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EMBRAPA Extração 30-11-2014LivroProtMolecular PDF
EMBRAPA Extração 30-11-2014LivroProtMolecular PDF
protocolos de extrao e de
amplificao de dna por meio da tcnica
de reao em cadeia da polimerase
Fundamentos
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Autores
Mrcia Cristina de Sena Oliveira
Mdica Veterinria, Dra., Embrapa Pecuria Sudeste, Rod. Washington Luiz, km
234, Caixa Postal 339, CEP: 13560-970, So Carlos, SP.
Endereo eletrnico: marcia@cppse.embrapa.br
Luciana Correia de Almeida Regitano
Mdica Veterinria, Dra., Embrapa Pecuria Sudeste, Rod. Washington Luiz, km
234, Caixa Postal 339, CEP: 13560-970, So Carlos, SP.
Endereo eletrnico: luciana@cppse.embrapa.br
Alexandre Dinnys Roese
Engenheiro Agrnomo, Mestre, Embrapa Trigo, Rod. BR 285, km 294, Caixa
Postal 451 CEP 99001-970 Passo Fundo, RS
Endereo Eletrnico: alex@cnpt.embrapa.br
Denilson Gouva Anthonisen
Bacharel em Qumica, Mestre, Embrapa Clima Temperado, Rod. BR 392, km 78,
9 Distrito, Monte Bonito, Caixa Postal 403 CEP 96001-970 Pelotas, RS
Endereo Eletrnico: denilson@cpact.embrapa.br
Epaminondas do Patrocnio
Bacharel em Qumica, Embrapa Mandioca e Fruticultura, Rua Embrapa, s/n, Caixa
Postal 007 CEP 44380-000 Cruz da Almas, BA
Endereo Eletrnico: epami@cnpmf.embrapa.br
Mrcia Maria Parma
Bacharel em Qumica, Embrapa Meio Ambiente, Rod. SP 340, km 127m5,
Tanaquinho Velho, Caixa Postal 69 CEP 13820-000 Jaguarina, SP
Endereo Eletrnico: mmparma@cnpma.embrapa.br
Sandra Maria Mansur Scagliusi
Biloa, Mestre, Dra., Embrapa Trigo, Rod. BR 285, km 294, Caixa Postal 451 CEP
99001-970 Passo Fundo, RS
Endereo Eletrnico: mansur@cnpt.embrapa.br
Wilston Henrique Belem Timteo
Licenciado em Matemtica, Mestre, Embrapa Milho e Sorgo, Rod. MG 424, km 45,
Caixa Postal 151 CEP 35701-970 Sete Lagoas, MG
Endereo Eletrnico: wilston@cnpms.embrapa.br
Silvia Neto Jardim
Biloga, Dra., Embrapa Milho e Sorgo, Rod. MG 424, km 45, Caixa Postal 151
CEP 35701-970 Sete Lagoas, MG
Endereo Eletrnico: silvia@cnpms.embrapa.br
SUMRIO
1.
2.
3.
4.
5.
6.
INTRODUO .........................................................................................................................1
CARACTERIZAO MOLECULAR DOS CIDOS NUCLICOS .....................................2
OBTENO DE AMOSTRAS PARA EXTRAO DE DNA...............................................3
CUIDADOS DURANTE E APS A EXTRAO DE DNA..................................................4
MATERIAL NECESSRIO PARA EXTRAO DE DNA ...................................................4
EXTRAO DE DNA DE AMOSTRAS DE TECIDOS DE MAMFEROS..........................5
6.1. Material (ver Apndice) ......................................................................................................5
6.2. Digesto da amostra ............................................................................................................5
6.3. Extrao do DNA com fenol ...............................................................................................5
6.4. Purificao do DNA por meio de precipitao com etanol.................................................6
7. PROTOCOLOS EMPREGADOS NA ROTINA DE EXTRAO DE DNA DE
AMOSTRAS DE SANGUE......................................................................................................7
7.1. Extrao de DNA de amostras de sangue com a utilizao de colunas de extrao...........7
7.2. Protocolo de extrao de DNA de sangue mediante precipitao com sal .........................8
7.3. Extrao de DNA de amostras congeladas de sangue.......................................................10
8. PROTOCOLOS EMPREGADOS NA EXTRAO DE DNA DE AMOSTRAS DE
ARTRPODES COM UTILIZAO DE COLUNAS DE PURIFICAO .......................11
8.1. Protocolo para extrao de DNA de amostras de carrapatos com colunas de purificao11
8.2. Protocolo de extrao de DNA de ovos de carrapatos com a utilizao de colunas de
purificao........................................................................................................................12
9. EXTRAO DE DNA DE AMOSTRAS DE SMEN ........................................................13
10. EXTRAO DE DNA DE PLANTAS..................................................................................14
11. LEITURA DA CONCENTRAO DE DNA NAS AMOSTRAS .......................................16
12. INTRODUO TECNICA DE PCR .................................................................................16
13. ESCOLHA DOS PRIMERS OU INICIADORES...................................................................19
14. PCR MULTIPLEX ..............................................................................................................20
15. NESTED
PCR ........................................................................................................................20
16. PCR QUANTITATIVA ..........................................................................................................21
17. ELETROFORESE DE CIDOS NUCLICOS .....................................................................21
17.1. Eletroforese em gel de agarose.......................................................................................22
17.2. Variveis que afetam a migrao do DNA atravs do gel de agarose ...........................23
18. PROTOCOLO PARA ANLISE DE PRODUTOS DE AMPLIFICAO E
FRAGMENTOS DE DIGESTO EM GEL DE AGAROSE.................................................25
19. ELETROFORESE EM SISTEMA CAPILAR .......................................................................26
20. PROTOCOLO PARA ANLISE DE PRODUTOS DE AMPLIFICAO EM SISTEMA
CAPILAR ................................................................................................................................28
21. PROTOCOLOS DE AMPLIFICAO DE DNA PARASITRIO......................................28
21.1. PCR para Babesia bigemina...........................................................................................28
21.2. Nested
PCR para Babesia bigemina..............................................................................29
22. ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE PARA VISUALIZAO DOS PRODUTOS
AMPLIFICADOS....................................................................................................................31
23. APNDICE .............................................................................................................................33
24. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS....................................................................................37
25. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA.........................................................................................37
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da polimerase
Fundamentos terico-prticos e protocolos de extrao e de amplificaode DNA por meio da tcnica de Reao em cadeia
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de 20C a
80C,
dependendo
do
tempo
de
fracionamento
em
pequenas
alquotas,
para
que
material
no
sofra
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TE
(trisHCl
10
mM,
EDTA
mM,
com
pH
8,0;
tris
hidroximetilaminometano).
g) Soluo de dodecilsulfato de sdio (SDS) a 0,1%.
h) Nitrognio lquido.
i) Frascos e bastes esterilizados.
j) Microtubos de polipropileno.
6.2. Digesto da amostra
As amostras de tecidos de origem animal ou vegetal que sero submetidas
extrao de DNA devem sofrer fragmentao e digesto enzimtica das protenas.
Para produzir a fragmentao, as amostras podem ser cortadas, submetidas a
congelamento em nitrognio lquido e rapidamente pulverizadas por processo manual
(utilizando um basto) ou mecnico (utilizando equipamentos para esse fim).
Quantidades da amostra (entre 200 mg e 1 g) so adicionadas a uma soluo-tampo
de digesto (na proporo de 1,2 mL de tampo para cada 100 mg de tecido) e
colocadas em banho-maria em temperatura prxima a 50C, para que ocorra a
digesto. O tempo de incubao pode variar entre oito e dezesseis horas, ou at que a
amostra se apresente totalmente digerida, ou seja, apresente aspecto viscoso.
6.3. Extrao do DNA com fenol
O mtodo mais utilizado para purificao do DNA a extrao com fenol
tamponado, que provoca a desnaturao das protenas de maneira eficiente. O
clorofrmio tambm usado como agente desnaturante das protenas contidas na
amostra. A mistura de fenol e de clorofrmio muito eficiente para desproteinizar e sua
ao se fundamenta na propriedade hidrfoba das protenas que apresentam afinidade
por solventes orgnicos. O lcool isoamlico previne a formao de espuma quando a
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mistura agitada, o que torna mais fcil a separao da fase orgnica e da fase
aquosa. A protena que foi desnaturada pelo tratamento com fenol e clorofrmio forma
uma camada na interface das duas fases, separando-se do DNA que se mantm na
fase aquosa. Para extrair o DNA de uma amostra, usar igual volume de soluo de
fenol, de clorofrmio e de lcool isoamlico (25:24:1). A extrao com o fenol
dependente do pH. O fenol empregado nas extraes de DNA deve ter o pH prximo
de 8,0 (fenol tamponado), j que faixas mais baixas de pH deslocam o DNA para a
interface na hora da centrifugao. Em pH 7,0 ou acima, o DNA permanece na fase
aquosa e em pH abaixo de 7,0, ele desnaturado e migra para a fase orgnica. Nesse
ltimo caso, o RNA permanece na fase aquosa. Metodologia para tamponamento do
fenol est descrita no Apndice. Aps a adio da soluo de extrao, centrifugar a
amostra por dez minutos a 1.700 g e transferir o sobrenadante para um novo tubo.
Cuidado: A manipulao de solues que contm fenol exige cuidado, pelo fato de
serem extremamente custicas, volteis e irritantes para as mucosas.
6.4. Purificao do DNA por meio de precipitao com etanol
A precipitao do DNA feita por meio da utilizao de etanol absoluto
associado a uma soluo com alta concentrao de um sal catinico. O etanol induz a
transio estrutural nas molculas de cido, fazendo-as se agregarem, com
conseqente precipitao. A precipitao com etanol absoluto, alm de concentrar o
DNA, ajuda a remover resduos de fenol e de clorofrmio presentes na amostra. O
etanol a 70% utilizado para remover resduos de sais. Embora tanto o cloreto de
sdio como o acetato de sdio e o acetato de amnio sejam eficazes na precipitao
do DNA, mais difcil remover o cloreto de sdio, em razo da sua menor solubilidade
em etanol.
Procedimento:
Adicionar meio volume de soluo de acetato de amnio 7,5 M e dois volumes
de etanol absoluto. Centrifugar a 1.700 g por cerca de dois minutos (o tempo deve ser
ajustado de acordo com a amostra). Eliminar a soluo alcolica e preservar o pellet de
DNA. Ressuspender o pellet em etanol a 70% (para eliminar impurezas presentes na
amostra), centrifugar novamente a 1.700 g por dois minutos. Descartar o sobrenadante
e deixar secar o pellet de DNA. Ressuspender o DNA em tampo TE (ver item 6.1.f).
Para facilitar a completa dissoluo do DNA nesse tampo, as amostras podem ser
incubadas em agitador a 65C por algumas horas.
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ele lavado at que apresente alta pureza. No final do protocolo, o DNA eludo com
gua quente ou com tampo TE. A utilizao de kits permite a purificao do DNA nas
amostras de maneira homognea e rpida.
Procedimento:
a) Colocar 300 L de sangue e 900 L de soluo de lise, em microtubo de 1,5 mL.
b) Homogeneizar e centrifugar a 20.800 g por cinco minutos e descartar o
sobrenadante, deixando cerca de 50 L.
c) Homogeneizar a amostra e adicionar 500 L de soluo de extrao.
d) Incubar por cinco minutos, em temperatura ambiente, e transferir o contedo do
microtubo para a coluna de extrao. Acoplar a coluna de extrao ao tubo coletor.
e) Centrifugar a 5.000 g por um minuto; descartar o contedo do tubo coletor.
f) Adicionar coluna 500 L de soluo de extrao e centrifugar a 5.000 g por um
minuto; descartar o contedo do tubo coletor.
g) Adicionar coluna 500 L de soluo de lavagem e centrifugar a 20.800 g por trs
minutos; descartar o contedo do tubo coletor.
h) Transferir a coluna para um microtubo de 1,5 mL, limpo e livre de enzimas que
decomponham o DNA.
i) Adicionar 100 L de gua ultrapura, autoclavada e aquecida a 70C; incubar por um
minuto, em temperatura ambiente, e centrifugar a 5.000 g por um minuto, obtendose assim a soluo de DNA. O DNA pode ser eludo em tampo TE tambm
aquecido a 70C.
7.2. Protocolo de extrao de DNA de sangue mediante precipitao com sal
Este protocolo, adaptado de Olerup & Zetterquist (1992), usado no Laboratrio
de Biotecnologia da Embrapa Pecuria Sudeste e pode ser empregado com volumes
pequenos de sangue.
Solues:
250 L.
250 L.
50 L.
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5 L.
10 L.
10 L.
12,5 L.
2,0 L.
f) H2O ultrapura
460,5 L.
10
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Obteno do DNA:
a) Ressuspender o pellet em 500 L de soluo B e misturar no vortex. Obs.: destruir
bem o pellet antes de incubar.
b) Incubar a 55C, at dissolver o pellet (durante quatro a seis horas ou de um dia
para o outro). De vez em quando, misturar as amostras no vortex, para que o pellet
fique bem dissolvido.
c) Ajustar o volume para 760 L com tampo TE (210 L). Acrescentar 240 L de
NaCl 5 M.
d) Incubar por quinze minutos em gelo.
e) Agitar os tubos por inverso, at formar pequenos cogulos de protena.
Centrifugar por quinze minutos a 16.000 g.
f) Dividir todo o sobrenadante em dois tubos novos (devidamente marcados), 500 L
em cada um.
g) Ligar o banho-maria a 37C. Adicionar 1 mL de etanol absoluto gelado e inverter o
tubo vrias vezes. Centrifugar por quinze minutos a 16.000 g. Descartar o
sobrenadante. Secar com papel (com cuidado).
h) Lavar com 500 L de etanol a 70%, gelado. Revolver o tubo. Centrifugar por cinco
minutos a 16.000 g. Descartar e colocar a secar (temperatura mxima de 40C).
Adicionar 250 L de tampo TE + soluo de enzima que degrada RNA (RNAse
10 g por mL de amostra) e incubar por uma hora a 37C.
7.3. Extrao de DNA de amostras congeladas de sangue
Solues utilizadas (Ver Apndice):
Tampo PBS.
Tampo de lise 1.
Etanol absoluto.
Procedimento:
a) Descongelar a amostra de sangue em temperatura ambiente e adicionar igual
volume de tampo PBS.
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Procedimento:
a) Pesar 20 mg da amostra e colocar em um microtubo de 1,5 mL.
b) Macerar com a ponta cnica de um basto. A macerao pode ser feita aps
congelamento com nitrognio lquido.
c) Adicionar 10 L de tampo de digesto 2 e incubar por quinze minutos em
temperatura ambiente.
d) Adicionar 15 L de proteinase K (20 mg/mL) e incubar por quatro horas na
temperatura de 56C.
e) Adicionar 500 L de soluo de extrao, incubar por quinze minutos em
temperatura ambiente.
f) Centrifugar a 5.000 g por dois minutos.
g) Recolher o sobrenadante, colocar em coluna de extrao e centrifugar a 5.000 g por
um minuto. Descartar o material do tubo coletor.
h) Novamente adicionar 500 L de soluo de extrao e incubar por quinze minutos
em temperatura ambiente. Centrifugar a 5.000 g por um minuto.
i) Adicionar a soluo de lavagem e centrifugar a 20.000 g por trs minutos (16.000
rpm).
j) Transferir a coluna para um tubo limpo de 1,5 mL e colocar 100 L de gua a 70C
(ou tampo TE). Aps um minuto, centrifugar o tubo com a coluna a 5.000 g por um
minuto.
9. EXTRAO DE DNA DE AMOSTRAS DE SMEN
Solues utilizadas (ver Apndice):
Tampo PBS.
Tampo de lise 2.
Procedimento:
a) Descongelar uma palheta de smen (cerca de 0,54 mL) e colocar em um microtubo
de 1,5 mL.
b) Centrifugar durante oito minutos a 16.000 g.
c) Lavar o pellet quatro vezes em 1 mL de tampo PBS (a cada lavagem passar no
vortex e centrifugar novamente).
d) Ressuspender em 100 L de tampo PBS (nesta fase, a amostra pode ser
armazenada no freezer).
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e) Adicionar 400 L de tampo de lise 2 e incubar por trinta minutos a 50C para
dissolver o pellet.
f) Adicionar soluo de proteinase K a 200 g/mL (100 g = 5 L da soluo de
estoque de 20 mg/mL). Agitar no vortex at dissolver. Incubar por dezesseis horas
a 50C.
g) Dividir as amostras em dois tubos, colocando 250 L em cada tubo.
h) Adicionar 80 L de NaCl 5 M por tubo. Agitar vigorosamente por inverso.
Centrifugar a 16.000 g por cinco minutos.
i) Transferir o sobrenadante para tubos limpos. Acrescentar 1 mL de etanol absoluto a
cada tubo e agitar por inverso. Centrifugar a 16.000 g por cinco minutos.
j) Desprezar o sobrenadante. Acrescentar 100 L de etanol a 70% a cada tubo (no
agitar no vortex).
k) Centrifugar a 16.000 g por cinco minutos. Desprezar o sobrenadante. Secar o pellet
e suspender em 100 L de tampo TE + enzima que atue sobre RNA (10 g/mL de
amostra).
l) Incubar por uma hora em temperatura ambiente.
10. EXTRAO DE DNA DE PLANTAS
A extrao de DNA de plantas envolve a lise das clulas vegetais por meio do
tratamento com detergente e posterior separao e precipitao do DNA.
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Procedimento:
a) Pesar 300 mg do tecido vegetal (a quantidade de tecido vegetal pode chegar a at
3 g).
b) Macerar com auxlio de nitrognio lquido, at que a amostra esteja pulverizada.
c) Colocar a amostra em microtubo de 2 mL e adicionar 700 L de soluo-tampo de
extrao vegetal e homogeneizar durante dez minutos por inverso.
d) Incubar as amostras em banho-maria a 65C por uma hora, homogeneizando
algumas vezes.
e) Retirar do banho-maria e deixar a temperatura da amostra se igualar temperatura
ambiente.
f) Adicionar 700 L de soluo de clorofrmio e de lcool isoamlico (24:1), e
homogeneizar suavemente.
g) Centrifugar a 5.000 g por dez minutos em temperatura ambiente, para separar a
fase orgnica e a fase aquosa.
h) Remover a fase aquosa (superior) para um novo microtubo, evitando tocar a
interface com a ponta da ponteira.
i) Repetir a extrao com soluo de clorofrmio e lcool isoamlico (24:1) mais uma
ou duas vezes, considerando que maior nmero de extraes pode purificar mais o
DNA, porm com alguma perda.
j) Aps a remoo final do sobrenadante, adicionar 450 L de isopropanol (gelado),
equivalente
aproximadamente
2/3
do
volume
coletado.
Homogeneizar
suavemente.
k) Manter a 20C por dois minutos (para evitar a precipitao de polissacardeos).
l) Centrifugar a 8.600 g por dez minutos.
m) Descartar o sobrenadante.
n) Lavar o pellet uma vez com etanol a 70%.
o) Lavar novamente o pellet com etanol a 95%.
p) Deixar secar por uma hora.
q) Ressuspender em 50 a 100 L de tampo TE (pode-se adicionar RNAse na
concentrao final de 10 g/mL de amostra).
r) Incubar a 37C por uma hora.
s) Manter a 20C.
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23
0,3
60 5,0
0,6
20 1,0
0,7
10 0,8
0,9
7 0,5
1,2
6 0,4
1,5
4 0,2
2,0
0,1
24
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(em ampres). Para ocorrer migrao eletrofortica, deve haver compromisso entre a
intensidade de corrente i e a voltagem do meio V. Em resumo:
V = Ri
P = Vi
ou
Ri2.
AMPLIFICAO
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aplicao de campos eltricos elevados (100 a 500 V/cm). Isso resulta em separaes
de alta eficincia, em alto poder de resoluo e em reduzido tempo de anlise.
Em geral, um aparelho de eletroforese capilar bsico consiste de uma fonte de
alta tenso, capilares (geralmente de slica fundida), eletrodos (de platina,
normalmente), e um detector apropriado. A fonte de alta tenso aplicada nos
eletrodos de platina situados nos reservatrios com soluo eletroltica apropriada. As
extremidades do capilar so imersas nos reservatrios da soluo, para completar o
contato eltrico. As amostras normalmente so introduzidas no capilar por mtodos
eletrocinticos, nos quais uma diferena de potencial estabelecida entre o capilar e o
recipiente que contm a amostra, durante um tempo predeterminado.
O detector localiza-se em algum ponto do capilar, prximo ao reservatrio de
sada.
A eletroforese capilar em gel utilizada exclusivamente para separao de
macromolculas, tais como oligonucleotdeos, fragmentos de DNA e protenas. Essa
tcnica teve incio com a aplicao nas separaes de DNA por tamanho molecular,
por meio de colunas preenchidas com gel, denominados gis qumicos: um capilar
tratado com um reagente que estabiliza o gel junto parede do capilar, atravs de
ligaes covalentes. Esse mtodo foi descartado, dado o grande nmero de problemas
que surgiram, tais como aparecimento de bolhas (perda de condutividade), introduo
limitada de amostra, reteno de fragmentos com alto peso molecular e degradao do
gel por hidrlise. Tais problemas levaram formulao de novos sistemas e que foram
denominados gis fsicos.
Gis fsicos so matrizes polimricas hidroflicas, dissolvidas em tampo
apropriado, que no so ligados parede do capilar. Assim, eles podem ser
substitudos a cada separao, o que permite o aproveitamento do mesmo capilar por
centenas de vezes, sem perda de eficincia. A uma dada concentrao de polmero, as
fitas polimricas individuais comeam a interagir umas com as outras e formam uma
estrutura em rede dentro do capilar, o que possibilita a separao dos fragmentos de
DNA. A concentrao polimrica tima depende do tamanho do DNA a ser separado.
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1X
29
H2O ultrapura
7,1 L
____ L
Tampo 10 X
1,25 L
____ L
MgCl2
0,375 L
____ L
DNTP (20 mM )
0,125 L
____ L
BiIA (10 M)
0,5 L
____ L
BiIB (10 M)
0,5 L
____ L
Taq (5 U/L)
0,15 L
____ L
1o ciclo
95,0
1
34 ciclos
95,0
72,0
65,0
6466 30"
30
30
64,0
30
72,0
72,0
30
4,0
30
Fundamentos terico-prticos e protocolos de extrao e de amplificaode DNA por meio da tcnica de Reao em cadeia
da polimerase
1X
H2O ultrapura
8,6 L
____ L
Tampo 10 X
1,25 L
____ L
MgCl2
0,375 L
____ L
DNTP (20 mM )
0,125 L
____ L
BiIAN (10 M)
0,5 L
____ L
BiIBN (10 M)
0,5 L
____ L
Taq (5 U/L)
0,15 L
____ L
1o ciclo
34 ciclos
95,0
72
30"
64,00
00
30
95,0
30
68,0
30
72,0
72,0
30"
4,0
Fundamentos terico-prticos e protocolos de extrao e de amplificaode DNA por meio da tcnica de Reao em cadeia
da polimerase
31
PCR
NestedPCR)
Primer
BiIA
CATCTAATTTCTCTCCATACCCCTCC
BiIB
CCTCGGCTTCAACTCTGATGCCAAAG
BiIAN
CGCAAGCCCAGCACGCCCCGGTGC
BiIBN
CCGACCTGGATAGGCTGTGTGATG
Produto (pb)
278
170
32
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da polimerase
CUIDADOS
O brometo de etdio um potente agente mutagnico. Utilizar luvas e mscara
para preparar a soluo de estoque e para manipular os gis.
No olhar diretamente para a luz ultravioleta.
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33
23. APNDICE
Preparo do fenol tamponado:
a) Colocar 250 mL de fenol lquido (ou 250 g de cristais de fenol fundido em banhomaria a 65C) em um frasco de vidro.
b) Adicionar 0,25 g de 8-hidroxiquinolina (antioxidante).
c) Adicionar 250 mL de trisbase (hidroximetilaminometano) 50 mM.
d) Agitar em temperatura ambiente por cerca de quinze minutos (usar agitador
magntico). Deixar repousar a 4C at a separao das fases. Aspirar a fase
aquosa com cuidado.
e) Adicionar 250 mL de soluo tris
HCl 50 mM com pH 8,0 e novamente repetir os
procedimentos dos itens c e d. Verificar o pH da fase fenlica (para isso pode ser
usado o papel indicador) e repetir itens c e d at que o fenol atinja o pH 8,0.
f) Finalmente, recuperar a fase fenlica, adicionar 125 mL de soluo tris
HCl 50 mM
com pH 8,0 ou tampo TE (tris
HCl 10 mM, EDTA 1mM com pH 8,0) e estocar em
frascos escuros a 4C para uso por at dois meses.
g) Nos protocolos de extrao, utilizar a fase fenlica (amarelada) da soluo de
estoque.
Soluo anticoagulante com cido ctrico:
a) cido ctrico
0,48 g.
b) Citrato de sdio
1,32 g.
c) Glicose
1,47 g.
d) gua ultrapura
100 mL.
108 g
55 g
40 mL
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da polimerase
25 mg
25 mg
10 mL
Tampo de lise 1:
TrisHCl, com pH 8,0
10 mM
10 mM
0,5%
20 g/mL
Fundamentos terico-prticos e protocolos de extrao e de amplificaode DNA por meio da tcnica de Reao em cadeia
da polimerase
Tampo de lise 2:
2-mercaptoetanol
2%
10 mM
NaCl
100 mM
10 mM
SDS
0,5%
2,7 mM
KH2PO4
1,5 mM
NaCl
137 mM
Na2HPO4
8 mM
pH
7,0
100 mg
5 mL
Cloreto de clcio
20 mM
Glicerol
50%
100 mM
10 mM
25 mM
SDS
0,5%
Proteinase K
0,1 mg/mL
Tampo de digesto 2:
TrisHCl
10 mM
1mM
Triton X-100
5%
35
36
Fundamentos terico-prticos e protocolos de extrao e de amplificaode DNA por meio da tcnica de Reao em cadeia
da polimerase
10 mg
10 mM
NaCl
15 mM
10 mg
1 mL
0,1 mL
0,082 g
gua ultrapura
100 mL
10 g
gua ultrapura
100 mL
Soluo de NaCl 5 M:
NaCl
292,25 g
gua ultrapura
1.000 mL
Concentrao final
2%
2,0 mL
NaCl 5 M
1,4 M
2,8 mL
0,1 M
1,0 mL
EDTA 0,5 M
20 mM
400 L
2-mercaptoetanol
0,4%
40 L
Polivinilpirrolidona
1,0%
0,1 g
gua ultrapura
3,76 mL
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24. REFERNCIAS
FIGUEROA, J. V.; CHIEVES, L. P.; JOHNSON, G. S.; BUENING, G. M. Multiplex
polymerase chain reaction based assay for the detection of Babesia bigemina, Babesia
bovis and Anaplasma marginale DNA in bovine blood. Veterinary Parasitology, v. 50,
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MANIATIS, T.; FRITSCH, E. F.; SAMBROCK, J. Molecular cloning: a laboratory
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25. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
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RFLP na anlise gentica. Braslia: Embrapa, Cenargen, 1995. 220 p.
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Paulo: Sarvier Editora de Livros Mdicos Ltda., 2004. 975 p.
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Fundamentos terico-prticos e protocolos de extrao e de amplificaode DNA por meio da tcnica de Reao em cadeia
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