J . c l i n . P a t h . ( 1 9 4 7 ) , 1 , 3 0 .

THE COLORIMETRIC DETERMINATION

OF
GLUCOSE
B Y
E. J . KING AND R. J . GARNER
B r i t i s h P o s t g r a d u a t e Me d i c a l Sc h o o l , Lo n d o n
( RECEIV ED FOR P UB LICATION, AP RIL 2 5 , 1 9 4 7 )
Se v e r a l n e w d e s c r i p t i o n s o f c o l o r i m e t r i c m e t h o d s
f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f b l o o d s u g a r h a v e b e e n
d e s c r i b e d i n r e c e n t ye a r s ( f o r e x a m p l e , P o l i s a n d
So r t we l l , 1 9 4 6 ; So m o g yi , 1 9 4 5 ; Ne l s o n , 1 9 4 4 ;
Ha s l e wo o d a n d St r o o k m a n , 1 9 3 9 ) . Th e s e p r o -
c e d u r e s a r e a l l b a s e d o n t h e u s e o f a l k a l i n e c o p p e r
r e a g e n t s a n d o n t h e p r o d u c t i o n o f m o l yb d e n u m
b l u e b y t h e a c t i o n o f c u p r o u s c o p p e r o n c o m p l e x
m o l yb d i c a c i d s o l u t i o n s . Wi t h a v i e w t o f i n d i n g
t h e m e t h o d o r c o m b i n a t i o n o f m e t h o d s wh i c h
g i v e s t h e m o s t r e l i a b l e r e s u l t s , p a r t i c u l a r l y i n t h e
v e r y l o w r a n g e o f b l o o d s u g a r , t h e f o l l o wi n g c o m -
b i n a t i o n s o f r e a g e n t s we r e c o m p a r e d : ( a ) Ha r -
d i n g ' s Sc h a f f e r -Ha r t m a n n c o p p e r r e a g e n t wi t h t h e
Fo l i n -Wu p h o s p h o m o l yb d i c a c i d ; ( b ) Ha r d i n g ' s
c o p p e r r e a g e n t wi t h t h e Ne l s o n a r " s e n o m o l yb d i c
a c i d ; ( c ) So m o g yi ' s c o p p e r r e a g e n t wi t h t h e Fo l i n -
Wu p h o s p h o m o l yb d i c a c i d , a n d ( d ) So m o g yi ' s
c o p p e r r e a g e n t wi t h t h e Ne l s o n a r s e n o m o l yb d i c
a c i d .
Mu c h d i f f i c u l t y h a s o c c u r r e d d u r i n g t h e wa r
ye a r s a n d s u b s e q u e n t l y i n t h i s c o u n t r y wi t h
c o l o r i m e t r i c m e t h o d s f o r b l o o d s u g a r . B i o -
c h e m i s t s h a v e r e p e a t e d l y c o m p l a i n e d o f t h e r a p i d
f a d i n g o f t h e b l u e c o l o u r s . Th i s f a u l t h a s b e e n
m o r e m a n i f e s t b e c a u s e o f t h e r e c e n t i n t r o d u c t i o n
o f p h o t o -e l e c t r i c i n s t r u m e n t s i n wh i c h t h e r a p i d
f a l l i n g -o f f o f t h e i n t e n s i t y o f t h e b l u e c o l o u r h a s
b e e n n o t e d b y n u m e r o u s wo r k e r s . Wi t h Du b o s c q
c o l o r i m e t e r s t h e f a d i n g wo u l d n o t h a v e b e e n s o
r e a d i l y n o t i c e d , s i n c e t h e r a t e o f f a d i n g i n s t a n d a r d
a n d t e s t i s v e r y s i m i l a r . It h a s f r e q u e n t l y b e e n
i m p o s s i b l e d u r i n g t h e l a s t s e v e r a l ye a r s t o o b t a i n
c h e m i c a l s o f An a l yt i c Re a g e n t q u a l i t y, a n d t h i s
a b n o r m a l b e h a v i o u r h a s b e e n t r a c e d t o t h e u s e o f
i n f e r i o r c h e m i c a l r e a g e n t s . Th e o r d i n a r y o r
t e c h n i c a l g r a d e o f s o d i u m c a r b o n a t e , f o r i n s t a n c e ,
c o n t a i n s c o n s i d e r a b l e s o d i u m b i c a r b o n a t e a s we l l
a s t h e s o d i u s i l c a r b o n a t e . Th e a m o u n t o f t h i s
i n f e r i o r r e a g e n t s p e c i f i e d f o r t h e p r e p a r a t i o n o f
a n a l k a l i n e c o p p e r s o l u t i o n c o n t a i n s i n s u f f i c i e n t
s o d i u m c a r b o n a t e t o p r o d u c e t h e d e s i r e d p r o p e r -
t i e s i n t h e f i n a l s o l u t i o n , a n d a n a b n o r m a l
b e h a v i o u r c o n s e q u e n t l y
r e s u l t s .
Ex p e r i m e n t a l
REAGENTS
Ha r d i n g ' s c o p p e r r e a g e n t . -Th e
m o d i f i e d Ha r d i n g -
Sc h a f f e r -Ha r t m a n n r e a g e n t i s d e s c r i b e d b y Ha s l e wo o d
a n d St r o o k m a n ( 1 9 3 9 ) . Th i s r e a g e n t i s i d e n t i c a l wi t h
t h a t d e s c r i b e d b y Ha r d i n g a n d Do wn s ( 1 9 3 3 ) , e x c e p t
f o r t h e o m i s s i o n o f t h e p o t a s s i u m
i o d i d e . It s p r e -
p a r a t i o n i s a l s o d e s c r i b e d b y Ki n g ( 1 9 4 7 ) .
So m o g yV -s c o p p e r r e a g e n t . -P r e p a r e d
a c c o r d i n g
t o
So m o g yi ( 1 9 4 5 ) .
Fo l i n a n d Wu ' s p h o s p h o m o l yb d i c
a c i d . -P r e p a r e d
a c c o r d i n g t o Fo l i n a n d Wu ( 1 9 2 0 ) .
Ne l s o n ' s a r s e n o m o l yb d i c a c i d . -P r e p a r e d
a c c o r d -
i n g t o Ne l s o n ( 1 9 4 4 ) , Ki n g ( 1 9 4 7 ) .
Gl Uc o s e s t a n d a r d s . -A
s t o c k s o l u t i o n
i s m a d e b y
d i s s o l v i n g 0 . 1 g . a n h yd r o u s g l u c o s e
i n s a t u r a t e d
b e n z o i c a c i d s o l u t i o n a n d m a k i n g u p t o 1 0 0 m l . ;
2 , 3 , a n d 5 m l . o f t h e s t o c k s o l u t i o n a r e d i l u t e d t o
1 0 0 m l . wi t h s a t u r a t e d b e n z o i c a c i d t o g i v e wo r k i n g
s t a n d a r d s o f 0 . 0 2 , 0 . 0 3 , a n d 0 . 0 5 m g . p e r
m l . r e s p e c -
t i v e l y ( e q u i v a l e n t t o 8 0 , 1 2 0 , a n d 2 0 0 m g . g l u c o s e p e r
1 0 0 m l . o f b l o o d , a c c o r d i n g t o t h e f o l l o wi n g m e t h o d ) .
Is o t o n i c s o d i u m s u l p h a t e -c o p p e r s u l p h a t e
s o l u -
t i o n . -3 g . Na , SO4 , 1 0 H, O, a n d 0 . 6 g . Cu SO4 ,
5 H, O
a r e d i s s o l v e d i n wa t e r a n d m a d e u p t o
1 0 0 m l .
So d i u m t u n g s t a t e . -1 0 g . p e r 1 0 0 m l .
P ROCEDURE
P r e p a r a t i o n o f b l o o d f i l t r a t e . -0 . 0 5
m l . o f b l o o d
i s a d d e d t o 1 . 8 5 m l . o f t h e i s o t o n i c s o d i u m s u l p h a t e -
c o p p e r s u l p h a t e s o l u t i o n i n a c o n i c a l c e n t r i f u g e t u b e ,
a n d 0 . 1 m l . o f s o d i u m t u n g s t a t e
i s a d d e d . Th e m i x -
t u r e i s s h a k e n , a n d t h e p r e c i p i t a t e d p r o t e i n s
a n d
c o p -
p e r t u n g s t a t e a r e s p u n d o wn i n t h e c e n t r i f u g e ,
o r
f i l t e r e d t h r o u g h a s m a l l p a p e r .
Es t i m a t i o n o f g l u c o s e . -1
m l . o f t h e a b o v e f i l t r a t e
a n d 1 m l . e a c h o f t h e g l u c o s e
s t a n d a r d s o l u t i o n s a r e
m e a s u r e d i n t o 3 / 4 -i n .
d i a m e t e r t e s t t u b e s ;
1 m l . o f
c o p p e r r e a g e n t
i s a d d e d a n d m i x e d . Th e t e s t t u b e s
a r e s t o p p e r e d
wi t h c o t t o n -wo o l a n d h e a t e d i n a b o i l -
i n g wa t e r b a t h f o r e x a c t l y 1 0 m i n u t e s . Th e y
a r e c o o l e d
i n r u n n i n g wa t e r ,
a n d 3 m l . o f Fo l i n -Wu . p h o s p h o -
m o l yb d i c a c i d , o r
1 m l . o f Ne l s o n ' s a r s e n o m o l yb d i c
a c i d , wi t h wa t e r t o
5
m l . ( f o r Du b o s c q ;
1 0 i n l . f o r
p h o t o -e l e c t r i c )
a r e a d d e d . Th e c o l o u r s a r e a l l o we d
t o d e v e l o p f o r 1 0 m i n u t e s a n d a r e t h e n c o m p a r e d .
COLORIMETRIC DETERMINATION OF GLUCOSE
Re s u l t s
REAGENTS P REP ARED FROM " ORDINARY GRADE
CHEMICALS
Co m p a r i s o n o f c o l o r i m e t r i c m e t h o d s . -Se v e r a l
d i l u t i o n s ( i n a d d i t i o n t o t h e a b o v e ) we r e m a d e o f
t h e s t o c k s t a n d a r d g l u c o s e s o l u t i o n . On e m l .
s a m p l e s we r e t r e a t e d a c c o r d i n g t o t h e a b o v e p r o -
c e d u r e a n d t h e c o l o u r s m e a s u r e d i n a p h o t o -e l e c t r i c
a b s o r p t i o m e t e r wi t h t h e Il f o r d s p e c t r u m r e d f i l t e r .
Th e z e r o a d j u s t m e n t wa s m a d e wi t h wa t e r i n t h e
c u v e t t e . Th e r e s u l t s ( Fi g . 1 ) s h o we d t h a t t h e c o m -
x
z
s o
-~
L: J
6 0
-
s o
LI
_J
a l -
-5 0 1 0 0 ISO 2 0 0 2 5 0
m g . g l u c o s e p e r 1 0 0 m l .
FIG. 1 . -P h o t o -e l e c t r i c r e a d i n g s ( E x 1 0 0 ) o f g l u c o s e
s o l u t i o n s e s t i m a t e d b y d i f f e r e n t m e t h o d s . Ch e m i c a l s
o f o r d i n a r y q u a l i t y ( n o t a n a l yt i c a l r e a g e n t g r a d e )
we r e u s e d i n p r e p a r i n g t h e r e a g e n t s . No t e t h e h i g h
" b l a n k " c o l o u r s .
b i n a t i o n s o f Ha r d i n g wi t h Fo l i n -Wu , Ha r d i n g wi t h
Ne l s o n , a n d So m o g yi wi t h . Ne l s o n , f u r n i s h p r o -
c e d u r e s c a p a b l e o f g i v i n g g o o d c o n f o r m a b i l i t y wi t h
B e e r ' s La w; b u t t h a t t h e Ha r d i n g -Fo l i n -Wu m i x -
t u r e p r o d u c e d a c o n s i d e r a b l y l a r g e r b l a n k t h a n
t h e o t h e r s . Th e So m o g yi -Fo l i n -Wu c o m b i n a t i o n
yi e l d e d m u c h l e s s s a t i s f a c t o r y f i g u r e wh o s e p r o -
p o r t i o n a l i t y f e l l o f f r a p i d l y wi t h i n c r e a s i n g c o n -
c e n t r a t i o n s o f g l u c o s e .
St a b i l i t y o f c o l o u r s p r o d u c e d . -St a n d a r d s o l u -
t i o n s c o n t a i n i n g a m o u n t s o f g l u c o s e e q u i v a l e n t t o
6 0 a n d 1 2 0 m g . g l u c o s e p e r 1 0 0 m l . a n d a wa t e r
b l a n k we r e p r e p a r e d wi t h t h e Ha r d i n g c o p p e r a n d
Fo l i n -Wu p h o s p h o m o l yb d i c a c i d . Ra p i d f a d i n g
wa s f o u n d t o o c c u r i n t h e f i n a l b l u e s o l u t i o n s wi t h
l o s s o f p r o p o r t i o n a l i t y ( Fi g . 2 ) . It wi l l b e s e e n t h a t
a c o n s i d e r a b l e a m o u n t o f r e d u c t i o n o c c u r r e d i n
t h e b l a n k . Th i s wa s , i n f a c t , v i s i b l e t o t h e n a k e d
e ye , t h e r e b e i n g a g r e e n i s h p r e c i p i t a t e o f c u p r o u s
o x i d e wh e n t h e t u b e wa s r e m o v e d f r o m t h e wa t e r
b a t h .
Th e r e a g e n t s u s e d i n t h e a b o v e e x p e r i m e n t s h a d
b e e n p r e p a r e d wh e n n o An a l yt i c a l Re a g e n t c h e m i -
c a l s we r e a v a i l a b l e . It h a d p r e v i o u s l y b e e n p o i n t e d
o u t f r o m t h i s ' l a b o r a t o r y ( Ki n g , Ha s l e wo o d , a n d
Gr a n t , 1 9 3 6 ) t h a t i m p u r e s o d i u m c a r b o n a t e c a n n o t
b e u s e d f o r t h e t i t r i m e t r i c m e t h o d f o r g l u c o s e , a n d
i t i s a p p a r e n t n o w t h a t i t i s e q u a l l y d a n g e r o u s t o
u s e i t f o r t h e c o l o r i m e t r i c p r o c e d u r e s . It wa s
o b s e r v e d t h a t wh e n t h e Fo l i n -Wu p h o s p h o -
m o l yb d i c a c i d wa s p r e p a r e d f r o m wa r t i m e m o l yb -
d i c a c i d , a c o n s i d e r a b l e a m o u n t o f a m m o n i a wa s
e v o l v e d wh e n t h e s o d i u m h yd r o x i d e wv a s a d d e d i n
t h e p r e p a r a t i o n o f t h e r e a g e n t .
REAGENTS P REP ARED FROM ANALY TIc AL
REAGENT CHEMICALS
Fr e s h c o p p e r r e a g e n t s we r e n o w p r e p a r e d i n
wh i c h An a l yt i c a l Re a g e n t c h e m i c a l s we r e u s e d
t h r o u g h o u t . Th e s o d i u m c a r b o n a t e wa s Ka h l b a u m
p r o . a n a l . ( Gr i f f i n a n d Ta t l o c k ) ; t h e o t h e r c h e m i -
c a l s we r e f r o m B r i t i s h Dr u g Ho u s e s .
Fr e s h p h o s p h o m o l yb d i c a c i d wa s p r e p a r e d u s i n g
a n e q u i v a l e n t a m o u n t o f s o d i u m m o l yb d a t e ( i n -
s t e a d o f m o l yb d i c a c i d a n d s o d i u m h yd r o x i d e ) .
4 4 . 3 g . Na 2 Mo O4 , H2 0 a n d 5 g . Na 2 WO4 , 2 H2 0
we r e d i s s o l v e d i n 2 5 0 m l . d i s t i l l e d wa t e r c o n t a i n -
i n g 2 . 8 g . Na OH, a n d t h e s o l u t i o n b o i l e d f o r 3 0
m i n u t e s . Wa t e r wa s a d d e d t o a p p r o x i m a t e l y
3 5 0 m l . , f o l l o we d b y 1 2 5 m l . H3 P O4 ( 8 9 p e r c e n t
w/ v ; s p . g r . 1 . 7 5 ) a n d t h e v o l u m e m a d e u p t o
5 0 0 m l .
B l a n k c o l o u r . -Th e u s e o f t h e s e r e a g e n t s
r e s u l t e d i n t h e e l i m i n a t i o n o f t h e h i g h
b l a n k
x
9 -
Z
6 0
C)
U
J
~0 5 4
U
0
2 C
2 0 4 0 6 0 8 0
TIME ( MINUTES)
1 0 0
FIG. 2 . -P h o t o -e l e c t r i c r e a d i n g s ( E x 1 0 0 ) o f g l u c o s e
s o l u t i o n s e s t i m a t e d b y t h e m o d i f i e d Ha r d i n g c o p p e r
r e a g e n t a n d t h e Fo l i n a n d Wu p h o s p h o m o l yb d i c
a c i d r e a g e n t . Or d i n a r y q u a l i t y c h e m i c a l s -n o t
An a l yt i c a l Re a g e n t g r a d e . No t e t h e h i g h " b l a n k "
r e a d i n g s a n d t h e r a p i d f a d i n g o f t h e c o l o u r s .
1 2 0
m . g u c o s e / t o o Ml .
-t ~~~~~~6
6 0
m g . g l u c o s e ! /
I
0 0
m l .
B l a n k ( O m g . g l u c o s e )
--O
-0
-0 - -
--0 -
--
-0 , -
I I
3 1 -
E. J . KING AND R. J . - GARNER
r e a d i n g s wi t h t h e Ha r d i n g wi t h Fo l i n -Wu c o m -
b i n a t i o n ( Ha s l e wo o d a n d St r o o k m a n m e t h o d ) .
B l a n k s p r e p a r e d f r o m f r e s h c o p p e r r e a g e n t s h e a t e d
wi t h wa t e r ( i n s t e a d o f g l u c o s e s o l u t i o n )
g a v e a
d e f l e c t i o n o f a p p r o x i m a t e l y a d i v i s i o n o n t h e
a b s o r p t i o m e t e r wh e n t h e z e r o a d j u s t m e n t wa s m a d e
wi t h d i s t i l l e d wa t e r .
St a b i l i t y o f c a l o u r . -Wa t e r b l a n k s a n d s t a n d a r d
s o l u t i o n s c o n t a i n i n g a n a m o u n t o f g l u c o s e e q u i v a -
l e n t t o 8 0 m g . p e r 1 0 0 m l . we r e p r e p a r e d , u s i n g
f r e s h c o p p e r r e a g e n t s , a n d t h e c o l o u r s d e v e l o p e d
wi t h e i t h e r p h o s p h o m o l yb d i c o r a r s e n o m o l yb d i c
a c i d . Th e c o l o u r s o b t a i n e d we r e c o m p a r e d i n a
Hi l g e r Sp e k k e r a b s o r p t i o m e t e r , u s i n g a n Il f o r d
s p e c t r u m r e d 6 0 8 f i l t e r . Th e z e r o a d j u s t m e n t wa s
m a d e wi t h t h e b l a n k s o l u t i o n s . Re s u l t s a r e s h o wn
i n Ta b l e I. Ex c e p t i n t h e c a s e o f t h e So m o g yi wi t h
Fo l i n -Wu c o m b i n a t i o n , t h e c o l o u r s r e m a i n e d s u b -
s t a n t i a l l y s t a b l e o v e r a t h r e e -h o u r p e r i o d .
TAB LE I
STAB ILl TY OF COLOUR IN AN 8 0 MG. GLUCOSE
STANDARD DURING THREE HOURS
( Fi g u r e s r e p r e s e n t p h o t o -e l e c t r i c r e a d i n g s , E x 1 0 0 )
Ha r d i n g Ha r d i n g So m o g yi So m o g yi
Ti m e a n d a n d a n d a n d
( m i n s . ) Fo l i n -Wu Ne l s o n Fo l i n -Wu Ne l s o n
2 2 2 . 5 2 4 2 3 2 4 . 5
1 0 2 2 . 5 2 5 2 2 . 5 2 5 . 2
2 0 2 2 . 5 2 5 2 1 . 5 2 6
3 0 2 2 . 5 2 5 2 0 . 5 2 6
6 0 2 2 . 2 2 5 1 9 . 5 2 6
1 8 0 2 2 2 5 1 7 . 5 2 5
Th e d e v e l o p m e n t o f c o l o u r i n a s i m i l a r s e r i e s ,
i n wh i c h t h e c o l o u r d e v e l o p m e n t wa s f o l l o we d
f o r e i g h t e e n h o u r s a n d t h e b l a n k c o l o u r s we r e r e a d
wi t h a wa t e r a d j u s t m e n t o f t h e i n s t r u m e n t z e r o ,
i s
i l l u s t r a t e d i n Ta b l e II. In e v e r y c a s e , a n d p a r t i c u -
l a r l y i n t h e b l a n k s , t h e c o l o u r b e c o m e s m o r e
i n t e n s e wi t h t h e l a p s e o f t i m e ; b u t t h e d i f f e r e n c e
b e t we e n t h e s t a n d a r d a n d t h e b l a n k r e a d i n g s
b e c o m e s l e s s e x c e p t i n t h e c a s e o f t h e Ha r d i n g
wi t h
Ne l s o n c o m b i n a t i o n ,
wh e r e i t b e c o m e s g r e a t e r .
Th u s , a l t h o u g h t h e r e i s a n a c t u a l i n t e n s i f i c a t i o n
o f
c o l o u r i n e v e r y c a s e , t h e r e i s , e x c e p t wi t h t h e
Ha r d i n g -Ne l s o n , a " r e l a t i v e f a d i n g " ( t h a t i s ,
a
l e s s e n i n g o f t h e d i f f e r e n c e b e t we e n s t a n d a r d
a n d
" b l a n k r e a d i n g s ) ,
wh i c h i s m o s t m a r k e d i n t h e
So m o g yi wi t h Ne l s o n c o m b i n a t i o n .
P r o p o r t i o n a l i t y. -Th e
r e l a t i o n b e t we e n
c o l o u r
d e v e l o p m e n t
a n d c o n c e n t r a t i o n o f g l u c o s e
wi t h
t h e f r e s h c o p p e r r e a g e n t s i s s h o wn i n Fi g . 3 .
B e e r ' s La w i s c l o s e l y a d h e r e d t o , e v e n i n t h e l o w
r a n g e o f s u g a r v a l u e s , p a r t i c u l a r l y wi t h t h e
Ha r d i n g -Ne l s o n c o m b i n a t i o n . Th e Ha r d i n g -
Fo l i n -Wu a n d t h e So m o g yi -Ne l s o n c o m b i n a t i o n s
a l s o g i v e s a t i s f a c t o r y r e s u l t s , b u t t h e Ha r d i n g -
Ne l s o n c o m b i n a t i o n i s -p r e f e r r e d b e c a u s e o f t h e
g r e a t e r s t a b i l i t y o f i t s b l a n k c o l o u r s .
Di s c u s s i o n
Th e a b o v e r e s u l t s e m p h a s i z e t h e n e c e s s i t y o f
p r e p a r i n g s u g a r r e a g e n t s f r o m t h e b e s t c h e m i c a l s _
o b t a i n a b l e . On l y An a l yt i c a l Re a g e n t c h e m i c a l s
s h o u l d b e e m p l o ye d . Th e u s e o f r e a g e n t s p r e -
p a r e d f r o m i m p u r e c h e m i c a l s c a n o n l y l e a d t o t h e
p r o d u c t i o n o f u n r e l i a b l e r e s u l t s .
Th e p u r i t y o f s o d i u m c a r b o n a t e s e e m s t o b e t h e
m o s t i m p o r t a n t f a c t o r i n t h e p r o d u c t i o n o f s a t i s -
f a c t o r y c o p p e r r e a g e n t s . If An a l yt i c a l Re a g e n t
s o d i u m c a r b o n a t e c a n n o t b e o b t a i n e d , t h e o r d i n a r y
s o d i u m c a r b o n a t e s h o u l d b e h e a t e d i n a c r u c i b l e
t o r e d h e a t a n d m a i n t a i n e d a t t h a t t e m p e r a t u r e
f o r a b o u t t h i r t y m i n u t e s . Th e c o o l e d p r o d u c t
i s
p o wd e r e d i n a m o r t a r a n d s t o r e d i n a b o t t l e wi t h a
t i g h t l y f i t t i n g s t o p p e r . Th i s t r e a t m e n t e n s u r e s t h a t
a n y c o n t a m i n a t i n g s o d i u m b i c a r b o n a t e i s d e c o m -
p o s e d i n t o s o d i u m c a r b o n a t e . Th e p r o c e d u r e ,
m g . g l u c o s e p e r 1 0 0 m l .
FIG. 3 . -Ca l i b r a t i o n c u r v e s f o r g l u c o s e
m e t h o d s wi t h
r e a g e n t s p r e p a r e d f r o m An a l yt i c a l Re a g e n t g r a d e
c h e m i c a l s . P h o t o -e l e c t r i c r e a d i n g s ( E
x 1 0 0 )
wi t h
t h e Hi l g e r Sp e k k e r a b s o r p t i o m e t e r ,
1 c m . c e l l s a n d
Il f o r d s p e c t r u m r e d f i l t e r s .
h o we v e r , i s o n l y
r e c o m m e n d e d
wh e n
An a l yt i c a l
Re a g e n t s o d i u m c a r b o n a t e i s n o t a v a i l a b l e .
So m e s a m p l e s
o f Ne l s o n a r s e n o m o l yb d i c
a c i d ,
p r e p a r e d s t r i c t l y a c c o r d i n g
t o Ne l s o n ' s i n s t r u c -
3 2
COLORIMETRIC DETERMINATION OF GLUCOSE
TAB LE I
STAB ILITY OF COLOUR OF A 2 0 0 MG. GLUCOSE STANDARD DURING EIGHTEEN HOURS
( Fi g u r e s r e p r e s e n t p h o t o -e l e c t r i c r e a d i n g s , E x 1 0 0 )
Ha r d i n g Ha r d i n g So m o g yi So m o g yi
a n d a n d a n d a n d
Ti m e Fo l i n -Wu Ne l s o n Fo l i n -Wu Ne l s o n
2 0 0 m g . B l a n k Du f f . 2 0 0 m g . B l a n k
Di f f .
2 0 0 m g . B l a n k
Di f f .
2 0 0 m g .
B l a n k Di f f .
s t d . s t d . s t d . s t d .
( m i n . )
5 6 3 3 . 5 5 9 . 5 7 7 . 5 1 4 6 3 . 5 7 6 1 8 . 5 5 8 . 5 8 0 1 9 . 5 6 0 . 5
( h r . )
1 6 4 . 5 5 5 9 . 5 7 8 . 5 1 4 . 5 6 4 7 7 . 5 2 2 . 5 5 5 8 3 2 3 6 0
1 8 7 2 2 1 . 5 5 0 . 5 1 2 7 1 8 1 0 9 7 8 4 0 3 8 1 0 7 8 5 2 2
t i o n s , g i v e a p e r s i s t e n t g r e e n c o l o u r wi t h e i t h e r t h e
Ha r d i n g o r So m o g yi c o p p e r r e a g e n t s . Ot h e r
b a t c h e s g i v e a g r e e n c o l o u r wh i c h wi t h Ha r d i n g
c o p p e r r e a g e n t d e v e l o p s i n t o a b l u e c o l o u r wi t h i n
5 m i n u t e s , wh i l e wi t h t h e So m o g yi r e a g e n t t h e
c o l o u r r e t a i n s a d e f i n i t e g r e e n i s h t i n t f o r a b o u t o n e
h o u r . It h a s a l s o b e e n f o u n d t h a t t h e r e a d i n g s o f
b l a n k s p r e p a r e d f r o m t h e Ha r d i n g o r So m o g yi r e -
a g e n t s i n c r e a s e s l i g h t l y wi t h t h e a g e o f t h e r e a g e n t .
Ne i t h e r o f t h e s e p o i n t s a f f e c t s t h e a c c u r a c y o f t h e
r e s u l t s wh e n t h e r e a d i n g s o f t h e c o l o u r s a r e m a d e
wi t h a r e d l i g h t f i l t e r , a n d wh e n , wi t h a p h o t o -
e l e c t r i c i n s t r u m e n t , t h e z e r o s e t t i n g i s m a d e wi t h a
b l a n k s o l u t i o n .
Su m m a r y
1 . Th e Ha r d i n g c o p p e r r e a g e n t ( wi t h o u t t h e
i o d a t e ) p r o p o s e d b y Ha s l e wo o d a n d St r o o k m a n
g a v e b e t t e r c o l o u r d e v e l o p m e n t b o t h wi t h Fo l i n
a n d Wu p h o s p h o m o l yb d i c a c i d a n d wi t h Ne l s o n
a r s e n o m o l yb d i c a c i d t h a n d i d t h e c o r r e s p o n d i n g
So m o g yi r e a g e n t .
2 . Th e c o l o u r d e v e l o p m e n t o b t a i n e d wi t h Ha r -
d i n g r e a g e n t i s o f t h e s a m e o r d e r a s t h a t o b t a i n e d
wi t h So m o g yi r e a g e n t .
3 . Th e Ha r d i n g -Fo l i n -Wu a n d Ha r d i n g -Ne l s o n
c o m b i n a t i o n s a r e f o u n d t o g i v e t h e m o r e s t a b l e
c o l o u r s , t h e So m o g yi -Ne l s o n a n d t h e So m o g yi -
Fo l i n -Wu c o m b i n a t i o n s b e i n g s u b j e c t t o v a r yi n g
d e g r e e s o f f a d i n g .
4 . Wi t h l o w s u g a r c o n c e n t r a t i o n s t h e Ha r d i n g -
Ne l s o n c o m b i n a t i o n i s f o u n d t o g i v e m o r e r e l i a b l e
r e s u l t s t h a n t h e Ha r d i n g -Fo l i n -Wu .
5 . On l y c h e m i c a l s o f An a l yt i c a l Re a g e n t ( A. R. )
q u a l i t y s h o u l d b e u s e d f o r t h e p r e p a r a t i o n o f b l o o d
s u g a r r e a g e n t s .
REFERENCES
Fo l i n , O. , a n d Wu , H. ( 1 9 2 0 ) . J . b i o l . Ch e m . , 4 1 , 3 6 7 .
Ha r d i n g , V . J . , a n d Do wn s , C. E. ( 1 9 3 3 ) . J . b i o l . Ch e m . , 1 0 1 , 4 8 7 .
Ha s l e wo o d , G. A. D. , a n d St r o o k m a n , T. A. ( 1 9 3 9 ) . B i o c h e m . J . ,
3 3 , 9 2 0 .
Ki n g , E. J . ( 1 9 4 7 ) . Mi c r o -An a l ys i s i n Me d i c a l B i o c h e m i s t r y. Lo n d o n :
Ch u r c h i l l .
Ki n g , E. J . , Ha s l e wo o d , G. A. D. , a n d Gr a n t , G. A. ( 1 9 3 6 ) . Na t u r e ,
1 3 7 , 8 7 2 .
Ne l s o n , N. ( 1 9 4 4 ) . J . b i o l . Ch e m . , 1 5 3 , 3 7 5 .
P o l i s , B . D. , a n d So r t we l l , M. ( 1 9 4 6 ) . Ar c h . B i o c h e m . , 1 1 , 2 2 9 .
So m o g yi , M. ( 1 9 4 5 ) . J . b i o l . Ch e m . , 1 6 0 , 6 1 .
3 3