UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CENTRO-OESTE

Elaborado por: Prof. Dr. Welligton Luciano Braguini

Colaborao e Apoio: Prof. Dra. Rosilene Rebeca

Alunos participantes do projeto: Mailson Poczunec Juliana Aparecida Freiberger

Manual de Aulas Prticas de Bioqumica

Laboratrio de Bioqumica e Biofsica
Prof. Welligton Luciano Braguini 2010

O manual de aulas de bioqumica resultante de um projeto de extenso intitulado Aulas prticas de bioqumica e biofsica no fortalecimento do conhecimento terico dos graduandos nas reas de Cincias Biolgicas, Agrrias e da Sade, na modalidade de Interveno Extensionista, na categoria de Projeto de Extenso por tempo determinado, no vinculado a Programa de Extenso Permanente, sem financiamento externo realizado durante o ano de 2009. Trata-se de um conjunto de aulas tericas e algumas aulas prticas, resumidas e apoiadas em livros textos atualizados da rea e apostilas de outras instituies. Aulas prtica sero realizadas de acordo com material e equipamento disponvel.

_____________________________________________________________________________________________

Disciplina de Bioqumica Departamento de Cincias Biolgicas - DEBIO Curso: Cincias Biolgicas 1 ano
PROFESSOR:

2 ( 2) =

(3 0,8) + (4 0,8) + + 2

= Prof. Dr. Welligton Luciano Braguini, wbraguini@unicentro.br, Lab. de Bioqumica e Biofsica - DEBIO

(1 + 2) 2

MONITOR (A): Nome: ___________________________________________________________________. Email: __________________________@________________________________________.

A presena em todas as atividades didticas obrigatria. Em casos do aluno no poder comparecer no dia da prova de avaliao por razes mdicas ou justificvel, desde que aceita pelo professor, dever protocolar no DIAP pedido de prova em poca especial em at 48 horas do trmino da avaliao previamente marcada com documento que comprove a sua ausncia no dia da prova. Dia 04 de agosto e 03 de dezembro de 2010 o prazo final para protocolar pedido de prova em poca especial referente s provas do primeiro e segundo semestre, respectivamente. O professor somente aplicar uma nica prva em poca especial. A nova prova ser realizada juntamente com a ltima prova do ano letivo. Reposies de atividades laboratoriais esto vedadas. Alunos que alcanarem a mdia final 5,0 e 6,9 e mostrarem freqncia 75% tero direito a exame final, devendo alcanar uma nota que, somada mdia anual e dividida por 2, resulte em um valor igual ou superior a 6,0. O aluno estar aprovado se alcanar a mdia anual 7,0 e frequncia igual ou superior a 75%. Cuidado com as faltas! (Mais informaes: solicite o Calendrio Universitrio 2010 no DEBIO). ALUNOS ENCONTRADOS COLANDO OU PLAGIANDO RECEBERO NOTA ZERO NA DISCIPLINA

INTRODUO E NORMAS GERAIS A disciplina de Bioqumica compreende o programa do plano de ensino mostrado no primeiro dia de aula do ano letivo. Cada aula focaliza um tpico a ser desenvolvido, envolvendo 3 atividades: 1- Aula expositiva pelo professor; 2- Grupos de discusso e resoluo de exerccios, dentro e fora da sala da aula, centrados em questes objetivas; 3- Laboratrio. Os grupos de discusso sero formados por at 5 alunos (mximo), organizados no primeiro dia de aula permanecendo fixos por todo o curso. AVALIAO A avaliao de desempenho ser composta dos seguintes itens: Provas bimestrais (P1, P2, P3 e P4), que consistiro de provas do contedo ministrado em cada um dos bimestres. Trabalhos individuais (T) ou em grupo e relatrios (R) referentes as aulas prticas prticos no laboratrio. Estas atividades R e T, podem no estar presentes juntas no mesmo bimestre e somente se somaro se o valor nao ultrapassar o limite da nota (10,0). O clculo da media semestral e final ser feito atravs da seguinte frmula:

BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA A bibliografia recomendada envolve 3 livros textos em portugus que constam no plano de ensino e na biblioteca: NELSON & COX. Lehninger Princpios de Bioqumica. MARZZOCO, A.; TORRES, B. B. Bioqumica bsica. DEVLIN, T. M. Manual de Bioqumica com Correlaes Clnicas. MURRAY et al.. Harper: Bioqumica. BOM ESTUDO!

1 ( 1) =

(1 0,8) + (2 0,8) + + 2

AULA PRTICA 17 ................................................................................................................................................ 46

Extrao de Glicognio do Fgado de rato ......................................................................................... 46

CONTEDO
Introduo ao Laboratrio .....................................................................................................................................7 AULA PRTICA 1 ....................................................................................................................................................9

AULA PRTICA 18 ................................................................................................................................................ 48

Hidrlise cida do Glicognio ........................................................................................................... 48

AULA PRTICA 19 ................................................................................................................................................ 50

pH e Tampes .................................................................................................................................... 9
AULA PRTICA 2 .................................................................................................................................................. 11

Doseamento de cido Ctrico ........................................................................................................... 50

AULA PRTICA 20 ................................................................................................................................................ 51

Caracterizao de Protenas por Meio de Reaes de Colorao e Precipitao ............................... 11

AULA PRTICA 3 .................................................................................................................................................. 14

Cintica Enzimtica .......................................................................................................................... 51

AULA PRTICA 21 ................................................................................................................................................ 53

Decomposio do Amido.................................................................................................................. 14
AULA PRTICA 4 .................................................................................................................................................. 16

Separao Eletrofortica de Protenas.............................................................................................. 53

Determinao da concentrao de protenas ................................................................................... 16

AULA PRTICA 5 .................................................................................................................................................. 30

Hidrlise cida e enzimtica do amido.............................................................................................. 30

AULA PRTICA 6 .................................................................................................................................................. 34

Fracionamento das protenas do leite e sua dosagem pelo mtodo do biureto ................................ 34
AULA PRTICA 7 .................................................................................................................................................. 36

Identificao de Aminocidos........................................................................................................... 36
AULA PRTICA 8 .................................................................................................................................................. 37

Identificao e Propriedades das Protenas ...................................................................................... 37

AULA PRTICA 9 .................................................................................................................................................. 38

Identificao e Classificao dos Carboidratos .................................................................................. 38

AULA PRTICA 10 ................................................................................................................................................ 39

Identificao e Classificao dos Lipdios .......................................................................................... 39

AULA PRTICA 11 ................................................................................................................................................ 40

Atividade Enzimtica ........................................................................................................................ 40

AULA PRTICA 12 ................................................................................................................................................ 41

Identificao de Vitaminas ............................................................................................................... 41

AULA PRTICA 13 ................................................................................................................................................ 42

Decomposio do Amido.................................................................................................................. 42
AULA PRATCA 14 ................................................................................................................................................ 43

Separao de Caroteno da Cenoura ................................................................................................. 43

AULA PRTICA 15 ................................................................................................................................................ 44

Determinao de Clorofila................................................................................................................ 44
AULA PRTICA 16 ................................................................................................................................................ 45

Clorofila - Substituio do Magnsio pelo Cobre, Formao de Feofitina .......................................... 45

INTRODUO AO LABORATRIO
INSTRUES GERAIS: 1- o laboratrio um lugar para trabalho srio e no deve servir para experimentos no programados. 2- no permitido comer ou fumar dentro do laboratrio. 3- indispensvel o uso de avental e culos de segurana. 4- a leitura das prticas com antecedncia proporcionar melhor aproveitamento das aulas. 5- Realize somente os experimentos indicados na aula. No permitido realizar aqueles no autorizados. 6- no troque os reagentes de uma bancada para outra. 7- Tendo qualquer dvida, solicite aos professores os devidos esclarecimentos. 8- Cuidados especiais devem ser tomados durante o manuseio de cidos e bases fortes e de materiais biolgicos. 9- Comunique aos professores quando houver material quebrado na bancada ou aparelhos danificados. Quando isto acontecer no utilize estes materiais. Se houver quebra de material durante o experimento, comunique ao professor imediatamente. 10- Ao final de cada aula, limpe todo o material. Descarte os resduos em frascos apropriados. Passe gua de torneira nos tubos e outros materiais utilizados. As pipetas devem ser colocadas dentro das cubas com as pontas para baixo. Instrues tcnicas: 1Use sempre uma pipeta para cada reagente a fim de evitar contaminao. 2Ateno para no trocar as tampas dos frascos de reagentes. 3Para aquecer o tubo de ensaio na chama direta (bico de Bunsen ou fogareiro) observe se o tubo est seco externamente, caso contrrio, seque-o antes de efetuar a operao. Para que o tubo seja uniformemente aquecido, prenda-o com pinas de madeira e mantenha-o em constante agitao. Nunca dirija a boca do tubo em sua direo ou na dos colegas. 4Espere que o vidro quente volte a esfriar antes de peg-lo. Lembre-se, o vidro quente parece estar frio. 5Terminado o uso do bico de Bunsen, verifique se as torneiras do gs esto bem fechadas, evitando assim exploses e intoxicaes. 6Nunca deixe ou abra frascos de lquidos inflamveis (ter, lcool, acetona, benzeno, etc) nas proximidades de chamas. 7Leia duas vezes os rtulos dos reativos antes de us-los. 8Nunca devolva restos de uma soluo para o frasco-estoque, porque poder estar contaminada. 9Antes de introduzir pipetas nas solues, certifique-se de que esto limpas. 10Para preparar solues de cidos fortes (sulfrico, clordrico, ntrico, etc.), verta sempre o cido sobre a gua, nunca a gua sobre o cido. 11Para o preparo das solues alcalinas (NaOH, KOH, etc) tome bastante cuidado, pois a dissoluo de bases fortes em gua exotrmica. Mantenha o frasco em banho de gelo e no aspire os vapores desprendidos. 12Para verificar o odor da substncia, nunca leve o frasco diretamente ao rosto. 13Quando preparar solues alcolicas, o lcool e a gua devem ser medidos separadamente e depois reunidos, porque h diminuio do volume total. 14O material volumtrico vem calibrado com gua destilada a uma dada temperatura, conforme vem registrado.

15a. b. c. d.

O uso das pipetas: Para volumes de 0 e 1 mL, use pipeta de 1 mL graduada ao centsimo. Entre 1 e 2 mL, use pipeta de 2 mL graduada ao centsimo. Entre 2 a 5 mL, use pipeta de 5 mL graduada ao centsimo. Entre 5 e 10 mL, use pipetas de 10 mL graduada ao dcimo.

Para o preparo de solues de solues-padro utilize pipetas volumtricas. O lquido no interior das pipetas forma um menisco e a leitura deve ser na altura dos olhos. O mesmo vale para bales volumtricos. Para medir substncias corrosivas ou txicas, obture a extremidade superior da pipeta com um pouco de algodo ou use uma bureta que mais seguro. Recomenda-se tambm o uso de peras, prpipetas ou pipetas automticas. Quando pipetar sangue, solues viscosas, cido concentrado ou solues alcalinas concentradas, lavar imediatamente com gua o material utilizado.

AULA PRTICA 1
PH E TAMPES

Objetivos

TUBO 3: Adicionar 2 gotas de HCl 0,1M. TUBO 4: Adicionar 2 gotas de HCl 0,1 M. *Observar a mudana de cor, determinar o pH e anotar o resultado na tabela. Continuar a adio de HCl ao 4, gota a gota, at a cor do 3. *Determinar quantas gotas de HCl devem ser adicionadas at que se obtenha a mesma colorao do 3.

Determinar o pH de solues utilizando os mtodos colorimtricos (indicadores de pH) e potenciomtrico. Reconhecer a capacidade tamponante de aminocidos e protenas. Relacionar os conhecimentos adquiridos ao funcionamento dos tampes de importncia biolgica.

TUBOS 1

Relao terico-prtica Conceitos de cidos e bases Ionizao da gua Definio de pH e pka Equao de Henderson-Hasselbach nos clculos sobre tampes Capacidade tamponante Valores de pK de aminocidos Tampes de importncia biolgica Aminocidos e protenas: estrutura e funo Reativos 1. Solues-tampo de pH 3,4,5,6,7,8,9,10 2. Indicador universal 3. Hidrxido de sdio 0,1 mol/L 4. cido clordrico 0,1 mol/L Tcnica a) Escala padro: preparar uma bateria de 8 tubos de ensaio e colocar em cada tubo 1 mL soluo-tampo pH 3 a 10. Adicionar 5 gotas do indicador universal e 9 mL de gua destilada. b) Experimento I: preparar uma bateria de 4 tubos de ensaio. TUBO 1: 5 gotas de indicador + 10 mL de gua. TUBO 2: 5 gotas do indicador + 1 mL do tampo pH 7,0 + 9 mL de gua. TUBO 3: 5 gotas de indicador + 10 mL de gua. TUBO 4: 5 gotas de indicador + 1 mL do tampo pH 7,0 + 9 mL de gua. *determine o pH de cada soluo e anotar o resultado na tabela. c) Experimento II TUBO 1: Adicionar 1 gota de NaOH 0,1 M. TUBO 2: adicionar 1 gota de NaOH 0,1 M. *Observar, determinar o pH e anotar o resultado na tabela. Soprar o ar expirado, por 15 segundos no 1 e por 1 minuto no 2. *Observar a mudana de cor, e determinar o pH e anotar o resultado na tabela.

AMOSTRA gua destilada + 1 gota de NaOH de 0,1 M + ar expirado por 15 s Tampo pH 7,0 + 1 gota de NaOH 0,1 M + ar expirado por 1 min gua destilada + 2 gotas de HCl 0,1 M N de gotas _____ para ter o pH = ao tubo 3

pH

Interpretao dos resultados Resoluo de exerccios Fundamento

10

AULA PRTICA 2 CARACTERIZAO DE PROTENAS POR MEIO DE REAES DE COLORAO E PRECIPITAO

TUBO 6: 1 ml de protena 10% + 1 ml de acetato de chumbo 5%. Anotar o resultado. d. REAO COM SOLVENTE ORGNICO TUBO 7: 1 ml de protena 10% + 3ml de lcool etlico. Anotar o resultado. e. EFEITO DA ADIO DE SAIS TUBO 8: 3 ml de clara pura + gua destilada at a formao de precipitado esbranquiado. Dissolver com auxlio de um basto, adicionar NaCl 1 mol/L gota a gota at o precipitado redissolver.

OBJETIVOS: 1234MATERIAL: Soluo de clara de ovo a 10% Soluo de ninhidrina 0,1% Soluo de Hidrxido de sdio 2,5 M Soluo de sulfato de cobre a 1% cido tricloroacetico (TCA) a 10% v/v Soluo de acetato de chumbo a 5% lcool etlico absolute Cloreto de sdio 1 mol/L Soluo saturada de sulfato de amnio 76,6g% p/V Caracterizar a presena de protenas em material biolgico Demonstrar as reaes de colorao de protenas Verificar experimentalmente a precipitao de protenas com e sem desnaturao Relacionar as observaes prticas com a teoria de propriedades gerais, estrutura e isolamento de protenas.

TUBO 9: 2 ml da soluo anterior + 4 ml de soluo saturada de sulfato de amnio. Observar. Adicionar 4 a 6 mL de gua destilada e observar o efeito.

Interpretao dos resultados: 1) Em que se fundamenta a reao da ninhidrina e que classes de substncias reagem positivamente? 2) Em que se fundamenta a reao do biureto e que grupos nas protenas so responsveis por esta reao? 3) Qual a importncia da reao do biureto? 4) Qual a importncia das reaes de precipitao de protenas por reagentes dos alcalides e por sais de metais pesados? Explique os mecanismos das precipitaes. 5) Explique os mecanismos que levam uma protena a se dissolver quando h um pequeno aumento na fora inica da soluo e os mecanismos que levam uma protena a precipitar quando h um grande aumento na fora inica da soluo. 6) Que mudanas ocorrem com uma protena quando em contato com o etanol?

Preparo dos reativos: Soluo de ninhidrina: pesar 100 mg de ninhidrina e dissolver em 100 ml de tampo fosfato 0,01 mol/L, pH 7. Conservar em frasco escuro e em geladeira. Soluo de protenas: preparar uma soluo de clara de ovo a 10% v/v em soluo salina (NaCl 0,9g/100ml) ou tampo fosfato 10 mmol/L, pH 7.

Fundamentos: Caracterizao de protenas: pode ser feita utilizando reaes de colorao ou precipitao. Devido presena de diferentes aminocidos e s ligaes peptdicas as protenas reagem com uma variedade de compostos, formando produtos coloridos. Existem reaes de colorao que so especficas para aminocidos encontrados nas protenas e essas reaes so importantes tanto na deteco como na dosagem de aminocidos e protenas. Existem tambm reaes chamadas de gerais, porque iro caracterizar grupamentos comuns a todas as protenas, como grupos amino e ligaes peptdicas (reao da ninhidrina e do biureto, respectivamente). Os grupos alfa-amino de aminocidos, peptdeos e protenas reagem com a ninhidrina formando um complexo de cor prpura, quando a soluo aquecida. A intensidade da cor proporcional concentrao de aminocidos sendo a tcnica utilizada para a determinao quantitativa dos mesmos. A reao do biureto devida s ligaes peptdicas dando positiva para peptdeos com mais de 2 aminocidos e protenas, sendo tambm positiva para substncias que contm mais de dois grupos amida. Ocorre a formao de um complexo de coordenao com o cobre de cor prpura. A solubilidade das protenas muito varivel e depende da distribuio e da proporo dos grupos polares e apolares na molcula. A protena solvel quando ocorre interao protena-gua e tende a ser insolvel quando ocorre interao protena-protena. Qualquer condio que altere essas interaes alterar a solubilidade. Desnaturao por definio a modificao que ocorre na estrutura nativa de uma protena, alterando assim suas propriedades. A desnaturao envolve alteraes nas estruturas quaternria, terciria e secundria

PROCEDIMENTO EM AULA: 1- Reaes de colorao: a. Reao da ninhidrina: TUBO 1: 2 ml de ninhidrina + 5 gotas de protenas 10%, banho-maria por 5 min, a 100C. Anotar o resultado. b. Reao do biureto: TUBO 2: 1 ml de protena 10% + 5 gotas de NaOH 2,5 mol/L e 3 gotas de sulfato de cobre a 1%. TUBO 3: 1 ml de gua destilada + 5 gotas de NaOH 2,5 mol/L e 3 gotas de sulfato de cobre a 1%. Anotar o resultado. 2- Reaes de precipitao: a. AO DO CALOR: TUBO 4: 2 ml de protena 10%, aquecer em banho-maria a 100C por 3 minutos. Anotar o resultado. b. REAO COM REAGENTES PARA ALCALIDES TUBO 5: 1 ml de protena 10% + 1 ml de TCA 10%. Anotar o resultado.

11

c.

REAO COM SAIS DE METAIS PESADOS

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de protenas. A estrutura primria mantida. Existem vrios agentes desnaturantes: calor, cidos, solventes orgnicos, sais de metais pesados, etc. As alteraes que se observam em decorrncia da desnaturao podem ser, entre outras, a diminuio da solubilidade e/ou a perda da atividade biolgica. A diminuio da solubilidade pode ser explicada pela exposio de radicais hidrofbicos e outros que prejudiquem a interao protena-gua e favorecem a interao protena-protena. A floculao e a coagulao so manifestaes visveis das alteraes estruturais causadas pelos agentes desnaturantes. MATERIAL: Bquer de 200Ml 200 mL de gua destilada 2 mL de cido clordrico 1 g de amido Lugol conta-gotas

AULA PRTICA 3 DECOMPOSIO DO AMIDO

Agentes desnaturantes Calor: agitao trmica afeta as interaes que estabilizam a estrutura tridimensional das protenas (pontes de hidrognio, interaes hidrofbicas). Reagentes para alcalides (cidos): combinam com protenas com carga positiva formando complexos insolveis. Por exemplo: tricloacetato de protena. Sais de metais pesados: combina-se com protenas com carga negativa, formando proteinatos insolveis, por exemplo, proteinato de chumbo. Solventes orgnicos: estes solventes apresentam constante dieltrica inferior gua, ento a atrao entre cargas opostas alta (precipitao). As protenas podem ser precipitadas sem sofrer desnaturao por variao do pH e por alteraes da fora inica do meio e por ao de solventes orgnicos baixa temperatura. Ao variar o pH da soluo de protena, os radicais dos aminocidos sofrem dissociao e no ponto isoeltrico quando a molcula est totalmente dissociada, a fora de atrao eletrosttica mxima e a solubilidade decresce. A capacidade dos sais neutros de influenciar a solubilidade de muitas protenas uma funo da fora inica. A concentrao reduzida de sal aumenta a solubilidade das protenas, porque diminui a interao protena-protena, fenmeno denominado salting-in. Em altas concentraes de sal ocorre a remoo da gua de hidratao, o que leva a predominncia da interao protena-protena, resultando em precipitao, ou salting-out. O salting-out um processo muito importante porque diferentes concentraes de sal podem ser empregadas para separar diferentes protenas. Procedimento: Pese 1 g de amido em um bquer de 200 mL, dissolva em 200 mL de gua destilada e adicione 2 mL de cido clordrico concentrado, dissolva bem o contedo do bquer e aquea at ebulio. Prepare 10 tubos de ensaio numerados, cada um, com uma gota de lugol. Aps o incio da ebulio, pipetar cada 4 minutos, 2 mL da soluo fervente de amido seguindo os tubos de ensaio pela ordem at o dcimo tubo. Observe e anote suas observaes: Descrio do aspecto e colorao do contedo do tubo de ensaio TUBOS 1

2 3 4 5 6 7 8 9 10

13

14

Perguntas e exerccios Fundamento O amido um gro formado de polissacardeos e encontrado abundantemente no reino vegetal, principalmente em sementes e tubrculos no qual desempenha a funo de reserva nutricional. Estruturalmente, os polissacardeos constituintes, a amilose e a amilopectina, so considerados homopolmeros, pois so constitudos somente de unidades de glucose, que diferem na estrutura molecular. A amilose apresenta uma estrutura linear com as unidades de glicose ligadas por ligaes glicosdicas (1 4) e a amilopectina ramificada, com ligaes glicosdicas (1 4) e (1 6). Dentro da clula o amido encontrado em forma de grnulos e, quando uma soluo de amido aquecida, os grnulos se desintegram formando uma soluo coloidal. Na sua caracterizao, pode-se empregar a Reao de Molisch ou a Reao com iodo. A Reao de Molisch um teste geral para carboidratos. Os carboidratos so desidratados a um derivado furfural, ou hidroximetil-furfural, na presena de um cido concentrado sobre uma pentose, ou hexose, respectivamente. Os derivados furfricos condensam-se com o alfa-naftol para resultar uma colorao violcea. No caso do amido, inicialmente ocorrer hidrlise pela ao do cido sulfrico, liberando molculas de glucose. Na reao positiva, formar-se- uma zona de cor violeta e verde na interfase. A reao com o iodo utilizada para pesquisa do amido, que forma um complexo colorido com o iodo. A amilose d origem a uma colorao negro-azulada, enquanto que a amilopectina d origem a uma colorao vermelho-violcea. Este complexo se dissocia por aquecimento e torna a se formar quando a soluo resfriada. A explicao para este fato advm do fato das cadeias lineares de amilose apresentarem uma conformao helicoidal capaz de ocluir o iodo, resultando no desenvolvimento de colorao azul-intensa tpica. Para cada 6 unidades de glucose ligadas alfa(1 4) da amilose estabelece-se um passo na hlice. O aquecimento da soluo de amido deve ento alterar esta conformao e como consequncia abolir a colorao resultante da interao amilose-iodo. A amilopectina apresenta uma reao semelhante mas a formao da hlice fica, em parte, dificultada pelos pontos de ramificao da molcula [ligaes glicosdicas alfa(1 6)]. Por esta razo, a intensidade da cor do complexo amilopectina-iodo menor e seu matiz (mxima de absoro) tambm diferente (vermelho-violceo). No glicognio, ainda mais ramificado que a amilopectina, este impedimento maior e a colorao resultante acastanhada.

AULA PRTICA 4 DETERMINAO DA CONCENTRAO DE PROTENAS

Objetivos: Elaborar curva de calibrao e estabelecer a sensibilidade de um mtodo espectrofotomtrico Resolver problemas especficos: clculos envolvendo diluio de determinao da concentrao de diferentes solues. Relao terica-prtica Protenas (determinao da concentrao no meio) Carboidratos (determinao da concentrao no meio) Ciclo da uria excreo da uria (determinao da concentrao no meio). Reativos: Reagente do biureto: dissolver em 500 ml de gua destilada: 1,5 g de sulfato de cobre pentaidratado 6,0 g de tartarato duplo de sdio e potssio Adicionar 300ml de soluo de hidrxido de sdio a 10% com constante agitao Adicionar gua destilada suficiente para 1 litro de soluo. Soluo padro de protena: pesar 250g de albumina de soro bovino e dissolver em 50 ml de gua destilada. Aliquotar em fraes de 10 ml e conservar a -20C. Tcnica: Curva de calibrao: Organizar uma bateria com seis tubos de ensaio. Identific-los com nmeros de 1 a 6. Adicionar os reagentes conforme a tabela: tubo 1 1,0 5,0 tubo 2 0,2 0,8 5,0 tubo 3 0,4 0,6 5,0 tubo 4 0,6 0,4 5,0 tubo 5 0,8 0,2 5,0 tubo 6 1,0 5,0

REAGENTES (ml) Soluo padro protena (5mg/mL) gua destilada Reagente do Biureto

de

Agitar e deixar em repouso por 10 minutos. utilizar o tubo 1 para calibrar o espectrofotmetro: 100% de transmitncia em 540 nm. Determinar a absorbncia das solues dos tubos 2 a 6. Traar, em papel milimetrado, o grfico: concentrao final de protena (mg/ml) na ordenada e Absorbncia (A) na abcissa. Interpolar a melhor reta possvel, passando pela origem dos eixos cartesianos. 1- Determinao da concentrao de protena em amostra-problema a. Separar dois tubos de ensaio. b. Identific-lo como tubo A e tubo B. c. Adicionar os reagentes conforme abaixo, considerando que o volume da amostra a ser analisada ser de 1 ml. Tubo A 1,0 Tubo B 0,5

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REAGENTES (mL) Amostra

16

gua destilada Reagente do Biureto d. e.

5,0

0,5 0,5*

Agitar e deixar em repouso por 10 minutos. Determinar a absorbncia das solues desconhecidas, utilizando o tubo 1 (item I) para calibrar o espectrofotmetro (100% de transmitncia em 540 nm). f. Determinar a concentrao de protena (mg/ml) presente nas amostras problema utilizando o grfico da curva de calibrao (item I). *anotar o fator de calibrao da amostra (2). Interpretao dos resultados Perguntas e exerccios: 1) Qual a finalidade e o fundamento da tcnica espectrofotomtrica? 2) Conceitue: faixa de sensibilidade do mtodo espectrofotomtrico. 3) Um determinado composto apresenta um mximo de absoro em 660 nm. Para uma concentrao de 0,75 umol/mL foi obtida uma absorbncia de 0,4. Sabendo-se que o limite de sensibilidade do mtodo utilizado de 0,1umol/mL a 3umol/mL, calcule a concentrao deste mesmo composto correspondente a uma absorbncia de 0,85. 4) Trs mililitros de uma soluo de azul de metileno (sol. A) foram diludos a 7,5 ml com gua destilada (sol. B). A absorbncia da soluo a 550nm foi de 0,4. Como voc determinaria a concentrao da soluo A?

Quando usamos a espectrofotometria como processo de medida, basicamente estamos empregando as propriedades dos tomos e molculas de absorver e emitir energia eletromagntica, em uma das muitas reas do espectro eletromagntico. Os fenmenos fsicos que acompanham a absoro de luz nas vrias regies do espectro eletromagntico e as caractersticas da faixa visvel so ilustradas nas tabelas abaixo. Tabela 1. Caractersticas do Espectro Eletromagntico Radiante (EMR). COMPRIMENTO DE ONDA Fenmeno fsico 0,1 - 100 nm 100 - 400 nm 400 - 700 nm 700nm - 100 m 100m - 30 cm efeito na molcula eltrons de subvalncia excitados a nveis energticos mais altos eltrons de valncia excitados a nveis energticos mais altos vibrao molecular rotao molecular

Regio Raios X Ultravioleta Visvel

Infravermelho Microonda

Tabela 2. Faixa visvel do Espectro Eletromagntico Radiante. Comprimento Cor Cor de onda (nm) absorvida da soluo 380 430 violeta amarelo-verde 430 475 azul Amarelo 475 495 verde-azul Laranja 495 505 azul-verde vermelho 505 555 verde prpura 555 575 amarelo-verde violeta 575 600 amarelo azul 600 620 laranja azul-verde 620 - 700 vermelho verde-azul Ao falarmos em fotometria, pensamos instintivamente em luz. Na realidade, a poro visvel do espectro eletromagntico (EMR) pequena, sendo ela que excita a retina, produzindo nosso mais importante sentido: a viso. Esta relao fotometria-luz desvantajosa porque encaramos o EMR em termos de luz e cor, quando deveria ser considerado em termos de energia, o que a realidade. Essa energia propagada sob a forma de ondas, que poderiam ser esquematicamente consideradas como uma unio de vales e elevaes que partem do ponto de emisso de energia. A distncia entre dois pontos mais altos de duas elevaes contguas denominada comprimento de onda, simbolizado por (Figura 1). Os comprimentos de onda variam de menores que 0,1 nm (raios gama) a maiores que 25 x 107 nm (ondas de rdio). O nanmetro (nm) a unidade empregada atualmente para medida do comprimento de onda. A quantidade de energia inversamente

Fundamento: ESPECTROFOTOMETRIA

Aspectos gerais As tcnicas espectrofotomtricas e fluoromtricas so de grande utilidade em Bioqumica. Sua utilidade abrange atividades de pesquisa cientfica e diversas atividades rotineiras na clnica mdica e em diversas reas industriais. A fotometria clssica , sem dvida, um dos maiores trunfos de que dispe o laboratrio na atualidade. Esta tcnica de medida, continuamente aperfeioada, ainda permanecer durante longo tempo sendo um dos mais teis instrumentos de medida. Com esta tcnica, compostos desconhecidos podem ser identificados por seus espectros caractersticos ao ultravioleta, visvel ou infravermelho. As concentraes de solues de compostos conhecidos podem ser determinadas, medindo-se a absoro de luz em um ou mais comprimentos de onda. Reaes enzimticas podem ser frequentemente seguidas, medindo-se, espectrofotometricamente, o aparecimento de produto ou desaparecimento de substrato. As regies espectrais do ultravioleta e visvel tm mais importncia para uso quantitativo, enquanto que a regio do infravermelho e outras, para elucidao estrutural. Nossa idia apresentar os princpios e operaes bsicas que devem ser parte integrante do conhecimento daqueles que operam com espectrofotmetros. Espectrofotmetros so instrumentos de medida de absoro de luz visvel e ultravioleta na pesquisa bioqumica.

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proporcional ao comprimento de onda e, portanto, os menores comprimentos de onda fornecem os maiores nveis de energia. Desenhe dentro do retangulo abaixo.

A lmpada de tungstnio a mais utilizada fonte de energia radiante para o ultravioleta prximo ao visvel. J a lmpada de hidrognio a melhor fonte de energia radiante constante na regio do ultravioleta. Estas lmpadas requerem uma estabilizao de 15 minutos, aps ligadas, para que possam fornecer quantidade constante de energia radiante. 3. Monocromador: utilizado para isolamento da poro desejada do espectro. Isto possvel utilizando-se de filtros, prismas e grades de difrao. O mais comum o uso de prismas. Os pequenos comprimentos de onda so refratados em grau maior, o que produz um espectro no linear com pequena definio nos grandes comprimentos de onda. 4. Fenda: o prisma necessita receber energia radiante atravs de uma fenda de entrada e o isolamento espectral feito por uma fenda de sada. Os prismas permitem o isolamento de faixas do espectro com diminuta faixa de emisso (0,5 a 1,5 nm).

Figura 1. Propagao da energia radiante. Os aparelhos que medem a absoro de energia eletromagntica radiante por solues e que tm aplicao no laboratrio so: os fotocolormetros, que utilizam filtros compostos para selecionar pores do espectro, e os espectrofotmetros, que utilizam grades de difrao ou prismas na seleo da poro desejada do espectro. Componentes bsicos da fotometria 4

5. Porta-cubeta: recipiente onde se coloca a cubeta contendo a soluo a ser medida. As cubetas so, provavelmente, a poro mais negligenciada do sistema fotomtrico, apesar de serem de grande importncia. Quando no so corretamente cuidadas, contribuem decisivamente no aumento do erro fotomtrico. Existem dois tipos de cubetas: quadrada e redonda. A cubeta quadrada tem faces planas e paralelas. polida ticamente e totalmente isenta dos efeitos de lente ou dos erros de refrao da cubeta redonda. utilizada para medies onde se requer grande preciso e exatido. A cubeta para medidas no ultravioleta, em comprimentos de onda abaixo de 320 nm, deve ser de quartzo, pois nesta regio o vidro absorve energia radiante. A cubeta redonda, por sua vez, no exatamente redonda, no polida, apresentando irregularidades na superfcie. Est sujeita aos erros de refrao e possui efeito de lente. A cubeta redonda muito sensvel ao efeito de posio em relao ao feixe de luz e, na maioria dos casos, contm uma marca orientadora para que seja colocada no porta-cubeta, sempre na mesma posio. Caso esta orientao no seja seguida, pequenos erros de refrao ou de efeito de lente podem ser ampliados, acentuando, portanto, o erro fotomtrico. 6. Detector: utilizado para receber a energia radiante transmitida atravs da soluo e transform-la em energia eltrica. O detector pode ser uma clula fotoeltrica ou um fotomultiplicador. A clula fotoeltrica composta de uma placa de ferro com uma das faces recoberta por uma camada de selnio cristalino. Um condutor eltrico transparente colocado sobre a camada de selnio e funciona como polo negativo. A placa de ferro atua como polo positivo. Os ftons, atingindo a camada de selnio, transferem sua energia para eltrons que passam placa de ferro, atingem o circuito medidor que se liga clula e retornam pelo polo negativo camada de selnio. No h, neste caso, perda de eltrons. O fotomultiplicador se assemelha a uma vlvula e contm um ctodo recoberto de uma substncia que emite eltrons proporcionalmente energia recebida.

6 7 1 3 2 Figura 2. Componentes da fotometria. 5

A Figura 2 esquematiza os componentes bsicos da fotometria: 1. Fonte de energia eltrica: fornecedora de energia regulada, constante e apropriada para a operao do aparelho.

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2. Fonte de energia radiante: capaz de emitir uma mistura de comprimentos de onda.

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7. Circuito medidor: recebe a energia eltrica emitida pelo detector, apresentando-a sob a forma til de medida, isto , absorbncia e/ou transmitncia. Este circuito consiste basicamente em um m permanente em forma de ferradura com uma espiral mvel suspensa entre seus plos. A espiral mvel recebe a corrente fornecida pelo detector e seu eixo est perpendicular ao campo magntico formado pelos dois plos do m permanente. Um ponteiro ligado espiral, movimentando-se sobre uma escala graduada em transmitncia e/ou absorbncia.

menor que 1 (porque I , neste caso, maior que Io). Para evitar operaes com decimais, recorreuse ao artifcio da multiplicao por 100. Assim, quando I e Io so iguais T = 1 = 100%.

Absorbncia a relao logartmica entre a energia incidente (Io) e a energia transmitida (I) pela soluo.

Leis da fotometria Quando um raio de energia radiante atravessa uma soluo, a energia incidente (Io) ser sempre mais intensa que a energia emergente (I). Esta atenuao da intensidade de energia pode ser atribuda a (1) reflexes nas interfaces entre o ar e a parede da cubeta e entre a soluo e a parede da cubeta; (2) disperso por partculas presentes na soluo; e (3) absoro da energia pela soluo em estudo (Figura 3). = = log

Nas aplicaes da fotometria, a absoro o fator primrio na reduo da energia incidente. Quando se usa energia monocromtica (simples comprimento de onda), a frao de radiao absorvida pela soluo, ignorando perdas por reflexo e disperso, ser funo da concentrao da soluo e da espessura da soluo. Matematicamente, esta funo pode ser definida como: = ( . onde: IO = intensidade de energia incidente e = base dos logartimos neperianos (2,303). = absortividade; constante caracterstica da soluo e que depende do comprimento de onda. c = concentrao da soluo. l = espessura da soluo atravessada pela radiao. Portanto, esta frmula estabelece que, quando a energia radiante monocromtica atravessa uma soluo, a quantidade de energia transmitida diminui exponencialmente com (1) o aumento da espessura atravessada e (2) aumento da concentrao ou da intensidade de cor da soluo. O primeiro conceito deriva da Lei de Lambert que pode ser representada pela equao: log =
. )

Io

Figura 3. Absoro da energia radiante que atravessa uma soluo.

Transmitncia a relao entre a energia transmitida (I) e a energia incidente (Io). = Se uma determinada soluo no absorve energia, I e I0 tm o mesmo valor e logo I/I0 ser igual a 1. Conclui-se, assim, que qualquer soluo que absorva energia ter transmitncia como:

J o segundo conceito deriva da Lei de Beer que, por sua vez, pode ser representada

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Estes dois conceitos constituem a Lei de Lambert-Beer, que pode ser representada por:

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log

Seleo da rea espectral Quando se realiza uma medida fotomtrica deve-se utilizar uma faixa do espectro na qual a energia radiante seja absorvida ao mximo, a fim de se obter o mais alto grau de sensibilidade. Uma soluo azul absorve o amarelo com maior intensidade e, portanto, deve ser escolhida a poro amarela para medida de soluo azul. Na maioria das determinaes colorimtricas, utiliza-se sempre uma faixa espectral cuja cor complementar da soluo a ser medida (ver Tabela 2). O melhor processo para avaliar a correta regio espectral para uma medida fotomtrica consiste no preparo do espectro de absoro, que consiste no relacionamento entre as absorbncias e os respectivos comprimentos de ondas.

Como A = log Io/I, ento a equao acima pode ser representada como: = Aplicaes da fotometria A) Curva de calibrao ou curva padro A principal finalidade de uma medida espectrofotomtrica, nas regies do ultravioleta e visvel, avaliar quantidades. Assim, extremamente importante efetuar uma rigorosa calibrao visando obter resultados exatos. Para obter-se uma curva de calibrao alguns aspectos devem ser considerados como: a escolha de uma soluo padro, o estabelecimento de um branco adequado e a seleo da rea espectral.

Obteno da Curva de Calibrao O preparo da curva de calibrao de grande importncia e deve ser bem entendido. Todo analista deve ser capaz de preparar suas prprias curvas de calibrao e interpretar os resultados obtidos. Para se obter o valor da concentrao de substncias cuja concentrao se desconhece, necessrio estabelecer uma relao entre a absorbncia desta soluo em diferentes concentraes com as suas concentraes. Isto se chama curva de calibrao. O procedimento a seguir pode ser usado como processo de preparo da curva: 1. Preparar uma srie de padres exatos, cobrindo a faixa de trabalho usada ou indicada. Usar o padro recomendado para o mtodo a ser calibrado. 2. Dosar todos os padres de acordo com a tcnica recomendada. Efetuar as leituras colorimtricas, usando o branco apropriado para acertar o zero-A ou 100%-T, alm do comprimento de onda recomendado pela literatura ou obtido pela curva de absoro espectral previamente realizada. 3. Ao proceder as leituras em Transmitncia, recorrer tabela de converso, transformando os resultados em Absorbncia. 4. Plotar os resultados em papel milimetrado, relacionando Absorbncia (ordenada) com as concentraes dos padres (abcissa). Examinar bem os pontos e decidir se eles sero cobertos por uma linha reta. Se os pontos aparentemente seguirem uma linha reta, traar uma curva de modo que mais se aproxime de todos os pontos obtidos. A curva no deve ser traada de ponto a ponto, mas interpolando atravs dos pontos.

Solues padres Constituem parte integrante da anlise quantitativa no laboratrio e usadas nas dosagens de amostras desconhecidas. Uma soluo padro apresenta concentrao exata de uma substncia conhecida, que servir como referncia na determinao fotomtrica de concentraes desconhecidas desta mesma substncia. Uma soluo padro tem grande importncia no preparo da curva de calibrao.

Brancos As medidas de absoro de luz devem ser feitas em relao a um branco, uma soluo que contm todos os componentes do experimento exceto o composto que est sendo medido. Quando usamos o branco em fotometria, para estabelecer o zero-Absorbncia ou 100%Transmitncia, estamos realmente usando um sistema simples para eliminar a absorbncia dos reagentes e das cubetas, perdas por reflexo e refrao, e compensao do efeito de lente produzido pelas cubetas redondas. Usamos o ponto zero-A ou 100%-T porque assim eliminamos a necessidade de clculos, pois neste ponto a energia incidente (Io) torna-se igual a 100 (T = I/Io). Em algumas dosagens, obtemos brancos com elevada absorbncia, o que dificulta o acerto do zero em muitos aparelhos. Neste caso, deve-se efetuar a leitura do branco e da amostra acertando o zero com gua destilada, determinando-se a seguir as diferenas entre branco e amostra para os posteriores clculos.

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5. Examinar a curva traada, avaliando se ela tem sensibilidade correta (Figura 5). Abs

Calibrao com fator O fator de calibrao (FC) um artifcio utilizado rotineiramente e seu clculo feito de acordo com o que se segue: Concentrao Figura 5. Tipos de curva de calibrao. (A) curva muito sensvel; (B) curva de sensibilidade ideal e (C) curva pouco sensvel. A curva de calibrao ideal deve ter ngulo de 45 em relao ao ponto de origem. Curvas de ngulos muito agudos ou obtusos no devem ser utilizadas. 6. Se a curva no for ideal devemos procurar um meio de corrigir este problema usando os seguintes processos: a. utilizar uma cubeta com dimetro interno maior ou menor; b. alterar o comprimento de onda. Este processo ir diminuir a sensibilidade em muitos casos, mas um recurso de muita valia; c. aumentar ou diminuir a alquota. Isto deve ser feito com muito cuidado, verificando se no ocorrem alteraes no sistema colorimtrico comprometendo a segurana do mtodo; d. aumentar ou diminuir o volume final da reao, variando os volumes dos reagentes. Evidentemente, uma curva de calibrao no estvel indefinidamente, podendo variar com: (a) variao da sensibilidade do aparelho de medida (fonte de energia radiante, detector, calibrao do comprimento de onda etc) e, (b) com variaes da sensibilidade dos reagentes. Todas as vezes que forem preparados novos lotes de reagentes ou que forem substitudas lmpadas do aparelho, novas curvas de calibrao devero ser realizadas. interessante observar a relao existente entre a curva de calibrao e a Lei de Lambert-Beer. Verifica-se que a Absorbncia (A) diretamente proporcional concentrao (C) quando considera-se e l constantes caractersticas da soluo e da cubeta, respectivamente. De onde se conclui que: = 2 1 = 2 1 =

Outra maneira de se obter o fator de calibrao atravs da prpria curva de calibrao, ou seja, pelo coeficiente angular da reta obtida. = = como tg = sen / cos , ento: = cos 1

De posse do fator de calibrao (FC), possvel obter-se a concentrao da amostra: =

Parte experimental Espectro de absoro do corante azul de Evans Reagente 1) Azul de Evans 1mg% Ligar o espectrofotmetro, deixando aquecer por 15 minutos, para estabilizao. Ajustar para 100%-T com o branco (gua destilada), em comprimento de onda de 400 nm. Encher a cubeta com soluo de azul de Evans 1 mg% at o trao de referncia existente na cubeta (volume mnimo de leitura). Ler na escala de Transmitncia ou Absorbncia, dependendo do aparelho utilizado. Repetir a operao, alterando o comprimento de onda de 10 em 10 nm, sempre ajustando o zero-Absorbncia com o branco, a cada mudana. Encerrar este procedimento quando o comprimento de onda atingir 700 nm.

Calibrao com padro dirio

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prtica considerada correta porque a calibrao no dia-a-dia feita com um padro dosado praticamente nas mesmas condies das amostras. O clculo feito da seguinte forma:

Traar um grfico, colocando na abcissa os comprimentos de onda e na ordenada as absorbncias. Analisar.

Colocar em um tubo de ensaio, 1 ml de soluo de albumina 10 mg/ml e 4 ml do reagente de biureto. Agitar. Deixar em repouso por 10 minutos. Transferir o contedo do tubo de ensaio para uma cubeta. Branco

Curva padro ou de calibrao do azul de Evans Enumerar 6 tubos de ensaio e preparar diferentes diluies da soluo de azul de Evans 1 mg%, como indicado na tabela abaixo. Tubo 1 2 3 4 5 6 azul de Evans 1 mg% (ml) 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 ---gua (ml) 4,0 3,0 2,0 1,0 ---5,0 Concentrao (mg%) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 ---Absorbncia Obteno do espectro Ligar o espectrofotmetro, deixando aquecer por 15 minutos, para estabilizao. Ajustar para 100%-T com o branco apropriado, em comprimento de onda de 400 nm. ----Encher a cubeta com soluo do complexo albumina-biureto at o trao de referncia existente na cubeta (volume mnimo de leitura). Ler na escala de Absorbncia. Repetir a operao, alterando o comprimento de onda de 10 em 10 nm, sempre ajustando o zero-Absorbncia com o branco, a cada mudana. Encerrar este procedimento quando o comprimento de onda atingir 700 nm. Traar um grfico, colocando na abcissa os comprimentos de onda e na ordenada as absorbncias. Analisar. Observao Eventualmente, pode-se obter um espectro de absoro do reagente de biureto, utilizando-se como branco gua destilada. Com isso pode-se demonstrar a capacidade de absoro do reagente de biureto que apresenta uma colorao azulada. Uma comparao entre os espectros do reagente e do complexo com a protena poder ser feita. Colocar em um tubo de ensaio, 1 ml de gua e 4 ml do reagente de biureto. Agitar. Transferir o contedo do tubo de ensaio para uma cubeta.

Ler no obtido atravs do espectro de absoro, contra branco apropriado. Traar um grfico, colocando na ordenada as absorbncias e na abcissa as concentraes. Analisar.

Determinao da concentrao da soluo de azul de Evans Usando o mesmo aparelho, determinar a absorbncia de solues de azul de Evans, de concentraes conhecidas. Determinar, por interpolao, a concentrao do corante. Obter o fator de calibrao (FC) atravs da curva e determinar a concentrao do corante.

Espectro de absoro do complexo protena-biureto Reagentes Soluo padro de albumina 10 mg/ml (1g%) Ragente de biureto: dissolver 3 g de sulfato de cobre heptahidratado e 9 g de tartarato de sdio e potssio em 500 ml de hidrxido de sdio 0,2 N. Em seguida, adicionar 5 g de iodeto de potssio e completar para 1000 ml com hidrxido de sdio 0,2 N. Soro sangneo ou amostras de albumina com concentraes desconhecidas.

Curva de calibrao A curva de calibrao ser preparada com solues de concentraes conhecidas de albumina. Enumerar seis tubos de ensaio e preparar diferentes diluies da soluo de albumina 10 mg/ml, tendo como volume final 1 ml, como indicado na tabela a seguir. tubo concentrao (mg/ml) 2,0 4,0 6,0 albumina 10 mg/ml (ml) gua (ml) biureto (ml) 4,0 4,0 4,0 absorbncia

Amostra

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1 2 3

8,0 4,0 10,0 1,0 4,0 --------1,0 4,0 ----Deixar os tubos em repouso por 10 minutos. Ler as absorbncias dos diferentes tubos, contra o branco, no comprimento de onda obtido anteriormente. Traar um grfico, colocando na ordenada as absorbncias e na abcissa as concentraes. Analisar. Avaliar o fator de calibrao (FC).

4 5 6

AULA PRTICA 5 HIDRLISE CIDA E ENZIMTICA DO AMIDO

Objetivos: Demonstrar a hidrlise do amido Verificar os diferentes tipos de catlise: por ao de cido e enzima especfica. Verificar atravs de reaes especficas o desaparecimento do amido e o concomitante aparecimento de acares redutores durante o curso da hidrlise. Elaborar curvas de tempo tanto para a hidrlise cida como para a enzimtica, por meio da dosagem de acares redutores formados. Reagentes utilizados e Preparo de reativos: 1. Soluo padro de glicose 2 mg/ml em cido benzico 0,1%. 2. Soluo de saliva (durante a aula). 3. HCl concentrado. 4. Soluo de amido: suspender 1 g de amido em 20 ml de gua destilada fria, adicionar com agitao 70 ml de gua destilada fervente. Deixar esfriar e completar o volume para 100 ml. 5. Soluo de lugol: pesar 1,0 g de iodo, 5,0 g de iodeto de potssio e dissolver em 100 ml de gua destilada. 6. Reativo do 3,5-dinitrosalicilato (DNS): dissolver, com aquecimento, 5 g de cido 3,5-dinitro-saliclico em 100ml de NaOH 2 mol/l. Separadamente, dissolver tambm com aquecimento 150g de tartarato duplo de sdio e potssio em 250 ml de gua destilada. Misturar as duas solues e completar o volume para 500 ml com gua destilada.

Dosagem de protenas totais no soro sangneo. Em um tubo de ensaio, pipetar 1,9 ml de gua destilada e 0,1 ml do soro a ser testado. Retirar uma alquota de 1 ml. Acrescentar 4 ml do reagente de biureto e deixar em repouso por 5 minutos. Efetuar a leitura no mesmo comprimento de onda utilizado anteriormente. Determinar a concentrao de protenas totais, utilizando-se da curva de calibrao obtida anteriormente, bem como do fator de calibrao. Para efetuar os clculos levar em considerao a diluio efetuada. Valores Normais: 60 a 80 mg/ml

I.

Curva de calibrao para dosagem de acar redutor pelo DNS: a. Organizar uma bateria de tubos com seis tubos de ensaio b. Identific-los com nmeros de 1-6 c. Adicionar os reagentes conforme a tabela. TUBO GLICOSE 2 mg/ml 1 2 3 4 5 6 0,1ml (0,2 mg) 0,2ml (0,4 mg) 0,4ml (0,8 mg) 0,8ml (1,6 mg) 1,0ml (2,0 mg)

GUA DESTILADA 1,5 ml 1,4 ml 1,3 ml 1,1 ml 0,7 ml 0,5 ml

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d. e. f. g. h.

Em cada tubo adicionar 1,0 ml do reativo DNS Aquecer em banho-Maria fervente por 5 minutos. Resfriar os tubos e adicionar, a cada tubo, 7,5ml de gua destilada. Ler a 540 nm e anotar as absorbncias Traar um grfico colocando as concentraes na abcissa e as absorbncias na ordenada. i. Interpretar os resultados. OBS: em vez de traar o grfico, pode-se calcular a concentrao da amostra de acar redutor, utilizando-se uma das concentraes do padro e aplicando-se a frmula: A amostra/A padro = C amostra/ C padro

Tempo (minutos) Teste do iodo (indicar a intensidade da cor) mg de acar redutor

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INTERPRETAO DOS RESULTADOS Perguntas e exerccios: 5) Com relao natureza dos produtos da hidrlise, diferenciar a ao de um cido mineral e da alfa-amilase salivar sobre o amido. 6) Em que se fundamenta o mtodo do 3,5-dinitrosalicilato para a dosagem de acares redutores? 7) Explicar os resultados obtidos nas hidrlises cida e enzimtica do amido, em funo da evoluo das cores obtidas (aos zero, 5, 10, 20 e 40 minutos) com o iodo. 8) Supondo que a hidrlise cida mineral do amido fosse parcial a ponto de permitir o isolamento preferencial de dissacardeos qual seria a estrutura dos mesmos (tipos de ligaes glicosdicas)?

II.

Hidrlise cida do amido a. Colocar 5 ml de soluo de amido em um tubo de ensaio e lev-lo em banho-maria fervente. Deixar 5 minutos para homogeneizar a temperatura. b. Adicionar ao tubo 0,2 ml de cido clordrico concentrado, misturar e imediatamente retirar 0,2 ml para o teste do iodo e 0,2 ml para o teste de acares redutores. Este o tempo zero da reao. TESTE DO IODO: no tubo com 0,2 ml da amostra adicionam-se 3 gotas de lugol e 10 ml de gua destilada. DOSAGEM DE ACAR REDUTOR: coloca-se em um tubo, 0,2 ml da amostra, 1,3 ml de gua destilada e 1,0 ml do reativo de DNS seguindo-se o procedimento da curva de calibrao.

FUNDAMENTO: Hidrlise cida: por aquecimento de uma soluo de amido em presena de HCl, ocorre hidrlise das ligaes peptdicas. Em funo do tempo de hidrlise so encontrados como produtos intermedirios dextrinas e oligossacardeos, sendo o produto final da hidrlise cida e glicose. As dextrinas, dependendo do seu tamanho e complexidade molecular, desenvolvem diferentes coloraes com o iodo: as dextrinas maiores podem desenvolver cor azul ou prpura, as de tamanho intermedirio do colorao avermelhada e as menores no desenvolvem cor em presena de iodo. A reao de hidrlise do amido pode ser acompanhada pela reao com 3-5-dinitrosalicilato ou outros reagentes que determine a concentrao de acares redutores, que so formados durante o curso de hidrlise. Hidrlise enzimtica: as amilases so enzimas que catalisam a hidrlise do amido e esto amplamente distribudas na natureza: alfa-amilase da saliva e do suco pancretico, beta-amilase do malte, gama-amilase de fungos, etc. A classificao das amilases feita de acordo com o seu modo de ao sobre o homoglucanas, ou seja, as alfa-amilase so endo-enzimas, isto , atuam ao acaso e no interior da molcula, as beta e gama-amilases so exo-enzimas, atuam a partir das extremidades no redutoras do polmero. A alfa-amilase, salivar e pancretica, catalisa a hidrlise das ligaes glicosdicas alfa(1 4) da amilose, amilopectina e do glicognio, produzindo, na clivagem inicial, oligossacardeos de 6 ou 7 unidades de glicose, que so posteriormente degradados a maltotriose e maltose. A maltose no substrato para enzima. A glicose pode aparecer entre os produtos finais da reao, desde que o tempo de ao da enzima sobre as glucanas seja prolongado. Sendo o amido constitudo de um polmero linear (amilose) de glicose, contendo ligaes alfa(1 4) e de um ramificado contendo ligaes alfa (1 4) e alfa (1 6) (Amilopectina), e sendo a amilase uma enzima

c. Imediatamente aps a retirada das alquotas do tempo zero, recolocar o tubo de hidrlise no banho fervente. A seguir nos tempos 5, 10, 20 e 40 minutos de hidrlise, retirar novas alquotas de 0,2 ml para os testes de iodo e dosagem de acar redutor. d. Calcular a quantidade de acar redutor formado (em mg de glicose) no curso da hidrlise, preencher a tabela abaixo e traar um grfico, colocando mg de glucose na ordenada e o tempo de hidrlise na abcissa. Tempo (minutos) 0 5 10 20 40 Teste do iodo (indicar a intensidade da cor) mg de acar redutor e. Interprete os resultados. Hidrlise enzimtica do amido a. Colocar 5 ml da soluo de amido a 1% em um tubo de ensaio e lev-lo em banhomaria a 37C. Deixar durante 5 minutos para homogeneizar a temperatura. b. Adicionar ao tubo 0,2 ml da soluo de saliva diluda, agitar e, imediatamente, retirar 0,2 ml para o teste de acar redutor j descrito na tcnica da hidrlise cida. Esse o tempo zero da reao. c. Recolocar o tubo de hidrlise no banho-maria a 37C. A seguir, nos tempos de 5, 10, 20 e 40 minutos de hidrlise, retirar novas alquotas de 0,2 ml para os testes de iodo e dosagem de acar redutor. d. Calcular a quantidade de acar redutor formado no curso da hidrlise, em mg de glucose, e preencher a tabela abaixo. Traar um grfico colocando mg de glucose na ordenada e tempo da hidrlise na abcissa.

III.

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especfica para ligaes alfa (1 4), sua ao sobre o amido ir produzir, tambm, polissacardeos resistentes ao enzimtica, por causa da presena das ligaes alfa-(1 6).

AULA PRTICA 6 FRACIONAMENTO DAS PROTENAS DO LEITE E SUA DOSAGEM PELO MTODO DO BIURETO

Objetivo: apresentar um exemplo de aplicao prtica da espectofotometria Relao terico-prtica: protenas: estrutura e funo Reativos e material: Soluo de cido clordrico 2% Reagente de Biureto 1 litro de leite. Papel de filtro Tcnica IPrecipitao da casena e dosagem das protenas do filtrado (PF) 1. Transferir 10 ml de leito bovino para um Becker de 50 ml. 2. Adicionar 10 ml de gua destilada morna 3. Com uma pipeta de 2 ml, acrescentar soluo de cido clordrico 2%, gota a gota e com agitao constante, at que se observe a coagulao do leite. Anotar o volume de cido adicionado. 4. Aguardar a sedimentao do precipitado e filtrar o sobrenadante. 5. Determinar a concentrao de protena casena do filtrado pelo Mtodo do Biureto: em um tubo de ensaio (PF) adicionar 1 ml do filtrado + 5 ml do reagente de Biureto. 6. Agitar e deixar em repouso por 10 minutos. 7. Determinar a absorbncia em espectrofotmetro (540nm) 8. Determinar a concentrao de protena (mg/ml) do filtrado utilizando o grfico de calibrao previamente traado na prtica de determinao da concentrao de protenas. 9. Fazer as correes necessrias tendo em vista a diluio da amostra. 10. Expressar o resultado em gramas de protena por 100 ml de leite (g%).

II1. 2. 3. 4. 5.

Dosagem de protenas totais (PT) Diluir 0,5 ml de leite bovino em 9,5 ml de gua destilada. Determinar a concentrao de protenas do leite diludo pelo Mtodo do Biureto. Deixar em repouso por 10 minutos. Determinar a absorbncia em espectrofotmetro (540nm) Determinar a concentrao de protena total do leite diludo (mg/ml) utilizando o grfico de calibrao previamente traado 6. Fazer as correes necessrias tendo em vista a diluio da amostra. 7. Expressar o resultado em gramas de protena por 100 ml de leite (g%) e calcular a porcentagem de casena do leite total.

Interpretao dos resultados

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1) Para a dosagem de protenas do leite utilizou-se 1 ml do mesmo diludo 1:20. A absorbncia desta alquota (tratada com o Reativo do Biureto) determinada em espectrofotmetro a 520nm foi de 0,04. Utilizando a curva de calibrao obtida no laboratrio, durante a aula prtica, calcule a concentrao de protenas totais em gramas por 100 ml de leite puro. MATERIAL: Pipetas de 10 mL Pipetador Gelatina Leite Soluo de clara de ovo a 10% Extratos Vegetais gua destilada Soluo de acetato de chumbo a 10% Soluo de hidrxido de sdio 10 M cido ntrico concentrado Soluo de Hidrxido de sdio 2,5 M Soluo de alfa-naftol Soluo de hipoclorito de sdio

AULA PRTICA 7 IDENTIFICAO DE AMINOCIDOS

Fundamento O leite contm trs protenas importantes: casena, lactoalbumina e lactoglobulina, todas com alto teor de aminocidos essenciais e em propores relativas que variam nas espcies animais. A casena constitui cerca de 85% das protenas totais no leite bovino e cerca de 25% das protenas totais no leite humano. O termo casena se aplica a um grupo heterogneo de protenas que contm grupos de fosfoserina cuja funo ligar clcio. Estas protenas esto presentes no leite na forma de micelas, ou seja, partculas carregadas formadas por agregados de protena, clcio e outros ons presentes, mas tambm como protena globular em soluo. Quatro classes de molculas diferentes podem ser diferenciadas por sua mobilidade eletrofortica: alfa (); beta (); gama () e capa (). Lactoglobulina e lactoalbumina tambm podem ser separadas, por eletroforese, em fraes alfa e beta. Quando o pH do leite abaixa de, normalmente, 6,6-6,9 at pH 4,6 ocorre a precipitao das micelas provavelmente pela perda de cargas negativas importantes para sua estabilidade em soluo. Este processo conhecido como precipitao isoeltrica da casena. Em condies naturais isto acontece, por exemplo, quando se d a colonizao do leite por microrganismos e a fermentao da lactose cido lctico acidifica o meio causando a precipitao da casena. Em condies controladas este processo permite a fabricao de coalhadas, queijos e iogurte.

PROCEDIMENTOS: 1- Reao Xantoproteica: identificao de Tirosina e Triptofano. -Coloque em 4 tubos de ensaio distintos: 1 mL de clara de ovo, 1 mL de Leite, 1 mL de Gelatina e 1 mL de gua destilada. -Adicione em cada tubo de ensaio, na capela de exausto, lentamente, 1 mL de cido ntrico. -Aquecer todos os tubos em banho de gua at o aparecimento de colorao caracterstica. -Retire os 4 tubos do aquecimento e coloque-os na grade. -Adicionar em cada tubo de ensaio 4 mL de hidrxido de sdio. -observe os resultados e tire suas concluses. 2- Reao para sulfurados: identificao de Cistina, Cistena e Metionina. -Coloque em 4 tubos de ensaio distintos: 1 mL de clara de ovo, 1 mL de Leite, 1 mL de Gelatina e 1 mL de gua destilada. -Adicione em cada tubo de ensaio 2 mL de hidrxido de sdio 2,5 M, agite lentamente. -Aquecer todos os tubos em banho de gua at ebulio. -Adicionar em cada tubo de ensaio, sem retirar da gua, 5 gotas de acetato de chumbo. -observe os resultados e tire suas concluses. 3- Reao de Sakaguchi: identificao da Arginina. -Coloque em 4 tubos de ensaio distintos: 1 mL de clara de ovo, 1 mL de Leite, 1 mL de Gelatina e 1 mL de gua destilada. -Adicione em cada tubo de ensaio 0,5 mL de hidrxido de sdio 2,5 M, agite lentamente. -Adicionar em cada tubo de ensaio, 5 gotas de alfa-naftol, agite lentamente. -Adicionar em cada tubo de ensaio, 3 gotas de hipoclorito de sdio, agite lentamente. -observe os resultados e tire suas concluses.

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AULA PRTICA 9 AULA PRTICA 8 IDENTIFICAO E CLASSIFICAO DOS CARBOIDRATOS IDENTIFICAO E PROPRIEDADES DAS PROTENAS
MATERIAL: Pipetas de 10 mL Pipetador Gelatina Leite Soluo de clara de ovo a 10% leo de soja gua destilada Extratos vegetais Soluo de Hidrxido de sdio 2,5 M Soluo de sulfato de cobre II a 0,5% Soluo de acetato de chumbo a 10% Soluo de nitrato de prata a 10% PROCEDIMENTO: 1- Identificao de Protenas - Reao de Biureto. -Colocar em 5 tubos de ensaio distintos: 2 mL de clara de ovo, 2 mL de gelatina, 2 mL de Leite, 2 mL de gua destilada e 2 mL de leo de soja. -Colocar igual volume de soluo de hidrxido de sdio 2,5 M. -Misturar bem, agitando lentamente. -Adicionar, gota a gota, 1 mL de soluo de sulfato de cobre. -Observe os resultados e tire suas concluses. 2- Propriedades das protenas - Ao de sais de metais pesados: acetato de chumbo. -Colocar em 3 tubos de ensaio distintos: 2 mL de clara de ovo, 2 mL de gelatina e 2 mL de Leite. -Adicionar em cada um, gota a gota, 2 mL de acetato de chumbo. -Misturar bem, agitando lentamente. -Observe os resultados e tire suas concluses. 3- Propriedades das protenas - Ao de sais de metais pesados: nitrato de prata. -Repetir o experimento, substituindo o acetato de chumbo por nitrato de prata. MATERIAL: Grade para tubos de ensaio tubos de ensaio bquer de 300 mL para imerso em gua quente grampo para tubo de ensaio pipetas de 10mL pipetador Soluo de monossacardeos a 1% Soluo de Dissacardeos a 1% Soluo de Polissacardeos a 1% Solues de amostras diversas cido clordrico concentrado reagente de Seliwanoff reagente de Fehling A/B soluo de Lugol soluo de hidrxido de sdio 20% PROCEDIMENTO: 1- Teste dos acares redutores: Em tubos de ensaio numerados, coloque 2mL dos carboidratos acima citados separadamente, com 1mL de reagente de Fehling A/B. Coloque os tubos para aquecer em imerso na gua fervente e aguarde at alguns mudarem de cor. Retire os tubos e separe aqueles que reagiram com o reagente de Fehling A/B. Analise os resultados e tire suas concluses. 2- Teste de Lugol: Em tubos de ensaio distintos e numerados, coloque 2mL dos carboidratos acima citados separadamente, com 5 gotas de soluo de Lugol. Agite, analise e conclua. 3- Reao de Seliwanoff: Em tubos de ensaio numerados, coloque no tubo 1, 2mL de glicose, no tubo 2 , 2mL de frutose e no tubo 3, 2mL de galactose. Acrescente em cada um 1mL do reativo de Seliwanoff, agite e deixe cada tubo em gua fervente por 3 minutos, observe os resultados e conclua.

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AULA PRTICA 10 IDENTIFICAO E CLASSIFICAO DOS LIPDIOS

MATERIAL: leo de soja Manteiga Margarina Soluo de permanganato de potssio 2% Clorofrmio gua destilada ter etlico Tubos de ensaio PROCEDIMENTO: 1- Teste de Solubilidade: Em 3 tubos de ensaio, coloque em cada um 2mL de gua destilada e 3 gotas de leo de soja no primeiro, 1 pitada de manteiga no segundo e 1 pitada de margarina no terceiro. Em 3 tubos de ensaio, coloque em cada um 2mL de clorofrmio e 3 gotas de leo de soja no primeiro, 1 pitada de manteiga no segundo e 1 pitada de margarina no terceiro. Em 3 tubos de ensaio, coloque em cada um 2mL de ter etlico e 3 gotas de leo de soja no primeiro, 1 pitada de manteiga no segundo e 1 pitada de margarina no terceiro. Agite os 9 tubos e verifique a solubilidade em cada um deles.Analise, conclua e explique. TUBOS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 2-Teste de Saponificao Em tubos de ensaio previamente preparados com os lipdios citados coloque 2 mL de soluo de soda, agite e observe os resultados. TUBOS 1 2 3 AMIDO 1 % 3 mL 3 mL 3 mL TAMPO 2 mL 2 mL 2 mL Temperatura de incubao 0C 37C 60C Descrio do aspecto e colorao do contedo do tubo de ensaio MATERIAL: Soluo Enzimtica Soluo de amido 1% Soluo de Lugol Soluo de Fehling A/B Soluo de sacarose 1%

AULA PRTICA 11 ATIVIDADE ENZIMTICA

PROCEDIMENTO: 1- Especificidade Enzimtica 1.1- Hidrlise do amido: colocar em um tubo de ensaio 2mL de amido com 2mL de amilase salivar, incubar durante 15 minutos a 37C, testar com Lugol e Fehling. 1.2- Hidrlise da sacarose: colocar em um tubo de ensaio 2mL de sacarose com 2mL de amilase salivar, incubar durante 15 minutos a 37C, testar com Lugol e Fehling. 2- Desnaturao Colocar em 3 tubos de ensaio: Tubo 1 : 2,5mL de gua + 5mL de amido 1% Tubo 2 : 2,5mL de amilase salivar a temperatura ambiente + 5mL de amido 1% Tubo 3 : 2,5mL de amilase salivar fervida por 10 minutos e resfriada + 5mL de amido 1% Incubar os 3 tubos por 10 minutos a 37C Testar com Lugol e Fehling 3- Influncia da temperatura Montar 5 tubos de ensaio de acordo com a tabela a seguir: enzima 1 mL 1 mL 1 mL

Obs: colocar a amilase s depois que os tubos estiverem nos respectivos banhos durante 5 minutos para homogeneidade trmica. Incubar durante 10 minutos, recolhendo alquotas de 1mL a cada 2 minutos e testando com 1 gota de lugol.

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AULA PRTICA 12 IDENTIFICAO DE VITAMINAS

MATERIAL: Vitaminas: A, E, C e B-6. Grades com Tubos de ensaio gua destilada Clorofrmio Soluo de cloreto frrico 1% Soluo de cloreto de antimnio 1% (soluo de Carr Price) Soluo de nitrato de prata 1% Soluo de iodo - Lugol Soluo de bicarbonato de sdio 5% PROCEDIMENTO: 1- Solubilidade: Distribuir em 8 tubos de ensaio os reagentes da seguinte forma: Tubo 1 = 2mL de gua + 2 gotas de vitamina A Tubo 2 = 2mL de gua + 2 gotas de vitamina E Tubo 3 = 2mL de gua + 1 mL de vitamina C Tubo 4 = 2mL de gua + 1 mL de vitamina B-6 Tubo 5 = 2mL de clorofrmio + 2 gotas de vitamina A Tubo 6 = 2mL de clorofrmio + 2 gotas de vitamina E Tubo 7 = 2mL de clorofrmio + 1 mL de vitamina C Tubo 8 = 2mL de clorofrmio + 1 mL de vitamina B-6 Agitar energeticamente cada tubo e verificar a solubilidade de cada vitamina. 2-Identificao de algumas vitaminas 2.1- Identificao da vitamina C: Distribua em 3 tubos de ensaio: 1 = 2mL de vitamina C em soluo + 5 gotas de Lugol 2 = 2mL de vitamina C em soluo + 2mL de nitrato de prata 3 = 2mL de vitamina C em soluo + 2mL de bicarbonato de sdio 2.2- Identificao da vitamina A: Coloque em um tubo de ensaio 2 gotas de vitamina A e dilua com 2mL de clorofrmio, acrescente 2mL de cloreto de antimnio. Agite, observe e conclua. 2.3- Identificao da vitamina B-6: Coloque em um tubo de ensaio 2mL de vitamina B-6 com 2mL de Cloreto frrico. MATERIAL: Bquer de 200mL 200 mL de gua destilada 2 mL de cido clordrico 1 g de amido lugol conta-gotas

AULA PRTICA 13 DECOMPOSIO DO AMIDO

Procedimento: Pese 1 g de amido em um bquer de 200 mL, dissolva em 200 mL de gua destilada e adicione 2 mL de cido clordrico concentrado, dissolva bem o contedo do bquer e aquea at ebulio. Prepare 10 tubos de ensaio numerados, cada um, com uma gota de lugol. Aps o incio da ebulio, pipetar cada 4 minutos, 2 mL da soluo fervente de amido seguindo os tubos de ensaio pela ordem at o dcimo tubo. Observe e anote suas observaes: TUBOS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Descrio do aspecto e colorao do contedo do tubo de ensaio

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AULA PRATCA 14 SEPARAO DE CAROTENO DA CENOURA

Material: Cenoura Acetona ter de petrleo Metanol Etanol Sulfato de sdio anidro Reagente de Carr Price Funil de Decantao Procedimento: Ralar 100g de cenouras frescas Adicionar 150 mL de acetona e 50 mL de ter de petrleo Passar para um funil de decantao, adicionar 50 mL de gua destiladae separar a camada etrea e desprezar a de acetona aquosa. Juntar 30 mL de metanol para retirar a xantofila. Separar a camada de ter de petrleo e lavar com gua. Separar a camada de ter de petrleo e secar com sulfato de sdio. Concentrar aquecendo a 50C num balo com rolha perfurada ligada a um tubo longo conectado com uma trompa de gua. Reduzir o volume at prximo 10 mL. Adicionar 20 mL de etanol e deixar na geladeira at a cristalizao do caroteno. Separar os cristais por filtrao ou centrifugao. Dissolver os cristais com clorofrmio e fazer o teste de Carr Price.

AULA PRTICA 15 DETERMINAO DE CLOROFILA

Objetivos: A presente prtica tem como objetivo o levantamento da curva de absoro da clorofila. A clorofila, encontrada nas plantas, apresenta como caracterstica espectrofotomtrica uma forte absoro para radiao na faixa do visvel. Verificaremos essa caracterstica no presente experimento analisando a variao da absorbncia para diferentes comprimentos de onda (). Material: Espectrofotmetro; Balana Gral e pistilo; Amostra de folhas; Pipetas e pra; Bquerers; Funil e papel filtro; 20mL de lcool PA e 0,01g de CaCO3; Cubeta Procedimento 1. Pesar 0,2 gramas de folhas e colocar no gral 2. Adicionar 0,01g de CaCO3 3. Pipetar 5mL de lcool PA e acrescentar no gral 4. Macere por cerca de 5 minutos 5. Despejar o extrato no funil, contendo o papel filtro 6. Lavar o gral com os 15 mL restantes e despejar no filtro 7. Coloque uma poro do extrato filtrado na cubeta 8. Medir a absorbncia nos comprimentos de 400nm 700nm (escala de 50 nm) 9. Preencher o quadro a seguir 10. Faa um grfico dos resultados (Ax) e identifique o comprimento de onda para a absorbncia, identifique para quais comprimentos de onda ocorrem picos de absorbncia, e quais as cores que so mais absorvidas. 11. Baseado nos resultados do espectro de absoro da clorofila responda seguinte questo. Por que a clorofila verde? Absorbncia (unidades arbitrrias) Absorbncia (unidades arbitrrias) (nm) (nm) 400 560 420 580 440 600 460 620 480 640 500 660 520 680 540 700 Referncias: Raven, P. H., Evert, R. F., Eichhorn, S. E. Biologia Vegetal. 6a edio. Editora Guanabara Koogan, 2001, Rio de Janeiro, RJ.

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AULA PRTICA 16 CLOROFILA - SUBSTITUIO DO MAGNSIO PELO COBRE, FORMAO DE FEOFITINA

Material: Extrato etreo de clorofila anteriormente obtido Soluo de cido clordrico a 25% Soluo de etanol a 95% Acetato de cobre Funil de separao de 100mL Cpsula de porcelana O magnsio da clorofila separado pelo cido clordrico e substitudo pelo hidrognio, formando-se a Feofitna. Procedimento: Tomar 2mL de extrato etreo de clorofila e adicionar 4mL da soluo de cido clordrico no funil de separao. Agitar e deixar 10 minutos. Separar a soluo etrea e deixar evaporar na cpsula de porcelana em banho a 45C at secagem. Dissolver o resduo em etanol a 95%. A soluo verde-oliva. Adicionar alguns cristais pequenos de acetato de cobre e aquecer em banho-maria. A cor desaparece gradativamente passando ao verde intenso. Se toda a clorofila for convertida em feofitina, a soluo no dar mais fluorescncia luz de lmpada ultravioleta.

AULA PRTICA 17 EXTRAO DE GLICOGNIO DO FGADO DE RATO

O glicognio o principal carboidrato de reserva em mamferos, e est presente em quase todas as clulas. O fgado uma fonte especialmente rica em glicognio. Quando estocado, ele representa uma reserva de carboidrato imediatamente disponvel para as necessidades energticas das clulas. O glicognio acumulado no fgado, quando o animal est bem alimentado, porm, rapidamente metabolizado, durante o exerccio muscular e o stress. Para a extrao do glicognio necessrio romper as clulas e precipitar os cidos nuclicos e protenas, o que conseguido pela adio de cido tricloroactico. O glicognio permanece em soluo de onde posteriormente precipitado pela ao de etanol. Maior purificao pode ser obtida por subseqentes re-solubilizaes em gua e novas precipitaes em etanol. Material cido tricloroactico 5% Etanol (95% em gua) ter Soluo de iodo (0,05 N em 3% de iodeto de potssio) Homogeneizador Dessecador Ratos Tcnica Decapitar um rato que tenha sido bem alimentado nos dias anteriores. Dissecar o fgado rapidamente. Retirar uma pequena amostra deixando temperatura ambiente para ser extrada posteriormente. Pesar a poro maior e cort-la em pequenos pedaos com auxlio de uma tesoura. Transferir para o homogeneizador, Adicionar 2 volumes (2 ml por grama de fgado) de cido tricloroactico 5% gela do ao fgado e homogeneizar completamente. Deixar em repouso por 5 minutos. Filtrar em gaze. Lavar com cido tricloroactico e centrifugar (2000 rpm por 3 minutos). Separar o sobrenadante, desprezando o precipitado. Retirar uma gota do sobrenadante e fazer o teste de iodo em um prato de porcelana contendo 2 gotas de iodo. Interpretar. Adicionar 2 volumes de etanol 95% ao sobrenadante obtido. Agitar a mistura e deixar at a formao de precipitado de glicognio. Centrifugar novamente, removendo o sobrenadante. Dissolver o precipitado em um volume mnimo de gua. Re-precipitar o glicognio pela adio de 2 volumes de etanol a 95%. Centrifugar e lavar o precipitado duas vezes com etanol 95%, e logo em seguida, com um pouco de ter. Coletar novamente por centrifugao e espalhar o resduo em vidro de relgio previamente pesado. Deixar em dessecador sob vcuo. Anotar o rendimento do material e estocar at uso.

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Anotaes

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Peso do rato: __________ Peso do vidro de relgio: _________ Rendimento: __________

Peso do fgado: __________ Peso do vidro + glicognio: __________

AULA PRTICA 18 HIDRLISE CIDA DO GLICOGNIO

Tcnica Dissolver 50 mg do glicognio obtido anteriormente, em 10 ml de gua destilada. Agitar bem para uma boa solubilizao. Retirar 1 ml desta soluo (5 mg) e diluir 1:10. Pipetar alquotas de 1 ml desta diluio em um srie de 5 tubos. Adicionar 1 ml de gua e 2 ml de cido clordrico 2 N a cada tubo (concentrao final de cido = 1 N). Colocar em banho-maria fervente, obturando o tubo com bola de gude, para evitar evaporao. Em tempos pr-determinados de 0, 30, 60, 90 e 120 minutos, retirar cada tubo e a seguir, neutralizar o contedo adicionando 1 ml de hidrxido de sdio 4 N. Retirar, de cada tubo, 1 ml e fazer a dosagem de acares redutores, liberados por hidrlise, atravs do mtodo de Somogi-Nelson. Paralelamente a realizao da curva de hidrlise, retirar 2 ml da soluo inicial de glicognio (50 mg/10ml). Adicionar 2 ml de cido sulfrico 2 N e deixar que ocorra a hidrlise, por 120 minutos. Esfriar. Adicionar carbonato de brio at que atinja o pH 5,0. Filtrar e usar para o experimento de cromatografia.

Determinao de acares redutores pelo mtodo de Somogi-Nelson O grupo aldedico dos acares redutores reduz o on cprico cuproso. O cido arsenomolbdico reoxida o xido cuproso formado, que, por sua vez, reduzido a uma mistura de xidos de molibdnio de cor azul. A cor desenvolvida comparada com a de uma srie de solues de glicose de teor conhecido, submetida ao mesmo processo.

Reagentes Reagente de Somogi: dissolver 24 g de Na2CO3 e 12 g de NaKC4H6O6.4H2O em 250 ml de gua destilada. Dissolver 4 g de CuSO4.5H2O em 50 ml de gua destilada e juntar gota a gota, e agitando, soluo de tartarato. Adicionar 16 g de NaHCO3 e dissolver. Paralelamente, dissolver em 500 ml de gua fervente 180 g de Na2SO4. Esfriar e juntar ao balo. Misturar bem e completar o volume a 1000 ml com gua destilada. Deixar em repouso por 5 dias e filtrar, se necessrio. Conservar a 20-25C, para evitar cristalizao. Reagente arsenomolbidico de Nelson: dissolver 100 g de molibdato de amnio em 1800 ml de gua destilada. Adicionar 84 ml de cido sulfrico concentrado. Dissolver 12 g de arseniato de sdio em 100 ml de gua e juntar primeira soluo. Misturar e colocar a 37C, por 48 horas. Conservar em frasco escuro.

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Soluo padro de glicose 100 mg%: pesar exatamente 100 mg de glicose dessecada sob vcuo, por 48 horas. Dissolver em gua destilada. Saturar com cido benzico (0,1 g%) e completar o volume a 100 ml com gua. Conservar em geladeira. Para uso, diluir 1:10 com gua.

AULA PRTICA 19 DOSEAMENTO DE CIDO CTRICO

Material: hidrxido de sdio 0,1 N soluo de fenolftalena - dissolver 1 g de fenolftalena em 100 ml de lcool etlico. Procedimento: 1) Pipetar 20 ml da amostra da soluo amostra em um erlenmeyer. 2) Adicionar 10 gotas da soluo de fenolftalena e titular com soluo de hidrxido de sdio 0,1N. 3) Cada mililitro da soluo de hidrxido de sdio 0,1N corresponde a 0,0070 g de cido ctrico.

Tcnica Preparar uma srie de tubos com concentraes entre 10 e 100 *gramas de glicose por tubo. Completar para 1 ml de gua. Adicionar 1 ml do reagente de Somogi. Colocar em banho-maria fervente, por 10 minutos, obturando o tubo com bola de gude para evitar evaporao. Resfriar e adicionar 1 ml do reagente de Nelson. Completar o volume com gua destilada at 10 ml. Misturar bem. Ler em comprimento de onda de 540 nm contra o branco. Efetuar a extrao, com cido tricloroactico 5%, da pequena poro de fgado que foi separada e mantida anteriormente em temperatura ambiente. Realizar o teste com iodo como descrito anteriormente. Interpretar.
tubo Glucose 10mg% (ml) gua (ml) Glucose g) Somogi (ml) Nelson (ml) gua (ml) absorbncia

1 2 3 4 5 6

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 ----

0,8 0,6 0,4 0,2 ---1,0

20 40 60 80 100 ----

1,0 1,0 1,0 1,0 1.0 1,0

1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

10,0 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0

-----

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AULA PRTICA 20 CINTICA ENZIMTICA

OBJETIVO

g de tartarato duplo de sdio e potssio em 250 mL de gua destilada. Misturar as duas solues e completar o volume para 500 mL com gua destilada. 5. TAMPO FOSFATO 0,05 mol/L pH 6,0; 7,0 e 8,0 Preparado pelo tcnico de laboratrio.

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL - Demonstrar experimentalmente o estudo da cintica enzimtica usando a invertase como enzima modelo. - Analisar o efeito da variao da concentrao de enzima e do tempo de incubao sobre a atividade enzimtica. - Analisar o efeito da variao do pH da soluo tampo e da concentrao de substrato sobre a atividade enzimtica. RELAO TERICO-PRTICA ENZIMAS: estrutura e funo Qumica de Carboidratos REATIVOS Soluo de enzima invertase (0,1 mg protena/mL) Substrato: sacarose 0,2 mol/L Soluo de acetato 0,05 mol/L; pH 4,7 Soluo alcalina de 3,5-dinitrosalicilato Solues: pH 4,0; 5,0; 6,0; 7,0 e 8,0 I. EFEITO DA VARIAO DA CONCENTRAO DO SUBSTRATO PREPARO DOS REATIVOS 1. ENZIMA: isolamento a partir de leveduras: Pesar 50 g de levedura seca (fermento de po), suspender em 250 mL de bicarbonato de sdio 0,15 mol/L e manter em banho-maria a 37 0C durante 6 horas, com agitao ocasional. Centrifugar por 20 minutos a 3.500 rpm. Coletar o sobrenadante, o qual contm a enzima invertase ativa. Como este procedimento uma purificao parcial e no sobrenadante podero ser encontradas enzimas de muitas outras vias metablicas, este material dito extrato bruto. Conservar a temperatura de 4 0C. Normalmente a concentrao de enzima para os ensaios de 0,1 mg de protena/mL. 2. SOLUO DE SACAROSE 0,2 mol/L: usar esta soluo para obter outras solues mais diludas de sacarose. 3. TAMPO ACETATO 0,05 mol/L pH 4,7: a) acetato de sdio 0,05 mol/L b) cido actico 0,05 mol/L Misturar 150 mL da soluo a e 300 mL da soluo b 4. SOLUO DE 3,5-DINITROSALICILATO: dissolver, usando aquecimento, 5 g de cido 3,5dinitrosaliclico em 100 mL de NaOH 2 mol/L. Separadamente, dissolver tambm com aquecimento 150 1. Organizar uma bateria com 6 tubos de ensaio. 2. Identific-los com nmeros de 1 a 6. 3. Fazer diluies da soluo de sacarose 0,2 mol/L para obter as concentraes especificadas na tabela. 4. Adicionar os reagentes, variando a concentrao de sacarose, conforme a tabela abaixo:

REAGENTES

TUBO 1 Tampo acetato (0,05 mol/L pH 4,7) 1,0 gua destilada 1,3 Sacarose 0,01 mol/L Sacarose 0,02 mol/L Sacarose 0,05 mol/L Sacarose 0,1 mol/L Sacarose 0,2 mol/L * Soluo de enzima (0,1 mg/mL) 0,2 * ATENO: a enzima sempre a ltima adio.

TUBO 2 1,0 0,3 1,0 0,2

TUBO 3 1,0 0,3 1,0 0,2

TUBO 4 1,0 0,3 1,0 0,2

TUBO 5 1,0 0,3 1,0 0,2

TUBO 6 1,0 0,3 1,0 0,2

5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16.

Levar a bateria de tubos ao banho-maria a 25 0C. Incubar durante 5 minutos. Adicionar 1,0 mL de soluo de 3,5-dinitrosalicilato a cada um dos tubos. Levar a bateria de tubos para aquecer em banho fervente (100 0C) por 5 minutos. Deixar resfriar por 5 minutos. Adicionar 6,5 mL de gua destilada a cada um dos tubos. Calibrar o espectrofotmetro a 540 nm com o tubo 1. Proceder a leitura das absorbncias dos demais tubos. Calcular a concentrao final da sacarose em cada tubo. Traar o grfico: Concentrao final de substrato (mmol/L) X Absorbncia Traar o grfico do Duplo-Recproco: calcular o km (constante de Michaelis). Interpretar os resultados.

PERGUNTAS E EXERCCIOS 1) Descreva a ao enzimtica da invertase. 2) Como se pode determinar a concentrao dos produtos da reao catalisada pela invertase? 3) Qual o km obtido para a invertase? Qual o seu significado? 4) Que tipo de inibidor a frutose?

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AULA PRTICA 21 SEPARAO ELETROFORTICA DE PROTENAS

OBJETIVO Utilizar eletroforese em gel de poliacrilamida/SDS (SDS-PAGE) para separar as protenas de diferentes amostras e estimar sua concentrao MATERIAIS, EQUIPAMENTOS E REAGENTES SOLUO A : Acrilamida Bis-acrilamida 45 g Acrilamida 1,2 g Bis-Acrilamida gua destilada (at 100 mL) SOLUO B: Tris-HCl pH 8,8 18,17 g Tris (em 50 mL de gua destilada) Ajustar o pH para 8,8 (com HCl) Adicionar SDS (4,0 mL, soluo a 10%) Completar o volume com gua destilada (at 100 mL) SOLUO C: Tris-HCl pH 6,8 6,06 g Tris (em 50 mL de gua destilada) Ajustar o pH para 6,8 (com HCl) Completar o volume com gua destilada (at 100 mL) TAMPO DE CORRIDA: 3,0 g de Tris, 14,4 g de Glicina e 10, 0mL de SDS (10%) Ajustar o volume de gua destilada para 1000 mL TAMPO DE AMOSTRA: SDS 10% (5,0 mL), 2-mercaptoetanol (0,5 mL), Glicerol (2,0 mL), EDTA 0,1M (0,1 mL), Azul de Bromofenol 1% (1,0 mL), Soluo C (2,5 mL) e gua destilada (at 20,0 mL) Tabela 1 Tubo cido Actico 0,1 mM cido Actico 1,0 mM cido Actico 50 mM cido Actico 1,0 M cido Actico 2,0 M PH Turvao (sim? no?) 1 1,0 mL 2 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL 6,7 5,7 4,7 3,7 1,0 mL 2,7 3 4 5

2. Adicionar, a cada um dos tubos, uma alquota (5,0 mL) de soluo de leite em p desnatado (5%, previamente centrifugado). 3. Agitar os tubos e aguardar 5 minutos 4. Separar alquotas de 1,0 mL, distribuir em tubos plsticos pequenos e centrifugar (5000 rpm, 5 minutos, temperatura ambiente). Descartar a fase sobrenadante e ressuspender o precipitado em NaOH 0,1M (1,0 mL) (Observao: utilizar o mesmo procedimento mesmo para os tubos que aparentemente no apresentam precipitado) 5. Aps a dissoluo total do precipitado, separar uma alquota da soluo obtida (10,0 L) para SDS-PAGE B. Eletroforese em gel de poliacrilamida/SDS (SDS-PAGE) B.1. Amostras para aplicar em eletroforese Para este experimento, sero utilizadas como amostras: alquotas de protenas purificadas anteriormente, a partir de uma soluo de leite em p (5%) (Amostras 1 a 5) a soluo contendo o extrato bruto de protenas totais de leite em p (5,0L) para comparao (Amostra 6) Soro Bovino diludo a 10% (10,0L), para comparao (amostra 7) Albumina Bovina a 4,0 mg/mL (5,0L) (padro de peso molecular 66,0 KDa) (padro)

B.2. Eletroforese em Gel de Poliacrilamida/SDS (SDS-PAGE) PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL A. Precipitao no pI 1. Preparar uma srie de tubos de ensaio de acordo com a tabela 1. OBSERVAES E PRECAUES: Acrilamida neurotxica quando no polimerizada. Utilize sempre luvas descartveis para manipular solues contendo acrilamida Evite inalar TEMED (mesmo diludo, pode ser txico) e butanol

III. PROTOCOLO EXPERIMENTAL

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1. Inicialmente montam-se as placas de vidro com os espaadores posicionados. Vedar o espao entre as placas com agarose (1% aquecida em ebulio). Aguardar resfriamento. 2. Preparar a soluo para o gel de resoluo (de corrida): gua destilada (3,7 mL) Soluo A (1,8 mL) Soluo B (1,9 mL) APS (Persulfato de Amnio) (0,12 mL) (soluo a 10%) TEMED (0,45 mL) (diludo 40 vezes) OBS: Adicionar o TEMED por ltimo, pois ele o agente polimerizante deste gel. 3. Utilizar a soluo imediatamente aps o preparo (aplicando-a no espao entre as placas de vidro com uma pipeta. Sero necessrios aproximadamente 4,0 mL de soluo. Aguardar a polimerizao do gel (5 minutos). Ser necessrio deixar aproximadamente 1,0 cm de espao para aplicar o gel de empilhamento OBS: A soluo comea a polimerizar muito rapidamente, necessrio ateno e rapidez para aplicar a soluo no aparato de eletroforese

Figura 1. Esquema do aparato para Eletroforese 4. Preparar a soluo para o gel de empilhamento: gua destilada (1,66 mL) Soluo A (0,3 mL) Soluo C (0,75 mL) APS (Persulfato de Amnio) (0,05 mL) (soluo a 10%) TEMED (0,24 mL) (diludo 40 vezes) OBS: Adicionar o TEMED por ltimo, pois ele o agente polimerizante deste gel. 5. Utilizar a soluo imediatamente aps o preparo, aplicando-a sobre o gel de resoluo (deve preencher um espao de cerca de 1 cm de altura). Colocar um pente plstico para formar os poos onde as amostras sero aplicadas (de acordo com a demonstrao). Sero necessrios aproximadamente 1,60 mL de soluo. Aguardar a polimerizao do gel (15 minutos)

OBS: A soluo comea a polimerizar muito rapidamente, necessrio ateno e rapidez para aplicar a soluo no aparato de eletroforese

6. Montar o aparato para eletroforese (de acordo com demonstrao em sala e a figura 3), adicionar na cuba o tampo de corrida at cobrir os poos do gel para eletroforese. 7. Adicionar tampo de amostra (10 L) a cada uma das amostras, e aquecer (2 minutos, 100 C) para desnaturar as protenas. Resfriar (gelo) e aplicar 15 L nos poos do gel para eletroforese seguindo a ordem da tabela 2.
Tabela 2

Poo no Amostra

1 Padro

2 Amostra 1

3 Amostra 2

4 Amostra 3

5 Amostra 4

6 Amostra 5

7 Amostra 6

8 Amostra 7

8. Aplicar a tenso nos eletrodos do aparato de eletroforese (150 V) e aguardar (30 minutos) at que o corante marcador (Azul de Bromofenol) se aproxime da base do gel 9. Interromper a eletroforese e mergulhar o gel em uma soluo de colorao: Coomassie Blue R (0,25g) em metanol : cido actico : gua (45% : 10% : 45%). Aguardar (5-10 minutos) 10. Substituir a soluo de colorao pela soluo de descolorao: metanol : cido actico : gua (45% : 10%: 45%) (15 minutos) 11. Verificar as protenas coradas, e estimar por comparao, a purificao da amostra

RESULTADOS E DISCUSSO

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Referncias bibliogrficas: LEHNINGER, A. Princpios de Bioqumica. So Paulo: Sarvier, 2007. RENDINA, G. Experimental methods in modern biochemistry. W.B. Saunders Company. 1971. BIOQUMICA, aulas prticas, 6 edio, UFPR editora, 1999.

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