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Efeito da Somatotropina Recombinante Bovina (rbST) na Resposta Ovulatria e na Qualidade dos Embries de Vacas Nelore Felipe de Jesus Moraes Junior1, Jos Ribamar de Souza Torres Junior2, Isolda Mrcia do Nascimento3, Antnio de Sousa Jnior4, Hlcio Santos Correia5, Aline Brito da Silva6, Rmulo Jos Vieira7, Jos Adalmir Torres de Souza7 RESUMO Avaliou-se os efeitos da rbST na produo in vivo de embries de oito vacas doadoras da raa Nelore. As superovulaes foram realizadas em duas etapas, em Julho e Outubro de 2007. Na primeira etapa, quatro animais (G1) receberam apenas FSH e quatro (G2) receberam alm do FSH, 250 mg de rbST, por via intramuscular, no dia denominado D0. Na segunda etapa, no sistema crossover, os animais que receberam apenas FSH, receberam 250 mg rbST. As superovulaes foram iniciadas no D4, com 133 mg de FSH, aplicadas em quatro dias consecutivos, com doses decrescentes, a intervalo de 12 horas. Os implantes foram retirados em D7 aps aplicao de duas doses de PGF2

em D6. No D8 foram aplicadas 200 g de um anlogo do GnRH e 12 a 24 horas aps, as inseminaes foram realizadas. Os embries foram coletados no stimo dia aps a primeira inseminao. A resposta superovultoria (presena de corpos lteos), total de estruturas, estdios de desenvolvimento e qualidade dos embries recuperados no foram afetados (P>0,05) pelo tratamento com a rbST. As mdias obtidas nos tratamento G1 e G2 foram respectivamente: estruturas colhidas, 9,53,0 e 7,62,2; embries viveis, 8,12,6 e 5,01,6; estruturas no fertilizadas, 0,30,2 e 0,50,3; estruturas degenerados, 1,00,5 e 0,50,3; mrulas, 0,50,2 e 2,31,9; blastocistos iniciais, 2,22,1 e 1,30,9; blastocistos, 4,71,6 e 2,50,5; blastocistos expandidos, 0,60,3 e 0,50,5; embries grau I 7,32,5 e 5,00,8; embries grau II, 0,50,3 e 1,10,5 e embries grau III, 0,20,1 e 0,50,5. A administrao da rbST no D0, na dose de 250 mg, no constitui boa alternativa para melhorar a qualidade de embries em vacas Nelore. Palavras-chave: bovino, FSH, GH

Doutorando em Cincia Animal/UFPI, Bolsista da FAPEMA (fmoraesjr@hotmail.com) DMV Reproduo Animal/UFMA (ttorresjunior@yahoo.com.br). 3 Doutoranda em Cincia Animal/UFPI (isolda.marcia@hotmail.com). 4 Laboratrio de Reproduo Animal/CCA/UFPI (sousa_jr@uol.com.brl). 5 Mdico Veterinrio (helcioscorreia@hotmail.com). 6 Mestranda em Medicina Veterinria/UEMA (alinevet@hotmail.com). 7 DCCV/CCA/UFPI (rvieira@ufpi.br/adalmir@ufpi.br).
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Effect of the Bovine Recombinant Somatotropin (rbST) in the Ovulatory Response and Embryos Quality of Nelore Cows ABSTRACT - To evaluate the effect of rbST in the in vivo production of Nelore cows embryos a study was carried with eight givers. The superovulation was carried in 2007, in two stages, the first one in July and the second other in October. In the first stage, four animals (G1) received only FSH and four (G2) received besides the FSH, 250 mg of rbST, both by intramuscular application, in the day D0. In the second stage, in the crossover system, the animals that had received only FSH received 250 mg of rbST. The superovulation was initiated in the D4, with 133 mg of FSH, applied in four consecutive days, with decreasing doses in the 12 hours interval. The implantations were removed in the D7 after application of two doses of PGF2 in D6. In the D8, 200 g of GnRH analogous were applied, and after 12 and 24 hours inseminations took place. The embryos were collected in the seventh day after the first insemination. The superovulated reply (presence of lutea corpora), total of structures, developmental stage and quality of the recouped embryos had not been affected (P>0.05) by the rbST treatment. The averages of G1 and G2 treatment were: recovered structures, 9.53.0 and 7.62.2; viable embryos, 8.12.6 and 5.01.6; not fertilized, 0.30.2 and 0.50.3; degenerated, 1.00.5 and 0.50.3; morulae, 0.50.2 and 2.31.9; early blastocysts, 2.22.1 and 1.30.9; blastocysts, 4.71.6 and 2.50.5; expanded blastocysts, 0.60.3 and 0.50.5; embryos degree I, 7.32.5 and 5.00.8; embryos degree II, 0.50.3 and 1.10.5 and embryos degree III, 0.20.1 and 0.50.5, respectively. The administration of 250 mg of rbST in the D0, do not improve the embryos quality in Nelore cows. Key Words: bovine, FSH, GH

Introduo O maior entrave dos programas de Transferncia de Embries (TE) continua sendo o elevado custo e a variabilidade da resposta ao tratamento superovulatrio entre as doadoras. Apesar do intenso nmero de pesquisas desenvolvidas

em diversos pases ainda no existe um protocolo capaz de contornar este problema. Alguns protocolos que sincronizam o desenvolvimento da onda folicular tm se revelado teis por facilitarem o manejo das doadoras e produzirem o mesmo nmero de embries dos tratamentos tradicionais utilizados (Nagano et al., 2004).
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A utilizao da somatotropina recombinante bovina (rbST) em doadoras no incio do ciclo estral, tem sido pesquisada com o objetivo de aumentar a populao de folculos recrutados e, conseqentemente, melhorar a resposta superovulatria (Gong et al., 1996). Os principais hormnios utilizados para superovular fmeas so o hormnio folculo-estimulante (FSH) e a gonadotrofina corinica eqina (eCG) e quando associados rbST tm a capacidade de aumentar o nmero de folculos recrutados e embries viveis (Gong et al., 1993; Gong et al., 1996). A rbST foi um dos primeiros fatores de crescimento produzidos em escala comercial como protena recombinante (Bauman, 1999). A maior quantidade de receptores para a rbST encontrada no fgado, que responsvel pela produo do fator de crescimento semelhante insulina (IGF-I). Entretanto a maioria dos outros tecidos tambm responde rbST. Sobre o sistema reprodutor, esse hormnio atua sobre os receptores do tero e ovrio induzindo-os produo de IGF-I (Lucy, 2000). Em vacas, arbST diminuiu o nmero de estruturas no fertilizadas, melhorou a taxa de sobrevivncia embrionria e acelerou o desenvolvimento embrionrio (Moreira et al., 2002). Por sua vez, Nagano et al. (2004) observaram que 500 mg de
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rbST aplicados no dia zero do protocolo de FSH, em vacas, aumentaram o nmero total de embries, de ovcito e de embries viveis. Esta pesquisa foi realizada com o objetivo de avaliar a rbST na produo in vivo de embries de vaca Nelore. Material e Mtodos O experimento foi realizado na fazenda Canarana, municpio de Vitria do Mearim-MA, com coordenadas geogrficas 032744 latitude Sul e 445214 longitude Oeste. O clima da regio quente e mido, com o perodo chuvoso de dezembro a junho, temperatura de 22 a 35C e precipitao pluviomtrica mdia anual 1.404 mm (NUGEO/UEMA, 2004). O experimento foi realizado nos meses de julho e outubro de 2007, correspondendo ao perodo de estiagem. Foram utilizadas oito vacas puras de origem (PO) da raa Nelore, no lactantes, com peso vivo mdio 525,3726,84 kg e escore de condio corporal 3,0 a 3,5, em escala de 1 a 5, onde 1 corresponde ao animal muito magro e 5 ao muito gordo (Dirksen et al., 1993), mantidas em pastagem de Brachiaria brizantha, sem suplementao, com gua e sal mineral vontade. Os animais foram previamente examinados por palpao retal, no intuito de eliminar fmeas com problemas clnico-

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ginecolgicos. Adotou-se o delineamento inteiramente casualizado, com dois tratamentos (com e sem rbST, Figuras 1

e 2) e oito repeties (vacas doadoras), no sistema crossover. O intervalo entre os tratamentos foi de 90 dias (primeira etapa em julho e segunda etapa em outubro).

Figura 1 - Protocolo de superovulao com FSH e rbST.

Figura 2 - Protocolo de superovulao com FSH e sem rbST.

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As doadoras receberam dois implantes auriculares com 6 mg de Norgestomet (Crestar, Intervet, Boxmeer, Holanda) e 2 mg de Benzoato de Estradiol (RIC-BE, Syntex, Buenos Aires, Argentina) associados a 250 mg de rbST (Boostin, Schering-Plough Sade Animal Indstria e Comrcio Ltda.) em um dia aleatrio do ciclo estral, denominado dia zero (D0). As superovulaes foram realizadas com 133 mg do FSH (Folltropin; Bioniche Canad Inc., Ontrio, Canad) divididas em oito doses decrescentes, aplicadas duas vezes ao dia, por quatro dias consecutivos. Quando da 5 e 6 administrao de FSH as doadoras receberam 150 g de D-Cloprostenol (Prolise, Syntex, Buenos Aires, Argentina) e 8 aplicao foi retirado o implante auricular. No D8 foram administrados 200 g de um anlogo do GnRH (Fertagyl, Intervet, Boxmeer, Holanda). A inseminao artificial, realizada com smen de uma nica partida de um touro, foi efetivada 12 e 24 h aps aplicao do GnRH. Dois tratamentos, um com rbST e outro sem rbST foram definidos e esto apresentados nas Figuras 1 e 2. No D15 do programa, os corpos lteos foram quantificados atravs de ultrasonografia, utilizando um aparelho Pie Medical, munido de um transdutor linear de 6/8 MHz. A seguir, realizou-se anestesia epidural e higienizao da regio perineal,
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procedendo-se ento a colheita das estruturas. Utilizou-se um cateter de duas vias com um balo em sua extremidade (sonda de Foley, N. 20), sendo este inflado aps passagem pela crvix e posicionado no corno uterino, vedando a passagem para o corpo uterino, impedindo o refluxo de lquidos. O meio utilizado para lavagem foi o PBS (Phosphate Buffer Solution) aquecido a 37C, utilizando cerca de 500 ml para lavagem de cada corno uterino. O lquido recolhido foi passado em filtro apropriado, onde ficaram retidas as estruturas em cerca de 50 ml do meio. Repetido o processo no outro corno uterino, o contedo foi colocado em uma placa de Petri, para identificao e captura de estruturas, com auxlio de uma lupa estereoscpia sob aumento de 40X. As estruturas capturadas foram colocadas em outra placa de Petri com meio de manipulao (HOLDING Embriocare) e foram classificados quanto aos estdios de desenvolvimento (Lindner & Wright,1983) e avaliados quanto qualidade (Kennedy et al., 1983). Os estdios de desenvolvimento foram classificados: estdio 1 (mrula: aglomerado celular em cuja superfcie blastmeros individuais podem ser distinguidos); estdio 2 (mrula compacta: blastmeros individuais no podem ser distinguidos na superfcie do embrio); estdio 3 (blastocisto inicial: uma pequena cavidade, a blastocele, est visvel e a massa

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celular interna comea a se formar); estdio 4 (blastocisto: o embrio ocupa a maior parte dentro da zona pelcida, a massa celular interna comea a tornar-se mais distinta, mas o dimetro global do embrio, incluindo a zona pelcida, permanece inalterado); e estdio 5 (blastocisto expandido: o dimetro embrionrio est aumentado e a espessura da zona pelcida pode ser reduzida para aproximadamente 1/3 da espessura original). Quanto qualidade, os embries foram classificados em quatro graus: grau I (excelente: estdio de desenvolvimento com zona pelcida intacta e esfrica, massa celular homognea com clulas de tamanho uniforme, nenhum ou poucos fragmentos celulares no espao perivitelino); grau II (bom: alteraes mnimas na forma e colorao com relao ao grau I, alguns fragmentos ou debris celulares no espao perivitelino e/ ou pequenas formaes vesiculares nos blastmeros); grau III (regular: claras alteraes comparadas com o grau II, embora com a maior parte da massa celular intacta); e grau IV (ruim: muitos fragmentos ou debris celulares no espao perivitelino, vesculas maiores e em maior nmero e claras mudanas degenerativas nos blastmeros, com menos da metade da massa celular intacta). Aps a avaliao, os embries (mrulas e blastocistos) de graus I e II foram colocados em uma placa de Petri contendo

meio de congelao (etilenoglicol), onde permaneceram por 10 min. Em seguida, foram envasados em palhetas de 0,25 mL contendo cinco colunas, duas de PBS nas extremidades e trs mais internas de etilenoglicol, sendo que a coluna central continha o embrio. As palhetas, depois de vedadas com lacradores plsticos e identificadas, foram congeladas utilizandose uma mquina modelo TK 3000. Os dados foram analisados utilizando-se o pacote estatstico SAS (1997), para obteno de mdias e erros padres dos parmetros avaliados (total de estruturas, embries viveis, estruturas no fertilizadas, estruturas degeneradas, estdios de desenvolvimento e qualidade embrionria). Foi utilizado o teste noparamtrico Wilcoxon, com probabilidade de 5%. Resultados e Discusso Para corpos lteos, estruturas recuperadas (embries viveis, no fertilizados e degenerados) e estdios de embries (mrulas, blastocistos iniciais, blastocistos e blastocistos expandidos) no houve efeito (P>0,05) dos tratamentos, onde as mdias gerais foram 12,48,5; 9,98,7 e 7,56,1, respectivamente, (Tabelas 1 e 2). Das 16 superovulaes, 14 (87,5%) responderam ao tratamento com FSH com trs ou mais ovulaes. Estes dados foram
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similares aos obtidos por Borges et al. (2001), onde cerca de 88,5% dos animais (n=23) responderam ao tratamento com FSH.

A mdia de corpos lteo diagnosticados (12,48,5) difere do obtido por Kuehner et al. (1993) onde o grupo tratado com 500 mg de rbST foi superior

Tabela 1 - Mdias e erros padres para corpos lteo e estruturas recuperados de vacas da raa Nelore superovuladas com FSH associado ou no rbST

*Mdias na mesma linha seguidas da mesma letra no diferem entre si pelo teste de Wilcoxon (P>0,05). Tabela 2 - Mdias e erros padres para estdios de desenvolvimento dos embries recuperados de vacas da raa Nelore superovuladas com FSH associado ou no rbST

*Mdias na mesma linha seguidas da mesma letra no diferem entre si pelo teste de Wilcoxon (P>0,05). ao grupo controle (P<0,05) (18,1 x 13,4 respectivamente). Lucy (2000) relatam que a rbST age no corpos lteo, devido presena de receptores para somatotropina. Este fato no foi verificado neste trabalho, pois todas as doadoras passaram pelos dois tratamentos, onde o grupo sem rbST apresentou maior nmero de corpos lteos em relao ao grupo com rbST, indicando pouca presena de receptores nos ovrios. Essa variao, segundo Lucy et al. (1993), De La Sota et al. (1993) e Kirby et al.
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(1997), pode ser influenciada pela raa. Para estruturas totais colhidas (8,77,3) e embries viveis (7,15,9), as mdias obtidas esto de acordo com resultados relatados por Cushman et al. (2001), 7,91,3 estruturas colhidas e 6,11,3 embries transferveis. A no influncia positiva (P>0,05) da rbST no grupo tratado difere de resultados obtidos por Gong et al. (1993, 1996), Moreira et al. (2002) e Nagano et al. (2004), onde a rbST influenciou positivamente no

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recrutamento dos folculos, no aumento do nmero de folculos ovulatrios e, conseqentemente, no de embries viveis. Resultados semelhantes tambm foram relatados por Neves et al. (2005) em trs grupos experimentais: controle 0 mg, 250 mg e 500 mg de rbST. O nmero de estruturas recuperadas pelos autores foi 8,475,60; 9,368,37 e 8,866,88 e de embries viveis 3,332,61; 5,919,31 e 4,795,79, respectivamente, e por Borges et al. (2001), onde as mdias das estruturas totais 15,39,5 e 17,410,9 e embries viveis 8,58,3 e 11,010,0 foram menores em animais tratados que no grupo controle. Segundo esses autores, a utilizao do rbST antes do incio da superovulao no aumenta as mdias de estruturas colhidas e embries viveis. Um fator que pode ter contribudo para a no influncia da rbST sobre as estruturas colhidas e embries viveis, foi a dose utilizada, pois, segundo Rieger et al. (1991), em vacas da raa holandesa, para estmulo dos ovrios so necessrias doses maiores que 500 mg de rbST. De modo geral, fmeas zebunas necessitam de menor dose hormonal para estimulao ovariana quando comparada com fmeas de raas europias. Na presente pesquisa a raa foi Nelore e a dose utilizada 250mg. Outro fator que tambm pode ter influenciado os resultados a raa, j observado em vacas da raa Holandesa (Hasler et al., 1983),

Angus, Brahman (Segerson et al., 1984), Charols, Simental e Hereford (Breuel et al., 1991). A ausncia do efeito do tratamento sobre embries degenerados e no fertilizados, verificada nesta pesquisa, corrobora com os dados de Nagano et al. (2004) e contrape-se aos resultados de Moreira et al. (2002), que atribuem rbST o aumento da taxa de fertilizao e melhoria na qualidade dos embries. Lucy et al. (1995), atribuem os efeitos diretos e indiretos a este hormnio, pois a rbST aumenta as concentraes IGF-I, podendo melhorar a qualidade embrionria, o que no foi observado nesta pesquisa. A rbST no afetou (P>0,05) os estdios de desenvolvimento embrionrios quando colhidos sete dias aps a primeira inseminao. As maiores mdias, tanto no tratamento com rbST como sem rbST referem-se aos estdios de blatocisto inicial (1,84,6) e blastocisto (3,73,6). Coelho (1986), ao obter embries no stimo dia de superovulao, tambm no observou diferena nas mdias de mrulas compactas e blastocistos jovens em taurinos (Bos taurus), como tambm no nmero de mrulas e mrulas compactas em zebunos (Bos indicus), demonstrando a variabilidade individual no desenvolvimento e na qualidade embrionria. Variaes de 24 a 48 h na idade dos embries podem ocorrer no desenvolvimento embrionrio (Lindner
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e Wright, 1983). Deste modo, importante considerar o dia das colheitas dos embries em funo da raa do animal. As mdias

e erros padres da qualidade dos embries recuperados esto apresentados na Tabela 3.

Tabela 3 - Mdias e erros padres para qualidade dos embries recuperados em vacas da raa Nelore superovuladas com FSH associado ou no rbST

*Mdias na mesma linha seguidas da mesma letra no diferem entre si pelo teste de Wilcoxon (P>0,05). A rbST tambm no antecipou a emergncia da onda folicular, melhorando a qualidade do folculo, e, conseqentemente, a qualidade embrionria. Neste sentido, Maffili et al. (2001) relataram que o uso de rbST, em associao com a superovulao no aumentou a quantidade de embries produzidos, mas melhorou o desenvolvimento e a qualidade dos mesmos. Concluses Em vacas da raa Nelore Referncias Bibliogrficas BAUMAN, D.E. Bovine somatotropin and lactation: from basic science to commercial application. Domestic Animal Endocrinology, v.17, n.2-3, p.101-116, 1999. BORGES, A.M.; TORRES, C.A.A.; RUAS, J.R.M. et al. Resposta superovulatria de novilhas mestias holands-zebu tratadas com somatotropina bovina recombinante (rbST). Revista Brasileira de Zootecnia, v.30, n.5, p.1439-1444, 2001. BREUEL, K.F.; BAKER, R.D.; BUTCHER, R.L. et al. Effects of breed, age of donor and dosage of follicle stimulating hormone on the superovulatory response of beef cows. Theriogenology, v.36, n.2, p.241255, 1991.

superovuladas com FSH no se justifica o tratamento prvio com rbST visando-se melhoria da resposta ovariana quanto ao nmero e qualidade dos embries.

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