1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO Instituto de Cincias Exatas e Biolgicas Departamento de Biodiversidade, Evoluo e Meio Ambiente Disciplina Gentica

Professor: Armando Maia Wood 4-Experimentos Importantes da Gentica A pergunta fundamental aqui: Quais foram os experimentos que definiram para o homem, que o responsvel pela hereditariedade seria o DNA? Experimento Nmero 1 Frederick Griffith, Ingls, publicou seu trabalho em 1928 Trabalhou com a bactria, Gran+, Diploccocus pneumoniae, causadora de pneumonia em humanos. Griffith estava atrs de uma vacina contra os pneumococos, desde Edward Jenner 1749-1823 (ingls tambm) os homens j conheciam as vacinas, Jenner observou que as mulheres que tiravam leite, e que tinham contato com pequenas feridas da varola da vaca no contraam a varola de humanos, uma pequena ferida na mo da mulher e em contato com as pstulas da doena em vacas, fazia com que as mulheres ficassem imunizadas. Jenner coletou as casquinhas das feridas nos beres das vacas e usou este material para vacinar humanos, com grande sucesso. Os Diploccocus pneumoniae quando eram colocados para crescer em meio semi-slido, apresentavam colnias, que quando a luz batia sobre elas, davam a impresso de serem colnias com aspecto em sua superfcie de lisas (em ingls smooth), logo chamou estes Diploccocus de S. Observando ao microscpio ptico, detectou-se a presena de uma cpsula ao redor da clula deste Diploccocus. Estas placas com meio semi-slido e os Diploccocus crescendo em sua superfcie (crescem com o raio, para todos os lados), se forem deixadas ocupar a superfcie do Agar (substncia na forma de p, purificada de algas, que serve para fazer meios semislidos), em um certo momento, naturalmente pode acontecer uma mutao natural, e sua freqncia de uma clula mutante em um milho de clulas selvagens. Se o crescimento neste setor continuar, ser formado um setor diferenciado, forma diferente, na placa. Observando este setor, e retirando algumas clulas deste local e colocando para crescer em meio lquido separado e depois plaqueando novamente, observa-se o aparecimento de colnias que apresentam um aspecto, quando a luz incide sobre elas, de apresentar aspecto rugoso em sua superfcie (em ingls rough). Logo Griffith deu o nome a estas clulas de R. Posteriormente observando estes mutantes ao microscpio tico, observou que estas no possuam cpsulas. Os experimento foram feitos tendo como cobaias alguns camundongos, os Diploccocus eram inoculados sob a pele do animal, e o animal quando morria, deveria atravs da autpsia, ser detectado o organismo causador da doena e a doena deveria ser necessariamente a pneumonia. Os experimentos consistiram em quatro diferentes situaes: 1)- S + Camundongo morte, autpsia (S). 2)- R + Camundongo no morre.

2 Estes resultados nos leva a desconfiar da cpsula, pois esta a nica diferena entre as duas clulas de Diploccocus. Uma das tcnicas para se fazer vacinas tentar diminuir a virulncia do agente causador da doena. Griffith vai usar o calor para lisar as clulas de Diploccocus. Coloca-se o tubo de ensaio com o meio e as clulas, retira-se uma gota desta soluo e observa-se ao microscpio tico (MO), observa-se as clulas andando de um lado para outro normalmente, depois coloca-se sobre um bico de Bunsen, aquecendo por um minuto e retira-se mais uma gota e observase ao MO, vendo que algumas clulas foram lisadas, repete-se a operao com mais um minuto at que todas as clulas estejam lisadas, mas observe bem, as estruturas moleculares contidas no tubo no foram destrudas, pois no ficou cozinhando o extrato para quebrar todas as ligaes existentes, mas foram lisadas todas as clulas. Chamaremos este material de extrato da clula S morta pelo calor que representaremos como S (esse delta). 3)- S + Camundongo no morre. 4)- S + R + Camundongo morte, autpsia (S). Este quarto experimento intrigante, o qu aconteceu? Griffith props a presena de um princpio transformante, algo do extrato (S) morto pelo calor, foi capaz de adentrar a clula R e transform-la em S, novamente. Griffith no foi capaz de determinar especificamente, qual a substncia, responsvel pela transformao, por isto colocou um nome sutil para o fator (princpio transformante). O objetivo do experimento no foi alcanado, Griffith no conseguiu a vacina contra o Diploccocus, mas achou interessante o quarto experimento, sentindo algo importante neste resultado, publicou seu trabalho em 1928. Bibliografia: Griffith, F., 1928. The significance of pneumococcal types. Jour. Hygiene, 27,113159. Experimento nmero 2 Avery,O.T. e Goebels, 1941 Avery e Goebels, fizeram uma leitura do trabalho de Griffith, para descobrir qual era o fator transformante, mas se restringiram ao estudo da cpsula, que era o fator mais claro, seu envolvimento com o princpio. Depois de uma centrifugao diferencial, purificaram as cpsulas de Diploccocus pneumoniae e foram capazes de determinar a composio qumica da cpsula, como constituda de polissacardeos. Descobriram tambm que cepas diferentes da bactria s eram capazes de fabricar um tipo especficode polissacardeo, do tipo I, II, III, e IV. Tentaram colocar a cpsula pura junto com R e injetaram em um camundongo mas no transformava. E consequentemente os camundongos no morriam. Experimento nmero 3 Avery,O.T.,C.M.Mac Leod, and M.Mc Carty, 1944 Pergunta: Como Avery et al, vo desenvolver o trabalho definitivo, onde ser determinado que o responsvel pelo princpio transformante de Griffith o DNA? Neste momento os bioqumicos j tinham purificado h pouco tempo, as seguintes enzimas: DNase, Rnase e uma Protease (tripsina e a quimiotripsina, j

3 conhecidas h mais tempo). Este foi um trabalho longo, demorou dez anos para sua publicao. Neste ponto devemos colocar que se desconfiava do DNA, do RNA e das protenas, o que se conhecia na poca de complexo eram as protenas e um responsvel por transportar uma mensagem para algo complexo deveria ser complexo tambm. Ainda no se conhecia as estruturas do DNA nem do RNA. No extrato estava presente o DNA, o RNA e as protenas, pois as clulas foram lisadas e tudo que estava dentro das clulas foi para fora e estava presente no extrato. A lgica do experimento que os trs estavam presentes ao mesmo tempo no extrato, logo se fossem usadas enzimas duas a duas, destruiramos duas substncias e ficaramos com somente uma ntegra em cada tubo e seria testado cada um quanto ao seu poder de transformao. Experimento: 1- Extrato + Dnase + Rnase = (P) + R + camundongo no morre 2- Extrato + Dnase + Protease = (R) + R + camundongo no morre 3- Extrato + Rnase + Protease + (D) + R + camundongo morte, autpsia (S). Como podemos observar s quando o DNA fica ntegro no tubo, neste foi capaz de se observar clulas transformadas de clulas R em S e sendo capaz de matar o camundongo de pneumonia portanto. Com este experimento se determinou o agente transformante e consequentemente da hereditariedade em bactrias era o DNA. O princpio transformante de Griffith era o DNA. O primeiro experimento definitivo, demonstrando que o DNA era o responsvel pela hereditariedade de um ser vivo. Hoje sabemos que o DNA entra nesta clula, Gram positiva, permissiva, e adentrando o citoplasma, o DNA exgeno, pareia com o DNA residente e fazem uma espcie de crossing over no meitico, trocando o gene com erro pelo gene correto para sntese da cpsula e este material incorporado, ao DNA bacteriano, permite agora a bactria produzir a sntese do polissacardeo expresso na cpsula. A maioria das bactrias no permite esta invaso por DNAs exgenos (clulas Gram negativas no permitem). O resultado desta ao permite a bactria o poder da invasibilidade, podendo infectar o camundongo matando-o de peneumonia. Bibliografia: Avery,O.T.,C.M.Mac Leod, and M.Mc Carty, 1944. Studies on the Nature of the Substance Inducing Transformation of Pneumococcal Types. Jour. Exp. Med ., 79: 137-158. Reprinted in J.A. Peters, ed. 1959. Classic Papers in Genetics, Englewood Cliffs, N.J.,Prentice-Hall. Experimento nmero 4 Pergunta: Como ampliar a importncia do DNA. Hershey,A.D., M. Chase, 1952, trabalharam com o vrus T2, que tem como hospedeiro a Escherichia coli, (Gram negativa, enterobactria) sendo portanto um bacterifago (vrus cujo hospedeiro uma bactria). Logo podemos induzir que esta bactria possui em sua membrana, um tipo de receptor para este tipo de vrus.

4 Para entender este experimento, so necessrios quatro conhecimentos: o primeiro, o que um istopo? Este conceito surge quando por exemplo comparamos dois tomos e se eles tiverem o nmero atmico igual (Z=) e o nmero de massa diferentes (A ) e compreendemos que eles so diferentes por causa dos seus nmero de nutrons (N), se isto ocorre consideramos estes dois tomos como istopos. Os qumicos j determinaram a existncia de uma certa porcentagem de istopos entre os tomos de um elemento qumico na natureza observa-se que cada um dos elementos qumico tem uma certa porcentagem de cada um de seus istopos. A maioria dos elementos apresentam dois ou mais istopos, mas em alguns casos (berlio, flor, sdio, alumnio) apresentam s um istopo naturalmente, podendo ainda apresentar outros produzidos artificialmente e mas so mais instveis. O estanho o elemento que apresenta o maior nmero de istopos estveis (10). As propriedades qumicas de todos os istopos de um elemento so iguais, podendo formar os mesmos compostos qumicos, que o elemento qumico seja capaz de fazer. O prton apresenta uma massa de 1,0078 unidades de massa atmica, o nutron apresenta uma massa de 1,0090 unidades atmicas. O hidrognio, por exemplo, apresenta os seguintes istopos: hidrognio comum (H1), chamado de leve (1,0078 unidades de massa atmica), mas em cada 5.000 tomos de hidrognio encontraram um chamado de deutrio (2,0168 de massa atmica), mais pesado, estes dois so os istopos estveis do hidrognio, artificialmente pode-se ainda conseguir o trtio (H3)(3,0258 unidades de massa atmicas), este radioativo, podendo se decompor espontaneamente. O oxignio comum o O-16, e encontramos uma pequena porcentagem de O-17 e O-18. O segundo ponto que devemos saber que o vrus em sua composio constitudo de uma cpsula protica e do material gentico, neste caso do T2 o DNA. Observando a constituio qumica dos dois teremos: DNA = C,O,H, N, P Protena = C,O,H, N, S A questo , qual elemento que est em cima que no est em baixo e qual est em baixo e no est em cima, concluso o fsforo acima e o enxofre abaixo. Temos de lembrar que se forem usados os dois istopos P32 e o S35, devemos saber que o fsforo marcar todos os monmeros (desoxirribonucleotdios), mas o enxofre marcar somente os aminocidos que possurem enxofre (que no caso so cistena e metionina), na composio das protenas. Quase sempre as protenas tm todos os aminocidos em sua composio, mas existem protenas que no possuem certos aminocidos, tambm pode acontecer. O terceiro ponto consiste em entender a lgica da tcnica de separao, chamada centrifugao, que ser mais bem explicada em um experimento posterior. Aqui neste ponto importante saber a lgica. A fora da centrifugao serve para separar substncias, compostos e estruturas. Quando se centrifuga, a fora empurra a matria, que possui uma certa superfcie, para esta fora atuar, quanto mais superfcie, menor a fora para empurrar a matria para o fundo do tubo, formando um precipitado ou pellet, e o que no foi empurrado para o fundo fica no sobrenadante em soluo. Se uma matria muito pequena e no tem superfcie para a fora atuar, neste caso preciso uma fora enorme para empurrar esta matria para o pellet. Uma clula, como uma bactria, quando se

5 usa a centrifugao de baixa velocidade empurrada para o pellet e devemos posteriormente, com cuidado, despejar o sobrenadante em um outro tubo e ficar com o pellet" (constitudo portanto, pelas clulas da bactria separadas pelo processo da centrifugao, aglomeradas no fundo do tubo) O quarto ponto como marcar o DNA e as protenas do vrus. Aqui devemos saber que o hospedeiro o responsvel pela sntese dos desoxirribonucleotdios e dos aminocidos que sero utilizados na reproduo do vrus. A bactria capaz de sintetizar todos os desoxirribonucleotdios e todos os aminocidos necessrios para a reproduo viral. Portanto devemos servir as bactrias com um meio, que possua compostos qumicos, que entre eles os istopos (P32 e o S35) na forma de sais, que se deseja usar e ao hospedeiro caber fabricar os monmeros necessrios para a reproduo viral, fabricando os monmeros, a partir do que se oferece no meio e conseqentemente marcando as protenas e o DNA viral. Se deixarmos as bactrias com os vrus crescendo durante a noite o ver night podemos dizer que o DNA e as protenas ficaro marcadas adequadamente, podendo ser usados no experimento posterior, podemos detectar as molculas atravs dos marcadores isotpicos. Experimento: As bactrias E.coli, com os vrus T2, foram deixadas crescer em meio com os istopos P32 e S35, durante a noite, aps este tratamento, purificou-se atravs de centrifugao os vrus que sero usados no experimento. Os vrus estando marcados com os istopos (vrus estrela) foram colocados junto com novas E. coli, que pudessem ser infectadas, e aps a infeco, usou-se um aparelho chamado de mesclador ou homogenizador, que faz com que as cpsulas virais ligadas aos receptores nas membranas da clula se soltem e as cpsulas vazias ficariam no sobrenadante, aps uma centrifugao de baixa velocidade separou-se o pellet (onde estavam s clulas, infectadas pelo DNA do vrus e marcado com o fsforo), e o sobrenadante, onde estavam as cpsulas vazias e marcadas com o enxofre. Analisando este sobrenadante encontrou-se 70% do material marcado com o enxofre. As clulas infectadas (com o DNA) foram colocadas em um meio novo, foi analisado o meio e no se percebia a presena de vrus no meio e se encontrarmos depois da incubao uma nova prole de vrus este fato se deveria a presena do DNA dentro da clula de E. coli e ento as clulas foram incubadas, aps um tempo adequado, centrifugou-se o meio, separando as clulas, e encontrando no sobrenadante vrus maduros e nestes alguns estavam marcados com o P32, representando 30% do material marcado total. No sendo encontrado o S35. Logo se chegou a concluso de que, em vrus o responsvel pela hereditariedade era o DNA. Devemos lembrar que existem vrus, cujo material gentico no o DNA. O vrus da AIDS por exemplo um retrovrus. Bibliografia: Hershey,A.D., M. Chase, 1952. Independent fuctions of rival protein and nucleic acid in growth of bacteriophage. Jour.Gen. Physiol.,36, 39-56. Reimpreso en la coleccin de Stenty en la de Taylor;1965, Selected Papers on Molecular Genetics. Academic Press, New York. Experimento nmero 5

6 Beadle, G.W. and E.L.Tatum, 1941. Pergunta: como as mensagens nos genes esto escritasna macromolcula DNA? Trabalharam com um fungo chamado Neurospora crassa, estes possuem um nmero haplide de cromossomos, usando um agente mutagnico fsico, descoberto por Miller, que era o Raio X, que permitia criar mutantes artificialmente. Os mutantes foram separados dos selvagens atravs do uso de dois tipos de meios: meio mnimo e meio completo ou complexo. Temos de saber que os fungos selvagens (selvagem so aqueles fungos encontrados na natureza) so capazes de crescer em meios mnimo e no completo, j os mutantes s crescem no meio completo. Os fungos foram deixados crescer em meio lquido e depois em meio semisslido, onde cresceu em quase toda a superfcie do agar, neste momento foi colocado uma fita adesiva ao redor da placa de petri, criando no interior uma condio e anaerobiose, isto estressa o fungo que levado para sua forma de resistncia, no caso ele forma corpos frutferos, chamados de ascosporos, condios, nestes condios encontramos os esporos (sua forma de resistncia). Quando irradiamos na presena destes esporos o DNA encontra-se mais empacotado o que facilita a incidncia dos raios X e, portanto propiciando a criao de mutantes. Estes mutantes so chamados de auxotrficos. No crescem no meio mnimo e precisam de uma suplementao alimentar (meio completo). J colocamos como os mutantes foram separados, atravs do crescimento ou no crescimento nos meios mnimo e completo, os mutantes escolhidos, todos no cresciam no meio mnimo e cresciam em meio complexo. Neste momento os mutantes devero ser classificados, e para classificlos, foram colocados dois tubos, um contendo meio mnimo, e o fungo no podia crescer neste tubo (controle negativo), pois essa era a garantia de que ele era mutante. Chamamos este tubo de controle e neste caso era um controle negativo, pois no era capaz de crescer. O segundo tubo continha meio mnimo e todos os tipos de aminocidos (20 tipos diferentes), se o mutante crescesse neste tubo, saberamos que ele perdera a capacidade de sintetizar um tipo de aminocido e agora no conseguia crescer sem que lhe fosse oferecido pronto o aminocido j sintetizado (meio completo). Os mutantes que apresentavam estas caractersticas passavam para uma outra bateria de tubos, em nmero de vinte e um, onde um deles era o controle negativo que o meio mnimo sozinho e os outros so meio mnimo mais um tipo de aminocido diferente. E devemos fazer isto com cada um dos mutantes. Desta bateria foram selecionados trs tipos de mutantes: 1) mutante que cresceu em um tubo onde foi acrescentado arginina 2) mutante que cresceu em dois tubos onde se acrescentou arginina e citrulina 3) mutante que cresceu em trs tubos onde foi acrescentado arginina, citrulina e ornitina. Neste momento, no pode ser esquecido que para o geneticista s interessa o mutante com um s tipo de mutao, porque conseqentemente no seria possvel saber se em um experimento qual das mutaes estaria influenciando o resultado encontrado. Tornando o experimento dbio e no aceitvel, devendo ser desprezados.

7 Outros pesquisadores abandonariam os nmeros dois e trs, mas Beadle e Tatum, tiveram a sensibilidade de perceber que dentre os trs mutantes, todos cresciam quando era oferecido arginina, e dois deles cresciam quando era oferecido citrulina. Pensaram se no seria possvel se estes aminocidos estivessem em uma mesma via metablica no fungo. Eles encontraram com os mutantes acima trs tipos diferentes de loci das mutaes e em cromossomos diferentes. Os aminocidos estavam realmente em uma mesma via metablica, formando uma seqncia mais ou menos assim: Precurssor Enz 1 Enz 2 Enz 3 ornitina citrulina arginina

Como pode ser visto, podemos dizer que o mutante nmero um tem um problema na enzima nmero 3, o mutante dois tem sua mutao na enzima 2 e o terceiro tem sua mutao na enzima nmero 1. Srb e Horowitz (1944), refizeram estas mutaes usando dois agentes mutagnicos fsicos o Rx e o UV, conseguindo 15 mutantes diferentes e encontraram os sete passos diferentes desta via. O que reforou os trs encontrados anteriormente. Como a sequncia: E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 1234Orn5CitruArginina 1 mutante problema na enzima 7 2 mutante problema na enzima 6 3 mutante problema na enzima 4 Cada vez que ocorria uma mutao, o fungo perdia uma enzima. Isto levou a dupla de pesquisadores a generalizar da seguinte maneira um gene uma enzima. Por um certo tempo esta generalizao permaneceu como correta, mas depois foram descobertas outras funes para as protenas e a generalizao no procedia mais e teve de ser modificada para um gene um polipeptdio. Desta maneira se descobriu que o DNA trazia mensagens para sintetizar protenas, que podiam exercer diferentes funes, como as enzimas sem dvida, mas tambm as protenas estruturais, os hormnios proticos (nem todo hormnio protico), as imunoglobulinas e muitas outras funes com protenas de transporte etc. Mas todas eram feitas com polipeptdios. O trabalho dos dois levou dez anos oferecendo muitos frutos, e Beadle e Tatum fizeram vrios outros experimentos, com complementos alimentares, que muitas vezes aparecem na literatura, quando se fala sobre seus trabalhos, vitaminas e etc. Por isto procure entre elas esta que colocamos aqui. Bibliografia: Beadle, G.W. and E.L.Tatum, 1941, Genetic Control of Biochemical Reactions in Neurospora . Proc. Nat. Acad. Sci. (US), 27: 499-506. Reprinted in J. Peters, ed.,1959. Classic Paper in Genetics. Englewood Clifft, N.J. : Prentice Hall. Experimento nmero 6

8 Matthew Meselson e Franklin Sthal, 1958 Pergunta: Qual o processo pelo qual o DNA duplicado? Trabalharam com a bactria, Escherichia coli , que foram deixadas crescer em um meio contendo um istopo pesado do nitrognio (N15), ao invs do istopo leve (N14). Este marcador isotpico foi insertado nas bases nitrogenadas, que por sua vez foram incorporadas na forma de desoxirribonucleotdios nas fitas novas do DNA. importante saber que a bactria fabrica os 4 tipos de desoxirribonucleotdios a partir da matria prima oferecido no meio. Aps vrias divises das clulas no meio com o N15, pode-se dizer que o DNA das clulas estar marcado com este istopo pesado. Devemos lembrar que o nitrognio esta presente em cada monmero do DNA nas bases nitrogenadas, cada base nitrogenada possui uma certa quantidade de nitrognios como: as bases nitrogenadas dos desoxirribonucleotdios de adenina e guanina possuem 5 nitrognios, citosina tem 3 N e timina tem 2 N. As clulas foram removidas do meio atravs de centrifugao de baixa velocidade, estas clulas com o N15 e foram colocadas em um novo meio contendo o istopo leve N14, para crescer; aps dar tempos de uma gerao (no caso de E.coli 20 minutos) e de dois tempos de gerao (40 minutos), amostras foram retiradas de meio com as clulas contidas. O DNA das clulas foram extrados das clulas em cada uma das amostras, de tempo zero, do tempo um ( tempo de 20 minutos) e as do tempo dois (40 minutos). Os DNAs purificados foram colocados em uma soluo de cloreto de csio (CsCl) e depois ultracentrifugadas, apresentando padres de bandas a serem observadas. Se o cloreto de csio colocado para girar na ultracentrfuga, este colocado sob uma tremenda fora oferecida por velocidades acima de 50.000 rpm, por vrias horas, os ons do cloreto de csio apresentam uma tendncia de serem puxados pela fora centrfuga para o fundo do tubo. Finalmente, um gradiente de ons de Cl+ e Cl-, estabilizam-se no tubo, com as maiores concentraes de ons no fundo do tubo. As molculas de DNA em soluo tambm so puxadas atravs do tubo at o fundo, pela fora centrfuga. Mas a medida que elas trafegam dentro do tubo, elas encontram um aumento crescente na concentrao do sal em direo ao fundo do tubo, em contrapartida as molculas de DNA tendem a serem puxadas para traz, fazendo-as boiar (ou sua tendncia de flotar, fora de flotao). Deste modo o DNA finalmente encontra um certo local no tubo, onde as foras da centrifugao e a fora de flotao entram em um balano em relao a molcula que migra, em um certo ponto determinado formando uma banda, no gradiente de densidade de cloreto de csio. A fora de flotao do DNA depende da densidade (o que reflete nas propores entre os pares: G e C e A e T). A presena do istopo pesado do nitrognio muda a densidade de flotao do DNA. Dando uma diferena de 1%, o que permite o bandeamento diferencial, aparecendo bandas diferentes. Os padres usados por Meselson e Sthal, foram os DNAs marcados com o istopo N14, e com o istopo do N15. Se for ultracentrifugado por tempo adequado em um gradiente de densidade em CsCl, teremos as seguintes bandas nos tubos aps a centrifugao, sabendo que quem mais pesado fica mais no fundo do tubo, quem mais leve fica mais perto da boca do tubo: 1) DNA marcado com N14 - d uma banda chamada de leve, mais perto da boca

9 do tubo. 2) DNA marcado com N15 - d uma banda chamada de pesada, pois est mais ao fundo do tubo. Quanto mais pesado o material, mais para o fundo ele ir formar sua banda que chamamos de pesada, e se for mais leve, no gradiente formar uma banda para o lado da boca do tubo e mais no alto, que chamamos de leve. Se forem misturados um pouco do material dos DNAs, marcados com os istopos N14 e N15 teremos juntos no mesmo tubo: 3) Um pouco dos dois DNA marcados um com o N14 e o outro com o N15teremos em um mesmo tubo um padro de banda de duas bandas uma leve e uma pesada. Estes so os nossos trs padres de migrao de bandas no gradiente de densidade. Agora vamos analisar as hipteses consideradas no trabalho: Primeira Hiptese chamada de Conservativa Nesta hiptese considera-se que as duas fitas do DNA servem de molde ao mesmo tempo para a formao de uma fita dupla toda nova que surge. Se purificarmos os DNAs de cada tempo (T=0; T=20; T=40) que tipo de padro teramos, se forem colocados ao lado de cada um. Hiptese Conservativa Duplicao Padres Logo: Tempo zero: TG-0 N15 / N15 = Uma banda pesada. 1 gerao=20. TG-1 N15 / N15 + N14 / N14 = padro duas bandas, uma leve e uma pesada. 2 gerao=40. TG-2 N15 / N15 N14 / N14 + N14 /N14 N14 / N14 = padro duas bandas, uma leve e uma pesada. TG = a tempo de gerao. Tempo necessrio para que uma bactria seja capaz de exercer suas funes, crescer e se desenvolver at se dividir em duas clulas, em E. coli este tempo de 20 minutos. Temos aqui o que estaria acontecendo com a duplicao do DNA e o que se espera como padro de banda em forma de bandas resultantes da ultracentrifugao em um gradiente de densidade de CsCl. Segunda Hiptese chamada de Semiconservativa Nesta hiptese considera-se que cada uma das fitas do DNA serve de molde para uma nova fita simples complementar a fita antiga. Se purificarmos os DNAs de cada tempo que tipo de padro teramos, ser colocado ao lado de cada uma. Logo: Tempo zero: TG-0 N15 / N15 = Uma banda pesada. 1 gerao=20. TG-1 N15 / N14 + N14 / N15 = padro duas bandas, nica intermediria. 2 gerao=40.

10 TG-2 N15 / N14 N14 / N14 + N14 /N14 N14 / N15 = padro duas bandas, uma leve e uma intermediria. Temos aqui o que estaria acontecendo com a duplicao do DNA e o que se espera como padro de banda em forma de bandas resultantes da ultracentrifugao em um gradiente de densidade de CsCl. Estas so as duas hipteses consideradas no trabalho. No experimento agora temos: as clulas foram deixadas crescer em meio adequado, com o istopo N15, durante a noite, depois foi feita uma centrifugao de baixa velocidade, separando as clulas do sobrenadante. Aps a separao das clulas, estas foram ressuspendidas em um meio novo onde se apresentava somente o istopo N14. As bactrias foram incubadas e deixadas crescer nos trs tempos distintos, o primeiro chamado de tempo zero, o segundo 20 e o terceiro 40, retirou-se um tero do volume constituindo o primeiro tempo zero, aps passar 20, retirou-se outro tero que era o segundo tempo (20) e foi colocado em um tubo junto com gelo (OC), depois de mais vinte minutos constitumos o 40 o ltimo tero foi colocado em um tubo no gelo. As clulas foram lizadas com lisozima e tiveram purificados seus DNA (tirar as protenas), e posteriormente foram colocados em um gradiente de densidade em CsCl, para ultracentrifugar, por 48hs a 100.000 rpm. Aps a corrida foram observados os padres de bandas em cada tubo e foram conseguidas em TG=0 uma banda pesada, em TG-1 uma banda intermediria e em TG-2 duas bandas uma leve e uma intermediria. Comparando estes resultados com as hipteses veremos que confere com a hiptese de nmero dois, semiconservativa. Logo o processo pelo qual o DNA duplicado em bactrias o semiconservativo. Como pode ser observado foram utilizados istopos do nitrognio neste experimento. A utilizao destes istopos se deveu a diferena em seus nmeros de massa, a diferena na massa das molculas de DNA e conseqentemente nas molculas de DNA dentro do gradiente de densidade, marcadas com o istopo N14 e as marcadas com o N15, permitiu o aparecimento de bandas diferenciadas onde podamos distinguir entre as molculas de DNA velho(N15) ou do recm sintetizado (N14). Mas lembre-se que este experimento o resultado dado com um padro de bandas conseguidos depois da ultracentrifugao em um gradiente de densidade de CsCl Bibliografia: Meselson, M.S., and F.W. Sthal, 1958. The Replication of DNA in Escherichia coli. Proc. Nat. Acad. Sci. (US), 44: 671-682. Experimento nmero 7 Rosalind Franklin e Maurice Wilkins 1952, Wilkins, ingls, Francklin, inglesa. A pergunta aqui colocada depois que ficou determinado que o DNA era o responsvel pela hereditariedade muitos cientistas procuraram determinar qual seria a exata estrutura molecular do DNA. Franklin e Wilkins trabalharam com E.coli , aps crescer em meio lquido, peletaram as clulas atravs de centrifugao, lisando estas clulas com lisozima posteriormente, purificando o DNA (tirar as protenas), e finalmente foi retirada a

11 gua contida no DNA e este se transformou em fibras cristalizadas. A tcnica usada foi a cristalografia, que consiste em colocar os cristais de interesse sob uma emisso de Raio X, que logo em seguida passa por um colimador, o colimador faz com que todos os raios que passam por ele fiquem paralelos entre si. Passando pelas fibras cristalizadas os raios, todos paralelos, estes so espalhados pela estrutura das molculas de sais ali presentes e a radiao espalhada e recolhida por um filme sensvel ao Raio X, que queimado pelos raios incidentes espalhados pelas molculas queimando o filme. Aps a revelao do filme, as manchas resultantes so interpretadas pelos cristalgrafos, como as caractersticas provocadas pelas distncias e ngulos destes cristais, que provocaram tal espalhamento, assim como informaes sobre a posio de certos tomos ou de certos grupos de tomos na molcula. E o trabalho desta dupla portanto consistiu na determinao de distncias e ngulos da molcula de DNA. A avaliao feita sugeria que o DNA era uma molcula longa e extremamente fina, e possuam duas fitas similares, paralelas uma a outra. Os dados apresentados pelo Raio X mostrou que a molcula era helicoidal. Bibliografia: Wilkins,M.H.F., A.R. Stokes y H.R. Wilson, 1953. Molecular structure of desoxypentose nucleic acids. Nature, 171, 738-740. Wilkins, M.H.F., 1963. The molecular configuration of nucleic acids. Science, 140,941-950. Franklin, R.E. and R.Gosling, Nature, 171, 740, 1953. Experimento nmero 8 J.D.Watson e F.H.C Crick 1953 (PN de 1962) Watson americano, Crick, ingls Cavendish Lab,Cambridge Univ. Temos frisar que estes no fizeram experimentos, desenvolveram experimentos tericos, Biologia terica. O trabalho de Franklin e Wilkins foi muito importante para Watson e Crick, outro indcio analisado por Watson e Crick, foi o trabalho de Erwin Chargaff, que determinou a proporo existente entre as bases A-T e C-G em DNA de vrios tipos de seres, Chargaff determinou empiricamente algumas regularidades: 1) A quantidade total de nucleotdeos de pirimidinas (T e C) era igual quantidade total de nucleotdeos de purinas (A e G); 2) A quantidade de T era igual quantidade de A, e a quantidade de C era igual de G. Mas a quantidade de A e T no era necessariamente igual quantidade de C e G. Watson e Crick conceberam de todos estes indcios um modelo de uma dupla hlice, feita por uma corrente de desoxirribonucleotdeos, ligados entre si por pontes de ligao fosfodister, onde um grupamento fosfato forma a ponte entre o grupo - OH entre dois resduos de acares adjacentes. As duas fitas so ligadas por pontes de hidrognio, duplas ou triplas, dependendo das bases nitrogenadas presentes. A e T so duplas e entre C e G so triplas. Para formar estas pontes de hidrognio so necessrios dois elementos eletronegativos, um de um lado e o outro do outro, que compartilham um prton (hidrognio) entre si. Uma ponte de hidrognio uma ligao fraca, pois significa 3% da fora de uma ligao covalente. Mas esta ligao fraca tem uma importncia grande na funo do DNA na hereditariedade. Um dos importantes fatos que a ponte de hidrognio fica mais forte se os tomos participantes so colocados um atras do

12 outro, com uma orientao sequencial. Os degraus se distanciam uns dos outros de 3,4 (angstrons), e uma volta completa na fita dupla sobre o eixo central dez vezes maior = 34 . O dimetro da molcula tem 20 . Temos de saber tambm que um degrau est deslocado em relao ao prximo, com um ngulo de 36 graus, formando uma hlice. Observando o desenho, pode ser visto que as duas fitas giram juntas ao redor do eixo central, de fora ento est a poro hidroflica e ao mesmo tempo o esqueleto da molcula, poro acar - fosfato, e a parte de dentro a poro hidrofbica, formada pelas bases nitrogenadas. Uma das fitas simples paralela outra fita simples, mas uma est o inverso da outra. Se for observada a orientao dos carbonos da pentose em uma das fitas, uma delas tem orientao 3 5 e a outra ao contrrio 5 3. A molcula apresenta-se como uma escada onde os corrimos so uma seqncia de pentoses e cidos fosfricos e nos degraus temos as bases nitrogenadas pareadas entre as duas fitas, formando as pontes de hidrognio e onde encontraremos as mensagens do cdigo gentico. Como poderia funcionar esta mensagem? Necessitamos de informaes para fazer protenas com a qual se constri os corpos dos seres vivos, para construir as protenas precisamos de aminocidos e estes existem formando seres vivos em nmero de 20 tipos diferentes. Nos degraus esto as bases nitrogenadas e estas esto em nmero de quatro: A (dATP),C(dCTP),G (dGTP),T(TTP), diferentes bases, encontradas nos desoxirribonucleotdios, cada um deles com uma base diferente. Se cada uma fosse uma mensagem teramos quatro insuficientes mensagens; 4 elevado a um =4; se tivssemos uma leitura com duas a duas, teramos 4 elevado a dois = 16, j ficou melhor mas estariam faltando quatro aminocidos, por fim se tivermos leitura com trs a trs; teramos 4 elevado a trs = 64. Que contempla perfeitamente e sobram mensagens. As mensagens portanto so constitudas por seqncias de tripletes e como temos mais de um triplete que podem significar um mesmo aminocido, denominamos o cdigo gentico de degenerado, existem somente dois aminocidos que possuem uma s mensagem como metionina (AUG) e o triptofano (UGG). Leucina aminocido que possui seis opes (UUA,UUG,CCU,CUC,CUA, CUG), prolina, treonina, alanina, arginina, e glicina possuem quatro, isoleucina tem trs, fenilalanina, histidina, cido glutmico, asparagina, lisina, cido asprtico, glutamina, cistina, serina e arginina possuem duas mensagens e ainda temos trs mensagens que no so mensagens para aminocidos, so mensagens de parada, cdigos de finalizao dos genes (UAA,UAG e UGA). Logo teremos 61 mensagens para aminocidos e trs sinais de parada formando ento 64 combinaes dos quatro desoxirribonucleotdeos. Com os tripletes formamos mensagens que se relacionam com uma sequencia de aminocidos, na constituio de uma protena, que capaz de exercer uma funo na clula. Logo se eles no estiverem em posio e na fita certa, no conseguiremos sintetizar as protenas necessrias. Tirar de fase um gene significa no respeitar estes cdigos na fita correta. Se mudarmos uma nica base, tudo que estiver para frente ser modificado na sequncia, se mudarmos dois da mesma forma atrapalha toda a sequncia para frente, mas se mudarmos trs bases mudamos somente um aminocido na seqncia da protena. Que pode ser considerado um dano menor, mas

13 dependendo do local na protena onde foi feita esta mudana, insignificante que possa parecer, pode mudar toda a protena inviabilizando sua funo. Temos de lembrar a mxima Forma possui relao direta com a Funo, quando se fala em protenas.

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Bibliografia: 1-Watson, J.D. e F.H.C. Crick , 1953. Molecular Structure of Nucleic Acids. A Structure for Deoxyribonucleic Acid. Nature, 171: 737-738. Reprinted in J.H.Taylor, ed., 1965. Selected Papers on Molecular Genetics. New York: Academic Press. 2-Watson, J.D. e F.H.C. Crick, 1953. Genetical implications of the estructure of the deoxyribonucleic acid. Nature, 171, 964-967. 3-Chargaff,E., and J.N. Davidson . 1955. The Nucleic acids. Vol II. Academic Press, New York.