Quim. Nova, Vol. 25, Supl. 1, 45-61, 2002 PRODUTOS NATURAIS: ATUALIDADE, DESAFIOS E PERSPECTIVAS Angelo C.

Pinto Instituto de Qumica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, CT, Bloco A, Cidade Universitria Ilha do Fundo, 21949-900 Rio de Janeiro - RJ Dulce Helena Siqueira Silva e Vanderlan da Silva Bolzani* Instituto de Qumica, Universidade Estadual Paulista, CP 355, 14801-970 Araraquara - SP Norberto Peporine Lopes Faculdade de Cincias Farmacuticas de Ribeiro Preto, Universidade de So Paulo, Av. do Caf, s/n, 14040-903 Ribeiro Preto - SP Rosngela de Almeida Epifanio Instituto de Qumica, Universidade Federal Fluminense, Outeiro de So Joo Batista, s/n, 24210-150 Niteri - RJ

CURRENT STATUS, CHALLENGES AND TRENDS ON NATURAL PRODUCTS IN BRAZIL. This article offers an overview on the historical facts and the recent state of art of Chemistry of Natural Products which, in the course of 25 years of SBQ, have led to the present development of this area in Brazil. In addition, this article deals with the last trends on Natural Products in Brazil and also in developed countries. Keywords: Chemistry of Natural Products; 25 years of SBQ; historical facts and trends.

INTRODUO O Brasil, com a grandeza de seu litoral, de sua flora e, sendo o detentor da maior floresta equatorial e tropical mida do planeta, no pode abdicar de sua vocao para os produtos naturais. A Qumica de Produtos Naturais (QPN) , dentro da Qumica brasileira, a rea mais antiga e a que, talvez ainda hoje, congregue o maior nmero de pesquisadores. Para facilitar a compreenso do texto e melhor situ-lo no contexto da QPN brasileira, julgou-se apropriado descrever alguns marcos histricos na evoluo dessa rea, sem a pretenso de hierarquizar estes marcos, mesmo porque a simples escolha e definio de limites depende do autor da escolha e por isso sempre um ato pessoal e muitas vezes at arbitrrio. Os primeiros mdicos portugueses que vieram para o Brasil, diante da escassez, na colnia, de remdios empregados na Europa, muito cedo foram obrigados a perceber a importncia dos remdios indgenas. Os viajantes sempre se abasteciam destes remdios antes de excursionarem por regies pouco conhecidas. Os primeiros cronistas da histria brasileira, para citar apenas dois, foram: Pero de Magalhes Gndavo que escreveu Histria da Provncia de Santa Cruz (a que vulgarmente chamamos Brasil) em 1576, e Gabriel Soares de Souza, o autor de Tratado Descritivo do Brasil, de 1587. Este ltimo denominava os produtos medicinais utilizados pelos ndios de as rvores e ervas da virtude1. Alm dos remdios naturais usados na teraputica mdica, no se pode deixar de mencionar o corante extrado da rvore do paubrasil, o principal produto de exportao da colnia durante mais de dois sculos, e um dos motivos para a colonizao do Brasil pelos portugueses2. Quando Portugal comeou a perder suas fontes de especiarias, na ndia e na sia, que foram passando para as mos de ingleses e holandeses, iniciou-se no Brasil a corrida s especiarias do serto canela, baunilha, cravo, anil, razes aromticas, urucum, puxur, salsa, sementes oleaginosas, madeiras etc... Em 1793, s de anil, foram exportadas 1400 arrobas para Portugal3.
*e-mail: bolzaniv@iq.unesp.br

A vinda da Corte Real para o Brasil, em 1808, e o decreto de D. Joo VI que abriu os portos brasileiros s naes amigas pode ser considerado como um dos primeiros marcos histricos oficiais na cincia brasileira, porque foi a partir deste decreto que comearam a chegar ao Pas as primeiras expedies cientficas, cujo principal objetivo era dar conhecimento aos europeus da exuberncia de nossa fauna e de nossa flora. A maioria dos naturalistas destas expedies vieram com a incumbncia de coletar espcimes de animais e de plantas para os museus europeus. No se pode, entretanto, deixar de mencionar que a Europa j tinha conhecimento, h muito tempo, de plantas medicinais brasileiras, atravs da obra Historia Naturalis Brasiliae. Trs homens foram responsveis pelo contedo do livro: Georg Marcgrave, originrio da Alemanha, mas tendo estudado em Leiden; Johannes de Laet, que editou a contribuio de Marcgrave e acrescentou comentrios prprios, e o mdico de Maurcio de Nassau, Willem Piso. A contribuio de Piso consiste de quatro extensas discusses. A primeira sobre o ar, a gua e a topografia do Brasil. A segunda, sobre doenas endmicas locais. A terceira, sobre venenos e seus antdotos. E a quarta sobre plantas medicinais. Este livro representa a primeira histria natural completa da Amrica do Sul4. Na comitiva que acompanhou a Princesa Leopoldina da ustria, noiva de D. Pedro, veio o mdico portugus Bernardino Antnio Gomes, que no Laboratrio Chimico da Casa da Moeda, em Lisboa, isolou a cinchonina das cascas da quina, antes de Pelletier e Caventou terem isolado a quinina das cascas da mesma planta. Formado em Medicina pela Universidade de Coimbra, em 1793, Bernardino Antnio Gomes (1768-1823) prestou servio, vrios anos no Brasil, na Armada Portuguesa. No Brasil fez valiosas observaes botnico-mdicas sobre plantas locais que lhe conferiram grande notoriedade. A cinchonina foi o primeiro alcalide natural sob a forma de base pura, na histria da Qumica5. Na mesma expedio cientfica vieram o mdico e botnico Carl Friederich von Martius e o zologo Johann Baptist Spix, dois dos iniciadores do estudo sistemtico da flora e da fauna brasileiras. Martius teve implicao direta com o incio da fitoqumica brasileira. Esta afirmao feita porque foi por sugesto de von Martius que o jovem farmacutico alemo, Theodoro Peckolt, em 1847, veio para o Brasil para estudar a flora. Este farmacutico pode ser considerado,

PN

46

Pinto et al.

Quim. Nova

pelo seu trabalho fantstico, o pai da fitoqumica brasileira, alm de ser o patriarca de uma famlia de cientistas notveis que se entregaram de corpo e alma ao estudo qumico de plantas brasileiras. Inicialmente instalado na cidade de Cantagalo no Estado do Rio de Janeiro, a mesma cidade onde nasceu Rodolpho Albino Dias da Silva (1889-1931), o autor nico da primeira farmacopia brasileira, Peckolt mudou-se mais tarde para o Rio de Janeiro onde fundou a Farmcia Peckolt, na rua da Quitanda, 157 (posteriormente, 197). Em 1874, Peckolt foi contratado para reorganizar o laboratrio qumico do Museu Nacional, no perodo da direo de Lasdilau Neto. O ano de 1874 pode ser considerado o ano do incio dos estudos de QPN numa instituio pblica brasileira. Entre os muitos trabalhos de Peckolt pode-se destacar o isolamento da substncia de Plumeria lancifolia, que ele denominou de agoniadina. Este foi o primeiro iridide a ser isolado da natureza em forma pura. S 88 anos depois do seu isolamento teve sua estrutura qumica determinada6. Hoje este iridide, muito comum na famlia Apocynaceae, conhecido como plumerdeo7. Na poca de Peckolt a atividade em QPN estava voltada para a comercializao de remdios e se desenvolvia nos laboratrios das antigas boticas. Foi numa farmcia localizada no Rio de Janeiro que o farmacutico Ezequiel Correia dos Santos isolou, em 1838, o alcalide pereirina das cascas do pau-pereira. A pereirina um dos primeiros alcalides, seno o primeiro, a ser isolado puro no Brasil8. Uma das instituies pioneiras de grande importncia para a QPN foi a Faculdade de Medicina do Rio de Janeiro. Nessa escola, dentre os que se dedicaram ao estudo qumico de plantas, destaca-se o nome de Domingos Jos Freire Jnior (1842-1899), que foi catedrtico da cadeira de Qumica Orgnica e Biolgica (1874-1895). Domingos Freire, alm de suas obras didticas, deixou uma srie de publicaes cientficas, algumas dessas na rea de fitoqumica. Descreveu, por exemplo, a grandiflorina isolada da fruta do lobo (Solanum grandiflora)9. Esse alcalide hoje conhecido pelo nome de solasonina10. Outro pesquisador solitrio que tem seu nome ligado QPN o farmacutico Pedro Batista de Andrade (1848-1937), um dos fundadores da Faculdade de Farmcia da Universidade de So Paulo. Este pesquisador realizou, entre muitos outros, estudos sobre a composio qumica do caf11. No sculo XX, a dcada de 20 pode ser considerada a da criao e das mudanas. O ano de 1920 viu a criao oficial de oito cursos de Qumica Industrial, anexos a instituies tcnicas ou de ensino j existentes12. Enquanto as artes explodem com a Semana de Arte Moderna e a poltica v nascer o Partido Comunista Brasileiro, as cincias aprofundam suas razes em solo firme. A Academia Brasileira de Cincias havia sido criada em 1916, e na dcada de 20 que comeam a ser fundadas as Sociedades Cientficas, como por exemplo, a Sociedade Brasileira de Qumica em 192213. No perodo ps-primeira guerra mundial destacam-se, no norte do pas, o nome de Paul Le Cointe, e no sudeste, o mdico baiano Mario Saraiva (1885-1950). O francs Paul Le Cointe esteve ligado Escola de Qumica Industrial do Par, anexa ao Museu Comercial de Belm, do qual foi diretor13. J Mario Saraiva foi idealizador e diretor durante anos do Instituto de Qumica Agrcola (IQA), no Rio de Janeiro. O IQA recebeu este nome em 1934, aps ter sido criado, em 1918, com o nome de Instituto de Qumica. Este , sem dvida, o bero da QPN brasileira14. Da, aps sua extino pelo decreto nmero 1477 de 26 de outubro de 1962, foi que se deu a grande dispora que resultou na disseminao dos grupos que se dedicam hoje no pas QPN. O IQA, graas s pesquisas desenvolvidas pelo seu corpo de pesquisadores constitudo, entre outros, por Otto Richard Gottlieb, Walter Baptist Mors, Benjamin Gilbert, Mauro Taveira Magalhes e Roderick Arthur Barnes, adquiriu grande prestgio nacional e internacional. A partir de dois qumicos notveis: Otto

Gottlieb e Walter Mors, que estavam no IQA na poca de sua extino, se consolidou a moderna fitoqumica brasileira. O primeiro, aps longa peregrinao por quase todo territrio nacional estruturando grupos de QPN, se fixou no Instituto de Qumica da USP, a convite da direo da FAPESP14. O segundo foi o responsvel pela criao do Centro de Pesquisas de Produtos Naturais (CPPN, atual NPPN), anexo Faculdade de Farmcia da UFRJ, a convite do Prof. Paulo da Silva Lacaz. Apesar da criao, em 1934, da Faculdade de Filosofia, Cincias e Letras da Universidade de So Paulo ser o marco principal da cincia brasileira, at a ida do Prof. Otto Gottlieb para o Instituto de Qumica da USP, foram muito poucos os trabalhos de pesquisas de QPN que l se desenvolveram. Estudos, por exemplo, sobre o cido anacrdico e seus derivados encontrados no leo da castanha de caju, o cafestol do caf, e a rena de Cassia alata foram feitos pelo Prof. Henrich Hauptmann (1905-1960)15. Os pesquisadores formados sob orientao dos professores Otto R. Gottlieb, Massayoshi Yoshida e Ndia F. Roque no Instituto de Qumica da USP, a partir de 1970, e pelos professores Walter Mors, Benjamin Gilbert, Maria Auxiliadora C. Kaplan, Mauro T. Magalhes e Roderick A. Barnes, no Rio de Janeiro, so responsveis pela implantao da maioria dos grupos de pesquisa em Produtos Naturais em todo o Brasil. Cabe destacar a professora Alade B. de Oliveira, orientada pelo professor Otto, que foi a grande responsvel pelo crescimento da fitoqumica em Minas Gerais. Os 316 pesquisadores cadastrados atualmente no CNPq desenvolvem trabalhos em 11 linhas de pesquisa: Fitoqumica, Metodologia Analtica, Atividade Biolgica, Ecologia Qumica, Sntese, Biossntese, Biotransformao, Biotecnologia, Quimiossistemtica, Produtos Naturais Marinhos e Qumica de Microrganismos/Insetos, assim divididas para possibilitar a anlise dos dados referentes diversificao de pesquisas dos grupos ou pesquisadores cadastrados nos arquivos do CNPq e da Diviso de PN-SBQ16. A avaliao de reas do conhecimento, em especial a de Produtos Naturais, tem sido realizada quase que continuamente nos ltimos 25 anos, tornando-se um tema recorrente na cincia brasileira. Ao longo dos 25 anos de existncia da Sociedade Brasileira de Qumica (SBQ), a QPN teve um crescimento marcante. Em 1994, com a criao das divises cientficas, a Diviso de Produtos Naturais se fortaleceu ainda mais devido ao trabalho conjunto das diretorias eleitas (ver Apndice) e de seus membros (scios vinculados Diviso) que vm sistematicamente realizando intensas discusses sobre o estado da arte em Produtos Naturais. A evoluo cientfica da QPN no Brasil teve seu marco histrico na fitoqumica clssica (isolamento e determinao estrutural), implantada e estruturada pelos pesquisadores de excelncia j mencionados, de onde surgiram os grupos consolidados e atuantes na rea por todo o pas. Este panorama histrico pode ser acompanhado do desenvolvimento da pesquisa em QPN feita atualmente em nosso pas. importante salientar que vrios desses grupos de pesquisa vm alterando o enfoque da fitoqumica tradicional privilegiando trabalhos que envolvem atividade biolgica, ecologia qumica e biossntese de micromolculas de plantas, microorganismos, organismos marinhos, entre outros, assim como novas metodologias analticas de trabalho com produtos naturais, como uma maneira de atuar na fronteira do conhecimento, a exemplo do que ocorre nos pases industrializados. A Tabela 1 mostra a distribuio desses pesquisadores e seus grupos nas diversas reas temticas. A diferena entre as propores observadas para cada linha de pesquisa segundo o CNPq e a DPN da SBQ devida considerao, pelo CNPq, de todas as linhas desenvolvidas por cada grupo de pesquisa, enquanto os dados da DPN se referem linha de pesquisa principal de cada grupo.

Vol. 25, Supl. 1

Produtos Naturais: Atualidade, Desafios e Perspectivas

47

A predominncia de grupos engajados em trabalhos sobre atividade biolgica deveria refletir a grande preocupao com a busca de aplicao para as molculas isoladas de fontes naturais atravs do seu uso como modelos qumicos para a indstria farmacutica. Nos resumos dos Simpsios de Plantas Medicinais do Brasil, realizados a cada 2 anos, verifica-se a predominncia de trabalhos sobre atividade biolgica. No entanto, uma porcentagem significativa destes relata estudos de toxicologia e farmacologia de plantas medicinais (fitoterpicos) com resultados preliminares, pois so realizados com extratos vegetais brutos ou fraes. Trabalhos envolvendo atividade farmacolgica e toxicolgica de princpios ativos puros so ainda pouco representativos. Grande parte dos projetos de pesquisa submetidos ao CNPq ainda trata de fitoqumica tradicional. Essa constatao fica evidente quando se avalia o resultado das pesquisas desses grupos apresentados nas Reunies Anuais da SBQ (Tabela 2) e nos resultados publicados nas revistas especializadas. A anlise dos resumos apresentados nas Reunies Anuais da SBQ nos ltimos 5 anos (1997 a 2001) (Tabela 2) revela o predomnio de trabalhos em fitoqumica, envolvendo principalmente isolamento e determinao estrutural (51%) e desenvolvimento e aplicao de metodologias analticas (16%), enquanto trabalhos sobre atividade biolgica representam cerca de 19%. Esses nmeros expressam a dificuldade que persiste em se realizar trabalhos multidisciplinares

envolvendo fitoqumica e atividade biolgica, apesar dos pesquisadores se proporem a realizar esse tipo de estudo. De 1997 a 2001, o nmero de trabalhos com esse carter multidisciplinar permaneceu praticamente inalterado. Todavia, a partir de 1999 observa-se um aumento significativo de trabalhos focalizando atividade biolgica, o que pode estar sinalizando uma nova tendncia, que enfatiza a realizao de trabalhos em colaborao. A consolidao dessa tendncia clara, quando se verifica o aumento de cerca de 10% nos trabalhos enfocando atividade biolgica, passando de cerca de 16% em 1996 para 26% em 2001. Aliada a essa perspectiva, tem-se o fato do enfoque biolgico poder se traduzir numa possvel aplicao, o que pode facilitar a obteno de financiamentos pesquisa de outras fontes extra governamentais. Neste incio de sculo, constata-se que alguns grupos de pesquisa j contam com apoio financeiro parcial do setor produtivo nacional. O Brasil j possui massa crtica para atuar nessa nova realidade de pesquisa. Isso pode ser verificado pela porcentagem de artigos publicados por autores brasileiros em revistas nacionais com corpo editorial como J. Braz. Chem. Soc. e Quim. Nova (Tabela 3) e internacionais como Phytochemistry, Planta Med., J. Nat. Prod., Phytother. Res. e J. Ethnopharmacol. (Tabela 4). Se considerarmos Phytochemistry e J. Nat. Prod. como as revistas mais representativas para divulgao de trabalhos realizados nos cinco continentes, com grande participao dos pases europeus, Estados Unidos, China e

Tabela 1. Dados sobre pesquisadores e suas reas temticas na pesquisa brasileira em Qumica de Produtos Naturais Pesquisadores cadastrados no CNPq Fitoqumica Metodologia Analtica Atividade Biolgica Ecologia Qumica Sntese Biossntese Biotransformao Biotecnologia (cultura de tecidos) Quimiossistemtica Produtos Naturais Marinhos Qumica de Microrganismos Total 39 9 84 16 24 2 6 8 24 16 6 234 % 17 4 36 7 10 1 3 3 10 7 3 100 Pesquisadores cadastrados na DPN-SBQ 40 7 37 12 19 3 4 5 4 131 % 31 5 28 9 15 2 3 4 3 100

Tabela 2. Distribuio anual dos resumos apresentados pela Diviso de Produtos Naturais nas Reunies da SBQ, conforme classificao de reas temticas Classificao /Ano Fitoqumica Metodologia Analtica Atividade Biolgica Ecologia Qumica Sntese Biossntese e Biotransformao Biotecnologia Quimiossistemtica Produtos Naturais Marinhos Produtos Naturais de Microrganismos e Insetos Total 1997 % 80 19 21 4 2 2 1 2 4 0 135 (61) (15) (16) (3) (2) (2) (<1) (2) (3) (0) 90 42 27 7 2 5 2 5 3 1 183 1998 % (49) (23) (15) (4) (1) (3) (1) (3) (2) (<1) 108 36 39 10 3 1 1 3 4 1 207 1999 % (52) (17) (19) (5) (1) (1) (<1) (1) (2) (<1) 79 28 38 6 1 2 1 1 3 10 169 2000 % (47) (17) (22) (4) (<1) (1) (<1) (<1) (2) (6) 98 17 49 8 1 5 2 2 0 3 185 2001 % (53) (9) (26) (4) (<1) (3) (1) (1) (0) (2) 455 142 174 35 9 15 7 13 14 15 Total Mdia % 51 16 19 4 1 2 1 2 2 2

48

Pinto et al.

Quim. Nova

Tabela 3. Nmero de artigos sobre Produtos Naturais publicados nas revistas Journal of the Brazilian Chemical Society e Qumica Nova 1997 J. Braz. Chem. Soc. Quim. Nova Total 103 103 PN 12 (12%) 14 (14%) 1998 Total 92 144 PN 20 (22%) 10 (7%) 1999 Total 86 147 2000 PN 29 (29%) 10 (7%) 2001 Total PN 104 22 (21 %) 120 11 (9%)

PN Total 23 (27 %) 100 14 (10%) 141

Tabela 4. Nmero de artigos de pesquisadores brasileiros publicados em peridicos internacionais nos ltimos 4 anos 1997 Biochem. Syst. Ecol. J. Braz. Chem. Soc.* J. Ethnopharmacol. J. Nat. Prod. Phytochemistry Phytochem. Anal. Phytother. Res. Planta Med. Quim. Nova* Total 96 12 107 339 850 52 156 188 14 Brasil 3 (3 %) 12 (100 %) 5 (5 %) 4 (1 %) 42 (5 %) 7 (14 %) 12 (8 %) 10 (5 %) 13 (93 %) 1998 Total 98 20 137 388 1118 47 195 240 10 Brasil 7 (7 %) 17 (85 %) 12 (9 %) 11 (3 %) 67 (6 %) 2 (4 %) 13 (7 %) 11 (5 %) 10 (100 %) 1999 Total 96 23 215 452 710 54 160 241 14 Brasil 9 (9 %) 23 (100 %) 21 (10 %) 12 (3 %) 37 (5 %) 4 (7 %) 16 (10 %) 10 (4 %) 14 (100 %) 2000 Total 117 29 288 441 564 59 146 211 10 Brasil 8 (7%) 28 (97%) 25 (9%) 5 (1%) 56 (10%) 7 (12%) 12 (8%) 10 (5%) 10 (100%) Total 118 30 196 404 477 66 135 231 17 2001 Brasil 11 (9%) 30 (100%) 9 (5%) 9 (2%) 45 (9%) 7 (11%) 11 (8%) 6 (3%) 16 (94%)

* Nmero de artigos sobre Produtos Naturais

Japo, conclui-se que a publicao de artigos de autores brasileiros em torno de 7 e 2%, respectivamente, tem potencial para crescimento relevante, se considerarmos a vantagem do Brasil, sobre os pases citados, em termos de biodiversidade. Outro fator que est contribuindo para uma tomada de conscincia pelo pesquisador brasileiro o valor potencial da biodiversidade brasileira. Esta, encarada como fonte de produtos de alto valor agregado, requer polticas que garantam a sua explorao de forma racional. No estgio atual, so os pases desenvolvidos, com uma biodiversidade pouco significativa, os produtores de substncias teis para a indstria farmacutica, agroqumica etc, a partir de fontes naturais. Apesar da necessidade de atuao nas reas de fronteira do conhecimento, o Brasil possui uma caracterstica territorial muito diferente dos pases industrializados, marcada principalmente pela sua imensa biodiversidade, sendo, portanto, ainda um celeiro para a busca de substncias novas, de interesse biolgico ou no. S um trabalho cientfico integrado de todos os grupos existentes no pas poder, num tempo limite, propiciar o conhecimento real da diversidade qumica dos ambientes tropicais e auxiliar nos estudos futuros sobre o perfil metablico (metaboloma) e associaes com perfil macromolecular (proteoma) das espcies de interesse de nossa biota. Os pesquisadores desta rea tm mo a matria prima mais abundante e diversificada do planeta. Estima-se que 20% desse patrimnio gentico esteja concentrado em territrio nacional, onde o ndice de endemismo altssimo. So 55 mil espcies vegetais (22% do total registrado no planeta), 524 mamferos (cerca de 131 endmicos), 517 anfbios (294 endmicos), 1.622 aves (191 endmicas), 468 rpteis (172 endmicos), 3 mil espcies de peixes de gua doce e cerca de 15 milhes de insetos (muitos sem qualquer descrio taxonmica)17. Em levantamento recente, Myers et al.18 identificaram reas do globo terrestre caracterizadas por excepcional concentrao de espcies endmicas e elevada degradao de habitat. Estas reas denominadas de hotspots, esto sendo exploradas de forma irracional pelo homem e necessitam de aes urgentes a fim de se evitar a extino em massa das espcies nelas existentes em um futuro prximo. Dos 25 hotspots identificados no mundo, o Cerrado e a Mata Atlntica foram reconhecidos como reas de

maior risco de extino, o que refora a importncia de uma massa crtica consolidada de pesquisadores que estudem estes ecossistemas, visando no somente sua preservao e o conhecimento do seu perfil qumico, mas tambm a descoberta de novas substncias teis ao homem. PRODUTOS NATURAIS: ATUALIDADE E DESAFIO Consideraes gerais acerca da histria da qumica de Produtos Naturais As primeiras descries sobre plantas medicinais feitas pelo homem remontam s sagradas escrituras e ao papiro de Ebers. Este papiro foi descoberto e publicado por Georg Ebers, sendo traduzido pela primeira vez, em 1890, por H. Joachin. Foi encontrado nas proximidades da casa morturia de Ramss II, porm pertence poca da XVIII dinastia. Enumera mais ou menos 100 doenas e descreve um grande nmero de drogas de natureza animal e vegetal19. Durante o perodo anterior era crist que ficou conhecido como civilizao grega, vrios filsofos podem ser destacados por suas obras sobre histria natural. Dentre esses, sobressaem-se Hipcrates, considerado o pai da medicina moderna, que se caracterizou por tomar a natureza como guia na escolha dos remdios (Natura medicatrix) e Teofrasto (372 aC), discpulo de Aristteles, que escreveu vrios livros sobre a histria das plantas. seu o registro da utilizao da espcie botnica Papaver somniferum, planta cujo princpio ativo a morfina (1)11 (Documentos sumerianos de 5000 aC referem-se papoula (P. somniferum) e tbulas assrias descrevem suas propriedades).

Vol. 25, Supl. 1

Produtos Naturais: Atualidade, Desafios e Perspectivas

49

Evidncias arqueolgicas mostram que o uso de drogas era amplo em culturas antigas. Nozes de btele, uma planta aromtica que contm substncias psicoativas, eram mascadas h 13 mil anos no Timor; e artefatos descobertos no Equador estendem o uso das folhas de coca a 5000 anos atrs. No sculo I da era crist destaca-se o eminente mdico grego Dioscride, autor de notvel obra sobre medicina e farmcia intitulada De Materia Medica que serviu como guia de ensino nestas reas at a poca do Renascimento. No mesmo sculo, o naturalista latino Plnio, cognominado O Velho, escreveu extensa obra sobre histria natural. No sculo seguinte sobressai Galeno, farmacutico e mdico grego, autor de vrios livros sobre medicina e farmcia. Suas formulaes medicamentosas originaram a farmcia galnica. Na Idade Mdia, no perodo entre 450-1000, conhecido como a Idade Tenebrosa devido ao obscurantismo religioso da cincia nesta poca, a preocupao teolgica invadiu os espritos e somente a partir de sculo VII a cincia readquiriu importncia entre os rabes. A civilizao rabe trouxe importantes contribuies medicina natural. A ela deve-se o emprego dos purgativos vegetais e o conhecimento do sabor doce da urina dos diabticos. No sculo X, impem-se o nome do mdico islmico Avicena (Abu Ali al Hussin ibn Abdallah ibn Sina), estudioso botnico, criador de um tratado sobre medicamentos cardacos. Sua obra mais importante, Canon, foi durante muito tempo o texto mdico mais popular da Europa20. O pensamento cientfico dos sculos XII e XIII sofreu forte controle da igreja. Esta poca caracterizou-se por movimentos religiosos que ficaram conhecidos como Cruzadas. No mbito da qumica ocidental, talvez o acontecimento mais importante deste perodo esteja relacionado com a utilizao do alambique para destilao de lcool. Por volta de 1280, o florentino Thaddeo Alderotti (12231303) destilou vinho para propsitos medicamentosos. Cabe mencionar que evidncias arqueolgicas demonstram que o alambique era conhecido antes da era crist21. Todo o empirismo mgico-feiticeiro da arte de curar ao longo da histria da humanidade, das teriagas s mandrgoras, encontra em Paracelso (1493-1541) sua figura mais polmica. sua a criao da teoria da assinatura dos corpos segundo a qual a atividade farmacolgica de uma planta estaria relacionada com o seu aspecto morfolgico. Assim, por exemplo, a serpentria, erva da famlia das arceas cuja haste malhada lembra o corpo de uma serpente, serviria para a cura de picadas de cobra22. As grandes navegaes trouxeram a descoberta de novos continentes, legando ao mundo moderno um grande arsenal teraputico de origem vegetal at hoje indispensvel medicina. As culturas americanas, especialmente a Inca, Asteca, Maya, Olmeca e Tolteca consignaram civilizao moderna a quina, a ipecacuanha, a coca e muitas outras drogas de valor teraputico23. O isolamento das primeiras substncias puras do reino vegetal comea a acontecer no sculo XVIII. Este sculo, juntamente com o XIX, caracteriza-se pelos trabalhos de extrao, principalmente de cidos orgnicos e de alcalides. desta poca o isolamento de morfina (1) (1806), quinina (2) e estriquinina (3) (1820)16. Aps a metade do sculo XVIII, Lavoisier (1743-1794) destruiu a teoria do flogstico criando as bases da qumica moderna ao estabelecer a natureza da combusto, permitindo desse modo a determinao da composio centesimal das substncias orgnicas. No sculo XIX, Whler (1828), derrubou a teoria da fora vital sintetizando, acidentalmente, a uria a partir de cianato de prata e cloreto de amnio, desferindo poderoso golpe nos vitalistas. A partir da metade do sculo XIX comeam a surgir os primeiros resultados importantes sobre os trabalhos de degradao qumica culminando, em 1873, com a sntese da alizarina. No ano seguinte ao desta sntese, van,t Hoff e Le Bel, ao mesmo tempo e isolada-

mente, propem a estrutura tetradrica do carbono, lanando as bases fundamentais da estereoqumica. Muito antes da proposio da geometria tetradrica do carbono, Biot (1816) descobriu que determinadas substncias orgnicas como o acar de cana, o cido tartrico, a turpentina, etc, tanto em forma pura como em soluo rodavam o plano da luz polarizada e Pasteur (1848) isolou os ismeros dextro e levo do tartarato de sdio e amnio. Em 1916, quando G. N. Lewis props a ligao covalente, j se conheciam vrias estruturas de substncias orgnicas naturais, resultado de laboriosos estudos de degradao qumica e de sntese orgnica. Esse perodo representa o apogeu da sntese dos corantes. O final dos anos vinte e toda a dcada de trinta pode ser caracterizado pelo grande nmero de trabalhos sobre o isolamento e a identificao de substncias de natureza esteroidal. Graas principalmente aos estudos de Wieland e Windaus e colaboradores (1903-1932), o principal representante dessa classe, o colesterol, teve sua estrutura determinada. No entanto, sua sntese s foi realizada, independentemente em 1951, por Robinson e Woodward24. No ano seguinte, este ltimo sintetizou a cortisona. A genialidade deste qumico, considerado o mais expressivo do sculo XX, pode ser avaliada atravs de suas snteses dos alcalides quinina (2) (1945), estriquinina (3) (1954) e reserpina (4) (1958)16.

Aps a Segunda Guerra Mundial a disponibilidade de carbono radioativo (14C) para estudos de biossntese de Produtos Naturais imprimiu um enorme avano neste campo. At ento, as vias biogenticas eram de natureza especulativa. No entanto, apesar de todo empirismo, as primeiras propostas feitas por Robinson, durante as primeiras dcadas do sculo XX, sobre as rotas de biognese de algumas classes de alcalides, foram comprovadas experimentalmente muitos anos depois. Robinson, em 1929, sugeriu pela primeira vez uma provvel origem biogentica da poro pirrolizidnica dos alcalides de Senecio, propondo o aminocido ornitina como o precursor de duas unidades C-4 que acoplariam para gerar as necinas25. Tal precursor foi comprovado por experincias que se seguiram com a incorporao do aminocido marcado em Senecio isatideus26 e Crotolaria spectabilis27. Entre as vrias contibuies advindas do emprego de 14C em investigaes de biossntese podem-se destacar a elucidao das primeiras etapas qumicas da fotossntese, a ciclizao de esqualeno a triterpenos, a degradao de lanosterol a esteris e a biossntese de colesterol.

50

Pinto et al.

Quim. Nova

A introduo dos mtodos espectroscpicos e das diferentes modalidades de cromatografia na fitoqumica alterou gradualmente os objetivos e a filosofia dos trabalhos de isolamento e de determinao estrutural de Produtos Naturais. A utilizao de mtodos espectroscpicos em identificao estrutural permitiu a reduo das quantidades de material necessrio para a anlise e possibilitou, ao mesmo tempo, a determinao em curto espao de tempo de estruturas complexas com vrios centros estereognicos. Plantas medicinais Plantas medicinais um tema recorrente na pauta da cincia brasileira. Unanimidade entre qumicos e farmaclogos brasileiros de reconhecida expresso internacional, os estudos com plantas medicinais ainda no receberam no Brasil, a ateno que o tema merece das agncias financiadoras, embora j exista uma massa crtica de pesquisadores qualificados nas reas de qumica e farmacologia. At o presente momento, no houve um processo coordenado de todos os atores (indstria, farmaclogos, fitoqumicos, qumicos sintticos, farmacuticos, mdicos, etc) visando o desenvolvimento de frmacos a partir de plantas28,29. Na tentativa de reverter este fato, o CNPq lanou recentemente um edital de financiamento para pesquisa de validao de plantas medicinais em uso como fitoterpicos (parceria universidade-indstria). O nico recurso teraputico de parcela da populao brasileira e de mais de 2/3 da populao do planeta, o mercado mundial de fitoterpicos movimenta cerca de US$ 22 bilhes por ano e vem seduzindo a cada ano mais adeptos nos pases desenvolvidos. Em 2000, o setor faturou US$ 6,6 bilhes nos EUA e US$ 8,5 bilhes na Europa, sendo a Alemanha, de longe, o maior mercado mundial de fitoterpicos. O extrato padronizado de Gingko biloba hoje um dos fitoterpicos mais vendidos no mundo e no Brasil. A balana comercial brasileira altamente deficitria neste item. O pas exporta cerca de US$ 7 mi-

lhes em extratos vegetais de alcauz, ales, bardana, catuaba, ipeca e quina. Por outro lado, importa uma quantidade considervel de hormnios esteroidais, produtos cosmticos de fonte natural, verdadeiro contra-senso para uma nao que possui uma das maiores populaes vegetais do planeta30. Um problema grave na comercializao de fitoterpicos no Brasil ou a possibilidade de exportao a falta do status de medicamento tico que lhe garanta eficcia, segurana e qualidade, padres estes mensurados em bases cientficas para a segurana do usurio31. Muitos exemplos de plantas medicinais da biota brasileira poderiam ser citados, entretanto, a maioria das plantas medicinais comercializadas no Brasil so introduzidas. Assim, as plantas medicinais endmicas ainda so pouco conhecidas e se constituem num fascinante assunto de pesquisa acadmica e de desenvolvimento. Neste contexto, o qumico de PN no s pode estar envolvido no isolamento e identificao dos constituintes ativos, como tambm desenvolvendo pesquisas na tentativa de validao de mtodos analticos modernos visando o controle de qualidade destas plantas. Micromolculas de plantas A natureza, de forma geral, tem produzido a maioria das substncias orgnicas conhecidas. Dentre os diversos reinos da natureza, o reino vegetal o que tem contribudo de forma mais significativa para o fornecimento de metablitos secundrios, muitos destes de grande valor agregado devido s suas aplicaes como medicamento, cosmticos, alimentos e agroqumicos32. Muitas dessas substncias constituem-se, sobretudo, em modelos para o desenvolvimento de medicamentos sintticos modernos, tais como procana, cloroquina, tropicamida33, ou de frmacos imprescindveis como, vimblastina (Velban) (5), vincristina (Oncovin) (6), podofilotoxina e os anlogos etoposdeo (VP-16-213; Vepeside) (7) e teniposdeo (VM-26; Vumon) (8), taxol (Paclitaxel; Taxol) (9) e mais recentemente camptotecina (10) e derivados, com participao num mercado que movimenta cerca de 50 bilhes de dlares anualmente.

Vol. 25, Supl. 1

Produtos Naturais: Atualidade, Desafios e Perspectivas

51

Depois da descoberta destes medicamentos de origem vegetal, possvel entender a corrida entre algumas indstrias transnacionais pela busca de substncias bioativas novas. Esta busca foi intensificada nos anos 90, especialmente nas florestas tropicais onde se concentra grande parte da biodiversidade34 e especialmente no Brasil, onde a grande maioria das espcies continua sem qualquer estudo qumico ou biolgico35. Mais fantstico ainda o acmulo de substncias enantiomericamente puras, pelas plantas. A preocupao da indstria farmacutica com produtos quirais intensificou-se e o mercado de frmacos cardiovasculares, antibiticos, hormnios, vitaminas, antiinflamatrios e antitumorais enantiomricos entre 1994 e 1998 girou em torno de 27%. Este mercado explodiu nos anos seguintes e o faturamento de produtos quirais produzidos a partir de espcies vegetais, s no ano passado, alcanou 45,2 bilhes de dlares. Foi muito em funo desses dados que a indstria farmacutica investiu maciamente em programas de bioprospeco, mesmo que considere um investimento de alto risco. Nos anos noventa, o avano das tecnologias de highthroughput screening (HTS) associados qumica combinatria, biotecnologia e estudos genmicos mudou completamente o panorama da pesquisa em Qumica de Produtos Naturais praticada nos pases industrializados. A fitoqumica deixou de ser o alvo. Eram necessrios estudos mais abrangentes sobre a funo, regulao e natureza desses produtos naturais. A biossntese bem reconhecida de muitas classes foi o elo de transio para o entendimento de processos moleculares. A corrida vertiginosa por novos prottipos de frmacos gerou as j conhecidas fbricas de descoberta de produtos bioativos, onde centenas de extratos poderiam ser testados em um dia. Analisando-se o contexto nacional, o saldo contabilizado de tudo que j foi estudado no muito animador. Se por um lado, o estudo fitoqumico de centenas de espcies vegetais revelou, no pas, um time de excelncia em isolamento e determinao estrutural, por outro lado no se logrou at o presente, divisas econmicas com a comercializao de um medicamento oriundo das pesquisas locais com plantas da nossa biota. Quantos lignides, alcalides, flavonides, etc foram isolados? Quantos foram testados? Quantos foram acondicionados e guardados para estudos posteriores? Esses dados merecem reflexo se considerarmos que a indstria transnacional j comea a desativar programas de bioprospeco com plantas, tendo em vista a importncia de medicamentos macromoleculares, devido era ps-genmica. A distncia entre o estado da arte da Qumica de Produtos Naturais praticada nos pases desenvolvidos e o Brasil existe mas no nos compromete. Os grupos atuais no s mudaram o enfoque bsico, como tambm diversificaram suas pesquisas. H grupos estudando biossntese, ecofisiologia, ecologia, atividade biolgica, entre outros. Recentemente, uma somatria de esforos da comunidade cientfica, setor privado e governamental tenta reverter a distncia que nos separa dos pases industrializados e vrios programas colaborativos foram criados (Biota-FAPESP, Bioamaznia, ExtractaBio Rio, etc). Merece destaque o programa Biota-FAPESP que nasceu da comunidade cientfica como uma forma de trabalho conjunto sobre a biodiversidade do Estado de So Paulo. Produtos Naturais de organismos marinhos Os oceanos cobrem 70 % da superfcie terrestre e so habitados por cerca de 200.000 espcies de plantas e invertebrados marinhos e milhes de microorganismos. Alm das plantas, esponjas, octocorais, ascdeas e briozorios so organismos ssseis quando adultos e se desenvolvem em condies adversas quando comparados aos terres-

tres (p. ex. maior presso de consumo e imersos em uma sopa de microorganismos). A evoluo e sobrevivncia destas espcies resultou em organismos que produzem substncias nicas com funes ecolgicas diversas. As pesquisas com Produtos Naturais marinhos no Brasil tiveram incio na dcada de 60 no Centro de Pesquisas de Produtos Naturais na Faculdade de Farmcia da UFRJ36. No entanto, ainda so poucas as informaes, documentadas em artigos cientficos, sobre as substncias isoladas e a atividade biolgica de produtos naturais de organismos marinhos coletados ao longo dos 7500 km de litoral brasileiro. As poucas informaes existentes sobre a qumica desses organismos, muitos dos quais so espcies endmicas, indicam um grande potencial de pesquisa para a rea no Brasil. Atualmente, apenas 4 grupos de pesquisa dedicam a quase totalidade de seus trabalhos ao isolamento e identificao de produtos naturais de organismos marinhos coletados no Brasil. Estes trabalhos do nfase avaliao da funo ecolgica e/ou atividade farmacolgica de substncias isoladas de algas e invertebrados marinhos. No aspecto ecolgico, os trabalhos tm sido direcionados procura de metablitos fagoinibidores, inibidores de crescimento de bactrias marinhas patognicas, inibidores de bioincrustao e na descoberta de mediadores da reproduo. Quanto atividade farmacolgica, neurotoxinas e substncias com atividade anticncer, antiviral, anticoagulante e antitrombtica tm sido isoladas e identificadas. A histria do estudo dos Produtos Naturais marinhos demonstra que, por volta de 1960, houve um grande investimento por parte das indstrias farmacuticas na busca de substncias bioativas a partir dos organismos que vivem nos oceanos. Alm da popularizao do mergulho autnomo e do desenvolvimento de equipamentos para coleta em maiores profundidades, a descoberta de grandes quantidades de prostaglandinas em um octocoral, despertou o interesse nas pesquisas em produtos naturais marinhos. Constituindo a maior concentrao de PGs na natureza (cerca de 2-3% do peso seco do octocoral Plexaura homomalla), as primeiras substncias desta classe isoladas de organismos marinhos foram os derivados de 15R-PGA2 (11a e 11b), epmeros em C-15 das prostaglandinas de mamferos37.

Desde ento, diversos laboratrios, principalmente nos Estados Unidos, Austrlia e Itlia, tm se dedicado ao estudo qumico de esponjas, corais, moluscos, algas, microorganismos e outros organismos marinhos. Muitas substncias identificadas possuem estruturas qumicas nicas e sem precedentes em fontes naturais terrestres; fato que tem motivado, alm do desenvolvimento de novos mtodos de isolamento e de sntese orgnica, pesquisas sobre a origem e biossntese das substncias isoladas, sua importncia ecolgica e atividades farmacolgicas. O estudo das substncias qumicas produzidas pelas espcies marinhas uma ferramenta fundamental para a compreenso da evoluo e da manuteno das comunidades marinhas nos diferentes oceanos 38. Apesar dos estudos em ecologia qumica terrestre j terem sido bastante explorados, somente no incio dos anos 80 que o papel ecolgico de substncias orgnicas produzidas no ambiente

52

Pinto et al.

Quim. Nova

marinho comeou a ser desvendado39. J existem vrias comprovaes experimentais de que pequenas molculas orgnicas so importantes na sobrevivncia das espcies estudadas. Algumas das atividades mais comumente atribudas aos produtos naturais marinhos so as de mediao na reproduo, de defesa contra potenciais predadores, patgenos, bioincrustao ou competidores de substrato40. Somente na ltima dcada que estas funes ecolgicas comearam a ser comprovadas experimentalmente, inclusive por pesquisadores brasileiros41, revelando papis importantes na estruturao dos ecossistemas e dando origem a outras hipteses envolvendo o papel de metablitos secundrios afetando a biodiversidade38-41. Acredita-se que a atividade de produtos naturais em bioensaios farmacolgicos (celulares ou enzimticos) est relacionada s propriedades de defesa do organismo produtor. Como exemplo, a briostatina (12), agente anticncer em fase de testes clnicos, atua no briozorio Bugula neritina (do qual foi isolada) como inibidor do ciclo celular, impedindo a proliferao de organismos estranhos42. Nos ltimos 50 anos cerca de 10.000 produtos naturais marinhos foram descobertos, muitos com atividade farmacolgica, incluindo acetogeninas, policetdeos, terpenos, alcalides, peptdeos e metablitos de origem biossinttica mista43.

Um exemplo histrico do desenvolvimento de frmacos a partir de produtos naturais marinhos, teve origem no isolamento dos nucleosdeos espongouridina (13a) e espongotimidina (13b) por Bergmann e colaboradores nos anos 50. Isoladas da esponja Tethya crypta, estas substncias possuem atividade antiviral e o estudo de anlogos sintticos levou ao desenvolvimento de agentes antivirais e anticncer, tais como ARA-A (14) e ARA-C (15)44.

Algumas substncias isoladas de ascdeas coletadas no Brasil tambm apresentaram atividade anticncer significativa, tais como os depsipeptdeos tamandarinas e os alcalides isogranulatimidas, estes ltimos, inibidores seletivos e especficos do ponto de checagem do ciclo celular46. Outros exemplos de prottipos de frmacos isolados de organismos marinhos so o esterol antiasmtico contignasterol (18) e o diterpeno antiinflamatrio pseudopterosina A (19)45. As pseudopterosinas j so comercializadas como substncias ativas de uma linha de cremes faciais, denominada Resilience, da Este Lauder. Como resultado das pesquisas com o contignasterol e com as pseudopterosinas, desenvolveram-se os derivados semi-sintticos denominados IPL576,092 e methopterosina, respectivamente. O primeiro j se encontra em fase II de testes clnicos, enquanto que o segundo foi aprovado recentemente pela FDA (Food and Drug Administration, EUA) para dar incio fase I47,48.

No entanto, a descoberta de frmacos de origem marinha s agora alcana a maturidade com algumas substncias j em fase clnica de testes, tais como os agentes anticncer briostatina (12), ecteinascidina 743 (16, do tunicato Ecteinascidia turbinata) e aplidina (17, do tunicato Aplidium albicans)45.

Vol. 25, Supl. 1

Produtos Naturais: Atualidade, Desafios e Perspectivas

53

Os estudos sobre polissacardeos sulfatados com atividades anticoagulante e antitrombtica, isolados de algas, ascdeas, pepinos e ourios-do-mar, so os mais significativos na rea de produtos naturais marinhos no Brasil. Como exemplo do resultado dessas pesquisas, o sulfato fucosilado de chondroitina, isolado do pepino-domar Ludwigothurea grisea apresenta-se como alternativa promissora para a heparina, por suas atividades anticoagulante e antitrombtica49. A dificuldade de cultivo de macroorganismos marinhos ou de sntese de molculas complexas em grande escala tm dificultado o desenvolvimento de frmacos de origem marinha. Por outro lado, vrias substncias com atividade farmacolgica so suspeitas de serem produzidas por microorganismos associados, passveis de cultura em larga escala. Isso explica, pelo menos em parte, o interesse crescente no estudo de microorganismos marinhos isolados de sedimentos, da gua do mar, de macroalgas, peixes e invertebrados 40,43. Recentemente, pesquisadores da Universidade da Califrnia identificaram a bactria, endossimbionte do briozorio Bugula neritina, responsvel pela produo da briostatina (12). A bactria Candidatus Endogobula sertula um simbionte verdadeiro e as tentativas de cultivo tm sido em vo. Por outro lado, a identificao e seqenciamento do gene responsvel pela sntese do anticncer 12, abre novas perspectivas para a produo industrial do frmaco. A clonagem do gene e sua expresso em bactrias heterlogas hospedeiras pode ser o caminho na produo em larga escala de briostatinas e anlogos, assim como de outros produtos naturais com estruturas complexas50. Produtos Naturais de microorganismos Os produtos farmacuticos juntamente com os agroqumicos so hoje considerados os dois pilares de sustentao da civilizao moderna. A frase mens sana in corpore sano , certamente, o produto ideal de um projeto cientfico interdisciplinar, cujo resultado final a qualidade de vida da espcie humana. Neste contexto, os produtos naturais isolados de microorganismos, de uma forma geral, tm uma importncia sem precedentes no s como medicamentos (exemplo antibiticos), mas, principalmente como agroqumicos menos danosos sade humana. Os pases desenvolvidos consomem cerca de 60 a 70% de produtos herbicidas na proteo de suas agriculturas. S nos EUA, o merca-

do de herbicidas est estimado em cerca de 4 bilhes de dlares anuais51. Este dado, aliado ao fato de uma tomada de conscincia das polticas pblicas locais, sobre os malefcios dos herbicidas poluentes (derivados clorados e fosfatados), colocam a pesquisa com microorganismos na agenda da pesquisa de PN brasileira. Recentemente, pesquisa neste tema vem sendo explorada por diversos grupos de Produtos Naturais espalhados no pas. O uso de sistemas enzimticos in vivo para reaes de biotransformao so objeto de estudos j h alguns anos nos laboratrios da UNICAMP, UFMG, UFPR , UFSCar e mais recentemente no IQ-USP. Microorganismo associado (fungos e bactrias endofticos) tambm outro tema recorrente da pesquisa em QPN realizada hoje no Brasil. Estes microorganismos vivem em associao ntima com plantas hospedeiras vivas e sadias e acreditase, atualmente, que muitas substncias bioativas que ocorrem em plantas podem ser produzidas por microorganismo associado. No estado de So Paulo, a UFSCar deu o passo inicial pesquisando fungos associados em plantas de Rutaceae e Meliaceae. Recentemente, o IQ-UNESP tambm comea a se dedicar a este estudo focalizando principalmente plantas de Cerrado e Mata Atlntica. Uma das propriedades mais importantes dos microorganismos, em especial dos fungos, est associada sua capacidade metablica de produzir uma grande diversidade de micromolculas bioativas. No obstante, os fungos so responsveis tambm pela produo de substncias altamente txicas para mamferos, conhecidas como micotoxinas, algumas consideradas carcinognicas potentes. Entre as micotoxinas incluem-se aflatoxinas (20), ocratoxinas (21), citreoviridinas (22), tricotecenos e fumonisinas, alm de uma variedade de derivados indlicos tremorgnicos52. Acredita-se que as toxinas produzidas por fungos sejam menos txicas que as substncias produzidas por bactrias, plantas e outras fontes. Nos ambientes tropicais, os fungos constituem-se num srio problema no processo de armazenamento de alimentos, principalmente de cereais, devido produo de micotoxinas txicas que contaminam alimentos e passam a ser um srio problema de sade pblica. Por outro lado, frmacos importantes de uso clnico em vrias patologias foram obtidos de fungos53. Esta dicotomia de funes pode ser proveniente da grande diversidade qumica que os fungos produzem. Em 1994, dos vinte medicamentos mais vendidos, representando um mercado de aproximadamente 6,7 bilhes de dlares, seis deles54, foram obtidos in natura ou por transformao qumica de metablitos provenientes de fungos. Dentre os medicamentos de maior repercusso teraputica para doenas infecciosas destacam-se os antibiticos penicilinas (23) e cefalosporinas (24) como os exemplos mais conhecidos de produtos de fungos. Recentemente, muitas substncias com outras atividades farmacolgicas foram produzidas a partir de metablitos de fungos. Um exemplo notvel a mevinolina (25) (mevacor = lovastatina), um agente redutor de colesterol, detentor de um mercado mundial em torno de U$1 bilho por ano. Outras substncias de grande relevncia como medicamento incluem ciclosporinas (26) e alcalides ergot (27). Numerosos metablitos de fungos vm sendo descobertos como frmacos potenciais, incluindo asperlicina (antagonista de doenas gastrointestinais e SNC) (28), papulacandinas (29) (antifngico), entre outros53,55.

54

Pinto et al.

Quim. Nova

As substncias isoladas de fungos destacam-se tambm como agroqumicos naturais56, tais como destruxinas (inseticidas) e estrobilurinas (fungicidas), alm de vrias fitotoxinas (herbicidas). Com relao ocorrncia e biodiversidade, os fungos constituem-se no segundo maior grupo de espcies sobre a terra, perdendo apenas para os insetos. Estimativas sugerem que h aproximadamente 1,5 milhes de espcies diferentes de fungos, sendo que menos de 5% foram descritas57. Assim, constata-se nos ltimos anos uma prioridade de pesquisa sobre a qumica dos fungos, temendo-se a perda da biodiversidade58. Muitas espcies ameaadas de plantas superiores e insetos esto associadas com a flora especfica dos fungos e, se estas perdas ocorrerem, podero resultar no desaparecimento das espcies de fungos. A busca de princpios bioativos de microorganismos uma das reas em que mais se investe nos pases desenvolvidos, principalmente nas pesquisas de bioprospeco realizadas pelas indstrias farmacuticas59. A utilizao de produtos obtidos de fungos no controle biolgico da agricultura vem crescendo de maneira marcante60. Destacamse nesse processo a utilizao de certos fungos como micoerbicidas, micoinseticidas ou micoparasitas. Devido produo de grande quantidade e diversidade de metablitos secundrios, os fungos competitivos so considerados uma fonte valiosa de produtos com atividade farmacolgica. Entre os fungos oportunistas, os pesquisadores especialistas na rea vm dando um destaque especial aos aquticos, ainda pouco estudados, mas, tambm, uma fonte inesgotvel de substncias bioativas. Estes fungos, como microorganismos competitivos, acumulam uma grande diversidade de micromolculas, muitas dessas com atividade biolgica de interesse61. Qumica de Produtos Naturais e a proteo de plantas Em 1976, sob os auspcios da Academia Pontifcia de Cincias do Vaticano, realizou-se na cidade do Vaticano, a semana de estudos Produtos Naturais e a Proteo de Plantas. As discusses travadas nessa

reunio focalizaram o papel de determinados metablitos secundrios na defesa de plantas contra organismos predadores. A importncia deste tema pode ser avaliada pela destruio cada vez maior dos cultivares de cereais pelo ataque de pragas, que chega a causar a perda de 1/3 da produo mundial de cereais. Este problema vem sendo agravado pela prtica cada vez mais freqente de monoculturas e pela resistncia dos predadores aos inseticidas sintticos. A busca por inseticidas naturais ganhou enorme impulso depois da descoberta dos efeitos indesejveis aos ecossistemas dos inseticidas sintticos, que tem no DDT seu principal vilo. Plantas possuem suas prprias defesas que as protegem de outras plantas, insetos fitfagos e herbvoros predadores de uma maneira geral. Estas defesas so de natureza qumica e, normalmente, envolvem substncias do metabolismo secundrio, as quais podem ser chamadas de fitotoxinas ou aleloqumicos. Esse fenmeno conhecido como alelopatia. A primeira interao planta-planta foi descrita pelo naturalista romano Plnio, que observou que sob a copa das nogueiras no crescem outros vegetais. Hoje se sabe que a fitotoxina responsvel por este fenmeno a juglona (30), um poderoso inibidor de germinao, presente na forma de glicosdeo nas folhas, que sofre hidrlise e oxidao quinona no solo. A definio mais recente de alelopatia, aquela que aceita pela Sociedade Internacional de Alelopatia, muito abrangente, como pode ser vista a seguir: a cincia que estuda qualquer processo envolvendo, principalmente, metablitos secundrios produzidos por plantas, algas, bactrias e fungos que influenciam o crescimento de sistemas biolgicos com efeitos positivos e negativos. Uma definio to ampla como esta para alelopatia dificulta at se afirmar o que sejam aleloqumicos. Estes vo dos fagorrepelentes s fitoalexinas, para citar apenas dois casos de alelopatia. Fagorrepelentes, do ingls antifeedants, so substncias naturais que tm a propriedade de interromper o pastejo, podendo o efeito ser temporrio ou permanente. Os fagorrepelentes geralmente agem sobre o sistema nervoso central dos insetos e so especficos para determinadas espcies. Um exemplo clssico de fagorrepelente a azadiraquitina (31), um triterpeno isolado de Azadirachta indica e

Vol. 25, Supl. 1

Produtos Naturais: Atualidade, Desafios e Perspectivas

55

Melia azedarach, muito ativo sobre Schistocerca gregaria, o gafanhoto do deserto. Outros fagorrepelentes muito potentes contra a chamada lagarta dos cereais, Leucania spp, so os sesquiterpenos poligodial e ugandensial, isolados de espcies da famlia Canellaceae.

As fitoalexinas so substncias com propriedades antimicrobianas produzidas pelas plantas quando estas so infectadas por microorganismos fitopatognicos como vrus, bactrias e fungos, ou quando as plantas esto sob condies de estresse, como secura, frio, ao de luz ultravioleta, etc. As fitoalexinas aparecem, geralmente, em altas concentraes em resposta infeco, desempenhando nas plantas um papel semelhante ao dos anticorpos nos animais. Apesar das fitoalexinas inclurem vrias classes de produtos naturais, existe uma relao entre a natureza qumica destas substncias de defesa com famlias botnicas. Por exemplo, as leguminosas geralmente produzem isoflavonides, as solanceas, diterpenos, asterceas, poliacetilenos e as orquidceas, diidrofenantrenos. As fitoalexinas podero ter no futuro um papel muito importante na agricultura. Na medida que sejam conhecidos os mecanismos de ao dos eliciadores (substncias que ativam o processo de defesa) nos hospedeiros e de como as plantas biossintetizam estes compostos, poder-se- chegar imunizao de plantas de valor econmico contra doenas causadas por fitopatgenos. Os vegetais desenvolvem mecanismos de defesa contra patgenos (vrus, bactrias, fungos, insetos, etc) produzindo toxinas contra o agente invasor e adquirindo resistncia infeco. Desde a dcada de 60, esses mecanismos so conhecidos mas, somente nos ltimos anos, os patologistas vegetais vm-se dedicando ao estudo das bases moleculares e genticas deste fenmeno. Recentemente foi descoberto o envolvimento do cido saliclico (AS) e de seu derivado acetilado (AAS) nas reaes de defesa contra patgenos. O cido saliclico acumulado no tecido vegetal aps a infeco, provocando uma resposta imune, chamada de resistncia sistmica adquirida (SAR). O cido saliclico foi descrito como a molcula sinalizadora no desenvolvimento da SAR no fumo e no pepino. No fumo, o nvel de AS aumentou em mais de 40 vezes nas imediaes da leso por onde penetrou o patgeno. A SAR, pelo que se sabe, est relacionada ao de genes que comandam a proteo de protenas, as quais atuam como antibiticos nos animais. Experimentos em que foram aplicados cido saliclico em folhas de fumo (Nicotiana tabacum) levaram a uma reao do tipo SAR, como se o patgeno (neste exemplo, o vrus do mosaico do tabaco) estivesse presente. Por outro lado, observou-se que quando a formao de cido saliclico foi bloqueada, a atividade SAR desapareceu ou diminuiu, enfraquecendo a resistncia do vegetal. Algumas substncias sintticas anlogas ao AS tambm induzem a SAR , como o cido 2,6-dicloro isonicotnico, o qual induz a mesma classe de genes da SAR, produzindo o mesmo espectro de resistncia observado pela induo biolgica. O AS parece que tambm desempenha papel importante na morte celular programada provocada pela infeco causada por patgenos.

Os altos nveis de AS acumulados no tecido infectado podem ser suficientes para inibir uma catalase, levando ao aumento da concentrao de H2O2 nos locais da infeco. A morte celular no local infectado oferece vantagens para a planta, visto que a morte da clula hospedeira interrompe o fluxo de nutrientes para o patgeno invasor impedindo sua multiplicao para outras clulas. No caso do patgeno ser um vrus, este s sobrevive se hospedando em clulas vivas. No arroz (Oryza sativa), por exemplo, o cido saliclico biossintetizado a partir do cido cinmico. Outra substncia de estrutura qumica muito simples e importante no sistema de defesa de plantas e que vem sendo alvo de estudos, por parte dos bioqumicos vegetais, o jasmonato de metila (32). Esta substncia indutora da produo de inibidores de enzimas que decompem protenas (proteinases), de protenas antifngicas e de enzimas envolvidas na biossntese de metablitos secundrios de defesa (Esquema 1). Desta forma, alm das funes j bem conhecidas no desenvolvimento e na regulao do crescimento vegetal, os jasmonatos tm papel importante como fitoormnios ou transdutores na sinalizao de defesa de plantas.

Esquema 1. Elicitao da produo e ao do cido jasmnico62

56

Pinto et al.

Quim. Nova

Pesquisas recentes mostram que determinadas plantas desenvolveram um sofisticado sistema de defesa para proteo contra herbvoros predadores. Um dos exemplos mais fascinantes a estratgia de defesa do milho, Zea mays, contra a lagarta Spodoptera exigua. O milho quando atacado por este predador emite uma mistura de substncias volteis constituda de indol, mono e sesquiterpenos, que atrai fmeas da vespa parasita Cotesia marginiventris, um predador natural da lagarta. Estas substncias so liberadas quando a secreo oral do herbvoro entra em contato com o tecido ferido da planta. Feridas mecnicas no provocam a emisso das substncias de defesa. Alm disso, a liberao desses volteis s ocorre no perodo do dia quando as vespas parasitas esto em busca de alimento do seu hospedeiro. A planta responde ao ataque do patgeno produzindo jasmonatos, que induziro genes a codificar enzimas que esto envolvidas na biossntese dos metablitos secundrios do sistema defensivo da planta (Esquema 2) 62. Outro exemplo que mostra a beleza do processo adaptativo planta-planta e de como os qumicos de Produtos Naturais com suas pesquisas podem trazer grandes benefcios para a humanidade relaciona-se com a erva daninha Striga asiatica, uma das mais devastadoras pragas das culturas cerealferas no mundo. Esta planta parasita diminui as reservas alimentares de quase meio milho de pessoas na sia e na frica. Striga asiatica possui um verdadeiro radar qumico e s germina, podendo permanecer latente no solo por muito tempo, quando a planta hospedeiro libera estrigol (33). No momento da liberao, a parasita agarra-se s razes do hospedeiro e dela se alimenta.

mearem os cereais lanam no solo estrigol ou seus derivados sintticos que induzem a germinao das sementes da erva parasita. O ciclo de crescimento de Striga asiatica de 4 dias, que morrer, aps germinar, sem nunca ter encontrado seu hospedeiro, deixando o solo livre para a plantao63. Programas atuais de bioprospeco nos pases industrializados Apesar da grande importncia da bioprospeco em pases em desenvolvimento e com grande potencial em termos de biodiversidade, as novas realidades legislativas e comerciais levaram a um novo enfoque na busca de produtos naturais bioativos por parte das grandes companhias farmacuticas. Este fato pode ser constatado pela desativao dos centros de bioprospeco como o da Abbott Pharmaceuthical e da Pfizer64. Atualmente, os grandes grupos multinacionais farmacuticos tm discutido a aplicao das tecnologias baseadas na genmica, onde o enfoque passa a ser macromolecular (peptdeos, protenas, etc) ao invs de micromolecular (substncias naturais ou sintticas) 65. O grande estmulo para esta mudana so os valores agregados a medicamentos ligados a doenas de origem gentica como Alzheimer, cncer, artrite entre outros. Por outro lado, doenas tropicais ou de fundo inflamatrio, entre outras, requerem ainda micromolculas. Contudo o alto custo das tecnologias de highthroughput screening (HTS) levou seleo de uma quantidade muito pequena de frmacos em relao s milhares de matrizes complexas (extratos vegetais ou de organismos marinhos) testadas, o que claramente no interessa s grandes multinacionais66. Quando nos deparamos com estas informaes somos levados a pensar, em um primeiro momento, que a indstria perdeu a credibilidade nos produtos de origem natural. Esta no uma informao correta. O momento atual para os grandes capitais a tentativa de estar na vanguarda tecnolgica, com isso obtendo novos mercados. Mas mesmo com o fluxo contrrio, ainda clara a possibilidade de descoberta de novos prottipos a partir de substncias naturais e para algumas empresas, maior que em qualquer processo sinttico. Por essas razes, atualmente os grandes grupos farmacuticos esto investindo na tecnologia de highthroughput screening de substncias puras, o que representa uma considervel economia. Em 1998, a Rhne-Poulenc Rhrer (hoje parte da Aventis) decidiu estrategicamente abandonar os ensaios com extratos brutos e iniciou os ensaios de substncias puras na busca de atividade biolgica. Esta

Graas s pesquisas dos qumicos de Produtos Naturais que desvendaram os mecanismos de interao parasita-hospedeiro e que determinaram as estruturas qumicas dos metablitos secundrios que esto envolvidos nessa interao, os agricultores antes de se-

Esquema 2. Sistema de defesa qumica do milho (Zea mays) sob ataque da lagarta Spodoptera exgua62

Vol. 25, Supl. 1

Produtos Naturais: Atualidade, Desafios e Perspectivas

57

deciso resultou em marcante reduo de custos e de tempo na obteno de um prottipo. Neste enfoque, a indstria necessitou de 18 meses para o isolamento de 4000 produtos naturais das mais diversas classes e fontes na faixa de 5 mg e com pureza em torno de 80%. Estas substncias so utilizadas para os testes de highthroughput screening. Outras empresas no s se preocupam com a criao de bibliotecas de substncias, como tambm criam bancos de dados para a comparao de matrizes por CLAE-EM, como o caso da AnalytiCom Discovery66. Considerando que no perodo de 1983 a 1994 foram aprovados 529 novos frmacos e dentre estes, 39% so produtos naturais ou derivados semi-sintticos, e a vasta biodiversidade brasileira, ainda pouqussima estudada, fica clara a necessidade de estudos de bioprospeco. Outro dado relevante a capacidade tecnolgica instalada no Brasil e o grande nmero de grupos especialistas na rea com competncia para que, num futuro prximo, possam criar uma grande biblioteca de substncias puras para ensaios de highthroughput screening (HTS)67 . Tcnicas hifenadas dentro do novo contexto das pesquisas com Produtos Naturais Atualmente, a possibilidade do emprego de tcnicas hifenadas ou tcnicas acopladas pode ajudar, em parte, os estudos em Produtos Naturais. Apesar de extratos vegetais serem misturas complexas de diferentes metablitos, a anlise de fraes volteis ou materiais apolares de superfcies foliares j , h muito tempo realizada, no sendo necessrio muitas vezes, nenhum fracionamento para a total caracterizao qumica do material em estudo. O grande avano na anlise destas misturas decorreu do desenvolvimento de aparelhos de cromatografia gasosa acoplada espectrometria de massas (CGEM), os quais so empregados rotineiramente, por exemplo, na indstria de essncias. Conforme citado acima, a grande limitao desta tcnica a possibilidade de analisarmos apenas substncias que podem ser volatilizadas e, em muitos casos, o emprego do impacto eletrnico na gerao dos ons limita tambm o uso para substncias instveis68. O emprego das primeiras tcnicas acopladas cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) abriu a possibilidade do uso de outros sistemas de deteco, como ultravioleta (UV), infravermelho (IV), eletroqumico e fluorescncia, entre outros. Nenhum destes sistemas novamente pode ser considerado universal, mas possibilita a anlise de matrizes no volteis e de alto peso molecular. Apesar da limitao da existncia de cromforos na molcula para o detector de UV, o desenvolvimento do arranjo de diodos (DAD diode array detector) estimulou o seu emprego em PN. Uma rpida consulta no Web of Science mostra como esta tcnica foi e tem sido muito empregada por exemplo no controle de qualidade de plantas medicinais, busca de metablitos ativos, em estudos de ecologia qumica e at estudos quimiossistemticos, como a anlise de tricomas glandulares. Alm da vantagem de obtermos o espectro de UV de cada substncia, o que fornece uma informao estrutural, o baixo preo do equipamento em relao a outras tcnicas foi a principal alavanca para seu sucesso. Contudo, a necessidade de uma maior informao estrutural de cada componente das matrizes analisadas levou ao desenvolvimento de tcnicas hifenadas mais modernas, como o acoplamento da CLAE com EM e com ressonncia magntica nuclear (RMN). O maior desenvolvimento e emprego das tcnicas de ionizao de MALDI (ionizao por dessoro a laser com auxlio de matriz) e ESI (ionizao por electrospray) no incio dos anos 90 possibilitou a anlise de molculas termolbeis, complexos organo-metlicos e molculas de elevada massa molecular incluindo polmeros e protenas69. Estes feitos ajudaram a popularizar a tcnica nas mais

diferentes reas das cincias biolgicas, desde a anlise de praguicidas no solo70 at a identificao e caracterizao de danos oxidativos ao DNA71 , passando pela Qumica de Produtos Naturais72. Quase a totalidade dos analisadores de massas requerem os ons na fase gasosa e Vestal73 mostra, em recente reviso, o grande nmero de equipamentos utilizando tcnicas diversas de gerao de ons existentes hoje no mercado. No Brasil, a maioria dos instrumentos de CLAE-EM possui o ESI como fonte geradora de ons. Por se tratar de ionizao branda (assim como outras tcnicas correlatas), no espectro de EM so observados apenas os ons quasi moleculares [M+H]+ e [M+Na]+. Este fato extremamente importante para a determinao da massa molecular de um analito e facilita os estudos quantitativos em CLAEEM. Para obtermos a fragmentao deste composto necessrio o acoplamento de dois analisadores de massas com uma clula de coliso entre eles (EM/EM). No primeiro analisador ocorre a seleo do on de interesse. Este on ento introduzido na clula de coliso onde colide com um gs inerte (argnio, nitrognio, etc) levando sua fragmentao. Finalmente, os fragmentos obtidos so analisados no segundo instrumento acoplado68. O nmero de diferentes analisadores de massas disponveis no mercado tambm aumenta, contudo, as pesquisas envolvem principalmente o acoplamento entre eles (EM/EM). O quadrupolo-quadrupolo e suas variaes, o quadrupolo/tempo de vo (Q-ToF) e o quadrupolo-ressonncia ciclotrnica de ons com transformada de Fourier (FT-ICR) so alguns exemplos de analisadores acoplados empregados no estudo de Produtos Naturais. A definio da biossntese do antibitico tetronasina e seus derivados um exemplo de aplicao recente da tcnica de ESI-EM/EM74,75. A anlise da eritromicina A por ESI-FTICR possibilitou a definio dos passos de fragmentao do anel76 e, posteriormente anlise de seus anlogos, foi possvel localizar a posio onde ocorre a primeira perda de gua, utilizando molculas marcadas com 18O77. O antibitico monensina A e seu derivado tambm tiveram suas vias de fragmentao elucidadas devido alta resoluo apresentada nas anlises de FT-ICR. Apesar dos espectros de EM/EM dos ons [M+H]+ e [M+Na]+ apresentarem fragmentos com a mesma massa em baixa resoluo, foi demonstrado em estudos de alta resoluo tratar-se de estruturas completamente diferentes78. A CLAE-EM atualmente o mtodo mais sensvel de anlise e o melhor para o emprego em quantificao79. Com as informaes anteriores torna-se evidente a possibilidade da determinao de novos derivados naturais em CLAE-EM/EM. Contudo, a tcnica mais poderosa para determinao estrutural de substncias inditas com novos esqueletos e, principalmente, em misturas biologicamente ativas a CLAE-RMN. Recentes progressos em gradientes de pulso de campo, supresso de solventes, a possibilidade de altos campos magnticos (400-800 MHz), entre outros, tm re-estimulado o uso desta tcnica que teve seu incio no final da dcada de 70, mas que, sem as atuais vantagens no alcanou grandes avanos. A maior limitao do uso do equipamento a baixa concentrao do analito e o alto custo dos solventes. Normalmente utilizamos misturas de solventes para separao em CLAE, e com exceo do xido de deutrio (D2O), todos os outros solventes deuterados so muito caros. Atualmente as novas tcnicas de supresso tm possibilitado o uso de solventes no deuterados (metanol e acetonitrila), mas tambm podem comprometer a anlise de determinadas regies do espectro. Aparelhos de 750 a 800 MHZ aliados a novas tcnicas de aquisio de dados tm solucionado os problemas de sensibilidade, contudo os problemas com os dados de 13C ainda no foram totalmente superados. Dependendo da concentrao do analito e da sua estrutura, a aquisio de dados pode ser em fluxo contnuo ou com interrupo do fluxo. Esta segunda possibilidade tem auxiliado na obteno de espectros de boa

58

Pinto et al.

Quim. Nova

qualidade. Em sua recente reviso sobre o assunto, Wolfender79 relata o emprego da tcnica com bons resultados para um grande nmero de classes de metablitos secundrios aromticos, para lactonas sesquiterpnicas, esterides, saponinas e iridides de vrias espcies com atividade biolgica. Apesar da clara utilidade da CLAE-RMN, at o presente momento, desconhecemos a existncia deste equipamento em qualquer grupo de pesquisa em Produtos Naturais no Brasil. A maior limitao o seu altssimo preo alm do alto custo da manuteno. Por outro lado, o grande nmero de tcnicas de ionizao introduzidas em CLAE-EM/EM, o aumento da resoluo dos analisadores e a comparao dos custos com CLAE-RMN mostram um futuro muito promissor para o emprego desta tcnica nos prximos anos pela comunidade de PN. Perspectiva da Qumica de Produtos Naturais dentro da era genmica O homem sempre procurou entender a natureza da vida e as chances de alcan-la e, pelo menos em nvel molecular, nunca esteve to prximo. Novas informaes sobre genes e suas funes, em parte, so responsveis por uma revoluo tecnolgica dirigida para as cincias da vida. Cabe neste momento ao qumico brasileiro, parar e refletir sobre o que ns realmente precisamos saber para passarmos da compilao de dados para o entendimento destes. Neste texto, vamos comentar e mostrar que o momento propcio para se iniciar a modelagem do perfil metablico de plantas da nossa biota, principalmente daquelas de interesse econmico como frmacos e/ ou agroqumicos. Este novo evento vai emergir da necessidade de se colocar a qumica de Produtos Naturais realizada no Brasil dentro dos novos paradigmas da pesquisa internacional, cujo enfoque nesta e nas prximas dcadas, estar centrado na genmica funcional de plantas. frente na cincia brasileira, a Biologia Molecular j inclui entre suas grandes realizaes o seqenciamento gentico de microorganismos patgenos como Xylella fastidiosa responsvel pela CVC (Clorose Variegada de Citrus) e o genoma da cana de acar, que deve levar a variedades mais produtivas e resistentes. Essas conquistas representam um marco na cincia brasileira, possvel graas ao coordenada de pesquisadores em torno de um objetivo comum e o financiamento expressivo da FAPESP80. O modelo clssico da gentica foi uma ferramenta valiosa para a biologia e os avanos da era ps-genmica. Ela revelou dados valiosos sobre a essncia molecular em diversos processos, como a diviso celular, morte programada da clula e desenvolvimento embrionrio. Estes eventos, hoje bem documentados, foram conseqncia dos estudos com Saccharomyces cerevisiae, Caenorhabditis elegans e Drosophila melanogaster81,82. Foram muitos anos de pesquisa para se chegar ao estgio da compreenso genmica. As prximas etapas vo tratar das reaes do panorama metabolmico. Genmica, termo que nos ltimos dois anos ocupou todos os meios de comunicao, a atividade de seqenciar genomas e derivar informaes tericas a partir da anlise do conjunto da expresso gentica de um indivduo, utilizando ferramentas computacionais, enquanto genmica funcional define o status do transcriptoma e do proteoma de uma clula, tecido ou organismo sob condies definidas; em outras palavras, determina a funo dos genes num organismo. O objetivo final da pesquisa protemica vai alm da simples catalogao de protenas que uma clula expressa em seu estado normal ou doente. O objetivo maior a elucidao da rede regulatria e sinalizadora da organizao e da dinmica metablica pelo qual a vida de uma clula processada. Alm disso, a protemica busca o entendimento de como estas redes (malha metablica) tornam-se disfuncionais nas clulas anor-

mais (doentes). Assim, ao se dominar as funes celulares, pode-se manipul-las para gerao de clulas sadias ou ainda produo de frmacos planejados de acordo com cada evento gentico disfuncional. Esta a meta mais ambiciosa e nobre da pesquisa em biologia molecular, em especial da fase protemica atual, e requer tecnologia de alta sensibilidade e conceitos novos, alm daqueles j dominados nas reas gentica e qumica. O conhecimento metablico e de diagnose da clula j esto muito avanados com relao a microrganismos83. Na fase atual, a pesquisa est voltada para o mapa celular ou proteoma estrutural84,85, cujo objetivo imediato identificar a estrutura das protenas e, em particular, identificar quais interagem com as formas complexas de outras protenas no evento metablico celular. Para este fim as ferramentas tecnolgicas disponveis, altamente sofisticadas tm sido 2DE (eletroforese bidimensional) e EM e o avano neste campo no tem precedentes, pois hoje se trabalha com a 2DE/EM hifenados, como 2DEPAGE e MALDI-ToF/EM86. A genmica de plantas ainda no atingiu o status das genmicas de microrganismos e animais, entretanto, com o seqenciamento do genoma de Arabidopsis thaliana, primeira espcie vegetal a ter seu cdigo gentico completamente decifrado, tem incio uma nova fase na pesquisa sobre biologia molecular de plantas e principalmente sobre o conhecimento de genes de regulao metablica87. A possibilidade de se utilizar genes regulatrios e suas associaes com compartimentalizao (de extrema importncia na regulao das vias metablicas secundrias) foi demonstrada pela ativao e produo de antocianinas em clulas de Arabidopsis e de milho, que se processam por ativao dos transcriptomas R e C188,89. Recentemente, trabalho sobre a biossntese de alcalides indlicos em Catharanthus roseus resultou no isolamento de genes regulatrios90. Mesmo com essas evidncias, at o presente, a maior parte das vias metablicas de plantas continua sem qualquer conhecimento sobre a funo dos genes regulatrios. Outro dado relevante para a compreenso da relao gene/metabolismo secundrio est na variao da concentrao e diversificao desses metablitos, que possivelmente esto relacionados com uma determinada funo enzimtica. Isto sugere que a funo do gene pode ser decifrada comparando-se os perfis da variao da concentrao dos metablitos. A. thaliana teve seu genoma completamente decifrado87. A questo que se abre no momento o que se fazer com a quantidade de informao armazenada; o ceticismo de que todo o conhecimento gentico produzido sobre esta erva poder ser benfico para a agricultura. Artigo recente sobre esta polmica mostrou engenhosamente que A. thaliana pode ser uma planta modelo para desenvolvimento agrcola, e quem sabe, no futuro ser uma planta comestvel. Numa dada espcie vegetal, a soma total dos efeitos de todos os genes representa o fentipo desta planta e a nica maneira de definir o fentipo em um momento qualquer da vida desta planta (organismo) defini-la no nvel de molculas. Se por um lado as macromolculas representam a estrutura do organismo, as micromolculas so mais especializadas e esto envolvidas nos processos metablicos das clulas. So elas que participam da interao das clulas e do organismo com o meio ambiente, ou seja, so substncias sinalizadoras, envolvidas na defesa contra pragas e doenas e na atrao e polinizao, eventos cruciais para a manuteno de determinada espcie sobre a terra. A anlise qualitativa e quantitativa dos eventos moleculares primrios e secundrios a etapa final da genmica funcional e a este conjunto completo de informaes de uma determinada clula chamamos de metaboloma. No estgio atual, quase toda ateno est centrada no proteoma, muito embora ainda no seja possvel analisar-se todas as protenas. Ainda, estudos recentes revelam que no h muita lgica na interao entre protena e metablito secundrio,

Vol. 25, Supl. 1

Produtos Naturais: Atualidade, Desafios e Perspectivas

59

como h entre os genes e as protenas90. A nica relao entre macro e micromolculas que pode ser diagnosticada com o conhecimento atual, que antes do metablito ser formado, os genes envolvidos na sua produo precisam ser transcritos e traduzidos por uma protena codificada. Em alguns casos, esta relao pode ser estabelecida sem o conhecimento prvio do proteoma. Em outras palavras, a combinao de metaboloma com transcriptoma pode, em muitos casos, ser suficiente para estabelecer a gentica das vias metablicas. importante salientar tambm que, para plantas, alm da caracterizao das micromolculas e das protenas, existem outras macromolculas tipo celulose e lignina, que deveriam ser analisadas dentro do enfoque genmico. O perfil metablico (metaboloma) no apenas de interesse para a genmica funcional, mas tambm para vrias outras situaes importantes, sendo uma delas, a aplicao desse conhecimento na produo de transgnicos seguros sade humana. Somente o mapeamento e a comparao de todas as substncias produzidas por uma determinada espcie selvagem e seu organismo transgnico podero apontar os riscos ou no das plantas obtidas por engenharia molecular. Outro interesse para a aplicao dos avanos da biologia molecular para os agricultores, devido possibilidade de se determinar as propriedades ou caractersticas de cada parte especfica da planta (resistncia contra pragas e doenas, sabor, cor etc) Finalmente, o conhecimento do perfil metablico ser fundamental tambm para o controle de qualidade de fitofrmacos. Somente a identificao de produtos bioativos de interesse em matrizes complexas de plantas, atravs de screenings rpidos, permitir a descoberta de novos frmacos em tempo recorde. Resumindo, o arsenal qumico micromolecular tem mostrado uma importncia econmica indiscutvel, principalmente pela vinculao qumica fina, para produo de fragrncias, tintas, alimentos, frmacos, inseticidas, corantes, antioxidantes, cosmticos, etc. A possibilidade de modificao gentica das plantas que produzem tais produtos abre uma excitante perspectiva de pesquisa sobre a biossntese desses metablitos e sobre o mecanismo de formao dessas vias metablicas em nvel celular. A qumica de Produtos Naturais na era ps-genmica continua sendo uma ferramenta fundamental para o entendimento dos mecanismos metablicos de cada parte da clula e das funes desses metablitos em determinada unidade celular90, mesmo sabendo-se que nenhuma dessas substncias est envolvida nos processos metablicos bsicos da clula, mas que respondem pela sinalizao, adaptao, polinizao e defesa. O mais complexo e fascinante no estudo prospectivo de plantas que cada txon possui um sistema prprio, caracterizado por metablitos especficos: alcalides, terpenides, fenlicos, etc. Dentro dessa premissa, cerca de 100.000 substncias de plantas so conhecidas e estima-se que cerca de 4.000 novas so descritas a cada ano91. A natureza vegetal ser sempre uma fonte inesgotvel de substncias teis, como os metablitos secundrios, mas quase sempre produzidos em quantidades insuficientes para qualquer utilidade econmica. Diante deste fato, os mecanismos celulares de regulao e produo destas substncias podero ser modificados para que sejam produzidas in natura, por interferncia nos genes responsveis pela regulao metablica de uma espcie de interesse, ou serem produzidas por cultura celular programada. CONCLUSES E PERSPECTIVAS A espcie humana se aproveita de uma frao muito pequena das plantas com as quais sempre conviveu e que a antecedem no planeta Terra. O reino vegetal ainda permanece como uma grande incgnita cujos mistrios comeam a serem desvendados. A humanidade, ao longo do tempo selecionou apenas cerca de

300 plantas para a alimentao e, de um pouco mais de uma centena, obteve princpios ativos puros para o tratamento de doenas. Estes nmeros so bem modestos quando se est diante de um universo de aproximadamente 250.000 espcies de plantas superiores. Segundo estimativas recentes feitas por dois pesquisadores americanos, as florestas tropicais midas guardam apenas 328 drogas teis medicina. Se esta previso for levada em considerao pela indstria farmacutica, pode-se supor que as gigantes desse mercado no investiro na bioprospeco das florestas, porque o retorno financeiro muito reduzido diante do volume de recursos necessrios que devem ser investidos para um empreendimento dessa magnitude. A literatura cientfica est repleta de previses como esta, cujo interesse maior parece ser definir valores econmicos para hectares de florestas de importncia vital para a sobrevivncia e bem estar das populaes das naes desenvolvidas. Se for necessria a internacionalizao de certas reas de floresta, o preo da terra j foi calculado em bases cientficas. Previses parte, uma verdade sobressai. No pode existir vida na terra sem a presena das plantas e, estud-las, sob qualquer que seja a tica cientfica, parte do domnio da qumica de Produtos Naturais. Em futuro prximo, a humanidade ter ao seu dispor as biofbricas vegetais, onde cultivares de mamo ou bananas geneticamente modificadas, por exemplo, substituiro as fbricas de vacinas, no que ser conhecido como setor agrocutico. Arroz e soja transgnicos, alm de resistentes a pragas, sero vitaminados. Os primeiros passos nessa direo foram dados com a decifrao do cdigo do mapa gentico do arroz, a base da dieta de mais da metade da populao mundial. Pode-se antecipar que solos contaminados com metais pesados e com material radioativo, hoje impossveis de serem ocupados, sero descontaminados com plantas, no que j chamado de fitoremediao, e que plantas substituiro os combustveis fsseis como fontes renovveis de energia limpa. Os qumicos de PN sero atores importantes no palco do futuro. O domnio das plantas vai ser possvel quando o mundo mgico das enzimas for melhor compreendido e as vias metablicas totalmente conhecidas. Expressar ou silenciar genes ser atividade rotineira na biologia molecular, quando bilogos e qumicos, em pareceria, perscrutarem o fundo das clulas vegetais vivas, seus ncleos, cromossomos e genes92. J se comeou a caminhada nessa direo e a participao dos qumicos de Produtos Naturais ser cada vez mais importante para que esse caminho seja percorrido mais depressa. O domnio das tcnicas analticas e preparativas de separao, tanto de metablitos secundrios como de macromolculas de plantas, como das tcnicas de identificao dessas mesmas molculas, parte da rotina da qumica de Produtos Naturais nos pases industrializados. Isso no significa que a comunidade brasileira de qumica de Produtos Naturais abandone seus projetos de bioprospeco de frmacos novos para se engajar nos mega-projetos de decifrao de cdigos genticos ou deixe de procurar nas plantas a razo de sua resistncia a pragas. Mas, tambm imperativo que os grupos novos de fitoqumicos no se limitem a continuar fazendo o que aprenderam com seus mestres para deixarem de ser clones cientficos. A histria da QPN brasileira dos prximos 25 anos certamente ter outros narradores, que num exerccio de futurologia traaro outros cenrios. At l pode-se esperar que a cincia retome seu caminho natural para melhor compreenso dos sistemas vivos e deixe de ser o grande balco de negcios no qual vem se transformando, fator de hegemonia cada vez maior das naes ricas. Seja qual for o cenrio futuro necessria a preservao das florestas e os qumicos de Produtos Naturais tm obrigao de defend-las para as prximas geraes, nem que seja para perpetuar a cultura de presentear o prximo com uma bela orqudea.

60

Pinto et al.

Quim. Nova

AGRADECIMENTOS Os autores agradecem gentilmente ao Dr. I. Castro-Gamboa, bolsista de ps-doutorado FAPESP, IQ-UNESP, Araraquara, pela valiosa colaborao na preparao desse manuscrito e ao Professor R. Verpoorte, Leiden University, Holanda, pelo envio de separatas sobre biologia molecular e discusso valiosa sobre genmica de plantas. REFERNCIAS
1. Veiga Jr., V. F.; Pinto, A. C.; Quim. Nova, 2002 , 25, 273. 2. Pinto, A. C.; Quim. Nova, 1995 , 18, 608. 3. Carneiro, E.; A Conquista da Amaznia, Coleo Mau, Ministrio da Viao e Obras Pblicas, Servio de Documentao: Rio de Janeiro, 1956. 4. Freedberg, D.; Cincia, Comrcio e Arte em o Brasil dos Holandeses 16301654, Herkenhoff, P., org.; GMT Editores Ltda.: Rio de Janeiro, 1999. 5. Costa, A. M. M.; Bol. Soc. Port. Quim. 1986, 23, 37. 6. dos Santos, N. P.; Pinto, A. C.; de Alencastro, R. B.; Quim. Nova 1998, 21, 666. 7. Halpen, O.; Schmid, H.; Helv. Chim. Acta, 1958, 41, 123. 8. Carrara Jr., E.; Meirelles, H.; A Indstria Qumica e o Desenvolvimento do Brasil - 1560-1889, Metalivros: So Paulo, 1996. 9. Mors, W. B.; Cincia e Cultura 1997, 49, 310. 10. Motidome, M.; Lecking, M. E.; Gottlieb, O. R.; An. Acad. Bras. Ci. 1970, 42 (Supl), 375. 11. Valle, J. R.; A Farmacologia no Brasil, Antecedentes e Perspectivas, Academia de Cincias do Estado de So Paulo: So Paulo, 1978. 12. Siqueira, M. D.; Curso de Qumica: 60 Anos de Histria, Curitiba: Universidade Federal do Paran, 1999. 13. Rheinboldt, H. Em As Cincias no Brasil; Azevedo, F. de, ed.; Melhoramentos: So Paulo, 1955, vol. 2, cap. VIII. 14. de Faria, L. R.; Histria, Cincia, Sade- Manguinhos 1997, 4, 51. 15. Mathias, S.; Cem Anos de Qumica no Brasil, Coleo da Revista de Histria, So Paulo,1975, LXIII. 16. http://www.sbq.org.br/PN-NET/ e http://www.cnpq.gov.br, acessada em Maro 2002. 17. http://www.biota.org.br, acessada em Maro 2002. 18. Myers, N.; Mittermeier, R. A.; Mittermeier, C. G.; Da Fonseca, G. A. B.; Kent, J.; Nature 2000, 403, 853. 19. Vilela, J. D.; Rev. Paul. Med. 1977, 89, 115. 20. Mahran, G.; Medicina Tradicional 1977, 1, 23. 21. Anderson, R. G. W.; Chem. Br. 1983, 19, 822. 22. Mors, W. B.; Cincia Hoje 1982, 1, 14. 23. Marini-Bettlo, G. B.; Cincia e. Cultura 1974, 26, 751. 24. Woodward, R. B.; Sondheimer, F.; Taub, D.; Heusler, K.; McLamore, W. M.; J. Am. Chem. Soc. 1951, 73, 2403; ibid 3547; ibid 1952, 74, 4223; Cardwell, N. M. E.; Cornforth, J. W.; Duff, S. R.; Holtermann, H.; Robinson, R.; Chem. Ind. 1951, 389; J. Chem. Soc. 1953, 361. 25. Robinson, R.; The Structural Relations of Natural Products, Clarendon Press: Oxford, 1975. 26. Nowacki, E.; Byerrum, R. U.; Life Sci. 1962, 5, 157. 27. Hughes, C. A.; Letcher, R.; Warren, F. L.; J. Chem. Soc. 1974, 4979. 28. Brito, A R.; Brito, A. A .S.; J. Ethnopharmacol. 1993, 39, 53. 29. Ferreira, S. H.; Barata, L. E. S.; Salles, S. L. M.; Queirz, S. R. R.; Heluy Neto, N. E.; An. Acad. Bras. Ci. 1998, 12, 33. 30. Fernandes, L. R.; Antunes, A. S.; Informaes Estratgicas sobre Plantas Medicinais Obtidas a partir de Bases de Dados em Linha Mimeo, Escola de Qumica, Universidade Federal do Rio de Janeiro: Rio de Janeiro, 2000. 31. Siani, A. C., Gilbert, B.; Riopharma 2000, 18. 32. Phillipson, G. W.; Anderson, A. C.; J. Ethnopharmacol. 1998, 25, 61. 33. Kinghorn, D.; ONeil, M. O.; ACS Symp. Ser. 1996, 179, 647. 34. Rouhi, A. M.; Chem. Eng. News 1997, 7, 214 35. Cordell, G. W; ACS Symp. Ser. 1995, 588, 8. 36. Kelecom, A.; Cincia e Cultura 1997, 49, 321. 37. Weinheimer, A. J.; Spraggins, R. L.; Tetrahedron Lett. 1969, 59, 5185; Valmsen, K.; Jrving, I.; Boeglin, W. E.; Varvas, K.; Koljak; R.; Pehk, T.; Brash, A. R.; Samel, N.; P. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2001, 98, 7700; Schneider, C.; Boeglin, W. E.; Prusakiewicz, J. J.; Rowlinson, S. W.; Marnett, L. J.; Samel, N.; Brash, A. R.; J. Biol. Chem. 2002, 277, 478. 38. Hay, M. E.; Fenical, W.; Oceanography 1997, 9, 10. 39. Paul, V. J., ed.; Em Ecological Role of Marine Natural Products; Publishing Associates: Comstock, 1992; Pawlik, J. R.; Chem. Rev. 1993, 93, 1911; Hay, M. E.; J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 1996, 200, 103; Millar, J. G.; Haynes, K. F., eds.; Em Methods in Chemical Ecology: Biological Method; Kluwer Academic Publishers: London, 1998.

40. McClintock, J. B.; Baker, B. J., eds.; Em Marine Chemical Ecology; CRC Press: New York, 2001. 41. Maia, L. F.; Epifanio, R. de A.; Eve, T.; Fenical, W.; J. Nat. Prod. 1999, 62, 1322; Epifanio, R. de A.; Maia, L. F.; Fenical, W.; J. Braz. Chem. Soc. 2000, 11, 584; Epifanio, R. de A.; Martins, D. L.; Villaa, R.; Gabriel, R.; J. Chem. Ecol. 1999, 25, 2255; Epifanio, R. de A.; Gabriel, R.; Martins, D. L.; Muricy, G.; J. Chem. Ecol. 1999, 25, 2247; Teixeira, V. L.; Cavalcanti, D. N.; Pereira, R. C.; Biochem. System. Ecol. 2001, 29, 313; Pereira, R. C.; Cavalcanti, D. N.; Teixeira, V. L.; Mar. Ecol. Prog. Ser. 2000, 205, 95. 42. Hung, D. T.; Jamison, T. F.; Schrieber, S. L.; Chem. Biol. 1996, 3, 623. 43. Faulkner, D. J.; Nat. Prod. Rep. 2002, 19, 1. 44. Newman, D. J.; Cragg, G. M.; Snader, K. M.; Nat. Prod. Rep. 2000, 17, 215; Pettit, G. R.; Lippert, J. W.; Taylor, S. R.; Tan, R.; Willians, M. D.; J. Nat. Prod. 2001, 64, 883. 45. Wright, E. M. Em Biodiversity: New Leads for the Pharmaceutical and Agrochemical Industries; Wrigley, S. K.; Hayes, M. A.; Thomas, R.; Chrystal, E. J. T.; Nicholson, N., eds.; Royal Society of Chemistry: Cambridge, UK, 2000, p. 113-139. 46. Veervot, H.; Fenical, W.; Epifanio, R. de A.; J. Org. Chem. 2000, 65, 782; Berlinck, R. G. S.; Britton, R.; Piers, E.; Lim, L.; Roberge, M.; Rocha, R. M.; Andersen, R. J.; J. Org. Chem. 1998, 63, 9850; Roberge, M.; Berlinck, R. G. S.; Xu, L.; Anderson, H.; Lim, L. Y.; Curman, D.; Stringer, C. M.; Friend, S. H.; Davies, P., Vincent, I.; Haggarty, S. J.; Kelly, M. T.; Britton, R.; Piers, E.; Andersen, R. J.; Cancer Res. 1998, 58, 5701. 47. Look, A. S.; Fenical, W.; Jacobs, R. S.; Clardy, J.; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1986, 83, 6238; Roussis, V.; Wu, Z.; Fenical, W.; J. Org. Chem. 1990, 55, 4916. 48. http://www.ag.auburn.edu/biotech/seagrant.htm e http:// www.inflazyme.com/products_technology.shtml, acessadas em Fevereiro 2002. 49. Pavo, M. S.; An. Acad. Bras. Ci. 2002, 74, 105. 50. Haygood, M. G.; Davidson, S. K.; Appl. Env. Microbiol. 1997, 63, 4612; Davidson, S. K.; Allen, S. W.; Lim, G. E.; Anderson, C. M.; Haygood, M. G.; Appl. Env. Microbiol. 2001, 67, 4531. 51. Ainsworth, S.; J. Chem. Eng. News 1996, 74, 35. 52. Miller, J. D.; Trenholm, H. L., eds.; Em Mycotoxins in Grain: Compounds other than Aflatoxin; Eagan Press: Minnesota, 1994, p. 552. 53. Masurekar, P. S. Em Biotechnology of Filamentous Fungi: Technology and Products; Finkelstein, D. B.; Ball, C., eds.; Butterworth-Heinemann: Boston, 1992, p. 241. 54. Czarnik, A. W.; Acc. Chem. Res. 1996, 29, 112. 55. Caporale, L.H.; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1995, 92, 75. 56. Gardner, W. A.; McCoy, C. W.; ref. 53, p. 335. 57. Hawksworth, D. L.; Mycol. Res. 1991, 95, 641. 58. Balandrin, M. F.; Kinghorn, A. D.; Farnsworth, N. R. Em Human Medicinal Agents from Plants; Balandrin, M. F.; Kinghorn, A. D., eds.; American Chemical Society: Washington D.C. 1993, p. 2. 59. Dreyfus, M. M.; Chapela, I. H. Em The Discovery of Natural Products with Therapeutic Potential; Gullo, V. P., ed.; Butterworth-Heinemann: Boston, 1994, p. 49. 60. Powell, K. A. Em Exploitation of Microorganisms; Jones, D. G., ed.; Chapman and Hall: London, 1993, p. 441. 61. Shearer, C. A.; Zare-Maivan, H.; Mycologia 1988, 80, 31. 62. Schrder, F.; Angew. Chem., Int. Ed. 1998, 37, 1213. 63. Chang, M.; Netzly, D. H.; Butler, L. G.; Lyan, D. G.; J. Am. Chem. Soc. 1986, 108, 7858. 64. Khosla, A.; Chemtracts. Org. Chem. 1998, 11, 1. 65. Bindseil, K.; Jakupovic, J.; Wolf, D.; Drug Discovery Technol. 2001, 6, 16. 66. Houghton, P. J.; Phytother. Res. 2001, 14, 419. 67. Kato, M. J.; Phytochemistry 2001, 57, 621. 68. Crews, P.; Rodrgues, J.; Jaspar, M.; Organic Structure Analysis, Oxford University Press: New York, 1998, p. 552. 69. Smith, R. D.; Loo, J. A.; Loo, R. O.; Busman, M.; Udseth, H. R.; Mass Spectrom. Rev. 1991, 10, 359. 70. Baglio, D.; Kotizias, D.; Larsen, B. R.; J. Chromatogr., A 1999, 854, 207. 71. Liao, P. C.; Li, C. M.; Hung, C. W.; Chen, S. H.; J. Mass Spectrom. 2001, 36, 336. 72. Wolfender, J.-L.; Rodrgues, S.; Hostettmann, K.; J. Chromatogr. 1998, 794, 299. 73. Vestal, M. L.; Chem. Rev. 2001, 101, 361. 74. Less, S. L.; Handa, S.; Leadlay, P. F.; Dutton, C. J.; Staunton, J.; Tetrahedron Lett. 1996, 37, 3511. 75. ibid ref. 74, 3515. 76. Gates, P. J.; Kearney, G. C.; Jones, R.; Leadlay, P. F.; Staunton, J.; Rapid Commun. Mass Spectrom. 1999, 13, 242.

Vol. 25, Supl. 1

Produtos Naturais: Atualidade, Desafios e Perspectivas

61

77. ibid ref. 76, 1650. 78. Lopes, N. P.; Stark, C. B. W.; Hong, H.; Gates, P. J; Stauton, J.; Rapid Commun. Mass Spectrom. 2002, 16, 414. 79. Wolfender, J.-L.; Rodrgues, S.; Hostettmann, K.; J. Chromatogr. 1998, 794, 299. 80. Simpson, A. J. G.; Reinach, F. C.; Arruda, P.; et al.; Nature 2000, 406, 151. 81. Hartwell, L. H.; Genetics 1991, 4, 975. 82. Nusselein-Volhard, C.; Wieschaus, E.; Nature 1980, 287, 795. 83. Van Bogelen, R. A.; Schiller, E. E.; Thomas, Z. D.; Weidhardt, F. C.; Electrophoresis 1999, 20, 2149. 84. Blackstock, W. P.; Weir, M. P.; Trends Biotechnol. 1999, 17, 121. 85. Anderson, M. L.; Matheson, A. D.; Steiner, S.; Curr. Opin. Biotechnol. 2000, 11, 408.

86. Gygi, S. P.; Rist, B.; Aubersold, R.; Curr. Opin. Biotechnol. 2000, 11, 396. 87. Meincke, D. W.; Cherry, J. M.; Dean, C.; Rounsley, S. D.; Koornneef, M.; Science 1998, 282, 662. 88. Geotewold, E.; Chanberlin, M.; Snook, M.; Siame, B.; Butler, E.; Swenson, J.; Maddock.; Plant Cell. 1998, 10, 721. 89. Martin, C.; Curr. Biol. 1996, 7, 130. 90. Verpoorte, R.; van der Heijden, R.; ten Hoopen, H. J.G.; Memelink, J.; Biotechnol. Lett. 1999, 21, 467. 91. Jacobs, D. I.; van der Heijden, R.; Verpoorte, R.; Phytochem. Anal. 2000, 11, 277. 92. Enriquez, J.; Nature 1998, 281, 925.

APNDICE Nmero de filiados: 316 (atual) 2000-2002 DIRETOR: VICE-DIRETOR: TESOUREIRO: 1998-2000 DIRETOR: VICE-DIRETOR: TESOUREIRO: 1996-1998 DIRETOR: VICE-DIRETOR: TESOUREIRO: 1994-1996 DIRETOR: VICE-DIRETOR: TESOUREIRO: 1993-1994 DIRETOR: VICE-DIRETOR: TESOUREIRO:

Frederico Guar Cruz Massuo Jorge Kato Norberto Peporine Lopes

Vanderlan da Silva Bolzani Edilberto Rocha Silveira Norberto Peporine Lopes

Paulo Cezar Vieira Ndia Franca Roque Joo Batista Fernandes

Ndia Franca Roque Raimundo Braz Filho Paulo Cezar Vieira

Ndia F. Roque Juceni Pereira Chaves Paulo Roberto Ribeiro Costa