Modulo 008

MICROBIOLOGIA CLNICA PARA O CONTROLE DE INFECO RELACIONADA ASSISTNCIA SADE
Mdulo 8: Deteco e Identificao de Fungos de Importncia Mdica
Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria | Anvisa
AGNCIA NACIONAL DE VIGILNCIA SANITRIA ANVISA
MICROBIOLOGIA CLNICA PARA O CONTROLE DE INFECO RELACIONADA ASSISTNCIA SADE Mdulo 8: Deteco e Identificao dos Fungos de Importncia Mdica
Copyright 2013 Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria. Todos os direitos reservados. permitida a reproduo parcial ou total dessa obra, desde que citada a fonte e que no seja para venda ou qualquer fim comercial. A responsabilidade pelos direitos autorais de textos e imagens dessa obra da rea tcnica. A Anvisa, igualmente, no se responsabiliza pelas idias contidas nessa publicao. 1 edio 2010 Elaborao, distribuio e informaes: AGNCIA NACIONAL DE VIGILNCIA SANITRIA SIA Trecho 5, rea Especial 57 CEP: 71205-050 Braslia DF Tel.: (61) 3462-6000 Home page: www.anvisa.gov.br Diretoria Dirceu Brs Aparecido Barbano Diretor-Presidente Jaime Cesar de Moura Oliveira Jos Agenor lvares da Silva Adjuntos de Diretor Luiz Roberto Klassmann Luciana Shimizu Takara Neilton Araujo de Oliveira Doriane Patricia Ferraz de Souza Gerncia Geral de Tecnologia em Servios de Sade GGTES Diana Carmem Almeida Nunes de Oliveira Gerncia de Vigilncia e Monitoramento em Servios de Sade GVIMS Magda Machado de Miranda Costa Coordenao Tcnica: Ana Clara Ribeiro Bello dos Santos Anvisa Carlos Emlio Levy Universidade de Campinas-SP Redao: Anglica Zaninelli Schreiber Universidade de Campinas (UNICAMP)-SP Carlos Emlio Levy Universidade de Campinas (UNICAMP)-SP Cludia Maria Leite Maffei Universidade de So Paulo (USP-Ribeiro Preto)-SP Mrcia de Souza Carvalho Melhem Instituto Adolfo Lutz (IAL)-SP e Secretaria Estadual da Sade de So Paulo SP Reviso tcnica Anvisa: Andr Anderson Carvalho Fabiana Cristina de Sousa Heiko Thereza Santana Magda Machado de Miranda Suzie Marie Gomes Cooperao tcnica: Termo de Cooperao n 64 Organizao Pan-Americana da Sade Organizao Mundial da Sade Representao Brasil Joaquin Molina Representante Enrique Vazquez Coordenador da Unidade Tcnica de Doenas Transmissveis e No Transmissveis e Anlise de Situao de Sade Rogrio da Silva Lima Consultor Nacional da Unidade Tcnica de Doenas Transmissveis e NoTransmissveis e Anlise de Situao de Sade Projeto Grfico e Diagramao: All Type Assessoria Editorial Ltda Capa: Camila Contarato Burns Anvisa
Ficha Catalogrfica Brasil. Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria Microbiologia Clnica para o Controle de Infeco Relacionada Assistncia Sade. Mdulo 8: Deteco e identificao de fungos de importncia mdica /Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria. Braslia: Anvisa, 2013. 46p..: il.9 volumes ISBN 1. Infeco Relacionada Assistncia Sade Controle. 2. Infeco em Servios de Sade. 3. Microbiologia Clnica. 4. Vigilncia Sanitria em Servios de Sade. 5. Resistncia microbiana. I. Ttulo.
Sumrio
Apresentao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 Captulo 1: Deteco e Identificao dos Fungos de Importncia Mdica . . . . . . . . . . . . 7 1.1 Introduo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 1.1.1 Fungos e Infeco Relacionada Assistncia Sade . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 1.2 Coleta, transporte e armazenamento de amostras. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 1.2.1 Recomendaes gerais de coleta e transporte de amostras. . . . . . . . . . . . . . . . 12 1.3 Processamento de amostras. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 1.3.1 Exame microscpico de amostras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 1.3.2 Exame microscpico direto com hidrxido de potssio (KOH) a 20%. . . . . . . 16 1.3.3 Exame microscpico direto com tinta nanquim (tinta da China) . . . . . . . . . . . 16 1.3.4 Exame microscpico com colorao pelo mtodo de Gram. . . . . . . . . . . . . . . . 17 1.3.5 Exame microscpico com colorao pantica (Giemsa, Leishman ou Wright). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 1.3.6 Cultura de amostras biolgicas para isolamento de fungos. . . . . . . . . . . . . . . . 19 1.3.7 Meios de cultura. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 1.3.8 Procedimentos para cultura. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 1.4 Identificao de fungos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 1.4.1 Identificao de leveduras (morfolgica e bioqumica). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 1.4.2 Prova do tubo germinativo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 1.4.3 Cultivo em lmina para prova de filamentao e produo de clamidsporo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 1.4.4 Prova da urease. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 1.4.5 Prova de assimilao de fontes de carbono e nitrognio ou auxanograma. 28 1.4.6 Fermentao de acares ou zimograma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 1.4.7 Mtodos comerciais para identificao de leveduras. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 1.4.8 Identificao de fungos filamentosos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 1.4.9 Tcnica de microcultivo para fungos filamentosos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 1.4.10 Identificao de fungos dimrficos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 1.5 Descrio das principais micoses observadas no Brasil. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 1.5.1 Micoses superficiais. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 1.5.2 Micoses subcutneas e profundas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 1.5.3 Micoses oportunistas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 1.6 Corantes e meios de cultura. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 Corante Azul de lactofenol-algodo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 1.7 Glossrio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43 1.8 Referncias Bibliogrficas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
Mdulo 8: Deteco e Identificao dos Fungos de Importncia Mdica
Apresentao
A resistncia microbiana um grave problema mundial, estando associada ao aumento do tempo de internao, dos custos do tratamento e das taxas de morbidade e mortalidade dos pacientes. O uso indiscriminado e incorreto dos antimicrobianos na comunidade e no ambiente hospitalar reconhecidamente um importante fator de risco para o aparecimento e a disseminao da resistncia microbiana. Nesse contexto, insere-se o Laboratrio de Microbiologia, que tem como objetivo no apenas apontar o responsvel por um determinado estado infeccioso, mas tambm indicar, atravs do monitoramento de populaes microbianas, qual o perfil dos micro-organismos que esto interagindo com o organismo humano, possibilitando a indicao de tratamentos mais adequados. Para o desempenho satisfatrio dessa funo, fundamental que os laboratrios de microbiologia possuam estrutura capaz de estabelecer informaes sobre a melhor amostra biolgica, reconhecer a microbiota e os contaminantes, identificar micro-organismos associados infeco ou com propsitos epidemiolgicos, obter resultados rpidos em casos de emergncia, realizar o transporte rpido das amostras e manter uma educao contnua em relao aos aspectos da infeco relacionada assistncia sade. Tendo em vista esses aspectos e considerando que a microbiologia um campo muito dinmico, a Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria Anvisa, em cooperao com a Organizao Pan-Americana da Sade OPAS, prope a terceira reviso do Manual de Procedimentos Bsicos em Microbiologia Clnica para o Controle de Infeco Relacionada Assistncia Sade, buscando atualizar informaes nos temas considerados essenciais e contando com um seleto e conceituado corpo editorial. O manual composto por nove mdulos, a saber: Mdulo 1 Biossegurana e manuteno de equipamentos em laboratrio de microbiologia clnica; Mdulo 2 Controle externo da qualidade; Mdulo 3 Principais Sndromes Infecciosas; Mdulo 4 Procedimentos laboratoriais: da requisio do exame anlise microbiolgica e laudo final; Mdulo 5 Tecnologias em Servios de Sade: descrio dos meios de cultura empregados nos exames microbiolgicos; Mdulo 6 Deteco e identificao de bactrias de importncia mdica; Mdulo 7 Deteco e identificao de micobactrias de importncia mdica; Mdulo 8 Deteco e identificao de fungos de importncia mdica e Mdulo 9 Infeces virais. A Anvisa e a OPAS esperam com essa publicao contribuir para que os laboratrios de microbiologia possam assimilar e alcanar novos nveis de complexidade laboratorial, atendendo s exigncias e caractersticas prprias de cada unidade hospitalar, alm de subsidiar a adoo de procedimentos bsicos padronizados nesses servios.
Captulo 1: Deteco e Identificao dos Fungos de Importncia Mdica

Anglica Zaninelli Schreiber Cludia Maria Leite Maffei Mrcia de Souza Carvalho Melhem Carlos Emlio Levy
1.1 Introduo
1.1.1 Fungos e Infeco Relacionada Assistncia Sade Os avanos da medicina que permitem a sobrevida de pacientes crticos e imunocomprometidos, uso de antimicrobianos de amplo espectro, implementao das tcnicas de transplantes de rgos slidos e de medula ssea so alguns dos fatores que tm transformado a rotina diagnstica dos laboratrios de microbiologia e micologia. Antes preocupados apenas com a deteco de patgenos fngicos clssicos (Quadro 1), hoje se deparam cada vez mais com a visualizao e isolamento de fungos considerados saprfitas, oportunistas e potencialmente patognicos, com a difcil tarefa de identific-los e, em conjunto com o clnico, valorizar ou no esse achado no material clnico coletado.
Quadro 1 Principais infeces micticas que acometem os seres humanos no Brasil

MICOSES CLSSICAS Superficiais Pitirase versicolor Cutneas Dermatofitoses Subcutneas Cromomicose, esporotricose Profundas Paracoccidioidomicose, Histoplamose OPORTUNISTAS Superficiais Candidases Dermatomicoses Invasivas - Candidemia - Criptococose - Aspergilose - Fusariose - Zigomicoses - Outras hialohifomicoses - Feohifomicoses
Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria Anvisa
Agentes como espcies de Aspergillus, Candida, Cryptococcus e zigomicetos, considerados, anteriormente, como contaminantes ambientais e, portanto, de pouca importncia clnica, so agora conhecidos agentes causais de enfermidades disseminadas, tais como as endocardites, infeces pulmonares, ceratites, entre outras, em pacientes imunodeprimidos. Dessa forma, esses fungos devem ser considerados, ao lado dos patgenos clssicos, como possveis agentes de quadros infecciosos. Dentre as centenas de espcies descritas, leveduras do gnero Candida so os importantes agentes de infeco relacionada assistncia sade e representam um desafio para a sobrevida de pacientes com doenas graves e aqueles em perodo ps-operatrio. Hospitais norte-americanos com sistema de vigilncia operante notificaram espcies de Candida como 6o patgeno nosocomial e a 4a causa mais comum de infeces de corrente sangunea, adquiridas em hospitais. Diferentes espcies de Candida podem causar quadros de fungemia, a saber: Candida albicans, Candida glabrata (Torulopsis glabrata), Candida tropicalis; Candida parapsilosis, Candida krusei, Candida guilliemondii, Candida lusitaniae, Candida lipolytica, Candida kefyr, Candida inconspicua, Candida norvergensis e Candida catenulata. Um grupo europeu realizou na dcada de 90 um estudo multicntrico e, por anlise univariada, concluram ser C. glabrata a espcie associada maior taxa de mortalidade e que o bito estava relacionado com maior idade e severidade da doena de base do paciente. A manifestao clnica mais comum nas candidases hospitalares febre. A candidemia pode ser definida como a ocorrncia de duas ou mais culturas positivas para a mesma espcie de Candida provenientes de amostras diferentes, coletadas aps 72 horas da admisso. A infeco invasiva por Candida spp. pode ser tambm considerada quando seu isolamento ocorrer a partir de material clnico estril, associado a, pelo menos, um outro sinal de infeco. A sensibilidade da hemocultura para Candida spp. baixa, aproximadamente 50% dos pacientes com infeco invasiva podem ter culturas negativas. Alm disso, se houver infeco bacteriana concomitante, essa pode diminuir a chance do isolamento da levedura. Os fatores de risco reconhecidos para infeco invasiva por Candida spp. so:

Permanncia > 4 dias em UTI Antibitico-terapia de largo espectro Cirurgia abdominal Cateterizao venosa central
Nutrio parenteral total Imunodepresso ndice APACHE II > 10 Ventilao mecnica > 48h Neutropenia Quimioterapia citotxica
O gnero Candida , sem dvida, o mais importante, mas existem outras leveduras no ambiente hospitalar, tanto em vegetais, ar atmosfrico e gua quanto na pele e no trato gastrointestinal dos pacientes e funcionrios, que podem causar quadros infecciosos. Os principais gneros so Pichia spp. (Hansenula spp.), Rhodotorula spp. e Trichosporon spp. Em adio, fungos filamentosos presentes no ambiente hospitalar tambm podem causar infeco em pacientes suscetveis. O gnero Aspergillus spp. (Aspergillus terreus, A. fumigatus, A. flavus e A. niger) o mais citado na literatura como fungo oportunista, especialmente em pacientes submetidos a transplante de medula ssea e neutropnicos. A inalao de esporos a via mais comum de transmisso e os surtos de aspergilose podem ser associados a reformas e construes, dentro e ao redor de hospitais. Doena pulmonar e, mais raramente, sinusite so as manifestaes de aspergilose. Outros gneros tais como: Fusarium sp., Acremonium sp., Penicillium sp., outros hifomicetos como zigomicetos (Rhizopus sp., Mucor sp.) e alguns feo-hifomicetos (fungos negros ou demcios), tambm dispersos no ar, so capazes de causar formas localizadas ou disseminadas de infeco relacionada assistncia sade. Diante dessas condies, recomenda-se monitorao com exames micolgicos de amostras biolgicas dos pacientes, tais como sangue, escarro, pontas de catteres intravasculares, lquido peritoneal e urina. Culturas positivas podem significar apenas colonizao, mas podem conduzir doena invasiva subsequente. Estudo prospectivo em pacientes cirrgicos de UTI mostrou que 38% de 29 pacientes desenvolveram infeco aps colonizao. A colonizao pode ser demonstrada por anlise de trs ou mais amostras, coletadas do mesmo local ou de locais diferentes, do mesmo paciente, em dias consecutivos. Nesse mdulo, ser apresentada uma viso geral das principais infeces fngicas, para que os microbiologistas possam adquirir certa habilidade para identificar fungos isolados de amostras biolgicas. Para um estudo mais
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completo sobre diagnstico de infeces fngicas, recomendam-se as referncias citadas ao final do captulo. Caractersticas gerais dos fungos Fungos so seres dispersos no meio ambiente, em vegetais, ar atmosfrico, solo e gua e, embora sejam estimados em 250 mil espcies, menos de 150 foram descritos como patgenos aos seres humanos. Os fungos de interesse mdico, agentes de micoses, apresentam-se sob dois tipos morfolgicos: leveduras, prevalentemente unicelulares e bolores ou fungos filamentosos, que so multicelulares (Figura 1). H ainda importantes agentes de micoses endmicas que, na dependncia principalmente da temperatura, mas sob influncia tambm do teor de CO2 e condies nutricionais, podem se apresentar sob ambas as formas sendo chamados fungos dimrficos. Figura 1 Estruturas microscpicas bsicas de fungos filamentosos (a, b, c) e leveduras (d, e).
Leveduras so fungos capazes de colonizar o homem e animais e, frente perda do equilbrio parasita-hospedeiro, podem causar diversos quadros infecciosos com formas clnicas localizadas ou disseminadas. De modo contrrio, fungos filamentosos, ou bolores, normalmente, no fazem parte da microbiota animal e, portanto o homem no um reservatrio importante para esse grupo de fungos. As portas de entrada no hospedeiro so as vias areas superiores ou quebra na barreira epidrmica aps traumatismos com objetos perfuro-cortantes.
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As leveduras tm como estrutura primria, visvel ao microscpio tico a partir de material clnico ou colnias em cultura, clulas que se reproduzem por brotamento, nico ou mltiplo, em geral, de forma arredondada. Essas clulas so esporos de origem assexual e so denominadas blastocondios. Alguns gneros de leveduras menos importantes em micologia mdica, reproduzem-se por fisso. Sob determinadas condies, as leveduras podem produzir pseudohifas (importantes para o processo de identificao presuntiva de espcies do gnero Candida) ou at mesmo hifas verdadeiras. A macromorfologia das colnias de leveduras a partir de crescimento em meios no diferenciais como gar sabouraud dextrose no permite a diferenciao de gneros. A exceo a colnia mucoide caracterstica do gnero Cryptococcus. Assim, a identificao de leveduras realizada, principalmente, por caractersticas fisiolgicas. Os fungos filamentosos possuem como elemento constituinte bsico a hifa, que pode ser septada ou no septada (cenoctica), hialina (hifomicetos) ou demcea (feo-hifomicetos). A partir da hifa formam-se esporos, para propagao das espcies. Na grande maioria dos fungos, os esporos podem ser chamados de condios, pois nascem diretamente delas ou sobre estruturas ligadas a elas. Esses conceitos fundamentais representam a base para a identificao de um fungo, pois a classificao de filamentosos feita, em geral, pela associao de caractersticas morfolgicas macroscpicas (cor, aspecto, textura da colnia, produo de pigmento difusvel no meio, etc.), microscpicas (forma e cor da hifa, presena ou no de septos, tipo e arranjo de esporos, etc.) e de velocidade de crescimento (lenta, moderada ou rpida).
1.2 Coleta, transporte e armazenamento de amostras

O tipo e a qualidade da amostra biolgica, submetida ao laboratrio de micologia, so fatores pr-analticos extremamente importantes para o sucesso do isolamento e identificao do verdadeiro agente etiolgico de infeces fngicas. Para tanto, a coleta do material biolgico, seu transporte e armazenamento adequados devem ser cuidadosamente considerados. O correto diagnstico laboratorial micolgico tambm depende de outros aspectos como:
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experincia do profissional que vai executar o exame; adequada comunicao entre os clnicos, vigilncia e laboratrio, essencial para direcionamento do tipo de amostra e quantidade a ser coletada; cuidados de coleta, frascos e meios utilizados para transporte e armazenamento das amostras; identificao correta das amostras, incluindo a identificao do paciente, data de coleta, presuno de diagnstico, para auxiliar no direcionamento das anlises laboratoriais e tempo de resposta ao clnico pelo laboratrio. Recomendaes gerais de coleta e transporte de amostras A esterilizao e desinfeco dos materiais necessrios dever ser realizada previamente, conforme recomendaes especficas. Lavar as mos e sec-las. As amostras devem ser identificadas com nome do paciente, nmero de registro hospitalar (quando for o caso), tipo de amostra e data da coleta, entre outras informaes adicionais para auxiliar o laboratrio no direcionamento dos exames. Coletar a amostra biolgica aps antissepsia e coloc-la em recipiente estril e vedado, conforme orientao para pesquisa de agente, em quantidade suficiente (>2 mL ou 0,5 cm3 ou duplicada) e no perodo de coleta apropriado, conforme especificao de agente em estudo, para permitir todos os procedimentos laboratoriais necessrios. Os swabs so usados para coleta apenas para realizao do exame cultura, de materiais tais como: ouvido, nasofaringe, orofaringe e boca. Esses devem ser colocados em tubos contendo salina estril e devem ser transportados o mais rpido possvel e/ou conservados a 4C durante o prazo de 8 a 10 horas, de modo a evitar a dessecao da amostra. Os materiais ditos contaminados, tais como urina, fezes, pus, secrees de feridas ou trato respiratrio, devem ser enviados, sob refrigerao a 4C, ao laboratrio, o mais rpido possvel, at 18 horas. Lquor e lquidos cavitrios devem ser coletados sob cuidados de antissepsia antes da puno e enviados em tubo estril selado hermeticamente e transportados o mais rpido possvel, para assegurar o diagnstico, mantidos temperatura ambiente. Sangue e material de puno de medula ssea so os nicos materiais biolgicos que devem ser semeados diretamente, em frascos contendo meio de cultura lquido ou bifsico (lquido sobre slido), de modo a evitar coagulao e consequente diminuio da sensibilidade do exame, o transporte deve ser em temperatura ambiente, entretanto encaminhar o mais rpido possvel ao laboratrio, uma vez que o processamento dessas amostras deve ser realizado em, no mximo, 8 a 9 horas.
1.2.1
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Recomendaes adicionais: Sempre que possvel, coletar amostras antes do incio da terapia especfica e, particularmente, para leses cutneas de pele e unhas, orientar o paciente para evitar uso de medicao tpica por 4 a 5 dias antes da coleta de escamas. A requisio mdica que acompanha a amostra deve conter, sempre que possvel, as hipteses diagnsticas que auxiliaro o micologista na escolha da colorao e do meio de cultura mais adequado para o isolamento do agente etiolgico suspeitado. Em pacientes imunodeprimidos ou muito debilitados o estudo de um mesmo tipo de amostra biolgica, coletada em 2 ou 3 dias consecutivos, importante para a interpretao correta de resultados positivos para fungos considerados como saprfitas, ou seja, contaminantes do meio ambiente, ou mesmo, constituinte da microbiota normal do paciente. Nesses pacientes, os fungos saprfitas podem se tornar oportunistas e comportarem-se como patgenos. Quadro 2 Procedimentos para coleta de amostras
Material Clnico Escarro Procedimento de coleta Recolher, de preferncia, a primeira expectorao da manh, aps gargarejo com gua limpa ou fervida, em frasco de boca larga, esterilizado. No deve conter saliva. Aspirar cerca de 5 a 10 mL de suco gstrico, atravs de sonda nasogstrica, pela manh, em jejum. Procedimento realizado por mdico treinado. O material colhido deve ser colocado em recipiente estril. Fazer antissepsia rigorosa no local da puno e coletar cerca de 5 a 6 mL de sangue venoso, que dever ser injetado diretamente em frasco contendo meio de cultura (ver detalhes no prximo tem). A ltima gota de material deve ser distendida em uma lmina de microscopia, para colorao de Giemsa. Fazer antissepsia rigorosa no local da puno. Coletar 2 mL ou mais, para exame microscpico e cultura para fungos. Os tubos na rotina hospitalar devem ser usados na seguinte sequncia: 1a exame bioqumico, 2a exame de celularidade, 3a microbiolgico, reduzindo assim a possibilidade de isolamento de contaminantes da pele. Entretanto, a coleta da amostra em tubos especficos para cada um desses exames aumenta a sensibilidade do exame micolgico e, por isso, deve ser recomendada. Colher assepticamente, utilizando instrumentos estreis e colocar o material em recipiente estril, com salina. No adicionar nenhum lquido fixador.
Aspirado gstrico Aspirado traqueal e secreo obtida por broncoscopia Sangue e aspirado de medula ssea
Lquor
Tecido obtido por bipsia, necropsia e peas operatrias
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Material Clnico Urina
Procedimento de coleta A amostra biolgica mais apropriada para o diagnstico de micose do trato urinrio obtida por sondagem ou citoscopia. Quando no for possvel, e para evitar contaminao com micro-organismos presentes nas reas vizinhas, fazer limpeza prvia da regio perineal com gua e sabo, desprezar o primeiro jato de urina da manh, e colher 3 a 5 mL de urina em frasco estril. Colees de 24 horas no tm valor para diagnstico micolgico. Fazer lavagem prvia da regio anal com gua e sabo, coletar pores de fezes em recipiente estril com tampa ou swab anal, mergulhar o swab em salina estril e enviar o tubo ao laboratrio. Colher material por curetagem da leso ou com swab estril. Mergulhar o swab umedecido em salina estril e enviar o tubo ao laboratrio. O melhor mtodo para recuperao de fungos requer raspado de crnea, aspirao de lquido intra-ocular ou bipsia. A coleta com auxlio de swab no indicada em local de drenagem. Coletar secreo, material necrtico ou tecido obtido por bipsia em recipiente estril. Coletar com swab estril o material de leso de mucosa jugal, papilas linguais ou regio tonsilar. Mergulhar o swab umedecido em salina estril e enviar o tubo ao laboratrio. Com auxlio de espculo, coletar material da leso ou do fundo de saco vaginal com swab estril. Mergulhar o swab umedecido em salina estril e enviar o tubo ao laboratrio. Fazer assepsia rigorosa no local da puno. Coletar cerca de 5 a 10mL de lquido em tubo de ensaio estril. Devem ser colhidos de preferncia, por aspirao de abscessos fechados, com seringa e agulha estril. Se a leso for aberta, limpar o local com gaze esterilizada embebida em salina estril, para eliminar os exsudatos superficiais que so altamente contaminados com bactrias. A seguir, colher o material com swab. Mergulhar o swab umedecido em salina estril e enviar o tubo ao laboratrio. Se possvel, descontaminar a pele com lcool 70% antes da coleta. Raspar com lmina de bisturi as escamas cutneas da borda das leses. Pode-se utilizar tambm uma lmina de microscopia. Colocar o material entre duas lminas limpas, de preferncia esterilizadas, vedando-se as bordas das lminas com fita adesiva para evitar perda do material. Os pelos tonsurados, devem ser retirados com pina estril e acondicionados entre lminas ou em potes, de preferncia esterilizados. Fazer limpeza prvia das unhas escovando com gua e sabo. Cortar com tesoura e desprezar a parte descolada da unha e, com lmina de bisturi, raspar as reas mais profundas e pulverulentas. Colocar esse material entre lminas e ved-las com fita adesiva.
Fezes
Secreo de conduto auditivo externo Material de Micose ocular
Leso de nariz e seios paranasais Mucosa oral e orofaringe
Secreo vaginal
Lquidos corporais (pleural, asctico, pericrdico e sinovial) Pus e material de abscesso
Pele e pelos
Unhas
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1.3 Processamento de amostras

O sucesso na visualizao e isolamento do agente etiolgico depende, alm da coleta, transporte, conservao e armazenamento adequados e volume suficiente da amostra, de seu processamento correto antes do exame micolgico. As seguintes recomendaes devem ser cuidadosamente seguidas para boa resoluo diagnstica:
Pelos, cabelos, escamas de unha e pele devem ser aliquotadas para exame microscpico direto e cultura, pois para exame so clarificadas com soluo aquosa de KOH a 20% e, para cultura, no podem sofrer nenhum tratamento prvio, sendo por isso, inoculadas diretamente na superfcie do meio de cultura. Lquor, secrees e fludos corporais como lquido pleural, asctico, sinovial, pericrdico, aspirado transtraqueal, lavado gstrico e broncoalveolar (BAL) devem ser concentrados por centrifugao (1500 a 2000 rpm por 10 minutos). Os materiais coletados com swabs devem ser eludos em soluo salina e tambm devem ser centrifugados. O sedimento obtido o material adequado para o exame microscpico e semeadura em meios de cultura. Para urina, recomendvel que uma alquota (ala calibrada) seja semeada, por esgotamento, sobre o meio de cultura distribudo em placa de Petri, para exame quantitativo, pela contagem de unidades formadoras de colnias (UFC). A outra alquota deve ser centrifugada (1500 a 2000 rpm por 10 minutos) e o sedimento ser utilizado para exame microscpico e nova semeadura em tubo (cultura qualitativa). Escarro pode ser digerido com enzima (v/v) N-acetil-L-cisteina (250 mg de enzima dissolvidas em 1 L de soluo-tampo citrato ou soluo fisiolgica), que fluidifica e facilita a manipulao da amostra e formao de sedimento aps centrifugao. Porm, no foi comprovado que esse tratamento melhore a recuperao de fungos da amostra sendo, portanto, opcional. Pode-se utilizar, como alternativa, para digesto da amostra, soluo de KOH 20%. A poro purulenta da amostra prefervel e pores liquefeitas no so adequadas para isolamento do agente. A poro da amostra tratada com KOH, porm, s pode ser usada para exame microscpico, pois a potassa destri, aps algumas horas, as estruturas do fungo, inviabilizando seu isolamento em meio de cultura. Nesse caso, outra poro da amostra deve ser centrifugada e o sedimento usado para cultura. Tecidos obtidos por bipsia requerem fragmentao, com o auxlio de um bisturi estril ou macerao (gnglio) com pistilo em almofariz; pode ser feito dentro de uma placa de Petri estril. Esse procedimento visa aumentar a rea de superfcie e expor o micro-organismo ligado ao tecido, ao maior contato com o meio de cultura. Sangue e aspirado de medula ssea no necessitam preparao, sendo que o exame microscpico tem baixa sensibilidade e, portanto, a cultura importante para identificao do agente. Para cultura, as amostras so semeadas imediata15
mente, aps a coleta, em frascos contendo meio de cultura. O meio pode ser bifsico (15 mL de gar inclinado sob 50 mL de caldo) composto de infuso de crebro-corao (meio BHI) ou Sabouraud. Meios contendo saponina para lise e posterior centrifugao da amostra so indicados. Na prtica, frascos para hemocultura bacteriolgica (simples ou automatizada) proporcionam isolamento adequado de fungos, desde que respeitados os perodos necessrios ao seu desenvolvimento. Para fungos dimrficos, de crescimento lento (>15 d), muitos autores consideram o mtodo de lise-centrifugao o mais sensvel. Sangue e medula ssea no devem ser coletados em seringas contendo EDTA, pois essa substncia se combina com elementos da parede dos fungos, diminuindo a sensibilidade do exame. Um dos procedimentos recomendados a inoculao de 5 a 6 mL da amostra no frasco com meio bifsico sendo uma parte para 10 partes do meio lquido, que deve ser ento incubado temperatura de 30C. 1.3.1 Exame microscpico de amostras Na dependncia do material clnico, a observao de um fungo na amostra biolgica tem grande valor diagnstico, pois demonstra sua presena no tecido e permite uma informao imediata ao mdico, a qual pode ser crucial para determinar a terapia apropriada ao paciente. No entanto, se a quantidade da amostra biolgica for insuficiente para o exame microscpico e cultura do material, a cultura, na maioria das amostras, tem prioridade sobre o exame microscpico, por ser mais especfico e, em muitos casos, mais sensvel. O exame microscpico da amostra realizado por vrias tcnicas, dependendo do tipo da amostra e suspeita clnica. 1.3.2 Exame microscpico direto com hidrxido de potssio (KOH) a 20% Tcnica utilizada para exame de pelos, pele, unha, tecido obtido por bipsia, exsudatos espessos e outros materiais densos. Colocar uma gota de KOH (aquoso a 20%) em uma lmina de microscopia e sobre essa uma poro da amostra a ser examinada. Cobrir a preparao com uma lamnula e, para intensificar a clarificao, aquecer ligeiramente, sobre a chama de um bico de Bunsen, sem deixar ferver a mistura. Examinar a preparao aps 20 minutos, em microscpio ptico comum, inicialmente, com objetiva de 10x, seguida de 40x. Exame microscpico direto com tinta nanquim (tinta da China) Utilizado em amostras de lquor, urina, secrees ou exsudatos, para visualizao de leveduras capsuladas do gnero Cryptococcus, que se tornam mais evidentes contra o fundo negro proporcionado pela tinta. Colocar uma gota de tinta nanquim e uma gota do sedimento da amostra centrifugada sobre uma lmina. Cobrir a preparao com lamnula e observar ao microscpio
1.3.3
16
ptico (objetivas de 10x e 40 x). Nessa tcnica, um erro bastante frequente confundir linfcitos com clulas de leveduras. A diferenciao feita pela refringncia da parede celular e das incluses no citoplasma das leveduras, alm da presena de brotamentos (Figura 2). Figura 2 Cryptococcus sp.: leveduras em brotamento rodeadas de halo transparente (cpsula polissacardica), sobre fundo negro formado pela tinta nanquim
1.3.4
Exame microscpico com colorao pelo mtodo de Gram Todos os fungos so Gram-positivos, assim a utilizao da colorao no visa a diferenciao dos micro-organismos, mas possibilita discriminar elementos fngicos de artefatos existentes em urina, secrees e fezes. A amostra espalhada de modo homogneo, em movimentos circulares, em uma lmina de microscopia, fixada com calor e submetida colorao. Exame microscpico com colorao pantica (Giemsa, Leishman ou Wright) Essas coloraes so usadas para pesquisa de Histoplasma capsulatum em diversas amostras biolgicas: medula ssea, sangue, aspirados e secreo cutnea. Nesses casos, faz-se um esfregao semelhante ao usado para colorao de Gram. Fixa-se com metanol e cora-se segundo o mtodo escolhido. Podem ser usadas ainda para corar imprints de tecidos obtidos por bipsia. A seguir esto esquematizados os principais aspectos morfolgicos observados ao exame microscpico e os possveis agentes etiolgicos de acordo com a amostra biolgica.
1.3.5
17
Quadro 3 Interpretao de aspectos morfolgicos encontrados em exames microscpicos de amostras biolgicas

Amostra Biolgica Pelos Unhas, escamas de pele Aspecto Morfolgico a. Hifas hialinas e/ou artrosporos(1) a. Hifas regulares, septadas, ramificadas, hialinas, artrosporadas(1) b. Leveduras e pseudo-hifas c. Grupo de leveduras e/ou pequenas hifas tortuosas, hialinas(1) Lquor Secreo vaginal Secrees (trato respiratrio, nasal, oral, naso-faringe) a. Levedura capsulada(2) a. Levedura e pseudo-hifa
(1,3)
Interpretao a. Dermatfitos a. Dermatfitos
b. Candida spp. c. Malassezia sp. a. Cryptococcus sp. a. Candida spp. a. Fungos filamentosos hialinos(5) b. Cryptococcus sp. c. Candida spp. d. Paracoccidioides brasiliensis
a. Hifas ramificadas, hialinas, septadas(3) b. Levedura capsulada(2) c. Levedura e pseudo-hifa(1,3) d. Leveduras globosas ou multiformes, de parede espessa, incluses citoplasmticas, com mltiplos brotamentos(1)
Tecidos, pus e aspirados (subcutneo, ganglionar, cerebral, pulmonar, mucosa ou outro)
a. Hifas irregulares, largas, cenocticas(1,3) b. Hifas ramificadas, hialinas, septadas(1,3) c. Hifas septadas de cor castanha ou marrom(1,3) d. Estruturas ovaladas, com ou sem septos, de cor castanha (estruturas muriformes)(1) e. Levedura e pseudohifa(1,2) f. Levedura capsulada(2) g. Levedura globosa ou ovide, de parede espessa, incluses citoplasmticas, com brotamento nico ou mltiplos(1) h. Leveduras pequenas, tipo charuto (achado muito raro)(3) i. Leveduras pequenas em macrfagos(4)
a. Zigomicetos b. Fungos filamentosos hialinos(5) c. Feohifomicetos (fungos demcios) d. Cromomicetos (agentes de cromomicose) e. Candida spp. f. Cryptococcus sp. g. Paracoccidioides brasiliensis
h. Sporothrix schenckii i. Histoplasma capsulatum
18
Amostra Biolgica Fludos oculares
Aspecto Morfolgico a. Fragmentos de hifas, hialinas, septadas(1,3) b. Leveduras e pseudohifas(1,3)
Interpretao a. Fungos filamentosos hialinos(5) b. Candida spp. a. Fungos filamentosos(5) b. Cryptococcus sp. c. Leveduras(6) d. Histoplasma capsulatum
Sangue e medula ssea
a. Fragmentos de hifas ramificadas, hialinas, septadas(3,4) b. Levedura capsulada(2) c. Leveduras em brotamento(3,4) d. Leveduras pequenas em macrfagos(4)
(1) Exame microscpico com KOH (2) Exame microscpico com tinta nanquim (3) Exame microscpico com colorao de Gram (4) Exame microscpico com colorao de Giemsa ou pantica (5) So fungos saprfitas que podem se tornar oportunistas, por exemplo Aspergillus, Fusarium, Acremonium, cuja identificao s possvel pela cultura. (6) No sangue, leveduras do gnero Candida no formam pseudohifas e a identificao de gnero e espcie possvel somente, aps isolamento em meio de cultura.
1.3.6
Cultura de amostras biolgicas para isolamento de fungos A amostra, aps o processamento, poder ser usada para isolamento do agente etiolgico. Para tanto, dever ser semeada em movimentos de estrias (ziguezague) sobre a superfcie de meios slidos de cultura, distribudos em tubos de ensaio, tamponados com tampo hidrfilo. Meios de cultura O meio de cultura pode ser selecionado segundo tipo de amostra e agente etiolgico, conforme a suspeita clnica. De acordo com os aspectos observados ao exame microscpico da amostra, pode-se ainda redirecionar o procedimento para isolamento do agente. Recomenda-se sempre 2 tubos de meio para semeadura da amostra biolgica, os quais devero ser incubados temperatura de 30C, usada atualmente para todos os tipos de amostras. Quando a hiptese diagnstica apontar para um fungo dimrfico, incubar um dos tubos a 35O C. Para isolamento de fungos a partir de qualquer tipo de amostra, devem ser utilizados meios no seletivos, que permitam crescimento de fungos patognicos e bolores de crescimento rpido (< de 7dias). Esses fungos, apesar de serem contaminantes de meio ambiente, podem ser agentes de micoses em pacientes suscetveis, ou seja, so potencialmente oportunistas. O meio bsico em laboratrio de micologia o gar Sabouraud dextrose (ASD), chamado simplesmente, gar Sabouraud. O ASD o meio mais utilizado, por ser relativamente barato e permitir o crescimento de todos os fun19
1.3.7
gos, com rarssimas excees. Em regra, usa-se um antibitico para impedir o crescimento de bactrias que poderiam prejudicar o isolamento de fungos. O cloranfenicol o mais indicado, pois resiste autoclavao. Pode ser colocado tanto no ASD como em outros meios de cultura para fungos. Meios ditos seletivos para fungos patognicos contm cicloheximida que inibe parcialmente, ou totalmente, fungos anemfilos. Esses meios so indicados para cultivo de materiais coletados de leses com suspeita de dermatofitose, para aumentar a sensibilidade no isolamento de dermatfitos. Deve-se ressaltar que essa substncia poder inibir o isolamento de fungos oportunistas, como Aspergillus sp., alm de Histoplasma capsulatum na fase leveduriforme e certas leveduras patognicas dos gneros Candida e Cryptococcus. Existem meios presuntivos que indicam presena de certos grupos de fungos ou determinados gneros, como por exemplo gar contendo compostos fenlicos para Cryptococcus sp. (gar contendo sementes de niger ou Guizzotia abssinica) ou gar especial para dermatfitos (Dermatophyte Test Medium). Existem ainda meios presuntivos, por reao enzimtica e colorimtrica, de espcies de Candida spp. (Candida Medium, ChromAgar, Biggy gar, etc). So meios mais caros que ASD e, alm disso, sua maior aplicao no isolamento primrio de leveduras, a partir de amostras biolgicas muito contaminadas, tais como: secreo vaginal, fezes e urina. A identificao, no entanto, feita somente aps anlise morfolgica e fisiolgica. Para isolamento ou subcultivo de dermatfitos recomenda-se o gar batata, encontrado no comrcio, sob forma desidratada, para aumentar a esporulao e facilitar a identificao do gnero e espcie do fungo. Para fungos dimrficos, de crescimento lento (> 15 dias), recomenda-se o uso de meios enriquecidos como o gar infuso de cerebro-corao (BHI) para obteno, em menor tempo, de culturas melhor desenvolvidas. Pode ser acrescido de 5 a 10% de sangue de carneiro e de antibiticos (de preferncia, cloranfenicol ou penicilina e estreptomicina). 1.3.8 Procedimentos para cultura Os materiais devidamente processados devem ser semeados na superfcie dos meios de cultura, com ala de nquel-cromo ou pipeta Pasteur, com movimentos em estrias em ziguezague, para permitir separao de eventuais contaminantes da amostra. O material no deve ser colocado em profundidade no gar, mas apenas aderido superfcie do meio. A temperatura de incubao recomendada para todas as amostras 30C, devido possibilidade
20
de o agente etiolgico ser oportunista, e desse modo, crescer melhor a 30C do que a 37C no primo isolamento. Alm disso, pensando em Brasil, em que, as temperaturas so muito altas nas regies Norte e Nordeste, dificilmente alcanam 25C, a menos que se utilize estufa BOD (body oxigen demand). A temperatura de 30C verificada, mais facilmente, durante muitas horas do dia.
Hemoculturas fazem parte da rotina diagnstica para casos de infeco relacionada assistncia sade e merecem algumas recomendaes parte para isolamento de fungos. Os frascos contendo meio bifsico e sangue ou aspirado de medula ssea devem ser submetidas agitao manual peridica, para maior homogeneizao do oxignio na fase lquida do frasco. Exames macroscpicos dirios da superfcie da fase slida so indicados para verificar aparecimento de colnias de: leveduras dos gneros Candida, Cryptococcus e outros (24 h-7 dias), fungos filamentosos e Sporothrix schenckii (2 a 15 d) e fungos dimrficos, como: Paracoccidioides brasiliensis, Histoplasma capsulatum (15 a 30d). Qualquer colnia de fungo deve ser repicada em ASD, para posterior identificao. O crescimento de fungos, ao contrrio de bactrias, no resulta em turvao imediata do meio lquido, de modo que a anlise microscpica de uma gota do meio, abrevia o prazo de resultados positivos. R ecomenda-se a pesquisa microscpica do crescimento de fungos corando por Gram, duas gotas do meio lquido, periodicamente, em cada um dos perodos acima citados. Alm do exame microscpico da fase lquida, um procedimento que resulta em maior sensibilidade da cultura a realizao de repiques de 1 mL da fase lquida para tubos contendo ASD ou BHI em dias alternados: 2, 10 e 30 dia. Visto que a maioria dos laboratrios brasileiros no trabalha com o meio bifsico, pode-se inocular a amostra, na mesma proporo de 10%, em frascos de hemocultura bacteriolgica e fazer a leitura como anteriormente descrito. Entretanto, sistemas automatizados para hemoculturas, que acusam o crescimento de qualquer micro-organismo em at 7 dias, no permitem identificar a presena de fungos de crescimento mais lento. Nesses casos, a incubao por perodo de at 30 dias, com repiques do caldo em ASD. O procedimento para sangue e aspirado de medula ssea, denominado lise-centrifugao, no muito difundido no Brasil, pelo custo de importao do sistema. O material biolgico inoculado diretamente no frasco do sistema, que contm saponina, que lisa as clulas liberando assim os micro-organismos intracelulares. A seguir, deve-se realizar centrifugao que direcionar os elementos fngicos para o fundo do tubo que j contm o meio de cultura. O sobrenadante desprezado e, dessa forma, a cultura foi realizada, evitando-se subcultivos que so ne21
cessrios quando se inocula o material em meios bifsicos ou lquidos. A incubao feita a 37C por perodo de at 30 dias. Abaixo esto os procedimentos recomendados para exame direto e cultura, visando obter melhor rendimento no isolamento primrio de fungos, de acordo com tipo de amostra biolgica.
Quadro 4 Procedimentos laboratoriais para exame direto e isolamento de fungos, segundo amostra biolgica
Amostra Biolgica Secreo respiratria Processamento - Fluidificao recomendada - Centrifugao - Uso do sedimento - Centrifugao - Uso do sedimento - Centrifugao - Uso do sedimento - Centrifugao - Uso do sedimento - Nenhum - Centrifugao - Uso do sedimento Exame Microscpico - a fresco - KOH a 20% - Giensa - Tinta naquim - Tinta naquim - Gram - a fresco - Gram - KOH 20% - Giemsa - KOH 20% - Giemsa - Gram Meio de Cultura* - ASD - BHI
Lquor Urina** Fluidos corporais (pleural, asctico, sinovial, pericrdico, gstrico, brnquico) Pus e secrees de abscessos Swab embebido em salina (mucosa oral, nasal, vaginal, anal, olhos, conduto auditivo) Pele, pelos e escamas de unhas Tecidos e peas
- ASD - ASD - ASD - BHI - ASD - BHI - ASD
- Nenhum - Fragmentao ou macerao - Imprint em lmina - Semeadura em meio de cultura - Esfregao ou distenso em lmina
- KOH 20% - KOH a 20% - Giensa - Tinta naquim - Giemsa
- ASD - ASD - BHI - BHI bifsico ou lquido - ASD bifsico ou lquido
Sangue e medula ssea
* Todos os meios slidos para isolamento de fungos devem conter cloranfenicol. ** Para contagem de colnias (UFC/mL), semear 0,1 mL de urina em ASD distribudo em placa de Petri, antes de centrifugar.
1.4 Identificao de fungos

O isolamento de um fungo em meio de cultura no significa, necessariamente, que ele o agente etiolgico da infeco. A presena de fungos na microbiota (flora) de
22
pacientes, por exemplo Candida sp., e no meio ambiente, por exemplo Aspergillus sp., pode resultar em cultura positiva. Isso explica o grande nmero de culturas positivas para fungos a partir de uma amostra biolgica. A relao entre o fungo isolado em meio de cultura e sinais e sintomas critrio clnico-epidemiolgico. No entanto, deve-se sempre valorizar o isolamento de um fungo procedente de:
Qualquer amostra biolgica que mostrou resultado positivo ao exame microscpico. Micose cutnea. Fludos corporais normalmente estreis. Tecidos obtidos por bipsias ou peas operatrias. Urina, obtida por sondagem ou cistoscopia, independentemente da contagem de colnias. Raspado de crnea. Paciente imunossuprimido (transplantado ou com Aids). Paciente em uso de antibiticos por longo tempo, internado em unidade de terapia intensiva ou submetido a ventilao mecnica, cateterismo ou outra manipulao. Paciente de hemodilise ou debilitado que apresente algum sintoma ou sinal de doena infecciosa independentemente do tipo de amostra clnica.
Alm desses casos, tm importncia as culturas de fungos:

Dimrficos. Fungos isolados mais de uma vez do mesmo tipo de amostra biolgica coletada em diferentes dias e procedentes do mesmo paciente. Isolados de ponta de cateter (alimentao parenteral, infuses venosas, etc.).
O profissional de laboratrio deve tentar identificar todas as culturas positivas relevantes e emitir o resultado mais acurado possvel. Muitas vezes, o exame microscpico direto da cultura suficiente para direcionar as medidas de controle da infeco, outras vezes somente a identificao do fungo pode orientar adequadamente a conduta clnica. A identificao dos fungos, de modo ideal, deve contemplar o gnero e a espcie; porm, muitas vezes, em especial para os fungos filamentosos, isso no possvel pelo grau de dificuldade e complexidade desses micro-organismos. Nesses casos, a identificao do grupo de fungos pode ser suficiente para o diagnstico da micose, por exemplo, zigomicetos, feo-hifomicetos, dermatfitos, leveduras, etc.
23
1.4.1
Identificao de leveduras (morfolgica e bioqumica) A macromorfologia das leveduras, em especial as do gnero Candida, no apresenta muita diversidade e, portanto, nem sempre um parmetro suficiente para sua identificao. Colnias de levedura obtidas de amostra biolgica s devem ser identificadas quando estiverem puras, ou seja, sem contaminao bacteriana ou em mistura de espcies. Para tanto, deve ser realizado o plaqueamento de cada colnia morfologicamente distinta e confirmada sua pureza, por microscopia. De cada colnia deve ser feito um repique em ASD para sua identificao. Para isolamento e identificao presuntiva ao mesmo tempo de algumas espcies de Candida mais frequentes, est disponvel no mercado o meio comercial Chromagar Candida . A pesquisa de cpsula, caracterstica marcante do gnero Cryptococcus, feita com uma gota de tinta nanquim e uma alada da cultura. A cpsula, constituda de material polissacardico, aparece como um halo claro ao redor dos blastocondios de Cryptococcus e contrastam com o fundo negro da lmina. As provas fisiolgicas mais comuns e mais simples para identificao de Candida albicans e Candida sp. so: tubo germinativo e filamentao em cultivo em lmina. No cultivo em lmina, avalia-se a capacidade de produo de hifas/pseudohifas. Desse modo, a presena de hifas hialinas, ramificadas e sem fragmentao, sugestiva do gnero Candida sp. e se, alm disso, desenvolver clamidsporos (clulas de reserva), em adio ao tubo germinativo positivo, identificada como Candida albicans. A presena de hifas hialinas ramificadas que podem se fragmentar em esporos, denominados artrocondios, indica espcies dos gneros Geotrichum e Trichosporon. Assim, gneros tais como Cryptococcus, Rhodotorula, Geotrichum e Trichosporon tambm podem, na maioria das vezes, serem identificados apenas por sua morfologia caracterstica. O restante dos gneros e a classificao em espcies, porm, necessita de provas bioqumicas para sua identificao. No entanto, do ponto de vista clnico, nem sempre importante a identificao acurada da levedura. Por outro lado, a simples identificao de C.krusei, intrinsecamente resistente a fluconazol, extremamente importante. A prova de urease, disponvel em todo laboratrio de microbiologia, muito utilizada em micologia. A reao positiva para urease, junto com a anlise
24
morfolgica, permite identificao presuntiva de Cryptococcus sp. Leveduras do gnero Rhodotorula so tambm urease positiva, mas, como normalmente, apresentam colnias com pigmento avermelhado ou salmo, so distinguidas de Cryptococcus sp. A identificao tambm pode ter interesse epidemiolgico. Para leveduras relacionadas a episdios de infeco relacionada assistncia sade, por exemplo, h grande preocupao no estudo das espcies dos agentes, como marcador epidemiolgico temporal e espacial de infeces, como no caso de espcies de Candida que tm menor sensibilidade a antifngicos azlicos. O esquema a seguir prope um fluxo para identificao das principais leveduras de interesse mdico. Figura 3 Esquema simplificado para identificao de alguns gneros de leveduras
Tubo Germinativo
Positivo Negativo
Cultivo em lmina
Candida albicans
Hifas Somente blasrocondios
Artroporadas
no-artrosporadas + blastocondios
Prova da Urease
Candida sp.
com blastocondios sem blastocondios Positiva Associar cor da colnia Negativa
Trichosporon sp.
Geotrichum sp.
Laranja, Avermelhada, Salmo
Branca Bege Associar pesquisa de cpsula
Rhodotorula sp.
Positiva
Negativa
Cryptococcus sp.
Auxanograma e Zimograma
Se as provas no conduzirem identificao presuntiva do gnero, provas de assimilao de fontes de carbono e nitrognio (auxanograma) e fermentao de carboidratos (zimograma) devem ser realizadas e interpretadas segundo tabelas existentes na bibliografia recomendada ao final deste captulo. Um exemplo simplificado o Quadro 5.
25
26
Quadro 5 Identificao das principais leveduras de interesse mdico

Ur Sa + V + + + V + + V V + + + + + + + V V + V + + + V + V + + + + V + + + + + + + + + + + + + + V + + + + + + + V + + + + V + + + + + + + + + + Ma La Ce Tr Ra X I NO2 GI Sa Ma La Ra V + V V + V Assimilao Tr Fermentao
Levedura + + -
Tg
Cultivo em lmina
Hifa
Ar
C. albicans
C. tropicafis
C. parapsifosis
C. krusei
C. guilliermondii
C. glabrata
C. neoformans
Geotrichum
Trichosporon
Rhodotorula sp.
Saccharomyces
Tg = tubo germinativo, Ar = artrsporo, UR = urease, Sa = sacarose, Ma = matose, La = lactose, Ce = celubiose, T = trealose, Ra = rafinose, X = xifose, I = inositol, NO2 = nitrato, GI = glicose, + = pos, = neg, V= varivel
1.4.2
Prova do tubo germinativo A partir de uma alada da colnia isolada, fazer uma suspenso em tubo de ensaio contendo 0,5 mL de soro humano (pode-se usar tambm soro estril de bovino, cavalo ou coelho). Incubar a 37C durante perodo mximo de 3 horas. Esse prazo importante porque, aps esse perodo, outras espcies de Candida e de outros gneros formam tambm tubo germinativo. Depositar ento uma gota da suspenso sobre lmina, cobrir com lamnula e examinar ao microscpio ptico. A presena de tubo germinativo, na forma de pequeno filamento que brota do blastocondio, sem formar constrio com a clula-me, permite a identificao presuntiva de Candida albicans (Figura 4).
Figura 4
Prova do tubo germinativo com blastocondios, tubo germinativo e pseudohihas de Candida albicans
1.4.3
Cultivo em lmina para prova de filamentao e produo de clamidsporo Depositar 3 mL de gar-fub fundido sobre uma lmina contida sobre um suporte dentro de uma placa de Petri. O suporte para a lmina pode ser um basto de vidro, outra lmina ou apenas dois palitos de madeira. Aps solidificao do meio, semear a levedura, com auxlio de uma agulha em L, fazendo 2 estrias paralelas. Recobrir as estrias com lamnula esterilizada. Fazer uma cmara mida, acrescentando 2 mL de gua destilada estril na placa, ou embebendo um algodo estril, para evitar dessecao do meio, durante o perodo de incubao da prova. Tampar a placa e aps 24 horas, 48 horas e 72 horas examinar a preparao em microscpio tico. A presena de hifas hialinas, septadas e ramificadas caracteriza o gnero Candida e se houver formao de clamidsporos indica Candida albicans. Formao exclusiva de artrsporos permite identificao de Geotrichum, mas quando so forma27
dos tambm blastocondios trata-se de Trichosporon. O meio de gar fub ou farinha de milho pode ser adquirido no comrcio (CornMeal gar) mas sua formulao simples, ressaltando-se que de todos as maneiras deve-se acrescentar a substncia tensoativa tween 80, para que a prova d resultados confiveis. Figura 5 Cultivo em lmina para prova de filamentao e clamidsporo
1.4.4
Prova da urease Semear uma alada da levedura na superfcie do meio de urease (gar uria de Christensen). Incubar a temperatura de 37C. A mudana da cor do meio para rosa bispo em 24 horas indica reao positiva. Prova de assimilao de fontes de carbono e nitrognio ou auxanograma Nessa prova so usados 2 meios, que podem ser adquiridos no comrcio na forma desidratada (Yeast Nitrogen Base e Yeast Carbon Base) ou formulados. A levedura semeada pour plate, homogeneizando-se 2 mL de uma suspenso das colnias a cada meio fundido ou semeada na superfcie de cada um dos meios previamente distribudos em 2 placas de Petri. So ento adicionadas pequenas alquotas de diferentes carboidratos que servem de fonte de carbono sobre a superfcie do meio isento de carbono. Vrias substncias, incluindo lcoois, protenas e aminocidos servem de fontes de nitrognio e so colocadas sobre a superfcie do meio isento de nitrognio. Aps incubao temperatura ambiente ou 25C, por perodo de uma semana, a levedura ir assimilar e crescer em volta de determinadas fontes, de acordo com o metabolismo caracterstico de sua espcie. A leitura feita pelo halo de turvao resultante do crescimento e indica prova de assimilao positiva para a respectiva fonte. Os resultados so comparados a tabelas existentes na bibliografia recomendada (exemplo simplificado consta no Quadro 5).
1.4.5
28
1.4.6
Fermentao de acares ou zimograma A capacidade de fermentar carboidratos, ao lado do auxanograma, ir completar o perfil bioqumico da levedura permitindo a identificao acurada de gnero e espcie (Quadro 5). As caractersticas morfolgicas so fundamentais para concluir a identificao, desde que diversas espcies tm perfis bioqumicos idnticos, mas morfologias distintas. Para o zimograma, diversas fontes de carboidratos so colocadas em tubos respectivos contendo meio bsico lquido. A levedura semeada em cada tubo e, aps um perodo de at 15 dias a 25C, a fermentao revelada por formao de bolhas de gs, observadas dentro de tubos de Durhan, colocados previamente durante a preparao do meio bsico. Mtodos comerciais para identificao de leveduras Em se tratando de espcies de Candida, o mercado j dispe de Kits manuais como API 20C AUX ( BioMerieux), ID 32C (BioMerieux), Candifast (International Microbio) e metodologia semiautomatizada, como os cartes de identificao de fungos Vitek (BioMerieux). Identificao de fungos filamentosos Os fungos filamentosos, patognicos ou contaminantes ambientais, potencialmente oportunistas, formam um grupo muito extenso impossvel de ser tratado neste Manual. Para identificao das diversas espcies ou grupos existe bibliografia especializada de textos, manuais e atlas, indicados no final do captulo. Dentro do objetivo deste Manual sero ilustrados apenas aspectos macroscpicos e microscpicos de alguns fungos de interesse mdico, isolados com maior frequncia no Brasil. A identificao de fungos filamentosos tem, como fundamento, a observao da morfologia da colnia e aspectos microscpicos. A anlise da colnia visa observar: cor, textura, superfcie, pigmento difusvel no meio de cultura, entre outros, e pode ser feita no tubo de ensaio contendo a cultura primria do fungo. Porm, o mais adequado a anlise a partir da colnia gigante, ou seja, uma cultura feita no ponto central de uma camada de gar Sabouraud Dextrose ou gar batata distribudo em placa de Petri. A velocidade de crescimento que pode ser rpida (< 7 dias), intermediria (8 a 14 dias) ou lenta (> 15 dias) fundamental para identificao presuntiva do fungo. A observao das estruturas microscpicas, tais como: hifa hialina ou demcia, septada ou cenoctica, forma, disposio e formao dos esporos so suficientes, em geral, para a identificao dos gneros, mas nem sempre para a caracterizao das espcies de fungos filamentosos. Em alguns grupos,
1.4.7
1.4.8
29
como o dos fungos demcios, pode ser necessrio tambm uso de provas bioqumicas. A morfologia microscpica mais bem visualizada com a tcnica de microcultivo que preserva a disposio original dos esporos sobre as hifas e mantm ntegras certas estruturas formadoras de esporos, por exemplo: os esporngios que so rgos de reproduo de zigomicetos. 1.4.9 Tcnica de microcultivo para fungos filamentosos Colocar sobre uma lmina esterilizada, contida em uma placa de Petri estril, um cubo de gar: ASD ou gar batata. A lmina deve estar sobre um suporte, que pode ser formado por outra lmina, ou um pequeno basto de vidro recurvado, ou ainda, dois palitos de fsforo. Semear o fungo, a partir de repique recente, nos 4 lados do cubo de gar. Recobrir com uma lamnula esterilizada. Fazer uma cmara mida, adicionando 1 a 2 mL de gua destilada estril no fundo da placa ou embeber um pequeno chumao de algodo estril, para evitar a dessecao do meio de cultura, durante o crescimento do fungo. Tampar a placa e deixar temperatura ambiente por 7 a 10 dias, at que se observe desenvolvimento de hifas com ou sem pigmentao (Figura 6). Aps esse perodo inativar a esporulao, adicionando 1 mL de formol ao algodo e vedando a placa com fita adesiva durante 24 horas 48 horas. O vapor de formol, alm de inativar o fungo, ir auxiliar na fixao das estruturas microscpicas. Retirar a lamnula com auxlio de uma pina, cuidadosamente, uma vez que nela devero estar aderidas as hifas e esporos do fungo. Pingar uma gota de corante azul de lactofenol-algodo (Cotton Blue) e montar sobre uma lmina. Desprezar o cubo de gar e, em seu lugar, pingar outra gota de corante lactofenol-azul algodo e recobrir com lamnula, para visualizar esporos e hifas tambm aderidos lmina. Observar em microscpio tico com objetiva de 40 X, o tipo e cor da hifa, forma, disposio e formao de esporos. Figura 6 Tcnica de microcultivo para anlise microscpica de fungos filamentosos
30
Figura 7
Estrutura geral de um fungo filamentoso
1.4.10 Identificao de fungos dimrficos Dimrficos so fungos filamentosos que podem, sob determinadas condies, assumir forma de levedura, diminuindo a capacidade de filamentao e dividindo-se por brotamento, conferindo s colnias aspecto cremoso. Essa fase leveduriforme ocorre sob temperatura acima de 30C, de preferncia a 37C. So fungos de crescimento lento (>15 dias) no primo-isolamento (Histoplasma capsulatum e Paracoccidioides brasiliensis) ou moderado (8 a 14 dias), como Sporothrix schenckii. A identificao feita pela comprovao do dimorfismo e pelo aspecto microscpico caracterstico de cada fase.
1.5 Descrio das principais micoses observadas no Brasil

1.5.1 Micoses superficiais Dermatofitoses (tineas) So infeces fngicas limitadas s camadas superficiais queratinizadas da pele, pelos e unhas, popularmente conhecida como epinge ou frieira, dependendo da localizao das leses que so extremamente pruriginosas. Em imunodeprimidos podem acometer tecidos subcutneos.
Agentes etiolgicos: Microsporum spp., Trichophyton spp. e Epidermophyton floccosum Ocorrncia: universal, acometendo indivduos de qualquer idade, sexo ou raa. Fontes de infeco: contgio direto com animais, solo ou indivduo infectado. Procedimento laboratorial: Amostra: escamas de pele, unha e cabelos.
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Exame da amostra com KOH a 20% revela hifas regulares, hialinas, septadas, refrigentes, frequentemente artrosporadas. Cultura: material deve ser semeado em ASD, com auxlio de uma ala em L, de forma a ficar em perfeito contato com o meio de cultura. As colnias de dermatfitos geralmente crescem a partir do 10 dia de incubao temperatura ambiente e os fungos so identificados pela sua morfologia macroscpica e microscpica. No Brasil, os dermatfitos mais frequentes so T. rubrum e T.mentagrophytes e M. canis.
Figura 8
Caractersticas microscpicas dos gneros de dermatfitos
1.5.2
Micoses subcutneas e profundas Esporotricose Infeco crnica cuja forma clnica mais frequente em nosso meio a forma linfangtica nodular ascendente. Atinge, em geral, uma das extremidades sob forma de leso ulcerada no ponto de inoculao e acomete a drenagem linftica regional com formao de gomas no trajeto. As formas disseminadas so raras em pacientes imunocompetentes, mas frequentes em pacientes com Aids.

Agente etiolgico: Sporothrix schenckii Ocorrncia: doena de distribuio universal que acomete principalmente trabalhadores rurais e floristas. Procedimento laboratorial: Amostra: aspirado das leses gomosas ou tecido subcutneo. Exame microscpico da amostra apresenta baixa sensibilidade, mas exame de cortes de tecido corados pode revelar leveduras em forma de charuto ou apenas formas ovaladas com diviso em brotamento (blastocondios). Cultura: fungo dimrfico que se desenvolve bem em ASD entre 7 a 12 dias e cuja forma filamentosa (< 30C) apresenta hifas hialinas finas e septadas com esporos dispostos em arranjo semelhante flor margarida. A forma leveduriforme (> 30C) no caracterstica do gne-
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ro e requer meios ricos acrescidos de sangue, cistena e submetidos tenso de CO2. O interesse na obteno da fase leveduriforme para diferenciar o agente da esporotricose do gnero Sporothricum, fungo filamentoso no-dimrfico e anemfilo de meio ambiente. A forma filamentosa apresenta na microscopia a forma adequada para identificao do agente. Figura 9 Microscopia em cultura de Sporothrix schenckii cultivado temperatura ambiente (A) e a 37oC (B)
Paracoccidioidomicose Doena granulomatosa crnica que pode acometer pele, mucosas, linfonodos, sistema respiratrio, trato gastrointestinal, adrenais, fgado, bao e SNC. Apresenta grande variabilidade de manifestaes clnicas, desde formas localizadas at formas disseminadas de mau prognstico, na dependncia da resposta imune do hospedeiro. Existe tambm a paracoccidioidomicose-infeco, em que o indivduo no apresenta sinais e sintomas mas demonstra por testes intradrmicos positivos que entrou anteriormente em contato com o fungo. Apresenta muitas semelhanas com a tuberculose.

Agente etiolgico: Complexo Paracoccidioides (P.brasiliensis e P.lutzii) Ocorrncia: pases da Amrica Latina, principalmente Brasil. Procedimento laboratorial: Amostra: raspado de leso e mucosa, secreo do trato respiratrio, aspirado de linfonodos, tecido obtido por bipsia. Exame direto com KOH a 20% revela a presena da forma leveduriforme constituda de clulas grandes (10m a 60 m), globosas, com parede celular dupla e refringente e com mltiplos brotamentos, semelhana de roda de leme, orelhas de Mickey Mouse ou argolas entrelaadas. Cultura: fungo dimrfico de crescimento lento (> 15 dias). Culturas desenvolvidas a < 30C so filamentosas, de cor branca, cotonosa, com
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sulcos centrais, composta de hifas hialinas finas, septadas e fragmentadas em esporos multiformes. As colnias incubadas entre 30C a 35C so de cor creme, pregueadas e enrugadas, cuja microscopia revela as formas caractersticas leveduriformes que permitem a identificao do agente. Figura 10 Microscopia em cultura de Paracoccidioides spp. cultivado temperatura ambiente (A) e a 37oC (B)
Histoplasmose Doena que acomete primariamente o sistema retculo-endotelial. A infeco pode ser localizada ou generalizada. A histoplasmose primria afeta o sistema respiratrio e a histoplasmose progressiva atinge fgado, bao, linfonodos, mucosas, mdula ssea, etc. Em indivduos hgidos, a infeco tem bom prognstico, porm atualmente importante infeco oportunista associada a Aids, nos quais ocorre a forma grave e disseminada.

Agente etiolgico: Histoplasma capsulatum Ocorrncia: distribuio universal, principalmente em pases de clima temperado. Fontes de infeco: inalao de esporos presentes em aerossis formados por solos contaminados com excretas de galinhas e morcegos. Procedimento laboratorial: Amostra: secreo do trato respiratrio, sangue, puno de mdula ssea, tecido obtido por bipsia de mucosas e outros. Exame microscpico direto, sem colorao, requer muita habilidade do tcnico. Recomenda-se colorao por Giemsa para melhor visualizao do agente em de cortes histolgicos, onde se evidencia, sob imerso, pequenas leveduras (2-5 m) intracelulares, dentro de clulas mononucleares. Cultura: fungo dimrfico de crescimento lento (15 a 30 dias) sendo que no primo-isolamento mais fcil obter a forma filamentosa de cor branca, aspecto cotonoso e sulcado, temperatura < 30C. A confir-
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mao do dimorfismo feita atravs de repique em meio rico (BHI) e incubao entre 30C e 35C. A transformao da forma filamentosa ou miceliana fase leveduriforme vista com a formao de pequenas (2-5 m) leveduras em brotamento. A identificao, porm, feita pela micromorfologia da forma filamentosa, com a observao de esporos grandes macrocondios arredondados e com inmeras espculas ou granulaes na parede celular, chamados hipnsporos ou esporos tuberculados. Figura 11 Microscopia em cultura de Histoplasma capsulatum cultivado temperatura ambiente (A) e a 37C (B)
1.5.3
Micoses oportunistas Candidase Candidiase uma doena com manifestaes clnicas variadas. As infeces aguda e crnica mostram leses na boca, faringe, pele, unhas, sistema broncopulmonar, intestinal e perianal. Ocasionalmente, endocardite, meningite, fungemia ou infeces em outras localizaes podem ser observadas.
Agentes etiolgicos: Candida albicans e outras espcies, que esto frequentemente envolvidas em casos de micoses oportunistas em pacientes debilitados. So os principais agentes etiolgicos de infeces relacionadas assistncia sade. As espcies de Candida podem ser isoladas de vrios locais do corpo humano, como microbiota normal de cavidade oral, mucosa vaginal, regio perianal e trato gastrointestinal. Ocorrncia: universal, incluindo as formas graves que ocorrem sob fatores predisponentes para desenvolvimento da doena, tais como: desnutrio, obesidade, diabetes, gravidez, antibioticoterapia, quimioterapia e uso de corticosterides, manipulao endovenosa inadequada, neoplasias e outras doenas debilitantes.
35
Procedimento laboratorial: Amostra: (depender da sintomatologia clnica) fragmentos de pele e unhas; raspados da mucosa oral, vaginal ou anal; secreo do trato respiratrio, sangue, lquor, urina e fezes. Exame de fragmentos de pele e unhas devem ser feitos com soluo de KOH 20%. Secreo do trato respiratrio ou material de mucosa podem ser examinados pela colorao de Gram. A levedura aparece como clulas arredondadas, com brotamentos com ou sem hifas. Pequenas clulas podem ter dimetro de 2-6m, mas formas maiores so tambm observadas. Cultura: o crescimento rpido (24-72 horas) entre 25C e 37C. O aparecimento ocorre em torno de 3 a 4 dias, com formao de colnias com colorao branca bege.
Criptococose A criptococose uma infeco subaguda ou crnica que envolve primariamente os pulmes, com tropismo pelo sistema nervoso central (meninges), podendo atingir pele e outros tecidos.

Agente etiolgico: Cryptococcus neoformans Ocorrncia: no homem, a distribuio da doena universal. Procedimento laboratorial: Amostra: lquor, secreo do trato respiratrio ou de leso de pele, aspirado de formao tumoral subcutnea e tecidos obtidos por bipsia. O exame laboratorial dever incluir urina, de preferncia aps massagem prosttica, para monitorar a presena do agente na prstata que constitui seu rgo de reserva. Exame obrigatoriamente com tinta nanquim para observao de clulas capsuladas com dimetro varivel, entre 5 m a 20 m, que sugerem Cryptococcus sp. Cultura: secreo do trato respiratrio, lquor e tecidos podem ser cultivados em ASD ou qualquer outro meio, desde que no contenham cicloheximida que inibe Cryptococcus. O agente cresce rpido (< 7 dias) entre 25C e 37C, sob forma de colnias mucides de colorao creme parda. A identificao de gnero e espcie feita atravs de provas bioqumicas como teste da urease e auxanograma.
Aspergilose A aspergilose pode se apresentar em indivduos imunocompetentes, como leses localizadas em unhas, ps, canal auditivo, olhos e forma bronco-pulmonar alrgica. Em pacientes imunocomprometidos, tende forma dissemi36
nada ou cerebral, de alta letalidade, geralmente associada a neutropenia ou a doenas debilitantes.

Agente etiolgico: Aspergillus fumigatus (o mais comumente isolado) Ocorrncia: tem distribuio universal. crescente o nmero de relatos dessa doena como infeco secundria em pacientes em tratamento prolongado com antibitico e corticosterides, doenas debilitantes como carcinoma, tuberculose, pacientes neutropnicos, e em leses de tecidos subcutneos, da pele ou da crnea. Procedimento laboratorial: Amostra: secreo do trato respiratrio, material de bipsia e lavado brnquico. O exame microscpico revela hifas septadas e hialinas, com 4 a 6 m de dimetro e que se ramificam em ngulo de at 45. Cultura: colnias de Aspergillus fumigatus, a espcie mais associada doena em humanos, podem ser facilmente isoladas em ASD, em at 7 dias (crescimento rpido) com desenvolvimento, na superfcie do meio, de filamentos brancos-hifas que se tornam verde a verde-acinzentado, com a formao de esporos.
Figura 12 Micromorfologia de Aspergillus fumigatus
Fusariose Hialo-hifomicose com quadros clnicos os mais variados, incluindo processos generalizados em pacientes com neoplasias. Destaca-se atualmente sua importncia como agente de ceratites e onicomicoses.
37
Agentes etiolgicos: as espcies de Fusarium mais frequentemente relatadas em casos de infeces humanas so Fusarium solani, F. oxysporum, F. chamydosporum e F. verticillioides (F. moniliforme). Ocorrncia: Fusarium spp. so ubquos e raramente causam infeco em indivduos sadios, no entanto, as infeces disseminadas so, na maioria, relatadas em locais de clima quente. Procedimento laboratorial: Amostra: dependente da localizao da leso, bipsia ou raspado de pele, crnea, fragmento de unha ou, em casos de suspeita de disseminao, sangue. Cultura: colnia inicialmente branca e coberta por um miclio areo plumoso que ao maturar produz um pigmento de cor lavanda a vermelho prpura na superfcie e no reverso. Apresentam hifas hialinas, septadas, microcondios de 2 a 3 mm de dimetro, e macrocondios com forma de banana ou de foice pela observao em microscopia ptica.
Figura 13 Micromorfologia de Fusarium spp.
Zigomicose Infeco geralmente subaguda de evoluo rpida que acomete indivduos debilitados, transplantados, diabticos descompensados ou ainda com Aids. Pode acometer seios paranasais, tecido subcutneo, pulmo e vasos sanguneos, causando embolia no SNC e trombose. A micose em indivduos imunodeficientes , em geral, fatal se o diagnstico no for rpido e o tratamento especfico no for prontamente estabelecido.
Agentes etiolgicos: fungos da classe dos Zigomicetos, compreendendo os gneros Mucor, Rhizopus, Absidia, entre outros. Ocorrncia: distribuio universal. Procedimento laboratorial: Amostra: secreo de sinus nasal ou tecidos obtidos por bipsia de seios paranasais ou leses subcutneas.
38
Exame com KOH a 20% revela hifas hialinas e largas (6-50m), cuja caracterstica principal a ausncia de septos, que caracterizam as hifas cenocticas desse grupo de fungos. Cultura: fungos de crescimento rpido (< 72 h) a 25C em ASD, com hifas ereas abundantes. A identificao feita pela microscopia da colnia que evidencia hifas cenocticas e esporos contidos dentro de estruturas fechadas denominadas esporngios.
Figura 14 Micromorfologia de Rhizopus sp.
As localizaes topogrficas mais frequentes, relacionadas aos agentes fngicos esto resumidas na Tabela 1.
39
40
Tabela 1
H. capsulatum P. brasiliensis
S. schenckii x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x
Agentes etiolgicos e localizaes topogrficas

Aspergillus sp. C. neoforman Zigomicetos Candida sp.
Dermatfitos x x
Trato respiratrio
Sangue
Osso
Medula ssea
Pele e Unha
Pelo
Crebro
Lquor
Ouvidos
Olhos
Fgado e Bao
Naso-faringe
Mucosas
Tecidos subcutneo e gnglios
Trato urinrio
Trato gastrointestinal
1.6 Corantes e meios de cultura

Esto detalhados aqui apenas os corantes e meios de cultura mais utilizados na rotina diria e que podem ser preparados facilmente no laboratrio. Para maiores detalhes e outros meios, recomenda-se a bibliografia no final do captulo. Corante Azul de lactofenol-algodo Composio: cido ltico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20g Cristais de fenol. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20g Glicerina. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20g Azul algodo*. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,05g gua destilada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20ml Preparo: Fundir os cristais de fenol em banho-maria e juntar. Esperar 24 horas e filtrar. * O azul algodo pode ser substitudo pelo azul de metileno. Os meios de cultura utilizados para o isolamento primrio de fungos a partir de amostras biolgicas podem ser adquiridos no comrcio, sob a forma desidratada, no precisando ser formulados no laboratrio. Aps a hidratao, conforme instrues do fabricante, o meio deve ser distribudo, de preferncia, em tubos, pois dessa forma h maior resistncia desidratao e contaminao, alm de oferecer menor bio-risco na manipulao da cultura e esterilizados por autoclavao. Para gar, recomenda-se a solidificao em tubo (18 x 180mm) inclinado, deixando espao de 3 cm do final do meio at o tampo, para evitar contaminao via meio externo. O armazenamento dos tubos contendo meios de cultura deve ser em saco plstico fechado, dentro de armrios, temperatura ambiente. Desse modo, se houver uma contaminao durante o tempo de armazenamento, as colnias de fungos contaminantes sero facilmente observadas, ao contrrio do que ocorre, quando se armazena sob refrigera o. O controle de esterilidade deve ser feito por 7 dias, temperatura ambiente, antes do uso de qualquer meio de cultura. gar sabouraud-dextrose (ASD) Composio: Dextrose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40 g Pepton. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10 g gar. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 g gua destilada. . . . . . . . . . . . . . . . . . 1000 mL
41
Preparo: Dissolver os componentes na gua destilada. Acertar o pH em 5,6. Aquecer at a completa dissoluo. Distribuir cerca de 10 mL por tubo. Esterilizar em autoclave a 120C por 15 minutos. gar sabouraud-dextrose com cloranfenicol Dissolver 100 mg de cloranfenicol em 10 mL de lcool 95C. Adicionar em 1 litro de ASD antes da esterilizao. gar-sabouraud-dextrose com cloranfenicol e cicloheximida (Meios comerciais mycosel, micobiotic gar ou meio seletivo para fungos) Diluir separadamente 400 mg de cicloheximida (Actidione) em 10 mL de acetona. Diluir 50 mg de cloranfenicol em 10 mL de lcool 95C. Misturar as solues e adicionar em 1 litro de ASD antes da esterilizao. pH= 7,0 Brain heart infusion gar com cloranfenicol (bhi) Dissolver 50 mg de cloranfenicol em 10 mL de lcool 95C. Adicionar em 1 litro de BHI preparado de acordo com as instrues do fabricante, antes da esterilizao. gar fub Composio: Fub . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 g gar. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 g Tween 80. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 mL Preparo: Adicionar o fub em 250 mL de gua e ferver at borbulhar. Filtrar o fub em gaze dobrada em quatro. Dissolver o gar em 250 mL de gua. Restaurar o volume da infuso de fub para 250 mL com gua quente, juntar as suspenses, ajustar o pH para 6,6 6,8 e adicionar o Tween 80. Distribuir volumes de 5 mL em tubos e esterilizar em autoclave a 120C por 15 minutos.
42
1.7 Glossrio
Artrsporo ou artrocondio: esporo formado pela desarticulao da hifa de fungos filamentosos ou leveduras. Blastosporo ou blastocondio: esporos formados por brotamento ou gemulao. Bolor: fungo filamentoso, multicelular, constitudo de hifas. Brotamento ou gemulao: reproduo com diviso de citoplasma atravs de estrangulamento. Cenoctica: hifa desprovida de septos, o mesmo que hifa contnua. Clamidsporo: estruturas de resistncia, constitudas de reserva nutritiva e membrana bastante espessa, permitindo resistir aos fatores externos, semelhante aos esporos. Condio: esporo assexuado externo. Demcio ou demaciceo: fungos negros que tm pigmento melanide (acastanhado), na parede celular. Dimrfico: que apresenta duas formas: leveduriforme e filamentosa. Esporngio: rgo de reproduo assexuada interna, geralmente em forma de vescula e contm inmeros esporos denominados de esporangiosporos. Feo-hifomiceto: fungo filamentoso demceo. Hialino: que no tem cor, translcido, assumindo a cor do corante utilizado. Hifa: reunio de clulas justapostas, formando estrutura tubular, filamentosa, que compe o corpo vegetativo dos bolores e de alguns gneros de leveduras (por ex, Candida spp.). Hifomiceto: fungo filamentoso. Levedura: fungo em regra unicelular que se reproduz geralmente por brotamento. Pseudohifa: uma srie de blastocondios que permanecem aderidos uns aos outros, formando filamentos semelhantes a hifas. Tuberculado: com granulaes ou nodosidades.
43
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Prancha 1
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Prancha I Legenda

Figura 1: Figura 2: Figura 3: Figura 4: Figura 5: Figura 6: Figura 7: Figura 8: Figura 9: Figura 10: Figura 11: Figura 12: Figura 13: Figura 14: Figura 15: Figura 16: Figura 17: Figura 18: Figura 19: Figura 20:
Macromorfologia de Candida albicans em gar Sabouraud. Placa de Petri preparada com filamentao. Aspecto microscpico da filamentao de Candida albicans. Macromorfologia de Cryptococcus neoformans em gar Sabouraud. Artrocondios de dermatfitos em exame direto de material clnico. Macromorfologia de Microsporum canis em gar Sabouraud. Macromorfologia de Trichophyton mentagrophytes em gar Sabouraud. Macromorfologia de Epidermophyton floccosum em gar Sabouraud. Macromorfologia de Paraccocidioides brasiliensis a 37o C. Micromorfologia de Paraccocidioides brasiliensis a 37o C. Macromorfologia de Histoplasma capsulatum a 25o C. Micromorfologia de Histoplasma capsulatum a 25o C. Placa de Petri preparada com microcultivo. Macromorfologia de Aspergillus fumigatus. Micromorfologia de Aspergillus fumigatus. Micromorfologia de Aspergillus fumigatus evidenciando a clula p. Macromorfologia de Fusarium solani. Micromorfologia de Fusarium solani. Macromorfologia de Rhizopus sp. Micromorfologia de Rhizopus sp.
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Mdulo 8: Deteco e Identificao de Fungos de Importncia Mdica

Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria | Anvisa

AGNCIA NACIONAL DE VIGILNCIA SANITRIA ANVISA

Mdulo 8: Deteco e Identificao dos Fungos de Importncia Mdica

Captulo 1: Deteco e Identificao dos Fungos de Importncia Mdica

Quadro 1 Principais infeces micticas que acometem os seres humanos no Brasil

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1.2 Coleta, transporte e armazenamento de amostras

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Tecido obtido por bipsia, necropsia e peas operatrias

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Material Clnico Urina

Secreo de conduto auditivo externo Material de Micose ocular

Leso de nariz e seios paranasais Mucosa oral e orofaringe

Lquidos corporais (pleural, asctico, pericrdico e sinovial) Pus e material de abscesso

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1.3 Processamento de amostras

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Quadro 3 Interpretao de aspectos morfolgicos encontrados em exames microscpicos de amostras biolgicas

Interpretao a. Dermatfitos a. Dermatfitos

Tecidos, pus e aspirados (subcutneo, ganglionar, cerebral, pulmonar, mucosa ou outro)

h. Sporothrix schenckii i. Histoplasma capsulatum

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Amostra Biolgica Fludos oculares

Aspecto Morfolgico a. Fragmentos de hifas, hialinas, septadas(1,3) b. Leveduras e pseudohifas(1,3)

Sangue e medula ssea

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- ASD - ASD - ASD - BHI - ASD - BHI - ASD

- KOH 20% - KOH a 20% - Giensa - Tinta naquim - Giemsa

- ASD - ASD - BHI - BHI bifsico ou lquido - ASD bifsico ou lquido

Sangue e medula ssea

1.4 Identificao de fungos

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Alm desses casos, tm importncia as culturas de fungos:

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Laranja, Avermelhada, Salmo

Branca Bege Associar pesquisa de cpsula

Quadro 5 Identificao das principais leveduras de interesse mdico

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Estrutura geral de um fungo filamentoso

1.5 Descrio das principais micoses observadas no Brasil

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Caractersticas microscpicas dos gneros de dermatfitos

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nada ou cerebral, de alta letalidade, geralmente associada a neutropenia ou a doenas debilitantes.