacinais podem ocorrer por mltiplos fatores como interferncia de anticorpos passivos, falhas individuais na resposta imune, qualidade, conservao e variabilidade antignica do imungeno e infeco anterior vacinao. O estudo realizado por Dahl et al. (2004) foi o primeiro a demonstrar que a vacina de DNA pode induzir a produo de altos nveis de anticorpos neutralizantes e completa proteo contra o vrus da cinomose no hospedeiro natural. As vacinas de vrus vivo atenuado induzem boa resposta em ces, porm podem induzir infeco virulenta em outras espcies. Como o gene da protena H quando aplicado no msculo pode induzir a produo de anticorpos IgG1 e, surpreendentemente, o DNA da protena F produz resposta de IgG1 e IgG2a, a vacina de DNA pode ser favorvel na estratgia vacinal de animais selvagens (SIXT et al., 1998). No entanto, Barrett (1999) relata que a maior desvantagem da vacina recombinante a pequena durao da sua imunidade quando comparada com a vacina de vrus vivo atenuado convencional. 4. Ribavirina O interesse na quimioterapia antiviral iniciou em 1950, quando a pesquisa de agentes antitumorais gerou interesse em inibidores da sntese de DNA e foram produzidos vrios compostos capazes de inibir a sntese de DNA viral. Agentes antivirais foram utilizados pela primeira vez com sucesso nos anos 1960, quando Bauer administrando thiosemicarbazone (methisazone) impediu doenas em pacientes expostos varola, enquanto Kaufman obteve melhora de pacientes com herpes utilizando idoxirudine tpico (BEAN, 1992). Em 1970, a ribavirina foi sintetizada pela primeira vez como parte de esforo intensivo de busca por novos agentes antivirais. No primeiro momento, foi desenvolvido para ser um anlogo a nucleotdeo de pirimidina. Porm, estruturalmente e funcionalmente mais parecida a guanosina (BEAN, 1992). Outros autores afirmaram que somente em 1972, Joseph Witkowski e Roland Robins sintetizaram a ribavirina pela primeira vez, pela combinao qumica dos derivados carboxamide e ribofuranoside mostrando que poderia ser um promissor agente antiviral de amplo espectro. A atividade antiviral da ribavirina especificamente associada a sua estrutura, o que faz com que alteraes na ribose ou na base resultam em perda significativa da atividade antiviral (GILBERT & KNIGHT, 1986; LIN et al., 2003). Atualmente, a forma industrial da produo da ribavirina ocorre pela utilizao do genoma da bactria Bacillus amyloliquefaciens cepa TA208 para produo de guanosina, tambm utilizada para a produo do frmaco pela assimilao da formamida pela fermentao (ZHANG et al., 2011). Nestas pesquisas iniciais envolvendo agentes antivirais de reduzida eficcia, os frmacos apresentavam apenas efetividade in vitro. Entretanto, a ribavirina (1--D-ribofuranosyl-1H-1,2,4-triazole-3-carboxamide) foi um agente antiviral que mostrou atividade in vivo contra grande variedade de vrus DNA e RNA (GILBERT & KNIGHT, 1986).

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A ribavirina foi aprovada pela U.S. Food and Drug Administration para o tratamento peditrico da infeco pelo vrus sincicial respiratrio e sua combinao com alfa-interferon para infeco crnica pelo vrus da hepatite C. Recentemente, benefcios teraputicos do antiviral tem sido avaliados para o tratamento de sndrome respiratria severa aguda e infeco do vrus da varola, em casos de bioterrorismo (WU et al., 2005). A ribavirina usada rotineiramente no tratamento de hepatite C crnica associada com o interferon-alfa (IFN-). O mecanismo pelo qual a ribavirina contribui junto com o IFN- na terapia da hepatite C crnica no muito bem entendido. No entanto, sugere-se que a ao como antiviral, decorra de mutaes no RNA, por mecanismos indiretos como aumentar a imunidade mediada por clulas T frente aos agentes virais, ou por inibio da enzima iosina monofosfato desidrogenase - IMPDH (VOLLMER et al., 2004). Atualmente a terapia antiviral em pacientes com hepatite C tem sobrevida de aproximadamente de 55% (SUNG, et al., 2011). A ribavirina frmaco antiviral, anlogo guanosina, inibidor da replicao in vitro de alguns RNA e DNA-vrus, incluindo Herpesvirus, Poxvirus, Influenza vrus, Parainfluenza vrus, Reovirus, Togavirus, Paramyxovirus e Tumor RNAvrus. In vivo, o espectro antiviral restrito, com ao contra Herpesvirus, Influenza virus, Parainfluenza, Paramyxovirus do Sarampo e Adenovirus (HAYDEN & DOUGLAS, 1990). At o momento, a ribavirina o nico antiviral aprovado e comercializado disponvel para Arenavirus. Demonstrou reduzir o nmero de bitos quando administrada no incio da infeco pelo Vrus da Febre de Lassa (CHARREL et al., 2011). Enria et al. (1987) demonstraram a ao da ribavirina frente a Febre Hemorrgica da Argentina, provando a sua eficcia em casos com poucos dias de sinais clnicos. No estudo realizado por Cashman et al. (2011), a dose de 25 mg/Kg de ribavirina por via intraperitoneal em cobaias demonstrou atividade antiviral pela reduo da viremia e por prolongar a sobrevida frente ao Vrus da Febre de Lassa. Nenhum antiviral est disponvel em dias atuais para o tratamento especfico de doenas causadas por Hantavrus. O nico antiviral que mostrou alguma atividade in vitro e com possibilidade para o uso in vivo foi a ribavirina. A eficcia do frmaco depende da fase da infeco e a severidade da doena ao se iniciar o tratamento (CHARREL et al., 2011). A Organizao Mundial da Sade (WHO) recomenda atualmente o uso da ribavirina como teraputico para a Febre Hemorrgica da Crimeia-Congo, tambm descrita como efetiva contra este vrus in vitro, embora esta eficcia seja controversa. Bodur et al. (2011) administrou a ribavirina por via oral na dose de 4 g/dia, durante 4 dias, seguido de 2,4 g/dia por mais 6 dias, no havendo eficcia no tratamento desta doena. A WHO recomenda a dose de 30 mg/Kg como dose inicial, a seguir 15 mg/Kg, a cada 6 horas por 4 dias, e aps 7,5 mg/Kg a cada 8 horas por 6 dias para tratamento da Febre Hemorrgica da Crimeia-Congo (ELALDI et al., 2009). Elaldi et al. (2009) verificaram que a ribavirina no foi capaz de melhorar os quadros de Febre Hemorrgica da Crimeia-Congo. Encontraram neste estudo toxicidade da ribavirina em pessoas que tinham comprometimento renal e

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heptico, alm de hemorragias. Sugeriram que a ribavirina em altas doses por via oral pode levar a falncia mltipla de rgos em casos severos da doena. Wright et al. (2005) comprovaram a eficcia da ribavirina em humanos infectados pelo vrus Hendra, tambm da famlia Paramyxoviridae. Foi comprovada a eficcia frente doena de Borna, em gerbis, com a diminuio da replicao viral com doses baixas como 1 mg/Kg, com tratamento de 10 dias aps a infeco. Neste mesmo estudo, comprovaram a ao da ribavirina em clulas da micrglia e a baixa produo de citocinas no crebro (LEE et al., 2008). A ribavirina foi testada frente ao Metapneumovrus Humano em infeco de ratos. Neste estudo, o antiviral foi associado a glicocorticide, demonstrando melhor resultado j que houve diminuio da inflamao nos pulmes. A dose utilizada foi de 40 mg/Kg e a ribavirina demonstrou ao frente ao Metapneumovrus Humano (HAMELIN et al., 2006). Segundo Gilbert & Knight (1986) existem trs possveis mecanismos de ao da ribavirina: a diminuio na concentrao intracelular de guanosina trifosfato (GTP) por uma inibio competitiva da inosina-monofosfato desidrogenase (IMPDH) e duas aes especficas no vrus: inibio da formao de mRNA e inibio da funo de codificao da RNA polimerase. A fosforilao intracelular, que forma derivados mono, di e trifosfatos, mediada por enzima da clula hospedeira (adenosina-quinase). A ribavirina monofosfato compete inibindo a IMPDH e interfere com a sntese da GTP. Consequentemente, a composio do local do nucleotdeo marcadamente alterado, impedindo a sntese de cido nuclico e do RNA viral. A queda da concentrao do competidor da guanosina pode potencializar outros efeitos antivirais (HAYDEN & DOUGLAS,1990; BEAN, 1992; CROTTY et al., 2002; WU et al., 2005). No entanto, quando aumenta a fosforilao ocorre leve diminuio na sua ao antiviral (CHANG & HEEL, 1981). A ribavirina pode produzir vrus mutantes por imitar os pares de bases adenosina e guanosina, que interagem com a timidina e citosina, no genoma viral. Por isso, a incorporao da ribavirina trifosfato no genoma viral pode induzir uma mutao e levar a um erro catastrfico no vrus. Como um anlogo do nucleotdeo de guanosina, a ribavirina trifosfato incorporada no lugar da guanosina monofosfato produzindo alterao na estrutura para transcrio do RNA viral, contribuindo para a diminuio da translao do genoma viral, chamada de mutagnese letal (CROTTY, et al., 2001; WU et al., 2005). Segundo Crotty et al. (2001) o principal efeito antiviral da ribavirina a mutao letal no genoma viral. No entanto, a efetividade in vivo contra RNA vrus depende do acmulo da ribavirina e da ribavirina trifosfato em alguns tecidos. Segundo Bean (1992) a ribavirina inibe a formao do mRNA, como um passo importante na replicao de muitos vrus. capaz de inibir diretamente vrus que so dependentes de RNA polimerase, como o Vrus da Influenza. Foi demonstrado que a ribavirina trifosfato pode ser incorporada na polimerase de Poliovirus como um anlogo de nucleotdeo. Atua como uma cadeia terminal (capping) que impede a replicao viral pela formao de mutaes. Este mecanismo de ao explicaria seu amplo espectro frente aos RNA vrus (CROTTY et al., 2002). Entretanto, todos ou nenhum dos mecanismos de ao descritos podem estar acontecendo a qualquer momento, contudo dependem do vrus

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infectante. Essa a principal caracterstica para a melhor inibio e para explicar a falha na deteco de resistncia viral (GILBERT & KNIGHT, 1986). O tratamento do Poliovrus em humanos com ribavirina, em altas doses, resultou em extino da populao pela ao mutagnica letal no gerando vrus resistentes. Quando foi aumentada ainda mais a concentrao da droga, foram observadas cepas virais resistentes. A mutao que torna os vrus resistentes ocorre na polimerase, devido a sua baixa taxa de mutaes, por isso alguns autores sugerem a combinao de terapias (VIGNUZZI et al., 2005). No grupo dos Paramyxovirus todos os componentes so sensveis a ribavirina, e o vrus do sarampo o mais sensvel (CHANG & HEEL, 1981). Pacientes com sarampo podem apresentar complicaes clnicas como otite, diarria, pneumonia ou encefalite em 10% dos casos, e a infeco do sistema nervoso central muito difcil de ser tratada por causa da barreira hematoenceflica (PARDRIDGE, 2003). Apenas um estudo revelou a passagem da ribavirina pela barreira hematoenceflica, aps administrao por aerosol em ratos (GILBERT & WYDE, 1988). A efetividade da ribavirina oral contra o sarampo foi reportada no Mxico, Brasil e nas Filipinas. Nestes relatos a dosagem diria usada foi de 10 mg/Kg de peso corporal, por cinco a sete dias. No foi encontrada anemia e nenhuma alterao clnica ou laboratorial, sugerindo que no houve evidncias de toxicidade. A ribavirina por via oral efetiva no tratamento da infeco aguda pelo vrus da hepatite A, sarampo e febre de Lassa (GILBERT & KNIGHT, 1986). A sua utilizao na encefalite subaguda esclerosante (SSPE) causada pelo vrus do sarampo preconizada por alguns pesquisadores. No estudo de Hara et al. (2003), a ribavirina em associao com o interferon, foi administrada por via intratecal e sua eficcia testada pela PCR em tempo real no lquor. Apesar de no terem observado melhora clnica dos pacientes, no foi encontrado mais o vrus livre no lquor. Assim, os autores sugeriram que o agente poderia estar no parnquima cerebral, j que os pacientes desenvolveram ttulos de anticorpos para o vrus do sarampo no lquor. Embora a ribavirina tenha sido capaz de combater o vrus livre no lquor, o micro-organismo continuou a se replicar no parnquima cerebral. Ainda no foi estabelecida nenhuma terapia especfica para a SSPE em humanos (TEKGL et al., 1999). Porm, a ribavirina tem sido testada nas infeces virais e mostra-se eficiente na estabilizao do quadro clnico neurolgico (TAKAHASHI et al., 1998; SOLOMON et al., 2002). Hosoya et al. (1989) descreveram a eficcia do frmaco frente ao vrus da SSPE e doses de ribavirina em concentraes baixas que no causam citotoxicidade. A ribavirina inibe a replicao de vrias cepas do vrus de SSPE in vitro e in vivo em animais experimentais, quando a sua concentrao liqurica atinge 7,5 g/mL (TAKAHASHI et al., 1998; GRANCHER et al., 2004). Concordando com estes autores, Wyde et al. (2000) demonstraram que a ribavirina foi eficaz contra o sarampo em ratos, quando administrada por via parenteral. No experimento de Elia et al. (2008) a ribavirina mostrou-se altamente efetiva na preveno da replicao do vrus da cinomose in vitro em baixas concentraes (6,5-12,5 g/mL), concordando com os valores encontrados para a inibio do vrus do sarampo.

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Ainda segundo estes autores a ribavirina causa mutaes no vrus da cinomose que levam a um erro catastrfico no RNA do genoma viral. Pode ser especulado que a ribavirina interfira com a RNA polimerase pela competio com nucleosdeos naturais e produza erro na terminao da cadeia do vrus. A ribavirina foi capaz de inibir a replicao do vrus da cinomose in vitro de forma dose e tempo-dependente. Ainda que a concentrao no citotxica da droga bloqueie completamente a replicao em 24 horas aps a exposio, a concentrao mantida at 72 horas. Desta forma, pode-se sugerir que a ribavirina afeta o vrus ainda no meio extracelular, de maneira precoce no seu ciclo de replicao. Aps 24 horas de exposio, mesmo em baixa concentrao a ribavirina reduz o nmero de cpias de RNA (ELIA et al., 2008). A ao antiviral in vivo depende de alguns fatores como a cepa e dose infectante, a via de infeco, idade e sexo dos animais, e a frequncia e via de administrao do frmaco (CHANG & HEEL, 1981). A ribavirina um antiviral composto de nucleosdeo sinttico solvel em gua, com espectro de ao frente a alguns vrus responsveis por causar encefalite, como sarampo, febre hemorrgica, West Nile, encefalites transmitidas por carrapatos e encefalite japonesa (JEULIN et al., 2009). Na administrao oral, a biodisponibilidade de aproximadamente 33% a 45% em humanos. O pico plasmtico ocorre entre 1 a 2 horas aps doses nicas. At o momento, sabe-se que no lquor alcanada at 70% da concentrao do plasma e o pico plasmtico ocorre 30 minutos aps a administrao intravenosa (HAYDEN & DOUGLAS,1990; GRANCHER et al., 2004). Cerca de 40% da ribavirina excretada pelos rins aps 72 horas da administrao, e o metabolismo heptico uma rota importante para sua eliminao (HAYDEN & DOUGLAS, 1990). No estudo realizado por Ogle et al. (1989) foi administrada ribavirina por via oral para humanos na dose de 10 mg/Kg, trs vezes ao dia, por trs dias e duas vezes ao dia por seis semanas. Este estudo demonstrou que a concentrao de ribavirina no lquor atingiu 48 a 75% do nvel srico aps sete dias, e a concentrao se manteve entre 25 a 66% do nvel srico durante todo o tratamento. Na pesquisa realizada por Jeulin et al. (2009), a ribavirina atingiu o crebro em duas ou trs horas aps a sua aplicao em ratos, na dose de 40 e 100 mg/Kg, respectivamente, e foi detectada no crebro aps um perodo de 24 horas. As condies neuroinflamatrias (incluindo as encefalites) so caracterizadas pela destruio da barreira hematoenceflica e pela abertura das junes pela ao das citocinas secretadas pelos macrfagos e micrglia, permitindo a passagem de outras substncias, assim como a ribavirina, como comprovado por Jeulin et al. (2009). Os autores relataram que o acmulo da ribavirina no crebro de ratos pode ser explicado pela diferena entre os perfis farmacocinticos dos animais que receberam mltiplas doses, e concluram que a concentrao neste tecido diminuiu vrios dias aps o trmino do tratamento mesmo nos animais que receberam apenas uma dose (JEULIN et al., 2009). Quando administrada por via oral, o tempo de absoro de aproximadamente duas horas, podendo chegar a 12 horas. Desta forma, sugere-se que a absoro ocorra por toda a extenso do trato gastrintestinal e

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o mecanismo de absoro identificado envolve transportadores de nucleotdeos dependentes de sdio (PRESTON et al., 1999). Lin et al. (2002) afirmaram que a biodisponibilidade da ribavirina quando administrada por via oral em ratos, na dose de 30 mg/Kg, de 27,1% e o tempo para a concentrao mxima foi de uma hora. J em macacos, na dose de 10 mg/Kg tambm por via oral, a biodisponibilidade foi de 59,3% com tempo para concentrao mxima de duas horas. A meia vida em ratos foi de oito horas e em macacos de 179 horas, quando administrada por via oral. Este estudo demonstrou o quanto importante trabalhar com o frmaco em cada espcie, devido as caractersticas diferentes de metabolismo e excreo. No estudo de radioatividade, de Lin et al. (2003), foi observado que a ribavirina excretada principalmente pela urina, com excreo mnima pela bile e 1,4% pelas fezes, da dose intravenosa em ratos e de 0,8% em macacos. A ribavirina excretada lentamente e retida em todos os tecidos, exceto o cerebral. Aps a administrao oral a maior parte dos produtos excretados da ribavirina no possui base e ribose de sua estrutura. A meia-vida estimada da ribavirina na urina de 10 a 12 horas e em eritrcitos aproximadamente 40 dias (GILBERT & KNIGHT, 1986). A meia-vida no plasma foi observada em cerca de 24 horas, mas uma pequena quantidade do frmaco persiste no plasma por mais de 16 dias (CHANG & HEEL, 1981). A meia-vida de eliminao da ribavirina de 79 horas em doses simples e pode chegar at 274 a 298 horas quando administradas mltiplas doses, sugerindo que os parmetros que descrevem a farmacocintica de uma nica dose no podem ser aplicados na farmacocintica de vrias doses (KRISHNAN & DIXIT, 2011). Em contraste, nas clulas do sangue e do fgado, ocorre pequeno acmulo da ribavirina no crebro de ratos e macacos. Esta informao indica que a ribavirina capaz de ultrapassar a barreira hematoenceflica (FERRARA et al., 1981). No estudo realizado por Bean (1992) a ribavirina ultrapassou a barreira hematoenceflica, chegando concentrao no lquor a 50 a 100% da encontrada no soro. Estudos que utilizaram administrao de altas doses intravenosas de ribavirina em pacientes com SSPE mostraram concentraes liquricas de aproximadamente 74% das encontradas no plasma (HAYDEN & DOUGLAS, 1990; HOSOYA et al., 2001), sendo eficientes no combate infeco. Segundo Hosoya et al. (2001), o nvel da ribavirina no lquor alcanou concentrao ideal de 7,5 g/mL pela administrao intravenosa da dose de 20 mg/Kg. No entanto, Jeulin et al. (2006) observaram que a ribavirina no foi capaz de impedir a morte de hamsters com encefalite pelo sarampo, quando administrada por via intraperitoneal na dose de 50 mg/Kg por dia. Estes autores observaram que ocorre melhora da atividade da ribavirina pelas ciclodextrinas, provavelmente relacionada ao em membranas biolgicas, facilitando sua passagem pela barreira hematoenceflica. Segundo Hosoya et al. (1989) a ribavirina no alterou a morfologia celular ou inibiu a sntese de protenas na concentrao de 200 g/mL, considerada alta em relao necessria para inibir a sntese de DNA e RNA. No estudo realizado por Elia et al. (2008), a ribavirina demonstrou baixa toxicidade na cultura de clulas Vero, enquanto a citotoxicidade s foi

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observada em concentraes 100 vezes maiores que as necessrias para inibir a replicao do vrus da cinomose. Browne (1978) observou que o aumento da concentrao da ribavirina levou ao declnio na sntese de protenas virais e, concomitantemente, a reintegrao da sntese de protenas da clula hospedeira. No entanto, possvel que a alta concentrao seja menos especfica na sua ao e cause alteraes no metabolismo do RNA, com exceo da capacidade de inibir a IMP desidrogenase. Jeulin et al. (2006) utilizaram em ratos a dose de 480 mg/Kg de ribavirina por via intraperitoneal, no perodo de 21 dias e no observaram bito entre os animais, tampouco obtiveram dose letal devido ao volume da droga a ser injetada. Mesmo em baixas concentraes, a ribavirina pode inibir de forma reversvel a sntese de macromolculas e a diviso rpida de clulas no infectadas. Este composto causa supresso da sntese de cido nuclico e no estimula a mitose de linfcitos humanos in vitro . Porm, no afeta a funo de leuccitos polimorfonucleares e capaz de inibir a secreo de mastcitos. No entanto, tem efeito imunossupressor em animais experimentais e mostra ao teraputica para vrus que induzem tumores transplantveis e doenas autoimunes (HAYDEN & DOUGLAS,1990). A ribavirina possui efeitos imunoreguladores, pois capaz de inibir a sntese de macromolculas e a diviso celular, a proliferao de linfcitos e a sntese de cido nuclico. Pode, suprimir tambm, a produo de linfcitos B e consequentemente a formao de anticorpos (BEAN, 1992). Em humanos, a ribavirina administrada por via oral foi capaz de diminuir o nmero de clulas CD4 e a proliferao de linfcitos, principalmente em altas doses, sugerindo possvel toxicidade para estas clulas (HEAGY et al., 1991). Ning et al. (1998) demonstraram que a ribavirina em concentraes utilizadas in vivo inibe quase totalmente a produo de mediadores prinflamatrios como TNF, IL-1 e atividade procoagulante de macrfagos in vitro de camundongos BALB/cj. Alm disso, a ribavirina diminuiu a produo de IL-4 pelas clulas Th1/Th2, portanto sem efeito sobre a produo de IFN- pelas clulas Th1. Contudo, os autores concluram que a ribavirina inibe a produo de mediadores prinflamatrios induzidos pela infeco viral. Os benefcios da ribavirina esto relacionados com a habilidade de reduzir a ativao de macrfagos e diminuir a produo de citocinas pelas clulas Th2, mas preservando a produo de citocinas pelas clulas Th1 (NING et al., 1998). Segundo Tam et al. (1999), a ribavirina possui uma atividade imunomoduladora capaz de estimular a imunidade celular mediada por clulas T, favorecendo a eliminao de patgenos virais intracelulares. Por outro lado, Vollmer et al. (2004) afirmaram que a ribavirina no possui efeito sobre as clulas B ou na secreo de citocinas, sugerindo que este frmaco no apresenta efeito estimulante isoladamente e diminui a secreo de IL-5. Estudos mais recentes mostram que a ribavirina em doses baixas pode ativar linfcitos B, potencializar linfcitos Th1 e suprimir resposta imune mediada por clulas Th2. Em altas concentraes inibe a proliferao de linfcitos T e tem efeito imunossupressor, pela inibio do gene que expressa interferon gamma. No entanto, os efeitos indesejveis de altas doses de ribavirina podem ser solucionados com a administrao de guanosina, como

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realizado na Hepatite C crnica, na qual somente em altas doses pode reduzir a replicao viral (RIGOPOULOU et al., 2007). Thomas et al. (2011) descreveram que a ribavirina capaz de modular os genes estimuladores de interferon. A ribavirina induz alguns genes antivirais (IRF7 e IRF9) que tm mostrado ser importante na resposta antiviral pela produo de interferon endgeno. Estimulando estes genes, a ribavirina amplificou a resposta imune pela produo de interferon. Esta ao dose dependente e foi encontrada na concentrao mais baixa de 1 a 3 g/mL na cultura celular. A ribavirina foi utilizada com o tiazofurin como possvel imunomodulador na encefalite autoimune experimental, que simula a esclerose mltipla em humanos. O efeito de reduzir GTP pela inibio de IMPDH mais potente em linfcitos do que em outros tipos celulares. Neste estudo a dose utilizada foi de 30 mg/Kg, por via intraperitoneal, diariamente, por 15 dias. Pela inibio da IMPDH, a ribavirina e tiazofurin demonstraram efeito antiproliferativo de linfcitos, includo clulas T que so as principais causadoras da resposta inflamatria no sistema nervoso central. Os autores demonstraram tambm que a associao destes frmacos pode causar uma resposta na micrglia, provavelmente indireta, como resultado da supresso de clulas T e macrfagos. Portanto, no se pode excluir a ao dos frmacos na micrglia diretamente, j que foi comprovado que a ribavirina e o tiazofurin so capazes de ultrapassar a barreira hematoenceflica. O tratamento tambm preveniu o aparecimento de leses desmielinizantes, e no foi encontrada leucopenia associada com o protocolo teraputico (STOJKOV et al., 2008). A aplicao clnica da ribavirina mostra restries devido a alguns efeitos adversos, especialmente induo de anemia hemoltica. O acmulo dos fosfatos em eritrcitos leva a anemia, que pode ser causa para descontinuao do tratamento (WU et al., 2005). A severidade da anemia mais grave em macacos, seguida em humanos, roedores e ces (LIN et al., 2003). A anemia ocorre em 30% dos casos tratados e resulta em 9% a 22% de pacientes que necessitam a reduo da dose para continuar o tratamento. A ocorrncia de anemia est relacionada com a dose de ribavirina, funo renal e a idade do paciente (SUNG et al., 2011). Segundo Krishnan & Dixit (2011) 54% dos pacientes tratados com 1000 a 1200 mg/dia de ribavirina apresentam uma queda de hemoglobina abaixo de 3 g/dL. Essa queda da hemoglobina leva a reduo da dose, o que compromete significantemente a resposta ao tratamento para Hepatite C. Esse efeito relatado devido a capacidade de clulas vermelhas de primatas acumular a ribavirina. A diferena entre espcies est relacionada com a variao da atividade enzimtica de nucleotdeos nos tecidos (FERRARA et al., 1981) Quando incorporada nos eritrcitos a ribavirina convertida em metablitos fosforilados. Estes metablitos diminuem os nveis de ATP intracelular, resultando na perda da integridade dos eritrcitos por desestabilizao da membrana que pode causar hemlise extravascular. A concentrao celular de ribavirina alcana nveis estveis em duas a trs semanas aps o incio do tratamento, quando ocorre a diminuio de hemoglobina. As mudanas na concentrao de ribavirina celular so inversamente proporcionais s alteraes nos nveis de hemoglobina (INOUE et al., 2004; HITOMI et al., 2011).

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No experimento de Homma et al. (1999) por cromatografia lquida, foi demonstrado que a concentrao de ribavirina no eritrcito trs vezes maior que a concentrao no plasma, e que 74% da ribavirina dos eritrcitos eram metablitos fosforilados, os quais no foram encontrados no plasma. A partir deste estudo, os autores sugeriram que o frmaco transportado para o interior dos eritrcitos por um transportador de nucleotdeos presente na membrana celular. A variao gentica que resulta na deficincia da enzima inosina trifosfato (ITPA) foi descoberta recentemente por proteger pacientes contra a anemia induzida pelo uso da ribavirina. A deficincia de ITPA leva ao aumento de inosina trifosfato nas hemcias, que interfere com a atividade da ribavirina trifosfato e diminui sua ao hemoltica. A partir destes resultados, novas intervenes teraputicas foram institudas com objetivo de suprimir ITPA, reduzir a anemia induzida pela ribavirina e a descontinuidade do tratamento por esta causa (FELLAY et al., 2010). A ribavirina administrada sistemicamente em altas doses pode causar efeitos indesejveis como anemia hemoltica, supresso da medula ssea, aumento de bilirrubina, ferro e cido rico no soro, que so reversveis quando h interrupo da administrao (BEAN, 1992; TAKAHASHI et al., 1998; HOSOYA et al., 2001). Ratas prenhes tratadas com ribavirina desenvolveram deformaes embrionrias no esqueleto, podendo levar at a reabsoro fetal. Por isso, a ribavirina contraindicada em mulheres grvidas (BEAN, 1992). De acordo com a Food and Drug Administration, a ribavirina tambm contraindicada para os parceiros de mulheres grvidas. imperativo evitar a gravidez durante o tratamento e at seis meses do trmino da terapia. Foi observado tambm que a ribavirina causa toxicidade testicular (SUNG et al., 2011). Outros efeitos foram reportados, como prurido, erupo cutnea aguda, nuseas, depresso, tosse e sinais respiratrios em humanos (HAYDEN & DOUGLAS,1990; SUNG et al., 2011). Shah et al. (2010) demonstraram que a ribavirina no causou efeito citotxico em culturas celulares diferentes. No entanto, estes autores demonstraram que o vrus da estomatite vesicular e o vrus Sendai foram resistentes a ao da ribavirina conforme a cultura celular em que foram mantidos. Os autores relacionaram essa atividade de resistncia do frmaco com a baixa capacidade de acmulo dentro da clula, dependente do tipo de metabolismo. Foi comprovado que a ribavirina tem mecanismo de ao diferente em cada tipo celular, pela capacidade de acmulo dos fosfatos. Estes resultados sugerem que outros vrus que foram testados in vitro para deteco do mecanismo de ao devem ser reavaliados conforme o tipo celular usado. 5. Aplicaes da Ribavirina na Medicina Veterinria A ribavirina oral piorou as condies de gatos experimentalmente infectados com Calicivrus. Supresso da medula ssea, perda de peso, aumento de enzimas hepticas e ictercia foram observadas. Porm, esses efeitos adversos no foram observados em ces que recebaram 60 mg/Kg do frmaco durante duas semanas (PAPICH et al., 2003).

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Em estudo recente foi estudada em cultivo celular a ao da ribavirina frente ao Calicivrus felino. Foi observada inibio da replicao viral em at 99,9% em altas concentraes (OKA et al., 2011). Embora a atividade da ribavirina tenha sido relatada anteriormente frente ao vrus da cinomose (SCAGLIARINI et al., 2006; ELIA et al., 2008), o mecanismo de ao no totalmente elucidado. Dal Pozzo et al. (2010) utilizaram um composto (EICAR), semelhante a ribavirina, frente ao vrus da cinomose, que demonstrou toxicidade nove vezes maior que a ribavirina em clulas Vero e melhor atividade antiviral. O mecanismo de ao provavelmente pela mutagnese letal, causando erro catastrfico no genoma viral. Mangia (2008) utilizou pela primeira vez testou a ribavirina em ces naturalmente infectados com o vrus da cinomose da regio de Botucatu, SP. Todos os animais apresentavam a fase neurolgica da doena e foram tratados com 30 mg/Kg de ribavirina por via oral, a cada 24 horas, durante 15 dias. Nenhum animal apresentou sinais de efeitos colaterais como descrito na terapia em humanos com o mesmo frmaco. Mangia et al. (2011) relatou a eficcia do tratamento com ribavirina na dose de 30 mg/Kg, por via oral, a cada 24 horas, durante 15 dias em caso de encefalite aguda em co pelo vrus da cinomose, quando associada ao DMSO na dose de 1 g/Kg, por via intravenosa, a cada 24 horas. 6. Prednisona Desde 1949, os glicocorticides tm sido utilizados no tratamento de doenas inflamatrias e apesar dos efeitos indesejveis ainda so considerados como um dos mais potentes antinflamatrios (CROXTALL et al., 2002). Na dcada de 50, alteraes na estrutura do cortisol resultaram em novos frmacos, como a prednisona e prednisolona. Assim, as modificaes estruturais dos esterides sintticos ampliaram a durao e a potncia do efeito dos glicocorticides, bem como propiciaram diferentes afinidades e tempo de ligao aos seus receptores (LONGUI, 2007). Os glicocorticides so esterides lipoflicos, com biodisponibilidade entre 60 e 100% quando administrados por via oral. A concentrao plasmtica depende, em boa parte, da capacidade de ligao s protenas sricas, como a transcortina e albumina (LONGUI, 2007). Por possurem caracterstica lipoflica passam de forma passiva para o citoplasma das clulas at chegarem ao receptor glicocorticide (VAN DEN BRANDT et al., 2007). Os glicocorticides possuem amplo espectro de indicaes teraputicas, podendo ser utilizados de forma substitutiva em casos de insuficincia adrenocortical ou no diagnstico de doenas como a sndrome de Cushing. Podem, ainda, ser empregados no tratamento agudo da hipoglicemia ou da hipercalemia. So capazes de induzir maturao celular (pneumcito tipo II), diferenciao celular (linhagens da crista neural) ou mesmo a morte celular por apoptose, o que permite seu uso no tratamento de tumores, especialmente os de linhagem hematopoitica. Porm, os glicocorticides tm seu papel central no tratamento de doenas nas quais estejam envolvidos mecanismos imunes e inflamatrios (LONGUI, 2007).

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A dexametasona, prednisona, cortisona e hidrocortisona possuem propriedades antinflamatrias e imunossupressoras, e so usados comumente como agentes teraputicos de afeces como asma, neurite ptica, dermatite atpica e colite ulcerativa, alm de outras doenas inflamatrias (FTICH & VAN DE BEEK, 2008). A ativao da proliferao e a morte de clulas do sistema imune so controladas por uma variedade de fatores: interao direta clula a clula, citocinas secretadas pelas clulas do sistema imune e os fatores relacionados com sistema neuroendcrino. Os glicocorticides so os reguladores mais estudados do sistema neuroendcrino e so reconhecidos por inibir a proliferao de linfcitos T e a produo de uma variedade de citocinas, incluindo interferon- (IFN). A interleucina-7 (IL-7) age mantendo a populao policlonal de linfcitos T imaturos e as clulas T de memria, e, portanto, controla o tamanho do estoque de clulas T (TALAYEV et al., 2005). A dexametasona, anlogo sinttico do grupo dos glicocorticides, usada por Talayev et al. (2005) foi capaz de aumentar a proliferao de clulas T e inibir a produo de IFN-. Os autores relataram que houve diminuio na concentrao das clulas T imaturas e as clulas de memria no acompanharam o aumento da morte celular. Neste estudo foi comprovado que a IL-7 inibiu a apoptose causada pela dexametasona em clulas progenitoras de timcitos, timcitos CD4+, CD8+ e em clulas T perifricas e maduras (VAN DEN BRANDT et al., 2007). A superexpresso do receptor glicocorticide est relacionada com a linhagem de clulas T, vsito que o nvel de receptores nestas clulas duas vezes maior. Esta superexpresso acompanhada por moderado aumento na sensibilidade aos glicocorticides, reduo do timo e do estoque de clulas T (VAN DEN BRANDT et al., 2007). Van Den Brandt et al. (2007) descreveram que os glicocorticides induziram clulas CD8 a formarem linfcitos T CD4+ e causaram apoptose de timcitos, mas mantendo as clulas T maduras do sangue perifrico, mimetizando uma proliferao hemosttica. Os autores concluram tambm que os glicocorticides no so responsveis pela involuo do timo, e sugeriram que os glicocorticides no interferem na maturao de clulas T, mas atuam na polarizao da resposta imune adaptativa. Os glicocorticides tambm inibem a expresso dos mediadores inflamatrios dos macrfagos e de outras clulas. Desta forma so usados no tratamento de vrias doenas inflamatrias imunomediadas (ABRAHAM, et al., 2006). Barnes (1999) referiu que a ao antinflamatria de certos glicocorticides ocorre pela interao na transcrio. Croxtall et al. (2002) afirmaram que a ao genmica ou no dos glicocorticides no so dependentes da dose, mas sim por vias ativadas pelo receptor para glicocorticides em diferentes tipos celulares. O receptor de glicocorticides uma estrutura protica codificada pelo gene do receptor de glicocorticide. caracterstica da famlia de receptores nucleares, os quais so protenas multifuncionais que traduzem o sinal determinado pelo seu hormnio ligante. Estes receptores possuem funes que ocorrem em trs nveis: recrutando os fatores de transcrio, modulando a ao dos fatores de transcrio independente da ligao ao DNA e modulando

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a estrutura da cromatina, permitindo a ligao de outras protenas reguladoras ao DNA (FARIA & LONGUI, 2006). A resposta fisiolgica e a sensibilidade aos glicocorticides variam amplamente entre as espcies, os indivduos, os tecidos, os tipos celulares e at mesmo durante as fases do ciclo de uma mesma clula. Muitas condies patolgicas tambm esto relacionadas aos estados de resistncia ou de hipersensibilidade aos glicocorticides, e vrios fatores influenciam a cascata de eventos que leva modulao da sensibilidade aos glicocorticides (FARIA & LONGUI, 2006). Considerando que a maior parte dos efeitos dos glicocorticides mediada pela ativao de seus receptores, um dos principais determinantes da responsividade e da sensibilidade a estes hormnios a densidade intracelular do receptor (FARIA & LONGUI, 2006). A resposta de uma clula exposta a um glicocorticide advm de diversos fatores moduladores, tais como a concentrao do hormnio livre, a potncia relativa do hormnio e a habilidade da clula em receber e traduzir o sinal hormonal (FARIA & LONGUI, 2006). Os glicocorticides possuem dois tipos de mecanismos de ao, genmico e no genmico, que atuam em vrios tecidos, inclusive o crebro, que pode desencadear respostas eletrofisiolgicas, metablicas, secretrias e inflamatrias. A via no genmica mais rpida e pode levar segundos a minutos para ser detectada (LOPES et al., 2008). A cascata de eventos que leva transativao ou transrepresso gnica pelos glicocorticides inicia-se com o hormnio lipoflico cruzando a membrana citoplasmtica da clula-alvo. O complexo hormnio-receptor-elemento de resposta hormonal modula a transcrio de genes-alvo dos glicocorticides, positiva ou negativamente, na dependncia do contexto do promotor e da participao de protenas co-ativadoras ou co-repressoras (ABRAHAM et al., 2006; FARIA & LONGUI, 2006). Os receptores ativados so capazes de agir especialmente como homodmeros, ligando-se dupla fita do DNA em uma sequncia especfica de seis nucleotdeos (hexmeros). Os receptores tambm modulam a ao dos fatores de transcrio independente de ligao direta ao DNA, por meio de interaes diretas protena-protena com outros fatores de transcrio (FARIA & LONGUI, 2006). Os glicocorticides so capazes de induzir resposta rpida e sustentvel na expresso da fosfatase 1 de especificidade dupla (DUSP1) em vrios tipos celulares, incluindo clulas mielides e seus precursores. DUSP1 uma fosfatase capaz de inativar a protenoquinase ativadora da diviso celular e tambm as vias c-Jun N-terminal quinase (JNK) e p38 MAPK, que contribuem para a expresso de mediadores inflamatrios no momento da transcrio e aps a transcrio. DUSP1 um importante regulador negativo da resposta inflamatria, e a induo da expresso deste gene o mecanismo de ao dos glicocorticides (ABRAHAM et al., 2006). Abraham et al. (2006) afirmaram que a dexametasona foi capaz de estimular a expresso DUSP1, consequentemente levou a inibio do JNK e p38 MAPK. Essa regulao da expresso do gene independente da dimerizao do receptor de glicocorticides. Os autores detectaram tambm que a ciclo-oxigenase 2 (COX-2), IL-1, IL-1, INF- e TNF foram fortemente inibidos pela dexametasona.

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Existem tambm os efeitos no genmicos dos glicocorticides, os quais determinam reduo da ao histamnica, diminuio da sntese de prostaglandinas (diminuem a fosfolipase A2) e da ativao do plasminognio (LONGUI, 2007). Outros efeitos no genmicos foram documentados principalmente para a vitamina D3, a progesterona e a aldosterona. Parecem envolver os sistemas de segundos-mensageiros, incluindo a protena quinase C, os nveis intracelulares de clcio e de xido ntrico e tirosina quinase (FARIA & LONGUI, 2006). A ao do glicocorticide no sistema imune ocorre em vrios pontos, culminando com o desvio da resposta para um padro T helper 2 (Th2), com caractersticas antinflamatrias dependentes do aumento de citocinas como as interleucinas IL-1, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13 e o fator estimulador de colnias provenientes de granulcitos e macrfagos. Induz ainda a secreo do fator transformador de crescimento, capaz de reduzir a ativao de linfcito T e a proliferao celular. Os glicocorticides so capazes de inibir citocinas prinflamatrias, como as interleucinas IL-2 e IL-12, o interferon gama e o fator de necrose tumoral, bem como molculas de adeso, como a lipocortina-1, molculas de adeso vascular e as molculas de adeso intercelular, ou ainda enzimas, como a sintase induzida pelo xido ntrico, a cicloxigenase (COX2) e a fosfolipase (PLA2) (LONGUI, 2007). Vrios aspectos do processo de inflamao envolvem o excesso de produo de metablitos eicosanides, como as prostaglandinas. Estas so formadas pela ao das enzimas PLA2 da membrana fosfolipdica e com subsequente converso da liberao de cido araquidnico pelas enzimas da COX. A atividade das enzimas PLA 2 e a expresso de COX no so os nicos pontos de controle que regulam a inflamao, mas so importantes para a interveno teraputica. Croxtall et al. (2002) afirmaram que os novos glicocorticides como mometasona, fluticasona, budesonide, diproprionato de beclometasona e prednisolona no possuem efeito significativo na produo de cido araquidnico e na atividade das enzimas PLA 2. Entretanto, inibem a atividade de expresso de COX. A supresso de prostaglandinas inflamatrias ocorre pela inibio dos seus precursores, o cido araquidnico, catalizado pela PLA 2, pelo mecanismo cistoltico envolvendo o receptor de glicocorticides, sem envolvimento genmico (LOPES et al., 2008). No SNC, os glicocorticides induzem a sntese e a liberao retrgrada de endocanabinides, que fazem a supresso da excitao sinptica de clulas neuroendcrinas suprapticas e paraventriculares. Alm dos neurnios, os endocanabinides possuem os receptores canabinides em clulas do sangue e clulas inflamatrias. Os endocanabinides so derivados de cidos graxos do metabolismo no oxidativo do cido araquidnico e esto envolvidos na resposta inflamatria e so estabilizadores de membranas em processos apoptticos (LOPES et al., 2008). Os endocanabinides podem ser neurotransmissores incomuns, no so armazenados em vesculas e sim sintetizados a partir da membrana fosfolipdica e desta forma atravessam facilmente a membrana da clula e agem nas regies pr e ps-sinpticas. Agem causando supresso momentnea de liberao de GABA, gerando assim supresso da despolarizao da sinapse de inibio. Esta ao est relacionada com o receptor celular e pode ser diferente nas diversas reas do crebro. No

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hipotlamo e em outras reas cerebrais foi descrita ao similar, porm com supresso da sinapse glutamatrgica excitatria (LOPES et al., 2008). O cido araquidnico serve como precursor para prostaglandinas, leucotrienos, tromboxanos, endocanabiides, mediadores e reguladores da inflamao e neurotransmissores. No sistema nervoso a resposta inflamatria, pela liberao de cido araquidnico, passa a ser pela liberao de neurotransmissores, neuromoduladores e neuropeptdeos (LOPES et al., 2008). A prostaglandina E2 demonstra atividade glutamatrgica na sipnase do hipocampo que revelada pelo aumento na frequncia de correntes excitatrias ps-sinpticas. Esse aumento da transmisso excitatria sinptica leva a efeitos neurotxicos, sugerindo que o metabolismo oxidativo de endocanabiides pela COX2 pode contribuir para neurodegenerao induzida pela inflamao. Os glicocorticides inibem a oxidao dos endocanabiides pela COX2, servindo como neuroprotetores, reduzindo a neurotoxicidade durante a inflamao ou aps a ativao de circuitos neuronais excitatrios (LOPES et al., 2008). Os efeitos neuroprotetores da metilprednisolona tem sido atribudos a captura de radicais livres quando administrados em altas doses (CROXTALL et al., 2002). Segundo Fitch & Van De Beek (2008) a terapia com esterides recomendada na reduo da ativao inflamatria nas doenas infecciosas do SNC. Alguns trabalhos relatam que em enfermidades autoimunes do SNC, em modelos experimentais humanos e animais, os glicocorticides no foram eficazes (SORRELLS & SAPOLSKY, 2007). Os glicocorticides sintticos, como a dexametasona, mostraram pouca capacidade de atravessar a barreira hematoenceflica. Porm, so carreados por globulinas e demonstraram afinidade pelo receptor glicocorticide ao contrrio do receptor mineralocorticide, como acontece com o cortisol. Desta forma possvel explicar as diferenas no mecanismo de ao entre glicocorticides endgenos e sintticos em processos inflamatrios do SNC (SORRELLS & SAPOLSKY, 2007). A integridade da barreira hematoenceflica alterada em vrias desordens neurolgicas. As estratgias teraputicas de vrias enfermidades incluem o tratamento com o glicocorticide, mas a base molecular de como os glicocorticides regulam a permeabilidade da barreira hematoenceflica ainda no totalmente entendida (FRSTER et al., 2005). No estudo de Frster et al. (2005) foi desenvolvido um sistema de cultura celular que representasse a barreira hematoenceflica in vitro, onde o gene occludin (protenas de juno intercelular) endgeno pode ser induzido pelos glicocorticides in vitro, sem a necessidade de cultivo em outros tipos celulares, com a formao da barreira principal. A hidrocortisona foi escolhida para induzir significantemente as propriedades da barreira e pelas alteraes encontradas na morfologia. Calcula-se que 50% destes frmacos sejam capazes de atravessar a monocamada. Os mecanismos moleculares no fechamento da barreira pelos glicocorticides foram elucidados por Frster et al. (2005). Foi observado que os glicocorticides podem atuar diretamente na transcrio pela interao especfica na sequncia de DNA do gene occludin. Neste mesmo estudo, os

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glicocorticides de forma dose-dependente aumentaram a transcrio do RNAm do occludin e da protena de clulas endoteliais de capilares do crebro. Esta a primeira descrio da ao direta de glicocorticides na regulagem da expresso de componentes juncionais. Em reviso realizada por Sorrells & Sapolsky (2007), concluiu-se que em ambos os sistemas nervoso e imune perifrico, a exposio prvia ao estresse ou ao glicocorticide pode resultar na produo de resposta imune a uma subsequente inflamao. No sistema nervoso, a administrao crnica de glicocorticides ou o estresse no so uniformemente anitinflamatrios e, em algumas circunstncias, agem aumentando o processo inflamatrio. Assim, foi observado aumento da migrao de clulas inflamatrias, pelo nvel de mediadores inflamatrios e pela ativao do fator de transcrio. No sistema nervoso lesado, em nveis basais ou de baixo estresse possuem efeito tradicional antinflamatrio. Esta resposta oposta encontrada no sistema imune perifrico. Outra concluso encontrada foi que os efeitos prinflamatrios no crebro so diferentes conforme a regio, o uso de sintticos versus glicocorticides endgenos e o tempo de exposio ao glicocorticide no que diz respeito a resposta inflamatria. Os glicocorticides podem ter efeitos opostos simultaneamente na injria do crtex e do hipotlamo, que podem estar relacionados com diferenas no efeito do complexo glicocorticide e receptor, de interaes com outros componentes de transcrio de genes ou de mecanismos completamente independentes do genoma. Outra hiptese para os glicocorticides agirem de formas diferentes no crebro pode ser a diferena na concentrao de receptor glicocorticide e receptor mineralocorticide em neurnios, micrglia e clulas endoteliais vasculares (SORRELLS & SAPOLSKY, 2007). Nveis basais e efeitos permissivos dos glicocorticides so a preveno da morte de neurnios, aumento da plasticidade sinptica e melhora da cognio dependente do hipocampo. Entretanto, o uso prolongado de glicocorticides pode causar efeitos deletrios, incluindo o prejuzo da cognio e da plasticidade sinptica, inibio da neurognese, atrofia dos prolongamentos dendrticos e reduo da densidade da medula espinhal. Esta ao prejudicial piora quando h leso prvia de neurnios, comprometendo a habilidade de sobrevida destas clulas no hipocampo, crtex e ncleo estriado a uma variedade de leses, incluindo hipxia/isquemia, convulses, hipoglicemia, gerao de radicais livres de oxignio, peptdeo beta-amilide e a glicoprotena do HIV. Os efeitos deletrios so exacerbados pelo fato que estas leses estimulam a secreo de mais glicocorticides, elevando a concentrao cerebral dos mesmos (SORRELLS & SAPOLSKY, 2007). O uso de glicocorticides para leses no SNC pode ser deletrio. Porm, estes efeitos so compensados com a diminuio da inflamao pela administrao crnica. Os efeitos benficos para o processo inflamatrio acontecem pelo bloqueio dos receptores de TNF- e pela inibio da proliferao de astrcitos no local da morte de neurnios. O fato que altas concentraes de glicocorticides aumentam a extenso da neurotoxicidade e da resposta inflamatria nos locais lesados (SORRELLS & SAPOLSKY, 2007). A regio CA3 do hipocampo local mais estudado em pesquisas de uso prolongado de glicocorticides por ser a primeira rea que demonstra reestruturao dendrtica. Conrad et al. (2007) confirmaram a hiptese que a retrao dendrtica da regio CA3 pode levar a vulnerabilidade do hipocampo

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s neurotoxinas e comprometimento dos neurnios com uso prolongado de glicocorticides. Fitch & Van De Beek (2008) recomendaram o uso dos esterides como adjuvantes no tratamento de meningites bacterianas em todos os pacientes, crianas ou adultos, desde que no apresentem choque sptico. Em pacientes com meningite bacteriana, os esterides devem ser administrados antes ou junto com a terapia antimicrobiana. Recomenda-se a dexametasona na dose de 0,4 a 0,6 mg/Kg por dia. Os esterides so recomendados tambm na meningite tuberculosa por reduzir o edema cerebral e a morte dos pacientes. Foi realizado estudo grande, prospectivo, controlado e randomizado com 141 crianas com meningite tuberculosa que foram tratadas com prednisona, e este tratamento proporcionou uma melhora na sobrevida e um resultado melhor na manuteno intelectual, sem contar que houve resoluo na produo de exsudato basal e dos tuberculomas pela tomografia computadorizada. O uso de esterides passou a ser recomendado na meningite tuberculosa, porm aps o incio do tratamento com as drogas antituberculosas (FITCH & VAN DE BEEK, 2008). Corticosterides podem ser utilizados devido a imunopatologia das leses neuronais e para reduzir o edema cerebral causados pelo vrus da cinomose, mantendo a terapia com doses antinflamatrias. A imunossupresso causada pelos esterides a principal desvantagem, porque a resposta inflamatria responsvel por combater o vrus. A terapia com glicocorticides com dosagens antinflamatrias pode ter algum sucesso no controle da dilatao pupilar causada pela neurite ptica ou de alguns sinais associados inflamao crnica da encefalite. A prednisolona comumente escolhida entre os glicocorticides na dose de 2 4 mg/Kg, a cada 24 horas, com administrao oral (TIPOLD et al., 1992; GREENE, 2006). Certos efeitos indesejveis sistmicos pelo uso de glicocorticides so relatados, como a reduo da massa ssea e muscular, necrose assptica de cabea de fmur e mero, disfuno hipofisria e gonadal, hipertenso, diabetes, intolerncia aos carboidratos, hipocalemia, alcalose metablica, calculose renal, pancreatite aguda, infiltrao gordurosa do fgado, hepatomegalia, erupes de pele, hiperpigmentao, leucocitose, linfopenia, eosinopenia, monocitopenia, supresso da hipersensibilidade tardia, supresso da resposta antignica primria, catarata subcapsular posterior, glaucoma, distrbio do sono e insnia, irritabilidade, pseudotumor cerebral, nefrocalcinose, nefrolitase e aumento no peso corporal por deposio de gordura, que em geral esto relacionados ao tempo de tratamento e uso de glicocorticides de ao mais prolongada (CROXTALL et al., 2002; LONGUI, 2007). Os anlogos sintticos de corticides podem causar distrbios gastroduodenais com mais frequncia que os hormnios naturais, como hidrocortisona e cortisona. Verifica-se que a incidncia de complicaes atinge a 6,4% dos pacientes na administrao de hidrocortisona e 30% nos que so mantidos tratados com prednisona ou prednisolona (BOLAND & HEADLEY, 1958). A partir de 1955 os autores comearam a prescrever preparaes anticidas junto com prednisona e prednisolona. E, nos estudos aps essa mudana, os sinais digestrios apareceram em 18% dos pacientes. Concluram que o desenvolvimento de manifestaes digestrias foi influenciado pela

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quantidade da dose administrada, pelo tempo de administrao e pela susceptibilidade do indivduo (BOLAND & HEADLEY, 1958). Em 1958, foi sugerido por Boland & Headley que prednisona e prednisolona aumentam cerca de duas vezes a secreo de cido clordrico, quando esses frmacos so administrados em doses antinflamatrias. Neste mesmo estudo o uso de anticidos foi suficiente para reduzir a severidade e a frequncia de sinais digestrios. 7. Dimetil Sulfxido (DMSO) O registro histrico do DMSO foi iniciado em 1867 quando o qumico russo, Alexander Saytzeff descreveu a oxidao do dimetil sulfide, identificou o produto e descreveu propriedades solventes do produto. Houve pouco interesse nas descobertas at 1950, quando essas propriedades foram exploradas em vrios processos industriais. Pesquisadores de indstrias descobriram que o frmaco servia como solvente para vrios herbicidas, fungicidas, antimicrobianos e hormnios de plantas, nas quais aumentava a penetrao e a eficcia. Cientistas trabalharam com DMSO e relataram outras propriedades incomuns: penetrava rapidamente na pele sem causar danos, sua aplicao tpica em qualquer parte do corpo rapidamente resultava em distinta e agressiva halitose lembrando alho ou ostra, devido ao odor do metablito dimetil sufide. O DMSO capaz de carrear vrios solutos pela pele, sendo necessrio cuidado no manuseio e conhecimento das solues ou compostos com potencial txico. Tambm capaz de auxiliar na cura de queimaduras lenta ou rapidamente e aliviar dor e edema de injrias. Essas observaes estimularam novas pesquisas com o DMSO para outras aplicaes mdicas e biolgicas. Robert Herschler da companhia de papel Crown Zellerbach, e Stanley Jacob da Universidade de Oregon Medical School, foram pioneiros para o incio dos estudos do DMSO como agente teraputico. O primeiro relato de investigao laboratorial do DMSO em sistemas orgnicos de mamferos foi publicado em 1959 (BRAYTON, 1986; ALI, 2001). O primeiro relato do DMSO como agente farmacolgico foi publicado em 1964 e a condio para investigao de novas drogas (IND) foi garantida pela Food and Drug Administration (FDA). Em novembro de 1965 a FDA terminou seus estudos clnicos sobre o DMSO, pois Rubin demonstrou que induzia as alteraes lenticulares em alguns animais de laboratrios. Em 1966, a FDA permitiu evoluo nas pesquisas para tratamento de condies srias como escleroderma, infeco persistente de Herpes Zoster e severa artite reumatide, para as quais no havia teraputica satisfatria. Em 1968, foi permitida sua utilizao tpica por at 14 dias de tratamento. Em 1970, a FDA aprovou a utilizao na veterinria em doenas musculares em cavalos e em 1972 foi aprovado para uso em ces. No ano de 1978, a FDA autorizou o uso da soluo de 50% de DMSO nos casos de cistite intersticial em humanos e, em maio de 1980, estabeleceu regulamentos especficos nos testes clnicos do DMSO (BRAYTON, 1986; ALI, 2001). A solubilizao de nucleotdeos em solventes orgnicos importante para a entrada de drogas nucleotdeas em membranas celulares. Pelos estudos de West et al. (1994), a base guanosina hidrofbica e sua interao com DMSO pode torn-la permevel a substncias lipoflicas, indicando que este pode

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servir como veculo de transporte de frmacos nucleotdeos por membranas celulares. Barreiras biolgicas como as membranas lipoproticas so altamente permeveis ao DMSO e no so alteradas e nem destrudas pela sua passagem. O frmaco pode penetrar em mucosas, ultrapassar a barreira hematoenceflica, membranas microbianas, clulas e membranas de organelas. Ademais, pode facilitar a penetrao de vrias outras substncias atravs de membranas e mesmo de leses tuberculosas granulomatosas (BRAYTON, 1986; PAES, 1999). Classificado como solvente seguro (Classe J), o DMSO tem sido usado no tratamento clnico de vrias afeces em humanos, porm mais utilizado in vivo para a administrao de substncias insolveis e como veculo de certos frmacos (SANTOS et al., 2003). Leekunjorn & Sum (2006) observaram que a passagem do DMSO pela regio da interface da membrana um processo rpido e considerado passivo, por perspectiva macroscpica. No entanto, em perspectiva molecular foi encontrado processo ativo que requer energia. Essa energia obtida pela interrupo da ligao de hidrognio da gua para o DMSO para a passagem na regio interfacial. O grupo metil do DMSO, que hidrofbico, interage de forma favorvel nas camadas lipdicas. A partir de 1964, o DMSO passou a ser amplamente estudado e utilizado em vrias pesquisas cientficas. Foram descobertas muitas das suas propriedades farmacolgicas, como a captura e remoo de radicais hidrxidos livres. Pela ao de seu metablito dimetil sulfide (DMS), o DMSO remove radicais livres de oxignio, o que explica suas propriedades protetoras como ao antinflamatria, antiisqumica, crioproteo e radioproteo (BRAYTON, 1986; PAES, 1999; LIND et al., 2000; ALI, 2001; KISHIOKA et al., 2007). A propriedade antioxidante do DMSO pode auxiliar em casos de endotoxemia e choque sptico como observado por Ali (2001), em que a efetividade do DMSO foi positiva na adeso intracelular de molculas e fatores nucleares em testes com ratos modelos de peritonite sptica. Este composto serve tambm como veculo e/ou potencializador de antimicrobianos, antiprotozorios, antifngicos, antivirais e agentes quimioterpicos. O DMSO foi relatado por ter efeito sinrgico com esterides nas clulas (BRAYTON, 1986; SANTOS et al., 2002). Nos relatos de Nagel et al. (2007) o DMSO demonstrou efeitos neuroprotetores em ratos em diferentes doses quando administrado antes e depois da isquemia de 24 horas. Estes autores mostraram tambm que houve atenuao na destruio da barreira hematoenceflica. A ao ocorre frente a formao de ROS em locais sem fagocitose de forma que o DMSO diminui o estresse oxidativo dos tecidos infartados e dos circunvizinhos. As propriedades antioxidantes atribudas ao DMSO representam um problema quando este composto tem o objetivo de ser usado como solvente no desenvolvimento de novas drogas antioxidantes e um substituto orgnico ainda no foi encontrado. A limitao passa a ser crucial na produo/captura de radicais livres de oxignio liberados na fisiopatologia das desordens neurodegenerativas (BARNHAM et al., 2004; GELLA & DURANY, 2009; JELLINGER, 2009) e levam eficcia atribuda aos frmacos antioxidantes no tratamento destas doenas (SUREZ et al., 2011).

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O DMSO possui efeito antioxidante capaz de reduzir a peroxidao de lipdeos induzida pela combinao de ons de ferro e perxido de hidrognio em crebros de ratos. Esse mecanismo descrito pela habilidade de capturar radicais hidroxil (HALLIWELL et al., 1987; BEKTASOGLU et al., 2006; SUREZ et al., 2011). Surez et al. (2011) comprovaram pela primeira vez que o DMSO capaz de reduzir a liberao de grupos carbonil de protenas pela mistura qumica de ons de ferro e perxido de hidrognio no crebro de ratos. Essa inibio ocorreu de forma dependente da concentrao, o que favoreceu as suas propriedades antioxidantes. Em situaes clnicas, benefcios antinflamatrios da terapia com DMSO so descritos em leses musculares agudas, em alteraes agudas, traumticas e inflamatrias do sistema nervoso central e em condies infecciosas ou spticas. Em inflamaes crnicas os resultados so menos consistentes. Certo sucesso foi relatado em doenas reumticas, artrites crnicas e cistite intersticial. Este composto contribui na manuteno da microcirculao e reduz a destruio celular pela inflamao. Como mecanismo de ao foi observado que inibe a migrao de clulas inflamatrias, modula a resposta imuno-mediada, inibe a produo de anticorpos e a proliferao de fibroblastos, que pode ser importante nas condies crnicas (BRAYTON, 1986). Koo & Kim (2009) relataram pela primeira vez o efeito inibitrio da degranulao de mastcitos como nova atividade biolgica para o DMSO. Estes achados sugerem que o DMSO tem atividade antialrgica em concentraes especficas, e estes resultados poderiam explicar as propriedades antinflamatrias atribudas ao frmaco. No entanto, Randhawa (2006) descreve que uma substncia relativamente txica e sua aplicao tpica pode causar dermatite irritante e reao urticariforme de contato que no mediada por reao imunolgica e sugere a liberao da histamina pela ativao de mastcitos. A despeito de todas as propriedades apresentadas pelo DMSO, poucos estudos tem utilizado o frmaco como carreador de drogas. Paes (1999) utilizou o DMSO visando aumentar o poder de penetrao da isoniazida em leses tuberculosas de bovinos e, provavelmente, tambm para melhor penetrao pela espessa e complexa membrana celular do Mycobacterium bovis. Quanto metabolizao, o DMSO oxidado em DMSO 2 (dimetil-sulfone) no sistema microssomal heptico na presena de NADPH 2 e oxignio molecular (PAES, 1999). O DMSO excretado sob a forma de dois metablitos: DMS (dimetilsulfide) e DMSO2 de forma rpida e eficientemente. Os pulmes e rins so os principais rgos envolvidos e sua excreo fecal baixa. Quando cessa a exalao do produto, coincide com o desaparecimento dos metablitos na urina e indcio que o DMSO circulante foi inteiramente metabolizado (PAES, 1999). Sabe-se que aps 12 horas da administrao, cerca de 25 a 27% da dose excretada na urina sem alteraes na forma (ALI, 2001). Amemori et al. (2006) observaram efeitos colaterais em humanos aps doses orais, como nuseas, vmito, anorexia, erupes de pele e bradiarritmia ou hipotenso. Porm, o efeito mais significante foi o odor na respirao e o sabor na boca semelhante ao alho, devido excreo pulmonar de uma

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pequena porcentagem do metablito (DAVIS et al., 1991; STRONCEK et al. 1991). O tratamento com DMSO em hepatcitos em cultivo celular foi efetivo na resposta celular ao estresse prapopttico. Foi observada migrao da caspase-9 (responsvel pelo mecanismo apopttico) do ncleo para o citoplasma, reduzindo a apoptose. De forma interessante, aps o tratamento longo o DMSO estimulou a migrao de caspase-9 para o ncleo. Assim, os autores consideraram que o tratamento curto pode ser benfico e, quando se prolonga, o DMSO passa a ser responsvel pelo estresse preapopttico (BANIC et al., 2011). Como antinflamatrio, o DMSO foi descrito por diminuir a produo de IL-6 e IL-8 durante um tratamento de 12 horas. Este achado foi acompanhado pela manuteno da viabilidade celular do cultivo de condrcitos e no houve induo de apoptose. Os autores concluram que o DMSO a 1% inibiu o estmulo de IL-1 na expresso de IL-6 e IL-8 (KELLY et al., 1994; KLOESCH et al., 2011). O DMSO bem tolerado em altas doses, no causando alteraes cardacas e no peso corporal (ALI, 2001). Em ces, elevadas doses podem levar a halitose, anemia, hemoglobinria e aumento dos nveis de transaminase. Precedendo a morte ocorre prostrao, convulso, dispnia, hipotenso, edema pulmonar e parada respiratria, porm sua DL 50 entre 2,5 a 8,9 g/Kg (BRAYTON, 1986; PAES, 1999). A terapia intravenosa indicada de 1 g/Kg, em soluo de 10-45%, administrado lentamente, em gatos, ces e cavalos (BRAYTON, 1986). Observaes clnicas e estudos em animais sugerem que o DMSO pode ser responsvel por neurotoxicidade aps a infuso de clulas tronco de sangue perifrico criopreservadas com o composto (CAVALETTI et al., 2000; TOPACOLGU et al., 2004). Os resultados de Muller et al. (2007) confirmaram reaes adversas e a neurotoxicidade ocorreu com baixa frequncia, em particular aps a infuso das clulas. Alm disso, nenhuma neurotoxicidade foi encontrada em pacientes com doena cerebral pr-existente. Portanto, estes autores sugerem que a neurotoxicidade fatal causada pelo DMSO representa efeito colateral raro. Outros autores observaram que o DMSO pode afetar a irrigao do crebro por vasoconstrico, podendo causar alterao na funo neuronal (WEI et al., 1998). Estudos anteriores indicavam que o DMSO podia inibir a dilatao arteriolar pial induzida por oxidantes e ativadores dos canais de potssio ATPsensitivo em gatos e ratos (WEI et al., 1998; ROSENBLUM et al., 2001). Brennan et al. (2007) documentaram que em altas concentraes (10%) o DMSO inibe a reao arteriolar e reduz a dilatao arterial associada a depresso difusa cortical (CSD). Os resultados de Sun et al. (2010) sugerem que o DMSO cause dilatao arteriolar cerebral e aumento da velocidade do sangue. Neste mesmo estudo, o composto inibiu de forma dose-dependente (0,1 a 4%) a resposta hemodinmica CSD em todos os compartimentos vasculares. O DMSO pode aumentar a permeabilidade das clulas musculares do endotlio vascular induzindo ao aumento da osmolaridade e ajustando a concentrao intracelular de Ca 2+ para regular o dimetro venoso (SUN et al., 2010).

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A administrao de DMSO em altas doses (2 e 4%) foram testadas com objetivo de determinar a relao dose dependente. Quando administrado em doses baixas, de 1%, foi capaz de inibir a resposta hemodinmica e a 4% aboliu a dilatao arteriolar e inibiu o aumento do fluxo sanguneo no crebro. O estudo indicou que o DMSO no causou danos eletrofisiolgicos durante a CSD (SUN et al., 2010). Injees rpidas intra-arteriais pode levar a efeitos adversos, como vasoespasmo, angionecrose, desnudamento do endotlio, destruio da lmina interna elstica, hemorragia subaracnide, derrame e morte (CHALOUPKA et al., 1994; DUDECK et al., 2006). Chaloupka et al. (1994) demonstraram que o DMSO angiotxico e neurotxico. Bakar et al. (2010) observaram que o DMSO produziu efeitos neurotxicos quando infundido no espao subaracnide de coelhos. Esses efeitos foram relacionados a distncia e a concentrao de infuso. Recentemente, Bakar et al. (2011) no observaram vasoespasmo, angionecrose, ruptura da parede arterial, angete obliterativa granulomatosa ou hiperplasia da camada ntima na histopatologia da artria cartida, com o uso do DMSO. Nos resultados histopatolgicos e bioqumicos, o DMSO no causou danos no crebro e na parede da artria, sugerindo que no possui efeitos angiotxicos e neurotxicos quando administrado lentamente na cartida. Alm disso, pode ser sugerido que o produto no causou alterao na permeabilidade da barreira hematoenceflica, devido a solubilizao na poro aquosa do sangue, sendo levado ao tecido nervoso pela circulao arterial. Os resultados de Bakar et al. (2011) sugerem tambm que o DMSO no causa a produo de radicais livres de oxignio pela membrana fosfolipdica do tecido nervoso. Desta forma, os efeitos txicos encontrados devem estar relacionados com outras doenas prvias dos animais quando usados como modelos experimentais. No entanto, Ali (2001) sugere que o DMSO possui efeitos sobre a funo neurolgica e pode ter como causa a veiculao de drogas neurotxicas. Sugere-se, desta forma, que a toxicidade no foi induzida pelo DMSO, mas como consequncia da capacidade de aumentar a permeabilidade de membranas celulares tornando os tecidos mais vulnerveis para substncias txicas. Em altas concentraes de DMSO possvel observar efeitos txicos irremediveis tanto in vitro como in vivo. No estudo realizado por Aita et al. (2005), o grupo de ratos tratados com 8 g/Kg de DMSO manifestou efeitos txicos. No entanto, os grupos tratados com 2 ou 4 g/Kg no apresentaram alteraes. Foi sugerido que a apoptose de linfcitos no timo manifestada na dose de 8 g/Kg, resultante de choque txico. Relatado em vrios trabalhos com animais experimentais, o efeito indesejvel do DMSO em altas doses a toxicidade celular que leva a induo de apoptose em clulas de linfoma e neurodegenerao apopttica desenvolvida no sistema nervoso central de ratos (KLOVERPRIS et al., 2010). Kloverpris et al. (2010) encontraram umento duas vezes superior na morte celular na concentrao de zero a 0,2% de DMSO, por sete dias. Em contraste, no observaram aumento na morte celular quando a exposio foi de uma hora, sugerindo que perodos mais longos de exposio ao DMSO est relacionado a morte celular. Alm disso, em concentraes acima de 2%, por mais de duas horas de exposio, houve influncia marcante na funcionalidade de linfcitos T, sugerindo que a apoptose induzida prximo desta concentrao,

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por longo perodo de exposio, poderia explicar o comprometimento da funcionalidade das clulas T neste estudo.

Objetivos

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1. Gerais x Identificar os possveis efeitos do tratamento experimental com ribavirina, prednisona e DMSO em ces naturalmente infectados com o vrus da cinomose. 2. Especficos x x x x x x x x Identificar as principais alteraes hematolgicas e liquricas de ces naturalmente infectados pelo vrus da cinomose. Identificar possveis efeitos adversos da ribavirina. Identificar possveis efeitos adversos da prednisona. Identificar possveis efeitos adversos do DMSO. Identificar possveis efeitos colaterais da associao dos frmacos experimentais supracitadas. Identificar os possveis efeitos antinflamatrios dos frmacos prednisona e DMSO em ces com encefalite pela cinomose. Identificar o perfil dos animais que apresentaram resultado positivo no tratamento com ribavirina. Identificar a frequncia da presena do vrus no sangue, medula ssea e lquor de ces naturalmente infectados pelo vrus da cinomose e aps o tratamento com as drogas experimentais.

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Material e Mtodos

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1. Animais Foram utilizados 60 ces com sinais neurolgicos de cinomose, diagnosticados a partir do histrico de vacinao, desenvolvimento clnico da doena e exame fsico. A confirmao diagnstica foi realizada pela tcnica da transcrio reversa seguida pela reao em cadeia da polimerase (RT-PCR). Os animais foram divididos em seis grupos de 10 animais de forma aleatria na medida em que foram atendidos no Hospital Veterinrio da FMVZ, UNESP Campus Botucatu, no Servio de Enfermidades Infecciosas dos Animais. 1.1 Critrios de incluso: Para a incluso dos animais no estudo, os sinais neurolgicos deveriam ter apresentao clnica multifocal e carter progressivo de no mximo 10 dias de evoluo. Porm, animais foram includos com apenas um sinal neurolgico. Os animais includos apresentaram sinais de acometimento dos sistemas respiratrio e/ou gastroentrico associados ou anteriormente apresentao neurolgica. Alguns animais apresentam tambm descamao de pele ou descarga ocular mucopurelenta. Esses sinais quando acompanhados de histrico de vacinao contra cinomose incorreta ou incompleta foram os principais critrios para a incluso dos animais no grupo experimental. Para serem considerados sinais respiratrios o animal deveria apresentar pelo menos uma das caractersticas a seguir: secreo nasal mucopurulenta, espirrro ou tosse produtiva e alteraes na ascultao pulmonar. Os sinais oculares foram caracterizados por secreo ocular,

ceratoconjuntivite seca, lcera de crnea e alopecia das plpebras. Os sinais gastroentricos foram considerados quando o animal

apresentava vmitos, diarria com ou sem sangue e anorexia ou hiporexia associado a episdios de regurgitao ou vmito. Foram includos animais com idade entre dois meses e seis anos, sem distino de sexo e raa.

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1.2 Critrios de excluso: No foram includos animais com quadro avanado da doena em fase neurolgica, como convulses, estado semicomatoso ou comatoso. 2. Grupos Experimentais Grupos 1 e 2: compostos por animais tratados com ribavirina e sua associao com o DMSO, respectivamente nas doses de 30 mg/Kg e 20mg/Kg, a cada 24 horas, durante 15 dias. Dessa forma, foram utilizados os materiais colhidos (sangue, medula ssea e lquor) para avaliao do tratamento pela RT-PCR. Estas amostras foram devidamente armazenadas em freezer a 80C desde 2007. Grupo 3: foram includos animais que serviram de controle para o tratamento antiviral especfico e para a avaliao da ao antinflamatria do DMSO. Estes animais receberam 50 mg/Kg de DMSO, diludo na concentrao de 10 a 20%, por via intravenosa, a cada 24 horas, durante 15 dias. Grupo 4: foram includos animais que serviram de controle para o tratamento antiviral especfico e para a avaliao da ao antinflamatria da prednisona. Estes animais receberam 4 mg/Kg de prednisona, por via oral, a cada 24 horas, durante 7 dias, em seguida receberam a dose de 2 mg/Kg de prednisona, tambm por via oral a cada 24 horas at completar os 15 dias de tratamento. Aps este perodo os animais foram encaminhados para o trmino do tratamento no prprio domiclio com reduo gradativa da dose. Grupo 5: os animais includos neste grupo receberam ribavirina na dose de 30 mg/Kg, por via oral, a cada 24 horas, durante 15 dias. Nestes foi administrado em associao a prednisona na dose de 4 mg/Kg, por via oral, a cada 24 horas, durante sete dias, com posterior reduo da dose para 2 mg/Kg, por via oral, a cada 24 horas, at completar o perodo de 15 dias. Aps este perodo os animais foram encaminhados para o trmino do tratamento no prprio domiclio com reduo gradativa da dose da prednisona por mais duas semanas. Este grupo foi considerado o grupo desafio da droga antiviral, j que a dose do glicocorticide foi imunossupressora.

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Grupo 6: os animais foram tratados com ribavirina, prednisona e DMSO. Neste grupo os ces receberam 30 mg/Kg de ribavirina, por via oral, a cada 24 horas, durante 15 dias; o DMSO foi administrado na dose de 50 mg/Kg, diludo na concentrao de 10 a 20%, por via intravenosa, a cada 24 horas; e a prednisona foi administrada na sua dose antinflamatria de 0,5 mg/Kg, por via oral, a cada 12 horas, durante sete dias, sendo reduzida para 0,25 mg/Kg, a cada 24 horas at completar 15 dias de tratamento. Aps este perodo o animal terminou o tratamento em domiclio com manuteno da dose e aumento do intervalo para 48 horas por mais sete dias. Todos os animais receberam tratamento sintomtico e de suporte bsico, que inclui suplementao vitamnica, fluidoterapia nos casos de desidratao e antibioticoterapia para combater infeces secundrias. Todos os animais foram avaliados neurologicamente e clinicamente todos os dias e foram realizados exames complementares de forma rotineira. Para padronizao dos exames clnicos dirios e melhor anlise dos resultados foi utilizada uma ficha clnica padro de simples preenchimento, contendo o dia de colheita e tipo de material colhido, permitindo ainda anexar todos os dados necessrios para a fcil realizao do experimento (Anexo 1). 3. Frmacos experimentais A Ribavirina1 utilizada na pesquisa possui apresentao de cpsulas de 250 mg e para facilitar o clculo da dose o medicamento foi diludo. A diluio foi realizada de forma assptica onde foram utilizadas oito cpsulas de ribavirina para 50 mL de gua destilada ou soluo fisiolgica 0,9% estril, formando uma soluo de 40 mg/mL para administrao oral. Depois de diluda, a ribavirina foi armazenada em frascos mbar e mantida em refrigerao constante em geladeira. A prednisona foi adquirida em farmcia de manipulao (Cruz Vermelha, Botucatu, SP), na forma de soluo oral, na concentrao de 40 mg/mL em frascos de 50 mL para os animais do grupo 4 e 5. Os animais do grupo 6 receberam uma dose menor e, por isso, foi solicitado uma nova formulao da droga na concentrao de 10 mg/mL em frascos de 50 mL. O DMSO2 foi utilizado a sua forma comercial Dimetil Sulfxido P. A., na concentrao de 99,9%, sendo que para a administrao intravenosa, a droga foi diluda em soluo fisiolgica 0,9% estril na proporo de 10 a 20%. O

1 2

Ribavirina: Ribavirin Laboratrio Blau DMSO: Dimetil Sulfxido P.A. Laboratrio Vetec Qumica Fina

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DMSO diludo foi administrado de forma lenta e o acesso venoso foi trocado a cada trs dias. 4. Ambiente e alimentao dos ces Os animais foram internados nos perodo de 15 dias para garantir que o medicamento fosse administrado corretamente, na dose e horrio

determinados. Da mesma forma, foi realizada avaliao clnica diria dos animais e exames complementares rotineiramente. Os animais ficaram em canis de alvenaria, com grades de ao inox, em uma sala separada do prdio da Disciplina de Enfermidades Infecciosas dos Animais, do Departamento de Higiene Veterinria e Sade Pblica da Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia da UNESP-Botucatu/SP. A sala de internao dos animais possui telas em portas e janelas, com rea externa isolada, porm sem controle de temperatura e umidade. A higienizao do ambiente foi realizada todos os dias, com desinfetante (Hipoclorito de sdio) e gua. Os canis foram forrados com papel de jornal, que era trocados duas a trs vezes ao dia, evitando que os animais ficassem sobre as fezes e urina. A alimentao dos animais foi caseira, basicamente de arroz e carne, oferecida duas vezes ao dia, sem quantidade pr-determinada. A gua foi oferecida vontade e trocada duas vezes ao dia. Os animais que apresentavam anorexia e desidratao por no ingerir gua recebiam fluidoterapia, com reposio energtica de glicose na dose de 5 mg/Kg. Os animais que apresentavam vmito foram mantidos em jejum no perodo de 12 horas at no apresentarem mais os sinais clnicos e receberam fluidoterapia durante este perodo. 5. Colheita de material e exames complementares: 5.1 Colheita de lquor: Todos os animais do experimento foram anestesiados conforme o protocolo sugerido pelo Departamento de Anestesiologia Veterinria da FMVZ UNESP Botucatu, SP para a colheita de lquor, composto pela medicao pr-anestsica acepromazina e diazepam e como anestsico intravenoso o

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tiopental. A acepromazina foi utilizada na dose de 0,05 mg/Kg e o diazepam na dose de 0,2 mg/Kg, por via intramuscular, cerca de 30 minutos antes da administrao do anestsico. O tiopental foi administrado por via intravenosa na dose de 7,5 mg/Kg, caso houvesse necessidade de aprofundar o estado hipntico foi utilizado mais 2,5 mg/Kg lentamente. Foram realizadas duas colheitas em cada animal, no momento em que o mesmo chegou ao ambulatrio, antes de qualquer tratamento e, aps um perodo de 15 dias, referente ao tempo do tratamento experimental. A tcnica de colheita de lquor seguiu a descrio feita por Dewey (2006). O lquor foi colhido em trs tubos por gotejamento e a quantidade de lquido colhida variou de 0,5 a 3 mL, dependendo do tamanho do animal. O lquido cerebroespinhal mais comumente obtido na cisterna cerebelomedular, local onde foi colhido o lquor de todos os animais. Os pontos de referncia anatmicos teis para a puno e colheita do lquor nesse local incluem a protuberncia occipital externa, a poro cranial da regio dorsal do xis (vrtebra cervical C2) e os processos transversos do atlas (vrtebra cervical C1). Os pacientes foram posicionados em decbito lateral e o pescoo foi flexionado por um assistente em aproximadamente 90 graus. O nariz do animal foi mantido paralelo mesa. No local da puno foi realizado tricotomia e assepsia da pele, e para a realizao do procedimento foram utilizadas agulhas hipodrmicas esterilizadas que foram introduzidas na linha mdia, direcionada para o espao atlantoccipital (DEWEY, 2006). Este material foi analisado pelo Laboratrio Clnico Veterinrio da FMVZ UNESP Botucatu para a realizao de exame fsico, qumico e contagem de clulas. Para a realizao da RT-PCR, o lquor foi colhido diretamente em microtubos de 500 L, livre de pirognios, DNAse, RNAse e metais pesados e armazenado em freezer a -80C, para posterior processamento, no Laboratrio de Biologia Molecular da Disciplina de Enfermidades Infecciosas dos Animais FMVZ UNESP Botucatu. 5.2 Exame do lquor:

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Devido rpida lise celular no ambiente de baixo teor protico do lquor, a contagem de clulas e as preparaes citolgicas do fluido foram realizadas dentro de 30 a 60 minutos aps a colheita. Foram avaliados o volume, cor, aspecto, densidade e a presena de cogulos na amostra. As alteraes registradas como partes do exame fsico foram classificadas como discretas, moderadas ou intensas. A mensurao da densidade foi realizada com uso do refratmetro. O exame qumico do lquor foi realizado com tiras reagentes 3 e foram avaliados pH, estimativa de protenas, glicose e sangue oculto. A quantificao de protenas totais do lquor requer um mtodo bioqumico 4 com a utilizao de espectrofotmetro5, pois a tira reagente um mtodo semi-quantitativo. Tambm como parte do exame qumico, foi realizado um teste qualitativo de protenas (Teste de Pandy), que detecta o aumento de globulinas. Para a realizao, utilizou-se uma gota da amostra em um mL do reativo de Pandy (soluo saturada de fenol), e a presena de turbidez da soluo foi considerada positiva e ento classificada em cruzes (+, ++ ou +++). Para contagens de hemcias e clulas nucleadas utilizou-se o hemocitmetro padro (Cmara de Neubauer). Para contagens de clulas nucleadas em lquor no-diludo, foram preenchidas ambas as cmaras do hemocitmetro. Todas as clulas nucleadas presentes na rea da cmara foram contadas para obteno de nmero total por microlitro. A contagem de hemcias foi realizada de modo semelhante. Como o lquor normalmente apresenta baixa celularidade, h a necessidade de concentrao destas clulas por citocentrifugao, que foi realizada colocando-se a amostra em um citofunil acoplado a uma lmina de microscopia e centrifugada a 800 rpm durante cinco minutos. As preparaes de citocentrifugao foram secas ao ar livre e coradas com o corante de base Romanowsky. Na objetiva de imerso do microscpio ptico, realizou-se a leitura da lmina preparada, visando contagem de no mnimo 50 clulas nucleadas (CHRISMAN, 1992; MEYER, 1995). 5.3 Colheita de sangue e urina: As amostras de sangue foram colhidas com seringas e agulhas esterilizadas e descartveis, no volume de 10 mL, sendo ento acondicionadas em tubos com EDTA a 7,5% e sem anticoagulantes, para retirada de soro. O local da puno foi a veia jugular. Aps o procedimento, as amostras foram levadas diretamente ao Laboratrio Clnico Veterinrio para realizao de hemograma e anlises bioqumicas de funo heptica e renal. O sistema

Combur Test - Roche Kit Bioqumico - Doles 5 CELM SB 190

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hepatobiliar

foi

avaliado

partir

da

atividade

srica

da

alanina-

aminotransferase (ALT), fosfatase alcalina (FA) e gama-glutamiltransferase (GGT) e da concentrao de albumina. O sistema renal foi avaliado pela mensurao dos resduos nitrogenados, uria e creatinina no soro, e pelo exame de urina tipo I. Nos animais dos grupos 3 e 4 foi colhido apenas sangue para hemogramas de acompanhamento nos dias 1, 7 e 15, j que foram utilizadas drogas

conhecidas. No foram realizados exames bioqumicos pelos mesmos motivos. Alm disso, este grupo foi formado com o objetivo de terem seus resultados comparados com os resultados da RT-PCR dos grupos experimentais. Os animais dos grupos 1, 2, 5 e 6, que receberam o antiviral, as amostras de sangue foram colhidas nos dias 1, 4, 7, 10, 12 e 15. As dosagens bioqumicas foram realizadas nos grupos 1, 2, 5 e 6 nos dias 1, 5, 10 e 15 para identificao de possveis efeitos colaterais dos frmacos experimentais. As amostras de sangue com anticoagulante foram acondicionadas em microtubos de 500 L, livre de pirognios, DNAse, RNAse e metais pesados e armazenadas em freezer a -80C para posterior processamento no Laboratrio de Biologia Molecular da Disciplina de Enfermidades Infecciosas dos Animais FMVZ UNESP Botucatu. Estas amostras foram colhidas antes e aps o tratamento experimental em todos os grupos, com intervalo de 15 dias. As amostras de urina foram colhidas com auxlio de seringas descartveis e agulhas descartveis esterilizadas atravs da puno da vescula urinria e foram levadas diretamente ao Laboratrio Clnico Veterinrio da FMVZ, UNESP Botucatu para a anlise. No caso de animais muito pequenos ou que no mantinham a vescula repleta foi utilizada a sondagem uretral para obteno da urina. Essa tcnica no foi escolhida para todos os casos por ser muito agressiva ao sistema urinrio do animal podendo levar a casos de cistite ascendente. Em alguns animais no foi possvel colher a urina em todos os momentos pela dificuldade de mant-lo com sonda uretral e de puncionar a vescula urinria devido ao tamanho do animal, porm para a manuteno do animal no grupo experimental, a urina foi colhida pelo menos em dois momentos durante o tratamento.

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O exame de urina do tipo I foi realizado nos animais dos grupos 1, 2, 5 e 6 nos dias 1, 5, 10 e 15 de tratamento com o antiviral com objetivo de identificar possveis efeitos colaterais dos frmacos experimentais utilizados. Lembrando sempre que os animais dos grupos 1 e 2 so animais que foram includos em pesquisa prvia, porm a metodologia foi mantida para comparao dos resultados j encontrados. 5.3 Hemograma: Aps chegada ao laboratrio, foi confeccionada a lmina de esfregao sanguneo e corada por corante a base de Romanowsky (Pantico rpido), para realizao da contagem diferencial de leuccitos, observao da morfologia das clulas e a realizao da estimativa do nmero de plaquetas. Parte da amostra foi colocada em tubos capilares e centrifugada em microcentrfugas por cinco minutos na rotao de 11.500 rpm e aps foi verificado o volume globular pelo carto de leitura de micro-hematcrito e a densidade plasmtica por refratometria, resultando no valor de protena total plasmtica. A contagem total de leuccitos e hemcias foi realizada em contador automtico6. Quando foi observada na lmina de esfregao sanguneo uma pequena quantidade de plaquetas dificultando a estimativa, foi realizada a diluio do sangue com Lquido de Brecher (oxalato de amnio 1%) e feita a contagem manual das mesmas em hemocitmetro padro (Cmara de Neubauer). Para
7

determinao

de

hemoglobina,

utilizou-se

hemoglominmetro , um mtodo colorimtrico. 5.5 Anlises bioqumicas: Para a realizao das provas bioqumicas as amostras foram

acondicionadas em tubos sem anticoagulante, com gel ativador da coagulao, no volume de trs a quatro mL de sangue. Aps a coagulao do mesmo, as amostras foram centrifugadas na rotao de 3.000 rpm durante oito minutos, e o soro foi separado e transferido para tubos menores e processado em
6 7

CELM CC 510 CELM HB 520

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espectofotmetro5. Nestas anlises foram utilizados kits comerciais para determinao por mtodo cintico, da creatinina8, enzimticos da uria8, ALT9, FA9, GGT9, e colorimtricos da protena total srica 8 e albumina8. 5.6 Exame de urina tipo I: As amostras de urina foram acondicionadas nas prprias seringas onde foram colhidas, com o objetivo de diminuir a contaminao, no volume aproximado de 10 mL. Da mesma forma, foram levadas e processadas imediatamente aps a colheita. Foram separados cinco mL da amostra em tubos e centrifugados na rotao de 1.500 rpm durante cinco minutos, permitindo desta forma, descartar o sobrenadante e o 0,5 mL restante foi utilizado para confeccionar lmina para a observao do sedimento urinrio em microscpio ptico, em aumento 40x. A outra parte da amostra foi utilizada para o exame fsico-qumico, sendo o exame fsico realizado pela observao, verificando cor e turbidez. Foram utilizadas tiras reagentes 3 para a avaliao de pH, protenas, glicose, alterao de urobilinognio, presena de bilirrubina e sangue oculto. A densidade foi obtida por refratometria e para determinao de sais biliares foi utilizado o teste com sal de enxofre. 5.7 Colheita de medula ssea: As colheitas de medula ssea foram realizadas nos mesmos momentos das colheitas de lquor, antes do incio do tratamento e aps 15 dias de administrao das drogas. Os animais estavam anestesiados para a colheita de lquor, facilitando a colheita no mero, que foi realizada com agulha de bipsia de medula ssea10, com mandril, e esterilizada. A colheita foi realizada com seringa esterilizada e com EDTA, o material foi depositado em microtubos de 500 L, livre de pirognios, DNAse, RNAse e metais pesados e armazenado em freezer a -80C para posterior processamento em Laboratrio de Biologia Molecular, da Disciplina de Enfermidades Infecciosas dos Animais da FMVZ, UNESP Botucatu.

Labtest Bioclin 10 Agulha de bipsia de medula ssea Modelo Komyiashiki - Japan

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6. Tcnica de Biologia Molecular: 6.1 Extrao do RNA: A extrao do RNA foi realizada a partir das amostras de sangue, medula ssea e lquor, utilizando-se o Kit para extrao de RNA Invisorb Spin Virus RNA Mini Kit (Inviteck). Para realizao da extrao foram diludos 100 L da amostra em 100 L de gua livre de nucleases. E para cada cinco amostras foram adicionados um controle negativo que era composto apenas por 200 L de gua livre de nucleases. As reaes foram realizadas em baterias de 10 amostras por vez. O controle positivo utilizou amostras de urina sabidamente positivas e para realizao da extrao foi utilizada mesma diluio em gua livre de nucleases. O procedimento da extrao foi realizado conforme a instruo do fabricante. s amostras diludas foram adicionados 600 L Lysis Buffer RV, 20 L de Carrier RNA e 20 L de Proteinase K, levados ao vrtex rpido para agitao constante em temperatura de 65C, durante 10 minutos. Aps, foram adicionados 400 L Binding Solution e levado ao vrtex rpido. O volume do tubo foi transferido para o tubo RTA Spin Filter, onde ficou incubado por um minuto e em seguida centrifugado em 8.000 rpm por um minuto. O lquido que passou pelo filtro foi descartado e RTA Spin Filter foi transferido para RTA Receiver Tube. Neste foi adicionado 600 L Wash Buffer R1 e centrifugado novamente em 8.000 rpm durante um minuto. O lquido que passou pelo filtro foi descartado e novamente transferido para um novo RTA Receiver Tube. Em seguida, adicionaram-se 600 L Wash Buffer R2 e o lquido foi colocado novamente para centrifugao em 8.000 rpm durante um minuto. Este ltimo procedimento foi realizado duas vezes. Para eliminar traos de etanol, realizouse nova centrifugao em 14.000 rpm por quatro minutos. Aps transferiu-se o RTA Spin Filter para RNase free 1,5 mL Elution tube e adicionou-se 100 L de Elution Buffer R (aquecido a 80C), que ficou incubado por trs minutos e centrifugado em 4.000 rpm durante um minuto. Aps foi descartado o filtro e o RNA foi imediatamente aliquotado em tubos menores com volume de 7 L da amostra e acondicionados a -80C. 6.2 Converso para cDNA: As amostras (7 L) foram retiradas do freezer -80C e levadas diretamente ao termociclador para desnaturao do RNA, durante sete minutos em temperatura de 95C. Ao mesmo tempo foi preparada a mistura para formao de cDNA. A mistura era composta por 3 L de gua Mili-Q autoclavada; 1 L de Randon Primer (250 g/L); 1 L de dNTP (10 mM); 5 L de Buffer 5x; 1 L de DDT (0,1 M); 1 L de inibidor de RNAse (10 U/L) e 1 L tampo de M-MLV Reverse transcriptase. A mistura formou como volume final 13 L. Aliquotou-se 13 L em cada microtubo previamente identificado com o RNA previamente aquecido, totalizando-se 20 L. Levou-se ao termociclador no programa CINOCDNA (composto por ciclo de 25C por 10 minutos; 37C por 50 minutos e 70C por 15 minutos, totalizando um perodo de 1 hora e 15 minutos).

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6.3 RT-PCR: Para a realizao da reao de RT-PCR foi necessria a preparao de outra mistura com 17,35 L de gua Mili-Q autoclavada; 2,5 L de Buffer 10x; 0,75 L de Mg2Cl2 (50 mM); 0,5 L de dNTP (10 mM); 1,25 L do Primer CDVNPS F1 (Tabela 1); 1,25 L do Primer CDV-NPS R1 (Tabela 1); 0,15 L de Taq DNA Platinum (5U/L), com volume final de 23,75 L da mistura. Aliquotou-se 23,75 L em cada microtubo previamente identificado, sempre mantido em gelo, na sala de aplicao foi pipetado 1,25 L do cDNA em cada tubo, totalizando 25 L de volume total. Aps os microtubos foram levados ao termociclador no programa CINOPCR (composto por ciclo de 95C por 10 minutos, 39 ciclos de 95C por 30 segundos, 56C por 30 segundos, 72C por 30 segundos, depois 72C por 10 minutos e 4 for ever) e, aps, foi armazenado a -20C. A leitura do gel foi realizada em gel de agarose a 2% em transluminador UV, corados com brometo de etdeo, onde se esperou um produto amplificado com 440 pb. 6.4 Hemi-Nested PCR: A reao do hemi-nested PCR (hn-PCR) foi realizada de forma semelhante a reao da PCR, utilizou-se para estas reaes as amostras que foram negativas na PCR, onde aliquotou-se 23,75 L da mistura e 1,25 L do produto amplificado da PCR. A mistura foi composta pelos mesmos reagentes, porm na hn-PCR utilizou-se Primer CDV-NPS R2 (tabela 1) no lugar do Primer CDV-NPS R1. E o produto esperado desta reao apresentou 331 pb na leitura do gel, assim como na reao anterior. TABELA 1 Descrio da sequncia de nucleotdeos iniciadores utilizados na reao de RT-PCR e hn-PCR no diagnstico da cinomose em ces. Botucatu, SP, 2011. Primers (nmero de acesso aos genes) Iniciadores Primer ITS 1 F (10 pmol) CVD-NPS F1 5-3 Primer ITS 1 R (10 pmol) CVD-NPS R1 5-3 Primer ITS 2 R (10 pmol) CVD-NPS R2 5-3 (AMARAL, 2007). Os iniciadores (primers) utilizados nas duas reaes amplificaram regies especficas do gene da nucleoprotena [GenBank: X02000.1]. CGAATTTTAACCCTCCATG CCTTGGTGATGCCAAGCTCG ATCCCCAGGRAACAAGCCTACAA

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7. Anlise estatstica: A comparao de frequncias de ocorrncias foi realizada pelos testes de Qui-quadrado ou G de Williams, de acordo com os resultados registrados em tabelas de contingncia. Para as variveis ordinais as comparaes entre os grupos foram realizadas pelo teste de Kruskall-Wallis, seguido de comparao de medianas pelo teste de Dunn. As variveis discretas e contnuas foram submetidas verificao do tipo de distribuio pelo teste de Shapiro-Wilkins; quando de distribuio Normal, os grupos foram comparados pela Anlise de Varincia Um Fator seguido de teste de Tukey; quando de distribuio Livre, os grupos foram comparados pelo teste de Kruskall-Wallis, seguido de comparao de medianas pelo teste de Dunn. Em todas as anlises, valores de P menores que 0,05 foram considerados significantes. Os testes foram realizados nos programas BioEstat 5.0 (AIRES et al, 2007) e EpiInfo 6.04 (1996).

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Resultados

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1. Animais e dados epidemiolgicos Foram utilizados 60 ces naturalmente infectados com o vrus da cinomose, apresentando sinais neurolgicos precedidos ou concomitantes com sinais sistmicos, como alteraes respiratrias, digestivas, oculares e epiteliais. Todos os animais no possuam histrico de vacinao correto e foi estudada a quantidade de animais que apresentavam histrico de contactantes sintomtico ou que possuam acesso rua. Os 20 animais dos grupos 1 e 2 fizeram parte da pesquisa precedente, porm todos os dados foram novamente avaliados para serem comparados com protocolos de tratamento testados na atual pesquisa. O estudo apresentou a frequncia de 45% de fmeas e 55% de machos que foram descritos na tabela 2. TABELA 2 Frequncia de ces machos e fmeas com cinomose includos nos respectivos grupos experimentais. Botucatu, SP, 2011. Fmeas Grupo G1 G2 G3 G4 G5 G6 Total n 5 4 6 3 4 5 27 % 50 40 60 30 40 50 45 n 5 6 4 7 6 5 33 Machos % 50 60 40 70 60 50 55

G1: grupo 1; G2: grupo 2; G3: grupo 3; G4: grupo 4; G5: grupo 5; G6: grupo 6 n: nmero de animais %: porcentagem

Os animais includos na pesquisa apresentavam idades a partir de trs meses at um de 156 meses. Apenas esse animal acima de seis anos foi includo na pesquisa, j que apresentou imunofluorescncia direta positiva no lquor, demonstrando que estava em fase aguda da doena. Os dados das idades dos animais esto na tabela 3.

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TABELA 3 Mdia, desvio padro, mediana das idades em meses dos ces com cinomose includos na pesquisa, divididos nos diferentes grupos. Botucatu, SP, 2011. Grupo Mdia Desvio padro 15,8 44,4 24,6 20,9 21,8 17,5 Mnimo P25 Mediana P75 Mximo

G1 G2 G3 G4 G5 G6

29,6 47,0 35,4 31,0 20,0 15,1

8,0 4,0 5,0 7,0 3,0 5,0

24,0 12,0 7,0 16,0 8,0 8,0

24,0 42,0 48,0 24,0 10,5 7,5

36,0 60,0 60,0 36,0 24,0 12,0

60 156 60 72 60 60

G1: grupo 1; G2: grupo 2; G3: grupo 3; G4: grupo 4; G5: grupo 5; G6: grupo 6 P25: percentil 25 P75: percentil 75

Mesmo o estudo sendo realizado de forma aleatria a incluso dos animais nos grupos, os componentes dos grupos 5 e 6 foram os mais jovens, no entanto os valores demonstraram que na sua maioria foram adultos, ou seja, acima de um ano de idade. Com relao raa dos animais includos na pesquisa, 75% foram ces sem raa definida; seis (10%) da raa Poodle; dois (3,3%) animais da raa Border Colie; dois (3,3%) Pinschers e um (1,7%) animais das raas Daschound, Labrador, Pit Bull, Pointer e Waimaraner. Quando analisou-se a frequncia das raas por grupo, verificou-se que a quantidade de animais sem raa definida ocorreu em 90% dos animais dos grupos 4 e 6; 70% nos grupos 1, 3 e 5, e 60% no grupo 2. Para serem includos na pesquisa, os animais deveriam apresentar no mximo 10 dias de evoluo dos sinais neurolgicos, com objetivo de selecionar os animais que estavam na fase aguda, onde h intensa replicao viral e possvel ao da droga antiviral. Estes dados do perodo de evoluo foram registrados na tabela 4.

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TABELA 4 Mdia, desvio padro e mediana dos dias de evoluo dos sinais clnicos neurolgicos dos ces com cinomose nos diferentes grupos. Botucatu, SP, 2011. Grupos Mdia Desvio padro 3,2 2,6 2,6 3,0 1,8 2,1 Mnimo P25 Mediana P75 Mximo

G1 G2 G3 G4 G5 G6

5,0 6,2 7,0 6,0 5,2 4,4

1,0 3,0 2,0 1,0 3,0 2,0

3,0 4,0 5,0 4,0 4,0 2,0

4,0 6,0 7,0 6,5 5,0 4,5

9,0 8,0 10,0 7,0 7,0 6,0

10,0 10,0 10,0 10,0 8,0 7,0

G1: grupo 1; G2: grupo 2; G3: grupo 3; G4: grupo 4; G5: grupo 5; G6: grupo 6 P25: percentil 25 P75: percentil 75

Dos animais includos no estudo 63,3% apresentavam sinais oculares. Os animais dos grupos 5 e 6 foram os que apresentaram maior ndice de acometimento ocular, em relao aos outros grupos. TABELA 5 Frequncia dos sinais oculares em ces com cinomose nos diferentes grupos experimentais. Botucatu, SP, 2011. Sem sinais oculares Grupo G1 G2 G3 G4 G5 G6 Total n 5 5 4 4 1 3 22 % 50,0 50,0 40,0 40,0 10,0 30,0 36,7 Sinais oculares n 5 5 6 6 9 7 38 % 50,0 50,0 60,0 60,0 90,0 70,0 63,3

Estatstica: Qui-quadrado, p=0,4307 G1: grupo 1; G2: grupo 2; G3: grupo 3; G4: grupo 4; G5: grupo 5; G6: grupo 6 n: nmero de animais. %: porcentagem.

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Com relao aos sinais respiratrios, foi encontrada uma frequncia de 41,7% dos animais includos na pesquisa. Somente o grupo 5 que apresentou 60% dos animais com sinais respiratrios, os outros grupos mostraram uma frequncia maior de animais sem sinais respiratrios. importante ressaltar que este mesmo grupo apresentou uma frequncia alta de animais com sinais oculares (Tabela 6). TABELA 6 Frequncia dos sinais respiratrios em ces com cinomose nos diferentes grupos experimentais. Botucatu, SP, 2011. Sem sinais respiratrios Grupo G1 G2 G3 G4 G5 G6 Total n 7 6 6 6 4 6 35 % 70,0 60,0 60,0 60,0 40,0 60,0 58,3 Sinais respiratrios n 3 4 4 4 6 4 25 % 30,0 40,0 40,0 40,0 60,0 40,0 41,7

Estatstica: Qui-quadrado, p=0,8507. G1: grupo 1; G2: grupo 2; G3: grupo 3; G4: grupo 4; G5: grupo 5; G6: grupo 6 n: nmero de animais. %: porcentagem.

De todos os animais includos na pesquisa, 38,3% deles apresentou sinais gatroentricos. Esta sintomatologia foi a que apresentou menor frequncia nos animais estudados. Apenas o grupo 6 apresentou maior frequncia de animais com sinais gastroentricos no momento de atendimento no Hospital Veterinrio ou no histrico. Estes animais tambm apresentaram uma frequncia alta de sinais oculares associados (Tabela 7).

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TABELA 7 Frequncia dos sinais gastroentricos em ces com cinomose nos diferentes grupos experimentais. Botucatu, SP, 2011. Sem sinais gastroentricos Grupo G1 G2 G3 G4 G5 G6 Total n 7 6 7 7 6 4 37 % 70,0 60,0 70,0 70,0 60,0 40,0 61,7 Sinais gastroentricos n 3 4 3 3 4 6 23 % 30,0 40,0 30,0 30,0 40,0 60,0 38,3

Estatstica: Qui-quadrado, p=0,7168. G1: grupo 1; G2: grupo 2; G3: grupo 3; G4: grupo 4; G5: grupo 5; G6: grupo 6 n: nmero de animais. %: porcentagem.

Aps a tabulao dos dados de sinais clnicos foi possvel verificar que os animais includos no estudo alm de apresentarem sinais neurolgicos, tiveram alta frequncia em sinais oculares, menor em sinais respiratrios e, por ltimo, sinais gastroentricos. No G5 foi possvel verificar alto ndice de sinais oculares e respiratrios e no G6 de sinais oculares e gastroentricos. Os outros grupos apresentaram distribuio homognea dos sinais sistmicos. Alm dos sinais sistmicos, tambm foi avaliada a frequncia dos sinais neurolgicos em todos os animais e nos diferentes grupos experimentais (Tabela 8).

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TABELA 8 Frequncia dos sinais neurolgicos nos ces com cinomose includos na pesquisa nos diferentes grupos experimentais. Botucatu, SP, 2011. Frequncia (%) Sinais neurolgicos G1 Alterao de Nervos Cranianos Alterao postura ou andar Ataxia Mioclonias Dficits de propriocepo Balanar a cabea Desvio de cabea Alterao no nvel de conscincia Choro noturno Alterao dos reflexos medulares Andar compulsivo Andar em crculos Opisttono Agressividade Presso da cabea contra objetos 60,0 80,0 G2 90,0 80,0 G3 90,0 80,0 G4 90,0 70,0 G5 90,0 50,0 G6 50,0 50,0 Total 78,3 68,3

90,0 40,0 30,0

70,0 60,0 30,0

70,0 50,0 60,0

60,0 60,0 50,0

70,0 20,0 60,0

50,0 40,0 30,0

68,3 45,0 43,3

50,0 20,0 40,0 10,0 20,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

40,0 30,0 20,0 10,0 20,0 20,0 10,0 10,0 0,0 0,0

40,0 50,0 30,0 20,0 30,0 20,0 20,0 10,0 10,0 0,0

0,0 10,0 20,0 10,0 10,0 30,0 10,0 30,0 20,0 20,0

10,0 20,0 0,0 10,0 0,0 10,0 10,0 0,0 10,0 0,0

30,0 10,0 20,0 20,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

28,3 23,3 21,7 13,3 13,3 13,3 8,3 8,3 6,7 3,3

Estatstica: Qui-quadrado. G1: grupo 1; G2: grupo 2; G3: grupo 3; G4: grupo 4; G5: grupo 5; G6: grupo 6 %: porcentagem.

Os sinais neurolgicos mais encontrados nos animais includos na pesquisa foram as alteraes de nervos cranianos (78,3%), seguidos de

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alteraes na postura e no andar (68,3%), junto com ataxia (68,3%). Dentre as alteraes de postura foram includos os animais que apresentavam dificuldade de ficar em estao, consequncia de paresia/paralisia flcida ou espstica dos quatro membros e/ou do pescoo, no foi considerado alterao apenas na postura de cabea, como o desvio de cabea. Dentre os dficits de andar foram consideradas as dificuldades de iniciar o movimento, hipo ou hipermetria, paresias flcidas ou espsticas, dificuldade de realizao de manobras especiais, como subir ou descer degraus e quedas espontneas durante a locomoo. A ataxia foi considerada separadamente das alteraes no andar por ser caracterizada, na maior parte das vezes, por um dficit de coordenao motora. A mioclonia apresentou uma frequncia de 45% em todos os grupos. Este sinal foi considerado em animais com acometimento de um msculo ou grupo de msculos. Alguns grupos de msculos apresentaram maior incidncia como os msculos mastigatrios, abdominais e flexores dos membros. Na pesquisa, animais que apresentavam dficits de propriocepo em um membro ou nos quatro membros foram agrupados e apresentaram uma frequncia de 43,3%. O balanar de cabea foi considerado como mudana de comportamento e foi encontrado em 28,3% dos animais. J o desvio lateral da cabea (23,3%) ocorre por alterao no sistema vestibular e foi considerado quando no havia paralelismo na posio das orelhas e olhos em relao ao cho. Este sinal neurolgico geralmente foi acompanhado por nistagmo e estrabismo, que foram considerados nas alteraes de nervos cranianos. A diminuio do nvel de conscincia (21,7%) foi caracterizada principalmente por animais que apresentavam apatia, j que no foram includos animais em estado semicomatoso ou comatoso. Dentre os dficits dos nveis de conscincia, o choro noturno apresentou uma frequncia de 13,3%. As alteraes de comportamento com menor frequncia ficaram caracterizadas por agressividade (6,7%), andar compulsivo (13,3%), presso da cabea contra objetos (3,3%) e andar em crculos (8,3%), este ltimo tambm considerado na sndrome vestibular quando caracterizado por crculos pequenos. Os reflexos medulares (13,3%) foram considerados tanto na hipo quanto na hiperreflexia, que geralmente esto alterados quando h um quadro de paresia. O opisttono foi encontrado em 8,3% dos animais includos na pesquisa e considerado como uma alterao postural, portanto por uma leso cerebral, diferente da maior parte das alteraes posturais que observamos, por isso foi colocado separadamente. Quando analisamos em cada grupo separadamente verificamos que no G1 90% dos animais apresentavam ataxia, 80% alterao de postura e andar e 60% alterao de nervos cranianos. O G2 apresentou as mesmas caractersticas do G3 com 90% de ces com alterao de nervos cranianos, 80% de alterao de postura e andar, seguida de 70% com ataxia. No G4, 90% dos animais includos apresentavam alterao dos nervos cranianos, 70% com alterao da postura e andar e 60% com ataxia ou mioclonias.

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Os animais do G5 apresentaram 90% de alterao de nervos cranianos, 70% de ataxia e 60% de dficits proprioceptivos. O grupo que apresentou maior distribuio dos sinais clnicos foi o G6, com 50% dos animais apresentando alteraes de nervos cranianos, alterao de postura e andar ou ataxia. Sendo que 40% apresentavam mioclonias e 30% dos ces tinham dficits de propriocepo e balanar de cabea. No foram includos animais com histrico de vacinao correta, ou seja, com trs doses e aplicadas por um mdico veterinrio. Os animais foram caracterizados por: no vacinados; com vacinao incompleta, ou seja, no receberam doses de reforo; vacinao sem orientao do mdico veterinrio e animais sem histrico de vacinao (Tabela 9). TABELA 9 Frequncia da vacinao dos ces com cinomose includos na pesquisa, segundo o grupo experimental. Botucatu, SP, 2011. SV Grupo G1 G2 G3 G4 G5 G6 Total n 5 6 6 6 5 5 33 % 50 60 60 60 50 50 55 n 0 2 1 1 1 1 6 VI % 0 20 10 10 10 10 10 n 4 2 3 1 4 4 18 VSO % 40 20 30 10 40 40 30 n 1 0 0 2 0 0 3 SHV % 10 0 0 20 0 0 5

G1: grupo 1; G2: grupo 2; G3: grupo 3; G4: grupo 4; G5: grupo 5; G6: grupo 6 n: nmero de animais %: porcentagem SV: sem vacinao; VI: vacinao incompleta; VSO: vacinao sem orientao do mdico veterinrio; SHV: sem histrico de vacinao.

O nmero maior de animais que foram includos no recebeu a vacina contra o vrus da cinomose nos ltimos trs anos, em seguida os animais que receberam vacina em casas agropecurias ou farmcias veterinrias sem orientao do mdico veterinrio e 10% dos animais receberam pelo menos uma ou duas doses da vacina contra o vrus da cinomose, independente se foi com orientao veterinria ou no. Os animais que no receberam a vacina no perodo dos dois ltimos anos foram includos no grupo de animais com vacinao incompleta, contando que houve uma interrupo na revacinao anual. Outros dados epidemiolgicos tambm foram estudados, como a presena de contactantes sintomticos e o acesso rua. Com relao aos animais que conviveram com animais doentes, verificou-se que apenas 16,7% dos animais tiveram esse contato. 55% dos animais da pesquisa no tinham contactantes

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na mesma residncia e 28,3% tinham contato com outros animais sem sinais clnicos. Dos 60 ces includos na pesquisa, 34 (56,7%) no tinham acesso rua e 26 (43,3%) acessavam a rua com frequncia, sozinhos ou acompanhados pelo proprietrio. 2. Dados relacionados com a evoluo clnica: Os animais que entraram na pesquisa foram includos nos grupos experimentais conforme o atendimento no setor de Enfermidades Infecciosas do Hospital Veterinrio da FMVZ UNESP, Campus Botucatu, SP. Todos os animais foram tratados com medicaes e suplementaes vitamnicas conforme a rotina de tratamento de ces com cinomose no setor. Estes ficaram internados para serem avaliados clnica e neurologicamente todos os dias. O internamento dos animais tambm serviu de garantia que eles recebessem todas as medicaes prescritas no perodo de 15 dias, enquanto seriam avaliados. Os animais do G1 foram tratados apenas com a ribavirina; G2 foram tratados com ribavirina e DMSO (20 mg/Kg); G3 tratamento apenas com DMSO (50 mg/Kg); G4 tratado com prednisona (4 mg/kg, a cada 24 horas); G5 receberam o tratamento com ribavirina e prednisona (4 mg/Kg, a cada 24 horas); G6 foram os animais tratados com ribavirina, prednisona (0,5 mg/Kg, a cada 12 horas) e DMSO (50 mg/Kg). A tabela 10 relaciona o tempo de tratamento de cada grupo experimental. Para a manuteno do animal na pesquisa, utilizou-se o tempo mnimo de tratamento de 3 dias para os grupos 3 e 4 que so controle; nos grupos que receberam ribavirina, os animais deveriam ser tratados pelo menos 5 dias para serem includos, j que na pesquisa anterior verificou que a ribavirina comeava a fazer efeito aps este perodo de administrao.

TABELA 10 Mdia, desvio padro, mediana do tempo de tratamento dos ces com cinomose para cada grupo experimental. Botucatu, SP, 2011. Grupo G1 G2 G3 G4 Mdia Desvio padro 2,2 2,8 5,0 5,2 Mnimo P25 Mediana P75 Mximo

14,1 13,7 12,1 9,3

8,0 8,0 3,0 3,0

14,0 15,0 10,0 5,0

15,0 15,0 15,0 8,0

15,0 15,0 15,0 15,0

15,0 15,0 15,0 15,0

92

G5 G6

13,7 14,0

2,7 1,8

7,0 10,0

14,0 13,0

15,0 15,0

15,0 15,0

15,0 15,0

G1: grupo 1; G2: grupo 2; G3: grupo 3; G4: grupo 4; G5: grupo 5; G6: grupo 6 P25: percentil 25 P75: percentil 75

Neste primeiro momento foi possvel observar que os grupos que receberam tratamento com a ribavirina (grupos 1, 2, 5 e 6) tiveram uma mdia de dias de tratamento maior do que os grupos controle (3 e 4). O grupo 4 foi o que apresentou pior evoluo, com mdia chegando a menos de 10 dias de tratamento e foi o nico grupo que apresentou mediana de 8 dias de tratamento. O tratamento experimental foi avaliado segundo a melhora clnica e a sobrevida dos animais nos diferentes grupos. Os dados foram tratados da seguinte forma: os animais que vieram a bito, que apresentaram melhora clnica e que sobreviveram aos 15 dias de tratamento. No entanto, aps o perodo de 15 dias de tratamento, alguns animais morreram, outros apresentaram piora ou ficaram com sequelas graves e foram eutanasiados, ou mesmo apresentaram melhora e sobreviveram, assim, estes animais foram agrupados todos juntos pela dificuldade de acompanhar a resposta, j que uma parte deles terminou o tratamento em domiclio (Tabela 11).

TABELA 11 Avaliao do tratamento experimental segundo a sobrevida dos ces com cinomose nos diferentes grupos. Botucatu, SP, 2011. bito Grupo G1 G2 G3 G4 G5 G6 Total n 3,0 2,0 3,0 7,0 3,0 4,0 22,0 % 30,0 20,0 30,0 70,0 30,0 40,0 36,7 Sobrevida n 1,0 4,0 4,0 2,0 2,0 2,0 15,0 % 10,0 40,0 40,0 20,0 20,0 20,0 25,0 n 6,0 4,0 3,0 1,0 5,0 4,0 23,0 Melhora % 60,0 40,0 30,0 10,0 50,0 40,0 38,3

Estatstica: Teste G de Willians; p=0,4034 G1: grupo 1; G2: grupo 2; G3: grupo 3; G4: grupo 4; G5: grupo 5; G6: grupo 6 n: nmero de animais %: porcentagem

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Como pior resultado frente sobrevida dos animais, o grupo 4 se destacou com 70% dos animais vindo ao bito e apenas um animal apresentou melhora clnica. Em compensao, os grupos tratados com ribavirina (1, 2, 5 e 6) tiveram os melhores resultados, quando observamos as taxas de melhora clnica (Figura 1).
7

5 Nmero de animais

4 bito 3 sobrevida melhora 2

0 G1 G2 G3 G4 G5 G6 Grupos Experimentais Estatstica: Teste G de Willians; p=0,4034 G1: grupo 1; G2: grupo 2; G3: grupo 3; G4: grupo 4; G5: grupo 5; G6: grupo 6

FIGURA 1 Representao grfica da avaliao do tratamento experimental segundo a sobrevida dos ces com cinomose nos diferentes grupos. Botucatu, SP, 2011. Dos 60 animais includos no experimento, apenas 23 (38,3%) apresentaram melhora clnica, sendo um resultado semelhante ao nmero de bitos (36,7%). Quando somamos os dados dos animais que receberam o antiviral, verificamos que 12 (30%) animais vieram ao bito e 19 (47,5%) apresentaram melhora clnica evidente no perodo de internao. Para melhor avaliar os tratamentos em relao aos grupos controle, foram realizadas anlises estatsticas separadas de comparao dos grupos tratados sem prednisona, com e sem ribavirina (Tabela 12) e dos grupos tratados com prednisona em relao aos dois grupos controle (Tabela 13).

TABELA 12 Avaliao do tratamento experimental atravs da sobrevida dos ces com cinomose includos nos grupos 1, 2 e 3. Botucatu, SP, 2011. bito Sobrevida Melhora

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Grupo G1 G2 G3 Total

n 3,0 2,0 3,0 8

% 30,0 20,0 30,0 26,7

n 1,0 4,0 4,0 9,0

% 10,0 40,0 40,0 30,0

n 6,0 4,0 3,0 13,0

% 60,0 40,0 30,0 43,3

Estatstica: Teste G de Willians; p=0,4919 G1: grupo 1; G2: grupo 2; G3: grupo 3; G4: grupo 4; G5: grupo 5; G6: grupo 6 n: nmero de animais %: porcentagem

TABELA 13 - Avaliao do tratamento experimental atravs da sobrevida dos ces com cinomose includos nos grupos 3, 4, 5 e 6. Botucatu, SP, 2011. bito Grupo G3 G4 G5 G6 Total n 3,0 7,0 3,0 4,0 17,0 % 30,0 70,0 30,0 40,0 42,5 Sobrevida n 4,0 2,0 2,0 2,0 10,0 % 40,0 20,0 20,0 20,0 25,0 n 3,0 1,0 5,0 4,0 13,0 Melhora % 30,0 10,0 50,0 40,0 32,5

Estatstica: Teste G de Willians; p=0,4224 G1: grupo 1; G2: grupo 2; G3: grupo 3; G4: grupo 4; G5: grupo 5; G6: grupo 6 n: nmero de animais %: porcentagem

No foi possvel encontrar resultado estatisticamente significativo entre os dados trabalhados, porm foi possvel observar que quando foi utilizado os dois grupos controle na tabela verificou-se que a porcentagem de bitos aumenta e diminui o ndice de melhora clnica, indicando, desta forma, o efeito principalmente do medicamento antiviral na sobrevida dos animais naturalmente infectados. importante ressaltar que os animais tratados com prednisona tiveram um resultado pior do que aqueles tratados apenas com ribavirina e DMSO. Mesmo aqueles que foram tratados com a associao da prednisona com a ribavirina apresentaram maior letalidade que os animais dos grupos 1 e 2. Alm disso, alguns dados epidemiolgicos foram tratados em relao a sobrevida dos animais, permitindo verificar se houve interferncia destes na avaliao do tratamento experimental. Os dados de sobrevida dos animais foram analisados frente ao histrico de vacinao independente e em relao ao grupo tratado, e frente idade do animal, independente e em relao ao grupo tratado.

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Similarmente, os dados foram avaliados como bito, melhora clnica e sobrevida ao tempo de tratamento independente da progresso da doena. Na tabela 14 foram avaliados os dados da sobrevida frente ao histrico de vacinao, que foi tratado como: sem vacinao, vacinao incompleta, vacinao sem orientao do mdico veterinrio e sem histrico de vacinao. TABELA 14 Avaliao da sobrevida dos ces com cinomose frente ao histrico de vacinao independente do grupo experimental. Botucatu, SP, 2011. Histrico de vacinao n SV VI VSO SHV Total 10,0 1,0 8,0 3,0 22,0 bito % 30,3 16,7 44,4 100 36,7 Sobrevida n 10,0 3,0 2,0 0,0 15,0 % 30,3 50,0 11,1 0,0 25,0 Melhora n 13,0 2,0 8,0 0,0 23,0 % 39,4 33,3 44,4 0,0 38,3

Estatstica: Teste G de Willians, p=0,1375 n: nmero de animais %: porcentagem SV: sem vacinao; VI: vacinao incompleta; VSO: vacinao sem orientao do mdico veterinrio; SHV: sem histrico de vacinao.

Os animais que apresentaram melhor resposta clnicamente foram os dos grupos de no vacinados e que receberam vacinao sem orientao do mdico veterinrio. A comparao dos dois grupos demonstra que a vacinao sem acompanhamento no foi capaz de aumentar os ndices de melhora clnica em animais naturalmente infectados pelo vrus da cinomose. Para confirmar a falta de efetividade da vacinao realizada sem orientao veterinria, os animais apresentaram o mesmo percentual de letalidade e melhora clnica, demonstrando que no fez diferena se o animal foi vacinado ou no. Sendo confirmado ainda pelos dados de animais no vacinados que apresentaram ndices semelhantes frente melhora e letalidade. Quando se compara estes dados frente aos grupos experimentais, verificou-se que no G1 60% dos animais apresentaram melhora clnica, 30% sobreviveram e 10% morreram. Dos animais que apresentaram melhora clnica, 50% no eram vacinados ou apresentavam vacinao sem orientao do mdico veterinrio (Tabela 15). No G1, dos animais no vacinados, 60% apresentaram melhora clnica e 20% sobreviveram ou morreram. E os animais vacinados sem orientao veterinria, apresentaram 75% de melhora clnica e 25% morreram; nenhum animal deste grupo sobreviveu (Tabela 15).

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Os animais do G2 apresentaram 40% de melhora clnica, 20% morreu e 40% sobreviveu. Dos animais que apresentaram melhora clnica, 50% no eram vacinados e 25% tinham vacinao incompleta ou receberam vacina sem orientao veterinria. Da mesma forma que a melhora clnica, a maior parte deste grupo composta por animais que no foram vacinados (75%) e 25% destes receberam vacinao sem orientao veterinria. Neste grupo no foram includos animais sem histrico de vacinao (Tabela 15). No grupo dos animais tratados com ribavirina e DMSO (G2), dos animais que no receberam vacinao, 50% sobreviveram, 33,3% apresentaram melhora clnica e 16,7% morreram. Dos animais vacinados sem orientao veterinria 50% melhoraram ou sobreviveram, portanto no houve bitos; e dos animais que receberam vacinao incompleta 50% morreram ou melhoraram (Tabela 15). No G3, grupo controle, composto por animais que receberam apenas DMSO, 40% sobreviveram e 30% melhoraram ou morreram. Dos 30% dos animais que melhoraram 66,7% no foram vacinados e 33,3% tinham vacinao incompleta. Dos animais que sobreviveram, 75% no foram vacinados e 25% tinham vacinao sem orientao veterinria. Dos ces que faleceram 66,7% receberam vacinao sem orientao e 33,3% no eram vacinados (Tabela 15). Assim como nos grupos descritos anteriormente, no G3 h maior quantidade de animais que no foram vacinados, como animais que receberam vacinao sem orientao. Dos animais que no foram vacinados 33,3% melhoraram, 50% sobreviveram e 16,7% morreram. Dos animais que receberam vacinao sem orientao 66,7% morreram, 33,3% sobreviveram e nenhum animal apresentou melhora clnica (Tabela 15). No G4 70% dos animais morreram, 20% sobreviveram e 10% apresentaram melhora clnica. Dos animais que morreram, 57,1% no receberam vacinao, 28,6% no apresentavam histrico de vacinao e 14,3% tinham sido vacinados sem orientao do mdico veterinrio. Neste grupo, dos animais que sobreviveram 50% apresentavam vacinao incompleta ou no foram vacinados. O nico animal que apresentou melhora clnica do G4 no recebeu vacinao (Tabela 15). Com relao aos animais do G5, verificou-se que 50% apresentaram melhora clnica, 30% morreram e 20% sobreviveram. Os animais que melhoraram tinham o seguinte histrico de vacinao: 80% no foram vacinados e 20% tinham vacinao sem orientao. Neste grupo, os trs animais que morreram apresentaram histrico de vacinao sem orientao do mdico veterinrio. E dos animais que sobreviveram 50% eram no vacinados ou tinham vacinao incompleta (Tabela 15). No G5, apenas um animal que recebeu vacinao incompleta sobreviveu aps 15 dias de tratamento. Quatro animais no foram vacinados e 80% deles apresentaram melhora clnica, os outros 20% foram animais que sobreviveram ao perodo de tratamento. No ocorreu bito de animais no vacinados neste grupo. No caso dos animais vacinados sem orientao no houve casos de animais que sobreviveram, 75% morreram e 25% apresentaram melhora clnica (Tabela 15). No grupo dos animais tratados com todos os frmacos (G6), 40% apresentou melhora clnica e morreu, e 20% sobreviveu ao perodo de tratamento. Dos animais que melhoraram, 75% receberam a vacinao sem

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orientao e 25% no foram vacinados. Dos animais que morreram, 75% no foram vacinados e 25% receberam a vacinao sem orientao do mdico veterinrio. 50% dos animais que sobreviveram, ou no receberam vacinao, ou tinham vacinao incompleta (Tabela 15). No G6 apenas um animal recebeu vacinao incompleta. Dos animais no vacinados 60% morreram e 20% ou melhoraram ou sobreviveram. Os animais que receberam vacinao sem orientao tiveram 75% de melhora clnica e 25% de bitos (Tabela 15). Os resultados apresentados na tabela 15 no foram significativos estatisticamente, desta forma, no houve diferena do histrico vacinal frente evoluo clnica da doena, e no houve interferncia no tratamento experimental.

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TABELA 15 - Avaliao da sobrevida dos ces com cinomose em cada grupo experimental frente ao histrico de vacinao. Botucatu, SP, 2011.
Estatstica: Teste G de Willians. Row %: valor percentual na linha. Histrico Vacinao

G1
1 20,0 33,3 0 0,0 0,0 1 50,0 33,3 1 100,0 33,3 3 30,0 100,0

G2 M
3 60,0 50,0 0 0,0 0,0 3 75,0 50,0 0 0,0 0,0 6 60,0 100,0

G3 M
2 33,3 50,0 1 50,0 25,0 1 50,0 25,0 0 0,0 0,0 4 40,0 100,0

G4 M
2 33,3 66,7 1 100,0 33,3 0 0,0 0,0 0 0,0 0,0 3 30,0 100,0

G5 M
1 16,7 100,0 0 0,0 0,0 0 0,0 0,0 0 0,0 0,0 1 10,0 100,0

G6 M
4 80,0 80,0 0 0,0 0,0 1 25,0 20,0 0 0,0 0,0 5 50,0 100,0

S
1 20,0 100,0 0 0,0 0,0 0 0,0 0,0 0 0,0 0,0 1 10,0 100,0

1 16,7 50,0 1 50,0 50,0 0 0,0 0,0 0 0,0 0,0 2 20,0 100,0

S
3 50,0 75,0 0 0,0 0,0 1 50,0 25,0 0 0,0 0,0 4 40,0 100,0

1 16,7 33,3 0 0,0 0,0 2 66,7 66,7 0 0,0 0,0 3 30,0 100,0

S
3 50,0 75,0 0 0,0 0,0 1 33,3 25,0 0 0,0 0,0 4 40,0 100,0

4 66,7 57,1 0 0,0 0,0 1 100,0 14,3 2 100,0 28,6 7 70,0 100,0

S
1 16,7 50,0 1 100,0 50,0 0 0,0 0,0 0 0,0 0,0 2 20,0 100,0

0 0,0 0,0 0 0,0 0,0 3 75,0 100,0 0 0,0 0,0 3 30,0 100,0

S
1 20,0 50,0 1 100,0 50,0 0 0,0 0,0 0 0,0 0,0 2 20,0 100,0

3 60,0 75,0 0 0,0 0,0 1 25,0 25,0 0 0,0 0,0 4 40,0 100,0

S
1 20,0 50,0 1 100,0 50,0 0 0,0 0,0 0 0,0 0,0 2 20,0 100,0

M
1 20,0 25,0 0 0,0 0,0 3 75,0 75,0 0 0,0 0,0 4 40,0 100,0

SV Row % Col % VI Row % Col % VSO Row% Col% SHV Row % Col % Total Row % Col %

Col %: Valor percentual na coluna. SV: sem vacinao; VI: vacinao incompleta; VSO: vacinao sem orientao do mdico veterinrio; SHV: sem histrico de vacinao. : bito; S: sobrevida; M: melhora clnica. G1: grupo 1; G2: grupo 2; G3: grupo 3; G4: grupo 4; G5: grupo 5; G6: grupo 6.

99

Os dados de sobrevida tambm foram avaliados com relao idade do animal, j que a idade est relacionada diretamente com o estado de maturidade do sistema imune, que pode favorecer a melhora clnica na cinomose. TABELA 16 - Mdia, desvio padro e mediana da idade dos ces com cinomose em relao sobrevida, independente do grupo experimental. Botucatu, SP, 2011. Evoluo clnica bito Sobrevida Melhora
P25: percentil 25 P75: percentil 75

Mdia

Desvio Mnimo padro 21,2 21,2 34,3 4,0 5,0 3,0

P25

Mediana

P75

Mximo

24,2 35,0 31,5

6,0 12,0 8,0

15,0 36,0 24,0

36,0 60,0 48,0

72,0 60,0 156,0

A anlise destes resultados mostrou que os animais que morreram eram mais novos que aqueles que sobreviveram ou que apresentaram melhora clnica. Esses resultados no foram avaliados em relao ao grupo de tratamento, portanto, influenciam, de certa forma, na evoluo clnica da enfermidade (Tabela 17). Os resultados no apresentaram diferenas estatsticas, quando foi comparada a idade dos animais frente sobrevida nos diferentes grupos. Quando esses dados foram trabalhados em grupos separados verificou-se que os animais dos grupos controle que morreram so animais mais velhos, enquanto que nos grupos tratados com a ribavirina e suas associaes, os animais que morreram so mais jovens (Tabela 17). Dos animais tratados com ribavirina que morreram, exceto o G5, a mediana da idade ficou em 12 meses ou menos, mostrando que animais mais jovens podem ter menos chances de sobreviver mesmo usando o antiviral. Os dados encontrados no grupo controle indicam que animais sem o tratamento experimental tendem a morrer com idades superiores a 24 meses, ou seja, animais com sistema imune maduro (Tabela 17).

100

TABELA 17 Mdia, desvio padro e mediana da idade dos ces com cinomose nos grupos experimentais frente evoluo clnica. Botucatu, SP, 2011.
Grupo Evoluo clnica bito G1 Sobrevida Melhora bito G2 Sobrevida Melhora bito G3 Sobrevida Melhora bito G4 Sobrevida Melhora bito G5 Sobrevida Melhora bito G6 Sobrevida Melhora Mdia 18,7 24,0 36,0 26,0 35,5 69,0 38,0 54,0 8,0 34,7 30,0 7,0 14,0 33,0 18,4 6,3 8,5 27,3 Desvio padro 15,1 0,0 15,2 31,1 22,6 63,0 28,4 6,9 3,6 23,1 8,5 0,0 9,2 38,2 23,5 1,3 4,9 24,0 Mnimo 8,0 24,0 24,0 4,0 10,0 12,0 6,0 48,0 5,0 9,0 24,0 7,0 6,0 6,0 3,0 5,0 5,0 7,0 P25 8,0 24,0 24,0 4,0 17,0 24,0 6,0 48,0 5,0 18,0 24,0 7,0 6,0 6,0 8,0 5,5 5,0 9,5 Mediana 12,0 24,0 30,0 26,0 36,0 54,0 48,0 54,0 7,0 24,0 30,0 7,0 12,0 33,0 9,0 6,0 8,5 21,0 P75 36,0 24,0 48,0 48,0 54,0 114,0 60,0 60,0 12,0 60,0 36,0 7,0 24,0 60,0 12,0 7,0 12,0 45,0 Mximo 36,0 24,0 60,0 48,0 60,0 156,0 60,0 60,0 12,0 72,0 36,0 7,0 24,0 60,0 60,0 8,0 12,0 60,0 0,1170 0,9442 0,2795 0,1000 0,4917 0,2902 Valor de p

Estatstica: Kruskall-Wallis. G1: grupo 1; G2: grupo 2; G3: grupo 3; G4: grupo 4; G5: grupo 5; G6: grupo 6.

101

Estes dados podem indicar o efeito da ribavirina favorecendo a resposta clnica dos animais, j que a diminuio do nmero de partculas virais circulantes permite melhor resposta imune do hospedeiro. Verificou-se ainda que os ces que receberam ribavirina e apresentaram melhora clnica so animais com mais de 24 meses de idade capazes que desenvolver uma resposta frente infeco viral. Neste caso, a idade interferiu na sobrevida dos animais includos no experimento (Tabela 17). Os dados de sobrevida foram trabalhados frente aos sinais clnicos que os animais apresentavam quando chegaram ao Hospital Veterinrio para o atendimento. Com relao aos dados de sinais sistmicos, como leses oculares, alteraes respiratrias e gastroentricas, o animal pode ter apresentado sinais clnicos antes de serem atendidos. Para a incluso dos animais na pesquisa, o tempo de evoluo dos sinais clnicos deveria ser no mximo de 10 dias, no entanto, quanto aos sinais sistmicos poderiam ter um tempo maior de evoluo. TABELA 18 Frequncia de acometimento ocular dos ces com cinomose em relao sobrevida. Botucatu, SP, 2011. Sinais oculares n Com sinais Sem sinais Total 16,0 bito % 72,7 Sobrevida n 9,0 % 60,0 Melhora n 13,0 % 56,5 n 38,0 Total % 63,3

6,0

27,3

6,0

40,0

10,0

43,5

22,0

36,7

22,0

100,0

15,0

100,0

23,0

100,0

60,0 100,0

Estatstica: Qui-quadrado, p=0,5048. n: nmero de animais. %: porcentagem.

Dos 23 animais da pesquisa que apresentaram melhora clnica no final do tratamento, 56,5% apresentavam sinais oculares. No entanto, 72,7% dos animais que morreram tinham sinais oculares. Os animais que no apresentavam sinais oculares tiveram uma frequncia maior na melhora clnica em relao sobrevida e bito (Tabela 19).

102

TABELA 19 Frequncia dos sinais oculares em relao sobrevida dos ces com cinomose em cada grupo experimental. Botucatu, SP, 2011. G1 Sobrevida Sem 0,0 0,0 1,0 100,0 4,0 66,7 5,0 50,0 Com 3,0 100,0 0,0 0,0 2,0 33,3 5,0 50,0 Sem 1,0 50,0 1,0 25,0 3,0 75,0 5,0 50,0 G2 Com 1,0 50,0 3,0 75,0 1,0 25,0 5,0 50,0 Sem 1,0 33,3 1,0 25,0 2,0 66,7 4,0 40,0 G3 Com 2,0 66,7 3,0 75,0 1,0 33,3 6,0 60,0 Sem 2,0 28,6 2,0 100,0 0,0 0,0 4,0 40,0 G4 Com 5,0 71,4 0,0 0,0 1,0 100,0 6,0 60,0 Sem 1,0 33,3 0,0 0,0 0,0 0,0 1,0 10,0 G5 Com 2,0 66,7 2,0 100,0 5,0 100,0 9,0 90,0 Sem 1,0 25,0 1,0 50,0 1,0 25,0 3,0 30,0 G6 Com 3,0 75,0 1,0 50,0 3,0 75,0 7,0 70,0

bito % Sobrevida % Melhora % Total %

Estatstica: Qui-quadrado, G1 p=0,097; G2 p=0,3679; G3 p=0,5170; G4 p=0,1322; G5 p=0,2735; G6 p=0,7881. G1: grupo 1; G2: grupo 2; G3: grupo 3; G4: grupo 4; G5: grupo 5; G6: grupo 6. Sem: sem sinais oculares; Com: com sinais oculares. %: porcentagem.

103

possvel identificar que dos animais que apresentaram melhora clnica nos grupos 1, 2 e 3 h uma maior porcentagem nos que no apresentavam sinais oculares, entretanto nos grupos 4, 5 e 6 a maior porcentagem de animais que tinham sinais oculares. Dos animais que morreram, a porcentagem com sinais oculares superior a 50%, em todos os grupos. A frequncia de sinais gastroentricos tambm foi comparada com a sobrevida dos animais, independente do grupo de tratamento, nos diferentes grupos experimentais, de acordo com a tabela 20. TABELA 20 Frequncia dos sinais gastroentricos em relao sobrevida dos ces com cinomose. Botucatu, SP, 2011. Sinais gastroentricos n Com sinais Sem sinais Total 6 16 22 bito % 27,3 72,7 100,0 Sobrevida n 5 10 15 % 33,3 66,7 100,0 Melhora n 12 11 23 % 52,2 47,8 100,0 n 23 37 60 Total % 38,3 61,7 100,0

Estatstica: Qui-quadrado, p=0,2059. n: nmero de animais. %: porcentagem.

Pode-se verificar que independente do tratamento realizado, dos animais que morreram 72,7% no apresentavam sinais gastroentricos e dos animais que melhoraram 52,2% tinham sinais de acometimento do sistema digestrio. Na tabela 21 pode-se verificar os resultados referentes aos sinais gastroentricos e de sobrevida, para os diferentes grupos. Sendo que os grupos 2, 3, 5 e 6 apresentaram ocorrncia acima de 50% de alteraes do sistema digestrio, dentre os animais que melhoraram clinicamente. Os sinais gastroentricos podem ter ocorrido antes ou durante o atendimento no Hospital Veterinrio. No G1 esta frequncia no ocorreu e no G4 apenas um animal apresentou melhora clnica e no teve sinais gastroentricos. Entre os animais que morreram a ausncia de sinais gastroentricos foi superior a 50%.

104

TABELA 21 - Frequncia dos sinais gastroentricos em relao sobrevida dos ces com cinomose nos grupos experimentais. Botucatu, SP, 2011. G1 Sobrevida Sem 3,0 100,0 0,0 0,0 4,0 66,7 7,0 70,0 Com 0,0 0,0 1,0 100,0 2,0 33,3 3,0 30,0 Sem 2,0 100,0 3,0 75,0 1,0 25,0 6,0 60,0 G2 Com 0,0 0,0 1,0 25,0 3,0 75,0 4,0 40,0 Sem 3,0 100,0 3,0 75,0 1,0 33,3 7,0 70,0 G3 Com 0,0 0,0 1,0 25,0 2,0 66,7 3,0 30,0 Sem 4,0 57,1 2,0 100,0 1,0 100,0 7,0 70,0 G4 Com 3,0 42,9 0,0 0,0 0,0 0,0 3,0 30,0 Sem 2,0 66,7 2,0 66,7 2,0 40,0 6,0 60,0 G5 Com 1,0 33,3 0,0 0,0 3,0 60,0 4,0 40,0 Sem 2,0 50,0 0,0 0,0 2,0 50,0 4,0 40,0 G6 Com 2,0 50,0 2,0 50,0 2,0 50,0 6,0 60,0

bito % Sobrevida % Melhora % Total %

Estatstica: Qui-quadrado, G1 p=0,1612; G2 p=0,1534; G3 p=0,1965; G4 p=0,3992; G5 p=0,3293; G6 p=0,4346. G1: grupo 1; G2: grupo 2; G3: grupo 3; G4: grupo 4; G5: grupo 5; G6: grupo 6. Sem: sem sinais gastroentricos; Com: com sinais gastroentricos. %: porcentagem.

105

TABELA 22 - Frequncia dos sinais respiratrios em relao sobrevida dos ces com cinomose. Botucatu, SP, 2011. Sinais respiratrios n Com sinais Sem sinais Total 11 11 22 bito % 50,0 50,0 100,0 Sobrevida n 9 6 15 % 60,0 40,0 100,0 Melhora n 5 18 23 % 21,7 78,3 100,0 n 25 35 60 Total % 41,7 58,3 100,0

Estatstica: teste do qui-quadrado, p=0,0395 n: nmero de animais. %: porcentagem.

Dos animais que apresentaram melhora clnica, 78,3% apresentavam sinais respiratrios, independente do tratamento realizado. Dos 60 animais includos na pesquisa, 41,7% apresentavam sinais respiratrios, antes ou durante o atendimento no Hospital Veterinrio. No entanto, dos animais que morreram, a ocorrncia de sinais respiratrios foi de 50%, mostrando que a presena destes sinais no foi determinante para a sobrevida dos animais, independente do tratamento que tenha recebido (Tabela 23). O grupo 5 foi o que apresentou maior nmero de animais com sinais respiratrios (60%), diferente dos demais. Porm, a presena de sinais respiratrios no influenciou na sobrevida dos animais nos diferentes tipos de tratamento, j que os grupos controle apresentaram resultados similares quanto ao bito e melhora clnica, comparando-se com os grupos submetidos aos diferentes tratamentos (Tabela 23).

106

TABELA 23 - Frequncia dos sinais respiratrios em relao sobrevida dos ces com cinomose nos grupos experimentais. Botucatu, SP, 2011. G1 Sobrevida Sem 2,0 66,7 0,0 0,0 5,0 83,3 7,0 70,0 Com 1,0 33,3 1,0 100,0 1,0 16,7 3,0 30,0 Sem 0,0 0,0 2,0 50,0 4,0 100,0 6,0 60,0 G2 Com 2,0 100,0 2,0 50,0 0,0 0,0 4,0 40,0 Sem 2,0 66,7 2,0 50,0 2,0 66,7 6,0 60,0 G3 Com 1,0 33,3 2,0 50,0 1,0 33,3 4,0 40,0 Sem 4,0 57,1 1,0 50,0 1,0 100,0 6,0 60,0 G4 Com 3,0 42,9 1,0 50,0 0,0 0,0 4,0 40,0 Sem 1,0 33,3 0,0 0,0 3,0 60,0 4,0 40,0 G5 Com 2,0 66,7 2,0 100,0 2,0 40,0 6,0 60,0 Sem 2,0 50,0 1,0 50,0 3,0 75,0 6,0 60,0 G6 Com 2,0 50,0 1,0 50,0 1,0 25,0 4,0 40,0

bito % Sobrevida % Melhora % Total %

Estatstica: Qui-quadrado, G1 p=2397; G2 p=0,0541; G3 p=0,8703; G4 p=0,6792; G5 p=0,3292; G6 p=0,7316. G1: grupo 1; G2: grupo 2; G3: grupo 3; G4: grupo 4; G5: grupo 5; G6: grupo 6. Sem: sem sinais respiratrios; Com: com sinais respiratrios. %: porcentagem.

107

Devido caracterstica multifocal da encefalite na cinomose, os sinais neurolgicos foram trabalhados conforme o local da leso que eles refletem. Desta forma, quanto maior a quantidade de sinais neurolgicos, maior a rea do SNC acometida e mais difusa a distribuio viral. Assim, analisou-se a quantidade de sinais neurolgicos em relao sobrevida dos animais (Tabela 24). TABELA 24 Mdia, desvio padro, mediana e percentis da quantidade de sinais neurolgicos nos ces com cinomose includos na pesquisa em relao sobrevida. Botucatu, SP, 2011. Sobrevida n Mdia Desvio Mnimo padro 5,32 3,60 4,13 2,23 2,03 1,87 1,00 1,00 2,00 P25 Mediana P75 Mximo

bito Sobrevida Melhora

22 15 23

4,00 2,00 3,00

5,00 3,00 3,00

7,00 5,00 5,00

10,00 7,00 10,00

Estatstica: Kruskall-Wallis, p=0,3530 n: nmero de animais. P25: percentil 25. P75: percentil 75.

Pode-se verificar que os animais que morreram tinham mais sinais que os animais que os sobreviventes ou que apresentaram melhora clnica. importante ressaltar que o mnimo da soma dos sinais neurolgicos nos animais que morreram e que sobreviveram foi de apenas um sinal, enquanto que os animais que melhoraram apresentaram no mnimo dois sinais neurolgicos. O mesmo ocorre com o mximo da soma dos sinais, onde os animais que melhoraram e que morreram apresentaram o mximo de 10 sinais neurolgicos. Desta forma, verificou-se que a quantidade de sinais neurolgicos no interferiu de forma determinante no desfecho da doena, independente do tratamento realizado.

108

TABELA 25 Mdia, desvio padro, mediana e percentis da soma dos sinais neurolgicos nos ces com cinomose em cada grupo experimental em relao evoluo clnica. Botucatu, SP, 2011.
Grupo Evoluo clnica bito G1 Sobrevida Melhora bito G2 Sobrevida Melhora bito G3 Sobrevida Melhora bito G4 Sobrevida Melhora bito G5 Sobrevida Melhora bito G6 Sobrevida Melhora n 3 1 6 2 4 4 3 4 3 7 2 1 3 2 5 4 2 4 Mdia 5,33 5,00 3,83 5,50 5,00 4,50 6,67 3,75 7,67 5,43 4,00 3,00 5,67 1,50 3,20 3,75 1,50 3,00 Desvio padro 2,52 0,00 1,17 3,54 2,45 1,29 0,58 1,71 2,52 7,62 2,00 0,00 1,15 0,71 0,45 2,22 0,71 0,82 Mnimo 3,00 5,00 3,00 3,00 2,00 3,00 6,00 2,00 5,00 1,00 3,00 3,00 5,00 1,00 3,00 1,00 1,00 2,00 P25 3,00 5,00 3,00 3,00 3,00 3,50 6,00 2,50 5,00 4,00 3,00 3,00 5,00 1,00 3,00 2,00 1,00 2,50 Mediana 5,00 5,00 3,50 5,50 5,50 4,50 7,00 3,50 8,00 5,00 4,00 3,00 5,00 1,50 3,00 4,00 1,50 3,00 P75 8,00 5,00 4,00 8,00 7,00 5,50 7,00 5,00 10,00 7,00 5,00 3,00 7,00 2,00 3,00 5,50 2,00 3,50 Mximo 8,00 5,00 6,00 8,00 7,00 6,00 7,00 6,00 10,00 10,00 5,00 3,00 7,00 2,00 4,00 6,00 2,00 4,00 0,3148 0,0167 0,6120 0,0513 0,8734 0,4563 Valor de p

Estatstica: ANOVA (Anlise de varincia), valores significativos p 0,05. n: nmero de animais; G1: grupo 1; G2: grupo 2; G3: grupo 3; G4: grupo 4; G5: grupo 5; G6: grupo 6.

P25: percentil 25; P75: percentil 75.

109

Apenas dois grupos apresentaram resultados estatisticamente significativos, os G3 e G5. No G3, os animais que apresentaram melhora clnica foram aqueles com maior quantidade de sinais neurolgicos, com mediana de oito sinais por animal, diferente do que ocorreu com os animais dos outros grupos experimentais. Neste grupo os animais foram tratados apenas com DMSO, e so considerados como controle. Os animais do G5 foram tratados com ribavirina e prednisona e tiveram um resultado significativo em relao soma de sinais neurolgicos com a evoluo clnica. Neste grupo, a maioria dos animais que melhoraram apresentava trs sinais neurolgicos quando chegaram para o atendimento hospitalar. Como aconteceu com todos os outros grupos no encontrou-se resultado estatsticamente significativo. Desta forma, os animais que melhoraram apresentavam menos sinais neurolgicos do que os que morreram, mesmo recebendo o antiviral. O tratamento experimental no foi capaz de desenvolver uma evoluo clnica favorvel em animais com muitos sinais neurolgicos, provavelmente pelo quadro de leso cerebral. Tal fato pode ser avaliado na figura 2.

8 7 Nmero de sinais neurolgicos 6 5 4 3 2 1 0 G1 G2 G3 G4 G5 G6 Grupos Experimentais Estatstica: Krsukall-Wallis G1: grupo 1; G2: grupo 2; G3: grupo 3; G4: grupo 4; G5: grupo 5; G6: grupo 6. bito sobrevida melhora clnica

FIGURA 2 Representao grfica dos valores de mediana da soma de sinais neurolgicos dos ces com cinomose em relao evoluo clnica em cada grupo experiemental. Botucatu, SP, 2011.

110

Dos animais pesquisados, 34 apresentavam entre trs e cinco sinais neurolgicos no momento do exame clnico inicial. Houve menor frequncia de animais com 10 ou mais sinais neurolgicos, pois estes geralmente apresentavam um quadro avanado da doena e poderiam no sobreviver para que pudessem receber o frmaco antiviral. Porm, houve semelhana na quantidade de animais quando agrupados pelo nmero de sinais neurolgicos (Tabela 26). Animais com apenas um ou dois sinais tambm no foram selecionados devido a caracterstica multifocal da enfermidade, optando-se para seleo de animais com mais de trs sinais neurolgicos, que caracterizasse melhor o quadro clnico da cinomose.

TABELA 26 Frequncia da soma de sinais neurolgicos em relao evoluo clnica dos ces com cinomose independente do grupo experimental. Botucatu, SP, 2011. Soma dos sinais neurolgicos 1 % 2 % 3 % 4 % 5 % 6 % 7 % 8 % 10 % Total bito Sobrevida Melhora Total

2,0 50,0 0,0 0,0 3,0 18,8 1,0 12,5 6,0 60,0 3,0 50,0 4,0 66,7 2,0 66,7 1,0 50,0 22,0

2,0 50,0 4,0 80,0 2,0 12,5 2,0 25,0 2,0 20,0 1,0 16,7 2,0 33,3 0,0 0,0 0,0 0,0 15,0

0,0 0,0 1,0 20,0 11,0 68,8 5,0 62,5 2,0 20,0 2,0 33,3 0,0 0,0 1,0 33,3 1,0 50,0 23,0

4 5 16 8 10 6 6 3 2

60

111

36,7

25,0

38,3

Estatstica: ANOVA (Anlise de Varincia). %: porcentagem em relao linha.

No entanto, animais com mais de cinco sinais neurolgicos apresentaram maior nmero de bitos em relao aos com um at quatro sinais (Tabela 27). Esta caracterstica esperada na encefalite pela cinomose, pois quanto maior a rea afetada, pior o prognstico da doena.

112

TABELA 27 Frequncia da soma de sinais neurolgicos nos ces com cinomose em relao evoluo clnica nos diferentes grupos experimentais. Botucatu, SP, 2011.
Soma dos sinais 1 % 2 % 3 % 4 % 5 % 6 % 7 % 8 % 10 % Total % G1
0,0 0,0 0,0 0,0 1,0 25,0 0,0 0,0 1,0 50,0 0,0 0,0 0,0 0,0 1,0 100,0 0,0 0,0 3,0 30,0

G2 M
0,0 0,0 0,0 0,0 3,0 75,0 2,0 100,0 0,0 0,0 1,0 100,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 6,0 60,0

G3 M
0,0 0,0 0,0 0,0 1,0 50,0 1,0 50,0 1,0 100,0 1,0 100,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 4,0 40,0

G4 M
0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 1,0 100,0 0,0 0,0 0,0 0,0 1,0 100,0 1,0 100,0 3,0 30,0

G5 M
0,0 0,0 0,0 0,0 1,0 50,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 1,0 10,0

G6 M
0,0 0,0 0,0 0,0 4,0 100,0 1,0 100,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 5,0 50,0

S
0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 1,0 50,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 1,0 10,0

0,0 0,0 0,0 0,0 1,0 50,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 1,0 100,0 0,0 0,0 2,0 20,0

S
0,0 0,0 1,0 100,0 0,0 0,0 1,0 50,0 0,0 0,0 0,0 0,0 2,0 100,0 0,0 0,0 0,0 0,0 4,0 40,0

0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 1,0 50,0 2,0 100,0 0,0 0,0 0,0 0,0 3,0 30,0

S
0,0 0,0 1,0 100,0 1,0 100,0 1,0 100,0 0,0 0,0 1,0 50,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 4,0 40,0

1,0 100,0 0,0 0,0 0,0 0,0 1,0 100,0 2,0 66,7 1,0 100,0 1,0 100,0 0,0 0,0 1,0 100,0 7,0 70,0

S
0,0 0,0 0,0 0,0 1,0 50,0 0,0 0,0 1,0 33,3 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 2,0 20,0

0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 2,0 100,0 0,0 0,0 1,0 100,0 0,0 0,0 0,0 0,0 3,0 30,0

S
1,0 100,0 1,0 100,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 2,0 20,0

1,0 50,0 0,0 0,0 1,0 33,3 0,0 0,0 1,0 100,0 1,0 100,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 4,0 40,0

S
1,0 50,0 1,0 50,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 2,0 20,0

M
0,0 0,0 1,0 50,0 2,0 66,7 1,0 100,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 4,0 40,0

Estatstica: Kruskall-Wallis : bito; S: sobrevida; M: melhora clnica. G1: grupo 1; G2: grupo 2; G3: grupo 3; G4: grupo 4; G5: grupo 5; G6: grupo 6.

113

No G1, 40% dos animais apresentavam trs sinais neurolgicos, e apenas um morreu. Os dois animais que apresentavam quatro sinais neurolgicos melhoraram, enquanto que os dois com cinco sinais neurolgicos no mostraram melhora clnica. Neste grupo se verificou que a mesma caracterstica observada em todos os animais, independente do grupo experimental, demonstrando que o tratamento no G1 no alterou a caracterstica da sobrevida dos animais. O G2 apresentou uma distribuio mais uniforme dos animais em relao soma de sinais neurolgicos e foi possvel verificar que apenas dois animais apresentaram trs, quatro e sete sinais clnicos. Dentre os animais que morreram, um apresentou trs sinais neurolgicos e o outro sete sinais. Neste grupo no foram includos animais com um ou 10 sinais neurolgicos. A resposta ao tratamento antiviral ficou bastante evidente neste grupo pela sobrevida e melhora clnica dos animais, mas no foi possvel afirmar com relao aos sinais neurolgicos. No grupo 3 apenas dois animais apresentaram seis e sete sinais neurolgicos e destes nenhum apresentou melhora clnica e trs morreram. Neste grupo nenhum animal apresentou apenas um sinal neurolgico. Um animal apresentou dois, outro trs, outro quatro, outro cinco, outro oito e outro 10 sinais. Destes seis animais, nenhum morreu e os trs com menos sinais sobreviveram. Estes resultados so diferentes aos obtidos no estudo de todos os animais includos na pesquisa, onde aqueles com mais sinais neurolgicos foram os que apresentaram melhora clnica. O G3, grupo controle para os tratamentos antivirais sem a prednisona, mostrou que em comparao aos grupos tratados com ribavirina houve diferena em relao ao nmero de sinais neurolgicos, o que mostra que quando tratados com ribavirina os animais com menor nmero de sinais neurolgicos apresentam maior chance de resposta na encefalite pela cinomose. Diferentemente no G3, em que houve maior sobrevida em relao melhora clnica, os animais com maior quantidade de sinais neurolgicos tiveram maior chance de sobreviver ao perodo de tratamento em relao aos animais que morreram. No G4 a maioria dos animais apresentava cinco sinais neurolgicos, sendo que dos trs animais, dois morreram. Este foi o pior grupo com relao sobrevida dos animais, demonstrando a maior letalidade (70%). Destes, um animal apresentou 10 sinais neurolgicos e nenhum apresentou dois sinais. Este grupo serviu de grupo controle principalmente para os grupos 5 e 6 pelo uso da prednisona, que mostrou pouca eficcia pois mesmo animais com pouco sinais neurolgicos morreram, diferente do ocorrido com os demais grupos. O G5 mostrou o segundo melhor resultado frente a melhora clnica (50%), sendo que quatro animais apresentavam apenas trs sinais neurolgicos e apenas um apresentou quatro sinais neurolgicos. Assim como nos outros grupos, os bitos ocorreram em animais com mais sinais neurolgicos. Nenhum animal deste grupo apresentou seis, oito e 10 sinais neurolgicos. Diferente do que ocorreu com todos os outros grupos, o G6 apresentou maior nmero de animais com um, dois e trs sinais neurolgicos, totalizando quatro bitos, sendo em dois animais com um e trs sinais apenas. Neste grupo no foram includos animais com sete, oito e 10 sinais neurolgicos. A melhor resposta para melhora clnica aconteceu nos animais com dois, trs e

114

quatro sinais. Apesar de tratado com antiviral este foi o segundo grupo com maior letalidade, com resultado similar aos dos outros grupos. Os sinais neurolgicos foram avaliados separadamente e so apresentados na tabela 28, relacionando-se evoluo clnica, que foi agrupada em sobrevida e melhora clnica, bem como o percentual de bito, para cada sinal. Dos 22 (36,7%) animais morreram, 20 (90,9%) animais apresentaram alteraes de nervos cranianos, que foi o sinal neurolgico relacionado ao maior nmero de bitos. Estes resultados no apresentaram valor significativo na anlise estatstica, porm pode-se verificar que alguns sinais foram importantes para a evoluo clnica (Tabela 28).

TABELA 28 Frequncia dos sinais neurolgicos nos ces com cinomose em relao evoluo clnica, independente dos grupos experimentais. Botucatu, SP, 2011. bito Sinais neurolgicos n Alterao de Nervos Cranianos Alterao de postura e andar Ataxia Mioclonias Dficits de propriocepo Balanar de cabea Desvio de cabea Alterao do nvel de conscincia Choro noturno 20 % 90,9 n 27 % 71,1 Sobrevida e Melhora

16

72,7

25

65,8

7 14 13

31,8 63,6 59,1

6 13 13

15,6 34,2 34,2

5 6 7

22,7 27,3 31,8

12 8 6

31,6 21,1 15,6

13,6

13,2

115

Reflexos Medulares Andar compulsivo Andar em crculos Opisttono Agressividade Presso da cabea contra objetos Total

4 4 2 3 3 2

18,2 18,2 9,1 13,6 13,6 9,1

4 4 3 2 1 0

10,5 10,5 7,9 5,3 2,6 0,0

22

38

Estatstica: Qui-quadrado n: nmero de animais. %: porcentagem em relao ao nmero de bitos.

78,3% dos animais pesquisados apresentavam alterao de nervos cranianos e apenas 42,6% morreram. Quanto alterao de nervos cranianos, pode-se afirmar que a sobrevida e melhora clnica quando associadas foi maior. As alteraes de postura e andar tambm foram percentualmente semelhantes, onde o maior nmero dos animais acometidos com essa alterao neurolgica foi para sobrevida e melhora clnica (61%). Estes sinais no foram decisivos para sobrevida dos animais, de modo que pudesse intervir no tratamento. Entre os animais includos na pesquisa 68,3% apresentaram ataxia, porm 63,4% destes chegaram ao final do tratamento ou melhoraram clinicamente. Este sinal tambm no interferiu no tratamento experimental. A mioclonia foi encontrada em 45% dos animais, sendo que, neste caso, 51,9% deles morreram. No entanto, dos 22 animais que morreram 63,6% apresentavam mioclonias. Este sinal neurolgico se revelou importante na evoluo clnica dos animais tratados, pois independente do tratamento a maior parte dos animais com mioclonias morreram. Dos 43,3% dos animais que apresentavam dficits de propriocepo, 50% morreram, e destes 59,1% apresentavam este dficit. Tal achado pode ter ocorrido porque animais que apresentam dficits de propriocepo geralmente apresentam outros sinais associados pela possvel localizao da leso. Desta forma, este resultado corresponde aos achados quando considerados em relao soma dos sinais neurolgicos. Os outros sinais neurolgicos encontrados apresentaram frequncias inferiores a 30%, causando menor interferncia nos resultados de sobrevida em relao ao tratamento. Assim sendo, os sinais de balanar a cabea (31,6%), desvio de cabea (57,1%), choro noturno (62,5%), reflexos medulares (50%), andar compulsivo (50%) e andar em crculos (60%) apresentaram taxas de sobrevida e melhora maior ou igual s de bito. No entanto, alguns sinais mesmo com baixa frequncia demonstraram certa influncia na sobrevida dos animais, com taxas de bito superiores em relao sobrevida e melhora clnica quando os animais apresentavam estes

116

sinais, como alterao do nvel de conscincia (53,8%), opisttono (60%), agressividade (75%) e presso da cabea contra objetos (100%). 3. Exames complementares: 3.1 Hemograma: Os dados de hemograma foram comparados em todos os momentos nos grupos tratados com ribavirina (1, 2, 5 e 6), e nos dias 1, 7 e 15 de tratamento em todos os grupos, inclusive nos dois grupos controle. Para cada parmetro do hemograma foram calculados: mdia, desvio padro, mediana e percentis em cada momento de colheita. Os resultados da contagem de hemcias demonstraram que os animais do grupo 4 apresentavam valores inferiores aos outros grupos. Os ces do G5 apresentaram mediana prxima do valor de normalidade (5.500.000-8.500.000 hemcias/L). A maior parte dos animais apresentava anemia, no momento do exame inicial, j que todos os grupos tiveram medianas com valores abaixo da normalidade para ces. Todos os grupos apresentaram queda na mediana da contagem de hemcias, evidenciando anemia aps o perodo de tratamento. Os animais dos grupos 3, 5 e 6 apresentaram valores inferiores 3.500.000 clulas/L (Figura 3). Diferente dos outros grupos, dois animais do G5 e um animal do G6 apresentaram valores inferiores a 2.000.000 clulas/L no 15 dia de tratamento, o que pode ser classificado como anemia grave. Apenas um animal do G6 recebeu transfuso sangunea durante o perodo de tratamento, sendo este dado desconsiderado no calculo da mediana para este parmetro (Figura 3).

117

6.500.000 6.000.000 5.500.000 Nmero de hemcias/dL 5.000.000 4.500.000

G1

G2
G3 G4 G5

4.000.000
3.500.000 3.000.000 2.500.000 1 4 7 10 12 15 Dias de Tratamento

G6

Estatstica: Teste de Kruskall-Wallis G1: grupo 1; G2: grupo 2; G3: grupo 3; G4: grupo 4; G5: grupo 5; G6: grupo 6.

FIGURA 3 Representao grfica das medianas da contagem de hemcias dos ces com cinomose em cada momento de colheita de material nos grupos experimentais. Botucatu, SP, 2011. Em relao dosagem de hemoglobina, encontrou-se resultado significativo estatisticamente em dois momentos, no 1 e 15 dias de tratamento. O primeiro dia o momento quando os animais chegam ao Hospital Veterinrio e ainda no receberam nenhum tratamento. Esta diferena dos valores seguiu a mesma relao dos valores da contagem de hemcias. Conforme ocorreu na contagem de hemcias, na dosagem de hemoglobina os animais do G4 foram os que apresentaram menor mediana. No entanto, o nico grupo que apresentou mediana da dosagem de hemoglobina dentro dos valores de referncias para ces foi o G5 (valores de referncia: 12-18 g/dL). No primeiro momento pode-se afirmar somente que a maioria dos animais apresentava contagem de hemcias e dosagem de hemoglobina baixas quando chegaram ao Hospital Veterinrio. Aps o tratamento experimental, o G2 foi o que apresentou mediana para a dosagem de hemoglobina, ao contrrio dos grupos 5 e 6. Pode-se observar que a ribavirina em associao com a prednisona induziram uma queda nos nveis de hemoglobina nos animais destes dois grupos, diferente dos animais do grupo controle e daqueles que no receberam a associao destes dois frmacos. Alm disso, os grupos 2 e 6 que receberam DMSO em associao aos medicamentos experimentais mantiveram a dosagem de hemoglobina mais

118

alta, do que nos grupos 1 e 5, onde foram utilizados os mesmos frmacos sem a associao do DMSO. Os dados da mediana da dosagem de hemoglobina em todos os momentos podem ser observados na figura 4.
15 14 13 12 G1 11 10 9 8 7 6 1 4 7 10 12 15 Dias de Tratamento Estatstica: Teste de Kruskall-Wallis G1: grupo 1; G2: grupo 2; G3: grupo 3; G4: grupo 4; G5: grupo 5; G6: grupo 6. G2 G3 G4 G5 G6

FIGURA 4 Representao grfica das medianas da dosagem de hemoglobina dos ces com cinomose em cada momento de colheita de material nos grupos experimentais. Botucatu, SP, 2011. Atravs do grfico foi possvel verificar que a queda da dosagem de hemoglobina ocorre aproximadamente no 10 dia de tratamento. Pelo traado das curvas possvel verificar tambm que tanto no grupo tratado com o antiviral, como nos grupos controle, ocorre uma queda na dosagem de hemoglobina, demonstrando que no em funo do tratamento antiviral. No entanto, nos animais do G5 a mediana foi mais baixa, em relao aos outros grupos. O volume globular das hemcias tambm foi analisado entre os grupos e estes dados apresentaram diferena estatstica (p=0,0021) somente no primeiro dia de tratamento, da mesma forma que a contagem de hemcias e a dosagem de hemoglobina. Os dados de volume globular so apresentados na Figura 5.

Hemoglobina (g/dL)

119

45

40

Volume Globular (%)

35

G1

G2
G3 30 G4 G5 G6 25

20 1 4 7 10 12 15 Dias de Tratamento Estatstica: Teste de Kruskall-Wallis G1: grupo 1; G2: grupo 2; G3: grupo 3; G4: grupo 4; G5: grupo 5; G6: grupo 6.

FIGURA 5 Representao grfica das medianas do volume globular das hemcias de ces com cinomose em cada momento de colheita de material nos grupos experimentais. Botucatu, SP, 2011. Apesar dos grupos controle apresentarem quase 10 pontos percentuais abaixo dos valores de referncia (37-55%) no 15 dia de tratamento, nos grupos que receberam ribavirina, exceto o G2, os valores de volume globular chegaram a extremos, abaixo de 25%. Assim como os outros resultados apresentados, todos os animais mostraram anemia no ltimo dia de tratamento, sendo que os grupos 1, 5 e 6 apresentaram os piores resultados tanto de volume globular, quanto de contagem de hemcias e dosagem de hemoglobina. Ficou evidenciado que o tratamento com ribavirina, sem o DMSO, pode levar a anemia mais grave que a prpria evoluo da doena. O antiviral quando associado prednisona pode levar a quadros de anemia grave, principalmente quando a prednisona administrada na dose de 4 mg/Kg, a cada 24 horas, como aconteceu no G5. Com relao ao nmero de plaquetas no encontradou-se resultado com significncia estatstica e em nenhum dos grupos foi encontrada uma alterao destes valores que fosse significativa clinicamente. O G6 foi o nico grupo que apresentou mediana relativamente baixa no ltimo dia de tratamento (86.000 plaquetas/L). No entanto, aps o 12 dia de tratamento todos os grupos demonstraram queda no nmero de plaquetas. O valor de normalidade para ces considerado foi de 200.000-400.000 plaquetas/L.

120

Na srie branca, a contagem total de leuccitos no apresentou resultados estatisticamente significativos. Nos dados da contagem de leuccitos foi possvel identificar que a mediana do G3 foi menor em relao aos outros grupos no ltimo dia de tratamento, chegando a 3.663 leuccitos/L, sendo os valores de referncia para ces de 6.000-17.000 leuccitos/L. O G1 tambm apresentou mediana abaixo dos valores de referncia com 4.550 leuccitos/ L, no 15 dia de tratamento. Enquanto que todos os outros grupos apresentaram medianas dentro dos limites de normalidade para ces (Figura 6). Os valores iniciais do leucograma mostraram uma distribuio muito ampla, com as medianas variando bastante entre si, sendo esta uma caracterstica da prpria enfermidade. A Figura 6 evidencia ainda que as medianas dos grupos 4 e 5, que receberam doses imunossupressoras de prednisona, mostraram uma contagem de leuccitos mais alta em relao aos outros grupos, sendo esta uma resposta esperada pelo uso de glicocorticides.
15000

13000

11000 Leuccitos/L G1 9000 G2 G3

G4
7000 G5 G6 5000

3000 1 4 7 10 12 15 Dias de Tratamento Estatstica: Teste de Kruskall-Wallis G1: grupo 1; G2: grupo 2; G3: grupo 3; G4: grupo 4; G5: grupo 5; G6: grupo 6.

FIGURA 6 Representao grfica das medianas da contagem total de leuccitos dos ces com cinomose nos momentos de colheita de material. Botucatu, SP, 2011. Os grupos 1, 2 e 3, que no receberam prednisona, demonstraram uma queda nesta contagem a partir do 12 dia de tratamento, demonstrando assim que esta alterao pode ser uma consequncia natural da doena, j que os animais do G3 no receberam ribavirina. A mediana do G6 demonstrou a mesma caracterstica, evidenciando que a dose de 0,5 mg/Kg, a cada 12 horas, no foi capaz de aumentar a quantidade de leuccitos circulantes tanto quanto a dose imunossupressora.

121

Com relao ao diferencial de clulas brancas, os neutrfilos apresentaram resultado estatisticamente significativo entre os grupos 1 e 6 (p=0,0177) no stimo dia de tratamento. Os valores das medianas do nmero de neutrfilos indicou um aumento considervel nos dias 4 e 7 do tratamento no G6, enquanto que o G1 mostrou o menor nmero destas clulas no dia 7, justificando assim a diferena significativa destes valores. O valor de referncia considerado para ces de 3.000-11.500 clulas/L, portanto nenhum grupo apresentou mediana abaixo ou acima dos valores de referncia, demonstrando a pouca relevncia clnica frente aos achados estatsticos. Desta forma, os tratamentos experimentais no intervieram nos valores de neutrfilos, nos diferentes grupos. A contagem de linfcitos extremamente importante na patogenia da cinomose e o tipo celular que mais sofre interferncia dos frmacos experimentais. Nesta contagem foi encontrada uma diferena estatstica no ltimo dia do tratamento entre os grupos 4 e 6 como pode ser observado na tabela 29. TABELA 29 Valor absoluto de linfcitos do hemograma dos ces com cinomose em mdia, desvio padro, mediana e percentis no dcimo quinto dia nos diferentes grupos. Botucatu, SP, 2011. Grupo G1 G2 G3 G4 G5 G6 Mdia 188 688 952 676 233 159 Desvio padro 166 998 969 349 231 140 Mediana 136ab 324ab 748ab 564a 136ab 120b P25 104 246 292 463 80 74 P75 251 590 1284 777 281 177

Estatstica: valores de mediana seguidos de letras diferentes indicam diferenas significativas entre os grupos pelo teste de Kruskall-Wallis (Valor de P=0,0234). P25: percentil 25 P75: percentil 75 G1: grupo 1; G2: grupo 2; G3: grupo 3; G4: grupo 4; G5: grupo 5; G6: grupo 6.

Verificou-se que o G3 apresentou melhor resposta linfocitria ao final do tratamento. No entanto, foi o nico grupo que no recebeu ribavirina e prednisona. Nos grupos que receberam ribavirina e/ou prednisona os valores de linfcitos foram menores. Os valores de referncia para o nmero absoluto de linfcitos para espcie canina de 1.000-4.800 clulas/L. Os valores das medianas nos grupos 1, 5 e 6 foram as menores encontradas no ltimo dia de tratamento, chegando prximo de 100 clulas/ L, considerada uma linfopenia relativamente acentuada. Os valores das medianas de todos os grupos so apresentados graficamente, conforme o momento da colheita de material, com objetivo de

122

avaliar a quantidade de linfcitos de acordo com os dias de tratamento, nos diferentes grupos experimentais (Figura 7).
800 700 600

500
Linfcitos/L 400 300 200 100 0 1 4 7 10 12 15 Dias de Tratamento Estatstica: Teste de Kruskall-Wallis G1: grupo 1; G2: grupo 2; G3: grupo 3; G4: grupo 4; G5: grupo 5; G6: grupo 6.

G1 G2 G3 G4 G5 G6

FIGURA 7 Representao grfica da mediana dos valores absolutos de linfcitos no hemograma dos ces com cinomose de cada grupo nos momentos de colheita de material. Botucatu, SP, 2011. No 4 dia de tratamento dos animais dos grupos 1, 5 e 6 foi possvel identificar uma queda nos valores de linfcitos, que foi constante nos trs grupos, chegando a valores prximos de 100 clulas/ L no dcimo quinto dia. Novamente foi possvel detectar que todos os grupos que receberam o tratamento antiviral apresentaram uma queda nos valores de linfcitos principalmente no ltimo dia de internamento. Os grupos 3 e 4, que no receberam ribavirina, apresentaram aumento do nmero de linfcitos circulantes aps o stimo dia de tratamento, com a mediana chegando prximo ao valor de referncia no dcimo quinto dia. Os valores de medianas de todos os grupos no atingiram os padres de referncia em nenhum momento do tratamento, caracterizando uma linfopenia persistente. As medianas dos valores absolutos de eosinfilos mostraram um resultado significativo estatsticamente no stimo dia de tratamento entre os grupos 2 e 5, j que a mediana do grupo 5 neste momento foi zero. Os grupos tratados com DMSO (G2 e G3) apresentaram os maiores valores de medianas no stimo dia de tratamento. No entanto, os grupos tratados com prednisona apresentaram valores de mediana igual zero (G4, G5 e G6). Os dados dos valores das medianas dos eosinfilos em todos os grupos foram avaliados em cada momento de colheita de sangue e no houve

123

significncia estatstica. Foi identificado um aumento de eosinfilos nos grupos 2 e 4, onde terminam o tratamento com valores de medianas altas, porm no ultrapassam os valores de referncia para ces (100-1.200 clulas/L) e, desta forma, no caracterizam uma eosinofilia. Os moncitos no apresentaram resultado estatstico significativo. A maior parte das medianas dos grupos experimentais apresentou valor dentro daqueles de normalidade para ces (100-1.300 moncitos/L). S foi encontrada monocitose no quarto dia de tratamento dos ces do G2, sem apresentar relevncia clnica pesquisa. Os dados apresentaram uma semelhana nos diferentes grupos, demonstrando que no houve alterao dos moncitos com a utilizao de ribavirina, prednisona e DMSO nas doses administradas.

3.2 Outras alteraes hematolgicas: Na realizao do hemograma feita uma lmina para a contagem diferencial e observao das clulas. Na cinomose h alteraes celulares comumente encontradas no hemograma, como linfcitos reativos, incluso de Lentz e moncitos ativados. No presente trabalho, esses dados foram estudados em todos os momentos, no entanto, em alguns momentos no foram encontradas as alteraes descritas. Alm disso, os grupos 3 e 4 tiveram menos colheitas de sangue para hemograma que os grupos experimentais, assim em algumas anlises esses grupos no foram includos. Por causa da baixa incidncia desses achados, no encontrou-se resultado significativo estatisticamente em nenhum momento de colheita. Apenas dois animais apresentaram moncitos ativados no primeiro dia, antes do tratamento, com uma frequncia de 3,3% de todos os animais includos na pesquisa. Somente um animal no G1 e no G3, com taxas de 10% em cada grupo respectivamente. No quarto dia de tratamento tambm foram encontrados moncitos ativados, porm neste dia no houve colheita de sangue para os animais dos grupos 3 e 4. Ainda foi possvel encontrar moncitos ativados, com uma taxa de 7,5% entre os 40 animais tratados com ribavirina e suas associaes. Dos animais que apresentaram essa alterao no hemograma, dois foram do grupo 1 e um do G2. No stimo dia de tratamento, os moncitos ativados foram encontrados em um nmero maior de ces. Neste momento, os seis grupos experimentais perfazem apenas 54 animais, sendo que os seis animais que morreram pertenciam aos G3 e G4. O G1 apresentou um nmero maior de animais com moncitos ativados circulantes (50%), seguido dos animais do G3 (25%) e estas clulas no foram encontradas nos animais dos grupos 4 e 6. Os moncitos ativados tambm foram encontrados nos hemogramas colhidos no dcimo dia de tratamento, porm nestes dias no houve colheita de sangue nos G3 e G4. Os resultados demonstram que proporcionalmente o aparecimento desta clula no hemograma aumenta com relao ao tempo de tratamento. No dcimo dia de tratamento, a taxa aumentou para 18,9%, observando-se que no G6 no houve deteco deste tipo de clula e que no G1 a taxa chegou a 42,9%. At o dcimo dia de tratamento trs animais

124

haviam morrido, um em cada grupo, 1, 2 e 5, por isso a soma total de animais foi para 37. No dcimo segundo dia de tratamento, os moncitos ativados caram para 17,6%. Nenhum animal do grupo 6 tinha moncitos ativados, entretanto todos os outros grupos permaneceram com esta clula e neste momento apresentavam uma taxa de 33,3%. No dcimo quinto dia de tratamento, o total de animais sobreviventes foi de 41, sendo que 9,8% apresentavam moncitos ativados no sangue circulante. Os grupos 4 e 6 no apresentaram estas clulas nos hemogramas, assim como ocorreu com o G6 em todos os momentos do tratamento (Figura 8).
5

Nmero de animais

G1 G2 G3

G4 G5 G6

0 1 4 7 10 12 15 Dias de Tratamento G1: grupo 1; G2: grupo 2; G3: grupo 3; G4: grupo 4; G5: grupo 5; G6: grupo 6.

FIGURA 8 Representao grfica do nmero de ces com cinomose que apresentaram moncitos ativados no hemograma nos diferentes momentos de colheita de material. Botucatu, SP, 2011. Foi possvel identificar que o G1 foi o grupo que apresentou o maior nmero de animais com moncitos ativados durante quase todo o perodo de tratamento, exceto no dcimo quinto dia. O grupo 2 chegou a dois animais no ltimo dia, com maior nmero de animais neste momento. Nos grupos 4 e 6 no foram encontrados animais com moncitos ativados no sangue perifrico, em nenhum momento do tratamento. Apesar dos animais apresentarem sinais neurolgicos e com tempo de evoluo de no mximo 10 dias, no se esperava encontrar corpsculos de incluso. No entanto, estes foram observados em dois momentos: no primeiro dia de atendimento, onde dos 60 animais includos apenas um (1,7%) animal

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do G3 apresentou incluses de Lentz no sangue perifrico; no dcimo quinto dia de tratamento tambm foi observado um (2,4%) animal dos 41 que sobreviveram que apresentava a incluso no hemograma, sendo que este animal estava includo no G5. Com relao aos achados hematolgicos, os linfcitos na sua forma reativa apresentam um significado importante na cinomose. Estes dados foram trabalhados da mesma forma que os moncitos ativados. Os dados foram avaliados para cada momento de colheita de sangue para realizao dos hemogramas, nos dias 1, 4, 7, 10, 12 e 15 para os grupos 1, 2, 5 e 6. Nos dias 4, 10 e 12 no foi realizada colheita de sangue para hemograma nos grupos 3 e 4. Portanto, no primeiro dia de atendimento no Hospital Veterinrio, antes do tratamento, os linfcitos reativos foram encontrados em 8,3% dos animais includos na pesquisa. Apenas os G2 e G4 no apresentaram animais com linfcitos reativos no hemograma. O grupo que apresentou maior nmero foi o G6 com dois animais neste momento. No quarto dia de tratamento, apenas um (2,5%) animal do grupo 2 apresentou linfcitos reativos no sangue perifrico, sendo que neste momento a frequncia foi calculada para 40 animais, j que os animais dos grupos 3 e 4 no foram includos. No dcimo dia de tratamento, apenas os grupos 5 e 6 apresentaram animais com linfcitos reativos circulantes, encontrando-se a taxa de 5,4% dos 37 animais que sobreviveram a este perodo de tratamento, nos quatro grupos experimentais. Com 12 dias de tratamento no foram encontrados linfcitos reativos e no dcimo quinto dia de tratamento foram encontrados linfcitos reativos em um (2,4%) animal, dos 41 que sobreviveram ao tratamento experimental, sendo que este pertencia ao grupo 6. 3.3 Dosagens bioqumicas: As dosagens bioqumicas foram realizadas nos animais dos grupos 1, 2, 5 e 6, considerados grupos experimentais, nos dias 1, 5, 10 e 15 de tratamento. Nos animais dos grupos controle no foram realizadas as dosagens bioqumicas, pois os animais receberam medicamentos conhecidos em sua farmacologia em trabalhos anteriores. O presente estudo objetivou identificar efeitos indesejveis causados principalmente pela ribavirina e suas associaes. Estas medidas foram utilizadas para identificar leses hepticas e renais frente administrao do frmaco antiviral. Para todos os grupos foram calculados mdia, desvio padro, mediana e percentis em cada momento de colheita, e foram analisados pelo teste de Kruskall-Wallis. As dosagens de uria e creatinina sricas foram utilizadas para avaliar a funo renal dos ces tratados com ribavirina. As dosagens de uria no mostraram diferena significativa estatisticamente entre os grupos nos diferentes momentos (Figura 9). Os valores de normalidade da dosagem de uria srica em ces so de 17-32 mg/dL e foi possvel identificar que a mediana do G5 no primeiro momento apresentou uma elevao de 44 mg/dL, com percentil 25 de 22

126

mg/dL e percentil de 75 de 48,5 mg/dL, demonstrando uma grande variedade de valores (Figrua 9). No primeiro momento, a dosagem de uria no soro est relacionada diretamente com o estado geral dos animais quando chegaram para o tratamento e no demonstra uma ao dos frmacos experimentais. No entanto, no dcimo dia de tratamento, os grupos 1, 2 e 5 apresentaram uma elevao dos valores das medianas, porm s os grupos 1 e 2 ultrapassaram os valores de referncia com 34 mg/dL e 34,64 mg/dL, respectivamente. Estes valores podem estar relacionados com a desidratao dos animais, j que neste perodo a maior parte dos animais apresentou sinais de irritao gstrica, como diminuio do apetite e vmitos (Figura 9).
47

42

Dosagem de uria (mg/dL)

37 G1 G2 G5 27 G6

32

22

17 1 5 10 15 Dias de Tratamento Estatstica: Teste de Kruskall-Wallis G1: grupo 1; G2: grupo 2; G5: grupo 5; G6: grupo 6.

FIGURA 9 Representao grfica das medianas das dosagens de uria srica dos ces com cinomose nos diferentes grupos experimentais nos momentos de colheita de material. Botucatu, SP, 2011. Ainda avaliando a funo renal, os valores de creatinina apresentaram significncia estatstica nos dia 5, 10 e 15 de tratamento. Porm nenhum dos dados ultrapassou os valores de referncia para ces (0,9-1,7 mg/dL), demonstrando que no houve leso renal. Os dados referentes s dosagens de creatinina no soro mostraram que no houve aumento destes no quinto dia de tratamento, mesmo havendo diferena significativa estatisticamente. Estes so valores abaixo da referncia para ces saudveis e no significam uma alterao na funo renal, como descrito pelos valores de uria no soro sanguneo.

127

Os valores da mediana da dosagem de creatinina apresentaram diferena frente aos grupos 5 e 6, portanto nenhum deles apresentou mediana superior aos valores de referncia que caracterizassem uma leso renal no dcimo dia de tratamento. Estes valores de mediana apresentam pouco valor clnico no presente trabalho, apesar de apresentarem significncia estatstica. Da mesma forma que ocorreram nos outros momentos, as dosagens de creatinina no apresentaram significado clnico relevante no presente estudo, no dcimo quinto dia de tratamento. Contudo, os dados foram esquematizados graficamente para melhor avaliao da funo renal em todo o perodo de tratamento nos diferentes grupos experimentais (Figura 10).
1,1

1 Dosagem de creatinina (mg/dL)

0,9 G1 G2 G5 0,7

0,8

G6

0,6

0,5 1 5 10 15

Dias de Tratamento
Estatstica: Teste de Kruskall-Wallis G1: grupo 1; G2: grupo 2; G5: grupo 5; G6: grupo 6

FIGURA 10 Representao grfica das medianas da dosagem de creatinina dos ces com cinomose nos grupos experimentais e nos momentos de colheita de material. Botucatu, SP, 2011. Alm da funo renal, tambm foi avaliada a funo heptica pelas enzimas alanina-aminotransferase, gama-glutamiltransferase, fosfatase alcalina e albumina. Estas dosagens tambm foram comparadas entre os grupos nos diferentes momentos de colheita de material (1, 5, 10 e 15 dias de tratamento). A dosagem de ALT no mostrou medianas que levassem a um resultado estatstico significativo. Os valores de referncia da dosagem de ALT srico para ces so de 10-120 UI/L. Em nenhum dos grupos foi encontrada mediana fora destes valores. O G5 apresentou uma elevao no ltimo dia, diferente dos outros grupos, porm sem importncia clnica. Assim, possvel afirmar

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que o tratamento experimental no causou danos hepticos detectveis por meio destas dosagens. Para complementar foi realizada a dosagem srica de fosfatase alcalina, que apesar de no ser uma enzima muito especfica, pode complementar os dados quando associada s outras enzimas hepticas. Na comparao entre os grupos foi encontrado um resultado significativo estatisticamente no dcimo quinto dia de tratamento. Esta diferena encontrada foi entre o G5 com G1 e G6. O valor da mediana do grupo 5 se destaca sendo a maior entre os grupos, no entanto, os valores de referncia para esta dosagem so 35-280 UI/L. Neste caso a diferena significativa estatisticamente no apresenta valor clnico. No grupo 5 foi encontrado um animal com aumento das enzimas hepticas, caracterizando um leso heptica no ltimo dia de tratamento, este animal foi capaz de aumentar a mdia do grupo porque apresentou a dosagem de FA no valor de 2694 UI/L. Este mesmo animal apresentou valores de ALT e GGT altas, com 3317 UI/L e 329 UI/L respectivamente, todas no ltimo dia de tratamento. Mesmo com as enzimas hepticas altas, o animal ainda assim apresentava funo heptica por manter normal o valor de albumina srica. A figura 11 presente melhor analisa dos dados das medianas da dosagem de FA entre os grupos nos diferentes momentos. A nica discrepncia de valores ocorre somente no ltimo momento do G5, no entanto a mediana no ultrapassa o valor de referncia desta enzima nos ces.
300

250

Dosagem de FA (UI/L)

200 G1

150

G2
G5

100

G6

50

0 1 5 10 15 Dias de Tratamento Estatstica: Teste de Kruskall-Wallis G1: grupo 1; G2: grupo 2; G5: grupo 5; G6: grupo 6.

FIGURA 11 Representao grfica das medianas da dosagem de fosfatase alcalina (FA) dos ces com cinomose nos grupos e nos diferentes momentos de colheita de material. Botucatu, SP, 2011.

129

Foi dosada tambm a concentrao de GGT no soro dos ces tratados com ribavirina. Estes dados apresentaram resultado significativo antes do tratamento entre os grupos 2 e 6; no entanto, no apresentam importncia para o referido estudo. A dosagem de GGT srica tem como valores de referncia para ces de 06UI/L, e, no entanto, a diferena estatstica encontrada no representa importncia clnica ao estudo, j que o valor da mediana do G2 est aumentado antes dos animais receberem os frmacos experimentais. E ao mesmo tempo, este aumento isolado no representa uma leso heptica grave que impossibilitasse os animais de participarem do estudo (Figura 12).
8

Dosagem de GGT (UI/L)

6 G1 G2 G5 4

G6

2 1 5 10 15

Dias de Tratamento
Estatstica: Teste de Kruskall-Wallis G1: grupo 1; G2: grupo 2; G5: grupo 5; G6: grupo 6.

FIGURA 12 Representao grfica das medianas da dosagem de gamaglutamiltransferase (GGT) dos ces com cinomose nos grupos e nos diferentes momentos de colheita de material. Botucatu, SP, 2011. Apenas os G2 e G5 apresentaram medianas acima do valor de referncia. No grupo 2 as medianas ficaram acima de 6 UI/L em todos os momentos do perodo de tratamento. J no grupo 5 a mediana ficou acima do valor de referncia a partir do 10 dia de tratamento. No entanto, a partir destes dados no foi possvel identificar se houve ou no leso heptica por ao da ribavirina. Os dados relacionados com a dosagem de protenas, mais especificamente de albumina podem indicar a diminuio da funo heptica quando estes valores estiverem abaixo dos valores de normalidade. Nas fraes de protena tambm foi analisada a globulina; esta pode estar relacionada diretamente com a produo de imunoglobulinas na doena viral.

130

Nesta anlise necessrio avaliar todos os componentes juntos para diferenciar a diminuio da albumina por uma alterao heptica ou por uma compensao concentrao de globulinas. Os valores de normalidade da protena srica total so 5,4-7,4 g/dL, e verificou-se que no primeiro momento os G1 e G2 apresentavam valores mais altos de protena srica. Neste momento, no foi possvel avaliar as diferenas entre grupos, pois que ainda no tinham sido administrados os frmacos experimentais (Figura 13).

Dosagem de protena total srica (g/dL)

7 G1 G2 6 G5 G6 5

4 1 5 10 15 Dias de Tratamento Estatstica: Teste de Kruskall-Wallis G1: grupo 1; G2: grupo 2; G5: grupo 5; G6: grupo 6.

FIGURA 13 Representao grfica das medianas da dosagem de protenas totais sricas dos ces com cinomose nos grupos experimentais e nos momentos de colheita de material. Botucatu, SP, 2011. Houve uma queda em todos os grupos experimentais na dosagem de protena srica a partir do 10 dia de tratamento. Para apresentar algum significado clnico, a protena srica deve ser analisada pelas suas fraes: albumina e globulina. Na frao albumina encontrou-se resultado significativo no primeiro momento do estudo, assim como aconteceu com a protena srica. Nenhuma das medianas apresentou valores acima dos padres de normalidade (2,7-4,5 g/dL); desta forma pode-se afirmar que neste momento, nenhum dos grupos apresentou quadro grave de desidratao que revelasse o aumento da albumina srica. Foi possvel verificar que as medianas esto mais prximas dos valores mais baixos de referncia. Apenas o G6 apresentou mediana abaixo de 2,7 g/dL, portanto a maioria dos animais deste grupo no

131

mostrou leso heptica nas outras anlises, indicando que a hipoalbuminemia encontrada pode estar relacionada com a presso onctica do sangue, havendo uma diminuio na produo de albumina para compensar a hiperglobulinemia. Outro fator que pode causar hipoalbuminemia a anorexia ou hiporexia que pode ser um sintoma clnico da cinomose. Para poder afirmar sobre tal achado, a anlise da dosagem de globulinas no soro fundamental. A dosagem de globulinas no apresentou diferena estatstica nos momentos de colheita de material. As medianas da dosagem de albumina e de globulinas foram trabalhadas entre os grupos e em cada momento esta anlise foi representada graficamente (Figuras 14 e 15). A mediana do G6 esteve abaixo do valor de referncia para ces e a hipoalbuminemia terminou no 15 dia de tratamento. No entanto, os grupos 1 e 2 apresentaram hipoalbuminemia no mesmo momento (Figura 14).
3,4

Dosagem de albumina srica (g/dL)

G1 2,7 G2 G5 G6

2 1 5 10 15 Dias de Tratamento Estatstica: Teste de Kruskall-Wallis G1: grupo 1; G2: grupo 2; G5: grupo 5; G6: grupo 6.

FIGURA 14 Representao grfica das medianas da dosagem de albumina srica dos ces com cinomose nos grupos experimentais nos diferentes momentos de colheita de material. Botucatu, SP, 2011. Os valores de referncia para ces na dosagem de globulina srica so de 1,93,4 g/dL, desta forma verificou-se que o G6 foi o nico que apresentou mediana dentro dos valores de normalidade. Os outros grupos experimentais apresentaram valores acima de 3,4 g/dL, demonstrando hiperglobulinemia at o dcimo dia de tratamento (Figura 15). No dcimo quinto dia apenas os grupos 1 e 2 continuaram a apresentar hiperglobulinemia. Os valores das medianas dos grupos 5 e 6 mostraram a

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eficcia da prednisona como antinflamatrio sistmico, j que a presena da hiperglobulinemia em ces com cinomose representa o aumento de imunoglobulinas produzidas frente a presena do vrus (Figura 15).

Dosagem de globulina srica (g/dL)

4,8

G1 G2 G5 3,4 G6

2 1 5 10 15 Dias de Tratamento Estatstica: Teste de Kruskall-Wallis G1: grupo 1; G2: grupo 2; G5: grupo 5; G6: grupo 6.

FIGURA 15 Representao grfica das medianas da dosagem de globulina srica dos ces com cinomose nos grupos experimentais nos diferentes momentos de colheita de material. Botucatu, SP, 2011. A diminuio das globulinas tambm ocorreu nos G1 e G2, porm as suas medianas no atingiram os valores de normalidade, demonstrando que houve resposta frente ao vrus com diminuio do processo inflamatrio (Figura 15). Quando se compara as curvas do grfico de globulina e albumina srica, pode-se afirmar que houve uma compensao das suas dosagens, demonstrando que a diminuio da frao albumina est relacionada com a presso onctica dentro dos vasos sanguneos por causa da hiperglobulinemia produzida a partir da infeco viral.

3.4 Exame de urina tipo I: Os resultados do exame de urina tipo I foram avaliados em cada grupo experimental e cada critrio analisado durante o exame. Inicialmente, o volume

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da amostra foi avaliado para saber se houve padronizao, apesar da dificuldade de conseguir a mesma quantidade de amostra de animais de tamanhos diferentes. Em alguns momentos de colheita houve grande dificuldade de conseguir as amostras por caractersticas prprias de cada animal. As amostras de urina foram colhidas nos momentos 1, 5, 10 e 15 dias de tratamento e analisadas pelo Laboratrio Clnico Veterinrio da FMVZ UNESP/Botucatu, SP. A anlise estatstica utilizada foi o teste de KruskallWallis para cada perfil avaliado no exame de urina tipo I. O volume das amostras apresentaram medianas que variaram em relao aos grupos e os dias de colheita de material entre 5 e 10mL, no havendo relevncia clnica. Com relao ao aspecto das amostras, podiam variar de lmpido, discretamente turvo a turvo. Assim, no primeiro momento, houve predominncia do aspecto discretamente turvo nas amostras de urina dos ces do G5. Em relao aos outros momentos houve predominncia do aspecto discretamente turvo em todos os grupos, possivelmente porque as punes da vescula urinria rotineiramente podem ter levado a quadros de cistite que apresentam aspecto discretamente turvo ou turvo da urina. Os dados de densidade foram avaliados pelas medianas nos diferentes grupos e em cada momento de colheita de material. No primeiro momento no houve resultado significativo estatisticamente e as medianas se apresentavam dentro dos valores de normalidade (1.015-1.045), exceto a mediana da densidade urinria do G5 que ficou em 1.048. Neste primeiro momento o aumento da densidade urinria est relacionado com o grau de desidratao dos animais, encontrado no grupo 5. Todos os outros grupos apresentaram medianas dentro da normalidade. No quinto dia de tratamento, os valores das medianas de cada grupo mantiveram-se dentro dos valores de referncia para ces. Estes dados tambm no apresentaram valores significativos estatisticamente. Este mesmo resultado aconteceu com as densidades urinrias do 10 e 15 dias de tratamento, mostrando que no houve leso renal causada pelos frmacos experimentais. Portanto, no foram organizados em tabelas ou grficos por no apresentarem valor clnico pesquisa. Com relao aos dados de pH urinrio no houve resultado estatstico significativo e, clinicamente, as medianas no variaram dos valores de normalidade para ces, 6,0 a 7,5. Em todos os momentos de colheita e em todos os grupos no houve alteraes, por isso no foram organizados em tabelas e no houve representao grfica. Na primeira colheita de material no foi encontrada alterao na dosagem de protenas. Esta dosagem medida em cruzes e pode variar de zero, traos, uma a quatro cruzes, desta forma, para anlise estatstica foi criado escore e a mediana representa a predominncia. Neste momento a predominncia encontrada foi de traos em todos os grupos, o que clinicamente no tem significado. Pela anlise estatstica, p=0,0364, entre os grupos 1 versus 5 e 6, porm a variao de zero para traos de protenas na urina, o que no tem significado clnico. Nenhum outro momento apresentou resultados significativos estatisticamente. Aps o perodo de 15 dias de tratamento, os grupos 2, 5, e 6 apresentaram valores altos de concentrao de protena na urina de alguns

134

ces, porm no mostra significncia clnica, j que alguns animais que sobreviveram apresentavam condies clnicas gerais ruins e podem influenciar estes resultados por outros fatores, como spse associada a quadros graves de pneumonia e no por leses renais causadas pelos frmacos experimentais. As dosagens de glicose so facilmente alteradas pela alimentao ou administrao de fluidos adicionados de glicose. Esta dosagem apresentou resultado significativo estatisticamente no primeiro dia quando o animal chegou ao Hospital Veterinrio. No primeiro dia, todos os animais foram anestesiados e para tal fez-se necessrio a fluidoterapia para acompanhar o procedimento como acesso venoso, alm disso, adicionava-se glicose para favorecer a diurese e eliminao dos frmacos anestsicos. Essa adio de glicose pode causar maior eliminao da mesma pela urina, interferindo nos resultados do exame de urina tipo I. Estes valores significativos das medianas em escores podem estar relacionados com essa administrao intravenosa de glicose, no apresentando valor significativo clinicamente. Nos momentos 5 e 10 de tratamento no houve resultado significativo estatstica e clinicamente, pois que todas as medianas de dosagem de glicose foram zero. No dcimo quinto dia de tratamento, no houve resultado estatstico significativo, mas os animais do grupo 2 apresentaram uma mediana de duas cruzes para a dosagem de glicose na urina. No ltimo dia de tratamento os animais eram anestesiados novamente para colheita de lquor, portanto novamente houve interferncia da adio de glicose na fluidoterapia. Essa eventual discrepncia pode estar relacionada com a dificuldade de colher o material dos animais nos respectivos grupos experimentais e a anestesia permitia melhor manejo destes. No foi encontrado acetona nas amostras de urina dos animais includos na pesquisa, em nenhum momento de colheita de material. A dosagem de urobilinognio tambm foi normal em todos os animais e em todos os momentos de colheita de material. A presena de bilirrubina tambm foi analisada e nos dois primeiros momentos de colheita de material (1 e 5 dias) no houve resultados significantes, tanto estatisticamente quanto clinicamente. No entanto, no dcimo dia de tratamento dos animais do G1 foi possvel detectar a presena de traos de bilirrubina na urina na maior parte deles, inclusive com resultado significativo estatisticamente (Tabela 30).

TABELA 30 - Mediana e percentis em escores da dosagem de bilirrubina na urina dos ces com cinomose nos diferentes grupos experimentais, no dcimo dia de tratamento. Botucatu, SP, 2011. Grupo G1 Mnimo 0,0 P25 0,0 Mediana 1,0a P75 1,0 Mximo 1,0

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G2 G5 G6

0,0 0,0 0,0

0,0 0,0 0,0

0,0b 0,0b 0,0b

0,0 0,0 0,0

0,0 2,0 0,0

Estatstica: Kruskall-Wallis, valores significativos representados pelas letras diferentes, p=0,0016. P25: percentil 25. P75: percentil 75. 0: negativo; 1,0: traos de bilirrubina; 2,0: + de bilirrubina; 3,0: ++ de bilirrubina; 4,0: +++ de bilirrubina; 5,0: ++++ de bilirrubina. G1: grupo 1; G2: grupo 2; G5: grupo 5; G6: grupo 6.

No dcimo quinto dia de tratamento no foi encontrado resultado significativo estatisticamente, porm todos os grupos apresentaram valores altos do percentil 75, evidenciando que todos os animais que apresentavam valores mais altos tinham uma mdia que variou de 2,0 a 5,0 no escore, representando de uma a quatro cruzes para a presena de bilirrubina na urina, que pode significar um incio de leso heptica (Tabela 31). TABELA 31 - Mediana e percentis em escores da dosagem de bilirrubina na urina dos ces com cinomose nos diferentes grupos experimentais, no dcimo quinto dia de tratamento. Botucatu, SP, 2011. Grupo G1 G2 G5 G6 Mnimo 0,0 0,0 0,0 0,0 P25 0,0 0,0 0,0 0,0 Mediana 0,0 0,0 2,5 0,5 P75 5,0 2,0 5,0 2,0 Mximo 5,0 5,0 5,0 5,0

Estatstica: Kruskall-Wallis, p=0,4952. P25: percentil 25. P75: percentil 75. 0: negativo; 1,0: traos de bilirrubina; 2,0: + de bilirrubina; 3,0: ++ de bilirrubina; 4,0: +++ de bilirrubina; 5,0: ++++ de bilirrubina. G1: grupo 1; G2: grupo 2; G5: grupo 5; G6: grupo 6.

O grupo 5 foi o que apresentou maior dosagem de bilirrubina na urina em relao ao nmero de animais acometidos no grupo. O escore de 2,5 seria entre uma cruz e duas cruzes, o que j pode significar uma leso ou sobrecarga heptica. Esses dados mostram uma semelhana que o aumento de bilirrubina na urina pelo menos em alguns animais de todos os grupos. O nico frmaco em comum a todos os grupos a ribavirina. Estes podem ser indcios que a partir do dcimo quinto dia a ribavirina possa levar a quadros de anemia hemoltica na dose e intervalo entre doses utilizadas na pesquisa. No foi encontrado resultado significativo na quantificao de sangue oculto na urina por uma variao muito grande dos dados, j que este resultado modificado por contaminao durante a puno da vescula urinria. Este dado foi avaliado em cada momento e nos grupos experimentais e no apresentou significncia estatstica. Nenhuma das amostras apresentou

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positividade para a presena de sais biliares na urina nos grupos experimentais e em nenhum dos momentos de colheita de material. Aps a avaliao fsico-qumica da urina, foi realizada a anlise do sedimento e neste pode-se verificar a presena de clulas do trato urinrio, de outras clulas, cristais, cilindros, bactrias e outras estruturas. As clulas renais foram encontradas nas amostras de urina no primeiro dia de atendimento no Hospital Veterinrio, principalmente nos grupos 5 e 6. A quantidade das medianas variou de raras a trs clulas por campo, sendo que este achado no tem grande valor no diagnstico de uma leso renal, portanto pode ser irrelevante clinicamente. A presena de clulas renais no sedimento urinrio nos grupos 5 e 6 continuaram aparecendo na mesma quantidade nos dias 5 e 10 de tratamento, levando a um resultado com diferena significativa na estatstica. Da mesma forma que ocorreu no primeiro momento, no quinto dia do tratamento foi encontrado trs clulas renais por campos no sedimento unrinrio, o que no deve ser considerada uma alterao grave. Como so achados encontrados desde o primeiro dia de colheita de material, no podemos assumir que h leso renal por causa dos frmacos experimentais. No dcimo dia, somente o grupo 5 apresentou predominncia da presena de clulas renais no sedimento urinrio. Porm, novamente a quantidade dessas clulas no nos permite afirmar que houve leso renal. No dcimo quinto dia de tratamento, no houve resultado significativo estatisticamente, alm disso, os valores de mediana para a presena de clulas renais no sedimento urinrio do grupo 5 foram menores do que no dcimo dia. Pode-se afirmar que houve diminuio da quantidade de clulas renais no sedimento urinrio e no houve leso renal pela ao dos frmacos experimentais. A presena de clulas de descamao do sistema urinrio comum no sedimento urinrio, porm em baixas quantidades. As clulas uretrais foram encontradas na variao de raras a trs clulas por campo nos dois primeiros momentos de colheita de urina. No primeiro e no quinto dia de tratamento no houve resultado significativo e no houve presena de grande quantidade destas clulas, portanto sem significado clnico tambm. Mesmo apresentando resultado significativo estatisticamente no dcimo dia de tratamento, a presena de clulas uretrais no sedimento urinrio de raras a trs clulas por campo no representa um processo descamativo inflamatrio ou leso uretral. Portanto, esses dados no apresentam significncia clnica para a pesquisa. At este momento os frmacos experimentais parecem no ter causado leso no sistema urinrio. No dcimo quinto dia de tratamento no houve resultado significativo estatisticamente e as medianas dos grupos no passaram do escore um, que significa presena de raras a trs clulas por campo. Neste momento, os valores mximos permaneceram no escore um, mostrando que no houve leso uretral pelos frmacos experimentais. Para as clulas da pelve no houve resultado significativo em momento algum e sem alteraes clnicas, j que em todos os momentos e em todos os grupos as medianas permaneceram no zero. Houve animais que apresentaram o escore um e dois da presena destas clulas, portanto no foi a maioria, provavelmente por uma condio do indivduo.

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A presena de clulas da pelve no mostrou resultado clnico pertinente a pesquisa realizada, demonstrando como os rins foram preservados mesmo com a administrao da ribavirina durante 15 dias consecutivos. A presena de hemcias no sedimento urinrio est relacionada com processos inflamatrios ou pode ocorrer por contaminao da amostra com sangue perifrico no momento da colheita. Os dados de contagem de hemcias na urina apresentaram resultado significativo estatstico apenas no segundo momento de colheita de material. No primeiro dia que os animais chegaram ao Hospital Veterinrio, as amostras apresentavam uma mediana com escore um, ou seja, a presena de hemcias estava variando de raras a trs clulas por campo, que pode ser considerado normal para ces. No quinto dia, alguns animais chegaram a apresentar mais de 50 clulas por campo no sedimento urinrio, porm as medianas de escore mostram que a predominncia ficou entre zero, raras a trs clulas por campo. Provavelmente, os valores mximos encontrados esto relacionados com erros na puno da vescula urinria e contaminao da amostra com sangue perifrico, j que a maior parte dos animais teve suas colheitas por cistocentese. Nos outros momentos essa incidncia de hemcias foi mantida entre os grupos, mostrando sempre o mximo de escore 5,0, ou seja, mais de 50 clulas por campo. Porm, os resultados mostraram que houve uma reduo gradual, chegando a zero nos grupos 1, 2 e 6 no ltimo dia de tratamento. A contagem de hemcias no sedimento urinrio no foi capaz de indicar alteraes causadas pelo uso dos frmacos experimentais, mas sim as alteraes causadas pela colheita rotineira de urina. Da mesma forma que as hemcias, os leuccitos aparecem na urina nos processos inflamatrios e infecciosos, ou mesmo por contaminao pelo sangue perifrico no momento da colheita de material. A presena de leuccitos no sedimento urinrio mostrou resultado significativo no primeiro dia de colheita de material. importante lembrar que neste momento os animais ainda no estavam em tratamento e a colheita de urina aconteceu antes da administrao dos medicamentos. No primeiro momento, encontrou-se maior nmero de animais com presena de raros a trs leuccitos por campo no sedimento urinrio nos grupos 5 e 6. Pode-se afirmar que os leuccitos presentes, junto com as hemcias encontradas na mesma quantidade, no mesmo momento e nos mesmos grupos, que est relacionado com a contaminao da amostra com sangue perifrico durante a colheita de material. No quinto dia de tratamento no houve resultado significativo estatisticamente e os animais apresentaram medianas com escore de um em todos os grupos, ou seja, raros a trs leuccitos por campo no sedimento urinrio. Estes resultados foram semelhantes apresentao de hemcias no mesmo momento e nos grupos, pode-se assim explicar pela contaminao da amostra com sangue perifrico no momento da colheita. Os dados encontrados no dcimo dia de tratamento apresentaram resultados significativos estatisticamente para os valores da contagem de leuccitos no sedimento urinrio. Neste momento importante lembrar que os grupos 5 e 6 so tratados com a prednisona e mantiveram os valores de leuccitos na urina, diferente do

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que aconteceu com os grupos 1 e 2. Todos os grupos mantiveram esses valores de hemcias, no entanto somente os grupos 5 e 6 apresentaram os valores de leuccitos, que pode estar relacionado com o desenvolvimento de cistite pela contaminao durante a puno, onde os animais que no recebem prednisona conseguem debelar a infeco e os animais que recebem o glicocorticide no. Esses dados devem ser trabalhados posteriormente com os dados da presena de bactrias para melhor afirmar a cistite. No dcimo quinto dia no houve resultado significativo, porm ocorreu uma semelhana na apresentao dos dados com o momento anterior. Nos grupos 5 e 6 a presena de leuccitos foi predominante na quantidade de raros a trs leuccitos por campo no sedimento urinrio, diferente do que ocorreu com as hemcias, sugerindo que houve cistite, mesmo que branda, nestes grupos. Com relao presena de cilindros no sedimento urinrio, no foi encontrado resultado significativo estatisticamente em nenhum grupo e em nenhum dos momentos. As medianas para contagem de cilindros ficaram todas no escore zero de todos os momentos e em todos os grupos. Mesmos os valores mximos de cilindros hialinos no se apresentaram fora da normalidade. Apenas no G2, no dcimo dia foi encontrado o valor de duas cruzes para a presena destes cilindros. Os cilindros granulosos foram encontrados no valor de uma cruz apenas no dcimo dia de tratamento tambm no grupo 2. Nos outros momentos e nos outros grupos os valores mximos no ultrapassaram raros cilindros por campo. Os valores de bactrias encontradas no sedimento urinrio apresentaram resultado significativo no primeiro momento de colheita de material, antes dos animais iniciarem os tratamentos experimentais. Assim como ocorreu com a contagem de hemcias e leuccitos, a presena de raras a trs bactrias por campo nos grupos 5 e 6 levou a resultado significativo estatisticamente (p=0,0000). As bactrias so avaliadas pelo nmero de cruzes e foi encontrado nos grupos 1, 5 e 6 raras bactrias no sedimento urinrio por campo. Nesta quantidade as bactrias podem ser consideradas at por contaminao da amostra durante a colheita, quando esta realizada por sondagem uretral. Nos grupos 5 e 6 foram encontrados valores de hemcias e leuccitos tambm e quando estes esto associados pode-se considerar um processo inflamatrio ou infeccioso da vescula urinria. No entanto, no primeiro momento de colheita de material os animais ainda no estavam em tratamento, ento so achados que condizem com a caracterstica imunossupressora da enfermidade. Em todos os animais foi utilizada a terapia antimicrobiana de amplo espectro que poderia atuar nessas infeces secundrias a partir deste momento. No quinto dia de tratamento no houve resultado estatstico significativo e apenas houve manuteno da presena de bactrias nos grupos 5 e 6. Neste momento houve tambm a presena de raras bactrias no sedimento urinrio do G2. No dcimo dia de tratamento, somente os animais do G1 apresentaram medianas que representam raras bactrias no sedimento urinrio. Os grupos 5 e 6 deixaram de apresentar bactrias no sedimento urinrio, mesmo recebendo a prednisona no tratamento (p=0,0016).

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No dcimo quinto dia de tratamento, as medianas que representam raras bactrias no sedimento voltaram a aparecer nos grupos 5 e 6. O G1 manteve o mesmo valor e o G2 voltou a apresentar valores de bactrias na urina. Neste momento provvel que todos estes achados sejam de contaminao durante a colheita da urina. Em nenhum momento houve medianas com valores extremos de bactrias na urina, portanto pode-se afirmar que a terapia antimicrobiana de amplo espectro utilizada manteve os processos de cistite controlados, com baixos valores de bactrias e baixos valores de hemcias e leuccitos, mesmo nos animais que receberam doses imunossupressoras de prednisona. A presena de cristais de bilirrubina pode indicar uma leso mais grave ou mais crnica do fgado. Porm, no foram encontrados resultados significativos estatstica e clinicamente para a presena de cristais de bilirrubina na urina de nenhum dos grupos experimentais e em nenhum momento. As medianas dessa anlise mantiveram-se em zero em todos os dados. Todos os outros cristais que podem ser formados na urina de ces foram estudados estatisticamente, porm o aparecimento destes foi aleatrio. Os cristais estudados foram urato amorfo, fosfato triplo e oxalato de clcio e no houve resultado significativo em nenhum momento e em nenhum grupo experimental, no havendo significncia clnica para o estudo. 3.5 Exame do lquor: O lquor foi colhido em dois momentos, antes e aps o tratamento. O lquor foi responsvel por demonstrar o processo inflamatrio no SNC dos animais naturalmente infectados com o vrus da cinomose apresentando o quadro de encefalite. Todos os animais foram anestesiados e o lquor foi colhido por gotejamento em trs tubos para evitar a contaminao do sangue perifrico, portanto em alguns momentos para conseguir a amostra foi necessrio utiliz-lo mesmo com contaminao do sangue perifrico. O lquor foi examinado pelos seus aspectos fsico-qumicos e pela celularidade. Dentre as caractersticas fsico-qumicas foram avaliadas cor, aspecto, densidade, pH, protena, glicose, sangue oculto e pelo Teste de Pandy. Com relao cor do lquido cefalorraquidiano, os dados foram trabalhados nos diferentes grupos e nos dois momentos pelo teste do quiquadrado, porm sem resultado estatisticamente significativo. Sendo que no primeiro momento foi encontrada uma frequncia de 96,7% de todos os animais includos na pesquisa com o lquor incolor. Dos 60 animais, apenas um do G1 e um do G5 apresentaram a colorao avermelhada do lquor no primeiro momento de colheita. No segundo momento, aps 15 dias de tratamento, apenas 82,5% (33) dos animais apresentavam o lquor incolor, sendo que 7,5% (3) foram rseos e 5% (2) avermelhados. Foi encontrado apenas um animal com lquor xantocrmico e avermelhado. Provavelmente, por um erro na puno que levou a contaminao do material com sangue perifrico como relatado anteriormente. Quando se comparou entre os grupos pelas medianas criadas a partir de escores da variao da turbidez, no houve resultado significativo

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estatisticamente nos dois momentos de colheita de material, antes e aps o tratamento experimental. No primeiro momento, em todos os grupos a maior parte dos animais apresentou o lquor lmpido, apenas nos grupos 1 e 5 foi encontrado lquor turvo nos animais que foram includos nestes grupos. Na segunda colheita, houve a mesma apresentao do aspecto lmpido do lquor nos diferentes animais, porm neste momento foi encontrado em menor quantidade animais nos grupos 1 e 2 com lquor discretamente turvo e nos grupos 3, 5 e 6 animais com lquor turvo. A densidade do lquor, no primeiro momento, foi analisada pelo teste do Kruskal-Wallis e apresentou resultado significativo com p=0,0079, porque houve pouca variao entre os grupos, sendo que o mnimo encontrado foi de 1.004 que variou at 1.008. Estes valores esto dentro da normalidade para o lquor de ces, no tendo significncia clnica para o atual estudo, apesar do resultado estatstico. No entanto, no segundo momento no houve resultado significativo estatisticamente, porm os valores de densidade variaram mais, chegando a 1.016 em alguns animais do G3. Estes valores podem estar relacionados com a contaminao pelo sangue perifrico, onde tambm foram encontrados a colorao avermelhada e o aspecto turvo. Mas a mediana, ou seja, o valor da maioria dos animais foi de 1.006, o que est dentro dos valores de normalidade. O valor de pH do lquor deve ser de neutro a bsico para ces, sendo que nos animais includos na pesquisa a mdia do pH variou de 8,5 a 8,9 no primeiro momento, e de 8,2 a 8,8 no segundo momento. No houve resultado significativo estatstico ou clnico com relao aos valores de pH entre os grupos e nos dois momentos. A dosagem de protena de extrema importncia para o estudo, j que ela pode indicar o grau de inflamao no SNC. Em ambos os momentos no foi encontrada significncia estatstica pelo teste de Kruskal-Wallis, porm clinicamente importante relacionar os dados, pois todos os grupos apresentaram valores maiores que 25 mg/dL, o que indica um processo inflamatrio enceflico (Tabela 32). TABELA 32 Mediana e percentis da dosagem de protena no lquor dos ces com cinomose nos diferentes grupos experimentais no primeiro momento. Botucatu, SP, 2011. Grupo G1 G2 G3 G4 G5 Mnimo 3,20 9,50 5,10 13,40 14,40 P25 22,10 19,50 11,90 25,00 29,90 Mediana 49,00 37,45 43,30 25,95 31,55 P75 63,00 58,80 65,00 65,00 53,20 Mximo 95,26 94,10 65,00 124,70 65,30

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G6

13,00

24,70

30,95

42,50

62,70

Estatstica: Kruskal-Wallis, p=0,9844. P25: percentil 25. P75: percentil 75. G1: grupo 1; G2: grupo 2; G3: grupo 3; G4: grupo 4; G5: grupo 5; G6: grupo 6.

No primeiro momento, os animais ainda no tinham recebido a medicao experimental, ento pode-se verificar que o G4 foi o que apresentou menor mediana com 25,95 mg/dL de protena no lquor e o G1 foi o que apresentou maior mediana com 49,00 mg/dL. Essa dosagem apresentou grande variao de valores, onde todos os grupos apresentaram valores mnimos dentro da normalidade, com praticamente ausncia de inflamao, enquanto que dentro dos valores mximos foi encontrado 124,70 mg/dL de protenorraquia, considerado um valor elevado indicando um processo de inflamao mais severo. Aps 15 dias de tratamento os valores da dosagem de protenas ainda continuaram com uma variao muito grande. Estes tambm no apresentaram resultados significativos, porm todos os grupos apresentaram medianas acima dos valores normais para ces (Tabela 33). TABELA 33 - Mediana e percentis da dosagem de protena no lquor dos ces com cinomose nos diferentes grupos experimentais aps o tratamento. Botucatu, SP, 2011. Grupo G1 G2 G3 G4 G5 G6 Mnimo 19,38 17,81 11,10 14,70 17,20 22,50 P25 30,00 21,86 17,10 14,70 25,25 25,90 Mediana 44,30 27,60 25,00 31,60 39,30 27,90 P75 45,52 56,14 65,00 65,00 64,30 37,30 Mximo 100,00 82,80 154,10 65,00 100,00 54,00

Estatstica: Kruskal-Wallis, p=0,8745. P25: percentil 25. P75: percentil 75. G1: grupo 1; G2: grupo 2; G3: grupo 3; G4: grupo 4; G5: grupo 5; G6: grupo 6.

Estes dados devem ser analisados conforme o grupo de tratamento, j que neste momento os animais foram tratados com os frmacos experimentais. O G3 foi o que apresentou menor valor de mediana com 25 mg/dL, podendo ser considerado dentro da normalidade, sendo que neste grupo houve grande variao dos valores de protena no lquor, que foram de 11 mg/dL, considerado normal, a 154,1 mg/dL, considerado um processo inflamatrio severo do SNC. Este grupo considerado controle, pois estes animais apenas

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receberam o DMSO e como foi encontrado no primeiro momento grande variao de valores no G3, demonstrando que no houve efeito do tratamento. Os valores mximos encontrados nos diferentes grupos experimentais mostraram que em todos os grupos houve uma diminuio, porm no G3 e G5 houve um aumento, ou seja, mesmo os animais sendo tratados com antinflamatrios, DMSO ou prednisona respectivamente, foram encontrados valores mais altos. Nos grupos 1, 2, 3 e 6 foi observado que as medianas diminuram de um momento para outro, diferente do que aconteceu nos grupos 4 e 5 (Figura 16).

50 Dosagem de protenas (mg/dL) 45 G1 40 35 30 25 G2 G3 G4 G5 G6 G5 G6

20
1 15 G1 G2 G3 G4

Dias de Tratamento

G1: grupo 1; G2: grupo 2; G3: grupo 3; G4: grupo 4; G5: grupo 5; G6: grupo 6. Estatstica: Kruskal-Wallis

FIGURA 16 Representao grfica das medianas da dosagem de protenas no lquor dos ces com cinomose includos na pesquisa, antes e aps o tratamento experimental. Botucatu, SP, 2011. possvel verificar que apenas os grupos 4 e 5 apresentaram elevao da quantidade de protena aps o tratamento, sendo que nestes grupos foi utilizada a prednisona na sua dose imunossupressora. Desta forma, a prednisona no foi capaz de diminuir o processo inflamatrio como desejado, j que houve aumento dos valores de protena no lquor dos animais tratados. O grupo 6 tambm foi tratado com prednisona, porm com doses menores e apresentou diminuio dos valores de protena no lquor. Desta forma, podese afirmar que a prednisona em doses antinflamatrias foi capaz de reduzir a quantidade de protena no lquor, enquanto que quando administrada em doses imunossupressoras houve aumento desses valores.

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Os dados de glicose no lquor foram analisados em escores, sendo observada variao de traos a quatro cruzes que quantificam a sua presena. considerada normal a presena de at duas cruzes no lquor de ces, porm essa dosagem sozinha no representa uma alterao importante, geralmente o aumento ou diminuio de glicose devem estar relacionados com outras alteraes encontradas no exame. A anlise estatstica utilizada para avaliar esses dados foi o teste de Kruskal-Wallis e foi encontrado resultado significativo nos valores de p nos dois momentos, antes do tratamento p=0,0006 e aps p=0,0002. Os dados demonstraram que em ambos os momentos a dosagem de glicose variou de uma cruz a duas cruzes. No G4 ficou evidenciado que no segundo momento houve predominncia do escore 1 que representa uma cruz de glicose, sendo que neste momento sobreviveram apenas trs animais, que determinaram essa dosagem diminuda da glicose. No entanto, nenhum dos animais apresentou outras alteraes no lquor que caracterizassem as alteraes nos nveis de glicose liqurico. As alteraes da glicose no lquor so apenas achados clnicos, sem valor para o estudo realizado. Ao mesmo tempo, a quantificao de sangue oculto na amostra est relacionada diretamente com a contaminao do lquor pelo sangue perifrico. Os dados em escores da dosagem de sangue oculto no deram resultados significativos estatisticamente. E a mediana desse escore ficou entre um e trs, que significa traos a duas cruzes de sangue oculto na amostra nos diferentes grupos experimentais e nos dois momentos de colheita de material. Em todos os grupos e em ambos os momentos foram encontrados quatro cruzes de sangue oculto que o valor mximo dessa dosagem. Para ces consideram-se valores normais at uma cruz de sangue oculto no lquor devido a colheita de material. Na atual pesquisa, alguns animais apresentaram grande quantidade de contaminao do sangue perifrico, dificultando a distino entre sangue oculto presente na amostra ou o sangue perifrico da contaminao. O teste de Pandy utilizado para deteco de imunoglobulinas no lquor, assim como as outras dosagens este descrito por escala de cruzes na variao da turbidez da reao e, da mesma forma que as outras dosagens, foi criado um escore e trabalhado estatisticamente. No primeiro momento no foi encontrado resultado significativo estatisticamente, portanto a mediana permaneceu no zero em todos os grupos, o que demonstra que a maior parte dos animais no apresentou reao no teste de Pandy. Neste primeiro momento, apenas os G1 e G4 apresentaram valores de trs cruzes no teste de Pandy. No segundo momento, apenas o G3 apresentou mediana com uma cruz neste teste, sendo que este grupo apenas recebeu o DMSO como tratamento, sendo considerado grupo controle (Tabela 34). TABELA 34 Mediana e percentis em escore do teste de Pandy no lquor dos ces com cinomose nos diferentes grupos experimentais aps o tratamento. Botucatu, SP, 2011. Grupo G1 Mnimo 0 P25 0 Mediana 0b P75 0 Mximo 1

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G2 G3 G4 G5 G6

0 0 0 0 0

0 0 0 0 0

0b 1a 0b 0b 0b

0 1 1 0 0

1 3 1 0 0

Estatstica: Kruskal-Wallis, valores significativos representados pelas letras diferentes, p=0,0105. P25: percentil 25. P75: percentil 75. 0: negativo; 1: + de turbidez; 2: ++ de turbidez; 3: +++ de turbidez. G1: grupo 1; G2: grupo 2; G3: grupo 3; G4: grupo 4; G5: grupo 5; G6: grupo 6.

Com esses resultados pode-se identificar o efeito dos tratamentos experimentais, j que aps o tratamento apenas os animais dos grupos controle apresentaram mediana e percentil 75 com turbidez. Nos grupos 1 e 2 ainda foi possvel observar animais com no mximo uma cruz de turbidez. Diferente do que aconteceu, os animais dos grupos 5 e 6 tiveram ausncia de turbidez no teste de Pandy, podendo identificar que no houve produo de imunoglobulinas quando os animais foram tratados com a ribavirina em associao com antinflamatrios. Aps as anlises fsico-qumicas, o lquor foi avaliado conforme a sua celularidade, que deve ser um dos critrios mais importantes na avaliao da encefalite causada pelo vrus da cinomose. A contagem de hemcias, assim como a colorao e a dosagem de sangue oculto, est relacionada diretamente com a contaminao da amostra com sangue perifrico. Normalmente no esperado encontrar esse tipo de clula no lquor de animais normais, porm em todos os tipos de inflamao pode-se encontrar uma pequena quantidade de hemcias circulantes. Os dados da contagem de hemcias no mostraram significncia estatstica em nenhum dos momentos de colheita de material. No primeiro momento, o valor da mediana da contagem de hemcias foi mais alto no G1, seguido do G4. No grupo 1 foi encontrada colorao avermelhada do lquor dos animais deste grupo, ento se pode considerar a contaminao no momento da colheita. O G4 apresentou tambm elevao na dosagem de sangue oculto, desta forma tambm se pode relacionar com a contaminao por sangue perifrico durante a colheita de material. Apenas os grupos 3 e 6 no apresentaram valores de percentis 75 altos, mostrando que apresentaram menor alterao da contagem de hemcias no lquor e ao mesmo tempo demonstram que comum ocorrer a contaminao da amostra com sangue perifrico. No primeiro momento no houve tratamento, portanto no apresentou significncia clnica pelos achados entre os grupos. Esses dados demonstraram que a contaminao com sangue perifrico pode ocorrer sem mesmo alterar a colorao das amostras, j que a grande quantidade de hemcias no esperada na encefalite pela cinomose.

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No segundo momento, aps o tratamento experimental, foi possvel identificar um valor alto da mediana do grupo 1. No entanto, todos os grupos apresentaram valores elevados nos dados de contagem mxima encontrada, demonstrando que em todos os grupos houve pelo menos um animal que teve seu lquor contaminado com sangue perifrico durante a colheita. A contagem de clulas nucleadas tambm no apresentou resultado significativo estatisticamente em nenhum dos momentos de colheita. Porm, para a avaliao do grau de inflamao do SNC, a contagem de clulas nucleadas de extrema importncia clnica, assim esses dados foram adicionados em tabelas e representados graficamente (Tabela 35). TABELA 35 Mediana e percentis da contagem de clulas nucleadas do lquor dos ces com cinomose nos diferentes grupos experimentais no primeiro momento de colheita de material. Botucatu, SP, 2011. Grupo G1 G2 G3 G4 G5 G6 Mnimo 2,0 2,0 2,0 3,0 0,0 1,0 P25 22,0 3,0 8,0 9,0 1,0 2,0 Mediana 50,5 37,0 14,0 11,5 10,0 4,5 P75 104,0 79,0 23,0 15,0 21,0 16,0 Mximo 207,0 265,0 183,0 8775,0 30,0 44,0

Estatstica: Kruskal-Wallis, p=0,0666. P25: percentil 25. P75: percentil 75. G1: grupo 1; G2: grupo 2; G3: grupo 3; G4: grupo 4; G5: grupo 5; G6: grupo 6.

Os grupos 5 e 6 apresentaram valores de mediana dentro dos valores de normalidade no incio do tratamento, demonstrando que o processo inflamatrio nesses animais teriam uma caracterstica mais aguda, sem a presena de clulas nucleadas no lquor. O grupo 1 apresentou maior mediana dos valores da contagem de clulas nucleadas, seguido do grupo 2. A maior contagem de clulas nucleadas demonstra um processo mais crnico na patogenia da enfermidade. Apenas um animal do G4 apresentou valor de 8775 clulas/dL, demonstrando um processo inflamatrio acentuado, sendo que este animal morreu durante o perodo de tratamento. No final do tratamento, os dados da contagem de clulas nucleadas no apresentaram resultado significativo estatisticamente, mas estes dados foram tabulados pela relevncia clnica (Tabela 36). TABELA 36 Mediana e percentis da contagem de clulas nucleadas no lquor dos ces com cinomose nos diferentes grupos experimentais aps o tratamento. Botucatu, SP, 2011.

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Grupo G1 G2 G3 G4 G5 G6

Mnimo 5,0 2,0 3,0 2,0 0,0 0,0

P25 5,0 3,0 7,0 2,0 1,0 0,0

Mediana 23,0 11,0 14,0 2,0 2,5 4,0

P75 74,0 31,0 82,0 20,0 98,5 7,0

Mximo 100,0 60,0 275,0 20,0 378,0 10,0

Estatstica: Kruskal-Wallis, p=0,0811. P25: percentil 25. P75: percentil 75. G1: grupo 1; G2: grupo 2; G3: grupo 3; G4: grupo 4; G5: grupo 5; G6: grupo 6.

Aps o perodo de tratamento, o G1 ainda apresentou o maior valor de mediana da contagem de clulas nucleadas, sendo que o G3 manteve o valor da mediana de antes e depois, enquanto que todos os outros grupos apresentaram reduo destes valores. O G3 foi tratado apenas com DMSO e serviu como grupo controle em relao ao processo inflamatrio nos outros grupos, j que no apresentou queda desta contagem, diferente do que foi encontrado nos outros grupos. O G4 apenas tratado com prednisona foi o que apresentou maior queda desses valores de mediana, porm foi o grupo com menor nmero de animais com melhora clnica. O G5 tambm teve esse tipo de apresentao dos seus valores da contagem de clulas e recebeu a mesma dose de prednisona, porm tambm recebeu a ribavirina, e neste grupo ocorreu o segundo ndice de melhora clnica dos seis grupos tratados. Os valores das medianas da contagem de clulas nucleadas do lquor foram representados graficamente para melhor visualizao destes dados (Figura 17).

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Contagem de clulas nucleadas (cls/dL)

50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 1 15 G1 Dias de Tratamento G2 G3 G4 G5 G6 G1

G2
G3 G4 G5 G6

Estatstica: Kruskal-Wallis G1: grupo 1; G2: grupo 2; G3: grupo 3; G4: grupo 4; G5: grupo 5; G6: grupo 6.

FIGURA 17 Representao grfica dos valores de medianas da contagem de clulas nucleadas do lquor dos ces com cinomose, antes e aps o tratamento experimental.Botucatu, SP, 2011. A figura capaz de evidenciar a discrepncia dos valores dessa contagem antes e aps o tratamento, tanto no G1 que no recebeu antinflamatrio, quanto nos grupos 2, 4, 5 e 6 que receberam o DMSO ou a prednisona. No entanto, foi possvel verificar que nos animais do G3 no houve diminuio dos valores antes e aps, demonstrando que o efeito antinflamatrio do DMSO no est relacionado com a diminuio do nmero de clulas. Ento, o G2 teve a sua queda nos valores provavelmente por uma ao direta da ribavirina e no por ao antinflamatria do DMSO. O G6 tambm apresentou uma queda pequena nesses valores, portanto as duas contagens, antes e aps o tratamento, estavam dentro dos valores de normalidade, neste caso a celularidade no serviu como parmetro para afirmar se houve reduo ou no da inflamao por ao dos frmacos. Aps a contagem de clulas nucleadas no lquor foi realizado o diferencial entre as clulas presentes; estes dados foram trabalhados em porcentagem e no seu valor absoluto. Para a atual pesquisa, os linfcitos e as clulas mononucleares so os tipos celulares mais importantes, assim o diferencial de clulas ficou em linfcitos, mononucleares e as outras clulas foram todas agrupadas, dentre estas clulas encontra-se neutrfilos, eosinfilos e clulas do SNC.

148

Os dados da porcentagem e dos valores absolutos de linfcitos no primeiro momento no apresentaram resultado significativo estatisticamente, porm estes dados foram tabulados pela sua importncia para o estudo realizado (Tabela 37). TABELA 37 Mediana e percentis da porcentagem e do valor absoluto de linfcitos na citologia liqurica dos ces com cinomose nos diferentes grupos experimentais antes do tratamento. Botucatu, SP, 2011. Mnimo Grupo n G1 G2 G3 G4 G5 G6 0,0 0,0 0,3 0,9 0,0 0,0 % 0,0 0,0 9,0 8,0 0,0 0,0 n 12,7 1,8 1,8 1,4 1,6 0,7 % 58,0 61,0 16,0 28,0 35,0 32,0 n 31,4 28,5 5,9 8,9 4,2 3,1 % 80,5 86,5 65,0 56,0 67,5 69,0 n 84,2 76,6 19,7 11,8 12,4 5,1 % 88,0 94,0 86,0 79,0 89,0 78,0 n 165,6 254,4 179,3 % 99,0 97,0 98,0 P25 Mediana P75 Mximo

1228,5 100,0 29,1 34,3 97,0 90,0

Estatstica: Kruskal-Wallis, p(n)=0,1398, p(%)=0,5287 P25: percentil 25. P75: percentil 75. n: valor absoluto de linfcitos; %: valor da porcentagem de linfcitos. G1: grupo 1; G2: grupo 2; G3: grupo 3; G4: grupo 4; G5: grupo 5; G6: grupo 6.

possvel notar que apenas o G4 apresentou valor da mediana abaixo de 60% de linfcitos. A presena de mais de 60% de linfcitos no lquor esperada em ces com encefalite pelo vrus da cinomose. Ao mesmo tempo, o G4 foi o grupo que apresentou maior valor relativo e absoluto de linfcitos no lquor. E o G2 foi o grupo que apresentou maior mediana de porcentagem de linfcitos com 86,5% no primeiro momento de colheita de material. TABELA 38 - Mediana e percentis da porcentagem e do valor absoluto de linfcitos na citologia liqurica dos ces com cinomose nos diferentes grupos experimentais aps o tratamento. Botucatu, SP, 2011. Mnimo Grupo n G1 G2 G3 4,2 2,0 1,0 % 49,0 73,0 20,0 n 4,7 2,8 4,2 % 61,0 83,5 36,0 n 22,5 8,6 13,0 % 93,0 95,0 79,0 n 49,0 29,9 55,0 % 98,0 99,0 93,0 n 68,8 43,8 81,2 % 99,0 100,0 99,0 P25 Mediana P75 Mximo

149

G4 G5 G6

0,7 0,0 0,0

25,0 0,0 0,0

0,7 0,0 0,0

25,0 0,0 0,0

1,7 0,6 0,8

36,0 33,5 12,0

5,0 2,0 3,4

88,0 67,3 80,0

5,0 5,5 5,8

88,0 91,0 86,0

Estatstica: Kruskal-Wallis, p(n)=0,0032, p(%)=0,0006 P25: percentil 25. P75: percentil 75. n: valor absoluto de linfcitos; %: valor da porcentagem de linfcitos. G1: grupo 1; G2: grupo 2; G3: grupo 3; G4: grupo 4; G5: grupo 5; G6: grupo 6.

Tanto o valor absoluto quanto o percentual apresentaram significncia estatstica entre o valor mximo e o mnimo das medianas dos grupos experimentais. O G1 apresentou 93% de linfcitos e o G6 apenas 12%. Apesar desta diferena houve uma queda na mediana dos valores absolutos de linfcitos em todos os grupos experimentais, exceto no G3 que no primeiro momento apresentou 5,9 linfcitos no diferencial, enquanto que aps 15 dias tratando com DMSO a mediana foi de 13 linfcitos. Alm da queda da mediana, tambm possvel notar que os valores mximos diminuram em relao ao primeiro momento de colheita de material em todos os grupos experimentais. Nos grupos 1, 2 e 3, que no receberam prednisona houve aumento dos valores mnimos, ou seja, nestes grupos os animais passaram a apresentar maior semelhana de valores, diminuindo a diferena entre o mximo e o mnimo, significando que a presena de linfcitos no lquor ficou mais constante, mesmo que em valores menores. Os dados das medianas de valores absolutos de linfcitos encontrados no lquor foram organizados para melhor visualizao do efeito dos tratamentos frente patogenia da enfermidade (Figura 18).

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32 Valor absoluto de linfcitos 28 24 20 16 12 8 4 0 1 15 G1 Dias de Tratamento G2 G3 G4 G5 G6 G1

G2
G3 G4 G5 G6

Estatstica: Kruskal-Wallis G1: grupo 1; G2: grupo 2; G3: grupo 3; G4: grupo 4; G5: grupo 5; G6: grupo 6.

FIGURA 18 Representao grfica das medianas de valores absolutos de linfcitos no lquor dos ces com cinomsoe, nos diferentes grupos, antes e aps o tratamento experimental. Botucatu, SP, 2011. possvel identificar que os valores das medianas dos grupos 4, 5 e 6 quase chegaram a zero aps o tratamento com prednisona. Em todos os grupos tratados com a ribavirina tambm foi possvel identificar uma queda nesses valores, mas a presena do antinflamatrio fez grande diferena tanto nos valores de celularidade quanto no nmero de linfcitos. As clulas mononucleares que tambm apresentam papel importante na patogenia da enfermidade so os macrfagos e os plasmcitos, avaliados tanto no percentual de clulas encontradas, quanto no valor absoluto, da mesma forma como foi realizado com os linfcitos. Em nenhuma das anlises foram encontrados resultados significativos estatisticamente, porm pela importncia clnica os dados so apresentados na Tabela 39. TABELA 39 - Mediana e percentis da porcentagem e do valor absoluto de clulas mononucleares na citologia liqurica dos ces com cinomose nos diferentes grupos experimentais no primeiro momento de colheita de material. Botucatu, SP, 2011. Mnimo Grupo n % n % n % n % n % P25 Mediana P75 Mximo

151

G1 G2 G3 G4 G5 G6

0,0 0,0 1,0 0,0 0,0 0,0

0,0 0,0 2,0 0,0 0,0 0,0

1,0 0,5 1,7 1,6 0,4 0,56

10,0 3,0 10,0 16,0 3,0 15,0

5,5 1,1 3,2 2,8 0,8 1,2

17,5 6,0 19,0 20,5 13,5 22,0

14,4 7,5 4,2 9,8 2,3 4,0

19,0 15,0 84,0 55,0 36,0 39,0

37,3 11,9 18,2 1667,2 7,6 10,9

34,0 26,0 91,0 82,0 69,0 100,0

Estatstica: Kruskal-Wallis, p(n)=0,1957, p(%)=0,1178 P25: percentil 25. P75: percentil 75. n: valor absoluto de linfcitos; %: valor da porcentagem de linfcitos. G1: grupo 1; G2: grupo 2; G3: grupo 3; G4: grupo 4; G5: grupo 5; G6: grupo 6.

Mesmo no apresentando resultado significativo estatisticamente, em relao a mediana dos valores percentuais, verificou-se que o G6 apresentou maior quantidade dessas clulas (22%), enquanto que o G2 teve a menor taxa com 6% apenas, no primeiro momento, antes do incio dos tratamentos experimentais. Com relao s medianas dos valores absolutos, o G1 foi o que mais apresentou esse tipo de clula no lquor, quando os animais chegaram ao Hospital Veterinrio. Apenas o G4 apresentou mais de mil clulas mononucleares dentro dos valores mximos encontrados no lquor, porm o surgimento desse valor pode estar relacionado com a contaminao da amostra com sangue perifrico (Tabela 40). TABELA 40 - Mediana e percentis da porcentagem e do valor absoluto de clulas mononucleares na citologia liqurica dos ces com cinomose nos diferentes grupos aps o tratamento experimental. Botucatu, SP, 2011. Mnimo Grupo n G1 G2 G3 G4 G5 G6 0,0 0,0 0,8 0,1 0,0 0,0 % 0,0 0,0 1,0 6,0 0,0 0,0 n 0,2 0,1 0,8 0,1 0,2 0,0 % 1,0 0,5 2,0 6,0 7,0 0,0 n 0,7 0,2 2,3 1,2 0,4 0,3 % 6,0 4,0 18,0 45,0 22,0 14,0 n 8,5 1,5 5,5 9,0 24,5 3,6 % 23,0 7,0 37,0 60,0 41,2 36,0 n 36,0 3,6 6,3 9,0 114,6 5,4 % 36,0 10,0 52,0 60,0 78,0 77,0 P25 Mediana P75 Mximo

Estatstica: Kruskal-Wallis, p(n)=0,3908, p(%)=0,1579 P25: percentil 25. P75: percentil 75. n: valor absoluto de linfcitos; %: valor da porcentagem de linfcitos.

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G1: grupo 1; G2: grupo 2; G3: grupo 3; G4: grupo 4; G5: grupo 5; G6: grupo 6.

Com a tabulao dos dados foi possvel identificar que os valores mximos do nmero de clulas mononucleares diminuram em todos os grupos, exceto no G5 que apresentou um aumento. As medianas dos valores absolutos tambm apresentaram diminuio dessas clulas em todos os grupos. Alm das clulas mononucleares e os linfcitos, foram encontradas outras clulas, com menor importncia para o estudo. Estes resultados no mostraram significncia estatstica, e estas clulas no ultrapassaram os 10% da celularidade liqurica. Apenas o G4 apresentou valores altos deste tipo celular que somado aos outros resultados pode-se afirmar que houve contaminao pelo sangue perifrico. Aps o tratamento, o G6 foi o grupo que apresentou a menor mediana, enquanto que os grupos 1 e 5 apresentaram aumento desses valores absolutos e relativos. O G3 e G5 mostraram valores absolutos mximos muito altos, o que pode representar uma contaminao da amostra por sangue perifrico. Os outros grupos tiveram suas medianas com valores mais baixos associados diminuio da celularidade aps o tratamento, como havia sido descrito anteriormente. Esses resultados no demonstraram importncia clnica ao estudo. 4. Biologia Molecular: Para diagnstico e identificao da presena do agente etiolgico aps o tratamento foi realizada a RT-PCR das amostras de sangue perifrico, medula ssea e lquor de todos os animais nos dois momentos. Quando alguma amostra apresentou resultado negativo foi realizado a hn-PCR. No total foram realizadas 308 reaes de RT-PCR, j que nem todos os animais sobreviveram aos 15 dias de tratamento, sendo que 130 (42,2%) foram positivas. Ento, foram realizadas 178 reaes da hn-PCR e 102 (57,3%) foram positivas. Assim, das 308 amostras analisadas, 232 (75,32%) foram positivas. Os dados foram trabalhados segundo o momento de colheita de material e a amostra utilizada para a realizao da pesquisa. Todos os animais foram positivos nos dois momentos da pesquisa em pelo menos uma das trs amostras colhidas. TABELA 41 Relao das amostras positivas e negativas na PCR no diagnstico da cinomose em ces antes do tratamento experimental, independente do grupo. Botucatu, SP, 2011. Positivas Amostra n Sangue Medula ssea Lquor
Estatstica: Qui-quadrado.

Negativas % 95,0 90,0 53,3 n 3,0 6,0 28,0 % 5,0 10,0 46,7

57,0 54,0 32,0

153
n: nmero de amostras. %: porcentagem.

No primeiro momento, o sangue perifrico foi o material que mais resultou positivo com 95%, sendo que apenas trs animais do G4 apresentaram resultado negativo nas duas tcnicas de biologia molecular realizadas. Estes dados apresentaram resultados estatisticamente significativos com p=0,0075. A medula ssea no primeiro momento apresentou 90% de positivos, sendo que nenhum dos animais do G4 apresentou resultado negativo e no G2 houve 20% de negativos. Os outros grupos apresentaram uma taxa de 10% de animais que no apresentavam o vrus na medula ssea. Portanto, esses dados no apresentaram resultado estatisticamente significativo (p=8176). O lquor foi a amostra que menos apresentou positividade (53,3%), porm esta ainda foi maior do que os resultados negativos (46,7%). Dos 28 animais que apresentaram negatividade no lquor, seis eram dos grupos 2 e 4; cinco dos grupos 3 e 6 e trs dos grupos 1 e 5. Estes dados tambm no apresentaram significado estatstico, pois p=5859. Aps o tratamento, as amostras tambm foram avaliadas independentes do grupo experimental (Tabela 42). TABELA 42 - Relao das amostras positivas e negativas de ces na RT-PCR aps o tratamento experimental, independente do grupo. Botucatu, SP, 2011. Positivas Amostra n Sangue Medula ssea Lquor
Estatstica: Qui-quadrado. n: nmero de amostras. %: porcentagem.

Negativas % 97,7 86,4 27,3 n 1,0 6,0 32,0 % 2,3 13,6 72,7

42,0 38,0 12,0

Aps 15 dias de tratamento, houve um aumento na porcentagem de amostras positivas, ou seja, das 43 amostras de sangue colhidas, 42 foram positivas, sendo que o nico animal que apresentou ausncia do vrus no sangue pertence ao G3. Este grupo e G4 so grupos controle e no receberam a ribavirina nos protocolos de tratamento, mesmo assim tiveram o vrus presente no sangue perifrico. Estes resultados no apresentaram significncia estatstica (p=3844). Mesmo aps o tratamento, a medula ssea ainda foi considerada como a segunda amostra com mais resultados positivos. Das 44 amostras, 86,4% foram positivas e 13,6% negativas. Das seis amostras negativas, duas foram de animais tratados nos grupos 5 e 6 e um animal em cada grupo G2 e G3. Esses dados tambm no apresentaram resultado significativo estatisticamente (p=5759). O lquor novamente foi o que apresentou menor nmero de amostras, e aps um perodo de 15 dias de tratamento, houve menor porcentagem de

154

positivos (27,3%). Sendo que 100% dos animais do G3 apresentaram resultado negativo do lquor aps o perodo de tratamento, mostrando que mesmo sem o antiviral o vrus no seria encontrado livre no lquor com maior tempo de evoluo da doena, condizendo com a literatura existente. Para melhor apresentao dos dados, os resultados positivos e negativos no lquor nos diferentes grupos aps o tratamento so apresentados na Tabela 43. TABELA 43 Resultados positivos e negativos da RT-PCR para deteco do vrus da cinomose do lquor dos ces nos diferentes grupos, aps o tratamento experimental. Botucatu, SP, 2011. Positivo Grupos n G1 G2 G3 G4 G5 G6 Total 5,0 2,0 0,0 2,0 1,0 2,0 12,0 % 55,6 25,0 0,0 50,0 12,5 25,0 27,3 n 4,0 6,0 7,0 2,0 7,0 6,0 32,0 % 44,4 75,0 100,0 50,0 87,5 75,0 72,7 n 9,0 8,0 7,0 4,0 8,0 8,0 44,0 % 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 Negativo Total

Estatstica: Qui-quadrado, p=0,1446. n: nmero de amostras. %: porcentagem. G1: grupo 1; G2: grupo 2; G3: grupo 3; G4: grupo 4; G5: grupo 5; G6: grupo 6.

O grupo com maior positividade na RT-PCR no lquor foi o G1, sendo que os outros grupos (2, 3, 5 e 6) apresentaram mais amostras negativas do que positivas, demonstrando que o vrus aps o perodo de 15 dias no estava mais livre no lquor. Como houve diminuio da celularidade pelo controle do processo inflamatrio, principalmente nos grupos 4, 5 e 6, menores seriam as chances de detectar vrus nesta amostra (Figura 19).

155

% de resultados positivos na RT-PCR

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1 15 Dias de Tratamento Sangue Medula ssea Lquor

Sangue Medula ssea Lquor

Estatstica: Qui-quadrado.

FIGURA 19 Representao grfica dos resultados positivos para o vrus da cinomose nas diferentes amostras de ces, antes e aps o tratamento, independente do grupo experimental. Botucatu, SP, 2011. O lquor foi a pior amostra para a realizao da RT-PCR e foi a amostra que apresentou maior queda nos valores percentuais, aps o tratamento experimental. Apesar de ter sido a pior amostra com relao a positividade, no processo de eletroforese, foi a amostra que apresentou menos bandas inespecficas no gel, tanto na RT-PCR quanto na hn-PCR. Na RT-PCR identificou-se bandas com 440 pb e na hn-PCR o produto esperado foi de 331 pb (Figura 20). Quando foi analisado pelo Teste McNemar o efeito do momento em cada amostra nos diferentes grupos no mostrou resultado significativo estatisticamente. Esses dados no foram representados em tabelas por no apresentarem significado clnico ao estudo.

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Sangue e Medula ssea

Lquor

A+: amostra positiva A-: amostra negativa C+: controle positivo C-: controle negativo M: marcador (Loading) pb: pares de bases

FIGURA 20 Eletroforese aps RT-PCR para deteco do vrus da cinomose de amostras de sangue, medula ssea e lquor de ces. Botucatu, SP, 2011. Podem-se identificar as bandas inespecficas encontradas principalmente nas amostras de sangue e medula ssea. Ao mesmo tempo foi possvel identificar a banda do tamanho esperado com 440 pb. Nas amostras que foram negativas na RT-PCR foi realizada a hn-PCR, utilizando um terceiro primer. Neste caso, pode -se esperar a visualizao de duas bandas no gel da eletroforese, onde um resultado da reao anterior com 440 bp, e o produto esperado deve ter 331 pb, no entanto no foram encontradas tantas bandas inespecficas como aconteceu na RT-PCR.

A+: amostra positiva A-: amostra negativa C+: controle positivo

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C-: controle negativo M: marcador (Loading) pb: pares de bases

FIGURA 21 Eletroforese aps hn-PCR para deteco do vrus da cinomose de amostras de sangue e medula ssea de ces. Botucatu, SP, 2011. TABELA 44 Resultados positivos e negativos da hn-PCR para deteco do vrus da cinomose de amostras de ces nos diferentes grupos experimentais independente do momento de colheita do material. Botucatu, SP, 2011. Positivo Grupos n G1 G2 G3 G4 G5 G6 Total 27,0 14,0 13,0 14,0 16,0 18,0 102,0 % 77,1 48,3 46,4 56,0 55,2 56,3 57,3 n 8,0 15,0 15,0 11,0 13,0 14,0 76,0 % 22,9 51,7 53,6 44,0 44,8 43,8 42,7 n 35,0 29,0 28,0 25,0 29,0 32,0 178 % 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 Negativo Total

Estatstica: Qui-quadrado, p=0,1543. n: nmero de amostras. %: porcentagem. G1: grupo 1; G2: grupo 2; G3: grupo 3; G4: grupo 4; G5: grupo 5; G6: grupo 6.

O grupo com maior nmero de hn-PCR foi G1, onde das 35 amostras, 77,1% foram positivas, sendo o grupo que mais apresentou positividade na hnPCR. Este resultado pode estar relacionado com o tempo de armazenamento das amostras, j que foi o primeiro grupo a ser estudado. No entanto, o G6 foi o segundo grupo com mais amostras negativas na RTPCR que foram verificadas pela hn-PCR. Este grupo teve o menor tempo de armazenamento, porm a taxa de positividade foi menor em relao ao G1. Estes resultados no apresentaram significncia estatstica, mas demonstraram a importncia da realizao da hn-PCR para confirmao do resultado. A realizao da hn-PCR tambm foi avaliada frente amostra utilizada para a reao. Estes dados apresentaram significncia estatstica pela necessidade de realizao dessa reao em muitas amostras de lquor em relao ao sangue perifrico e medula ssea (Tabela 45). TABELA 45 Relao dos resultados positivos e negativos da hn-PCR para deteco do vrus da cinomose em relao ao tipo de amostra de ces, independente do grupo experimental. Botucatu, SP, 2011.

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Positivo Amostras n Sangue Medula ssea Lquor Total 43,0 30,0 29,0 102,0 % 91,5 71,4 32,6 57,3

Negativo n 4,0 12,0 60,0 76,0 % 8,5 28,6 67,4 42,7 n 47,0 42,0 89,0 178

Total % 100,0 100,0 100,0 100,0

Estatstica: Qui-quadrado, p=0,0000. n: nmero de amostras. %: porcentagem.

A amostra com maior nmero de hn-PCR foi o lquor e 67,4% foi negativo nesta reao, demonstrando que no a amostra mais indicada para o diagnstico molecular da cinomose. As amostras de sangue e medula ssea apresentaram mais positividade e menor necessidade de realizao da hnPCR. A medula ssea foi a melhor amostra, pois foi a que menos necessitou de hn-PCR e apresentou grande quantidade de resultados positivos na reao. Estes dados apresentaram resultado significativo estatisticamente no s quando trabalhados independente do grupo experimental, mas tambm nos diferentes grupos (Tabela 46). Das 35 amostras do G1 que foram realizadas hn-PCR, 18 eram de lquor, 11 de sangue e seis de medula ssea. O G1 apresentou 27 (77,1%) das amostras positivas na hn-PCR e 22,9% negativas. Das amostras negativas, sete foram de lquor e uma de medula ssea e 100% das amostras de sangue deste grupo foram positivas. Das amostras de medula ssea 83,3% foram positivas (Tabela 46). No G2 foram realizadas 29 reaes de hn-PCR, sendo que 15 (51,7%) foram negativas e 14 (48,3%) positivas. Das amostras negativas 12 foram de lquor e trs de medula ssea. Novamente 100% das amostras de sangue foram positivas. Neste grupo, as amostras de medula ssea apresentaram 57,1% de positividade (Tabela 46). No G3 foram realizadas 28 reaes de hn-PCR, sendo que 16 de lquor, seis de medula e seis de sangue. Dessas 28 amostras, 15 (53,6%) foram negativas e 13 (46,4%) foram positivas. Assim como no G2, das amostras de lquor, 75% foram negativas e das amostras de sangue e medula, 83,3% e 66,7%, respectivamente foram positivas (Tabela 46). Das 25 amostras que foram processadas pela tcnica de hn-PCR no G4, 11 foram de lquor, sete de medula ssea e sete de sangue perifrico. Neste grupo 100% das medulas foram positivas e apenas 27,3% das amostras de lquor. Das amostras negativas, oito foram de lquor e trs de sangue (Tabela 46). No G5 foram realizadas 29 reaes de hn-PCR, sendo que 16 foram de lquor, sete de medula ssea e seis de sangue perifrico. Dessas 29 amostras, 16 (55,2%) foram positivas e 13 (44,8%) foram negativas. Da mesma forma

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que aconteceu na maioria dos grupos, 62,5% das amostras de lquor foram negativas e 57,1% das de medulas e 100% das amostras de sangue tambm foram positivas, respectivamente (Tabela 46).

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TABELA 46 Relao dos resultados da hn-PCR para deteco do vrus da cinomose em cada tipo de amostra de ces nos diferentes grupos experimentais. Botucatu, SP, 2011. Grupo G1 % G2 % G3 % G4 % G5 % G6 % Total % Sangue + 11,0 100,0 8,0 100,0 5,0 83,3 4,0 57,1 6,0 100,0 9,0 100,0 43,0 91,5 0,0 0,0 0,0 0,0 1,0 16,7 3,0 42,9 0,0 0,0 0,0 0,0 4,0 8,5 Medula ssea + 5,0 83,3 4,0 57,1 4,0 66,7 7,0 100,0 4,0 57,1 6,0 66,7 30,0 71,4 1,0 16,7 3,0 42,9 2,0 33,3 0,0 0,0 3,0 42,9 3,0 33,3 12,0 28,6 Lquor + 11,0 61,1 2,0 14,3 4,0 25,0 3,0 27,3 6,0 37,5 3,0 21,4 29,0 32,6 7,0 38,9 12,0 85,7 12,0 75,0 8,0 72,7 10,0 62,5 11,0 78,6 60,0 67,4 0,0000 0,0008 0,0316 0,0101 0,0270 0,0005 0,0495 Valor de p

Estatstica: Qui-quadrado. +: positivo; -: negativo; %: porcentagem; G1: grupo 1; G2: grupo 2; G3: grupo 3; G4: grupo 4; G5: grupo 5; G6: grupo 6.

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Assim como nos outros grupos, o G6 apresentou 32 amostras para a realizao da hn-PCR, sendo 14 de lquor, nove de sangue e nove de medula. Dessas, 18 (56,3%) foram positivas e 14 (43,8%) negativas. Das amostras de lquor 78,6% foram negativas 66,7% das de medula ssea e 100% das de sangue foram positivas, respectivamente. Esses resultados no avaliaram o tratamento experimental, mas foi possvel identificar a melhor amostra a ser utilizada neste tipo de estudo, que seriam as amostras de sangue e medula associadas, sendo realizada a hnPCR nas amostras negativas na RT-PCR. A realizao da hn-PCR foi comparada nos momentos de colheita de material, ou seja, antes e aps o tratamento experimental com relao aos resultados positivos ou negativos (Tabela 47). TABELA 47 Relao dos resultados positivos e negativos da hn-PCR para deteco do vrus da cinomose de amostras de ces, realizadas antes e aps o tratamento experimental independente do grupo. Botucatu, SP, 2011. Positivo Momento n 1 dia 15 dia Total 74,0 28,0 102,0 % 66,7 41,8 57,3 n 37,0 39,0 76,0 % 33,3 58,2 42,7 n 111,0 67,0 178 % 100,0 100,0 100,0 Negativo Total

Estatstica: Qui-quadrado, p=0,0019. n: nmero de amostras. %: porcentagem.

Estes dados apresentaram resultado significativo estatisticamente e foi possvel identificar uma queda no nmero de reaes positivas no segundo momento de colheita de material. Esta queda aconteceu independente do grupo, ou seja, se o animal foi tratado com o antiviral ou no, podendo estar relacionada com a patogenia da cinomose (Tabela 48).

TABELA 48 Resultados da hn-PCR para deteco do vrus da cinomose de amostras de ces, antes e aps o tratamento nos diferentes grupos experimentais. Botucatu, SP, 2011. 1 dia Grupo Positivo G1 % 19,0 82,6 Negativo 4,0 17,4 Positivo 8,0 66,7 Negativo 4,0 33,3 0,2565 15 dia Valor de p

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G2 % G3 % G4 % G5 % G6 % Total %

10,0 55,6 11,0 64,7 9,0 50,0 13,0 76,5 12,0 66,7 74,0 66,7

8,0 44,4 6,0 35,3 9,0 50,0 4,0 23,5 6,0 33,3 37,0 33,3

4,0 36,4 2,0 18,2 5,0 71,4 3,0 25,0 6,0 42,9 28,0 41,8

7,0 63,6 9,0 81,8 2,0 28,6 9,0 75,0 8,0 57,1 39,0 58,2 0,0019 0,3232 0,0179 0,3049 0,0430 0,5348

Estatstica: Qui-quadrado. %: porcentagem. G1: grupo 1; G2: grupo 2; G3: grupo 3; G4: grupo 4; G5: grupo 5; G6: grupo 6.

Apenas no G3 e G5 foi observado o resultado significativo entre o primeiro momento e aps 15 dias de tratamento. No entanto, na maior parte dos grupos experimentais foi encontrada uma queda dos valores percentuais no segundo momento de colheita de material, esta queda s no ocorreu no G4, onde foi observado um aumento dos valores percentuais. Este grupo considerado controle e os animais foram tratados apenas com prednisona, mostrando que apesar de ser o grupo com maior nmero de bitos foi o nico que apresentou elevao dos valores no segundo momento, aps o tratamento. importante lembrar que em todos os grupos houveram bitos, portanto o nmero de animais deve diminuir de um momento para outro, assim deve-se trabalhar com os dados percentuais (Figura 22).

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90 80 % de resultados positivos 70 60 50 40 30 20 10 0 1 15 G1 Dias de Tratamento G2 G3 G4 G5 G6 G1

G2
G3 G4 G5 G6

Estatstica: Qui-quadrado. %: porcentagem. G1: grupo 1; G2: grupo 2; G3: grupo 3; G4: grupo 4; G5: grupo 5; G6: grupo 6.

FIGURA 22 Representao grfica dos valores percentuais dos resultados positivos da hn-PCR para deteco do vrus da cinomose em amostras de ces, antes e aps o tratamento nos diferentes grupos experimentais. Botucatu, SP, 2011. A figura 22 evidencia o aumento dos valores percentuais de resultados positivos na hn-PCR no G4, diferente do que ocorreu em todos os outros grupos que apresentaram diminuio destes valores. Como a hn-PCR foi realizada apenas nas amostras que resultaram negativa na RT-PCR, estes dados demonstram que dando grande quantidade de resultados negativos aps o perodo de 15 dias de tratamento e mesmo realizando a hn-PCR os resultados continuaram em sua maior parte negativos no segundo momento. Como o G3 um grupo controle, ou seja, os animais no receberam o tratamento antiviral, e apresentou maior queda dos valores percentuais de resultados positivos, demonstra que este deveria ser um resultado esperado na patogenia da cinomose. Portanto, o que foi possvel verificar que os grupos tratados tiveram uma queda, mas que no foi muito acentuada como no G3.

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Discusso
Para compor os grupos experimentais, no houve distino de sexo e raa entre os animais selecionados e o atual estudo apresentou 45% de fmeas e 55% de machos. Na pesquisa realizada por Sonne (2008) a autora encontrou 59,26% de machos e 40,74% de fmeas infectadas com o vrus da cinomose. Os resultados de Headley & Graa (2000) demonstraram que no h diferena de susceptibilidade infeco pelo vrus da cinomose entre machos e fmeas. Da mesma forma, Corra & Corra (1992) afirmam que a enfermidade no tem predileo por sexo ou raa. No entanto, alguns autores afirmam que raas braquioceflias apresentam menor prevalncia da doena, de mortalidade e de sequelas comparadas com as raas dolicoceflicas (HEADLEY & GRAA, 2000; GREENE, 2006). Os animais includos na pesquisa no apresentaram diferena estatstica conforme a raa, mas a frequncia encontrada foi de 75% de ces sem raa definida, 10% de ces da raa Poodle e 3,3% das raas Border Collie e Pinscher e esses dados no demonstram susceptibilidade racial. J na pesquisa realizada por Sonne (2008), a frequncia de ces sem raa definida foi de 44,44%, seguida de animais da raa Poodle com 11,11%, apresentando dados semelhantes a atual pesquisa. Portanto, a frequncia no indica predisposio racial, mas sim o nmero de animais atendidos e um casual ndice elevado de Poodles. Headley e Graa (2000) encontraram 63% dos casos de encefalite pela cinomose em animais com menos de 18 meses, sugerindo que a maior taxa de mortalidade nesta forma acontea ao redor de um ano de idade. Concordando com esses dados, Silva et al. (2007) encontraram uma taxa de 49,5% dos casos com alteraes neurolgicas em animais com menos de um ano de idade, 48% dos animais com estes sinais estavam na faixa etria de um a nove anos de idade e 2,5% possuam mais de 10 anos. Na pesquisa realizada por Sonne (2008), dos 40 animais includos 78,5% apresentavam idade de dois a seis meses e em 11,1% dos animais a faixa etria situou-se entre sete meses e um ano de idade. Nos animais do presente estudo a idade variou de trs meses a 13 anos, no entanto as medianas das idades variaram de sete a 48 meses de idade, concordando com os dados dos autores acima. Sendo que os animais dos grupos 5 e 6 foram mais jovens com mediana de 10 e sete meses

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respectivamente, e pelas concluses de Headley e Graa (2000) estes animais teriam maior predisposio morreram pela doena na sua forma neurolgica. Pelo estudo da patogenia da doena, verificou-se que a infeco do tecido epitelial e SNC ocorreram no perodo de oito a nove dias ps-infeco e que no perodo de nove a 14 dias aps a disseminao nestes tecidos h produo de anticorpos contra o vrus (GREENE, 2006). No entanto, Vandevelde & Zurbriggen (2005) afirmam que quando uma efetiva resposta imune antiviral neutralizante ausente na fase aguda da cinomose, anticorpos IgM anti-vrus aparecem nas duas primeiras semanas da infeco. Alm disso, alguns autores relatam que os anticorpos contra o vrus interagem com macrfagos infectados em leses no SNC, causando sua ativao com liberao de ROS. Esta atividade, por sua vez, pode levar destruio de oligodendrcitos e bainha de mielina (TIPOLD et al., 1992; SUMMERS et al., 1995; GEBARA et al., 2004; GREENE, 2006; STEIN et al., 2006). Portanto, no utilizou-se animais com evoluo clnica neurolgica muito avanada com objetivo de minimizar esta influncia do sistema imune na progresso da enfermidade. Assim os animais foram selecionados no mximo com 10 dias de evoluo dos sinais nervosos, sendo que as medianas variaram de quatro a sete dias de evoluo, e que nos grupos 1 e 6 o perodo de incio de tratamento foi menor e nos grupos 2, 3 e 4 foi maior. No entanto, estes dados no mostraram interferncia na sobrevida dos animais e muito menos na amplificao da resposta inflamatria no sistema nervoso. O diagnstico da cinomose difcil de ser realizado, depende de tcnicas caras e de capacitao tcnica para realizao, como ELISA (LATHA et al., 2007), imunofluorescncia (MEGID et al, 2000) e RT-PCR (SAITO et al, 2000; GEBARA et al., 2004). Em vrios casos a combinao de alguns principais sintomas como, inflamao conjuntival, secreo respiratria, diarria, doena com trs semanas ou mais e sinais neurolgicos sugerem um diagnstico presuntivo da cinomose (KIM et al., 2006). Em regies endmicas, a cinomose deve sempre ser considerada como um importante diagnstico para ces com alteraes neurolgicas, independente do tipo, curso, extenso e natureza da doena neurolgica (AMUDE et al., 2010a). Assim os autores referem que chega-se na suspeita clnica baseando-se na histria, sintomatologia e achados hematolgicos (SILVA et al., 2005; GREENE, 2006).

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Como descrito na literatura, os animais do experimento foram selecionados a partir de suspeitas clnicas e de algumas caractersticas epidemiolgicas e sinais extraneurais. Estes sinais clnicos encontrados na cinomose foram divididos na atual pesquisa em alteraes oculares, sinais respiratrios e digestivos. Dos animais includos no estudo 63,3% apresentavam sinais oculares, como secreo ocular, ceratoconjuntivite seca, lcera de crnea e alopecia das plpebras. Os animais dos grupos 5 e 6 foram os que apresentaram maior nmero de acometimento ocular, em relao aos outros grupos. Estes dados de sinais oculares podem estar relacionados com a idade dos animais, j que os animais dos grupos 5 e 6 so os mais jovens e podem ter o sistema imune menos desenvolvido permitindo a colonizao bacteriana secundria. Na pesquisa realizada por Sonne (2008), 50% dos animais apresentavam sinais oculares e 35,2% secreo nasal. Os sinais no sistema respiratrio so rinite, descarga nasal serosa a mucopurulenta, pneumonia intersticial inicial e posterior evoluo para broncopneumonia devido infeco secundria, caracterizada por tosse estridente, mida e produtiva, alm de crepitaes na ascultao (CORRA & CORRA, 1992; GREENE, 2006). Os sinais respiratrios descritos foram observados em 41,7% dos animais includos na pesquisa. No sistema gastrointestinal h ocorrncia de vmitos intermitentes, anorexia, diarria pastosa a lquida, escura, com ou sem a presena de sangue, havendo desidratao em poucos animais (CORRA & CORRA, 1992; GREENE, 2006). Dos animais includos na pesquisa, 38,3% deles apresentaram sinais gastroentricos. Esta sintomatologia foi a de menor frequncia nos animais estudados. J na pesquisa de Sonne (2008), os achados necroscpicos foram de 48,1% dos animais com contedo intestinal diarrico. Os animais includos no estudo alm de apresentarem sinais

neurolgicos, tiveram uma alta frequncia de sinais oculares, menor em sinais respiratrios e, a seguir, sinais gastroentricos. No G5 foi possvel verificar um alto ndice de sinais oculares e respiratrios e no G6 de sinais oculares e gastroentricos. Ao mesmo tempo estes foram os grupos que apresentaram as menores medianas de idade (abaixo de 12 meses). Concordando com os dados de patogenia da enfermidade, animais mais jovens sofrem mais com o processo de imunossupresso, levando a infeco bacteriana secundria nos locais de replicao viral (GREENE, 2006). Segundo Tipold et al. (1992) apenas dois teros dos ces infectados desenvolvem sinais extraneurais, incluindo conjuntivite, febre, sinais

respiratrios, envolvimento gastroentrico, tonsilite e caquexia, ao passo que

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um tero desenvolve sinais neurolgicos sem sinais extraneurais no exame fsico. Os sinais clnicos, curso da doena e o tipo de envolvimento do SNC dependem da virulncia da cepa viral, condies ambientais, idade e estado imune do hospedeiro (SHELL, 1990; TIPOLD et al., 1992; GREENE, 2006). Filhotes e ces imunossuprimidos so propensos a desenvolvem necrose neuronal, enquanto que ces mais velhos ou imunocompetentes desenvolvem desmielinizao (SHELL, 1990). Os sinais neurolgicos so mltiplos e consequentes da replicao viral em neurnios e clulas gliais, refletindo desta forma, a distribuio do vrus e as consequentes leses no SNC (TIPOLD et al., 1992; GREENE, 2006). Deve ser considerado o objetivo da pesquisa cujos dados so relacionados, pois o trabalho de Amude (2005) foi realizado em animais que foram indicados para eutansia e na atual pesquisa os animais deveriam sobreviver ao tratamento experimental pelo menos cinco dias, quando receberam ribavirina e trs dias os do grupo controle. Por isso, alguns sinais neurolgicos diferem bastante de uma pesquisa para outra, j que representam graus diferentes de acometimento do SNC. No estudo de Silva et al. (2007) com 620 casos, a forma neurolgica da cinomose foi caracterizada por uma grande variedade de sinais, sendo que os ces apresentavam um nico sinal clnico ou uma combinao deles, sendo que este levantamento tambm foi realizado no atual estudo, havendo concordncia nos dados obtidos. Na atual pesquisa 68,3% dos animais apresentavam dficits posturais, sendo que os dficits de propriocepo foram separados totalizando 43,3% dos animais. Na pesquisa de Amude (2005) as plegias e paresias foram tratadas separadas, no atual estudo foram trabalhadas como alteraes posturais e de andar. Na pesquisa de Silva et al. (2007) as alteraes posturais e motoras ocorreram em 20,5% dos animais. Na presente pesquisa nenhum dos animais chegou apresentando nistagmo, este sinal surgiu aps o incio do tratamento como a evoluo da enfermidade. A ataxia na pesquisa de Amude (2005) teve frequncia de 62,5%, porm s foi considerada a ataxia cerebelar, mas nesta pesquisa foram consideradas as formas de ataxia cerebelar, vestibular e proprioceptiva, por isso tivemos um ndice maior de 68,3% de frequncia. O

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estudo de Silva et al. (2007) apresentou um ndice de 25% dos animais com ataxia. A alterao de conscincia foi encontrada em 21,7% dos animais includos no estudo, enquanto que Amude (2005) encontrou uma taxa de 25%, no entanto esse tipo de alterao neurolgica considerado principalmente nos casos de eutansia, como foram os animais includos na pesquisa do referido autor. Assim como ocorreu com andar compulsivo e opisttono que foram encontrados em 25% dos casos da sua pesquisa, enquanto que no atual estudo foram includos 13,3% de animais com andar compulsivo e 8,3% com opisttono. O sinal neurolgico de balanar a cabea teve frequncia de 12,5% no estudo de Amude (2005), enquanto que nesta pesquisa foi de 28,3%. Com relao ao estrabismo vestibular que foi separado na pesquisa de Amude (2005), na atual pesquisa foi includo junto s alteraes de nervos cranianos que ficaram com 78,3%. As alteraes comportamentais tiveram frequncia de 6,7% no atual estudo, enquanto que Amude (2005) encontrou 12,5% delas. No houve referncia com relao ao choro noturno, no entanto pode ter sido considerado como alterao de comportamento, porm nesta pesquisa este sinal foi encontrado em 13,3% dos animais. Amude (2005) encontrou 12,5% de animais que apresentavam mioclonias, enquanto que na atual pesquisa observou-se uma frequncia em 45% dos animais. No estudo de Silva et al. (2007) os dados de animais com mioclonias foram mais semelhantes com 38,4% dos casos. Andar em crculos e pressionamento da cabea contra objetos tambm foram encontrados nos animais da pesquisa de Amude (2005), porm com uma frequncia de 12,5% e neste estudo foi encontrado em 8,3% e 3,3%, respectivamente. As vacinas produzidas com as amostras do vrus da cinomose, isoladas de ces naturalmente infectados, como Snyder Hill, Rockborn, Onderstepoort, adequadamente atenuadas em culturas de clulas, so eficientes em induzir o estado de imunidade dos animais vacinados, protegendo-os contra infeco natural (BIAZZONO et al., 2001). Na pesquisa de Amude (2005) os oito ces includos no estudo s apresentavam sinais neurolgicos, sendo que quatro animais tinham recebido

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pelo menos trs doses da vacina contra a cinomose com vrus atenuado, dois no eram vacinados e outros dois tinham histrico vacinal. Na atual pesquisa no foram includos animais que apresentavam histrico vacinal correto, ou seja, quando filhotes com mais de trs doses de vacina de vrus vivo atenuado com orientao do mdico veterinrio ou adultos que recebessem anualmente uma dose. Os animais foram caracterizados de quatro formas: sem vacinao (55%), vacinao incompleta (10%), vacinao sem orientao veterinria (30%) e sem histrico de vacinao (5%). Este ltimo item, em alguns momentos tambm influenciou a no escolha dos animais para o estudo, j que como o histrico no era conhecido, o animal poderia ter recebido a vacinao. Mais de 50% das infeces pelo vrus da cinomose so subclnicas ou com sinais clnicos moderados (SILVA et al., 2007), ou seja, a taxa de infeco maior do que o nmero dos animais que manifestam a enfermidade, estimando-se em at 75% de ces susceptveis que eliminam o vrus sem qualquer sinal clnico da doena (CORRA & CORRA, 1992; GEBARA et al., 2004). Acima de 30% dos ces exibem sinais de envolvimento neurolgico durante ou aps a infeco sistmica pelo vrus da cinomose (RUDD et al., 2006). A transmisso ocorre principalmente por aerossis e gotculas que contm o vrus, pelas secrees respiratrias, fezes e urina (CORRA & CORRA, 1992). Neste estudo foi avaliada a frequncia dos animais que entraram em contato direto com outro animal doente e apenas 16,7% deles tinham tido esse contato, sendo que 55% dos animais no tinham outros contactantes em casa, porm 43,3% de todos os ces includos na pesquisa tinham acesso rua, tanto sozinhos quanto com os proprietrios. Desta forma, mesmo que a maior parte dos animais no tivesse entrado em contato direto com outros doentes, a infeco provavelmente aconteceu por meio do proprietrio (indiretamente), pelo contato com animais no vacinados que podem ter a infeco sem apresentar sinais clnicos ou mesmo por contato direto com animais doentes nas ruas. Nos animais da pesquisa, o principal motivo da infeco ocorreu por falta de um histrico vacinal correto.

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No estudo de Elia et al. (2008) foi observado que a relao entre efeito da droga e o tempo de exposio mostrou que a atividade antiviral em altas concentraes ocorre no perodo de 24 horas. Entretanto, em baixas concentraes a eficcia da droga foi obtida aps 48 horas de exposio. Porm, este estudo refere eficcia da ribavirina frente ao vrus da cinomose in vitro. Mangia (2008) analisou a eficcia da ribavirina em ces naturalmente infectados com o vrus da cinomose e concluiu que a melhora dos sinais na maior parte dos animais estudados ocorreu a partir do stimo dia de administrao da droga. Por isso, no atual estudo no foram includos animais que morreram com menos de cinco dias de tratamento, pois se deduziu que poderia no haver ainda ao da ribavirina sobre o vrus da cinomose. No entanto, como nos grupos controle no havia droga experimental para ser testada, foram includos os animais que no morreram no perodo de trs dias de tratamento, ou seja, animais que morreram com at dois dias de tratamento no entraram na pesquisa. A atual pesquisa revelou que mesmo com a incluso de mais dois grupos tratados com a ribavirina e dois grupos controle a mdia de dias de sobrevida dos animais tratados com o antiviral foi maior do que dos animais que entraram no grupo no tratado. Este dado sugere-se que a ribavirina aumentou o tempo de vida dos animais naturalmente infectados com o vrus da cinomose apresentando encefalite. A terapia antiviral na SSPE (encefalite causada pelo vrus do sarampo em humanos) tem como objetivo diminuir a progresso da doena ou estabilizao temporal de progresso da doena, prolongar a sobrevida, ou, menos provvelmente obter a melhora clnica. O benefcio esperado mais do que a taxa de 5% de remisso descrita na literatura (GUTIERREZ et al., 2010). A ribavirina foi aprovada pela U.S. Food and Drug Administration para o tratamento peditrico da infeco pelo vrus sincicial respiratrio e sua combinao com alfa-interferon para infeco crnica pelo vrus da Hepatite C (WU et al., 2005). Hoje na terapia antiviral com ribavirina os pacientes com hepatite C tem uma sobrevida de 55% (SUNG et al., 2011). No atual estudo o tratamento experimental foi avaliado segundo a melhora clnica e a sobrevida dos animais nos diferentes grupos, onde foi encontrada uma taxa de 60 a 70% entre os que sobreviveram ou apresentaram melhora clnica, que em relao ao tratamento usado em humanos apresentou melhores resultados, com exceo do G4 com 70% de bitos. A sobrevida e melhora clnica do estudo foi melhor do que se espera da droga em humanos. Dos 60 animais includos no experimento, apenas 38,3% apresentaram melhora clnica, quando se soma os dados dos animais que

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receberam o antiviral verificou-se que 12 (30%) animais morreram e 19 (47,5%) apresentaram melhora clnica evidente no perodo de internao. Quando feita a avaliao da sobrevida junto com a melhora clnica dos animais, verificou-se que 70% dos animais tratados com o antiviral apresentaram melhora clnica ou sobrevida, no entanto nos grupos controle essa taxa chegou a 50%. Pode-se identificar que clinicamente a ribavirina favoreceu a sobrevida ou a melhora dos animais tratados, assim como foi descrito por Mangia (2008). Segundo Corra & Corra (1992), a cinomose na fase neurolgica progressiva, raramente estacionando, levando morte em curso agudo ou crnico e sempre deixando sequelas que podem ser inabilitantes nos eventuais sobreviventes. Mangia (2008) observou que a eficcia da ribavirina no foi influenciada pelo perodo de evoluo apresentado pelos animais ao incio do tratamento. Foi sugerido que a ribavirina como forma de tratamento na fase neurolgica da cinomose torna o prognstico mais favorvel. Segundo Appel (1969) a taxa de mortalidade de ces infectados pelo vrus da cinomose chega a 50%, aps trs a quatro semanas de exposio viral. Dependendo da espcie afetada e do estado imunolgico do indivduo a mortalidade pode exceder 80% (HARDER & OSTERHAUS, 1997). No estudo tambm foi possvel identificar que os grupos tratados com a prednisona tiveram um resultado pior do que aqueles tratados apenas com ribavirina e DMSO. Comparativamente os autores Fitch & Van De Beek (2008) afirmaram que a encefalite pelo Herpes Simplex Virus (HSV) considerada a pior condio dentre as encefalites infecciosas, com ndice de mortalidade de 70%, caso no seja tratada, reduzindo-se a 20 a 50% de mortalidade nos casos tratados com antivirais. Embora o controle da inflamao parecesse ser benfico ao SNC, a nica considerao do uso de esterides nas infeces virais a diminuio da retirada do vrus do organismo, prolongando ainda mais a enfermidade. Como no existem grandes estudos sobre o uso de corticosterides na encefalite pelo HSV, ainda no h recomendao para a terapia adjuvante. No entanto, Tipold et al. (1992) e Greene (2006) afirmam que os corticosterides podem ser utilizados devido a imunopatologia das leses neuronais e para reduzir o edema cerebral causados pelo vrus da cinomose, mantendo a terapia com doses antinflamatrias. A imunossupresso causada pelos esterides a principal desvantagem, porque a resposta inflamatria responsvel por combater o vrus. Este aspecto foi facilmente identificado na atual pesquisa j que a taxa de letalidade no G4 foi de 70%. Ao mesmo tempo, o G5 mostrou que quando h associao da ribavirina, mesmo em animais imunossuprimidos, h aumento da sobrevida e melhora clnica, chegando a 70% como ocorreu neste grupo. Segundo Biazzono et al. (2001) vrios fatores interferem na qualidade e durao da resposta imune vacinao, como a amostra viral utilizada, a massa antignica ou o ttulo vacinal e o grau de atenuao do antgeno viral. Existem tambm os fatores relacionados ao prprio hospedeiro, como a variao individual na capacidade de resposta a uma mesma vacina, o estado nutricional, parasitismo, os estados de imundeficincia e fatores relacionados s condies ambientais. Concordando com os dados descritos pelos autores, animais que receberam a vacina de forma correta no foram includos no atual estudo.

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Contudo, a pesquisa evidenciou que animais que no foram vacinados apresentaram ndices melhores de sobrevida e melhora clnica, assim como ocorreu na pesquisa de Mangia (2008). Na atual pesquisa foi identificado que animais que receberam a vacina sem orientao do mdico veterinrio tambm apresentaram taxas melhores de sobrevida e melhora clnica sendo demonstrado, desta forma, que a vacinao realizada sem orientao do mdico veterinrio no foi capaz de causar melhora dos ndices de avaliao clnica, portanto pode-se afirmar que no possuem massa antigncia capaz de causar resposta imune nos animais vacinados com as mesmas. Nenhum dos tratamentos mostrou diferena com relao ao histrico vacinal, mas foi possvel notar que os grupos 1, 2 e 6 apresentaram taxas acima de 50% de melhora clnica para os animais que receberam a vacinao sem orientao veterinria. J os animais que no receberam vacinao, os ndices de melhora foram evidentes nos grupos 1, 4 e 5, sendo que os G4 e G5 so grupos tratados com doses imunossupressoras de prednisona. Diferente do que foi descrito por Mangia (2008), os dados demonstram que o histrico vacinal no alterou os dados do tratamento experimental. A disseminao do vrus no epitlio e nos tecidos do SNC ocorre no perodo de oito a 10 dias ps-infeco, por via hematgena ou pelo lquor dependendo do estado imune humoral e da imunidade citomediada do animal (TIPOLD et al., 1992; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 1995; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005; GREENE, 2006). Nos ces com nveis intermedirios de resposta imune mediada por clulas e com ttulos de anticorpos que aparecem tardiamente aps nove a 14 dias, o vrus se dissemina pelos tecidos. Os sinais clnicos podem desaparecer se ocorrer o aumento da titulao de anticorpos, mas podem persistir por longos perodos em tecidos uveais, neurnios e tegumentos, bem como nos coxins plantares. A recuperao da infeco est associada com a imundade a longo prazo e interrupo da replicao viral. A proteo pode ser comprometida se o co for exposto a cepa altamente virulenta, dose infectante elevada e/ou sofrer imunossupresso (CORRA & CORRA, 1992; GREENE, 2006). Sabendo da interferncia do sistema imune na sobrevida dos animais, o atual estudo mostrou que os animais que morreram eram mais novos que os animais que sobreviveram ou que apresentaram melhora clnica, independente do grupo tratado. Este resultado concorda com os dados da literatura. No entanto, a pesquisa mostrou que os animais dos grupos controle que morreram eram mais velhos, enquanto que nos grupos tratados com a ribavirina e suas associaes os animais que morreram eram mais jovens; discordando com a literatura analisada, j que se esperava em todos os grupos que animais mais jovens tivessem maior letalidade. Assim, os dados encontrados na pesquisa indicaram que a ribavirina favoreceu a melhora clnica dos animais, j que a diminuio de partculas virais circulantes permite melhor resposta imune do hospedeiro e verificou que os ces que receberam ribavirina e apresentaram melhora clnica so animais com mais de 24 meses de idade, capazes de produzir uma resposta eficaz frente infeco viral. Em vrios estudos envolvendo a ocorrncia natural da encefalite pelo vrus da cinomose, sinais sistmicos simultneos com doena neurolgica so a apresentao mais comum, assim como convulses e mioclonias so sinais mais encontrados quando h acometimento do SNC (FRISK et al., 1999;

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HEADLEY & GRAA, 2000; MORO et al., 2003; GEBARA et al., 2004). Concordando com os dados da literatura, os animais do presente estudo apresentaram no histrico, sinal sistmico seguido ou concomitante com a doena enceflica. No entanto, no existem dados na literatura com relao a sobrevida dos animais em relao ao sinal clnico sistmico, quando associado com sinais neurolgicos. A presente pesquisa verificou-se que animais com apresentao clnica da associao de sinais oculares com neurolgicos tiveram maior ndice de bitos (72,7%) e os animais que no apresentaram sinais oculares tiveram maior ndice de sobrevida e melhora clnica. Quando compara-se esses dados nos diferentes grupos experimentais, nota-se que quando no foi usada a prednisona a maior porcentagem de melhora clnica foi dos animais que no apresentavam sinais oculares e nos grupos 4, 5 e 6 os animais que melhoraram tinham sinais oculares. Com relao a presena de sinais grastroentricos nos animais estudados, notou-se que houve xito no ndice de melhora clnica dos animais na presena destes sinais, este fato ocorreu principalmente nos grupos 2, 3, 5 e 6. J a presena de sinais respiratrios no intervieram na sobrevida dos animais estudados quando analisados na chegada ao Hospital Veterinrio, pois 50% dos animais que morreram apresentavam sinais respiratrios. Quando este sinal foi estudado nos diferentes grupos experimentais, os resultados demonstraram que no influenciaram na sobrevida dos animais nos diferentes tipos de tratamento experimental, j que os grupos controle apresentaram as mesmas caractersticas nas taxas de bito e melhora clnica que os grupos experimentais. A presena deste sinal foi importante durante o perodo de internamento, pois que animais que apresentavam decbito ficaram mais predispostos a desenvolverem sinais respiratrios mesmo com o uso de antimicrobianos, favorecendo a morte destes ces mesmo com o uso do antiviral. Em alguns casos, o desenvolvimento de pneumonia durante o perodo de internamento foi uma complicao da prpria enfermidade que levou ao bito dos animais. A encefalomielite da cinomose normalmente uma doena neurolgica multifocal e os sinais clnicos refletem a difuso do vrus e a disseminao de leses no SNC (SHELL, 1990; KOUTINAS et al., 2002). Algumas vezes os sinais neurolgicos da cinomose sugerem uma localizao restrita de leses no SNC (TIPOLD et al., 1992; KOUTINAS et al., 2002). Na pesquisa de Sonne (2008) foram analisados os encfalos de 54 ces e foram encontradas leses microscpicas em 29 deles. Nos animais analisados a encefalopatia foi classificada em 79,0% como aguda, 13,8% como subaguda e 6,9% como crnica. Em dois animais no se observou alteraes microscpicas no crebro e cerebelo, porm o antgeno viral foi visualizado por teste imunoistoqumico. Estes autores demonstram a importncia do estudo das leses enceflicas em ces com cinomose. Na atual pesquisa os sinais neurolgicos foram avaliados conforme o local da leso que eles refletem, assim quanto maior a quantidade de sinais neurolgicos, maior a rea do SNC acometida e mais difusa a distribuio viral. Os dados encontrados nos animais estudados mostraram que os que morreram tinham mais sinais neurolgicos que os animais que sobreviveram ou apresentaram melhora clnica. Os resultados obtidos demonstraram que os animais que melhoraram apresentavam menos

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sinais neurolgicos do que os que morreram, mesmo recebendo o antiviral, o que mostra que o tratamento experimental no foi capaz de causar uma evoluo clnica favorvel na presena de muitos sinais neurolgicos. Quando avaliados de acordo com a quantidade de sinais, notou-se que os animais includos na pesquisa apresentaram taxas maiores de bitos quando tinham mais de cinco sinais neurolgicos em relao aos com um a quatro sinais, concordando com os dados de literatura que quanto maior a rea afetada pior o prognstico da doena (AMUDE, 2008). Apenas no G3 os animais que apresentavam mais sinais neurolgicos foram os que apresentaram melhora clnica, ou seja, mesmo a enfermidade sendo difusa, os animais tratados com DMSO apresentaram melhores ndices de cura clnica. No G4 mesmo os animais apresentando poucos sinais neurolgicos, morreram mostrando que o tratamento pode ter piorado a evoluo do processo neurolgico. Visando no s a difuso viral, a localizao das leses foi relacionada com a sobrevida e foi encontrado que a maior parte dos animais que apresentaram mioclonias morreram, independente do grupo tratado. Estudos experimentais mostram que uma leso focal na medula espinhal pode ser responsvel pela mioclonia. especulado que o local de destruio o neurnio motor inferior da medula espinhal ou o ncleo do nervo cranial. possvel que a leso no ncleo basal inicie a mioclonia pela estabilizao de um marca-passo na medula ou tronco enceflico (DE LAHUNTA, 1983). Sendo este sinal mais caracterstico na encefalite de ces jovens (BRAUND, 1994). No h dados na literatura sobre a relao da incidncia de mioclonias com o bito dos animais, na verdade, esperava-se que fosse um sinal menos importante ao prognstico at mesmo por afetar neurnios perifricos, no entanto pode estar associada ao nmero de bitos de animais mais jovens, o que pode ter ocorrido no presente estudo. Alguns sinais com menor frequncia nos animais includos, porm que intervieram na sobrevida dos animais acometidos foram: alterao do nvel de conscincia, opisttono, agressividade e pressionamento da cabea contra objetos. Estes sinais esto relacionados com leses cerebrais, principalmente dienceflicas (DEWEY, 2006). No que se refere s alteraes hematolgicas, a anemia pode ser atribuda ao aumento da destruio dos eritrcitos ou pela diminuio de sua produo. A destruio determinada pela presena do vrus nos eritrcitos ou pela deposio de imunocomplexos na membrana destas clulas. A queda da produo pode ser atribuda falncia da medula ssea devido ao estresse desencadeado pela doena. Na maioria dos casos os eritrcitos apresentam-se normocticos e normocrmicos e no h sinais de regenerao medular (SILVA et al., 2005). Concordando com a literatura, a maior parte dos animais da pesquisa apresentava anemia quando chegou para o tratamento, j que todos os grupos tiveram medianas da contagem de hemcias abaixo dos valores de normalidade para ces (MEYER et al., 1995). Como ocorreu na pesquisa anterior de Mangia (2008), os animais aps o perodo de tratamento com a ribavirina apresentaram valores baixos da contagem de hemcias. Na atual pesquisa verificou-se que todos os grupos apresentaram uma queda na mediana da contagem de hemcias, mesmo os animais do grupo controle. Os animais dos grupos 3, 5 e 6 foram os que apresentaram valores inferiores 3.500.000 hemcias/ L. Dois animais do G5

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e um do G6 apresentaram valores da contagem de hemcias abaixo de 2.000.000 clulas/L no 15 dia de tratamento, que podemos classificar como anemia grave (MEYER et al., 1995). A aplicao clnica da ribavirina mostra restries devido a alguns efeitos adversos, especialmente, induo de anemia hemoltica. O acmulo dos fosfatos da droga em eritrcitos leva a anemia, que pode ser a causa para a descontinuao do tratamento (WU et al., 2005). A severidade da anemia mais grave em macacos, seguidos dos humanos, roedores e ces (LIN et al., 2003). No entanto, Papich et al. (2003) afirmam no ter encontrado efeitos colaterais da ribavirina em ces, na dose de 60 mg/Kg durante duas semanas. Na dose de 30 mg/Kg tambm administrada no perodo de duas semanas apresentou um leve quadro de anemia, porm quando administrada junto com o glicocorticide apresentou anemia grave. No foram encontrados na literatura relatos de efeitos colaterais potencializados por glicocorticides no uso da ribavirina em qualquer espcie animal que j foi testada, portanto este o primeiro relato de quadros de anemia severa em ces que receberam ribavirina em associao com a prednisona. Mangia (2008) sugeriu que o DMSO minimizou os efeitos colaterais da ribavirina, causando uma queda menor nos valores de contagem de hemcias. Foi encontrada uma semelhana desse quadro quando comparou-se os grupos 5 e 6, e que o G6 que recebeu a associao com o DMSO manteve a contagem de hemcias mais alta do que os animais do G5. A dosagem de hemoglobina apresentou semelhana com os resultados da contagem de hemcias, onde no primeiro momento a maior parte dos animais apresentava contagem de hemcias e dosagem de hemoglobina baixas quando chegaram ao Hospital Veterinrio. Aps o tratamento experimental, o G2 foi o que melhor apresentou mediana da dosagem de hemoglobina, ao contrrio do que aconteceu com os grupos 5 e 6. Foi possvel identificar que a ribavirina em associao com a prednisona foi capaz de causar uma queda nos nveis de hemoglobina nos ces destes grupos experimentais, diferente do que foi encontrado nos animais do grupo controle e nos animais que no receberam a associao das duas drogas. Quando incorporada nos eritrcitos, a ribavirina convertida em metablitos fosforilados. Estes diminuem os nveis de ATP intracelular, resultando na reduo da integridade dos eritrcitos por uma desestabilizao da membrana, podendo chegar hemlise. A concentrao celular de ribavirina alcana nveis estveis em duas a trs semanas aps o incio do tratamento, quando ocorre a diminuio de hemoglobina. As mudanas na concentrao de ribavirina celular so inversamente proporcionais s alteraes nos nveis de hemoglobina (INOUE et al., 2004; HITOMI et al., 2011). No entanto, os nveis de hemoglobina em ces apresentaram a sua primeira queda prximo do 10 dia de tratamento e no apenas com duas semanas, como sugere a literatura. A incorporao de metablitos fosforilados est relacionada com a dose administrada, ou seja, sugere que os animais do presente estudo receberam uma dose elevada e a incorporao de metablitos ocorreu em um perodo inferior ao descrito na literatura.

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Ao mesmo tempo, o glicorticide atua em vrias regies da clula, tanto na membrana celular quanto na membrana do ncleo e, desta forma, podem interferir aumentando o acmulo dos metablitos da droga nas hemcias. No entanto, no existem dados que relatem a administrao da ribavirina junto com a prednisona, como ocorreu neste estudo, portanto esses dados so sugestes para novas pesquisas que venham trabalhar com o antiviral em ces. Apesar dos grupos controle apresentarem quase 10 pontos percentuais abaixo dos valores de referncia para ces no 15 dia de tratamento, nos grupos que receberam ribavirina, exceto o G2, os valores de volume globular chegaram a extremos, abaixo de 25%. Assim como os outros resultados, todos os animais mostraram anemia no ltimo dia de tratamento, sendo que os grupos 1, 5 e 6 apresentaram os piores resultados tanto de volume globular quanto de hemcias e dosagem de hemoglobina. Assim como sugerido por Mangia (2008) o DMSO pode ter ajudado a diminuir essa alterao causada pela ribavirina no G2. possvel que este composto diminua a degradao da ribavirina pela adenosina quinase dentro dos eritrcitos, impedindo seu acmulo e posterior perda da hemoglobina. Esta sugesto surgiu a partir do estudo de Yoon et al. (2006), que mostrou que o DMSO possui efeitos variados na atividade de isoenzimas, sua presena nas reaes enzimticas produz efeitos inibitrios diretos no metabolismo mediado por estas. A afinidade relativa do DMSO com o substrato das enzimas pode ter um papel importante como consequncia dessa interao. Por esta pesquisa ficou evidenciado que o tratamento com ribavirina, sem o DMSO, pode levar a anemia mais grave que a prpria evoluo da doena. Tipold et al. (1992) afirmam que a trombocitopenia um achado raro na cinomose, no entanto, Silva et al. (2005) afirmam que a trombocitopenia um achado frequente. Sabe-se, apenas, que em infeces pelo Morbillivirus j se observou aumento de anticorpos antiplaquetas. A trombocitopenia provavelmente do tipo imunomediada com remoo das plaquetas pelo sistema retculo endotelial. Essa explicao tambm citada nos estudos de Rima & Duprex (2006) e concluram que um achado transitrio que desaparece com trs a quatro semanas aps a infeco por Morbillivirus. Em nenhum dos grupos foi encontrada uma alterao destes valores que fosse significativa clinicamente. No entanto, no ltimo dia de tratamento apenas os G1 e G5 apresentaram medianas dentro dos valores de referncia (MEYER et al., 1995), assim sugere que mesmo com o tratamento experimental ainda houve ao do vrus no sangue circulante. O G6 foi o nico grupo que apresentou mediana relativamente baixa no ltimo dia de tratamento, porm no h dados na literatura que relatam efeitos colaterais das drogas experimentais sobre as plaquetas. O leucograma a caracterstica mais varivel com as contagens abrangendo de leucopenia a leucocitose. Infeces bacterianas oportunistas no trato digestrio e respiratrio podem ser observadas e isso justifica a leucocitose por neutrofilia e o desvio a esquerda (SILVA et al., 2005). Tudury et al. (1997) estudando a forma neurolgica da cinomose relatou que anemia e linfopenia so os achados hematolgicos mais freqentes na enfermidade. Segundo Moro & Vasconcellos (1998) a infeco resulta em leucopenia devido linfopenia que se inicia uma semana aps a infeco e que pode persistir at a convalescncia. O animal com infeco persistente permanece

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com baixa contagem de leuccitos. A replicao do vrus nas clulas linfides seguida por um extenso perodo de imunossupresso e segundo Schobesberger et al. (2005) a queda significativa de linfcitos foi observada no perodo de trs dias aps a infeco, antes da viremia. No presente estudo, na contagem de leuccitos foi possvel identificar que a mediana do G3 foi menor em relao aos outros grupos no ltimo dia de tratamento, o que nos permite afirmar que os animais deste grupo permaneceram infectados at o ltimo dia de tratamento, porm este grupo no recebeu o antiviral. No entanto, o G1 tambm apresentou uma mediana abaixo da normalidade, mostrando que a leucopenia predominante no grupo pode ser um indcio da no eficcia da ribavirina em interromper a ao viral nestas clulas. O presente estudo revelou que as medianas dos grupos 4 e 5, que receberam doses imunossupressoras de prednisona, apresentaram uma contagem de leuccitos mais alta em relao aos outros grupos. Este achado foi descrito na pesquisa de Van Den Brandt et al. (2007), na qual os glicoorticides mostraram induzir clulas CD8 a formarem linfcitos T CD4+ e causaram apoptose de timcitos, mas mantendo ainda as clulas T maduras do sangue perifrico mimetizando uma proliferao hemostsica. E complementando com o trabalho de Abraham et al. (2006) em que os autores afirmam que os glicocorticides inibem a expresso dos mediadores inflamatrios dos macrfagos e de outras clulas, desta forma, so usados no tratamento de vrias enfermidades inflamatrias imunomediadas. Assim, mesmo que os animais dos G4 e G5 apresentassem imunossupresso, a contagem de leuccitos nesses animais tenderia para valores mais altos como ocorreu na pesquisa. Os grupos 1, 2 e 3, que no receberam prednisona, demonstraram uma queda nesta contagem a partir do 12 dia de tratamento, demonstrando assim que esta alterao pode ser consequncia natural da doena, j que os animais do G3 no receberam a ribavirina. A mediana do G6 demonstrou a mesma caracterstica, evidenciando que a dose de 0,5 mg/Kg, a cada 12 horas, no foi capaz de aumentar a quantidade de leuccitos circulantes tanto quanto a dose imunossupressora. Com relao a quantidade absoluta de neutrfilos, nenhum grupo apresentou medianas abaixo ou acima dos valores de referncia para ces (MEYER et al., 1995), demonstrando a pouca relevncia clnica frente aos achados estatsticos. Desta forma, os tratamentos experimentais no intervieram nos valores de neutrfilos em todos os grupos pesquisados. Um quadro proeminente da infeco de ces gnobiticos com vrus da cinomose a linfopenia prolongada e depleo linfide sistmica. A causa da linfopenia ocorre provavelmente devido a habilidade do vrus em se replicar e destruir os tecidos linfides (MORO & VASCONCELOS, 1998). Entretanto, nos relatos atuais foi observado que a cintica da infeco viral no est relacionada com a da depleo de linfcitos e a morte celular. No perodo de trs a seis dias aps infeco, h um aumento na apoptose, porm o vrus no detectvel. Esses efeitos podem ser mediados pela produo de citocinas inflamatrias, que afetam a hemostasia de linfcitos (KUMAGAI et al., 2004; SCHOBESBERGER et al., 2005). No estudo de Silva et al. (2005), em 85% dos casos de cinomose foi encontrada linfopenia. J no experimento de Amude et al. (2007) a alterao na

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contagem de linfcitos foi de 37,5% dos casos. Na pesquisa de Mangia (2008) o ndice de linfopenia foi de 75%. Baseado nos relatos de Schobesberger et al. (2005), a determinao do nmero de linfcitos tem um valor prognstico no desenvolvimento da doena. No presente estudo foi possvel verificar que o G3 apresentou melhor resposta linfocitria ao final do tratamento. No entanto, foi o nico grupo que no recebeu ribavirina e prednisona. Nos grupos tratados com estas drogas os valores de linfcitos foram menores no dcimo quinto dia de internao. Sendo que dos grupos tratados, os grupos 1, 5 e 6 apresentaram medianas da contagem de linfcitos muito baixas, considerada uma linfopenia relativamente acentuada. Existem autores que afirmam que a ribavirina tem efeitos imonureguladores, pois capaz de inibir a sntese de macromolculas e a diviso celular, proliferao de linfcitos e a sntese de cido nuclico. s vezes, pode suprimir a produo de linfcitos B e consequentemente a formao de anticorpos (BEAN, 1992). Em humanos, a ribavirina administrada por via oral foi capaz de diminuir o nmero de clulas CD4 e a proliferao de linfcitos, principalmente em altas doses, sugerindo uma possvel toxicidade dos linfcitos (HEAGY et al., 1991). Como este foi um achado sugerido na pesquisa de Mangia (2008), possvel que a presena de linfopenia nos grupos tratados com ribavirina seja uma alterao da sua toxicidade em ces tambm. Na presente pesquisa foi possvel detectar que todos os grupos que receberam o tratamento antiviral apresentaram uma queda nos valores de linfcitos principalmente no ltimo dia de internamento. Os grupos 3 e 4, que no receberam ribavirina apresentaram aumento no nmero de linfcitos circulantes aps o stimo dia de tratamento. Na contagem de eosinfilos houve diferena estatstica na mediana dos grupos 2 e 3 em relao aos outros grupos no stimo dia de tratamento, sendo que estes achados podem estar relacionados com o uso do DMSO. Porm, no existem dados na literatura que mostrem o aumento de eosinfilos circulantes pelo uso do DMSO em ces. Somente Randhawa (2006) afirma que o DMSO uma substncia relativamente txica e sua aplicao tpica pode causar uma dermatite irritante e uma reao urticariforme de contato que no mediada por reao imunolgica, sendo possvel a liberao de histamina pela ativao de mastcitos. No entanto, no presente estudo observou que ao final do tratamento, mesmo que os valores de eosinfilos tenham aumentado, no ficou caracterizada uma eosinofilia j que os valores de referncia no foram ultrapassados (MEYER et al., 1995). No foram encontrados resultados significativos em relao aos outros tipos celulares examinados no hemograma, como basfilos e moncitos. Segundo Tipold et al. (1992) os achados hematolgicos frequentes em ces com cinomose so linfopenia, s vezes associado com leucopenia ou leucocitose, anemia, monocitose e raramente trombocitopenia. No entanto, na atual pesquisa a monocitose no foi encontrada em nenhum momento nos diferentes grupos experimentais. Porm, foi encontrada uma taxa de 3,3% dos moncitos ativados no dia em que os animais chegaram para atendimento no Hospital Veterinrio.

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Foi encontrado tambm um aumento gradativo no nmero de moncitos ativados durante o perodo de internamento dos animais. Apenas os grupos 4 e 6 no apresentaram moncitos ativados no sangue perifrico em nenhum momento do tratamento. As incluses citoplasmticas denominadas corpsculos de Lentz ou Sinigaglia-Lentz, que aparecem em algumas clulas do sangue, em pequeno nmero nos linfcitos, neutrfilos e hemcias, possuem particular relevncia no diagnstico clnico da cinomose. A ocorrncia dessas incluses em leuccitos evidencia a presena do vrus, mas quando no encontradas possuem pouco valor na determinao da ausncia do vrus, j que so observadas somente na fase virmica da doena (CORRA & CORRA, 1992). importante ressaltar que a viremia ocorre no perodo de quatro a seis dias, quando aps a replicao em rgos linfides, causa um aumento na temperatura corporal, ocorrendo leucopenia causada por danos virais nas clulas linfides (CORRA & CORRA, 1992; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 1995; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005; GREENE, 2006). A disseminao do vrus no epitlio e nos tecidos do SNC no perodo de oito a dez dias ps-infeco, ocorre por via hematgena ou pelo lquor dependendo do estado imune humoral e da imundade citomediada do animal (TIPOLD et al., 1992; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 1995; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005; GREENE, 2006). Pela literatura existente, no era para se encontrar o corpsculo de Lentz, j que as fases virmicas acontecem no incio da infeco e os animais que foram includos na pesquisa j apresentavam sinais neurolgicos. No entanto, no primeiro momento, encontrou-se 1,7% de incluses. Aps 15 dias de tratamento, 2,4% dos animais apresentaram incluses no sangue. Este achado neste momento da pesquisa pode ter sido o primeiro indcio do aparecimento de partculas virais na circulao sangunea aps o tratamento com a ribavirina, j que a incluso foi encontrada em um nico animal do G5. Segundo Jain (1993) os linfcitos reativos esto presentes nas respostas imunes com formao de anticorpos, e so geralmente caracterizados por atipia e linfcitos altamente basoflicos ou imunocompetentes. Os linfcitos na sua forma reativa apresentam um significado importante na referida enfermidade, pois caracterizam uma resposta imune ao vrus. Este achado foi encontrado em 8,3% dos animais includos na pesquisa. Porm, este achado hematolgico no apresentou resultado estatstico significativo em nenhum dos momentos, com a apresentao espordica nos diferentes grupos, sugerindo que no houve influncia do tratamento na sua ocorrncia. No exame bioqumico de funo heptica e renal, os achados no so especficos para a infeco pelo vrus da cinomose (TIPOLD et al., 1992; GREENE, 2006). Pela anlise da dosagem de creatinina srica, pode-se afirmar que no houve leso renal aguda nos animais tratados com ribavirina. No entanto, as alteraes na dosagem de uria srica, demonstraram no primeiro momento e no dcimo segundo dia de tratamento uma elevao dos valores, sugerindo processos de desidratao encontrado nos animais dos grupos 1, 2 e 5, principalmente. Assim, os dados encontrados concordam com a literatura. As dosagens bioqumicas de funo heptica (ALT, FA e GGT) no apresentaram resultados significativos clinicamente entre os grupos. Estes

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resultados demonstram que a ribavirina e o DMSO no exercem efeitos hepatotxicos, apesar da metabolizao ocorrer no fgado, como descrito por Hayden & Douglas (1990) e Paes (1999), respectivamente. No grupo 5 foi encontrado um animal com aumento das enzimas hepticas, caracterizando uma leso heptica no ltimo dia de tratamento. Este animal apresentou valores de ALT, FA e GGT altas, com 3317 UI/L, 2694 UI/L e 329 UI/L respectivamente, todas no ltimo dia de tratamento. Mesmo com as enzimas hepticas altas, o animal ainda assim apresentava funo heptica no comprometida por manter normal o valor de albumina srica. Segundo Greene (2006), a elevao das globulinas plasmticas frequente em vrias reaes inflamatrias e, em particular, o componente alfa2, que aumenta significativamente nas infeces bacterianas e vricas, notadamente na cinomose. Assim como descrito por Mangia (2008) houve aumento das protenas sricas dos G1 e G2, e no presente estudo houve uma queda em todos os grupos experimentais na dosagem de protena srica a partir do dcimo dia de tratamento. Com relao a frao de albumina srica, foi possvel verificar que as medianas esto mais prximas dos valores mais baixos de referncia (MEYER et al., 1995) no primeiro dia. Apenas o grupo 6 apresentou mediana abaixo de 2,7 g/dL, portanto a maioria dos animais deste grupo no mostrou leso heptica nas outras dosagens bioqumicas, indicando que a hipoalbuminemia encontrada pode estar relacionada com a presso onctica do sangue, onde h uma diminuio na produo de albumina para compensar a hiperglobulinemia. Na dosagem de globulinas sricas, o G6 apresentou valores normais de globulinas, ento a hipoalbuminemia pode estar relacionada com alguns animais que apresentavam anorexia. Os outros grupos experimentais apresentaram valores acima do normal para ces, demonstrando hiperglobulinemia at o dcimo dia de tratamento, como descrito na literatura. Os grupos 5 e 6 mostraram uma queda mais acentuada dos valores de globulinas no dcimo quinto dia, sendo que estes animais receberam a prednisona, que possui efeito antinflamatrio, j que a presena de hiperglobulinemia em ces com cinomose pode representar o aumento de imunoglobulinas produzidas frente a presena do vrus. Quando comparadas as curvas dos resultados de globulina e albumina srica permitem afirmar que houve uma compensao das duas dosagens demonstrando que a diminuio da frao albumina est relacionada com a presso onctica dentro dos vasos sanguneos por causa da hiperglobulinemia produzida a partir da infeco viral. Os dados do exame de urina do tipo I mostram que os animais desenvolveram cistite, tanto no primeiro momento quanto durante o tratamento. Este exame teve como principal objetivo identificar presena de leso renal e heptica agudas. Apenas os grupos 2, 5 e 6 apresentaram valores altos da concentrao de protenas na urina de alguns ces no dcimo quinto dia de tratamento, podendo significar uma leso renal aguda, onde ainda no houve aumento das dosagens de uria e creatinina. Sabe-se que cerca de 40% da ribavirina excretada pelos rins aps 72 horas da administrao, e o metabolismo heptico uma rota importante para sua eliminao (HAYDEN & DOUGLAS, 1990). Portanto, o uso associado com outras drogas como o DMSO e a prednisona pode ter levado a uma leso renal de alguns ces no ltimo dia de tratamento. Para concluir este dado seria

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necessrio o estudo destes animais por perodo mais longo, avaliando a funo renal aps cessar a administrao da droga, o que no ocorreu na presente pesquisa. Com relao funo heptica, no dcimo dia de tratamento dos animais do G1 foi possvel detectar a presena de traos de bilirrubina na urina na maior parte deles. A ribavirina administrada sistemicamente, em altas doses, pode causar efeitos indesejveis, como anemia por hemlise extravascular e aumento de bilirrubina no soro, os quais so reversveis quando cessada a administrao da droga (BEAN, 1992; TAKAHASHI et al., 1998; HOSOYA et al., 2001). Assim, pode-se sugerir que a presena de bilirrubina possa ser consequncia da hemlise causada pela ribavirina e no necessariamente por uma leso heptica. Da mesma forma aconteceu no dcimo quinto dia de tratamento, um aumento da quantidade de bilirrubina na urina em todos os grupos, sendo que o G5 foi o que apresentou a maior dosagem de bilirrubina na urina. Outra hiptese para estes achados seriam indcios de uma sobrecarga do sistema hepatobiliar destes ces, na dose e intervalo entre doses da ribavirina utilizada na pesquisa. No entanto, nenhuma das amostras de urina apresentou positividade para a presena de sais biliares na urina nos grupos experimentais e em nenhum dos momentos, o que diminui as chances que seja uma alterao no sistema hepatobiliar. Pelo sedimento urinrio foi possvel detectar a presena de cistite, mesmo que branda nos animais dos grupos 5 e 6, j que foram encontrados leuccitos, hemcias e bactrias. No primeiro momento de colheita de material a presena de cistite pode estar relacionada com o carter imunossupressor da enfermidade. Segundo Moro & Vasconcelos (1998) a causa da linfopenia em animais infectados pelo vrus da cinomose ocorre provavelmente devido a habilidade do vrus em se replicar e destruir os tecidos linfides. A replicao viral causa extenso perodo de imunossupresso, durante o qual podem ocorrer infeces oportunistas que agravam o quadro clnico. Alm da imunossupresso causada pelo vrus, os animais destes grupos so os mais jovens, o que pode estar relacionado tambm pela imaturidade do sistema imune. Provavelmente por este motivo, estes animais apresentaram alteraes de infeco e inflamao da vescula urinria todo o perodo de tratamento. A anlise do lquor um dos melhores mtodos de diagnstico das afeces do encfalo e da medula espinhal. O exame do lquor est indicado em todo paciente com doena neurolgica, na qual no h diagnstico bvio, incluindo casos com suspeita de afeco intracraniana (PELLEGRINO et al., 2003). No presente estudo e de Mangia (2008), o processo inflamatrio no SNC foi confirmado pelo exame do lquor dos ces com encefalite pela cinomose, antes e aps o tratamento experimental. Segundo Gama et al. (2005), as caractersticas fsico-qumicas do lquor tais como colorao, aspecto, densidade, pH e glicose, no foram capazes de contribuir para indicar qualquer anormalidade liqurica nas diferentes fases da cinomose. Por outro lado, o componente protico e a celularidade mostraram alteraes importantes na presena de sinais neurolgicos, porm na ausncia destes no adicionam informaes capazes de levar a deteco precoce de leses do SNC em colaborao ao diagnstico da referida enfermidade. De

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acordo com os autores, na atual pesquisa as caractersticas citadas no contriburam para a identificao do processo inflamatrio causado pelo vrus da cinomose. Segundo alguns autores, no estgio crnico com a inflamao ocorre aumento de protena (acima de 25 mg/dL), principalmente representado por IgG antivrus e aumento de clulas (mais que 10 clulas/ L, com predomnio de linfcitos (CORRA & CORRA, 1992; TIPOLD, et al., 1992; SUMMERS et al., 1995; GREENE, 2006). Portanto, possvel afirmar que a maior parte dos animais encontravam-se na fase crnica da enfermidade, j que todos os grupos apresentaram medianas para dosagem de protenas no primeiro momento acima de 25 mg/dL. O G3 foi o grupo que apresentou menor valor de mediana da dosagem de protenas no lquor aps o tratamento experimental, porm os valores variaram muito. Sendo que os valores mximos encontrados nos diferentes grupos experimentais mostraram que em todos os grupos houve uma diminuio, porm nos grupos 3 e 5 houve um aumento, mesmo sendo estes grupos tratados com antinflamatrios. Apenas os grupos 4 e 5 apresentaram elevao da quantidade de protena aps o tratamento, sendo que nestes grupos foi utilizada a prednisona na sua dose imunossupressora. Desta forma, a prednisona no foi capaz de diminuir o processo inflamatrio como desejado j que houve aumento dos valores de protena no lquor dos animais tratados. O G6 tambm foi tratado com a prednisona, porm com doses menores e apresentou diminuio dos valores de protena no lquor. Assim, pode-se afirmar que a prednisona em doses antinflamatrias foi capaz de reduzir a quantidade de protena no lquor, enquanto que quando administrada em doses imunossupressoras houve aumento desses valores. A literatura explica que no sistema nervoso, a administrao crnica de glicocorticides ou o estresse no so uniformemente antinflamatrios e em algumas circunstncias agem aumentando o processo inflamatrio, que foi identificado pelo aumento da migrao de clulas inflamatrias, pelo nvel de mediadores inflamatrios e pela ativao do fator de transcrio. No sistema nervoso lesado, nveis de estresse do glicocorticide podem induzir uma resposta pr-inflamatria, e que em nveis basais ou de baixo estresse possuem um efeito tradicional antinflamatrio (SORRELLS & SAPOLSKY, 2007). Os autores ainda afirmam que o uso de glicocorticides para leses no SNC pode ser deletrio, porm estes efeitos so compensados pela diminuio da inflamao pela administrao crnica. Os efeitos benficos para o processo inflamatrio acontecem pelo bloqueio dos receptores de TNF- e pela inibio da proliferao de astrcitos no local da morte de neurnios. O fato que altas concentraes de glicocorticides aumentam a extenso da neurotoxicidade e da resposta inflamatria nos locais lesados (SORRELLS & SAPOLSKY, 2007). O aumento de anticorpos antivrus no lquor oferece evidncia da encefalite pela cinomose, pois estes anticorpos so produzidos no local, e o aumento no encontrado em animais vacinados ou na cinomose sistmica sem alteraes neurolgicas (GREENE, 2006). Para avaliar a produo de imunoglobulinas inespecficas no lquor dos animais da pesquisa foi utilizado o teste de Pandy. Sendo que, no primeiro momento a maior parte dos animais no apresentou

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reao no teste de Pandy. Aps 15 dias de tratamento apenas com o DMSO, o G3 apresentou uma cruz de turbidez no teste. Pelo teste de Pandy, pode-se identificar o efeito dos tratamentos experimentais, j que aps o tratamento apenas os animais do grupo controle que apresentaram mediana e percentil 75 com turbidez no teste de Pandy. Feitosa et al. (1997) encontraram positividade no teste de Pandy em todos os animais estudados com cinomose, sendo possvel constatar que aqueles animais com nveis proticos totais elevados apresentavam tambm maior turbidez no teste e uma maior porcentagem de plasmcitos, sugerindo que o aumento dos nveis proticos ocorreu por uma produo local de anticorpos e no por uma leso na barreira hematoenceflica. Em casos de cinomose a pleocitose ocorre predominantemente por um aumento de linfcitos, havendo tambm a presena de moncitos, macrfagos e raros neutrfilos (FEITOSA et al., 1997). Por isso no houve relevncia dos resultados encontrados na contagem de hemcias no lquor dos animais includos na pesquisa, demonstrando que em todos os grupos houve pelo menos um animal que teve seu lquor contaminado com sangue perifrico durante a colheita de material. Gama et al. (2005) encontraram 50% dos animais infectados e com sintomatologia neurolgica apresentando pleocitose, com mais de oito clulas/L. A ausncia de clulas no lquor, em ces com cinomose e sinais nervosos, est associada a estgios iniciais e agudos desta enfermidade. Feitosa et al. (1997) afirmam a ocorrncia de pleocitose em ces com cinomose e a contagem de clulas nucleadas variou de 19 a 400 clulas/ L. No presente estudo foi encontrada variao de zero a 8775 clulas/L no lquor dos animais no primeiro momento, antes do tratamento experimental. Outros autores consideram pleocitose quando h aumento de clulas nucleadas acima de 10 clulas/ L, o que foi estabelecido no presente estudo (GREENE, 2006). Desta forma, os grupos 5 e 6 apresentavam valores de medianas dentro da normalidade no incio do tratamento, demonstrando que o processo inflamatrio nesses animais foi agudo. No entanto, o G1 apresentou maior mediana para clulas nucleadas, seguido do G2, sendo considerado como processo crnico na patogenia da cinomose. O G3 foi tratado apenas com DMSO e serviu como grupo controle em relao ao processo inflamatrio nos outros grupos, j que no apresentou queda desta contagem, diferente do que foi encontrado nos outros grupos. Como mecanismo de ao do DMSO a literatura descreve que possui efeitos neuroprotetores em ratos em diferentes doses quando administrado antes e depois da isquemia. Os autores mostraram que houve atenuao na destruio da barreira hematoenceflica tambm. A ao ocorre frente a formao de radicais livres de oxignio locais sem fagocitose, de forma que o DMSO diminui o estresse oxidativo dos tecidos (NAGEL et al., 2007). J Farkas et al. (2004) observaram que o mesmo capaz de prevenir a produo da cicloxigenase-2 e a perda de neurnios. Alm disso, o DMSO pode apresentar efeitos na funo neurocondutora (ALI, 2001). Tsvyetlynska et al. (2005) sugerem que o DMSO age na transmisso sinptica do glutamato na medula espinhal, auxiliando na locomoo dos animais. Pela literatura verificou-se que o DMSO no age na proliferao de clulas e na liberao de citocinas quimiotxicas, esperando-se que no presente estudo no houvesse

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interveno do DMSO no nmero de clulas nucleadas no lquor dos animais afetados. Assim, pode-se afirmar que o G2 apresentou queda nos valores da contagem de clulas nucleadas no lquor no segundo momento, provavelmente por uma ao apenas da ribavirina. O G4 apenas tratado com prednisona foi o que apresentou maior queda desses valores, porm foi o grupo com menor nmero de animais com melhora clnica. O G5 tambm teve o mesmo comportamento com relao a contagem de clulas, e recebeu a mesma dose de prednisona, entretanto, associada ribavirina. Destaca-se que neste grupo ocorreu a segunda melhor resposta para melhora clnica. A partir destes dados foi possvel verificar que a prednisona na sua dose imunossupressora levou ao aumento da dosagem de protenas e uma diminuio da contagem de clulas nucleadas no lquor. Sugere-se que a prednisona faa uma imunomodulao nessa dose em ces e no uma potente ao antinflamatria. Pela literatura existente pode-se afirmar que os glicocorticides so reconhecidos por inibir a proliferao de linfcitos T e a produo de uma variedade de citocinas, incluindo interferon alfa. A IL-7 age mantendo a populao policlonal de linfcitos T imaturos e as clulas T de memria, e, portanto, controla o estoque de clulas T (TALAYEV et al., 2005). Ao mesmo tempo Feitosa et al. (1997) afirmam que os altos nveis de protenas no lquor so encontrados em animais com cinomose com uma porcentagem maior de plasmcitos, uma vez que todos os animais estudados se encontravam com alteraes neurolgicas h mais de 10 dias e sugerem que, alm da produo de anticorpos contra o vrus, a desmielinizao j estivesse ocorrendo por uma resposta imune e no por uma ao viral direta, levando tambm produo de anticorpos contra a bainha de mielina. Assim, a prednisona provavelmente age na populao de linfcitos T, enquanto os plasmcitos encontrados no lquor causam o aumento de protenas sob ao do mesmo glicocorticide. A pleocitose do lquor nas encefalites virais caracterizada por apresentar mais que 60% de linfcitos, mas tambm pode ser encontrada na meningoencefalomielite granulomatosa e na encefalite bacteriana tratada com antimicrobianos (CHRISMAN, 1992). Na cinomose, Feitosa et al. (1997) afirmam que a pleocitose ocorre predominantemente por um aumento de linfcitos, havendo tambm a presena de moncitos, macrfagos e raros neutrfilos. Todos os grupos do estudo apresentaram medianas acima de 60% de linfcitos no primeiro momento, exceto o G4. Ao mesmo tempo, o G4 foi o grupo que apresentou maior valor relativo e absoluto de linfcitos no lquor. Aps o tratamento experimental, o G1 apresentou 93% de linfcitos e o G6 apenas 12%, que apresentou resultado significativo estatisticamente. Apesar desta diferena houve uma queda na mediana dos valores absolutos de linfcitos em todos os grupos, exceto no G3 onde os animais foram tratados apenas com DMSO. Apesar da ausncia de manguitos perivasculares, numerosas clulas CD8+ so encontradas nas leses agudas desmielinizantes e tambm distribudas difusamente no parnquima cerebral, correlacionando de forma desigual com reas de infeco viral. No lquor destes animais altos ttulos de IL-8 foram encontrados, isto sugere que a ativao inicial das clulas da

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micrglia serve como iniciadora para a invaso de clulas T no SNC (VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005). Nos grupos 1, 2 e 3, que no receberam prednisona houve aumento dos valores mnimos, ou seja, nestes grupos os animais passaram a apresentar maior semelhana de valores, diminuindo a diferena entre o mximo e o mnimo, significando que a presena de linfcitos no lquor ficou mais constante, mesmo que em valores menores. Assim como Mangia (2008) relatou, a presena de linfcitos no lquor, mesmo aps o tratamento, pode significar uma resposta a essa produo de citocinas, desencadeada na presena do antgeno viral, que induz a migrao de mais clulas e podem manter a inflamao no SNC, resultando em resposta imunomediada, conforme descrito por Wnschmann et al. (1999) e Markus et al. (2002). Para confirmar o que foi sugerido anteriormente, as medianas da contagem de linfcitos dos grupos 4, 5 e 6 quase chegaram a zero aps o tratamento, sendo que estes grupos foram tratados com prednisona. Em todos os grupos tratados com ribavirina tambm foi possvel identificar uma queda nesses valores, mas a presena do antinflamatrio fez grande diferena tanto nos valores de celularidade quanto no nmero de linfcitos. Com relao s clulas mononucleares, foi encontrada uma queda dos valores relativos do primeiro dia em relao ao ltimo dia de tratamento em todos os grupos, exceto no G5 que apresentou um aumento. As medianas dos valores absolutos tambm apresentaram diminuio entre os dois momentos em todos os grupos. Como descrito na literatura, as outras clulas encontradas no lquor no ultrapassaram 10% da celularidade liqurica. Somente o G4 apresentou valores altos deste tipo celular que somado aos outros resultados sugere que houve contaminao pelo sangue perifrico. As alteraes encontradas neste tipo celular aps o tratamento mostraram apenas contaminaes do lquor com sangue durante a colheita de material. Atualmente, a tcnica da reao em cadeia pela polimerase precedida de transcrio reversa (RT-PCR) vem sendo empregada com sucesso na deteco do vrus da cinomose em diferentes tipos de amostras biolgicas provenientes de ces com sinais clnicos sistmicos e neurolgicos (BARRETT, 1999; GEBARA et al., 2004). Os resultados demonstraram que a tcnica de RT-PCR um mtodo eficiente para realizao do diagnstico rpido, precoce e in vivo (FRISK et al., 1999; SATO et al., 2006; SAITO et al., 2006; ELIA et al., 2008). Foram realizadas 308 reaes da RT-PCR, sendo que 130 (42,2%) foram positivas. Foram realizadas 178 reaes da hn-PCR e 102 (57,3%) foram positivas. Assim, das 308 amostras analisadas, 232 (75,32%) foram positivas. A degradao autoltica do RNA viral causada por RNAses endgenas pode ser considerada nos casos de resultado falso-negativo (FRISK et al., 1999). No entanto, Saito et al. (2006) afirmam que o soro e o sangue perifrico no so amostras boas para a deteco do vrus da cinomose pela RT-PCR, quando o co apresenta apenas distrbios neurolgicos sem envolvimento sistmico da doena. A baixa celularidade do lquor pode ser insufuciente para a preparao da amostra, que pode causar um inadequado isolamento do RNA viral. Assim, sugere-se que parte das amostras que ficaram armazenadas durante quatro anos, mesmo que em frascos adequados e no freezer -80C

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possam ter sofrido com a degradao autoltica de RNAses endgenas mais do que as amostras colhidas recentemente. Ao mesmo tempo, os animais apresentaram diminuio da celularidade liqurica aps o tratamento, diminuindo as chances de encontrar o RNA viral nas amostras. Por isso, a pesquisa teve 75,32% de amostras positivas, j que a tcnica tem alta sensibilidade e especificidade. Segundo Amaral (2007) os iniciadores utilizados foram capazes de amplificar o produto de 440 pb na RT-PCR e na hn-PCR um produto de 331 pb, como na presente pesquisa. Encontrou uma frequncia de 43 positivos na hnPCR das 50 amostras testadas, sendo que o maior nmero ocorreu nos casos de secrees genitais, seguido de urina, secreo ocular e clulas brancas do sangue perifrico. Segundo Frisk et al. (1999) foi encontrado o RNA viral pelo RT-PCR em 86% das amostras de soro sanguneo e 88% de sangue circulante e lquor de ces com cinomose confirmada pela imunoistoqumica do SNC. Kim et al. (2006) afirmam que amostras incluindo sangue perifrico, secreo conjuntival, nasal, urina, lquor, e secreo vaginal, tecidos pulmonares, estomacais, intestinais e urinrio podem ser utilizados para o diagnstico de cinomose pela tcnica RT-PCR. Entretanto, secreo conjuntival a mais apropriada para o diagnstico precoce da cinomose. A presente pesquisa, 95% das amostras de sangue perifrico foram positivas, concordando com os resultados de Frisk et al. (1999). A medula ssea foi a segunda amostra que apresentou maior positividade (90%), seguida do lquor que apresentou 53,3% de positividade, concordando com os resultados encontrados na literatura. Aps o tratamento, houve um aumento das amostras positivas de sangue (97,7%) e diminuiu as amostras positivas do lquor (27,3%). A diminuio da positividade das amostras de lquor pode estar relacionada diretamente com a diminuio da celularidade do lquor, consequente da diminuio do processo inflamatrio no SNC promovido pelas drogas experimentais. Amaral (2007) e outros autores (FRISK et al., 1999; SHIN et al., 2004) observaram que a associao de colheita de diferentes amostras biolgicas por animal aumentou o nmero de resultados positivos. Como foi realizado na presente pesquisa, onde se encontrou positividade em todos os animais antes e aps o tratamento experimental. Alm disso, nos animais do presente estudo, seria indicado o uso do sangue e medula ssea como melhores amostras para o diagnstico da cinomose. Amude et al. (2006) obtiveram resultados negativos de urina e lquor de ces com sintomatologia, exclusivamente neurolgica, com diagnstico de cinomose confirmado pela PCR e pela presena de leses histopatolgicas caractersticas no SNC. Este achado pode explicar porque 100% dos animais do G3 apresentaram resultado negativo no lquor aps o perodo de tratamento. Com relao a presena de bandas inespecficas encontradas na presente pesquisa, pelos dados de Amaral (2007), autora que desenhou os iniciadores utilizados, no ocorreu a formao destas bandas no seu estudo, sugerindo que as bandas encontradas tenham surgido em funo do mtodo de extrao utilizado, que foi diferente ao adotado pela referida pesquisadora, que obteve a mesma sensibilidade analtica para a Nested-PCR. Shin et al. (2004) levantaram a hiptese de utilizao da nested-PCR para diagnstico da cinomose. A efetividade da tcnica foi demonstrada em

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amostras clnicas incluindo sangue, urina, swab nasal e saliva. Sendo um mtodo ideal para deteco do vrus da cinomose em amostras clnicas, apresentou alta sensibilidade e consistncia no desempenho laboratorial. Comparativamente ao RT-PCR, mostrou positividade relevante em todas as amostras testadas (JZWIK & FRIMUS, 2005). RT-PCR combinada com o nested-PCR mostrou-se mais especfica e sensvel para o diagnstico ante-mortem da cinomose, especialmente nas formas subagudas e crnicas, quando o vrus no se encontra mais em epitlios e a reao de imunofluorescncia negativa (JZWIK & FRIMUS, 2005). Na atual pesquisa confirmou-se a necessidade da realizao da hn-PCR porque das 178 amostras negativas na RT-PCR, 57,3% foram positivas na hnPCR. Sendo que das 178 amostras, 89 eram de lquor, 47 de sangue e 42 de medula ssea. Quando analisa-se os resultados da hn-PCR em relao ao tratamento experimental utilizado, verifica-se que houve aumento dos valores percentuais de positividade na hn-PCR no G4, diferente do que ocorreu em todos os outros grupos que apresentaram diminuio destes valores. O G4 um dos grupos controle e no recebeu antiviral, somente a prednisona em dose imunossupressora, assim sugere que este tratamento no foi capaz de combater o vrus e diminuir sua distribuio no organismo. No entanto, o G3 tambm um grupo controle, ou seja, os animais no receberam o tratamento antiviral, e apresentou maior queda dos valores percentuais dos resultados positivos, demonstrando que este deveria ser um resultado esperado na patogenia da cinomose. Portanto, o que foi possvel verificar que os grupos tratados tiveram uma queda, mas que no foi acentuada como no G3. Considerado um ensaio clnico, o presente estudo apresentou algumas limitaes, como o nmero de animais em cada grupo experimental, dificultando nas anlises estatsticas quando comparadas nos diferentes grupos. O experimento s foi realizado em animais que apresentavam at 10 dias de evoluo clnica e, portanto, no pode-se afirmar sobre seu uso em animais com maior tempo de evoluo clnica neurolgica. O estudo s foi realizado em animais com at seis anos de idade, da mesma forma no se sabe se em animais mais velhos a ribavirina teria outros efeitos ou apresentaria efeitos colaterais, como descritos em humanos, com leses hepticas e renais. As limitaes da metodologia de biologia molecular que para afirmar a verdadeira eficcia da ribavirina o uso da PCR em tempo real poderia nos informar com relao ao nmero de partculas virais. Este mtodo no foi empregado pela dificuldade de financiamento para tais tcnicas moleculares. A metodologia clnica ficou limitada por no apresentar tcnicas de mensurao do processo inflamatrio completo no lquor dos animais, como o estudo de citocinas pr e inflamatrias. Junto com o estudo clnico, outros trabalhos com estudo da biodisponibilidade da ribavirina em ces poderiam informar sobre sua concentrao lqurica em animais com encefalite pela cinomose. Estes estudos poderiam informar a correta dose e intervalo entre doses mais indicado para utilizao da ribavirina em ces. O perodo de utilizao da droga e o surgimento de efeitos colaterais tambm devem ser pesquisados, pois que o atual estudo s utilizou a droga durante 15 dias. A utilizao de outras

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dosagens da ribavirina e em ces no somente com sintomatologia neurolgica, devem ser estudadas. Enfatiza-se ainda a importncia de pesquisas que avaliem o desenvolvimento de vrus da cinomose mutantes em animais tratados com ribavirina, a partir do sequenciamento gentico viral, aps a utilizao destes medicamentos.

Concluses
1. Gerais: x O melhor tratamento foi o G2; seguido do G1, sendo que deste grupo seis animais apresentaram melhora clnica; depois G5, sendo que deste grupo cinco animais apresentaram melhora e G3 com trs animais que apresentaram melhora clnica. Os outros grupos de tratamento apresentaram baixos ndices de sobrevida e melhora no sendo suficiente para estabelecimento do protocolo de tratamento.

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2. Especficos: x As principais alteraes hematolgicas encontradas foram anemia, trombocitopenia, linfopenia absoluta e em menor frequncia moncitos ativados, corpsculo de incluso e linfcitos reativos. As principais alteraes liquricas foram hiperproteinorraquia e pleocitose linfoctica. x x O principal efeito adverso da ribavirina foi a anemia por hemlise. A ribavirina ainda impediu o aumento dos valores de linfcitos sanguneos. Os efeitos adversos da prednisona na dose imunossupressora apresentou aumento da dosagem de protena no lquor e de leuccitos no sangue perifrico. x x x O DMSO no apresentou efeitos colaterais nas doses utilizadas. O efeito colateral mais grave da associao dos frmacos foi a anemia nos grupos que receberam ribavirina e prednisona. O efeito antinflamatrio no SNC do DMSO no foi identificado. A prednisona causou aumento de protena e diminuio da celularidade no lquor nos animais tratados com doses imunossupressoras. Com doses antinflamatrias, ela levou a diminuio da concentrao de protena e no foi possvel identificar o efeito sobre a celularidade do lquor. x Os animais que tiveram maiores ndices de melhora clnica

apresentavam vacinao sem orientao do mdico veterinrio, com aproximadamente 24 meses de idade, sinais gastroentricos, com trs tipos de sinais neurolgicos, dos sinais neurolgicos as alteraes em nervos cranianos apresentaram maior frequncia nos animais que sobreviveram ou melhoraram. x Antes do tratamento, o vrus da cinomose foi encontrado em 95% das amostras de sangue, 90% das medulas sseas e 53,3% de lquor. Aps o tratamento experimental a frequncia do vrus foi de 97,7% nas amostras de sangue, 86,4% nas amostras de medula ssea e 27,3% nas amostras de lquor.

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Trabalho a ser enviado para Pesquisa Veterinria Brasileira: Efeitos colaterais do uso da ribavirina, prednisona e DMSO em ces naturalmente infectados pelo vrus da cinomose. The side effects of ribavirin, prednisone and DMSO in dogs naturally infected by canine distemper virus 1 MANGIA, S. H. ; MORAES, L. F.2; TAKAHIRA R. K.3; RODRIGO R. G.4; SALCEDO, E. S.5; MEGID, J.6; SILVA, A. V.7; PAES, A. C.8

ABSTRACT [The side effects of ribavirin, prednisone and DMSO in dogs naturally infected by canine distemper virus.] The present study aims at the identification of undesirable effects of ribavirin, predinisone and DMSO in dogs naturally infected by canine distemper vrus. The research analyzed 60 dogs with clinical neurological signs and 10 days of evolution. The animals were hospitalized for the appropriate support treatment; were daily observed, and complete blood cells count, biochemical analysis, and urine exam type I were conducted. Groups 1 and 2 were treated with ribavirin and its combination with DMSO; Groups 3 and 4 treated with prednisone and DMSO, Group 5 treated with ribavirin and prednisone, while Group 6 with ribavirin, prednisone and DMSO. The animals were anesthetized for the cerebrospinal fluid, bone marrow and blood samples collection before the treatment for the diagnose based on RT-PCR. The negative samples were analyzed using the hn-PCR technique. All
Autor para correspondncia. Departamento de Higiene Veterinria e Sade Pblica, FMVZ, UNESP/Botucatu. End: Rubio Jnior, s/n Botucatu, SP. CEP: 18.618-000, Caixa Postal: 560. E-mail: simangia@hotmail.com 2 Departamento de Clnica Veterinria, FMVZ, UNESP/Botucatu. E-mail: liviafm@gmail.com 3 Departamento de Clnica Veterinria, FMVZ, UNESP/Botucatu. E-mail: takahira@fmvz.unesp.br 4 Departamento de Higiene Veterinria e Sade Pblica, FMVZ, UNESP/Botucatu. E-mail: rgmotta@fmvz.unesp.br 5 Departamento de Clnica Veterinria, FMVZ, UNESP/Botucatu. E-mail: soteloedu@gmail.com 6 Departamento de Higiene Veterinria e Sade Pblica, FMVZ, UNESP/Botucatu. E-mail: jane@fmvz.unesp.br 7 Grupo de pesquisa em parasitologia, Laboratrio de Anlises Clnicas e Parasitologia, Departamento de Cincias Biolgicas, Universidade Estadual de Feira de Santana, BA. E-mail: aristeusilva@gmail.com 8 Departamento de Higiene Veterinria e Sade Pblica, FMVZ, UNESP/Botucatu. E-mail: paesacmi@fmvz.unesp.br
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the animals presented positive results in at least one of the 2 tests. The adverse result of ribavirin and its association with prednisone was characterized by haemolytic anemia, confirmed by the evaluation of bilirrubin occurrence only in the urine of dogs treated with ribavirin. Prednisones immunosuppressive dose led to the increase of protein dosage and leukocytes blood count, while CSFs cellularity decreased. The anti-inflammatory dose led to the blood protein concentrations decrease. INEDX TERMS: Canine Distemper, Ribavirin, DMSO, Prednisone, undesirable effects. RESUMO [Efeitos colaterais do uso da ribavirina, prednisona e DMSO em ces naturalmente infectados pelo vrus da cinomose.] O estudo tem o objetivo de identificar efeitos indesejveis da ribavirina, prednisona e DMSO em ces naturalmente infectados com o vrus da cinomose. Foram utilizados 60 ces apresentando quadro neurolgico da cinomose com evoluo de 10 dias. Os animais foram internados e receberam tratamento de suporte; foram avaliados diariamente e realizados hemograma, dosagem bioqumica e exame de urina tipo I. Os grupos 1 e 2 foram tratados com ribavirina e sua associao com DMSO; os grupos 3 e 4 com DMSO e prednisona e o grupos 5 com ribavirina e prednisona e o grupo 6 com ribavirina, prednisona e DMSO. Os animais foram anestesiados para a colheita de lquor, medula ssea e sangue, antes do tratamento para diagnstico atravs da RT-PCR. As amostras negativas foram analisadas pela tcnica de hn-PCR. Todos os animais apresentaram resultado positivo em pelo menos uma das duas reaes. O efeito adverso da ribavirina e a sua associao com a prednisona foi a anemia hemoltica, que foi confirmada pela observao de bilirrubina na urina apenas dos ces tratados com ribavirina. A prednisona na dose imunossupressora levou ao aumento da dosagem de protena e diminuio da celularidade no lquor, aumento de leuccitos no sangue e a dose antinflamatria levou a diminuio da concentrao de protena no lquor.

TERMOS DE INDEXAO: Cinomose, ribavirina, prednisona, DMSO, efeitos indesejveis.

INTRODUO A cinomose uma doena viral muito antiga que afeta ces e outros carnvoros em todo o mundo. Entretanto, mesmo com uso de estratgias vacinais, ela ainda uma doena importante na populao canina, apresentando a maior taxa de mortalidade depois da raiva (Summers & Appel 1994). A cinomose uma enfermidade infectocontagiosa, causada por um RNA vrus da ordem Mononegavirales, famlia Paramyxovirus, gnero Morbillivirus. Possui trs formas de apresentao clnica: aguda, subaguda e crnica, com manifestaes gastroentricas, respiratrias e neurolgicas. So descritas

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basicamente trs formas de encefalite causada pelo vrus da cinomose: encefalite dos ces jovens, encefalite em ces adultos e encefalite do co velho (Corra & Corra 1992). Embora a vacinao contra a cinomose venha sendo utilizada amplamente por vrias dcadas, a doena ainda importante e surtos foram recentemente relatados em vrios pases, como Dinamarca, Estados Unidos, Japo, Finlndia e Alemanha (Jzwik & Frymus 2005, Vandevelde & Zurbriggen 2005). No Brasil, alguns relatos clnico-patolgicos e sorolgicos indicam a elevada presena da infeco na populao canina (Headley & Graa 2000, Silva et al. 2004). Alguns fatores como a persistncia do vrus no ambiente e em animais portadores, o aparecimento de novas cepas e o desenvolvimento de infeco e doena mesmo em animais vacinados tm contribudo para a manuteno do carter enzotico da virose com ocorrncia ocasional de surtos (Bhm et al. 2004). A ribavirina uma droga antiviral, anloga guanosina, inibidora da replicao in vitro de alguns RNA e DNA-vrus, incluindo Herpesvirus, Poxvirus, Influenza vrus, Parainfluenza vrus, Reovirus, Togavirus, Paramyxovirus e Tumor RNA-vrus. In vivo, o espectro antiviral restrito, com ao contra Herpesvirus, Influenza, Parainfluenza , Paramyxovirus do Sarampo e Adenovirus (Hayden & Douglas 1990). No experimento de Elia et al. (2008) a ribavirina mostrou-se altamente efetiva na preveno da replicao do vrus da cinomose in vitro em baixas concentraes, de aproximadamente 6,5-12,5 g/mL, concordando com os valores encontrados para a inibio do vrus do sarampo. Segundo Elia et al. (2008) a ribavirina causa mutaes no vrus da cinomose e estas levam a um erro catastrfico no RNA do genoma viral. Pode ser especulado que a ribavirina interfira com a RNA polimerase pela competio com nucleosdeos naturais e produz erro na terminao da cadeia do vrus. A aplicao clnica da ribavirina mostra restries devido a alguns efeitos adversos, especialmente induo de anemia hemoltica. O acmulo dos fosfatos da droga em eritrcitos leva a anemia, que pode ser causa para descontinuao do tratamento (Wu et al. 2005). A severidade da anemia mais grave em macacos, a seguir em humanos, roedores e ces (Lin et al. 2003). A anemia ocorre em 30% dos casos tratados e resulta em 9% a 22% de pacientes que necessitam a reduo da dose para continuar o tratamento. A ocorrncia de anemia est relacionada com a dose de ribavirina, funo renal e a idade do paciente (Sung et al. 2011). Mangia (2008) pela primeira vez testou o uso da ribavirina em ces naturalmente infectados com o vrus da cinomose. Todos os animais apresentavam a fase neurolgica de doena e foram tratados com 30 mg/Kg de ribavirina por via oral, a cada 24 horas, durante 15 dias. Nenhum animal apresentou sinais de efeitos colaterais como descrito na teraputica humana com a mesma droga.

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Mangia et al. (2011) demonstraram a eficcia do tratamento com ribavirina na dose de 30 mg/Kg, por via oral, a cada 24 horas, durante 15 dias em um caso com encefalite aguda pelo vrus da cinomose, quando associada ao DMSO na dose de 1 g/Kg, por via intravenosa, a cada 24 horas. Os glicocorticides so os reguladores mais estudados do sistema neuroendcrino e so reconhecidos por inibir a proliferao de linfcitos T e a produo de uma variedade de citosinas, incluindo interferon- (IFN). A interleucina-7 (IL-7) age mantendo a populao policlonal de linfcitos T imaturos e as clulas T de memria, e, portanto, controla o tamanho do estoque de clulas T (Talayev et al. 2005). Na pesquisa de Van den Brandt et al. (2007), os glicocorticides mostraram induzir clulas CD8 a formarem linfcitos T CD4+ e causaram apoptose de timcitos, mas mantendo ainda as clulas T maduras do sangue perifrico mimetizando uma proliferao hemosttica. No trabalho de reviso de Sorrells & Sapolsky (2007), os autores concluram que em ambos os sistemas, nervoso e imune perifrico, a exposio prvia ao estresse ou ao glicocorticide pode resultar na produo de uma resposta imune a uma subsequente inflamao. No sistema nervoso, a administrao crnica de glicocorticides ou o estresse no so uniformemente anitinflamatrios e em algumas circunstncias agem aumentando o processo inflamatrio; assim foi observado pelo aumento da migrao de clulas inflamatrias, pelo nvel de mediadores inflamatrios e pela ativao do fator de transcrio. No sistema nervoso lesado, nveis de estresse do glicocorticide podem induzir uma resposta pr-inflamatria e em nveis basais ou de baixo estresse possuem um efeito tradicional antinflamatrio; esta resposta oposta encontrada no sistema imune perifrico. Outra concluso encontrada na pesquisa foi que os efeitos pr-inflamatrios no crebro so diferentes conforme a regio, o uso de sintticos versus glicocorticides endgenos e o tempo de exposio ao glicocorticide no que diz respeito a resposta inflamatria. A solubilizao de nucleotdeos em solventes orgnicos importante para a entrada de drogas nucleotdeas em membranas celulares. Pelos estudos de West et al. (1994), a base guanosina hidrofbica e sua interao com DimetilSulfxido (DMSO) pode torn-la permevel a substncias lipoflicas, indicando que este pode servir como veculo de transporte de drogas nucleotdeas por membranas celulares. A partir de 1964, o DMSO passou a ser amplamente estudado e utilizado em uma gama imensa de pesquisas cientficas atravs das quais foram descobertas muitas das suas propriedades farmacolgicas, como a captura e remoo de radicais hidrxidos livres. Pela ao de seu metablito dimetil sulfide (DMS), o DMSO remove radicais livres de oxignio, o que explica suas propriedades protetoras como ao antinflamatria, antiisqumica, crioproteo e radioproteo (Brayton 1986, Paes 1999, Lind et al. 2000, Ali 2001, Kishioka et al. 2007).

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Em situaes clnicas, benefcios antinflamatrios da terapia com DMSO so descritos em leses musculares agudas, em alteraes agudas, traumticas e inflamatrias do sistema nervoso central e em condies infecciosas ou spticas. Este composto contribui na manuteno da microcirculao e reduz a destruio celular pela inflamao. Como mecanismo de ao foi observado que inibe a migrao de clulas inflamatrias, modula a resposta imuno-mediada, inibe a produo de anticorpos e inibe a proliferao de fibroblastos, que pode ser importante nas condies crnicas (Brayton 1986). O DMSO bem tolerado em altas doses, no causando alteraes cardacas e no peso corporal (Ali 2001). Em ces, elevadas doses, podem levar a halitose, anemia, hemoglobinria e aumento dos nveis de transaminase. E, precedendo a morte ocorre prostrao, convulso, dispnia, hipotenso, edema pulmonar e parada respiratria, porm sua DL 50 entre 2,5 a 8,9 g/Kg (Brayton 1986, Paes 1999). A terapia intravenosa indicada de 1 g/Kg, em soluo de 10-45%, administrado lentamente, em gatos, ces e cavalos (Brayton 1986). O objetivo do estudo identificar efeitos colaterais causados pelo uso de ribavirina, prednisona e DMSO em ces naturalmente infectados com o vrus da cinomose e apresentando encefalite. MATERIAL E MTODOS
Foram utilizados 60 ces com sinais clnicos neurolgicos de cinomose, diagnosticados a partir do histrico de vacinao, desenvolvimento clnico da doena e exame fsico. A confirmao foi realizada pela tcnica da reao em cadeia pela polimerase pela transcriptase reversa (RT-PCR).

Para a incluso dos animais no estudo, os sinais neurolgicos deveriam ter apresentao clnica multifocal e carter progressivo de no mximo 10 dias de evoluo. Os animais includos apresentaram sinais de acometimento dos sistemas respiratrio e/ou gastroentrico juntos ou anteriormente apresentao neurolgica, ou at mesmo descamao de pele ou descarga ocular mucopurelenta.
Os animais foram divididos em seis grupos de 10 animais de forma aleatria na medida em que foram atendidos no Hospital Veterinrio da FMVZ, UNESP Campus Botucatu, no Servio de Enfermidades Infecciosas dos Animais. Grupos 1 e 2: compostos por animais j tratados com a ribavirina e sua associao com o DMSO, respectivamente nas doses de 30 mg/Kg e 20mg/Kg, a cada 24 horas, durante 15 dias. Dessa forma, foram utilizados os materiais colhidos (sangue, medula ssea e lquor) para avaliao do tratamento pela RT-PCR. Estas amostras foram devidamente armazenadas em freezer a 80C desde 2007. Grupo 3: foram includos animais que serviram de controle para o tratamento antiviral especfico e para a avaliao da ao antinflamatria do DMSO. Estes animais receberam 50 mg/Kg de DMSO, diludo na concentrao de 10 a 20%, por via intravenosa, a cada 24 horas, durante 15 dias.

213 Grupo 4: foram includos animais que serviram de controle para o tratamento antiviral especfico e para a avaliao da ao antinflamatria da prednisona. Estes animais receberam 4 mg/Kg de prednisona, por via oral, a cada 24 horas, durante 7 dias, aps receberam a dose de 2 mg/Kg de prednisona, tambm por via oral a cada 24 horas at completar os 15 dias de tratamento. Aps este perodo os animais foram encaminhados para o trmino do tratamento no prprio domiclio com reduo gradativa da dose. Grupo 5: os animais includos neste grupo receberam a ribavirina na dose de 30 mg/Kg, por via oral, a cada 24 horas, durante 15 dias. Nestes foi administrado em associao a prednisona na dose de 4 mg/Kg, por via oral, a cada 24 horas, durante sete dias, com posterior reduo da dose para 2 mg/Kg, por via oral, a cada 24 horas, at completar o perodo de 15 dias. Aps este perodo os animais foram encaminhados para o trmino do tratamento no prprio domiclio com reduo gradativa da dose da prednisona por mais duas semanas. Este grupo foi considerado o grupo desafio da droga antiviral, j que a dose do glicocorticide foi imunossupressora. Grupo 6: os animais foram tratados com a ribavirina, prednisona e DMSO. Neste grupo os ces receberam 30 mg/Kg de ribavirina, por via oral, a cada 24 horas, durante 15 dias; o DMSO foi administrado na dose de 50 mg/Kg, diludo na concentrao de 10 a 20%, por via intravenosa, a cada 24 horas; e a prednisona foi administrada na sua dose antinflamatria de 0,5 mg/Kg, por via oral, a cada 12 horas, durante sete dias, sendo reduzida para 0,25 mg/Kg, a cada 24 horas at completar 15 dias de tratamento. Aps este perodo o animal terminou o tratamento em domiclio com manuteno da dose e aumento do intervalo para 48 horas por mais sete dias. Todos os animais receberam tratamento sintomtico e de suporte bsico, que inclui suplementao vitamnica, fluidoterapia nos casos de desidratao e antibioticoterapia para combater infeces secundrias. Todos os animais foram avaliados neurologicamente e clinicamente todos os dias e foram realizados exames complementares de forma rotineira. A Ribavirina9 utilizada na pesquisa possui apresentao de cpsulas de 250 mg e para facilitar o clculo da dose a droga foi diluda. A diluio foi realizada de forma assptica onde foram utilizadas oito cpsulas de ribavirina para 50 mL de gua destilada ou soluo fisiolgica 0,9% estril, formando uma soluo de 40 mg/mL para administrao oral. Depois de diluda, a ribavirina foi armazenada em frascos mbar e mantida em refrigerao constante em geladeira.

A prednisona foi adquirida em farmcia de manipulao (Cruz Vermelha, Botucatu, SP), na forma de soluo oral, na concentrao de 40 mg/mL em frascos de 50 mL. O DMSO10 foi utilizado a sua forma comercial Dimetil Sulfxido P. A., na concentrao de 99,9%, sendo que para a administrao intravenosa, a droga foi diluda em soluo fisiolgica 0,9% estril na proporo de 10 a 20% para administrao intravenosa.

10

Ribavirina: Ribavirin Laboratrio Blau DMSO: Dimetil Sulfxido P.A. Laboratrio Vetec Qumica Fina

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Todos os animais do experimento foram anestesiados conforme o protocolo sugerido pelo Departamento de Anestesiologia Veterinria da FMVZ UNESP Botucatu, SP para a colheita de lquor. Foram realizadas duas colheitas de lquor em cada animal, no momento em que o mesmo chegou ao ambulatrio, antes de qualquer tratamento e, aps um perodo de 15 dias, referente ao tempo do tratamento experimental. A tcnica de colheita de lquor seguiu a descrio feita por Dewey (2006). O lquor foi colhido em trs tubos por gotejamento e a quantidade de lquido colhida variou de 0,5 a 3 ml, dependendo do tamanho do animal.
As amostras de sangue foram colhidas com seringas e agulhas esterelizadas e descartveis, no volume de 10 mL, sendo ento acondicionados em tubos com EDTA A 7,5% e sem anticoagulantes, para retirada de soro. O local da puno foi a veia jugular, aps o procedimento as amostras foram levadas diretamente ao Laboratrio Clnico Veterinrio para realizao de hemograma e anlises bioqumicas de funo heptica e renal. O sistema hepatobiliar foi avaliado a partir da atividade srica da alanina-aminotransferase (ALT), fosfatase alcalina (FA) e gama-glutamiltransferase (GGT) e da concentrao de albumina. O sistema renal foi avaliado pela mensurao dos resduos nitrogenados, uria e creatinina no soro, e pelo exame de urina tipo I. Nos animais dos grupos 3 e 4 foi colhido apenas sangue para hemogramas de acompanhamento nos dias 1, 7 e 15, j que foram utilizadas drogas conhecidas. E no foram realizados exames bioqumicos pelos mesmos motivos. Alm disso, este grupo foi formado com o objetivo de terem seus resultados comparados com os resultados da RT-PCR dos grupos experimentais. J nos animais dos grupos 1, 2, 5 e 6, que receberam o antiviral, as amostras de sangue foram colhidas nos dias 1, 4, 7, 10, 12 e 15.

As dosagens bioqumicas foram realizadas nos grupos 1, 2, 5 e 6 nos dias 1, 5, 10 e 15 para identificao de possveis efeitos colaterais das drogas experimentais.
As amostras de urina foram colhidas com auxlio de seringas descartveis e agulhas descartveis esterelizadas atravs da puno da vescula urinria e foram levadas diretamente ao Laboratrio Clnico Veterinrio da FMVZ, UNESP Botucatu para a anlise. No caso de animais muito pequenos ou que no mantinham a vescula repleta foi utilizado a sondagem uretral para obteno da urina. Essa tcnica no foi escolhida por ser muito agressiva ao sistema urinrio do animal podendo levar a casos de cistite ascendente. O exame de urina do tipo I foi realizado nos animais dos grupos 1, 2, 5 e 6 nos dias 1, 5, 10 e 15 de tratamento com o antiviral com objetivo de identificar possveis efeitos colaterais das drogas experimentais utilizadas. Tcnicas de biologia Molecular

A extrao do RNA foi realizada a partir das amostras de sangue, medula ssea e lquor, utilizando-se o Kit para extrao de RNA Invisorb Spin Virus RNA Mini Kit (Inviteck). Para realizao da extrao foram diludo 100 L da amostra em 100 L de gua livre de nucleases. E para cada cinco amostras foram adicionados um

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controle negativo que era composto apenas por 200 L de gua livre de nucleases. As reaes foram realizadas em baterias de 10 amostras por vez. O controle positivo foi utilizado amostras de urina sabidamente positivas e para realizao da extrao utilizou-se a mesma diluio em gua livre de nucleases. O RNA foi imediatamente aliquotado em tubos menores com volume de 7 L da amostra e acondicionados a -80C. Para converso em cDNA as amostras (7 L) foram retiradas do freezer 80C e levadas diretamente ao termociclador para desnaturao do RNA, durante sete minutos em temperatura de 95C. Ao mesmo tempo foi preparado a mistura para formao de cDNA. A mistura era composta por 3 L de gua Mili-Q autoclavada; 1 L de Randon Primer (250 g/L); 1 L de dNTP (10 mM); 5 L de Buffer 5x; 1 L de DDT (0,1 M); 1 L de inibidor de RNAse (10 U/L) e 1 L tampo de M-MLV Reverse transcriptase. A mistura formou como volume final 13 L. Aliquotou-se 13 L em cada microtubo previamente identificado com o RNA previamente aquecido, totalizando-se 20 L. Levou-se ao termociclador no programa CINOCDNA (composto por ciclo de 25C por 10 minutos; 37C por 50 minutos e 70C por 15 minutos, totalizando um perodo de 1 hora e 15 minutos). Para a realizao da reao de RT-PCR foi necessria a preparao de outra mistura com 17,35 L de gua Mili-Q autoclavada; 2,5 L de Buffer 10x; 0,75 L de Mg2Cl2 (50 mM); 0,5 L de dNTP (10 mM); 1,25 L do Primer CDVNPS F1 (tabela 1); 1,25 L do Primer CDV-NPS R1 (tabela 1); 0,15 L de Taq DNA Platinum (5U/L), com volume final de 23,75 L da mistura. Aliquotou-se 23,75 L em cada microtubo previamente identificado, sempre mantido em gelo, na sala de aplicao foi pipetado 1,25 L do cDNA em cada tubo, totalizando 25 L de volume total. Aps os microtubos foram levados ao termociclador no programa CINOPCR (composto por ciclo de 95C por 10 minutos, 39 ciclos de 95C por 30 segundos, 56C por 30 segundos, 72C por 30 segundos, depois 72C por 10 minutos e 4 for ever) e, aps, foi armazenado a -20C. A leitura do gel foi realizada em gel de agarose a 2% em transluminador UV, corados em brometo de etdeo, onde se esperou um produto amplificado com 440 pb. A reao do hn-PCR foi realizada de forma semelhante a reao da PCR, utilizou-se para estas reaes as amostras que foram negativas na PCR, onde aliquotou-se 23,75 L da mistura e 1,25 L do produto amplificado da PCR. A mistura foi composta pelos mesmos reagentes, porm na hn-PCR utilizou-se Primer CDV-NPS R2 (tabela 1) no lugar do Primer CDV-NPS R1. E o produto esperado desta reao apresentou 331 pb na leitura do gel, assim como na reao anterior.

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Os iniciadores (primers) utilizados nas duas reaes amplificaram regies especficas do gene da nucleoprotena [GenBak: X02000.1]. Anlise estatstica: A comparao de frequncias de ocorrncias foi realizada pelos teste de Qui-quadrado ou G de Williams, de acordo com os resultados registrados em tabelas de contingncia. Para as variveis ordinais as comparaes entre os grupos foi realizada pelo teste de Kruskall-Wallis, seguido de comparao de medianas pelo teste de Dunn. As variveis discretas e contnuas foram submetidas verificao do tipo de distribuio pelo teste de Shapiro-Wilkins; quando de distribuio Normal, os grupos foram comparados pela Anlise de Varincia Um Fator seguido de teste de Tukey; quando de distribuio Livre, os grupos foram comparados pelo teste de Kruskall-Wallis, seguido de comparao de medianas pelo teste de Dunn. Em todas as anlises, valores de P menores que 0,05 foram considerados significantes.

RESULTADOS Todos os animais includos na pesquisa apresentaram positividade na RTPCR ou na Hemi-nested PCR (hn-PCR) em pelo menos uma das trs amostras colhidas, sangue perifrico, medula ssea ou lquor. O tratamento experimental foi avaliado segundo a melhora clnica e a sobrevida dos animais nos diferentes grupos. Os dados foram tratados da seguinte forma: os animais que vieram ao bito, que apresentaram melhora clnica e que sobreviveram aos 15 dias de tratamento. No entanto, aps o perodo de 15 dias de tratamento, alguns animais morreram, outros apresentaram piora ou ficaram com sequelas graves e foram eutanasiados, ou mesmo apresentaram melhora e sobreviveram, assim, estes animais foram agrupados todos juntos pela dificuldade de acompanhar a resposta, j que uma parte deles terminou o tratamento em domiclio (Figura 1). Como pior resultado frente sobrevida dos animais, o grupo 4 teve o pior desempenho com 70% dos animais vindo ao bito e apenas um animal apresentou melhora clnica. Em compensao, os grupos tratados com ribavirina (1, 2, 5 e 6) tiveram os melhores resultados de quando observamos as taxas de melhora clnica. Dos 60 animais includos no experimento, apenas 23 (38,3%) apresentaram melhora clnica, sendo um resultado semelhante ao nmero de bitos (36,7%). Quando somamos os dados dos animais que receberam o

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antiviral, verificamos que 12 (30%) animais vieram ao bito e 19 (47,5%) apresentaram melhora clnica evidente no perodo de internao. Os dados de hemograma foram comparados em todos os momentos nos grupos tratados com ribavirina (1, 2, 5 e 6), e nos dias 1, 7 e 15 de tratamento em todos os grupos, inclusive os dois grupos controle. A figura 2 demonstra que todos os grupos apresentaram queda na mediana da contagem de hemcias, evidenciando a presena de anemia aps o perodo de tratamento. Os animais dos grupos 3, 5 e 6 foram os que apresentaram valores inferiores 3.500.000 clulas/L. Diferente dos outros grupos, dois animais do G5 e um animal do G6 apresentaram valores da contagem de hemcias abaixo de 2.000.000 clulas/L no 15 dia de tratamento, que podemos classificar como anemia grave. Apenas um animal do G6 precisou receber transfuso sangunea durante o perodo de tratamento, sendo este dado desconsiderado na mediana da contagem de hemcias. Aps o tratamento experimental, o G2 foi o que melhor apresentou mediana da dosagem de hemoglobina, ao contrrio do que aconteceu com os grupos 5 e 6. Nesta tabela possvel identificar que a ribavirina em associao com a prednisona foi capaz de causar uma queda nos nveis de hemoglobina nos ces destes grupos experimentais, diferente do que foi encontrado nos animais do grupo controle e nos animais que no receberam a associao das duas drogas. Alm disso, os grupos 2 e 6 que receberam DMSO em associao s drogas experimentais mantiveram a dosagem de hemoglobina mais alta do que nos grupos 1 e 5 que usam as mesmas drogas sem o DMSO. Os dados da mediana da dosagem de hemoglobina em todos os momentos foram esquematizados na figura 3. Ficou evidenciado que o tratamento com ribavirina, sem o DMSO, pode levar a anemia mais grave que a prpria evoluo da doena. O antiviral quando associado prednisona pode levar a quadros de anemia grave, principalmente quando a prednisona for administrada na dose de 4 mg/Kg, a cada 24 horas, como aconteceu no G5. Com relao ao nmero de plaquetas no foi encontrado resultado com significncia estatstica. Nos dados da contagem de leuccitos foi possvel identificar que a mediana do G3 foi menor em relao aos outros grupos no ltimo dia de tratamento, chegando a 3.663 leuccitos/ L. Sendo que os valores de referncia para ces so de 6.000-17.000 leuccitos/L.
Ainda neste parmetro, o G1 tambm apresentou uma mediana abaixo dos valores de referncia com 4.550 leuccitos/ L, no 15 dia de tratamento. Enquanto que todos os outros grupos apresentaram medianas dentro dos valores de normalidade para ces.

Atravs do grfico evidenciou que as medianas dos grupos 4 e 5, que receberam doses imunossupressoras de prednisona, apresentaram uma

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contagem de leuccitos mais alta em relao aos outros grupos, sendo esta uma resposta esperada pelo uso de glicocorticides.
Os grupos 1, 2 e 3, que no receberam prednisona, demonstraram uma queda nesta contagem a partir do 12 dia de tratamento, demonstrando assim que esta alterao pode ser uma conseqncia natural da doena, j que os animais do G3 no receberam ribavirina. A mediana do G6 demonstrou a mesma caracterstica, evidenciando que a dose de 0,5 mg/Kg, a cada 12 horas, no foi capaz de aumentar a quantidade de leuccitos circulantes tanto quanto a dose imunossupressora. No foram encontrados resultados significativos na dosagem bioqumica de funo heptica e renal dos animais que receberam as drogas experimentais. No exame de urina tipo I tambm no apresentaram resultados importantes com relao as funes heptica e renal. No dcimo quinto dia de tratamento no foi encontrado resultado significativo estatisticamente, porm todos os grupos apresentaram valores altos do percentil 75, evidenciando que todos os animais que apresentavam valores mais altos tinham uma mdia que variou de 2,0 a 5,0 no escore, representando de uma a quatro cruzes para a presena de bilirrubina na urina, que pode significar um incio de leso heptica. Estes dados foram organizados na tabela 2. Esses dados mostram uma semelhana que o aumento de bilirrubina na urina pelo menos em alguns animais de todos os grupos. A nica droga em comum a todos os grupos a ribavirina. Estes podem ser indcios que a partir do dcimo quinto dia a ribavirina possa causar hemlise.

Os dados da dosagem de protenas no lquor devem ser analisados conforme o grupo de tratamento e o G3 foi o que apresentou menor valor de mediana com 25 mg/dL, podendo ser considerado dentro da normalidade, sendo que neste grupo houve grande variao dos valores de protena no lquor, que foram de 11 mg/dL, considerado normal 154, 1 mg/dL, considerado um processo de inflamao severa do SNC. Este grupo considerado controle, pois estes animais apenas receberam o DMSO e como foi encontrado no primeiro momento grande variao de valores, tambm ocorreu neste grupo, demonstrando que no houve efeito do tratamento. Os valores mximos encontrados nos diferentes grupos experimentais mostraram que em todos os grupos houve uma diminuio, porm no G3 e G5 houve um aumento, ou seja, mesmo os animais sendo tratados com antinflamatrios, DMSO ou prednisona respectivamente, foram encontrados valores mais altos. Nos grupos 1, 2, 3 e 6 foi observado que as medianas diminuram de um momento para outro, diferente do que aconteceu nos grupos 4 e 5. Este aspecto foi demonstrado na figura 4. Aps o perodo de tratamento, o G1 ainda apresentou o maior valor de mediana da contagem de clulas nucleadas, sendo que o G3 manteve o valor da mediana de antes e depois, enquanto que todos os outros grupos apresentaram reduo destes valores.

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O G3 foi tratado apenas com DMSO e serviu como grupo controle em relao ao processo inflamatrio nos outros grupos, j que no apresentou queda desta contagem, diferente do que foi encontrado nos outros grupos. O G4 apenas tratado com prednisona foi o que apresentou maior queda desses valores de mediana, porm o foi grupo com menor nmero de animais com melhora clnica. O G5 tambm teve esse tipo de apresentao dos seus valores da contagem de clulas e recebeu a mesma dose de prednisona, porm tambm recebeu a ribavirina, e neste grupo houve o segundo ndice de melhora clnica dos seis grupos tratados. Os valores das medianas da contagem de clulas nucleadas do lquor foram representados graficamente para melhor visualizao destes dados (Figura 5). O grfico foi capaz de evidenciar a discrepncia dos valores dessa contagem antes e aps o tratamento, tanto no G1 que no recebeu antinflamatrio, quanto nos grupos 2, 4, 5 e 6 que receberam o DMSO ou a prednisona. No entanto, foi possvel verificar que nos animais do G3 no houve diminuio dos valores antes e aps, demonstrando que o efeito antinflamatrio do DMSO no est relacionado com a diminuio do nmero de clulas. Ento, o G2 teve a sua queda nos valores provavelmente por uma ao direta da ribavirina e no por ao antinflamatria do DMSO. O G6 tambm apresentou uma queda pequena nesses valores, portanto as duas contagens, antes e aps o tratamento, estavam dentro dos valores de normalidade, neste caso a celulariadade no serviu como parmetro para afirmar se houve reduo ou no da inflamao por ao das drogas. DISCUSSO E CONCLUSO A ribavirina foi aprovada pela U.S. Food and Drug Administration para o tratamento peditrico da infeco pelo vrus sincicial respiratrio e sua combinao com alfa-interferon para infeco crnica pelo vrus da Hepatite C (Wu et al. 2005). Hoje a terapia antiviral com ribavirina em pacientes com hepatite C tem uma sobrevivncia de 55% (Sung et al. 2011). No atual estudo o tratamento experimental foi avaliado segundo a melhora clnica e a sobrevida dos animais nos diferentes grupos, onde foi encontrada uma taxa de 60 a 70% dos animais que sobreviveram ou apresentaram melhora clnica, que em relao ao tratamento usado em humanos foi melhor. O pior desempenho foi G4 com 70% de bitos.
Quando feita a avaliao da sobrevida junto com a melhora clnica dos animais, verificou-se que 70% dos animais tratados com o antiviral apresentaram melhora clnica ou sobrevida, no entanto nos grupos controle essa taxa chegou a 50%. Atravs do atual estudo podemos identificar que clinicamente a ribavirina favoreceu a sobrevida ou a melhora dos animais tratados, assim como foi descrito por Mangia (2008).

Como ocorreu na pesquisa anterior de Mangia (2008), os animais aps o perodo de tratamento com a ribavirina apresentaram valores baixos da contagem de hemcias. Na atual pesquisa verificaram que todos os grupos

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apresentaram uma queda na mediana da contagem de hemcias, mesmo os animais do grupo controle. Os animais dos grupos 3, 5 e 6 foram os que apresentaram valores inferiores 3.500.000 hemcias/ L. Dois animais do G5 e um do G6 apresentaram valores da contagem de hemcias abaixo de 2.000.000 clulas/L no 15 dia de tratamento, que podemos classificar como anemia grave. A aplicao clnica da ribavirina mostra restries devido a alguns efeitos adversos, especialmente, induo de anemia hemoltica. O acmulo dos fosfatos da droga em eritrcitos leva a anemia, que pode ser a causa para a descontinuao do tratamento (Wu et al. 2005). A severidade da anemia mais grave em macacos, seguidos dos humanos, roedores e ces (Lin et al. 2003). No entanto, Papich et al. (2003) afirmam no ter encontrado efeitos colaterais da ribavirina em ces, na dose de 60 mg/Kg durante duas semanas. Na dose de 30 mg/Kg tambm administrada no perodo de duas semanas apresentou um leva quadro de anemia, porm quando administrado junto com o glicocorticide apresentou anemia grave.
No foi encontrado na literatura relatos de efeitos colaterais potencializados por glicocorticides no usa da ribavirina em qualquer espcie animal que j foi testada, portanto este o primeiro relato de quadros de anemia severa em ces que receberam ribavirina em associao com a prednisona. A atual pesquisa revelou que as medianas dos grupos 4 e 5, que receberam doses imunossupressoras de prednisona, apresentam uma contagem de leuccitos mais alta em relao aos outros grupos. Este achado foi descrito na pesquisa de Van den Brandt et al. (2007), os glicoorticides mostraram induzir clulas C D8 a formarem linfcitos T CD4+ e causaram apoptose de timcitos, mas mantendo ainda as clulas T maduras do sangue perifrico mimetizando uma proliferao hemostsica. E complementando com o trabalho de Abraham et al. (2006) em que os autores afirmam que os glicocorticides inibem a expresso dos mediadores inflamatrios dos macrfagos e de outras clulas, desta forma, so usados no tratamento de vrias enfermidades inflamatrias imunomediadas.

A ribavirina administrada sistemicamente, em altas doses, pode causar efeitos indesejveis, como anemia por hemlise extravascular e aumento de bilirrubina no soro, os quais so reversveis quando cessada a administrao da droga (Bean 1992, Takahashi et al. 1998, Hosoya et al. 2001). Assim, pode sugerir que a presena de bilirrubina possa ser consequncia da hemlise causada pela ribavirina e no necessariamente por uma leso heptica. Da mesma forma aconteceu no dcimo quinto dia de tratamento, houve um aumento da quantidade de bilirrubina na urina em todos os grupos, sendo que o G5 foi o que apresentou a maior dosagem de bilirrubina na urina. Outra hiptese para estes achados seriam indcios de uma sobrecarga do sistema hepatobiliar destes ces, na dose e intervalo entre doses da ribavirina utilizada na pesquisa. No entanto, nenhuma das amostras de urina apresentou positividade para a presena de sais biliares na urina nos grupos experimentais e em nenhum dos momentos, o que diminui as chances que seja uma alterao no sistema hepatobiliar.

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Apenas os grupos 4 e 5 apresentaram elevao da quantidade de protena aps o tratamento, sendo que nestes grupos foi utilizada a prednisona na sua dose imunossupressora. Desta forma, a prednisona no foi capaz de diminuir o processo inflamatrio como desejado j que houve aumento dos valores de protena no lquor dos animais tratados. O G6 tambm foi tratado com a prednisona, porm com doses menores e apresentou diminuio dos valores de protena no lquor. Assim, pode-se afirmar que a prednisona em doses antinflamatrias foi capaz de reduzir a quantidade de protena no lquor, enquanto que quando administrada em doses imunossupressoras houve aumento desses valores. A literatura explica que no sistema nervoso, a administrao crnica de glicocorticides ou o estresse no so uniformemente antinflamatrios e em algumas circunstncias agem aumentando o processo inflamatrio. Foi observado pelo aumento da migrao de clulas inflamatrias, pelo nvel de mediadores inflamatrios e pela ativao do fator de transcrio. No sistema nervoso lesado, nveis de estresse do glicocorticide podem induzir uma resposta pr-inflamatria, e que em nveis basais ou de baixo estresse possuem um efeito tradicional antinflamatrio (Sorrells & Sapolsky 2007). O G4 apenas tratado com prednisona foi o que apresentou maior queda desses valores de mediana, porm foi o grupo com menor nmero de animais com melhora clnica. O G5 tambm teve esse tipo de apresentao dos seus valores da contagem de clulas e recebeu a mesma dose de prednisona, porm tambm recebeu a ribavirina, e neste grupo houve o segundo ndice de melhora clnica. A partir destes dados foi possvel verificar que a prednisona na sua dose imunossupressora levou ao aumento da dosagem de protenas e uma diminuio da contagem de clulas nucleadas no lquor. Sugere que a prednisona faa uma imunomodulao nessa dose em ces e no uma potente ao antinflamatria. Pela literatura existente pode-se afirmar que os glicocorticides so reconhecidos por inibir a proliferao de linfcitos T e a produo de uma variedade de citosinas, incluindo interferon alfa. A IL-7 age mantendo a populao policlonal de linfcitos T imaturos e as clulas T de memria, e, portanto, controla o tamanho do estoque de clulas T (Talayev et al. 2005). Ao mesmo tempo Feitosa et al. (1997) afirmam que os altos nveis de protenas no lquor so encontrados em animais com cinomose com uma porcentagem maior de plasmcitos, uma vez que todos os estudados se encontravam com alteraes neurolgicas h mais de 10 dias e sugerem que, alm da produo de anticorpos contra o vrus, a dismielinizao j estivesse ocorrendo por uma resposta imune e no por uma ao viral direta, levando tambm produo de anticorpos contra a bainha de mielina. Assim, a prednisona provavelmente age na populao de linfcitos T, enquanto os plasmcitos encontrados no lquor causam o aumento de protenas sob ao do mesmo glicocorticide.

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Primers (nmero de acesso aos genes) Primer ITS 1 F (10 pmol) CVD-NPS F1 5-3 Primer ITS 1 R (10 pmol) CVD-NPS R1 5-3 Primer ITS 2 R (10 pmol) CVD-NPS R2 5-3 CGAATTTTAACCCTCCATG CCTTGGTGATGCCAAGCTCG Iniciadores ATCCCCAGGRAACAAGCCTACAA

(AMARAL, 2007).

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Tabela 2 - Mediana e percentis em escores da dosagem de bilirrubina na urina nos diferentes grupos experimentais, no dcimo quinto dia de tratamento.
Grupo G1 G2 G5 G6 Mnimo 0,0 0,0 0,0 0,0 P25 0,0 0,0 0,0 0,0 Mediana 0,0 0,0 2,5 0,5 P75 5,0 2,0 5,0 2,0 Mximo 5,0 5,0 5,0 5,0

Estatstica: Kruskall-Wallis, p=0,4952. P25: percentil 25. P75: percentil 75. 0: negativo; 1,0: traos de bilirrubina; 2,0: + de bilirrubina; 3,0: ++ de bilirrubina; 4,0: +++ de bilirrubina; 5,0: ++++ de bilirrubina. G1: grupo 1; G2: grupo 2; G5: grupo 5; G6: grupo 6.

Figura 1 Representao grfica da avaliao do tratamento experimental segundo a sobrevida dos animais nos diferentes grupos.
7 6 Nmero de animais 5 4 3 2 1 0 G1 G2 G3 G4 G5 G6 Grupos Experimentais Estatstica: Teste G de Willians; p=0,4034 G1: grupo 1; G2: grupo 2; G3: grupo 3; G4: grupo 4; G5: grupo 5; G6: grupo 6. bito sobrevida melhora

Figura 2 Representao grfica das medianas da contagem de hemcias em cada momento de colheita de material nos grupos experimentais.

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6.500.000 6.000.000 Nmero de hemcias/dL 5.500.000 5.000.000 4.500.000 4.000.000 3.500.000 3.000.000 2.500.000 1 4 7 10 12 15 Dias de Tratamento Estatstica: Teste de Kruskall-Wallis G1: grupo 1; G2: grupo 2; G3: grupo 3; G4: grupo 4; G5: grupo 5; G6: grupo 6. G1 G2 G3 G4 G5 G6

Figura 3 Representao grfica das medianas da dosagem de hemoglobina em cada momento de colheita de material nos grupos experimentais.
15 14 13 Hemoglobina (g/dL) 12 11 10 9 8 7 6 1 4 7 10 12 15 Dias de Tratamento Estatstica: Teste de Kruskall-Wallis G1: grupo 1; G2: grupo 2; G3: grupo 3; G4: grupo 4; G5: grupo 5; G6: grupo 6. G1 G2 G3 G4 G5 G6

Figura 4 Representao grfica das medianas da dosagem de protenas no lquor antes e aps o tratamento experimental.

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Dosagem de protenas (mg/dL)

50 45 G1 G2 G3 G4 G5 G5 G6 G6

40
35 30 25 20 1 15 G1 Dias de Tratamento G2 G3 G4

G1: grupo 1; G2: grupo 2; G3: grupo 3; G4: grupo 4; G5: grupo 5; G6: grupo 6. Estatstica: Kruskal-Wallis

Figura 5 Representao grfica dos valores de medianas da contagem de clulas nucleadas, antes e aps o tratamento experimental.
Contagem de clulas nucleadas (cls/dL)

50 40 30 20 10 0 1 15 G1 Dias de Tratamento G2 G3 G4 G5 G6

G1
G2 G3

G4
G5 G6

Estatstica: Kruskal-Wallis G1: grupo 1; G2: grupo 2; G3: grupo 3; G4: grupo 4; G5: grupo 5; G6: grupo 6.

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Trabalho a ser enviado para Pesquisa Veterinria Brasileira:

RT-PCR e Hemi-Nested PCR antes e aps o tratamento com ribavirina, prednisona e DMSO de ces com encefalite pelo vrus da cinomose. RT-PCR and Hemi-Nested PCR before and after treatment based on ribavirin, prednisone and DMSO of dogs with encephalitis by cinine distemper virus. MANGIA, S. H.21; MORAES, L. F.22; TAKAHIRA R. K.23; RODRIGO R. G.24; SALCEDO, E. S.25; MEGID, J.26; SILVA, A. V.27; PAES, A. C.28

Autor para correspondncia. Departamento de Higiene Veterinria e Sade Pblica, FMVZ, UNESP/Botucatu. End: Rubio Jnior, s/n Botucatu, SP. CEP: 18.618-000, Caixa Postal: 560. E-mail: simangia@hotmail.com 22 Departamento de Clnica Veterinria, FMVZ, UNESP/Botucatu. E-mail: liviafm@gmail.com 23 Departamento de Clnica Veterinria, FMVZ, UNESP/Botucatu. E-mail: takahira@fmvz.unesp.br 24 Departamento de Higiene Veterinria e Sade Pblica, FMVZ, UNESP/Botucatu. E-mail: rgmotta@fmvz.unesp.br 25 Departamento de Clnica Veterinria, FMVZ, UNESP/Botucatu. E-mail: soteloedu@gmail.com 26 Departamento de Higiene Veterinria e Sade Pblica, FMVZ, UNESP/Botucatu. E-mail: jane@fmvz.unesp.br 27 Grupo de pesquisa em parasitologia, Laboratrio de Anlises Clnicas e Parasitologia, Departamento de Cincias Biolgicas, Universidade Estadual de Feira de Santana, BA. E-mail: aristeusilva@gmail.com 28 Departamento de Higiene Veterinria e Sade Pblica, FMVZ, UNESP/Botucatu. E-mail: paesacmi@fmvz.unesp.br

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ABSTRACT [RT-PCR and Hemi-Nested PCR before and after treatment based on ribavirin, prednisone and DMSO of dogs with encephalitis by cinine distemper virus] The present study aims at the identification of the frequency of canine distemper virus in the blood, bone marrow and cerebrospinal fluids (CSF) samples collected from dogs naturally infected with the virus, with encephalitis and treated with ribavirin, prednisone and DMSO. A number of 60 dogs presenting canine distemper neurological signs were subjected to the support treatment and neurologically assessed on daily basis. Groups 1 and 2 were treated with ribavirin and its combination with DMSO; Groups 3 and 4 treated with prednisone and DMSO, Group 5 treated with ribavirin and prednisone, while Group 6 with ribavirin, prednisone and DMSO. The animals were anesthetized for the cerebrospinal fluid, bone marrow and blood samples collection before and after the treatment, then the RT-PCR of the samples was proceeded. The negative samples were analysed according to the hn-PCR technique. The canine distemper virus were found In 95% of blood samples, 90% of bone marrow and 53,3% of CSF before the treatment. Considering the survival and clinical improvement rates, the most successful treatment was the one applied to the G2 (80%); followed by G1 with 70% and 6 animals presenting clinical improvement; G5 with 70% and five animals with clinical improvement; G3 with 70% and three animals with clinical improvement; G6 with 60%; and the lowest rate G4 with 30%. After the treatment, the virus frequency rate was 97,7% in the blood, 86,4% in the bone marrow and 27,3% in the CSF.

INDEX TERMS: RT-PCR, hn-PCR, canine distemper virus, ribavirina, prednisone, DMSO

RESUMO [RT-PCR e Hemi-Nested PCR antes e aps o tratamento com ribavirina, prednisona e DMSO de ces com encefalite pelo vrus da cinomose.] O estudo tem objetivo de identificar a frequncia da presena do vrus da cinomose nas amostras de lquor, sangue e medula ssea de ces com encefalite naturalmente infectados e tratados com ribavirina, prednisona e DSMO. Foram utilizados 60 ces apresentando quadro neurolgico da cinomose com evoluo de 10 dias. Os animais foram internados e receberam tratamento de suporte e foram avaliados neurologicamente todos os dias. Os grupos 1 e 2 foram tratados com ribavirina e sua associao com DMSO; os grupos 3 e 4 com DMSO e prednisona e o grupos 5 com ribavirina e prednisona e o grupo 6 com ribavirina, prednisona e DMSO. Os animais foram anestesiados para a colheita de lquor, medula ssea e sangue, antes e aps o tratamento e realizada a RT-PCR das amostras. As amostras negativas foram analisadas pela tcnica de hn-PCR. O vrus da cinomose foi encontrado em 95% das amostras de sangue, 90% de medula ssea e 53,3% de lquor antes do tratamento. Atravs dos ndices de sobrevida e melhora clnica, o melhor tratamento foi o G2 com 80%; seguido do G1 com 70%, sendo que seis animais apresentaram melhora clnica; G5 com 70% e cinco animais

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melhoraram e o G3 com 70%, sendo trs animais com melhora clnica; o G6 com 60%; o G4 com o pior ndice com 30%. Aps o tratamento, a frequncia do vrus foi de 97,7% no sangue, 86,4% na medula ssea e 27,3% no lquor.

TERMOS DE INDEXAO: RT-PCR, hn-PCR, vrus da cinomose, ribavirina, prednisona e DMSO.

INTRODUO A cinomose uma doena viral muito antiga que afeta ces e outros carnvoros em todo o mundo. Entretanto, mesmo com uso de estratgias vacinais, ela ainda uma doena importante na populao canina, apresentando a maior taxa de mortalidade depois da raiva (Summers & Appel 1994). A cinomose uma enfermidade infectocontagiosa, causada por um RNA vrus da ordem Mononegavirales, famlia Paramyxovirus, gnero Morbillivirus. Possui trs formas de apresentao clnica: aguda, subaguda e crnica, com manifestaes gastroentricas, respiratrias e neurolgicas. So descritas basicamente trs formas de encefalite causada pelo vrus da cinomose: encefalite dos ces jovens, encefalite em ces adultos e encefalite do co velho (Corra & Corra 1992). Embora a vacinao contra a cinomose venha sendo utilizada amplamente por vrias dcadas, a doena ainda importante e surtos foram recentemente relatados em vrios pases, como Dinamarca, Estados Unidos, Japo, Finlndia e Alemanha (Jzwik & Frymus 2005, Vandevelde & Zurbriggen 2005). No Brasil, alguns relatos clnico-patolgicos e sorolgicos indicam a elevada presena da infeco na populao canina (Headley & Graa 2000, Silva et al. 2004). Alguns fatores como a persistncia do vrus no ambiente e em animais portadores, o aparecimento de novas cepas e o desenvolvimento de infeco e doena mesmo em animais vacinados tm contribudo para a manuteno do carter enzotico da virose com ocorrncia ocasional de surtos (Bhm et al. 2004). A ribavirina uma droga antiviral, anloga guanosina, inibidora da replicao in vitro de alguns RNA e DNA-vrus, incluindo Herpesvirus, Poxvirus, Influenza vrus, Parainfluenza vrus, Reovirus, Togavirus, Paramyxovirus e Tumor RNA-vrus. In vivo, o espectro antiviral restrito, com ao contra Herpesvirus, Influenza, Parainfluenza , Paramyxovirus do Sarampo e Adenovirus (Hayden & Douglas 1990). No experimento de Elia et al. (2008) a ribavirina mostrou-se altamente efetiva na preveno da replicao do vrus da cinomose in vitro em baixas concentraes, de aproximadamente 6,5-12,5 g/mL, concordando com os valores encontrados para a inibio do vrus do sarampo.

231

Segundo Elia et al. (2008) a ribavirina causa mutaes no vrus da cinomose e estas levam a um erro catastrfico no RNA do genoma viral. Pode ser especulado que a ribavirina interfira com a RNA polimerase pela competio com nucleosdeos naturais e produz erro na terminao da cadeia do vrus. Mangia et al. (2011) demonstraram a eficcia do tratamento com ribavirina na dose de 30 mg/Kg, por via oral, a cada 24 horas, durante 15 dias em um caso com encefalite aguda pelo vrus da cinomose, quando associada ao DMSO na dose de 1 g/Kg, por via intravenosa, a cada 24 horas. Os glicocorticides so os reguladores mais estudados do sistema neuroendcrino e so reconhecidos por inibir a proliferao de linfcitos T e a produo de uma variedade de citosinas, incluindo interferon- (IFN). A interleucina-7 (IL-7) age mantendo a populao policlonal de linfcitos T imaturos e as clulas T de memria, e, portanto, controla o tamanho do estoque de clulas T (Talayev et al. 2005). No trabalho de reviso de Sorrells & Sapolsky (2007), os autores concluram que em ambos os sistemas, nervoso e imune perifrico, a exposio prvia ao estresse ou ao glicocorticide pode resultar na produo de uma resposta imune a uma subsequente inflamao. No sistema nervoso, a administrao crnica de glicocorticides ou o estresse no so uniformemente anitinflamatrios e em algumas circunstncias agem aumentando o processo inflamatrio; assim foi observado pelo aumento da migrao de clulas inflamatrias, pelo nvel de mediadores inflamatrios e pela ativao do fator de transcrio. No sistema nervoso lesado, nveis de estresse do glicocorticide podem induzir uma resposta pr-inflamatria e em nveis basais ou de baixo estresse possuem um efeito tradicional antinflamatrio; esta resposta oposta encontrada no sistema imune perifrico. Outra concluso encontrada na pesquisa foi que os efeitos pr-inflamatrios no crebro so diferentes conforme a regio, o uso de sintticos versus glicocorticides endgenos e o tempo de exposio ao glicocorticide no que diz respeito a resposta inflamatria. A solubilizao de nucleotdeos em solventes orgnicos importante para a entrada de drogas nucleotdeas em membranas celulares. Pelos estudos de West et al. (1994), a base guanosina hidrofbica e sua interao com DimetilSulfxido (DMSO) pode torn-la permevel a substncias lipoflicas, indicando que este pode servir como veculo de transporte de drogas nucleotdeas por membranas celulares. A partir de 1964, o DMSO passou a ser amplamente estudado e utilizado em uma gama imensa de pesquisas cientficas atravs das quais foram descobertas muitas das suas propriedades farmacolgicas, como a captura e remoo de radicais hidrxidos livres. Pela ao de seu metablito dimetil sulfide (DMS), o DMSO remove radicais livres de oxignio, o que explica suas propriedades protetoras como ao antinflamatria, antiisqumica, crioproteo e radioproteo (Brayton 1986, Paes 1999, Lind et al. 2000, Ali 2001, Kishioka et al. 2007).

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Em situaes clnicas, benefcios antinflamatrios da terapia com DMSO so descritos em leses musculares agudas, em alteraes agudas, traumticas e inflamatrias do sistema nervoso central e em condies infecciosas ou spticas. Este composto contribui na manuteno da microcirculao e reduz a destruio celular pela inflamao. Como mecanismo de ao foi observado que inibe a migrao de clulas inflamatrias, modula a resposta imuno-mediada, inibe a produo de anticorpos e inibe a proliferao de fibroblastos, que pode ser importante nas condies crnicas (Brayton 1986). Atualmente, a tcnica da reao em cadeia pela polimerase precedida de transcrio reversa (RT-PCR) vem sendo empregada com sucesso na deteco do vrus da cinomose em diferentes tipos de amostras biolgicas provenientes de ces com sinais clnicos sistmicos e neurolgicos (Barrett 1999, Gebara et al. 2004). Segundo Gebara et al. (2004) possvel detectar o cido nuclico do vrus em urina de ces tanto com encefalite aguda quanto crnica. Estes resultados demonstram que a tcnica de RT-PCR um mtodo eficiente para realizao do diagnstico rpido, precoce e in vivo (Saito et al. 2006, Sato et al. 2006, Elia et al. 2008). As vrias amostras incluindo sangue perifrico, swab conjuntival, secreo nasal, urina, lquor, e swab vaginal, tecido pulmonar, estomacal, intestinal e urinrio podem ser utilizados para o diagnstico de cinomose pela tcnica RTPCR. Entretanto, o swab conjuntival o mais apropriado para o diagnstico in vivo da cinomose (Kim et al. 2006). Shin et al. (2004) levantaram a hiptese de utilizao do nested PCR para diagnstico da cinomose. A efetividade da tcnica foi demonstrada em amostras clnicas como sangue, urina, swab nasal e saliva. Sendo um mtodo ideal para deteco do vrus da cinomose em amostras clnicas, apresentou alta sensibilidade e consistncia no desempenho laboratorial. Comparativamente ao RT-PCR, mostrou positividade relevante em todas as amostras testadas (Jzwik & Frymus 2005). O atual estudo teve como objetivo identificar a frequncia do vrus da cinomose nas amostras de sangue perifrico, medula ssea e lquor de animais com encefalite naturalmente infectados, atravs de tcnicas altamente sensveis e especficas como a RT-PCR e Hemi-Nested-PCR (hn-PCR). MATERIAL E MTODOS
Foram utilizados 60 ces com sinais clnicos neurolgicos de cinomose, diagnosticados a partir do histrico de vacinao, desenvolvimento clnico da doena e exame fsico. A confirmao foi realizada pela tcnica da reao em cadeia pela polimerase pela transcriptase reversa (RT-PCR).

Para a incluso dos animais no estudo, os sinais neurolgicos deveriam ter apresentao clnica multifocal e carter progressivo de no mximo 10 dias de evoluo. Os animais includos apresentaram sinais de acometimento dos sistemas respiratrio e/ou gastroentrico juntos ou anteriormente apresentao neurolgica, ou at mesmo descamao de pele ou descarga ocular mucopurelenta.

233 Os animais foram divididos em seis grupos de 10 animais de forma aleatria na medida em que foram atendidos no Hospital Veterinrio da FMVZ, UNESP Campus Botucatu, no Servio de Enfermidades Infecciosas dos Animais. Grupos 1 e 2: compostos por animais j tratados com a ribavirina e sua associao com o DMSO, respectivamente nas doses de 30 mg/Kg e 20mg/Kg, a cada 24 horas, durante 15 dias. Dessa forma, foram utilizados os materiais colhidos (sangue, medula ssea e lquor) para avaliao do tratamento pela RT-PCR. Estas amostras foram devidamente armazenadas em freezer a 80C desde 2007. Grupo 3: foram includos animais que serviram de controle para o tratamento antiviral especfico e para a avaliao da ao antinflamatria do DMSO. Estes animais receberam 50 mg/Kg de DMSO, diludo na concentrao de 10 a 20%, por via intravenosa, a cada 24 horas, durante 15 dias. Grupo 4: foram includos animais que serviram de controle para o tratamento antiviral especfico e para a avaliao da ao antinflamatria da prednisona. Estes animais receberam 4 mg/Kg de prednisona, por via oral, a cada 24 horas, durante 7 dias, aps receberam a dose de 2 mg/Kg de prednisona, tambm por via oral a cada 24 horas at completar os 15 dias de tratamento. Aps este perodo os animais foram encaminhados para o trmino do tratamento no prprio domiclio com reduo gradativa da dose. Grupo 5: os animais includos neste grupo receberam a ribavirina na dose de 30 mg/Kg, por via oral, a cada 24 horas, durante 15 dias. Nestes foi administrado em associao a prednisona na dose de 4 mg/Kg, por via oral, a cada 24 horas, durante sete dias, com posterior reduo da dose para 2 mg/Kg, por via oral, a cada 24 horas, at completar o perodo de 15 dias. Aps este perodo os animais foram encaminhados para o trmino do tratamento no prprio domiclio com reduo gradativa da dose da prednisona por mais duas semanas. Este grupo foi considerado o grupo desafio da droga antiviral, j que a dose do glicocorticide foi imunossupressora. Grupo 6: os animais foram tratados com a ribavirina, prednisona e DMSO. Neste grupo os ces receberam 30 mg/Kg de ribavirina, por via oral, a cada 24 horas, durante 15 dias; o DMSO foi administrado na dose de 50 mg/Kg, diludo na concentrao de 10 a 20%, por via intravenosa, a cada 24 horas; e a prednisona foi administrada na sua dose antinflamatria de 0,5 mg/Kg, por via oral, a cada 12 horas, durante sete dias, sendo reduzida para 0,25 mg/Kg, a cada 24 horas at completar 15 dias de tratamento. Aps este perodo o animal terminou o tratamento em domiclio com manuteno da dose e aumento do intervalo para 48 horas por mais sete dias. Todos os animais receberam tratamento sintomtico e de suporte bsico, que inclui suplementao vitamnica, fluidoterapia nos casos de desidratao e antibioticoterapia para combater infeces secundrias. Todos os animais foram avaliados neurologicamente e clinicamente todos os dias e foram realizados exames complementares de forma rotineira. A Ribavirina29 utilizada na pesquisa possui apresentao de cpsulas de 250 mg e para facilitar o clculo da dose a droga foi diluda. A diluio foi realizada de forma assptica onde foram utilizadas oito cpsulas de ribavirina para 50 mL de gua destilada ou soluo fisiolgica 0,9% estril, formando uma soluo de 40 mg/mL para

29

Ribavirina: Ribavirin

Laboratrio Blau

234 administrao oral. Depois de diluda, a ribavirina foi armazenada em frascos mbar e mantida em refrigerao constante em geladeira.

A prednisona foi adquirida em farmcia de manipulao (Cruz Vermelha, Botucatu, SP), na forma de soluo oral, na concentrao de 40 mg/mL em frascos de 50 mL. O DMSO30 foi utilizado a sua forma comercial Dimetil Sulfxido P. A., na concentrao de 99,9%, sendo que para a administrao intravenosa, a droga foi diluda em soluo fisiolgica 0,9% estril na proporo de 10 a 20% para administrao intravenosa. Todos os animais do experimento foram anestesiados conforme o protocolo sugerido pelo Departamento de Anestesiologia Veterinria da FMVZ UNESP Botucatu, SP para a colheita de lquor. Foram realizadas duas colheitas de lquor em cada animal, no momento em que o mesmo chegou ao ambulatrio, antes de qualquer tratamento e, aps um perodo de 15 dias, referente ao tempo do tratamento experimental. A tcnica de colheita de lquor seguiu a descrio feita por Dewey (2006). O lquor foi colhido em trs tubos por gotejamento e a quantidade de lquido colhida variou de 0,5 a 3 ml, dependendo do tamanho do animal. Para a realizao da RT-PCR, o lquor foi colhido diretamente em microtubos de 500 L, livre de pirognios, DNAse, RNAse e metais pesados e armazenado em freezer a -80C. O sangue foi colhido com agulhas e seringas esterelizadas de puno de veia julgular. A amostra foi acondicionada em tubos com anticoagulantes homogenizadas e, posteriormente, acondicionadas em microtubos de 500 L, livre de pirognios, DNAse, RNAse e metais pesados e armazenadas em freezer a -80C para posterior processamento. Estas amostras tambm foram colhidas antes e aps o tratamento experimental em todos os grupos, com intervalo de 15 dias. As colheitas de medula ssea foram realizadas nos mesmos momentos das colheitas de lquor, antes do inicio do tratamento e aps 15 dias de administrao das drogas. Os animais estavam anestesiados para a colheita de lquor, facilitando a colheita no mero, que foi realizada com agulha prpria, com mandril e esterilizada. A colheita foi realizada com seringa esterelizada e com EDTA, o material foi depositado em microtubos de 500 L, livre de pirognios, DNAse, RNAse e metais pesados e armazenado em freezer a 80C para posterior processamento em Laboratrio de Biologia Molecular, da Disciplina de Enfermidades Infecciosas dos Animais da FMVZ, UNESP Botucatu, assim como as amostras de sangue e lquor.
Tcnicas de biologia Molecular

A extrao do RNA foi realizada a partir das amostras de sangue, medula ssea e lquor, utilizando-se o Kit para extrao de RNA Invisorb Spin Virus RNA Mini Kit (Inviteck).
30

DMSO: Dimetil Sulfxido P.A. Laboratrio Vetec Qumica Fina

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Para realizao da extrao foram diludo 100 L da amostra em 100 L de gua livre de nucleases. E para cada cinco amostras foram adicionados um controle negativo que era composto apenas por 200 L de gua livre de nucleases. As reaes foram realizadas em baterias de 10 amostras por vez. O controle positivo foi utilizado amostras de urina sabidamente positivas e para realizao da extrao utilizou-se a mesma diluio em gua livre de nucleases. O RNA foi imediatamente aliquotado em tubos menores com volume de 7 L da amostra e acondicionados a -80C. Para converso em cDNA as amostras (7 L) foram retiradas do freezer 80C e levadas diretamente ao termociclador para desnaturao do RNA, durante sete minutos em temperatura de 95C. Ao mesmo tempo foi preparado a mistura para formao de cDNA. A mistura era composta por 3 L de gua Mili-Q autoclavada; 1 L de Randon Primer (250 g/L); 1 L de dNTP (10 mM); 5 L de Buffer 5x; 1 L de DDT (0,1 M); 1 L de inibidor de RNAse (10 U/L) e 1 L tampo de M-MLV Reverse transcriptase. A mistura formou como volume final 13 L. Aliquotou-se 13 L em cada microtubo previamente identificado com o RNA previamente aquecido, totalizando-se 20 L. Levou-se ao termociclador no programa CINOCDNA (composto por ciclo de 25C por 10 minutos; 37C por 50 minutos e 70C por 15 minutos, totalizando um perodo de 1 hora e 15 minutos). Para a realizao da reao de RT-PCR foi necessria a preparao de outra mistura com 17,35 L de gua Mili-Q autoclavada; 2,5 L de Buffer 10x; 0,75 L de Mg2Cl2 (50 mM); 0,5 L de dNTP (10 mM); 1,25 L do Primer CDVNPS F1 (tabela 1); 1,25 L do Primer CDV-NPS R1 (tabela 1); 0,15 L de Taq DNA Platinum (5U/L), com volume final de 23,75 L da mistura. Aliquotou-se 23,75 L em cada microtubo previamente identificado, sempre mantido em gelo, na sala de aplicao foi pipetado 1,25 L do cDNA em cada tubo, totalizando 25 L de volume total. Aps os microtubos foram levados ao termociclador no programa CINOPCR (composto por ciclo de 95C por 10 minutos, 39 ciclos de 95C por 30 segundos, 56C por 30 segundos, 72C por 30 segundos, depois 72C por 10 minutos e 4 for ever) e, aps, foi armazenado a -20C. A leitura do gel foi realizada em gel de agarose a 2% em transluminador UV, corados em brometo de etdeo, onde se esperou um produto amplificado com 440 pb. A reao do hn-PCR foi realizada de forma semelhante a reao da PCR, utilizou-se para estas reaes as amostras que foram negativas na PCR, onde aliquotou-se 23,75 L da mistura e 1,25 L do produto amplificado da PCR. A mistura foi composta pelos mesmos reagentes, porm na hn-PCR utilizou-se Primer CDV-NPS R2 (tabela 1) no lugar do Primer CDV-NPS R1. E

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o produto esperado desta reao apresentou 331 pb na leitura do gel, assim como na reao anterior. Os iniciadores (primers) utilizados nas duas reaes amplificaram regies especficas do gene da nucleoprotena [GenBak: X02000.1]. Anlise estatstica: A comparao de frequncias de ocorrncias foi realizada pelos testes de Qui-quadrado ou G de Williams, de acordo com os resultados registrados em tabelas de contingncia. Para as variveis ordinais as comparaes entre os grupos foram realizadas pelo teste de Kruskall-Wallis, seguido de comparao de medianas pelo teste de Dunn. As variveis discretas e contnuas foram submetidas verificao do tipo de distribuio pelo teste de Shapiro-Wilkins; quando de distribuio Normal, os grupos foram comparados pela Anlise de Varincia Um Fator seguido de teste de Tukey; quando de distribuio Livre, os grupos foram comparados pelo teste de Kruskall-Wallis, seguido de comparao de medianas pelo teste de Dunn. Em todas as anlises, valores de P menores que 0,05 foram considerados significantes. RESULTADOS O tratamento experimental foi avaliado segundo a melhora clnica e a sobrevida dos animais nos diferentes grupos. Os dados foram tratados da seguinte forma: os animais que vieram ao bito, que apresentaram melhora clnica e que sobreviveram aos 15 dias de tratamento. No entanto, aps o perodo de 15 dias de tratamento, alguns animais morreram, outros apresentaram piora ou ficaram com sequelas graves e foram eutanasiados, ou mesmo apresentaram melhora e sobreviveram, assim, estes animais foram agrupados todos juntos pela dificuldade de acompanhar a resposta, j que uma parte deles terminou o tratamento em domiclio (Figura 1). Como pior resultado frente sobrevida dos animais, o grupo 4 teve o pior desempenho com 70% dos animais vindo ao bito e apenas um animal apresentou melhora clnica. Em compensao, os grupos tratados com ribavirina (1, 2, 5 e 6) tiveram os melhores resultados de quando observamos as taxas de melhora clnica. Dos 60 animais includos no experimento, apenas 23 (38,3%) apresentaram melhora clnica, sendo um resultado semelhante ao nmero de bitos (36,7%). Quando somamos os dados dos animais que receberam o antiviral, verificamos que 12 (30%) animais vieram ao bito e 19 (47,5%) apresentaram melhora clnica evidente no perodo de internao. No total foram realizadas 308 reaes da RT-PCR, j que nem todos os animais sobreviveram aos 15 dias de tratamento, sendo que 130 (42,2%) foram

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positivas. Ento, foram realizadas 178 reaes da hn-PCR e 102 (57,3%) foram positivas. Assim, das 308 amostras analisadas, 232 (75,32%) foram positivas. Os dados foram trabalhados segundo o momento de colheita de material e a amostra utilizada para a realizao da pesquisa. Todos os animais foram positivos nos dois momentos da pesquisa em pelo menos uma das trs amostras colhidas. No primeiro momento, o sangue perifrico foi amostra que mais resultou positivo com 95%, sendo que apenas trs animais do G4 apresentaram resultado negativo nas duas tcnicas de biologia molecular trabalhadas. Estes dados apresentaram resultados estatisticamente significativos com p=0,0075. A medula ssea no primeiro momento apresentou 90% de positivos, sendo que nenhum dos animais do G4 apresentou resultado negativo e no G2 houve 20% de negativos. Os outros grupos apresentaram uma taxa de 10% de animais que no apresentavam o vrus na medula ssea. Portanto, esses dados no apresentaram resultado estatisticamente significativo (p=8176). O lquor foi a amostra que menos apresentou positividade (53,3%), porm esta ainda foi maior do que os resultados negativos (46,7%). Dos 28 animais que apresentaram negatividade no lquor, seis eram dos grupos 2 e 4; cinco dos grupos 3 e 6 e trs dos grupos 1 e 5. Estes dados tambm no apresentaram resultado estatstico, pois p=5859. Aps 15 dias de tratamento, houve um aumento da porcentagem de amostras positivas, ou seja, das 43 amostras de sangue colhidas, 42 foram positivas, sendo que o nico animal que apresentou ausncia do vrus no sangue pertence ao G3. Este grupo e G4 so grupos controle e no receberam a ribavirina nos protocolos de tratamento, mesmo assim tiveram o vrus presente no sangue perifrico. Estes resultados no apresentaram significncia estatstica (p=3844). Mesmo aps o tratamento, a medula ssea ainda foi considerada como a segunda amostra com mais resultados positivos. Das 44 amostras, 86,4% foram positivas e 13,6% negativas. Das seis amostras negativas, duas foram de animais tratados nos grupos 5 e 6 e um animal em cada grupo G2 e G3. Esses dados tambm no apresentaram resultado significativo estatisticamente (p=5759). O lquor novamente foi o que apresentou menor nmero de amostras, e aps um perodo de 15 dias de tratamento, houve menor porcentagem de positivos (27,3%). Sendo que 100% dos animais do G3 apresentaram resultado negativo do lquor aps o perodo de tratamento, mostrando que mesmo sem o antiviral o vrus no seria encontrado livre no lquor com maior tempo de evoluo da doena, condizendo com a literatura existente. A figura 2 evidencia que o lquor foi a pior amostra para a realizao da RT-PCR e foi a amostra que apresentou maior queda dos valores percentuais, aps o tratamento experimental.

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Apesar de ter sido a pior amostra com relao a positividade, no processo de eletroforese, foi a amostra que menos apresentou bandas inespecficas no gel, tanto na RT-PCR quanto na hn-PCR. Na RT-PCR identificou-se bandas com 440 pb e na hn-PCR o produto esperado foi de 331 pb. O grupo que mais precisou fazer a hn-PCR foi G1, onde das 35 amostras, 77,1% foram positivas, sendo o grupo que mais apresentou positividade na hnPCR. Estes resultados no apresentaram significncia estatstica, mas demonstraram a importncia da realizao da hn-PCR para confirmao do resultado. A realizao da hn-PCR tambm foi avaliada frente amostra utilizada para a reao. Estes dados apresentaram significncia estatstica pela necessidade de realizao dessa reao em muitas amostras de lquor em relao ao sangue perifrico e medula ssea (Tabela 2). Das 35 amostras do G1 que foram realizadas hn-PCR, 18 eram de lquor, 11 de sangue e seis de medula ssea. O G1 apresentou 27 (771,%) das amostras positivas na hn-PCR e 22,9% negativas. Das amostras negativas, sete foram de lquor e uma de medula ssea e 100% das amostras de sangue deste grupo foram positivas. Das amostras de medula ssea 83,3% foram positivas. No G2 foram realizadas 29 reaes de hn-PCR, sendo que 15 (51,7%) foram negativas e 14 (48,3%) foram positivas. Das amostras negativas 12 foram de lquor e trs de medula ssea. Novamente 100% das amostras de sangue foram positivas. Neste grupo, as amostras de medula ssea tiveram 57,1% de positividade. No G3 foram realizadas 28 reaes de hn-PCR, sendo que 16 de lquor, seis de medula e sangue. Dessas 28 amostras, 15 (53,6%) foram negativas e 13 (46,4%) foram positivas. Assim como no G2, das amostras de lquor, 75% foram negativas e das amostras de sangue e medula, 83,3% e 66,7% respectivamente foram positivas. Das 25 amostras que foram processadas pela tcnica de hn-PCR no G4, 11 foram de lquor, sete de medula ssea e de sangue perifrico. Neste grupo 100% das medulas foram positivas e apenas 27,3% das amostras de lquor. Das amostras negativas, oito foram de lquor e trs de sangue. No G5 foram realizadas 29 reaes de hn-PCR, sendo que 16 foram de lquor, sete de medula ssea e seis de sangue perifrico. Dessas 29 amostras, 16 (55,2%) foram positivas e 13 (44,8%) foram negativas. Da mesma forma que aconteceu na maioria dos grupos, 62,5% das amostras de lquor foram negativas, 57,1% das medulas foram positivas e 100% das amostras de sangue tambm foram positivas. Assim como nos outros grupos, o G6 apresentou 32 amostras para a realizao da hn-PCR, sendo que 14 foram lquor, nove de sangue e de

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medula. Dessas 32 amostras, 18 (56,3%) foram positivas e 14 (43,8%) foram negativas. Das amostras de lquor 78,6% foram negativas e 66,7% das amostras de medula ssea foram positivas e 100% de sangue foi positivo. Esses resultados no avaliaram o tratamento experimental, mas foi possvel identificar a melhor amostra a ser utilizada neste tipo de estudo, que seria as amostras de sangue e medula associadas, sendo realizada a hn-PCR nas amostras negativas na RT-PCR. Foi possvel identificar uma queda no nmero de reaes positivas no segundo momento de colheita de material. Esta queda aconteceu independente do grupo, ou seja, se o animal foi tratado com o antiviral ou no, pode estar relacionada com a patogenia da cinomose. O grfico evidencia o aumento dos valores percentuais de resultados positivos na hn-PCR no G4, diferente do que ocorreu em todos os outros grupos que apresentaram diminuio destes valores. Como a hn-PCR foi realizada apenas nas amostras que resultaram negativo na RT-PCR, estes dados demonstram que dando grande quantidade de resultados negativos aps o perodo de 15 dias de tratamento e mesmo realizando a hn-PCR os resultados continuaram em sua maior parte negativos no segundo momento. Como o G3 um grupo controle, ou seja, os animais no receberam o tratamento antiviral, e apresentou maior queda dos valores percentuais dos resultados positivos demonstra que este deveria ser um resultado esperado na patogenia da cinomose. Portanto, o que foi possvel verificar que os grupos tratados tiveram uma queda, mas que no foi muito acentuada como o G3. DISCUSSO E CONCLUSO Atualmente, a tcnica da reao em cadeia pela polimerase precedida de transcrio reversa (RT-PCR) vem sendo empregada com sucesso na deteco do vrus da cinomose em diferentes tipos de amostras biolgicas provenientes de ces com sinais clnicos sistmicos e neurolgicos (Barrett 1999, Gebara et al. 2004). Os resultados demonstraram que a tcnica de RTPCR um mtodo eficiente para realizao do diagnstico rpido, precoce e in vivo (Frisk et al. 1999, Sato et al. 2006, Saito et al. 2006, Elia et al. 2008). No atual estudo foram realizadas 308 reaes da RT-PCR, sendo que 130 (42,2%) foram positivas. Foram realizadas 178 reaes da hn-PCR e 102 (57,3%) foram positivas. Assim, das 308 amostras analisadas, 232 (75,32%) foram positivas. A degradao autoltica do RNA viral causada por RNAses endgenas pode ser considerada na possibilidade de resultado falso-negativo (Frisk et al. 1999). No entanto, Saito et al. (2006) afirmam que o soro e o sangue perifrico no so amostras boas para a deteco do vrus da cinomose pelo RT-PCR quando o co apresenta apenas distrbios neurolgicos sem envolvimento sistmico da doena. A baixa celularidade do lquor pode ser insufuciente para a preparao da amostra, que pode causar um inadequado isolamento do RNA viral.

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Assim, os animais que apresentaram diminuio da celularidade liqurica aps o tratamento, tiverem menos chances de encontrar o RNA viral nas amostras. Por isso, a pesquisa teve 75,32% de amostras positivas, j que a tcnica tem alta sensibilidade e especificidade. Segundo Amaral (2007) os iniciadores utilizados foram capazes de amplificar o produto de 440 pb na RT-PCR e na hn-PCR um produto de 331 pb, assim como aconteceu na atual pesquisa. Amaral (2007) encontrou uma frequncia de 43 positivos na hm-PCR das 50 amostras testadas, sendo que o maior nmero ocorreu em zaragatoas genitais, seguido de urina e zaragatoas oculares e clulas brancas do sangue perifrico. Segundo Frisk et al. (1999) foi encontrado o RNA viral pelo RT-PCR em 86% das amostras de soro sanguneo e 88% de sangue circulante e lquor de ces com cinomose confirmada pela imunoistoqumica. Kim et al. (2006) afirmam que amostras incluindo sangue perifrico, swab conjuntival, secreo nasal, urina, lquor, e swab de vagina, tecidos pulmonares, estomacais, intestinais e urinrio podem ser utilizados para o diagnstico de cinomose pela tcnica RT-PCR. Entretanto, o swab conjuntival o mais apropriado para o diagnstico precoce da cinomose. Na atual pesquisa, 95% das amostras de sangue perifrico foram positivos, concordando com os resultados de Frisk et al. (1999). A medula ssea foi a segunda amostra que apresentou maior taxa de positividade (90%), seguida do lquor que apresentou 53,3% de positividade, concordando com os resultados encontrados na literatura. Aps o tratamento, houve um aumento das amostras positiva de sangue (97,7%) e diminuiu as amostras positivas do lquor (27,3%). A diminuio da positividade das amostras de lquor pode estar relacionada diretamente com a diminuio da celularidade do lquor, consequente da diminuio do processo inflamatrio no SNC promovido pelas drogas experimentais. Amaral (2007) e outros autores (Frisk et al., 1999, Shin et al. 2004) observaram que a associao de colheita de diferentes amostras biolgicas por animal aumentou o nmero de resultados positivos. Como foi realizado na atual pesquisa, onde se encontrou positividade em todos os animais antes e aps o tratamento experimental. Alm disso, nos animais do atual estudo, seria indicado o uso do sangue e medula ssea como melhores amostras para o diagnstico da referida enfermidade. Amude et al. (2006) obtiveram resultados negativos de urina e lquor de ces com sintomatologia, exclusivamente neurolgica, com diagnstico de cinomose confirmado pela PCR e pela presena de leses histopatolgicas caractersticas no SNC. Este achado pode explicar que 100% dos animais do G3 apresentaram resultado negativo no lquor aps o perodo de tratamento. Com relao a presena de bandas inespecficas encontradas na atual pesquisa, atravs dos dados de Amaral (2007), autora que desenhou os iniciadores utilizados, no houve a presena destas bandas no seu estudo.

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Portanto, sugere que as bandas encontradas tenham surgido por causa do mtodo de extrao utilizado, o que foi diferente da pesquisa da autora supracitada. Amaral (2007) mostrou que a tcnica da hn-PCR apresentou a mesma sensibilidade analtica que a de Nested-PCR. Shin et al. (2004) levantaram a hiptese de utilizao o nested-PCR para diagnstico da cinomose. A efetividade da tcnica foi demonstrada em amostras clnicas incluindo sangue, urina, swab nasal e saliva. Sendo um mtodo ideal para deteco do vrus da cinomose em amostras clnicas, apresentou alta sensibilidade e consistncia no desempenho laboratorial. Comparativamente ao RT-PCR, mostrou positividade relevante em todas as amostras testadas (Jzwik & Frimus 2005). RT-PCR combinada com o nested-PCR mostrou mais especfico e sensvel mtodo para diagnstico ante-mortem da cinomose, especialmente nas formas subagudas e crnicas, quando o vrus no se encontra mais em epitlios e a reao de imunofluorescncia foi resultado negativo (Jzwik & Frimus 2005). Na atual pesquisa confirmou-se a necessidade da realizao da hn-PCR porque das 178 amostras negativas na RT-PCR, 57,3% foram positivas na hnPCR. Sendo que das 178 amostras, 89 eram de lquor, 47 de sangue e 42 de medula ssea. Quando analisamos os resultados da hn-PCR em relao ao tratamento experimental utilizado, verificamos que houve aumento dos valores percentuais de resultados positivos na hn-PCR no G4, diferente do que ocorreu em todos os outros grupos que apresentaram diminuio destes valores. O G4 um dos grupos controle e no recebeu antiviral, somente a prednisona em dose imunossupressora, assim sugere que este tratamento no foi capaz combater o vrus e diminuir sua distribuio no organismo. No entanto, o G3 tambm um grupo controle, ou seja, os animais no receberam o tratamento antiviral, e apresentou maior queda dos valores percentuais dos resultados positivos demonstra que este deveria ser um resultado esperado na patogenia da cinomose. Portanto, o que foi possvel verificar que os grupos tratados tiveram uma queda, mas que no foi acentuada como no G3. REFERNCIAS ALI, B. H. Dimethyl Sulfoxide: Recent pharmalogical and toxicological research. Veterinary and Human Toxicology, v. 43, n. 4, p. 228-231, 2001. AMARAL, H. A. Deteco do vrus da cinomose pela tcnica de RT-PCR em ces com sintomatologia neurolgica . 2007. Tese (Doutorado). Universidade de So Paulo, Programa de Ps-Graduao em Clnica Veterinria, So Paulo, SP. AMUDE, A. M.; ALFIERI, A. A.; ALFIERI, A. F. The nervous form of canine distemper. Veterinria e Zootecnia, v. 13, p. 125-136, 2006.

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monophosphate and guanosine in dimetylsulfoxide. Nucleic Acids Research, v. 22, n. 23, p. 5128-5134, 1994. Tabela 1 Descrio da sequncia de nucleotdeos iniciadores utilizados na reao de RT-PCR e hn-PCR.
Primers (nmero de acesso aos genes) Primer ITS 1 F (10 pmol) CVD-NPS F1 5-3 Primer ITS 1 R (10 pmol) CVD-NPS R1 5-3 Primer ITS 2 R (10 pmol) CVD-NPS R2 5-3 CGAATTTTAACCCTCCATG CCTTGGTGATGCCAAGCTCG Iniciadores ATCCCCAGGRAACAAGCCTACAA

(AMARAL, 2007). Tabela 2 Relao dos resultados positivos e negativos da hn-PCR em relao ao tipo de amostra, independente do grupo experimental.
Amostras n Sangue Medula ssea Lquor Total 43,0 30,0 29,0 102,0 Positivo % 91,5 71,4 32,6 57,3 n 4,0 12,0 60,0 76,0 Negativo % 8,5 28,6 67,4 42,7 n 47,0 42,0 89,0 178 Total % 100,0 100,0 100,0 100,0

Estatstica: Qui-quadrado, p=0,0000. n: nmero de amostras. %: porcentagem.

Figura 1 Representao grfica da avaliao do tratamento experimental segundo a sobrevida dos animais nos diferentes grupos.

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7 6 Nmero de animais 5 4 3 2 1 0 G1 G2 G3 G4 G5 G6 Grupos Experimentais Estatstica: Teste G de Willians; p=0,4034 G1: grupo 1; G2: grupo 2; G3: grupo 3; G4: grupo 4; G5: grupo 5; G6: grupo 6 bito sobrevida melhora

Figura 2 Representao grfica dos resultados positivos para o vrus da cinomose nas diferentes amostras, antes e aps o tratamento, independente do grupo experimental.
% de resultados positivos na RT-PCR

100 80 60 40 20 0 1 15 Sangue Medula ssea Lquor Sangue Medula ssea Lquor

Dias de Tratamento

Estatstica: Qui-quadrado.

Figura 3 Representao grfica dos valores percentuais dos resultados positivos da hn-PCR antes e aps o tratamento nos diferentes grupos experimentais.

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90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1 15

% de resultados positivos

G1 G2 G3 G4 G5 G2 G3 G4 G5 G6 G6

G1

Dias de Tratamento

Estatstica: Qui-quadrado. %: porcentagem. G1: grupo 1; G2: grupo 2; G3: grupo 3; G4: grupo 4; G5: grupo 5; G6: grupo 6.

NORMAS DA REVISTA
Apresentao de manuscritos

1. Os trabalhos devem ser organizados, sempre que possvel, em Ttulo, ABSTRACT, RESUMO, INTRODUO, MATERIAL E MTODOS, RESULTADOS, DISCUSSO, CONCLUSES (ou combinao destes dois ltimos), Agradecimentos e REFERNCIAS: a) o Ttulo do artigo deve ser conciso e indicar o contedo do trabalho; pormenores de identificao cientfica devem ser colocados em MATERIAL E MTODOS. b) O(s) Autor(es) deve(m) sistematicamente encurtar os nomes, tanto para facilitar sua identificao cientfica, como para as citaes bibliogrficas. Em muitos casos isto significa manter o primeiro nome e o ltimo sobrenome e abreviar os demais sobrenomes: Paulo Fernando de Vargas Peixoto escreve Paulo V. Peixoto ou Peixoto P.V.; Franklin Riet-Correa Amaral escreve Franklin Riet-Correa ou Riet-Correa F.; Silvana Maria Medeiros de Sousa Silva poderia usar Silvana M.M.S. Silva, inverso Silva S.M.M.S., ou Silvana M.M. Sousa-Silva, inverso, Sousa-Silva S.M.M., ou mais curto, Silvana M. Medeiros-Silva, e inverso, Medeiros-Silva S.M.; para facilitar, inclusive, a moderna indexao, recomenda-se que os trabalhos tenham o mximo de 8 autores; c) o ABSTRACT dever ser apresentado com os elementos constituintes do RESUMO em portugus, podendo ser mais explicativos para estrangeiros.

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Ambos devem ser seguidos de "INDEX TERMS" ou "TERMOS DE INDEXAO", respectivamente; d) o RESUMO deve apresentar, de forma direta e no passado, o que foi feito e estudado, indicando a metodologia e dando os mais importantes resultados e concluses. Nos trabalhos em ingls, o ttulo em portugus deve constar em negrito e entre colchetes, logo aps a palavra RESUMO; e) a INTRODUO deve ser breve, com citao bibliogrfica especfica sem que a mesma assuma importncia principal, e finalizar com a indicao do objetivo do trabalho; f) em MATERIAL E MTODOS devem ser reunidos os dados que permitam a repetio do trabalho por outros pesquisadores. Na experimentao com animais, deve constar a aprovao do projeto pela Comisso de tica local; g) em RESULTADOS deve ser feita a apresentao concisa dos dados obtidos. Quadros devem ser preparados sem dados suprfluos, apresentando, sempre que indicado, mdias de vrias repeties. conveniente, s vezes, expressar dados complexos por grficos (Figuras), ao invs de apresent-los em Quadros extensos; h) na DISCUSSO devem ser discutidos os resultados diante da literatura. No convm mencionar trabalhos em desenvolvimento ou planos futuros, de modo a evitar uma obrigao do autor e da revista de public-los; i) as CONCLUSES devem basear-se somente nos resultados apresentados no trabalho; j) Agradecimentos devem ser sucintos e no devem aparecer no texto ou em notas de rodap; k) a Lista de REFERNCIAS, que s incluir a bibliografia citada no trabalho e a que tenha servido como fonte para consulta indireta, dever ser ordenada alfabeticamente pelo sobrenome do primeiro autor, registrando-se os nomes de todos os autores, em caixa alta e baixa (colocando as refer ncias em ordem cronolgica quando houver mais de dois autores), o ttulo de cada publicao e, abreviado ou por extenso (se tiver dvida), o nome da revista ou obra, usando as instrues do "Style Manual for Biological Journals" (American Institute for Biological Sciences), o "Bibliographic Guide for Editors and Authors" (American Chemical Society, Washington, DC) e exemplos de fascculos j publicados (www.pvb.com.br). 2. Na elaborao do texto devero ser atendidas as seguintes normas: a) os trabalhos devem ser submetidos seguindo o exemplo de apresentao de fascculos recentes da revista e do modelo constante do site sob "Instrues aos Autores" (www.pvb.com.br). A digitalizao deve ser na fonte Helvtica, corpo 11, entrelinha simples ; a pgina deve ser no formato A4, com 2cm de margens (superior, inferior, esquerda e direita), o texto deve ser

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corrido e no deve ser formatado em duas colunas, com as legendas das figuras e os Quadros no final (logo aps as REFERNCIAS). As Figuras (inclusive grficos) devem ter seus arquivos fornecidos separados do texto. Quando includos no texto do trabalho, devem ser introduzidos atravs da ferramenta "Inserir" do Word; pois imagens copiadas e coladas perdem as informaes do programa onde foram geradas, resultando, sempre, em m qualidade; b) a redao dos trabalhos deve ser concisa, com a linguagem, tanto quanto possvel, no passado e impessoal; no texto, os sinais de chamada para notas de rodap sero nmeros arbicos colocados em sobrescrito aps a palavra ou frase que motivou a nota. Essa numerao ser contnua por todo o trabalho; as notas sero lanadas ao p da pgina em que estiver o respectivo sinal de chamada. Todos os Quadros e todas as Figuras sero mencionados no texto. Estas remisses sero feitas pelos respectivos nmeros e, sempre que possvel, na ordem crescente destes. ABSTRACT e RESUMO sero escritos corridamente em um s pargrafo e no devero conter citaes bibliogrficas. c) no rodap da primeira pgina dever constar endereo profissional completo de todos os autores e o e-mail do autor para correspondncia, bem como e-mails de outros autores; d) siglas e abreviaes dos nomes de instituies, ao aparecerem pela primeira vez no trabalho, sero colocadas entre parnteses e precedidas do nome por extenso; e) citaes bibliogrficas sero feitas pelo sistema "autor e ano"; trabalhos de at trs autores sero citados pelos nomes dos tr s, e com mais de trs, pelo nome do primeiro, seguido de "et al.", mais o ano; se dois trabalhos no se distinguirem por esses elementos, a diferenciao ser feita atravs do acrscimo de letras minsculas ao ano, em ambos. Trabalhos no consultados na ntegra pelo(s) autor(es), devem ser diferenciados, colocando-se no final da respectiva referncia, "(Resumo)" ou "(Apud Fulano e o ano.)"; a referncia do trabalho que serviu de fonte, ser includa na lista uma s vez. A meno de comunicao pessoal e de dados no publicados feita no texto somente com citao de Nome e Ano, colocando-se na lista das Referncias dados adicionais, como a Instituio de origem do(s) autor(es). Nas citaes de trabalhos colocados entre parnteses, no se usar vrgula entre o nome do autor e o ano, nem ponto-e-vrgula aps cada ano; a separao entre trabalhos, nesse caso, se far apenas por vrgulas, exememplo: (Christian & Tryphonas 1971, Priester & Haves 1974, Lemos et al. 2004, Krametter-Froetcher et. al. 2007); f) a Lista das REFERNCIAS dever ser apresentada isenta do uso de caixa alta, com os nomes cientficos em itlico (grifo), e sempre em conformidade com o padro adotado nos ltimos fascculos da revista, inclusive quanto ordenao de seus vrios elementos. 3. As Figuras (grficos, desenhos, mapas ou fotografias) originais devem ser preferencialmente enviadas por via eletrnica. Quando as fotos forem obtidas atravs de cmeras digitais (com extenso "jpg"), os arquivos devero ser enviados como obtidos (sem tratamento ou alteraes). Quando obtidas em papel

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ou outro suporte, devero ser anexadas ao trabalho, mesmo se escaneadas pelo autor. Nesse caso, cada Figura ser identificada na margem ou no verso, a trao leve de lpis, pelo respectivo nmero e o nome do autor; havendo possibilidade de dvida, deve ser indicada a parte inferior da figura pela palavra "p". Os grficos devem ser produzidos em 2D, com colunas em branco, cinza e preto, sem fundo e sem linhas. A chave das convenes adotadas ser includa preferentemente, na rea da Figura; evitar-se- o uso de ttulo ao alto da figura. Fotografias devero ser apresentadas preferentemente em preto e branco, em papel brilhante, ou em diapositivos ("slides"). Para evitar danos por grampos, desenhos e fotografias devero ser colocados em envelope. Na verso online, fotos e grficos podero ser publicados em cores; na verso impressa, somente quando a cor for elemento primordial a impresso das figuras poder ser em cores. 4. As legendas explicativas das Figuras contero informaes suficientes para que estas sejam compreensveis, (at certo ponto autoexplicatvas , com independncia do texto) e sero apresentadas no final do trabalho. 5. Os Quadros devero ser explicativos por si mesmos e colocados no final do texto. Cada um ter seu ttulo completo e ser caracterizado por dois traos longos, um acima e outro abaixo do cabealho das colunas; entre esses dois traos poder haver outros mais curtos, para grupamento de colunas. No h traos verticais. Os sinais de chamada sero alfabticos, recomeando, se possvel, com "a" em cada Quadro; as notas sero lanadas logo abaixo do Quadro respectivo, do qual sero separadas por um trao curto esquerda.

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Anexo 1
FICHA CLNICA Data: ___/___/____ - X dia Nome: _________________________ Esp: Canina Raa: __________________________ Idade: __________ RG: __________________ N animal: Grupo tratamento: ( ) Ribavirina (I) ( ) Ribavirina + DMSO (II) Anamnese / Hitrico: ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ___________________________________ EXAME CLNICO NEUROLGICO: Tempo de evoluo: _____________________ 1. Cabea: Nvel de conscincia: ( ) Alerta ( ) Delrios ( ) Aptico/Deprimido ( ) Semicomatoso (responsivo ao estmulo visual) ( ) Semicomatoso (responsivo ao estmulo auditrio) ( ) Semicomatoso (responsivo somente aos estmulos neurolgicos repetidos) ( ) Comatoso ( ) Hiperexcitabilidade ( ) Agressividade ( ) Balanar a cabea ( ) Andar em crculos Comportamento: ( ) Convulso ( ) Andar compulsivo

( ) Presso da cabea contra objetos ( ) Vocalizao Postura: ( ) Desvio lateral da cabea ( ) Giro ortotnico da cabea e pescoo ( ) Tremores 2. Nervos cranianos: ( ) Opisttono N = normal; = ausente; P = presente; D = diminudo; A = Direita Esquerda

Pares de Nervos I Par Olfatrio II Par ptico III Par Reflexo pupilar direto

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Reflexo pupilar consensual Estrabismo lateral IV Par Estrabismo dorso medial V Par Reflexo palpebral (sensitivo) Sensibilidade da face (sensitivo) Mastigao (motor) Massa muscular (motor) VI Par Estrabismo medial VII Par Ptose auricular (motor) Ptose palpebral (motor) Ptose labial (motor) Pares de Nervos VIII Par Audio Desvio da cabea Estrabismo ventro-lateral Nistagmo Fisiolgico Horizontal Vertical Rotacional Posicional Fase rpida IX e X Deglutio (motor) Pares XI Par Atrofia Braquiceflico muscular Esternoceflico Omotransverso Trapzio XII Par Protuso / Desvio de lngua Atrofia

Direita

Esquerda

3. Andar: ( ) Padro normal de locomoo; ( ) Dficits dificilmente observados durante a locomoo em linha reta, mas confirmados aps a realizao de manobras especiais; ( ) Dficits facilmente observados durante a locomoo em linha reta e exarcebados durante a realizao de manobras especiais; ( ) Apresenta postura anormal mesmo quando parado; ( ) Quedas espontneas durante a locomoo; ( ) Decbito permanente; ( ) Ataxia. 5. Reaes posturais: = Ausente P = presente Anterior Esquerdo Posterior Direito Esquerdo

Direito Paresia Hipermetria Hipometria

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Espasticidade Falcidez

N = normal; = ausente; P = presente; D = diminudo; A = Membros Anteriores Esq. Propriocepo Tnus do pescoo Sensibilidade Superficial Profunda Reflexo biceptal (face anglo-medial do cotovelo) Reflexo triciptal (olecrano) Reflexo carpo-radial Reflexo flexor Membros Posteriores Esq. Propriocepo Propulso extensora Sensibilidade Superficial Profunda Reflexo patelar Reflexo gastrocnmio Reflexo tibial cranial Reflexo flexor 5. Cauda e nus: N = normal; = ausente; P = presente; D = diminudo; A = Tnus Reflexos Sensibilidade Superficial Profunda Dir. Dir.

Cauda nus 6. Mioclonias: Grupo muscular: ______________________________ ______________________________ ______________________________ EXAMES COMPLEMENTARES: - Hemograma completo - Uria

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- ALT - FA - GGT - Albumina - Bilirrubinas ADIMINISTRADO RIBAVIRINA? ADIMINISTRADO DMSO?

- Creatinina - Urinlise

( ) Sim

) No

( ) Sim

( ) No

ALGUM EFEITO TXICO? QUAL?