APLICAO DA ESPECTROSCOPIA NIR PARA ANLISE EXPLORATRIA DE PLUMAS E TECIDOS DE ALGODO COLORIDO

GERMANA ROSY MEDEIROS DE SOUSA

UNIVERSIDADE ESTADUAL DA PARABA

CAMPINA GRANDE-PB MARO DE 2013

APLICAO DA ESPECTROSCOPIA NIR PARA ANLISE EXPLORATRIA DE PLUMAS E TECIDOS DE ALGODO COLORIDO

GERMANA ROSY MEDEIROS DE SOUSA

Dissertao apresentada ao Programa de PsGraduao em Cincias Agrrias da Universidade Estadual da Paraba / Embrapa Algodo, como parte das exigncias para obteno do ttulo de Mestre em Cincias Agrrias / rea de Concentrao: Agricultura Familiar e Sustentabilidade.

Orientador: Prof. Dr. Everaldo Paulo de Medeiros

CAMPINA GRANDE-PB MARO DE 2013

 expressamente proibida a comercializao deste documento, tanto na sua forma impressa como eletrnica. Sua reproduo total ou parcial permitida exclusivamente para fins acadmicos e cientficos, desde que na reproduo figure a identificao do autor, ttulo, instituio e ano da dissertao

FICHA CATALOGRFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL-UEPB

A725a

Sousa, Germana Rosy Medeiros de. Aplicao da espectroscopia NIR para anlise exploratria de plumas e tecidos de algodo colorido. [manuscrito] / Germana Rosy Medeiros de Sousa. 2013. 55 f.: il. color. Digitado Dissertao (Mestrado em Cincias Agrrias), Centro de Cincias Humanas e Agrrias, Universidade Estadual da Paraba, 2013. Orientao: Prof. Dr. Everaldo Paulo de Medeiros, Pr-Reitoria de Ps-Graduao e Pesquisa 1. Algodo colorido. 2. Reflectncia difusa. 3. Espectroscopia. I. Ttulo. 21. ed. CDD 633.51

APLICAO DA ESPECTROSCOPIA NIR PARA ANLISE EXPLORATRIA DE PLUMAS E TECIDOS DE ALGODO COLORIDO

GERMANA ROSY MEDEIROS DE SOUSA

Dissertao apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Cincias Agrrias da Universidade Estadual da Paraba / Embrapa Algodo, como parte das exigncias para obteno do ttulo de Mestre em Cincias Agrrias / rea de Concentrao: Agricultura Familiar e Sustentabilidade.

Aprovada em 08 de maro de 2013

Banca Examinadora:

_____________________________________________________________________________ Maria Betania Hermenegildo dos Santos (D. Sc., Qumica Analtica) UFPB

_____________________________________________________________________________ Liziane Maria de Lima (D. Sc., Cincias Biolgicas) Embrapa Algodo

_____________________________________________________________________________ Everaldo Paulo de Medeiros (D.Sc.,Qumica Analtica) Embrapa Algodo Orientador

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A Deus, por sua infinita bondade e misericrdia, fora maior para o meu desenvolvimento como ser humano. Por ter posto em minha vida uma famlia abenoada.

Dedico!
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AGRADECIMENTOS

A Deus, o maior educador diante dos homens que me inspirou na sabedoria e incentivou-me a ser autntica, mostrando o caminho para descobrir os valores da simplicidade, sinceridade e coerncia.

minha filha, Emanuelle Yohanna Medeiros de Oliveira, minha maior fonte de inspirao.

Ao meu esposo, Egli Emanoel pelo seu amor, companheirismo, por acreditar na minha capacidade, pelo seu incentivo e apoio.

Aos Meus pais, Maria Dalva e Josivaldo de Sousa, e meus irmos Jermeson Carllos, Willame Medeiros e Wadna Mayanne, que cuidaram com todo amor de minha filha quando estive ausente, me deram fora para lutar e conquistar meus ideais.

A minha sogra Edilsa e minhas cunhadas Edyla, Ericarla e Eduina pelos conselhos que me ajudaram a superar momentos difceis.

Ao Prof. Dr. Everaldo Paulo de Medeiros, pela oportunidade de realizar este trabalho, apoio, confiana e ensinamentos para a minha formao profissional.

Embrapa Algodo, por disponibilizar suas dependncias e equipamentos na execuo do trabalho.

A Masa e Joenio do Laboratrio de fibras e fios pelo fornecimento das amostras de plumas de algodo colorido.

Ao pesquisador Joo Paulo da Embrapa Algodo por ter conseguido s amostras de tecidos de algodo colorido.

Coordenao do Curso de Cincias Agrrias, em especial ao Prof. Dr. Napoleo Esberard de Macdo Beltro pelo apoio e ensinamentos.
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 Prof. Dra Prof. Liziane Maria de Lima e Prof. Dra Maria Betania Hermenegildo dos Santos, por ter aceitado o convite de fazer parte da Banca.

A todos do Laboratrio de Qumica (LATEQ) Katcilnya, Pollyne, Mrcia, Lgia, Welma, Talita, Lidiane, Iranilma em especial, Betania, Edijane e Clebia, pela colaborao, boa convivncia e amizade.

As minhas colegas Patrcia, Emanuelle, Darlene e Monaliza, pelo companheirismo e amizade, em especial a Taiza Soares pela troca de idias, de conhecimentos, experincias e pelo incentivo a busca de novos conhecimentos.

A Capes pelo fornecimento da bolsa.

A todos que direta ou indiretamente contriburam para a realizao deste trabalho. Obrigada!

SUMRIO

1. INTRODUO .......................................................................................................................... 1 1.1 Objetivos. ............................................................................................................................... 3 1.1.1. 1.1.2. Objetivo Geral ........................................................................................................... 3 Objetivos Especficos ................................................................................................ 3

2. REVISO DE LITERATURA ................................................................................................... 4 2.1 Aspectos gerais e importncia da cultura .............................................................................. 4 2.2. Algodo Colorido ................................................................................................................. 5 2.2.1. BRS 200 Marrom............................................................................................................ 6 2.2.2. BRS Verde ...................................................................................................................... 6 2.2.3. BRS Rubi ........................................................................................................................ 7 2.2.4. BRS Safira ...................................................................................................................... 7 2.2.5. BRS Topzio ................................................................................................................... 7 2.3. Flavonides ........................................................................................................................... 7 2.4. Espectroscopia ...................................................................................................................... 9 2.4.1. Espectroscopia Ultravioleta e Visvel ............................................................................. 9 2.4.2. Espectroscopia no Infravermelho ................................................................................... 9 2.5. Quimiometria ...................................................................................................................... 11 2.5.1. Tcnicas de reconhecimento de padres....................................................................... 11 2.6. Calibrao ........................................................................................................................... 13 2.6.1. Regresso por mnimos quadrados parciais (PLS) ....................................................... 13 3. MATERIAL E MTODOS ...................................................................................................... 14 3.1 Local dos ensaios ................................................................................................................. 14 3.2 Seleo de amostras de plumas e tecidos de algodo naturalmente colorido ...................... 14 3.3. Preparo das amostras de algodo branco tingido artificialmente ....................................... 16 3.4. Instrumentao.................................................................................................................... 17 3.5. Anlises quimiomtricas..................................................................................................... 19 3.6. Isolamento e medio de flavonides ................................................................................. 19
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3.6.1. Instrumentao.............................................................................................................. 19 3.6.2. Reagentes e padro de referncia ................................................................................. 20 3.6.3. Procedimentos Experimentais ...................................................................................... 20 3.6.4. Tempo de extrao de pigmentos ................................................................................. 20 3.6.5. Medio de flavonides ................................................................................................ 20 4. RESULTADOS E DISCUSSO .............................................................................................. 23 4.1. Seleo da regio espectral de trabalho e pr-processamento dos espectros das plumas de algodo colorido e tingidas. ....................................................................................................... 23 4.1.1. Anlise exploratria dos dados ..................................................................................... 25 4.2. Seleo da regio espectral de trabalho e pr-processamento dos dados de tecidos de algodo colorido, adulterados e falsificados .............................................................................. 28 4.2.1. Anlise exploratria dos dados ..................................................................................... 30 4.3. Aplicao do modelo SIMCA as plumas e tecidos coloridos, adulterados e falsificados .. 31 4.4. Tempo de extrao de pigmentos ....................................................................................... 32 4.5. Calibrao multivariada no destrutiva para flavonides ................................................... 33 5. CONCLUSES ......................................................................................................................... 35 REFERNCIAS ............................................................................................................................ 36

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Caractersticas gerais das cinco cultivares de algodo colorido.....................................5 Tabela 2: Regies espectrais do infravermelho............................................................................10 Tabela 3: Lotes de plumas utilizados na anlise...........................................................................15 Tabela 4: Amostras de tecidos utilizados na anlise.....................................................................16
Tabela 5: Resumo da aplicao dos modelos SIMCA (5% de nvel de significncia) para plumas..........31

Tabela 6: Resumo da aplicao dos modelos SIMCA (5% de nvel de significncia) para tecidos entre 400-2500 nm.........................................................................................................................31 Tabela 7: Resultados obtidos para o modelo de calibrao multivariada (PLS)..........................33

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Estrutura bsica dos flavonides.....................................................................................8 Figura 2: Amostras de plumas de algodo colorido.....................................................................14 Figura 3: Amostras de tecidos de algodo colorido......................................................................15 Figura 4: Amostras tingidas com corantes naturais e sinttico.....................................................17 Figura 5: Espectrofotmetro XDS near-infraredRapidContentTMAnalyser.................................18 Figura 6: Clula de quartzo e tampa reflexiva para clula de quartzo..........................................18 Figura 7: Padro de reflectncia...................................................................................................19 Figura 8: Pluma da BRS Verde, sem adio de reagente (A), com adio de reagente (B).........21 Figura 9: Sistema de destilao (C), Pluma da BRS Verde aps duas horas de destilao (D)...21 Figura 10: Espectros brutos das 147 amostras de algodo colorido e tingidas na regio de 4002500 nm.........................................................................................................................................23 Figura 11: Espectros NIR Pr-Processados (SNV) das plumas de algodo colorido. A rea grifada representa a regio em que ocorre a melhor identificao das amostras na PCA.............24 Figura 12: Grfico dos escores de PC1 versus PC2 das amostras das cinco cultivares de algodo colorido: BRS Topzio (Rosa), BRS Marrom (Azul), BRS Safira (Cinza claro), BRS Rubi (Marrom), BRS Verde (Cinza escuro) e amostras tingidas: Bege sinttico (vermelho), Cajueiro roxo (Verde) e Barbatimo (Azul) na regio de 629 a 717 nm....................................................25 Figura 13: Espectros Brutos NIR da BRS Rubi e BRS Safira na regio de 400-2500 nm..........25 Figura 14: Espectros NIR Pr-Processados (Savitzky- Golay) da BRS Rubi e BRS Safira na regio de 400-2500 nm..................................................................................................................27 Figura 15: Grfico dos escores de PC1 versus PC2 da cultivar BRS Safira (Cinza) e BRS Rubi (Marrom) na regio de 1860-1874 nm...........................................................................................28 Figura 16: Espectros brutos dos tecidos de algodo colorido, adulterados e falsificados............29 Figura17: Espectros NIR Pr-Processados (Savitzky- Golay) dos tecidos de algodo colorido.29 Figura 18: Grfico dos escores de PC1 versus PC2 dos tecidos confeccionados com algodo branco, colorido e adulterados: A - algodo branco (crculo amarelo), colorido: B - BRS Verde (crculo verde), C - BRS Marrom (crculo marrom), D - BRS Safira (crculo azul), E- BRS Rubi (crculo roxo) e adulterado: G - Vestido (crculo rosa), F - Blusa (crculo vermelho)..................30 Figura 19: Absorbncias mdias em extraes realizadas em diferentes tempos........................32

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Figura 20: Valores experimentais mdios das triplicatas (Ymedidos) versus valores preditos (Ypreditos) do conjunto de calibrao do modelo de regresso usando quatro variveis latentes....34

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

HCA - Anlise Hierrquica de Agrupamentos MLR - Regresso Linear Mltipla MSC - Correo multiplicativa de sinal NIR - Infravermelho Prximo PCs - Componentes Principais PCA - Anlise de Componentes Principais PCR - Regresso em componentes principais PLS - Regresso por mnimos quadrados parciais R2 Coeficiente de determinao RMSECV Raiz Quadrada dos erros mdios de validao cruzada r Coeficiente de correlao SIMCA - Modelagem independente e flexvel por analogia de classe SNV Transformao Padro Normal de Variao UV-VIS - Ultravioleta e visvel VIS/NIR Vsivel e Infravermelho prximo VL Variveis Latentes

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RESUMO

SOUSA, Germana Rosy Medeiros de, Ms.,Universidade Estadual da Paraba/Embrapa Algodo; fevereiro de 2013. Aplicao da espectroscopia NIR para anlise exploratria de plumas e tecidos de algodo colorido. Orientador: Everaldo Paulo de Medeiros. Durante longos perodos os tecidos produzidos a partir de algodo foram confeccionados apenas com a fibra branca, sendo necessrio o tingimento para a obteno de tecidos coloridos. O algodo naturalmente colorido vem destacando-se como produto de maior valor agregado, por apresentar reduo dos custos de obteno do tecido durante o processo de industrializao e menor impacto ambiental ao longo da cadeia de produo. Existe uma carncia de tcnicas para a determinao rpida e precisa da qualidade e classificao da fibra de algodo, o que pode ser obtido com o uso da espectroscopia de reflectncia VIS/NIR e tcnicas quimiomtricas. Objetivou-se com esse trabalho classificar plumas e tecidos de algodo colorido, usando a espectroscopia VIS/NIR com o mtodo de classificao SIMCA e predio de flavonides por PLS. Foram utilizadas amostras das cinco cultivares de algodo colorido (BRS 200 Marrom, BRS Topzio, BRS Rubi, BRS Verde e BRS Safira) desenvolvidas pela Embrapa, como tambm amostras de algodo branco tingidos artificialmente. Para anlise dos tecidos foram utilizadas amostras confeccionadas a partir do algodo naturalmente colorido e duas amostras consideradas falsas. As medidas espectrais foram registradas na regio de 400 a 2500 nm com trs repeties autnticas para cada amostra. Estas foram realizadas invertendo as faces inferior e superior de cada amostra. Os espectros de reflectncia das plumas foram pr-processados com a tcnica de Variao Normal Padro (SNV), os dos tecidos com algoritmo Savitzky-Golay usando-se primeira derivada e janela de 11 pontos com ajuste por polinmio de segunda ordem. A Anlise de Componentes Principais (PCA) confirmou a tendncia de formao de agrupamentos nas PC1 (98%, 76%) vs PC2 (1%, 13%) entre as cultivares de algodo colorido e tecidos industrializados, respectivamente. O mtodo de classificao SIMCA possibilitou o reconhecimento de amostras de algodo colorido com resultados 100% de classificao correta das classes modeladas ao nvel de estatstico de 1%, 5% e 10%. A calibrao multivariada (PLS) para flavonides na faixa de 80,3 a 383,5 g/ 10 mL forneceu os seguintes parmetros, RMSECV= 32,7 g/ 10 mL, r=0,9465, variveis latentes = 4. Portanto, a espectroscopia VIS-NIR permite analisar de forma no destrutiva e rpida a autenticidade de amostras de plumas e tecidos de algodo colorido e inferir sobre a concentrao de flavonides totais. Palavras-chave: Colored cotton, Reflectncia difusa, Classificao e Anlise multivariada.
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ABSTRACT

SOUSA, Germana Rosy Medeiros de, Ms., State University of Paraba / Embrapa Cotton; February 2013. Application of NIR spectroscopy for exploratory analysis of the plumes and tissues cotton fabrics. Supervisor: Everaldo Paulo de Medeiros.

During long periods fabrics made from cotton were made using only the white fiber dyeing is necessary for obtaining colored fabrics. The naturally colored cotton is standing out as a product with higher added value, by having lower costs of obtaining tissue during the process of industrialization and lower environmental impact throughout the supply chain. There is a lack of techniques for the rapid and accurate determination and classification of quality of cotton fiber, which can be obtained with the use of reflectance spectroscopy VIS / NIR and chemometric techniques. The objective of this work sorting feathers and colorful cotton fabrics, using spectroscopy VIS / NIR with the classification method SIMCA and PLS prediction by flavonoids. Samples of five cultivars of colored cotton (Brown BRS 200, BRS Topaz, Ruby BRS, BRS and BRS Safira Verde) developed by Embrapa, as well as samples of artificially dyed white cotton. For analysis of tissue samples were used prepared from naturally colored cotton and two samples considered false. Measurements were recorded in the spectral region 400-2500 nm with three replicates for each authentic sample. These were performed by inverting the upper and lower faces of each sample. The reflectance spectra of feathers were pre-processed with the technique of Standard Normal Variation (SNV), the tissue with Savitzky-Golay algorithm using first derivative and window setting with 11 points for second-order polynomial. The Principal Component Analysis (PCA) confirmed the trend of clustering in PC1 (98%, 76%) vs. PC2 (1%, 13%) among cultivars of colored cotton fabrics and industrial, respectively. The SIMCA classification method allowed the recognition of colored cotton samples with results of 100% correct classification class of statistical modeled at 1%, 5% and 10%. The multivariate calibration (PLS) to flavonoid in the range from 80.3 to 383.5 mg / 10 mL yielded the following parameters, RMSECV = 32.7 g / 10 mL, r = 0.9465, = four latent variables. Therefore, the VISNIR spectroscopy allows to analyze nondestructively and quickly authenticity of samples of feathers and colorful cotton fabrics and infer the concentration of flavonoids.

Keywords: Colored cotton, diffuse reflectance, Classification and Multivariate Analysis.

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1. INTRODUO

O algodoeiro herbceo ou anual caracteriza-se por ser uma cultura de grande relevncia na agricultura mundial. Sendo as espcies Gossypium hirsutum L.r. latifolium Hutch e G. barbadense L. as mais cultivadas no mundo. A cultura do algodo a principal fonte de matriaprima das indstrias txteis, oferecendo uma diversidade de produtos com grande importncia na economia brasileira e mundial (BELTRO et al., 2011). A maioria das espcies primitivas de algodoeiro possui fibra colorida, dentre as quais destaca-se a de tonalidade marrom, embora j tenham sido descritos algodes nas cores verde, amarela e cinza (FREIRE et al., 1999). Estes algodes, por longos perodos foram descartados pela indstria txtil mundial e at mesmo proibida sua explorao em alguns pases, pois devido aos cruzamentos naturais, poderiam contaminar algodes de tonalidade branca (BARROSO, 2005). A cor expressa na pluma caracterizada pela presena de um gene dominante, enquanto, o branco da fibra fornecido por um gene recessivo. Existem relatos da identificao do algodo colorido pelos povos antigos tais como Astecas e os Incas h mais de 4.500 anos e por outros povos da sia e frica. Depois de muito tempo sem uso do algodo de fibra colorida, o interesse por este surgiu recentemente em alguns pases, dentre eles o Brasil, com o lanamento pioneiro da cultivar BRS 200 Marrom pela Embrapa Algodo em 2000 derivada do algodo moc (BELTRO e CARVALHO, 2004). Trs tipos de pigmentos so distribudos nos tecidos vegetais, clorofila, carotenides e flavonides, este ltimo so os principais pigmentos naturais sintetizados no algodo de fibra colorida (HUA et al., 2007). Durante longos perodos os tecidos feitos a partir de algodo foram confeccionados apenas com a fibra branca, sendo necessrio o tingimento para a obteno de tecidos coloridos. Este processo exige o uso de vrias substncias txicas, incluindo metais pesados, substncias sintticas e derivados do petrleo. Muitos destes produtos qumicos so cancergenos e podem causar reaes alrgicas, problemas dermatolgicos, erupes cutneas e outros problemas de sade relacionados aos seres humanos (DUTT et al., 2004). Alm do impacto ambiental gerado pelos efluentes no tratados e do alto custo para esse processo, h ainda um apelo social, j que a produo de algodo colorido possui forte apelo na agricultura familiar. Por esta razo, o

aumento do cosumo desses produtos tem ocorrido de forma espontnea (BULUT e AKAR, 2012). Os produtos de fibras coloridas tem maior valor de mercado em comparao aos de fibra branca devido as caractersticas e aumento da sustentabilidade ecolgica (BARROSO, 2005). Ademais, tem sido uma das opes agrcolas para retomada da atividade econmica em algumas regies do semirido brasileiro. Por essas caractersticas tem sido um produto passvel de falsificao com fibras de algodo branco tingidas artificialmente, em que podem ser usados produtos naturais ou sintticos. O algodo colorido, produto desenvolvido pela Embrapa, vem sendo objeto de falsificao segundo relatos de produtores e da mdia paraibana. A falsificao envolve o tingimento do algodo branco com produtos com cor parecida as das cultivares de algodo colorido. Para minimizar essa fraude foi desenvolvido na Embrapa Algodo uma marca para a comercializao do produto com o selo de Algodo Cor Natural. Este selo garante a autenticidade e origem do algodo colorido, assegurando desta forma os produtos desenvolvidos pela empresa (BARBOSA, 2011). Assim, tendo em vista a possibilidade de falsificao do algodo colorido, buscou-se neste trabalho uma metodologia para diferenciar plumas e tecidos de algodo colorido, provenientes das variedades da Embrapa Algodo, de amostras tingidas artificialmente com produtos qumicos ou naturais. Vrias tcnicas, incluindo mtodos fsicos e qumicos, tm sido desenvolvidos para classificar as fibras de algodo, porm estas so demoradas e s vezes destrutivas (LIU et al., 2010). A espectroscopia VIS/NIR e tcnicas quimiomtricas uma alternativa a essa demanda, pois rpida, precisa, no destrutiva e de baixo custo para altas demandas. Alm disso, as medidas dispensam o uso de reagentes, atendendo as caractersticas de baixo custo de manuteno e gerao de resduos. A combinao de medidas espectrais e anlises de reconhecimento de padro vem sendo relatadas na literatura como sendo uma tecnologia moderna para classificao de produtos, identificao de fraudes e adulterao, aplicvel ao controle de qualidade de indstrias petroqumicas e farmacuticas (DUTT et al., 2004; HUA et al., 2007; PONTES, 2009; VOGEL, 2002). Nesse contexto, as tcnicas de anlises propostas podem ser vistas como uma alternativa para classificao e identificao de pluma e tecidos de algodo naturalmente colorido com intuito de diferenci-las de produtos falsificados com o uso do algodo branco tingido. A espectroscopia de reflectncia de infravermelho prximo em combinao com a

quimiometria fornece vantagens por ser rpida e com resultados satisfatrios com diversas aplicaes em anlises qumicas de alimentos e tem sido aplicado com sucesso para classificar a farinha de peixe, farinha de carne e amostras de farelo de soja (COZZOLINO et al., 2009), para determinao do teor de protena e acar total em amostras de caf cru (MORGANO et al., 2005; MORGANO et al., 2007), e para predio da cor e ndices fsicos do algodo colorido, possibilitando a realizao de anlises no destrutivas (LIU et al., 2010). Nas indstrias agrcolas, farmacuticas e petroqumicas, como tambm no setor de polmeros (PASQUINI, 2003).

1.1. Objetivos 1.1.1. Objetivo Geral Desenvolver modelos espectrais na regio do visvel e infravermelho prximo para classificao de plumas e tecidos de algodo colorido.

1.1.2. Objetivos Especficos Fazer anlises exploratrias usando as tcnicas de Anlise de Componentes Principais (PCA) da pluma e tecidos de algodo colorido; Classificar amostras de algodo colorido utilizando espectroscopia na regio do visvel e no infravermelho prximo aplicando a tcnica de Modelagem independente e flexvel por analogia de classe (SIMCA); Desenvolver um modelo de calibrao por regresso por Mnimos Quadrados Parciais (PLS) para predio no destutiva do indce de flavonides em fibras de algodo colorido.

2. REVISO DE LITERATURA

2.1 Aspectos gerais e importncia da cultura Dentre 52 espcies de algodo do gnero Gossypium, apenas 4 produzem fibra comercial, o G. herbaceum L., que j foi muito importante no passado, sendo plantada apenas em algumas regies ridas da sia e frica, G. arboreum L. que cultivado na ndia e comercialmente muito importante, G. barbadense L. e Gossypium hirsutum L.r. latifolium Hutch que contribuem com cerca de 8% e 90%, respectivamente da fibra produzida mundialmente, as espcies restantes so silvestres com pouco potencial econmico (CARVALHO, 2008). Os maiores produtores de algodo em pluma so: China, ndia, Estados Unidos da Amrica, Paquisto, Brasil e Uzbequisto. J em relao produo mundial de algodo em caroo o Brasil ocupa o terceiro lugar (FAO, 2011). A rea plantada com algodo no Brasil para safra 2012/2013 est estimada em 976,6 mil de hectares (CONAB, 2013). A cultura do algodo a principal fonte de matria-prima da indstria txtil nacional e mundial, devido as suas caractersticas fsicas que conferem uma grande diversidade de aplicao (SANTANA et al., 2008). A regio centro-oeste responsvel pela maior parte da produo brasileira de algodo, sendo o estado do Mato Grosso o maior produtor brasileiro (IBGE, 2012). O cultivo do algodo colorido estava quase abandonado na metade do sculo XX por causa da baixa produtividade, falta de uniformidade de cores e pobres caractersticas, como fibras de menor comprimento, menos fortes e mais baixos ndices de finura, isso porque a cor requer uma energia adicional para o pigmento, ou seja, para a sntese de flavonides que so o tipo de pigmento dominante nas fibras coloridas (DUTT et al., 2004). Estudos de mercado demonstraram que o consumidor esta cada vez mais exigente quanto qualidade dos artigos txteis (VALLE et al. , 2004). Os programas de melhoramento do algodoeiro visam melhoria da produtividade da pluma e da qualidade da fibra, como comprimento, resistncia e finura, alm de caractersticas especiais como a fibra colorida (FREIRE et al., 2011). Embora as caractersticas do algodo colorido sejam inferiores ao de fibra branca, o algodo naturalmente colorido uma proposta muito boa para aqueles que esto preocupados com sade, tendo conscincia do perigo no uso de produtos qumicos utilizados pelas indstrias

txteis.

2.2. Algodo Colorido O algodo colorido to antigo quanto o de fibra branca. Como comprovam amostras encontradas em escavaes realizadas por arquelogos, onde foram relatados a existncia do algodo colorido no Peru e Paquisto, respectivamente h 2.500 e 2.700 a.C. (VALE et al., 2011). Alguns algodes brasileiros de fibra marrom eram usados como plantas ornamentais at serem explorados em plantios comerciais, em particular no estado da Paraba a partir do ano 2000, mesmo ano em que j tinham sido identificadas 39 espcies silvestres de algodo colorido (FREIRE, 2000; CARVALHO, 2008). O mercado do algodo colorido anteriormente era direcionado apenas a um pblico alvo de pessoas alrgicas, porm, recentemente a sociedade como um todo vem aderindo a esta mentalidade ecolgica; por lei a indstria txtil tem que investir em equipamentos de despoluio e reaproveitamento da gua, mas a grande maioria das indstrias no respeita esta lei e jogam a gua utilizada no processo de tingimento diretamente nos rios. O que pode ser evitado com o uso da fibra naturalmente colorida, pois essa fase excluda, desta forma preservando o meio ambiente (QUEIROGA et al.,2008), alm de economizar cerca de 150 litros de gua por quilo de fibra (BELTRO e ARAUJO, 2004; LI et al, 2012b). Desde 1980, a Embrapa Algodo vem desenvolvendo trabalhos de melhoramento gentico com o objetivo de selecionar cultivares de fibra colorida, produtivas e de boas caractersticas de fibra. At agora, foram lanadas comercialmente cinco cultivares: BRS 200 Marrom, BRS Verde, BRS Rubi, BRS Safira e BRS Topzio conforme Tabela 1 (CARVALHO et al., 2011).

Tabela 1: Caractersticas gerais das cinco cultivares de algodo colorido. Cultivares Cor da Pluma Marrom Claro Verde Marrom Escuro Ciclo (dias) At 3 anos 120 - 140 120 - 140 Produtividade Comp. (Kg) (mm) 1.300 2.146 1.848 28 29,56 25,4 Resist. (gf/tex) 24,3 25,86 24,5 Uniformidade (%) 83 __ 81

BRS 200 Marrom BRS Verde BRS Rubi

Tabela 1, Cont.

BRS Safira BRS Topzio

Marrom Escuro Marrom Claro

120 - 140 120 - 140

1.915 2.825

24 30,4

24,2 31,9

80,1 85,2

Fonte: Adaptado de VALE et al. (2011).

2.2.1. BRS 200 Marrom A BRS 200 Marrom foi primeira cultivar de algodo de fibra colorida, oriunda de algodoeiros arbreos, obtida no Brasil e sintetizada por meio do melhoramento convencional, utilizando o mtodo de seleo genealgica. uma cultivar com ciclo perene, podendo ser plantada nas regies do Serid e Serto, preferencialmente nas localidades zoneadas para o cultivo do algodoeiro arbreo, possui elevada resistncia a seca e produtividade superior s cultivares de algodoeiro moc, como a cultivar CNPA 5M e equivalente CNPA 7H em regime de sequeiro, possui valor de mercado de 30% a 50% superior as fibras de algodo branco (EMBRAPA ALGODO, 2004).

2.2.2. BRS Verde A BRS Verde uma cultivar de algodoeiro herbceo, que surgiu de estudos iniciados em 1996, do cruzamento entre um material de fibra verde, o Arkansas Green, introduzido dos EUA, com a cultivar de fibra branca CNPA 7H, de ampla adaptao regio Nordeste e fibra de boa qualidade (CARVALHO et al., 2009b). indicada para plantio no Nordeste, podendo ser cultivada em outras regies, em reas livres de doenas, pois susceptvel s mesmas. A cor verde da fibra tem uma particularidade que a reduo ou a perda parcial dessa cor no campo, caso o produtor retarde a colheita, deixando os capulhos expostos ao sol por vrios dias. Para evitar que isso acontea, aconselhado fazer duas colheitas (VALE et al., 2011). Esta cultivar indicada preferencialmente para fiar fios grossos, como a confeco de jeans e outros artigos artesanais, devido a sua baixa resistncia luz solar j que ocorre um pequeno desbotamento com o tempo (CARVALHO et al., 2009b).

2.2.3. BRS Rubi Ela o resultado do cruzamento de material introduzido dos EUA de fibra marromescura com a CNPA 7H. Sua fibra possui uma cor marrom-escura ou marrom-avermelhada (EMBRAPA ALGODO, 2006). A BRS Rubi uma cultivar de algodoeiro herbceo ou anual que pode ser explorada na regio Nordeste em regime de sequeiro, nos locais zoneados para este tipo de algodo e em regime irrigado (CARVALHO et al., 2009a ).

2.2.4. BRS Safira A BRS Safira o resultado do cruzamento de material introduzido dos EUA de fibra marrom-escura e a CNPA 87-33. Sua fibra possui uma cor marrom-escura ou marrom avermelhada, porm em tonalidade mais clara que a fibra da BRS Rubi, herbcea ou anual, podendo ser cultivada em regime de sequeiro, nas reas zoneadas para este tipo de algodo e em regime irrigado (CARVALHO et al., 2009c).

2.2.5. BRS Topzio A BRS Topzio uma cultivar de algodo herbceo, de fibra marrom-clara, derivada do cruzamento entre as cultivares Suregrow 31 e Delta Opal. Principal caracterstica desta cultivar a colorao da fibra marrom bem clara com grande uniformidade. Destaca-se por possuir alta porcentagem de fibra, alta uniformidade e alta resistncia, que lhe conferem excelentes caractersticas, comparvel s cultivares de fibras brancas e superior s demais cultivares de fibras coloridas (VIDAL NETO et al., 2010).

2.3. Flavonides Os flavonides consistem em um grande grupo de substncias polifenlicas de baixo peso molecular, de ocorrncia natural em vegetais, frutas, nozes, sementes, caules, flores, ch, vinho, e so uma parte integrante da dieta humana. Mais de 6000 flavonides foram caracterizados na natureza, mas a sua variedade e quantidade pode variar devido s diferenas no ambiente, maturidade e condies de crescimento (KIM et al., 2007; WANG et al., 2010; SANDHAR et al., 2011). Estruturalmente, os flavonides constituem substncias aromticas, com uma estrutura bsica que contm 15 carbonos organizados em dois anis aromticos, ligados por uma cadeia de

trs carbonos, os flavonides so classificados de acordo com sua estrutura qumica (COOK e SAMMAN, 1996; TAIZ e ZEIGER, 2004). A Figura 1 mostra a estrutura genrica de flavonides e o sistema de numerao utilizada para distinguir as posies de carbono em torno da molcula.

Figura 1: Estrutura bsica dos flavonides (COOK e SAMMAN, 1996).

A grande diversidade estrutural dos flavonides explicada pelas modificaes que estes compostos podem sofrer, tais como: hidroxilao, metilao, acilao e glicosilao dentre outras (LOPES et al., 2000). Neste grupo esto inclusos as antocianinas, as flavonas, os flavonis e as isoflavonas (TAIZ e ZEIGER, 2004). As antocianinas so flavonides glicosilados pigmentados, responsveis pela maioria das cores vermelha, rosa, prpura e azul das plantas, do cor s frutas, verduras e como tambm conferem benefcios a sade humana, elas podem agir como antioxidantes, fitoalexinas ou como agentes anti-bacterianos (KONG et al, 2003; SANDHAR et al., 2011; XIE, 2011). As flavonas e os flavonis so um grupo de protetores, absorventes de luz ultravioleta, que podem tambm atrair para as flores insetos polinizadores e quando secretados por razes de leguminosas so intermediadores no solo de interaes com simbiontes fixadores de nitrognio, j as isoflavonas so o grupo de flavonides com atividade antimicrobiana (TAIZ e ZEIGER, 2004; HASSAN e MATHESIUS, 2012). Os pigmentos responsveis pela cor do algodo colorido podem pertencer classe dos flavonides. Estes tm sido objeto de estudos, quanto as suas propriedades biolgicas, farmacolgicas e qumicas (KIM et al., 2007; HUA et al., 2007). Em experimentos desenvolvidos por anlise de expresso observou-se que a acumulao do pigmento em algodo de fibra marrom pode ser causada pela oxidao de proantocianidinas (LI et al., 2012a; XIAO et

al., 2007). Uma anlise protemica comparativa de fibra de algodo de cor marrom demonstrou o papel crucial de flavonides na sntese de pigmento em algodo colorido (LI et al, 2012b). A qualidade da fibra depende de vrios fatores fisiolgicos e parmetros bioqumicos. O algodo colorido possui uma alta concentrao de flavonides o que reduz a quantidade total de hidratos de carbono que de outra forma poderia ser utilizado para a sntese de celulose, j que a maior qualidade do algodo de fibra branca esta relacionado ao alto teor de celulose, quando comparado ao de fibra colorida (DUTT et al., 2004; HUA et al., 2007; YUAN et al., 2012).

2.4. Espectroscopia a interao de qualquer tipo de radiao eletromagntica com a matria, por meio da anlise do espectro observado podemos obter informaes relevantes sobre a estrutura molecular e modo de interao entre molculas. De acordo com o valor de energia da radiao eletromagntica, as transies entre os estados podem ser de vrios tipos, dos quais as principais so as transies eletrnicas, vibracionais e rotacionais (OLIVEIRA, 2001).

2.4.1. Espectroscopia Ultravioleta e Visvel Neste tipo de espectroscopia utiliza-se a radiao eletromagntica na faixa espectral de 200 e 780 nm. Quando exposta a essa radiao, a molcula de um composto pode sofrer transies eletrnicas por ocasio da absoro de energia quantizada. Isto requer que a molcula contenha pelo menos um grupo funcional insaturado (NUNES, 2008). Os espectros eletrnicos de absoro apresentam sobreposio de bandas associadas a duas ou mais substncias presentes em uma amostra. Essas caractersticas decorrem da natureza alargada das bandas e da modesta correlao entre o espectro e a estrutura molecular. Onde, substncias com estruturas moleculares muito diferentes, mas contendo os mesmos grupos que absorvem radiaes (cromforos), podem apresentar espectros UV-Vis com perfis semelhantes e bandas localizadas nas mesmas regies de comprimentos de onda (SKOOG et al., 2009). A dificuldade da interpretao das matrizes complexas geradas torna necessrio a utilizao de mtodos quimiomtricos para auxiliar na elucidao dos perfis espectrais (VERAS et al., 2011).

2.4.2. Espectroscopia no Infravermelho

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A faixa da regio do infravermelho compreende aproximadamente de 780 nm a 100000 nm. A Tabela 1 ilustra a poro desta faixa no espectro eletromagntico e a sua diviso em trs partes (SKOOG et al., 2009).

Tabela 2: Regies espectrais do infravermelho. Comprimento de onda Nmeros de onda (), nm , cm-1 780 a 2500 12800 a 4000 Prximo 2500 a 5000 4000 a 200 Mdio 5000 a 100000 200 a 10 Distante Fonte: Adaptado de SKOOG et al. (2009). Regio Frequncia (v), Hz 3,8 x1014 a 1,2 x 1014 1,2 x 1014 a 6,0 x 1012 6,0 x 1012 a 2,0 x 1013

A condio para que haja absoro da radiao infravermelha que uma molcula apresente uma variao no momento de dipolo durante seu movimento vibracional ou rotacional. Molculas diatmicas heteronucleares, como por exemplo, o cloreto de hidrognio (HCl) possuem um momento de dipolo significativo, ou seja, possuem modos vibracionais de absoro ativos no infravermelho. O contrrio ocorre em espcies homonucleares, como O 2, N2 ou Cl2, na qual a vibrao de dois tomos idnticos, no altera a simetria eltrica ou o momento de dipolo, tendo como consequncia a no absoro da radiao infravermelha (PEREIRA, 2007; VOGEL, 2002).

2.4.2.1. Espectroscopia no Infravermelho prximo (NIR) O Infravermelho prximo trata-se da regio posterior a do visvel, a espectroscopia no NIR apresenta uma ampla diversidade de aplicao, tem sido utilizada em diversas reas como agrcola, mdica, ambiental, petroqumica e farmacutica. Quando comparada a outros mtodos qumicos, a espectroscopia NIR tem mais vantagens, pois, em geral, no precisa de preparao de amostras, no gera resduo, rpida e no destrutiva (GONZAGA, 2006). O uso da espectroscopia NIR tem como objetivo principal obter informaes qualitativas ou quantitativas de uma amostra, por meio da interao das ondas eletromagnticas do infravermelho com os constituintes da amostra, compreende as bandas de absoro correspondentes a qualquer molcula contendo as ligaes C-H, O-H, N-H e S-H, sem qualquer pr-tratamento da amostra (PASQUINI, 2003). Esta tcnica permite a anlise no destrutiva das amostras. Sendo muito relevante, pois

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quanto mais tratamento a amostra sofrer, antes de obter uma resposta final, maior ser a possibilidade de erros na anlise, alm da habilidade de extrair informaes quantitativas, quimicamente significativas, via uso de tcnicas estatsticas multivariadas (CAMOLESI, 2009). O infravermelho prximo (NIR) uma tcnica potencialmente til, tem sido usado para obter informaes estruturais sobre celulose de algodo, para fazer a previso de avaliaes quantitativas da qualidade do algodo, como tambm nos processos de controle de qualidade de produtos txteis(CLEVE et al, 2000; LIU et al., 2010). A espectrometria NIR apresenta-se como uma ferramenta eficaz para determinaes analticas. Entretanto, as bandas espectrais de baixa intensidade e muito sobrepostas, geradas por matrizes complexas, dificultam a obteno de uma boa correlao entre grupos de tomos presentes numa molcula e a sua composio nas amostras. Para tratamento das informaes dos espectros gerados, necessria a utilizao de ferramentas quimiomtricas, a qual utiliza mtodos ou tcnicas estatsticas para interpretar melhor os dados obtidos (NUNES, 2008; PEREIRA, 2007).

2.5. Quimiometria Quimiometria um ramo da qumica analtica que utiliza tcnicas matemticas e estatsticas para extrao de informaes relevantes a partir de dados analticos, como os dados espectrais NIR, facilitando assim a interpretao dos mesmos (PASQUINI, 2003; NASCIMENTO et al., 2010). A quimiometria abrange planejamento e otimizao de experimento, calibrao univariada e multivariada, reconhecimento de padres, entre outros (NUNES, 2008). Na utilizao do NIR para aplicaes qualitativas, deve-se utilizar as tcnicas de reconhecimento de padro, cuja finalidade identificar as semelhanas e diferenas em diferentes tipos de amostras, comparando-as entre si. As tcnicas de reconhecimento de padro podem ser feitas por meio de duas abordagens: mtodos supervisionados ou no supervisionados (PASQUINI, 2003).

2.5.1. Tcnicas de reconhecimento de padres

2.5.1.1. No supervisionadas

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Tm a finalidade de verificar a formao de uma classe de amostras com caractersticas semelhantes, sem utilizar o conhecimento prvio dos membros das classes. Dentre essas tcnicas destaca-se a anlise de componentes principais (PCA - Principal ComponentsAnalysis) e anlise de agrupamentos hierrquicos (HCA - Hierarchical Clusters Analysis) (PONTES, 2009). A PCA uma manipulao matemtica dos dados originais, com objetivo de se obter o mximo de informaes relevantes, por meio da combinao linear das variveis originais, se constitui um novo conjunto de variveis que apresentam ortogonalidade entre si, denominadas de componentes principais (PCs), organizadas em ordem decrescente de importncia, a primeira PC (PC1) descreve a mxima varincia dos dados originais, a segunda PC (PC2) descreve a mxima varincia que no foi considerada pela PC1, e as prximas PCs descrevem a mxima varincia restante (CORREIA e FERREIRA, 2007). Cada amostra representada por um ponto no espao multidimensional, formando agrupamentos que apresentem caractersticas semelhantes (NASCIMENTO et al., 2010). As coordenadas das amostras no novo sistem a de eixos dos PCs so chamadas de escores, que mostra a similaridade e diferenas entre as amostras e a contribuio que cada varivel original exerce sobre uma determinada PC denominada peso (loading), este que indica quais variveis so importantes para descrever a varincia dos dados. Os pesos podem ser definidos como o cosseno do ngulo entre o eixo da varivel e o eixo da PC (DANTAS, 2010; FERREIRA et al., 1999).

2.5.1.2. Supervisionadas So modelos em que so utilizados uma base de dados obtidas a partir de informaes preliminares sobre um conjunto de amostras, so usadas para prever se uma amostra desconhecida pertence a uma classe conhecida, a tcnica mais utilizada a modelagem

independente e flexvel por analogia de classes (SIMCA - Soft Independent Modeling of Class Analogies), que usa PCA para cada classe definida e testa se as amostras analisadas se enquadram em uma, a vrias ou nenhuma das classes (DANTAS, 2010; VERAS et al., 2011). Os resultados da classificao SIMCA podem ser expressos por meio de tabelas de classificao em que a presena de amostra na classe analisada sinalizada por um asterisco e sua ausncia sinaliza que a amostra no foi classificada para aquela classe ou grfico bidimensional Si x Hi, em que Si a raiz quadrada da varincia residual que representa a distncia da amostra ao modelo da classe selecionado, e Hi, que a distncia da amostra

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projetada ao centro do modelo, tambm conhecida como influncia ou medida de Laverage (BEEBE et al., 1998).

2.6. Calibrao A relao entre o resultado da resposta instrumental com a propriedade de interesse da amostra denominada calibrao. Quando se tem uma relao matemtica entre uma varivel dependente e uma nica varivel independente a calibrao dita univariada. J quando a relao entre mais de uma varivel denomina-se multivariada. A equao matemtica que descreve a relao o modelo de calibrao e a representao grfica chamada de curva analtica ou curva de calibrao. Os mtodos de calibrao multivariada podem ser: Regresso em componentes principais (PCR), Regresso por mnimos quadrados parciais (PLS) e Regresso Linear Mltipla (MLR) (NUNES, 2008). O processo de calibrao consiste geralmente em duas etapas: a descritiva, que usa concentraes conhecidas para construir um modelo que relaciona a grandeza medida, com a concentrao da espcie de interesse e a preditiva a qual usa esse modelo para pressupor concentraes de novas amostras, a partir dos sinais analticos medidos por elas (PIMENTEL e NETO, 1996).

2.6.1. Regresso por mnimos quadrados parciais (PLS) A modelagem PLS utiliza tanto a informao da matriz de dados X (variveis independentes - dados espectrais) como da matriz Y (variveis dependentes - propriedade a serem analisada, concentrao), obtendo-se novas variveis denominadas variveis latentes, fatores ou componentes (equivalentes as PCs na PCA). Para construir desta forma o modelo de calibrao, este usado para fazer estimativa parmetro em novas amostras (NUNES, 2008). O mtodo PLS foi escolhido para este trabalho devido ser o mais utilizado, tendo sido empregado com sucesso na determinao de flavonides em folhas de Ginkgo biloba (YONG et al., 2012).

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3. MATERIAL E MTODOS

3.1 Local dos ensaios Este trabalho foi realizado no Laboratrio Avanado de Tecnologia Qumica (LATECQ) da Embrapa Algodo, em Campina Grande, PB. 3.2 Seleo de amostras de plumas e tecidos de algodo naturalmente colorido Foram utilizadas para anlise explortoria da pluma, amostras de cinco cultivares de algodo colorido BRS 200 Marrom, BRS Topzio, BRS Rubi, BRS Verde e BRS Safira todas desenvolvidas pela Embrapa Algodo (Figura 2) e amostras tingidas com corantes naturais e sinttico.

Figura 2: Amostras de plumas de algodo colorido. Foto: Germana Rosy M. de Sousa, Campina Grande, 2012.

As amostras utilizadas foram oriundas de lotes independentes (Tabela 3). De cada lote foram retidas trs amostras de pontos diferentes, totalizando 147 amostras, as leituras foram realizadas com duas repeties para cada amostra, invertendo-se as faces inferior e superior das amostras de plumas.

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Tabela 3: Lotes de plumas utilizados na anlise. Amostras BRS 200 Marrom BRS Topzio BRS Rubi BRS Verde BRS Safira Barbatimo Cajueiro roxo Bege sinttico Total Nmero de lotes 6 7 9 10 8 3 3 3 49

As amostras de tecidos foram oriundas de peas comerciais de algodo naturalmente colorido com selo de Algodo Cor Natural, o qual assegura os produtos desenvolvidos pela Embrapa, garantindo dessa forma sua autenticidade e origem (Figura 3) e duas amostras com suspeitas de serem adulteradas.

Figura 3: Amostras de tecidos de algodo colorido. Foto: Germana Rosy M. de Sousa, Campina Grande, 2012.

Foram analisadas 283 amostras de tecidos independentes de lotes distintos e do mesmo lote em que caracterizem heterogeneidade do tecido (Tabela 4), as leituras foram realizadas com duas repeties para cada amostra, invertendo-se as faces inferior e superior das amostras de tecidos.

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Tabela 4: Amostras de tecidos utilizados na anlise. Tecidos Ribana Verde Ribana Safira Ribana Marrom Ribana Verde (Sem lavar) Ribana Crua Brim Colono Algodozinho P Algodozinho D Linho Marrom Linho Verde MR Marrom MR Rubi MR Crua Piquiti Marrom Piquiti Crua Malha Verde Malha Crua Moletinho Crua Moletinho Rubi Blusa Vestido Total Nmero de amostras 14 16 18 17 13 16 16 15 14 14 15 12 12 16 12 13 12 15 16 3 46 283

3.3. Preparo das amostras de algodo branco tingido artificialmente Amostras de algodo branco oriunda da cultivar BRS 8H foram tingidas com tintura sinttica (bege sinttico) e com pigmentos naturais (barbatimo e cajueiro roxo), como observase na Figura 4. Todas as amostras foram tingidas em triplicata (VELOSO, 2012). O tingimento foi realizado conforme procedimento descrito por Manhita et al. (2011). O primeiro passo consiste em tratar uma amostra de 4,0 g de pluma de algodo com uma soluo

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fixadora (mordente) contendo 1,0 g de cloreto de sdio e 200 mL de gua em ebulio durante 30 min. Logo aps, a pluma foi removida da soluo, lavada com gua destilada e seca ao abrigo da luz ambiente. Em seguida, s amostras de pluma de algodo foram coradas da seguinte maneira: cada banho corante foi preparado com 0,5 g de material seco triturado imerso em 50 mL de gua destilada durante 2 horas a 90 oC e depois filtrada a vcuo. Aps isto, a pluma tratada com a soluo fixadora foi adicionada soluo do corante e mantida a 90 C durante 30 min. Aps o procedimento de tingimento, todas as amostras de algodo foram removidas, lavadas com gua destilada e secas em placas de petri sobre papel toalha ao abrigo da luz. J para as amostras tingidas com corante artificial foi utilizada a metodologia recomendada pelo fabricante, na qual a amostra ficou submersa na soluo corante por 30 minutos em ebulio.

Figura 4: Amostras tingidas com corantes naturais e sinttico. Foto: Germana Rosy M. de Sousa, Campina Grande, 2012.

3.4. Instrumentao As medidas espectrais de reflectncia difusa na regio do visvel e infravermelho prximo foram adquiridas por meio do espectrmetro VIS/NIR modelo XDS Analyser (Foss Analytical, Hogans, Sweden) como ilustrado na Figura 5.

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Figura 5: Espectrofotmetro XDS near-infraredRapidContentTMAnalyser da FOSSAnalytical. Foto: Germana Rosy M. de Sousa, Campina Grande, 2012.

Na Figura 6 observa-se a clula de quartzo usada para leitura da amostra a ser analisada e a tampa reflexiva usada para bloquear a radiao espria do ambiente.

Figura 6: Clula de quartzo e tampa reflexiva para clula de quartzo. Foto: Germana Rosy M. de Sousa, Campina Grande, 2012.

Para o registro do sinal do branco, utilizou-se um padro de reflectncia conforme observado na Figura 7.

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Figura 7: Padro de reflectncia. Foto: Germana Rosy M. de Sousa, Campina Grande, 2012.

3.5. Anlises quimiomtricas A partir dos espectros de reflectncia gerados em cada comprimento de onda foram empregadas as tcnicas de pr-processamento dos espectros e a anlise multivariada. Foram testados alguns tipos de pr-processamento (correo multiplicativa de sinal MSC, para minimizar os efeitos de espalhamento da luz, o mtodo de suavizao de SavitzkyGolay com derivada de primeira ou segunda ordem em janela com no mnimo 11 e mximo de 25 pontos com ajuste por polinmio de segunda ordem e o mtodo de Variao Normal Padro SNV). A tcnica multivariada de reconhecimento padro no supervisionadas (PCA Anlise de Componentes Principais) foi aplicada para a anlise exploratria das amostras de algodo colorido e tingidas, a tcnica supervisionada SIMCA (Modelagem Flexvel por Analogia de Classes) foi usada para classificao de amostras de origem natural e artificialmente tingidas. A PCA foi executada no modo de validao cruzada completa observando a faixa de 400 a 2500 nm. Essa mesma faixa espectral foi empregada na etapa de calibrao multivariada de flavonides em que usou-se a tcnica de regresso por PLS (PLS - Mnimos Quadrados Parciais) com validao cruzada completa. As anlises quimiomtricas foram executadas no software The Unscrambler X.2 com a finalidade de modelar e prever as variveis fsicas e qumicas a partir de seus espectros de reflectncia.

3.6. Isolamento e medio de flavonides 3.6.1. Instrumentao

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Empregaram-se espectrofotmetro modelo Genesys 10 (Analtica), cubeta de quartzo de 10 mm de caminho ptico (Sorbline). Nas medidas de massas foi utilizada balana analtica com preciso de 0,1 mg.

3.6.2. Reagentes e padro de referncia Os solventes usados para quantificar flavonides de algodo colorido foram todos de grau analtico: HNO3 (Vetec), etanol P.A. (FMaia), NaNO2 (Vetec ), Al(NO3)3 (Vetec), NaOH (Vetec). A rutina (Sigma-Aldrich, Shanghai, China, No. R5143) foi utilizada como padro para determinao de flavonides.

3.6.3. Procedimentos Experimentais Para construo das curvas de calibrao foi preparada uma soluo etanlica de rutina a 0,2 mg/ mL, sendo retiradas 5 alquotas 200, 900, 1600, 2300 e 3000 L da soluo estoque. Esses volumes corresponderam as concentraes de 40, 180, 320, 460, e 600 g para diluio em balo volumtrico de 10 mL. Antes da aferio total foram acrescentados 4 mL de etanol (30% v/v), 300 L NaNO2 (2,9 mol/L). Homogeinizou-se a mistura e esperou-se um tempo de equilbrio de 5 min antes de adicionar 300 L Al (NO3)3 (0,47 mol/L). Seis minutos depois adicionou-se etanol (30%, v/v) para tornar o volume final de 10 mL. Aps 10 min em temperatura de 25oC, as leituras foram realizadas em espectrofotmetro a 510 nm. Para ajuste da linha de base utilizou-se todos os reagentes anteriores (exceto a rutina). 3.6.4. Tempo de extrao de pigmentos As amostras de plumas de algodo colorido foram trituradas, para aumentar a superfcie de contato, em seguida foram submetidas a temperaturas entre 60 e 70C conforme recomendado por Almeida et al. (2005). Os tempos empregados foram de 1, 2, 3, 4, 5 e 6 horas e a absorbncia medida em 510 nm.

3.6.5. Medio de flavonides O ndice de flavonides foi determinado usando como referncia o mtodo descrito por Dutt et al. (2004). Na extrao dos pigmentos de algodo colorido, uma amostra de 0,2 g de fibra de algodo colorido triturada foi colocada em um balo de destilao (Figura 8A) com adio de

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uma soluo de 10 mL de HNO3 em etanol (1:3 v/v) (Figura 8B). A extrao dos pigmentos da fibra foi realizado por duas horas (Figura 9).

Figura 8: Pluma da BRS Verde, sem adio de reagente (A), com adio de reagente (B). Foto: Germana Rosy M. de Sousa, Campina Grande, 2012.

Figura 9: Sistema de destilao (C), Pluma da BRS Verde aps duas horas de destilao (D). Foto: Germana Rosy M. de Sousa, Campina Grande, 2012.

O extrato com a pluma resultante foi filtrado usando papel de filtro faixa preta. O filtrado resultante foi transferido para balo volumtrico de 10 mL e a soluo de HNO3 em etanol (1:3, v/v) adicionada para aferio do volume final. A concentrao de flavonides foi quantificada usando rutina (Sigma-Aldrich, Shanghai, China, No. R5143) como o padro de controle de acordo com a descrio de Hua et al. (2007). Em seguida, 1,0 mL do filtrado diludo foi colocado em um balo de 10 mL e adicionou-se 4 mL de etanol (30%, v/v) amostra. Logo aps, 300 L

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NaNO2 (2,9 mol/L) foi acrescentado. Misturou-se a soluo e esperou-se um tempo de equilbrio de cinco minutos antes da adio de 300 L Al (NO3)3(0,47 mol/L). Seis minutos depois, 2 mL de NaOH (1 mol/L) foi adicionado, e em seguida adicionou-se etanol (30%, v/v) para tornar o volume final de 10 mL. A absorbncia da amostra foi medida no comprimento de onda 510 nm e a concentrao de flavonides foi expressa referindo-se a equao de calibrao com 40, 180, 320, 460, e 600 g/ 10 mL de rutina. Os ensaios foram realizados com trs repeties autnticas e utilizando sempre reagentes de grau analtico.

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4. RESULTADOS E DISCUSSO

4.1. Seleo da regio espectral de trabalho e pr-processamento dos espectros das plumas de algodo colorido e tingidas. Os espectros das plumas de cinco cultivares de algodo colorido: BRS 200 Marrom, BRS Topzio, BRS Rubi, BRS Verde e BRS Safira juntamente com as amostras tingidas foram obtidos entre 400 a 2500 nm como podem ser observados na Figura 10.

-Log(1/R)

Comprimento de Onda (nm) Figura 10: Espectros brutos das 147 amostras de algodo colorido e tingidas na regio de 4002500 nm.

Na Figura 10 nota-se variaes sistemticas nos espectros de reflectncia que podem mascarar uma propriedade de interesse e, assim, uma tcnica de pr-processamento para os espectros foi empregada, antes da construo dos modelos quimiomtricos. O SNV foi o pr-processamento que melhor forneceu resultados para discriminar as amostras na PCA. Os espectros pr-processados pelo SNV das 147 amostras de plumas de algodo colorido naturais e tingidas podem ser visualizados na Figura 11. Observa-se que em geral todas as amostras analisadas possuem perfis espectrais semelhantes e sobrepostos, isto

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pode ser atribudo a complexidade do sinal obtido e semelhana existente na composio qumica das plumas analisadas.

-Log(1/R)

Comprimento de onda (nm) Figura 11: Espectros NIR Pr-Processados (SNV) das plumas de algodo colorido. A rea grifada representa a regio em que ocorre a melhor identificao das amostras na PCA.

A tcnica de SNV uma tcnica usualmente aplicada a dados espectrais para corrigir efeitos de espalhamento da radiao centrando e escalonando cada espectro individualmente. A aplicao prtica dessa tcnica muito recorrente em espectros de reflectncia difusa em que o tamanho de partcula e efeitos multiplicativos de sinais esto presentes (CHEN et al., 2012; JAMSHIDI et al., 2012; LI et al., 2004). Os espectros pr-processados ainda no permitem uma distino entre as plumas das cultivares de algodo colorido apenas por meio de uma inspeo visual dos espectros. Assim torna-se necessrio o uso de ferramentas de anlise multivariada para identificar a distribuio das amostras. Em geral, as tcnicas de anlise exploratria so usadas para investigar a distino ou semelhanas entre amostras de um determinado conjunto (BEEB et al., 1998).

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4.1.1. Anlise exploratria dos dados A tcnica de reconhecimento de padro no supervisionado PCA foi usada para investigar a ocorrncia de agrupamentos e/ou diferenas entre as amostras de algodo colorido e tingidos, a partir dos espectros pr-processados. Ao observar os perfis espectrais das 120 amostras de algodo colorido e 27 tingidas constatou-se que seleo a priori na regio entre 629 a 717 nm forneceu os melhores resultados para identificao das plumas das cinco cultivares de algodo colorido. Pode-se notar no grfico dos escores obtidos pela PC1 (98% da varincia explicada) versus PC2 (1% da varincia explicada) a formao de grupos de amostras que correspondem as cinco cultivares de algodo colorido e as amostras tingidas (Figura 12).

PC2 (1%)

PC1 (98%) Figura 12: Grfico dos escores de PC1 versus PC2 das amostras das cinco cultivares de algodo colorido: BRS Topzio (Rosa), BRS Marrom (Azul), BRS Safira (Cinza claro), BRS Rubi (Marrom), BRS Verde (Cinza escuro) e amostras tingidas: Bege sinttico (vermelho), Cajueiro roxo (Verde) e Barbatimo (Azul) na regio de 629 a 717 nm.

Ao analisar estes dados, observa-se que as informaes necessrias para a formao dos agrupamentos foram expressas por apenas duas PCs. Porm, a sobreposio entre duas classes das cultivares BRS Safira (cinza claro) e BRS Rubi (Marrom) requer uma anlise mais detalhada.

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A partir dos perfis espectrais da BRS Safira e BRS Rubi, observa-se que os espectros dessas classes so semelhantes entre si. A sobreposio entre as classes das cultivares fica mais evidente como ilustrado na Figura 13. Uma possvel explicao para esta sobreposio pode ser devido semelhana entre as cores decorrentes dos flavonides das classes das duas cultivares.

-Log(1/R)

Comprimento de Onda (nm) Figura 13: Espectros Brutos NIR da BRS Rubi e BRS Safira na regio de 400-2500 nm.

O pr-processamento SNV no foi eficiente para observar a separao das duas classes de algodo colorido. Assim, O melhor pr-processamento dos espectros evidenciado foi empregando primeira derivada, com o algoritmo de Savitzky-Golaye ajuste com polinmio de segunda ordem em uma janela de 11 pontos ( Figura 14).

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-Log (1/R)

Comprimento de Onda (nm) Figura 14: Espectros NIR Pr-Processados (Savitzky- Golay) da BRS Rubi e BRS Safira na regio de 400-2500 nm.

A justificativa da derivao ter proporcionado melhor resultado deve-se a caracterstica de inclinao da linha de base dos espectros que com a tcnica de SNV ela no removida. Entretanto, com a derivada esse efeito minimizado e o espectro resultante possui um perfil resultante diferente do espectro bruto original. A aplicao da PCA matriz dos espectros pr-processados resultou nos escores apresentado na Figura 15. A PC1 (85% de varincia explicada) versus PC2 (15% de varincia explicada). Observa-se que ocorreu separao das duas classes de cultivares com seleo a priori na regio de 1860-1874 nm.

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PC2(15%)

PC1 (85%) Figura 15: Grfico dos escores de PC1 versus PC2 da cultivar BRS Safira (cinza) e BRS Rubi (marrom) na regio de 1860-1874 nm.

4.2. Seleo da regio espectral de trabalho e pr-processamento dos dados de tecidos de algodo colorido, adulterados e falsificados Na Figura 16, podem ser observados os espectros das 276 amostras de tecidos coloridos e das 7 amostras de duas peas comerciais com suspeita de serem falsas, sem tratamento

matemtico na regio entre 400 a 2500 nm. Os espectros obtidos ao longo de todo o perfil no permitem uma fcil distino entre as amostras de tecidos naturalmente coloridos, adulterados e peas falsificadas. A regio do visvel permite uma identificao de algumas classes, porm entre algumas classes h sobreposio que dificulta sua distino inequvoca. Para superar esse desafio foi realizado um pr-processamento dos espectros brutos.

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-Log(1/R)

Comprimento de Onda (nm) Figura 16: Espectros brutos dos tecidos de algodo colorido,adulterados e falsificados.

O pr-processamento empregado foi realizado com o algoritmo de Savitzky-Golay com janela de 11 pontos, primeira derivada e ajuste com polinmio de segunda ordem (Figura 18).

-Log(1/R)

Comprimento de Onda (nm) Figura 17: Espectros NIR Pr-Processados (Savitzky- Golay) dos tecidos de algodo colorido.

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As variveis de 1099 a 1101 foram removidas em decorrncia do pico formado pela mudana do detector quando o espectro obtido. No espectro derivativo a formao desse pico mais sensvel e pode interferir na definio dos modelos de anlise exploratrio e de calibrao.

4.2.1. Anlise exploratria dos dados A Figura 18 ilustra a distribuio de escores para as amostras de tecidos confeccionados com pluma branca, colorida natural e falsificadas. As duas primeiras PCs descrevem 89% de varincia em que possvel verificar as classes associadas cor e as caractersticas fsicas de cada conjunto de amostras de tecidos.

PC2 (13%)

PC1 (76%) Figura 18: Grfico dos escores de PC1 versus PC2 dos tecidos confeccionados com algodo branco, colorido e adulterados: A - algodo branco (crculo amarelo), colorido: B - BRS Verde (crculo verde), C - BRS Marrom (crculo marrom), D - BRS Safira (crculo azul), E- BRS Rubi (crculo roxo) e adulterado: G - Vestido (crculo rosa), F - Blusa (crculo vermelho).

Os tecidos confeccionados a partir da pluma branca (A) est separada dos demais BRS Verde (B), BRS Marrom (C), BRS Safira (D) e BRS Rubi (E), formando classes definidas por cada conjunto de amostras. Observa-se tambm que as amostras do vestido (G) e da blusa (F) consideradas falsificadas no se enquadram em nenhuma classe das amostras de tecidos oriundos de algodo colorido. Esses resultados mostram que a espectroscopia de reflectncia de infravermelho prximo em combinao com a anlise multivariada fornece vantagens por ser

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rpida, no destrutivo e com resultados de separao correta para cada classe. De modo geral, os dados esto de acordo com Liu et al. (2010) que em seu estudo demonstrou a utilidade da espectroscopia UV/VIS/NIR associada a quimiometria para predio da cor e ndices fsicos do algodo. Essas estratgias tm sido aplicadas com sucesso para identificar produtos alimentares e de origem agrcola com sucesso, tais como farinha de peixe, farinha de carne e amostras de farelo de soja (COZZOLINO et al., 2009).

4.3. Aplicao do modelo SIMCA as plumas e tecidos coloridos, adulterados e falsificados Os modelos usando validao cruzada total possibilitou a obteno de um algoritmo SIMCA para classificao de plumas coloridas na regio do visvel entre 629-717 nm, e no infravermelho prximo na regio entre 1860-1874 nm e para tecidos de algodo colorido na regio de 400-2500 nm, sem erros de tipo I ou do tipo II. Na Tabela 5 e na Tabela 6 visualizamse o resumo da classificao das plumas e tecidos coloridos obtidos pelos modelos SIMCA.

Tabela 5: Resumo da aplicao dos modelos SIMCA (5% de nvel de significncia) para plumas.

SIMCA- Modelo AMOSTRAS BRS Marrom BRS Safira BRS Rubi BRS Topzio BRS Verde Barbatimo Cajueiro roxo Bege sinttico Plumas coloridas

Tabela 6: Resumo da aplicao dos modelos SIMCA (5% de nvel de significncia) para tecidos entre 400-2500 nm SIMCA- Modelo AMOSTRAS Tecidos confeccionados com algodo colorido Blusa Vestido Tecidos confeccionados com algodo colorido

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Com base nos resultados apresentados pelos modelos SIMCA, percebe-se que no ocorrem erros do Tipo I e nem do Tipo II. A modelagem SIMCA classificou corretamente 100% das plumas e tecidos naturalmente coloridos ao nvel de significncia de 1%, 5% e 10%. Nenhuma pluma adulterada foi classificada no modelo criado para plumas coloridas, assim tambm as amostras de tecidos adulteradas no foram classificadas no modelo criado para tecidos confeccionados com algodo colorido. Dessa forma, amostras que no foram classificadas nas classes corretas foram consideradas falsas.

4.4. Tempo de extrao de pigmentos As amostras de plumas de algodo colorido quando submetidas ao aquecimento entre 60 e 70C em diferentes tempos observou-se uma menor variao em relao s medidas de absorbncia entre as cinco cultivares de algodo colorido no tempo de duas horas, tempo este tambm utilizado por Dutt et al. (2004) no qual se obteve uma extrao satisfatria de pigmentos de algodo colorido (Figura 19), no tempo de seis horas houve degradao das fibras, no sendo por esse motivo indicado para extrao de pigmentos.

0.25 0.2 0.15

Absorbncia (510 nm)

BRS 200 Marrom BRS Rubi

0.1
0.05

BRS Topzio BRS Safira BRS Verde

0
0 2 4 6 8

Tempo de Extrao (horas)

Figura 19: Absorbncias mdias em extraes realizadas em diferentes tempos.

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4.5. Calibrao multivariada no destrutiva para flavonides A regio espectral empregada na calibrao multivariada para predio no destrutiva de flavonides com base nos espectros de reflectncia foi executada com a tcnica de regresso por PLS com validao cruzada total. Para a construo do modelo de regresso foram utilizados os valores mdios de trs repeties do teor de flavonides obtido pelo mtodo descrito por Dutt et al. (2004) e os espectros pr-processados por SNV na faixa de 400 a 2500 nm. Os resultados dos parmetros de calibrao podem ser visualizados na Tabela 7. Na faixa de calibrao de 80,3 - 383,5 g/ 10 mL o RMSECV (Raiz Quadrada do Erro Mdio de Validao Cruzada) representa 40,7% e 8,5% dos extremos dessa faixa, respectivamente. Essa atribuio deve-se a um erro relativo alto no limite inferior da faixa que pode decorrer dos resultados de referncia para quantificao de flavonides. Alm disso, desvio de linearidade pode ser a causa principal para se estabelecer uma calibrao com um menor RMSECV em relao a ampla faixa de concentrao do limite de deteco necessrio para uma medida de reflectncia VIS-NIR. Entretanto, vale destacar que nesse modelo de predio para flavonides consegue-se inferir de forma no destrutiva, com alta frequncia analtica sem a necessidade do uso de reagentes de alto custo e outros insumos requeridos pelo mtodo de referncia. Nesse particular, cabe ressaltar ainda que por meio do mtodo de referncia para flavonides foi possvel realizar quatro ensaios por dia. Enquanto, com o NIR e calibrao por PLS se atinge uma frequncia de 40 amostras por hora de trabalho.

Tabela 7: Resultados obtidos para o modelo de calibrao multivariada (PLS). Faixa de concentrao(g/ 10mL) 80,3 - 383,5 4 32,7 0,9023 0,9465 Variveis Latentes RMSECV g/ 10mL R2 r

A relao entre as concentraes medidas versus as concentraes preditas de flavonides esto ilustrados na Figura 20. Nessa figura, as amostras analisadas possuem concentrao mais frequente no limite inferior em torno de 100 g/ 10 mL. Alm disso, ao longo dos valores de flavonides medidos e preditos as amostras com menor concentrao do pigmento so oriundas

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das cultivares BRS Topzio, BRS Marrom e BRS Safira e com maior concentrao para BRS Verde e BRS Rubi.

Ypreditos

Ymedidos Figura 20: Valores experimentais mdios das triplicatas (Ymedidos) versus valores preditos (Ypreditos) do conjunto de calibrao do modelo de regresso usando quatro variveis latentes.

Yong et al. (2012) observou que a espectroscopia NIR combinada ao mtodo de calibrao multivariada (iPLS), mostrou-se uma tcnica alternativa simples e rpida para determinao de flavonides em folhas de Ginkgo biloba. As amostras utilizadas pelos autores com concentrao de 2,73 a 36,68 mg/ g forneceram os seguintes parmetros de calibrao RMSEP=2,62 mg/ g, RMSEC = 2,36 mg/ g e R2=0,82. Essa faixa de concentrao cerca de 100 vezes superior a concentrao em pluma e tecidos de algodo colorido. Entretanto, observa-se que o RMSEC e RMSEP so altos para a faixa em Ginkgo Biloba com erro relativo para o menor valor da faixa de concentrao de 96% e 86,4%. Em relao ao modelos PLS desenvolvido nesse trabalho para flavonides o erro relativo na menor concentrao foi de 40,7. Portanto, o modelo para flavonides totais em pluma e tecido de algodo forneceram resultados mais parcimoniosos que com o modelo para Ginkgo biloba.

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5. CONCLUSES

1. A PCA aplicada aos espectros NIR das plumas e dos tecidos de algodo colorido eficiente para observar a tendncia de formao de classes entre essas amostras. 2. O modelo SIMCA foi capaz de classificar corretamente as amostras de plumas e tecidos de algodo colorido, a um nvel de significncia de 1%, 5% e 10%, podendo ser empregada para identificao de amostras de plumas ou tecidos falsificados. 3. A tcnica VIS/NIR associada quimiometria eficiente para discriminao e classificao de algodo colorido, proporcionando as seguintes vantagens: menor custo operacional, maior simplicidade e rapidez, no destruio, pouca manipulao, dispensa o tratamento prvio das amostras e uso de reagentes. 4. A espectroscopia VIS/NIR associada ao mtodo de calibrao multivariada (PLS) uma tcnica alternativa simples e rpida, para determinao do teor de flavonides total em amostras de algodo colorido de forma no destrutiva.

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