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10 e 11 - Crescimento Microbiano
10 e 11 - Crescimento Microbiano
- Anel proteico (~10000 molculas FtsZ) no centro da clula, quando comea a segregao dos dois nucleides (DNA). Fts Filamentous temperature sensitive - Proteinas Fts do anel proteico divisoma (no centro da clula em diviso; orquestra sntese da membrana plasmtica e da parede celular durante enlongamento da clula, seguindo-se constrio para formar o septo e separao das clulas).
Fase C
Fase D
E. coli
Tempo de gerao mdio, em condies ptimas ~ 25 minutos
A B
CRESCIMENTO EXPONENCIAL
Imagine que arranja uma forma de manter uma populao de clulas de E. coli em crescimento exponencial durante 24 horas. Se partir de uma nica clula, estime quantas clulas obteria aps esse perodo de 24 horas.
CRESCIMENTO EXPONENCIAL
(http://www.e-escola.utl.pt)
[clulas] [clulas]
1 N0
21 N0. 21
22 N0.22
2n
(aps n geraes)
Concentrao de clulas aps um periodo de tempo t de crescimento exponencial - Nt. n - n de geraes ocorridas durante o perodo t de crescimento exponencial
Nt = N0.2n
n =
g=t/n
Fase exponencial
dNt dt
-taxa especfica
= .Nt de crescimento da populao microbiana
(t-t0)
N,
N0
g t0
Prescott, Harley & Klein, Microbiology, th edition,Mc GrawHill, 2002
Crescimento exponencial equilibrado clulas completamente adaptadas s condies de crescimento N pode representar: - Concentrao de clulas, N; - Densidade ptica da cultura, DO; - concentrao de biomassa, X, - concentrao de qualquer componente celular (p.ex. proteinas)
y = b + ax
- taxa especfica de crescimento da populao microbiana (o valor de corresponde ao declive da recta lnNt vs. (t-t0))
(h; min)
OBTENO DA CURVA DE CRESCIMENTO DA POPULAO MICROBIANA MTODOS PARA AVALIAR A CONCENTRAO DE CLULAS NUMA POPULAO MICROBIANA
CONTAGEM DE CLULAS VIVEIS [expresso em UFC (Unidades Formadoras de Colnias) por ml de suspenso] Mtodo das diluies sucessivas e espalhamento em meio slido
DETERMINAO ESPECTROFOTOMTRICA DA DENSIDADE CELULAR (Densidade Optica DO - medida a um comprimento de onda, , particular)
I0 intensidade de luz incidente ( particular) I intensidade de luz transmitida atravs da suspenso de clulas
I0
I0
DO = Abs
= - log T/100 = log (I0/I)
Prescott, Harley & Klein, Microbiology, th edition,Mc GrawHill, 2002
Terico
Medido
DO640nm
Medies no espectrofotmetro
0 Concentrao de clulas
BIOMASSA -
Estimativa da biomassa seca (peso seco) - Pesagem da massa de clulas presentes na cultura microbiana. - Peso seco ou hmido - usado em circunstncias especficas, como, por exemplo quando se pretende obter o rendimento em biomassa do crescimento.
Em certas condies, o aumento da massa pode no reflectir crescimento da populao, mas aumento de compostos de reserva
Cmara de contagem
Lmina de vidro especial, onde est marcado um reticulado com dimenses conhecidas; tambm conhecida a distncia da lmina lamela, sendo possvel estimar o volume de suspenso de clulas sobre o reticulado. Fcil, barato e rpido. til para contar clulas de eucariotas e procariotas. No distingue clulas viveis de mortas.
Observao no Microscpio ptico
Figure 6.5
Prescott, Harley & Klein, Microbiology, th edition,Mc GrawHill, 2002
Fase estacionria
Fase exponencial
5 4 3 2 Declive: 0,7
1 0 1 2 3 4
Estacionria
Populao duplica em 1h
Tempo (h)
Valores de g e de dependem de: - potencial gentico da estirpe microbiana. - composio do meio de cultura; - condies ambientais (Temperatura, pH, disponibilidade de gua, nvel de oxignio, etc.)
Crescimento diuxico
Exemplo:
Crescimento de populao de Escherichia coli em meio de cultura com duas fontes de C e energia, glucose e lactose.
lactose
-galactosidade
glucose + galactose
ln [ Clulas viveis]
Consumo de glucose
Tempo
Glucose rapidamente metabolizada; Represso da expresso do opero da lactose (Fenmeno: Represso Catablica)
[Biomassa] X (mg/L)
2 1
15
Tempo (h)
A cheio (vermelho) - Curva de crescimento expressa em termos de evoluo da concentrao total de biomassa formada (escala logaritmica) em funo do tempo. A tracejado (azul) Evoluo da concentrao do nutriente S ao longo do tempo de crescimento.
[Nutriente], S (---)
5 4 3
30
The relationship between concentration of limiting nutrient, growth rate (green curve) and growth yield (red curve) in a batch culture (closed system).
At low nutrient concentrations both growth rate and growth yield are affected.
A taxa especfica de crescimento, , depende da concentrao de nutriente limitante (S) fornecida no meio de cultura
Ks + S
Ks
,S Concentrao saturante de S
Situao raramente encontrada nos ambientes naturais, onde um ou mais nutrientes esto normalmente presentes em concentraes limitantes ( < max )
max
- Taxa especfica mxima de crescimento - quando concentrao de S saturante; sistemas de transporte transmembranar para o nutriente S esto saturados Constante de semi-saturao - numericamente igual concentrao de substrato que permite uma taxa de crescimento igual a metade da max; reflecte a afinidade dos sistemas de transporte transmembranar para a molcula do nutriente limitante (maior Ks menor afinidade menor ) Os valores das constantes max e KS dependem: - das caracteristicas intrnsecas do microrganismo; - do substrato limitante; - das condies ambientais (ex. Temperatura, pH, etc.) Microrganismo Temperatura 37C 37C 37C 30C 30C Nutriente limitante Glucose Glicerol Lactose Glucose Glucose max (h-1) 0.8-1.4 0.9 0.8 0.5 0.5-0.6 Ks (mg/L) 2-4 2 20 25 50-75
KS
Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae Candida tropicalis
,S
Rendimento do crescimento, Y =
=
Massa de nutriente usada
X S
- Y reflecte a eficincia do crescimento microbiano relativamente ao nutriente (substrato) limitante usado para crescimento (fins comerciais / custos de produo)
Biomassa produzida (g) FACTOR DE RENDIMENTO EM ATP (YATP) = ATP produzido (moles)
Medida da eficincia com que a clula utiliza para crescimento (i.e. biossntese de novo de biomassa) a energia que produz.
S
ENERGIA ( ATP)
Crescimento
Tempo
(
Metabolito secundrio
aps a fase de produo das clulas (aps o crescimento exponencial), normalmente a partir de um metabolito primrio ou de substrato usado para crescimento que esteja em excesso Ex. antibiticos produzidos por fungos miceliais ou por bactrias)
S0, F
X, S, F
QUIMIOSTATO opera por fornecimento do nutriente limitante do crescimento a uma taxa constante
(relacionada com o caudal de entrada do meio de cultura fresco), de modo que a densidade celular (biomassa) e a taxa especfica de crescimento do microrganismo se ajustam a este fornecimento.
TAXA DE DILUIO
Caudal de alimentao do meio fresco = caudal de sada da cultura = F (Litros/hora) Volume da cultura no quimiostato = V = constante (L)
F D taxa de diluio =
V
ESTADO ESTACIONRIO
O quimiostato permite manter a populao microbiana em crescimento equilibrado, isto , na fase de crescimento exponencial, durante perodos de tempo longos i.e. em ESTADO ESTACIONRIO.
S0, F
= =
dX dt
.X
F V
.X
Estado dX =0 estacionrio dt .X = F V F V
.X
=D
S concentrao de nutriente Limitante (g/L) T tempo (h) taxa especfica de crescimento (h-1) D taxa de diluio (h-1)
=D
(S0)
(S) (D)
Exemplo: Volume cultura = 5000 mL; Caudal atravs do quimiostato, F = 2500 mL/hora --- D = 0,5 h-1 Nota: alterao de F alterao da taxa de diluio, D
WASHOUT (quando D Dc
(X)
(S0)
(S) (D)
Vantagens na seleco de microrganismos que sejam mais competitivos na utilizao do nutriente limitante
Vantagens no estabelecimento de culturas de enriquecimento para isolamento de populaes microbianas especficas a partir de populaes mistas (por ex., amostras ambientais)
A afirmao (ou no) de um dado microrganismo face a outro (p.ex., se a populao for mista), depende da relao entre os coeficientes de Monod para os microrganismos em causa (depende em particular da constante de semi-saturao para o substrato S, KS, que inversamente proporcional eficincia com que o microrganismo utiliza o nutriente limitante).
EXEMPLO
Quimiostato a operar com D = A
Microrganismo A
Microrganismo B
S B = max B KsB + S
D = A = max A
maxA ~ maxB
KsA + S
Em cultura contnua, um microrganismo invasor (p.ex. contaminante ou mutante vivel) pode acumular no quimiostato, se for competitivo, isto , se utilizar o nutriente limitante eficientemente face estirpe microbiana original contaminao da cultura original. Mas, se no for competitivo, expulso do quimiostato.
CRESCIMENTO MICROBIANO
O crescimento microbiano definido como o aumento coordenado de todos os constituintes celulares (por exemplo, cidos nucleicos, protenas, lpidos ). Este aumento est normalmente associado ao aumento do nmero de clulas em consequncia da multiplicao celular. definido como o crescimento duma populao de clulas dum microrganismo, ou seja, o aumento do nmero de clulas do microrganismo ao longo do tempo. normalmente quantificado em termos do aumento no tempo de: (i) n de clulas; (ii) densidade ptica da cultura; ou, (iii) massa celular (biomassa). Em certas condies, o aumento da massa pode no reflectir crescimento da populao, mas aumento de compostos de reserva (p.ex. glicognio, poli--hidroxibutirato, etc.) Grande parte dos microrganismos multiplica-se por fisso binria (p.ex. maior parte das bactrias) ou por gemulao (p.ex. maior parte das leveduras). Em consequncia do processo de multiplicao celular, uma clula dar origem a duas ao fim de um certo perodo de tempo que designado por tempo de gerao ou duplicao.
O tempo de duplicao (ou gerao) pode repetir-se vrias vezes, enquanto estiverem disponveis no meio de cultura nutrientes em quantidade suficiente para assegurarem os metabolismos catablico (bioenergtico) e anablico (biossntese) das clulas e enquanto as condies ambientais forem favorveis.
A durao do crescimento exponencial de bactrias em meio de cultura laboratorial depende da bactria em causa e pode ficar limitada por falta de nutrientes, privao de oxignio, acumulao de produtos txicos, ou outros factores.
O conhecimento dos valores de (taxa especifica de crescimento) e de g (tempo de duplicao) para um dado microrganismo permite: - prever como evoluir a concentrao de clulas ao longo do tempo de incubao num determinado meio de cultura e/ou em determinadas condies ambientais; - testar o efeito de uma determinada alterao das condies ambientais sobre o crescimento do microrganismo (p.ex. modificao do meio de cultura, da Temperatura, etc.) OBJECTIVOS ESSENCIAIS: seleccionar as condies de cultura ptimas para um dado microrganismo. estabelecer mtodos que permitam controlar o crescimento de microrganismos.
Contadores electrnicos
(ex. Contador coulter, citmetro de fluxo)
So instrumentos usados para contar partculas em suspenso. Possuem um pequeno orifcio onde estabelecida uma corrente elctrica por recurso a 2 elctrodos. Suspenso de clulas forada a passar pelo orifcio. A passagem de cada partcula (clula, esporo, etc.) causa uma diminuio momentnea da condutividade elctrica entre os elctrodos. Os perodos de interrupo da corrente elctrica so contados, sendo essa contagem uma medida do nmero de partculas presentes na suspenso.
Fcil e rpido No permite distinguir clulas viveis de mortas til para microrganismos grandes, mas no para a maior parte das bactrias
FASES DO CRESCIMENTO MICROBIANO EM DESCONTNUO Cultura batch sistema fechado (excepto troca de gases)
Fase de latencia No ocorre aumento mensurvel do nmero de clulas. Fase de adaptao ao novo meio (p.ex. sntese de novas enzimas) e a condies ambientais novas.
Durao da fase de latncia pode ser longa (vrias horas), quando esto presentes compostos txicos, substratos dificeis de metabolizar ou o inculo insuficiente (n de clulas viveis ou vitalidade das clulas insuficientes).
Fase exponencial Crescimento da populao com taxa (velocidade) constante. Durante esta fase, em que todos os nutrientes esto presentes em excesso, os microrganismo dividem-se e a populao cresce com uma taxa especfica de crescimento mxima. O valor desta taxa de crescimento depende do potencial gentico do microrganismo, da composio do meio de cultura e das condies de crescimento (temperatura, pH, disponibilidade de gua, etc.). Fase estacionria O crescimento da populao pra, devido a esgotamento de nutriente essencial ou acumulao de metabolito txico. Parte das clulas podem permanecer viveis durante algumas horas custa do consumo de materiais de reserva endgenos.
Algumas espcies bacterianas exibem, nesta fase de crescimento, a produo de endsporos.
Fase de morte Perda irreversvel da capacidade de diviso celular; ocorre o decrscimo progressivo no n de clulas viveis da populao.
QUIMIOSTATO opera por fornecimento do nutriente limitante do crescimento a uma taxa constante
(relacionada com o caudal de entrada do meio de cultura fresco), de modo que a densidade celular (biomassa) e a taxa especfica de crescimento do microrganismo se ajustam a este fornecimento. Meio de cultura fresco (esterilizado) fornecido contnuamente (caudal F), o qual contm, entre outros nutrientes, o nutriente limitante (concentrao S0). Simultneamente, parte da cultura removida, com o mesmo caudal F a que meio de cultura fresco entra. O efluente removido contm clulas do microrganismo (biomassa, X), assim como produto(s) sintetizado(s) pelas clulas. A concentrao de nutriente limitante sada (S) , em condies operacionais adequadas, muito baixa ou aproximadamente nula.
S D= D = max Ks + S
S=
D. KS max - D
Notas sobre as representaes grficas da concentrao de biomassa (X), da concentrao de nutriente limitante (S) e do tempo de duplicao da populao microbiana no estado estacionrio, em funo da taxa de diluio a que o quimiostato opera (D).
A densidade celular (biomassa, X) igual, para uma gama larga de taxas de diluio a que o quimiostato pode operar (consequentemente, a concentrao residual de nutriente limitante, S, no quimiostato mantida com um valor baixo, uma vez que este nutriente est a ser consumido pelas clulas da cultura em crescimento) ;
Apesar da concentrao de biomassa permanecer constante, a taxa especfica de crescimento pode variar com a variao da taxa de diluio que aplicada no quimiostato (porque = D); quanto maior a taxa de diluio, maior a taxa de crescimento da populao (e, inversamente, menor o tempo de duplicao ou gerao).
A gama de valores de taxa de diluio, D, a que o quimiostato pode operar limitada. O valor limite a taxa de diluio crtica (Dc). Para valores muito altos da taxa de diluio (D Dc), o crescimento celular no consegue compensar a diluio da cultura, e a populao de clulas sai do quimiostato (Wash-out lavagem do quimiostato) ; consequentemente, nessas condies, a concentrao de nutriente limitante aumenta, porque no consumido ; quando D Dc S=S0) A taxa de diluio torna-se crtica e ocorre o Wash-out quando a taxa de diluio a que o quimiostato opera ultrapassa a taxa especfica mxima de crescimento da populao microbiana (mx)
Cultura contnua permite estabelecer condies selectivas para o enriquecimento de amostras ambientais (populaes mistas) em microrganismos especficos Por exemplo: microganismos capazes de metabolizar eficientemente nutrientes txicos ou dificilmente metabolizveis (comparativamente a outros microrganismos presentes numa amostra ambiental, p.ex. solo, gua, esgoto, etc.)
P.ex. til para o isolamento de microrganismos capazes de biodegradar hidrocarbonetos do petrleo, benzeno, fenol, cido benzico, pesticidas ou outros compostos orgnicos, a partir de solo (populao mista).
(nestes casos, o quimiostato inoculado com a amostra ambiental; o meio de cultura fresco contm o composto em causa como substrato limitante para crescimento e fornecido contnuamente com taxa de diluio adequada; nestas condies, prolifera(m) preferencialmente o(s) microrganismo(s) que seja(m) capaz(es) de metabolizar eficientemente o composto em causa; outros microrganismos que no tenham essa capacidade (p.ex, com < D) eventualmente presentes na amostra ambiental, sofrero washout, sendo expulsos do quimiostato)
Em cultura contnua, mediante a seleco de taxa(s) de diluio adequada(s), possvel seleccionar uma populao de clulas dum microrganismo nico, que seja muito competitivo e metabolize muito eficientemente um composto orgnico face a outros microrganismos menos competitivos eventualmente presentes numa populao mista inicial.
Pelo contrrio, em cultura descontnua/batch, todos os microrganismos, mais ou menos competitivos na utilizao do composto orgnico, permanecem no meio de cultura cultura batch menos eficiente quando se pretende seleccionar microrganismos muito eficientes na utilizao do composto em causa como substrato para crescimento.
Em cultura contnua, necessrio manter condies de esterilidade durante perodos longos. A adio contnua de meio fresco e o arejamento aumentam a probabilidade de ocorrer contaminao da cultura. Contudo, condies especiais, tais como temperaturas elevadas, valores de pH extremos e substratos pouco usuais podem reduzir a probabilidade de ocorrer contaminao da cultura.
Degenerescncia da cultura
Durante a multiplicao celular dum certo microrganismo pode ocorrer uma mutao expontnea, e surgir um mutante vivel na cultura.
Consequncias
Em cultura contnua, um microrganismo invasor (contaminante ou mutante vivel) acumula no quimiostato se for competitivo, isto , se utilizar o nutriente limitante eficientemente face estirpe microbiana original contaminao da cultura original. Mas, se no for competitivo, expulso do quimiostato. Na cultura bacth, todo o contaminante (ou, mutante vivel) capaz de utilizar o nutriente limitante acumula no meio de cultura, juntamente com o microrganismo que se pretende cultivar contaminao da cultura original.