Contribuio ao estudo da constituio gentica da populao brasileira: Anlise de regies polimrficas do cromossomo Y em uma amostra populacional de Alagoas

Dalmo Almeida de Azevedo Orientador: Prof. Dr.Elizeu Fagundes de Carvalho

Introduo
Genoma Nuclear Humano
Sequncias nicas Sequncias Repetidas

Dispersas

Em Tandem

Ex.: Alu, genes de RNAs estruturais.

Ex.: Minissatlites, Microssatlites.

Dalmo A. de Azevedo

Introduo
Microssatlites ou STRs

Repeties com 2 a 6 pb

1 a cada 10.000 pb ( 3% do GH)

Autossomos e crom. sexuais

Frequncia de mutao 10-3

Dalmo A. de Azevedo

Introduo

Estrutura de um microssatlite com 11 repeties [tcta]. A sequncia acima corresponde ao alelo 11 (11 repeties).

Dalmo A. de Azevedo

Introduo
Aplicaes dos Microssatlites
Biologia molecular Gentica funcional e qualitativa

Gentica de populaes
Identificao Humana
Dalmo A. de Azevedo

Introduo
Marcadores Biallicos (UEPs)

SNPs

INDELs

Haplogrupos

Cromossomo Y e DNAmt
Dalmo A. de Azevedo

Introduo
SNPs Polimorfismos de nucleotdeo nico

Mutaes de ponto: frequncia 10-8

90% das variantes no DNA

> 4 milhes no GH
Dalmo A. de Azevedo

Introduo
INDELs (Mills et al., 2006)

415.436 INDELs nicas

Comprimento entre 1 e 9.989 pb

29,1% so SNPs
Dalmo A. de Azevedo

Introduo
Padres de herana

Autossomos
(passados em parte, por todos ancestrais)

Cromossomo Y
(passado completo, s para os filhos)

Mitocndria
(passada completa, s pelas filhas)

Dalmo A. de Azevedo

Introduo
X

Y
PAR1 NRY ou MSY PAR2

Regies do cromossomo Y: regies pseudo autossmicas (PAR1 e PAR2); regio no recombinante (NRY), ou especfica do sexo masculino (MSY) (Fonte: Butler, 2005).
Dalmo A. de Azevedo

Introduo
Polimorfismos do Y

DNA satlite alfide

MSY (minissatlite);

Microssatlites - hapltipos

Marcadores biallicos (INDELs, SNPs) - haplogrupos

Dalmo A. de Azevedo

Introduo
Cromossomo Y
1 Y: 3 X: 4 Autossomos Maior deriva gentica Antropologia

Genealogia
Filogenia

Forense
Dalmo A. de Azevedo

Introduo
YCC (2002): 243 marcadores 153 hgs. Karafet et al. (2008): 599 marcadores 311 hgs.

Dalmo A. de Azevedo

Introduo

Mapa das migraes humanas com as provveis rotas dos haplogrupos do Y. (Fonte: Family Tree DNA).
Dalmo A. de Azevedo

Introduo

Formao da populao brasileira

Dalmo A. de Azevedo

Introduo
Ancestrais em nmeros

Amerndios 2,4 milhes (1.500)

Europeus mais de 6 milhes (scs. XVI-XX) Africanos 4 milhes (scs. XVI-XIX)

Dalmo A. de Azevedo

Introduo
Estado de Alagoas

Segundo menor estado brasileiro (27.767,661 km2)

Populao: 3 milhes de hab. (IBGE, 2007)

Emancipao: 16 setembro 1817

Dalmo A. de Azevedo

Introduo
Colonizao de Alagoas 1534 Duarte Coelho Capitania de Pernambuco
Franceses

Engenhos e escravido

Holandeses (1630-1654)
Dalmo A. de Azevedo

Introduo
IBGE, 2000 Brancos 53,7% Pardos 38,4% Negros 6,2% Indgenas 0,4%
Dalmo A. de Azevedo

Introduo

AIMs (Parra et al., 1998): A relao entre caractersticas fsicas e ancestralidade gentica no bem definida.

Dalmo A. de Azevedo

Introduo

STRs do Y (Grattapaglia et al,. 2005; Ges et al., 2005; Schwengber et al., 2009): Populao miscigenada: Grande similaridade gentica com a populao portuguesa.

Dalmo A. de Azevedo

Introduo

STRs do Y (Domingues et al., 2007): Populao afro-descendente (autodeclarada): Maior proximidade gentica com a populao portuguesa do que com populaes africanas.

Dalmo A. de Azevedo

Introduo

Marcadores biallicos do Y (Carvalho-Silva et al., 2001; Abe-Sandes et al., 2004; Silva et al., 2006): Predomnio de haplogrupos de origem europia; Haplogrupos africanos pouco frequentes; Haplogrupos amerndios so raros.

Dalmo A. de Azevedo

Justificativa
Informaes adicionais sobre a histria da populao brasileira; Distribuio desigual de imigrantes europeus; Escassez de dados de populaes do nordeste brasileiro.

Dalmo A. de Azevedo

Objetivo Geral

Contribuir para o estudo da ancestralidade da populao brasileira por meio da anlise de uma amostra da populao de Alagoas e da comparao desta com outras amostras populacionais.

Dalmo A. de Azevedo

Objetivos Especficos
Caracterizar a populao de Alagoas quanto aos polimorfismos do cromossomo Y para microssatlites e SNPs localizados na NRY. Traar a origem geogrfica das patrilinhagens presentes na populao de Alagoas, bem como a proporo da cada grupo ancestral na populao atual.

Dalmo A. de Azevedo

Objetivos Especficos
Construir uma base de dados de frequncias dos polimorfismos dos marcadores analisados, com vista a eventual aplicao na rea de identificao humana;
Comparar os dados com outras populaes do Brasil.

Dalmo A. de Azevedo

Metodologia

F ig u ra 1 : M a p a d o E sta d o d e A la g o a s d e sta ca n d o o s m u n icp io s d e o rig e m 247 homens de 42 n a a m o stra a do estado de Alagoas. d o s in d ivd u o s in clu id o s municpios n a lisa d a .
Dalmo A. de Azevedo

Metodologia

Marcadores STR analisados: Hapltipo mnimo: DYS19, DYS385, DYS389I, DYS389II, DYS390, DYS391, DYS392 e DYS393; DYS447, DYS458 e DYS464

Dalmo A. de Azevedo

Metodologia
Amplificao em quatro reaes.

Dalmo A. de Azevedo

Metodologia

Eletroforese em gel de poliacrilamida a 6%;

Colorao com nitrato de prata; Identificao dos alelos: Escadas allicas

Dalmo A. de Azevedo

Metodologia
Calibrao: DNA controle 9948; Kit Powerplex Y Sequenciamento (DYS447 e DYS464)
Controle de qualidade: Exerccio de genotipagem (www.yhrd.org)

do

YHRD

Dalmo A. de Azevedo

Metodologia

Seleo de um conjunto de SNPs (24) que fosse adequado para a anlise de populaes brasileiras; Minissequenciamento com SNaPshot.

Dalmo A. de Azevedo

Metologia

Dalmo A. de Azevedo

Metodologia
SRY10831.1 M168 M96 M2 M35 M78 M81 M123 M34 M213 M201 M170 M26 M304 M172 M9 M22 M45 M3 M173 SRY10831.2 M17 P25 M269 M70

M-III

M-II

M-I

Dalmo A. de Azevedo

Metodologia
Arlequin Distncias genticas RST STRs FST SNPs
AMOVA

Diversidades Frequncias dos hapltipos (STRs).

Dalmo A. de Azevedo

Metodologia

SPSS Statistics v.17.0 MDS Network Redes filogenticas (median-joining)

Dalmo A. de Azevedo

Metodologia
Populaes brasileiras -STRs
Populao Rio de Janeiro (miscigenados) Rio de Janeiro (afro-descendentes) Brasil Santa Catarina Rio Grande do Sul Par Sigla RJm RJa BR SC RS PA Referncia Ges et al ., 2005 Domingues et al ., 2007 Grattapaglia et al ., 2005 Cain et al ., 2005 Schwengber et al ., 2009 Palha et al ., 2007

Dalmo A. de Azevedo

Metodologia
Populaes dos grupos geogrficos ancestrais STRs.
Populao Holanda Portugal Amerndios Terenas Moambique Guin Equatorial Angola Sigla HO PO Am Te MO GQ AO Referncia Roewer et al ., 2005 Beleza et al ., 2006 Tarazona-Santos et al ., 2001 Silva D.A., comun. Pessoal Alves et al ., 2003 Arroyo-Pardo et al ., 2005 Coelho et al ., 2009

Dalmo A. de Azevedo

Metodologia

Populaes comparadas - SNPs.

Populao Rio de Janeiro (miscigenados) Brasil Bahia Portugal Sigla RJm BR* BA PO Referncia Silva et al ., 2006 Carvalho-Silva et al. , 2001 Nascimento et al ., 2009 Beleza et al ., 2006

Dalmo A. de Azevedo

Resultados e discusso
Microssatlites 227 hapltipos 2 hapltipos 3 ocorrncias; 16 hapltipos 2 ocorrncias; 209 hapltipos 1 ocorrncia
Diversidade haplotpica: 0,99930,0005
Dalmo A. de Azevedo

Resultados e discusso
Resultados da AMOVA para as populaes AL, RJm, RJa, BR, SC, RS e PA.
Fonte de variao Entre populaes Graus de liberdade 6 Soma dos quadrados 28,998 Componentes da varincia 0,01713 Porcentagem da variao 0,96

Dentro das populaes Total

ndice de fixao

1.263

2237,188

1,77133

99,04

1269

2266,188

1,78846

FST=0,00958; P=0,000000,00000

Dalmo A. de Azevedo

Resultados e discusso
Resultados da AMOVA para as populaes AL, RJm, BR, SC e RS.
Fonte de variao Graus de liberdade 4 930 Soma dos quadrados 8,161 1608,975 Componentes da varincia 0,00170 1,73008 Porcentagem da variao 0,10 99,90

Entre populaes Dentro das populaes Total ndice de fixao

934

1617,136

1,73178

FST=0,00098 (P=0,191350,00295)

Dalmo A. de Azevedo

Resultados e discusso
Matriz das distncias genticas (RST) para hapltipos de microssatlites entre pares de populaes (a=0,00294).
AL AL RJm BR RS * -0,00029 0,00726 0,00330 RJm 0,43223 * 0,00232 -0,00285 BR 0,02703 0,23305 * 0,00887 RS 0,10702 0,74913 0,01416 * SC 0,87308 0,24522 0,03732 0,11029 PA 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 RJa 0,00000 0,00030 0,00000 0,00000

SC PA
RJa

-0,00415 0,03836
0,06838

0,00263 0,05233
0,04414

0,00935 0,04554
0,08090

0,00508 0,06420
0,04440

* 0,03679
0,06191

0,00010 *
0,13141

0,00000 0,00000
*

Dalmo A. de Azevedo

Resultados e discusso
Matriz das distncias genticas (RST) para hapltipos de microssatlites entre pares de populaes (a=0,00294).
AL
AL HO PO MO * 0,00808 0,00816 0,38103

HO
0,06524 * 0,02223 0,43038

PO
0,02485 0,00366 * 0,46060

MO
0,00000 0,00000 0,00000 *

GQ
0,00000 0,00000 0,00000 0,33611

AO
0,00000 0,00000 0,00000 0,00000

Te
0,00000 0,00000 0,00000 0,00000

Am
0,00000 0,00000 0,00000 0,00000

GQ
AO

0,38440
0,45109

0,43977
0,50610

0,46915
0,52449

0,00070
0,03472

*
0,05269

0,00000
*

0,00000
0,00000

0,00000
0,00000

Te
Am

0,36313
0,24436

0,50662
0,31757

0,44007
0,22921

0,40641
0,56604

0,43636
0,57810

0,43358
0,61353

*
0,33226

0,00000
*

Dalmo A. de Azevedo

Resultados e discusso

Grfico em duas dimenses do MDS das distncias genticas entre pares de populaes (RST) (valor de stress = 0,085).
Dalmo A. de Azevedo

Resultados e discusso

a) M-I (61% da amostra), b) M-II e c) M-III

Dalmo A. de Azevedo

Resultados e discusso

Diversidade = 0,6735

Dalmo A. de Azevedo

Resultados e discusso
K*(xL,P,T)-M9 R1a1*-M17 T*-M70 Q1a3a*-M3 E*(xE1b1a-b)-M96 E1b1a*-M2 E1b1b1*(xE1b1b1a-c)M35 E1b1b1a*-M78 E1b1b1b*-M81 E1b1b1c1*-M34 R1b1b2*-M269 G*-M201 I*(xI2a2)-M170 I2a2*-M26 J*(xJ2)-M304

J2*-M172

Distribuio dos haplogrupos na populao de Alagoas. Dalmo A. de Azevedo

Resultados e discusso
Propores Quanto Origem Geogrfica

frica 4,45% Europa 94,74% Amrica-nativo 0,81%

Propores quanto origem geogrfica.

Dalmo A. de Azevedo

Resultados e discusso

R1-M173

a) 14-24-11-13-13-25 (hapltipo modal do Atlntico b) 14-24-10-13-13-25

Dalmo A. de Azevedo

Freq.
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

BCD E*(xE1b1a-b)-M96 E1b1a*-M2 E1b1b1*(xE1b1b1a-c)-M35 E1b1b1a*-M78 E1b1b1b*-M81 E1b1b1c1*-M34 G*-M201 I*(xI2a2)-M170 I2a2*-M26 J*(xJ2)-M304 J2*-M172 R1b1b2*-M269 R1a1*-M17 K*(xL,P,T)-M9 L*-M22 T*-M70 Q1a3a*-M3
Haplogrupo

Resultados e discusso

FST=0,00058 (P=0,315510,0042)
AL RJm

Dalmo A. de Azevedo

Freq.
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

BDECF(xDE,J,O2b,P)SRY10831.1

E*(xE1b1a,E1b1b1c1)M96

E1b1a*-M2

E1b1b1c1*-M34

Resultados e discusso

Haplogrupo

FST=0,00161 (P=0,233440,0040)
J*-M304 P*(xQ1a3a,R1a,R1b1b 2d)-M45 Q1a3a*-M3 R1a*-SRY10831.2
AL BR*

Dalmo A. de Azevedo

Freq.
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7

E*(xE1b1a-b)-M96

E1b1a*-M2 E1b1b1*(xE1b1b1 a-c)-M35 E1b1b1a*-M78

E1b1b1b*-M81

E1b1b1c1*-M34

Resultados e discusso

Haplogrupo

G*-M201

FST=0,04494 (P=0,00000,0000)
I*(xI2a2)-M170 I2a2*-M26 J*(xJ2)-M304 J2*-M172 ABCDF(xG,I,J)
AL BA

Dalmo A. de Azevedo

Freq.
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7

E*-M96

E1b1b1a*-M78

E1b1b1b*-M81 E1b1b1c1*M34 F*-M213

G*-M201

I*-M170

Resultados e discusso

Haplogrupo

I2a2*-M26

FST=-0,00041 (P=0,467330,00473)
J*(xJ2)-M304 J2*-M172 L*-M22 R1a*SRY10831.2 R1b1b2*-M269 T*-M70
AL PO

Dalmo A. de Azevedo

Concluses
O conjunto de microssatlites utilizado apresentou diversidade elevada na populao; Marcadores com duplicaes (DYS385 e DYS464): Maior diversidade; No puderam ser utilizados em comparaes populacionais.

Dalmo A. de Azevedo

Concluses
Minissequenciamento com SNaPshot: Confiabilidade; Rapidez. Conjunto de SNPs utilizado: Identificao de 16 haplogrupos; Caracterizao de todos os indivduos da amostra.
Dalmo A. de Azevedo

Concluses
Comparaes populacionais STRs: Homogeneidade entre populaes brasileiras (em geral); Grande nmero de imigrantes portugueses nas diferentes regies; Migraes internas.

Dalmo A. de Azevedo

Concluses
Comparaes populacionais SNPs: Similaridade gentica entre AL, RJ e BR*; Diferenciao significativa entre AL e BA; Sugestiva da importncia da ampliao de estudos sobre populaes brasileira.

Dalmo A. de Azevedo

Concluses
Comparaes populacionais e critrios de amostragem: Brancos e miscigenados (autodeclarados): No h diferena gentica significativa. Miscigenados e Afro descendentes (autodeclarados): Diferenciao gentica significativa.

Dalmo A. de Azevedo

Concluses
Alagoas e grupos geogrficos ancestrais: Grande similaridade gentica entre AL e PO tanto para STRs como SNPs: Portugal foi a fonte majoritria das linhagens masculinas encontradas em Alagoas.

Dalmo A. de Azevedo

Concluses
Em Alagoas as propores de linhagens europias, africanas e amerndias, so semelhantes s observadas em estudos prvios.
Na formao da populao de Alagoas houve forte cruzamento direcional entre homens europeus e mulheres europias, africanas e amerndias.

Dalmo A. de Azevedo

Muito obrigado!

Dalmo A. de Azevedo