Fundamentos e Aplicaes de Engenharia Gentica

Fundamentos de Engenharia Gentica

A Engenharia Gentica permite manipular directamente os genes de determinados organismos com objectivos prticos.

Tecnologia de DNA recombinante

Permite combinar na mesma molcula de DNA genes provenientes de fontes diferentes, mas no necessariamente de espcies diferentes, dando origem a uma molcula de DNA recombinante (DNAr). Baseia-se na utilizao de ferramentas moleculares como as enzimas de restrio, as ligases do DNA e os vectores. Enzimas de restrio reconhecem determinadas sequncias de DNA e cortam a molcula nesses locais. As zonas de restrio correspondem a sequncias de DNA curtas e simtricas que se lem da mesma forma nas duas cadeias na direco 5'-3'. As enzimas de restrio so bastante especficas e ocorrem naturalmente em bactrias. Protegem as bactrias dos ataques dos vrus, uma vez que reconhecem e cortam sequncias especficas do DNA viral, inactivando-o. O DNA bacteriano est protegido da actividade das enzimas de restrio. A actividade das enzimas de restrio d origem a fragmentos de DNA em dupla hlice fragmentos de restrio - com extremidades em cadeia simples extremidades coesivas. Verifica-se complementaridade de bases do DNA nas extremidades coesivas de diferentes fragmentos de restrio obtidos com a mesma enzima. As extremidades coesivas emparelham atravs de ligae sde hidrognio entre bases complementares e podem unir-se pela actividade de ligases do DNA que catalizam a formao de ligaes fosfodister. Vector entidade, constituda por DNA, que transfere o DNA de uma clula ou de um organismo dador para uma clula ou um organismo receptor. Os vectores mais utilizados so os plasmdeos e os bacterifagos. Os plasmdeos so pequenas molculas circulares de DNA que ocorrem naturalmente em algumas bactrias, leveduras e clulas vegetais. Os plasmdeos ligam-se a determinados compostos, tornando-os mais densos, permitindo a sua separao por centrifugao.

Processo de obteno e expresso de uma molcula de DNAr: 1. Selecciona-se uma molcula de DNA dadora, contendo o gene com interesse que se pretende transferir e clonar, e um vector adequado. 2. A molcula de DNA e o vector so tratados com a mesma enzima de restrio, que corta as duas molculas em regies com a mesma sequncia de nucletidos. 3. Misturam-se os fragmentos de restrio da molcula de DNA e o vector e juntam-se ligases do DNA. O vector e os fragmentos de restrio emparelham pelas extremidades coesivas, que so complementares, e a ligase estabelece a ligao. 4. O vector, contendo o DNA dador, transferido para uma clula ou organismo receptor.

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5. O DNA dador incorporado no genoma da clula ou organismo receptor, que passa a possuir um DNA recombinante. 6. Um meio selectivo ou testes qumicos permitem identificar as clulas que exprimem o gene desejado. No processo descrito formam-se fragmentos de restrio que no tm o gene desejado e nem todas as clulas receptoras incorporam o DNA dador.

DNA Complementar - DNAc

Os procariontes so organismos muito utilizados em Engenharia Gentica como receptores de DNA estranho porque so fceis de cultivar, tm um crescimento rpido e processos bioqumicos bem conhecidos. No entanto, no processam o RNAm e, quando recebem genes com intres, estes no so retirados e a protena produzida no funcional. DNA complementar (DNAc) molcula de DNA sem intres que directamente transcrita numa molcula de RNAm funcional. O processo de obteno de DNAc o seguinte: 1. Isola-se uma molcula RNAm funcional das clulas. 2. Adiciona-se transcriptase reversa e nucletidos livres. A transcriptase reversa catalisa a sntese de uma cadeia simples de DNA a partir de um molde de RNAm. 3. Junta-se uma enzima que degrada o RNAm que serviu de molde e DNA polimerase que catalisa a formao da cadeia complementar do DNA. O DNAc pode ser inserido atravs de um vector contendo o promotor e sequncias reguladoras. Todos os DNAc que se sintetizam a partir do RNA podem ser clonados em bactrias, originando uma biblioteca de DNAc, em que toda a informao (genes que se encontravam a ser transcritos expressos num dado momento), fica armazenada em bactrias por longos perodos de tempo, desde que sejam fornecidas todas as condies indispensveis para a sua manuteno.

Reaco de Polimerizao em Cadeia PCR

Tcnica que permite amplificar qualquer poro de DNA fora das clulas. Material necessrio: sequncias de DNA que se pretende amplificar; um par de iniciadores (primers); os quatro tipos de nucletidos; uma polimerase DNA (Taq); soluo-tampo que impea variaes de pH e que contenha Mg , io essencial para a actividade da polimerase.

Uma reaco de PCR corresponde a um conjunto de ciclos, envolvendo cada um destes ciclos: Desnaturao da dupla hlice conseguida com a incubao do DNA a uma temperatura de 95C, formando duas cadeias simples a partir de uma dupla cadeia; Emparelhamento dos iniciadores diminuio da temperatura aproximadamente para os 55C, para ocorrer a ligao dos primers;

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Polimerizao (sntese) de DNA ocorre a 70C, temperatura ptima de actividade da Taq polimerase. Esta liga-se na regio dos iniciadores, e promove a polimerizao, com elongao da cadeia de DNA, servindo a outra como molde. Este ciclo repetido dezenas de vezes, para obter milhes de cpias de DNA, em poucas horas e sem interveno manual. No final, leva produo de 2^n molculas de DNA de interesse, em que n representa o nmero de ciclos. A Taq polimerase uma polimerase extrada da Thermus aquaticus, uma bactria que habita fontes termais com gua extremamente quente, resistindo s variaes de temperatura e contribuindo significativamente para o sucesso da tcnica de PCR (o aquecimento para desnaturar as cadeias de DNA provocava a inactivao definitiva da polimerase, obrigando a adicionar mais enzima por ciclo de aquecimento).

Um dos aspectos mais negativos desta tcnica a grande sensibilidade ``a contaminao com DNA estranho, podendo ocorrer emparelhamento entre os iniciadores e este DNA estranho, amplificando sequncias no pretendidas.

DNA Fingerprint

No genoma humano existem sequncias de DNA repetitivas que so reconhecidas e cortadas por determinadas enzimas de restrio. Estas enzimas dividem o DNA em fragmentos cujas dimenses e composio em nucletidos variam de pessoa para pessoa e reflectem as diferenas entre os alelos dos vrios loci. Diferentes fragmentos de DNA movimentam-se de modo diferente quando submetidos a electroforese (tcnica em que determinadas molculas so sujeitas aco de um campo elctrico num meio poroso) e o resultado um padro de bandas que difere de indivduo para indivduo.

Aplicaes das Tcnicas de Engenharia Gentica

DNA recombinante(DNAr): Investigao fundamental: torna possvel isolar genes de organismos complexos e estudar as suas funes a nvel molecular. Obteno de OGM: os OGM so organismos em cujo genoma foram introduzidos genes que conferem caractersticas vantajosas. Os OGM Os animais transgnicos, normalmente, so produzidos atravs de microinjeco de DNA de um determinado gene em clulas de um ovo fertilizado, ou atravs de clulas colocadas no tero de uma fmea, decorrendo assim o seu desenvolvimento. Os OGM so utilizados para: produo de alimentos em maior quantidade e qualidade; produo de grandes quantidades de substncias com aplicao mdica ou farmacutica, como a insulina, hormona do crescimento ou factores de coagulao sangunea; produo de substncias com aplicao industrial;

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biorremediao modificao de organismos no sentido de degradarem poluentes.

DNA complementar (DNAc): Obteno de cpias de genes que codificam produtos com interesse torna possvel a produo de protenas humanas por procariontes que podem ser cultivados facilmente em biorreactores. PCR:

Obteno de grandes quantidades de DNA em pouco tempo, a partir de uma quantidade muito pequena. Esse DNA pode ser posteriormente utilizado em tcnicas de recombinao de DNA ou em fingerprint.

DNA fingerprint: Investigao criminal, forense e histrica a tcnica permite partir de material biolgico deixado num local (cabelo, sangue, esperma...) e compar-lo com o dos suspeitos; permite a identificao de cadveres. Determinao de paternidade a comparao das impresses digitais genticas dos progenitores e do descendente permite excluir a paternidade ou confirm-la com um elevado grau de certeza.

H alguns obstculos na expresso de genes eucariontes em bactrias. Deve associar-se o gene s sequncias promotoras e reguladoras mais apropriadas e que possam ser reconhecidas pela RNA polimerase da bactria (as zonas de regulao da expresso gnica em procariontes so diferentes dos eucariontes). A resoluo deste problema pode ser obtida pela combinao de uma determinada sequncia nucleotdica com um promotor da prpria bactria, permitindo a expresso da sequncia eucarionte inserida. Quando se transferem genes para uma bactria, aconselhvel que o DNA transferido j esteja processado, uma vez que as bactrias hospedeiras no possuem enzimas para o processamento e remoo dos intres, introduzindo uma cpia de DNAc do gene. A utilizao e introduo no mercado dos OGM um assunto controverso e que levanta problemas ticos. Apesar das vantagens associadas a estes organismos, o impacto que podem vir a ter sobre o ambiente e a sade humana desconhecido e imprevisvel.

Retirado de: http://biohelp.blogs.sapo.pt/

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