1. INTRODUO A espectrofotometria uma tcnica analtica que utiliza a luz para pedir a concentrao de espcies qumicas.

. Este mtodo analtico baseia-se na interao (absoro e/ou emisso) da matria com a energia radiante, ou seja, radiao eletromagntica quando os eltrons se movimentam entre nveis energticos Beer afirmou que o decrscimo em energia radiante, verificado quando um feixe de radiao atravessa um meio material, proporcional potncia do feixe e quantidade da substncia absorvente encontrada pela radiao em seu percurso atravs do meio considerado (Ohlweiler). Para demonstrao desse raciocnio toma-se como base uma seo transversal de um bloco com rea S e uma espessura infinitesimal dx. Considera-se haver nessa seo dn partculas absorventes e em cada partcula ocorrer a captura de ftons (absoro). A rea total projetada dessas superfcies de captura dentro desta seo representada por dS e a razo entre a rea de captura e a rea total dada por dS/S. Considera-se ainda que a potencia do feixe que atinge a seo dado por Px e proporcional ao nmero total de ftons por centmetro quadrado e dPx a quantidade absorvida dentro da seo, sendo a frao absorvida dada por dPx/Px. A relao dada ento: -dPx/Px = dS/S. O desenvolvimento dessa expresso leva a: LOG (P0 / P) = bc = A. Nessa expresso, a absortividade molar quando c a concentrao em mol por litro e b a largura da cubeta (comprimento do percurso ptico) em centmetros. A absortividade molar uma constante caracterstica da espcie absorvente em um solvente e para um comprimento de onda particulares (Ohlweiler). Assim, para radiaes monocromticas, a absorbncia

diretamente proporcional ao comprimento do caminho ptico atravs do meio e concentrao c das espcies absorventes. (Skoog) A lei de Beer vale sobre um intervalo considervel da concentrao quando a estrutura do on corado, ou do no eletrlito corado, no estado dissolvido, no se altera com a concentrao (Vogel). Os desvios ocorrem quando, por exemplo, o soluto corado sofre ionizao, ou dissociao, ou

associao em soluo. A lei de Beer no vale quando o soluto forma complexos, cuja composio depende da concentrao. Os desvios tambm ocorrem devido falta de monocromaticidade. Mtodo 3,5 DNS

Consiste no na reduo do cido 3,5- DNS para cido 3-amino-5nitrossaliclico, enquanto que, no caso mais simples o grupamento aldedo parece ser oxidado a cido aldnico. Entretanto a equivalncia entre o cido aminonitrossaliclico produzido e a quantidade do acar no exata e diferentes acares produzem diferente intensidade na cor desenvolvida. Isso sugere que a qumica da reao deva ser mais complexa que a apresentada, podendo estar relacionada com as reaes de decomposio de acares em soluo alcalina. As anlises foram feitas segundo Miller. O acar redutor foi quantificado por espectrofotometria com comprimento de onda de 540nm, utilizando-se uma curva padro de glicose.

2. OBJETIVOS Determinar a concentrao de acares redutores em uma amostra de xarope de glicose pelo mtodo do cido 3,5-dinitrossaliclico (mtodo 3,5DNS).

3. REVISO BIBLIOGRFICA

Os carboidratos (ou glicdios, aucares, hidratos de carbono), abrangem um dos maiores grupos de compostos orgnicos conhecidos na natureza, e juntamente com as protenas formam os principais constituintes dos organismos vivos, compondo um grupo amplo e importante, de grande ocorrncia na natureza, tendo funo energtica (reserva energtica de animais e plantas, compondo tambm a base da alimentao humana, em termos de calorias) e estrutural (tecidos de sustentao vegetal, carapaas, cartilagens), sendo tambm componentes de importantes matrias-primas da agroindstria e da indstria biotecnolgica. Na natureza e na indstria existem diversas reaes, tanto de degradao como de formao, de carboidratos que so determinantes no controle de qualidade de produtos. Um acar redutor um acar no qual o carbono da carbonila no est envolvido em uma ligao glicosdica e, portanto, pode sofrer oxidao. Os monossacardeos podem ser oxidados por agentes oxidantes relativamente suaves, tais como os ons frrico e cprico. O carbono do grupo carbonila oxidado a cido carboxlico (LENINGHER, 1995). Todos os monossacardeos so potencialmente redutores, devido a presena da carbonila. Outros carboidratos necessitam ser hidrolisados para se tornarem redutores. O mtodo utilizado na presente aula prtica o da determinao espectrofotomtrica de aucares redutores pela reduo do cido 3,5dinitrosolislico (3,5-DNS). Os mtodos espectrofotomtricos, mais

especificamente os de absoro molecular, se valem da capacidade de todas as molculas orgnicas serem capazes de absorver radiao eletromagntica, por conterem eltrons de valncia que podem ser excitados para nveis mais altos de energia. Estas transies envolvem a excitao de eltrons no ligantes (n) para orbitais *. Tambm podem ocorrer, e de forma mais comum, as transies de eltrons no ligantes ou para o estado excitado *. Neste caso, precisa a molcula possuir um grupo funcional insaturado para fornecer
4

tais eltrons. Essas molculas orgnicas so chamadas de cromforas (SKOOG et. al., 2002). Neste caso, especificamente, ocorre a reduo do 3,5-di-

nitrosalicitato cido (de cor amarelo forte) e a oxidao do monossacardeo, a glicose, formando o 3-amino-5-nitro-salicilato (de cor laranja-marrom forte), na proporo estequiomtrica. Portanto, pela determinao da luz absorvida a 540nm pelo 3-amino5-nitrosalicilato, pode-se determinar a concentrao de acar redutor presente na soluo. Devemos tambm, para cada tipo de amostra, estimarmos uma curva padro do acar em estudo. Por exemplo, se a amostra analisada contm frutose, devemos fazer a curva padro para a frutose, dentro de um determinado intervalo de concentrao, e respeitando a Lei de Beer: Eq. 1 Onde A a absorbncia, a a absorbncia especfica (em mL(mg1

cm-1)) e b o caminho ptico percorrido pela radiao durante o percurso de

cubeta (em cm). Uma vez levantada essa curva, pode-se calcular a concentrao da amostra (SKOOG et. al., 2002).

4. MATERIAIS E MTODOS Materiais utilizados: * Tubo de ensaio; * Pipetas graduadas e volumtricas; * gua destilada; * Soluo padro de acar (glicose) (1 g/L); * Reagente 3,5-DNS; * Banho-maria; * Banho de gelo; * Espectrofotmetro.

Colocou-se 1 ml da amostra em um tubo de ensaio e adicionou-se 0,5 ml de 3,5-DNS. Aps levou-se o tubo para um banho-maria 100 C durante 5 minutos. Logo o tubo foi resfriado em um banho de gelo e acrescentou-se 8,5 ml de gua destilada. Em seguida foi feita a leitura da transmitncia em um espectrofotmetro a 540 nm. Para a construo da curva padro utilizou-se 6 tubos onde foram adicionados volumes de 1, 0,8, 0,6, 04, 0,2 e 0 ml da soluo padro (glicose) com volumes de gua destilada correspondentes para atingir 1 ml. O tratamento dado a esses tubos foi idntico ao tratamento da amostra exposto anteriormente.

5. RESULTADOS E DISCUSSO Curva Padro. Os valores encontrados de transmitncia e absorbncia esto expostos na Tabela 1. Os valores de absorbncia foram calculados pela Equao 1:

Equao 1 Tabela 1 Valores de transmitncia e absorbncia da curva padro

Volume (ml)

Concentrao (g/l) Transmitncia (%)

Absorvncia

1 0,8 0,6 0,4 0,2 0

1 0,8 0,6 0,4 0,2 0

19,2 26,8 33,6 49,2 75 100

0,716699 0,571865 0,473661 0,308035 0,124939 0

Utilizando-se os dados da tabela 1 foi plotado o grfico da absorbncia versus concentrao de glicose, a curva do grfico foi gerada por atravs do mtodo de regresso linear. E a equao obtida foi a seguinte:

Eq. 2

0.8 0.7 0.6 Transmitncia 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 0 0.2 0.4 0.6 Concentrao (g/L) 0.8 1 1.2 0.124938737 0.308034897 y = 0,7271x R = 0,9939 0.473660723 0.716698771 0.571865206

Grfico 1 Curva padro de glicose

Determinao da Concentrao de Acares Redutores na amostra. O valor de transmitncia obtido para a amostra foi: %T = 22,8. Com o uso da Equao 1 calcula-se a absorbncia: A=2-log (%T) A=2-log(22,8) A=0,6420 Com a utilizao da Equao 2, obtida na anlise da curva padro, obtm-se a concentrao de glicose da amostra: A= 0,7271 x C C = 0,6420/0,7271 C=0,8829 g/l

6. CONCLUSO Analisando os resultados obtidos, nota-se que a soluo de sacarose analisada tem concentrao prxima da real. Com erros mnimos, pode-se afirmar que os mtodos so confiveis. Estes dois mtodos de anlise podem ser usados em pequenas escalas, como em laboratrios de pesquisa, acadmicos e industriais. Porm apresentam a desvantagem de a leitura do grau Brix ser feita com pouca preciso, tanto do refratmetro quanto do densmetro.

7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

http://www.hortibrasil.org.br/jnw/index.php?option=com_content&view=article&i d=234%3Aa-medida-do-sabor&catid=64%3Afrutas-e-hortalicas frescas&Itemid=82&showall=1 <acesso em 07/07/2013>

SKOOG, Douglas A.; HOLLER, F. James; NIEMAN, Timothy A - Princpios de Anlise Instrumental 5 Edio, Editora Bookman. LENINGER, L.A., NELSON D. L, COX M.M. Princpios de Bioqumica 2 Ed So Paulo: Editora Sarvier, 1995.

REGULY, J. C. Biotecnologia dos processos fermentativos. v.1. Pelotas: Universitria UFPel, 1996. p.149.

OLIVEIRA, M. A. B. de. Anlise qumica de acares: mtodos qualitativos e quantitativos. Cachoeira de Itapemirim: o Autor, 2009.

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8. ANEXOS

Anexo 1 Correo e leitura do Brix Areomtrico para temperatura normal de 20C

Temperatura(C) 0 5 Brix observado 10 15 20 25

Subtrair ao Brix observado

15,0 15,5 16,0 16,5 17,0 17,5 18,0 18,5 19,0 19,5 20,0 20,5 21,0 21,5 22,0 22,5 23,0 23,5 24,0 24,5 25,0 25,5 26,0 26,5 27,0 27,5

0,20 0,19 0,17 0,15 0,13 0,11 0,09 0,07 0,05 0,02

0,22 0,20 0,18 0,16 0,14 0,12 0,10 0,07 0,05 0,02

0,24 0,22 0,20 0,17 0,15 0,13 0,11 0,08 0,05 0,02

0,26 0,24 0,22 0,19 0,16 0,14 0,11 0,08 0,05 0,03

0,28 0,26 0,23 0,20 0,18 0,15 0,12 0,09 0,06 0,03

0,30 0,28 0,25 0,22 0,19 0,16 0,13 0,09 0,06 0,02

Adicionar ao brix observado

0,02 0,04 0,07 0,10 0,13 0,16 0,18 0,21 0,24 0,27 0,30 0,33 0,36 0,40 0,43

0,02 0,05 0,08 0,10 0,13 0,16 0,19 0,22 0,25 0,28 0,31 0,34 0,37 0,41 0,44

0,03 0,06 0,09 0,11 0,14 0,17 0,20 0,23 0,27 0,30 0,33 0,36 0,39 0,42 0,46

0,03 0,06 0,09 0,12 0,15 0,17 0,21 0,24 0,28 0,31 0,34 0,37 0,40 0,44 0,48

0,03 0,06 0,09 0,12 0,16 0,19 0,23 0,26 0,29 0,32 0,36 0,40 0,43 0,46 0,50

0,03 0,06 0,10 0,13 0,17 0,20 0,24 0,27 0,31 0,34 0,37 0,40 0,44 0,48 0,52

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28,0 28,5 29,0 29,5 30,0

0,46 0,50 0,54 0,58 0,61

0,47 0,51 0,55 0,59 0,62

0,49 0,53 0,56 0,60 0,63

0,51 0,55 0,59 0,63 0,66

0,54 0,57 0,61 0,65 0,68

0,56 0,59 0,63 0,67 0,70

Anexo 2 Relaes entre Graus Brix, Grauns Baum, densidade e concentraes para solues de sacarose.

Composio das solues de sacarose

Graus Brix Graus Baum Densidade 20/20 Slidos por litro de soluo gua por litro de soluo Peso em gramas por litro de soluo

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80

2,79 5,57 8,34 11,10 13,84 16,57 19,28 21,97 24,63 27,28 29,90 32,49 35,04 37,56 40,03 42,47

1,0196 1,0399 1,0610 1,0928 1,1055 1,1289 1,1533 1,1785 1,2046 1,2317 1,2597 1,2887 1,3186 1,3495 1,3814 1,4142

50,98 103,99 159,15 216,56 276,37 338,67 403,65 471,40 542,07 615,85 692,83 773,22 857,09 944,65 1.036,05 1.131,36

968,62 935,90 901,85 866,26 829,13 790,23 749,65 707,10 662,53 615,85 566,87 515,48 461,51 400,85 345,35 282,84

1.019,6 1.039,9 1.061,0 1.082,8 1.105,5 1.128,9 1.153,3 1.178,5 1.204,6 1.231,7 1.259,7 1.289,7 1.318,6 1.349,5 1.381,4 1.414,2

Anexo 3 Pergunta

Voc tem um caldo de cana de acar, o qual tem 18% p/v de sacarose. Voc quer fermentar este caldo em fermentador de 30.000L, volume til, para produzir lcool etlico. Por outro lado, voc quer iniciar a fermentao

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com 16 Brix (medidos a 30C). Ser preciso diluir o seu caldo de cana? Em caso afirmativo, como ser feita essa diluio?

Resoluo: Utilizando-se dos dados do Anexo 1 (Correo e leitura do Brix Areomtrico para temperatura normal de 20C), temos:
Temperatura (C) 30 Brix Observado 15 Adicionar ao Brix Observado 0,66 0,68 20

Interpolando tem-se: 20-15 = 20-16 0,68-X

0,68-0,66

X=0,664 Posteriormente, fez-se a correo e o valor real do Brix obtido foi 16,664 Brix. Utilizando os dados do Anexo 2 (Relaes entre Graus Brix, Graus Baum, densidade e concentraes para solues de sacarose), teremos outra interpolao:

Graus Brix Slido por litro de soluo

15 159,15

20 216,56

Fazendo a interpolao temos: 20-15 = 20-16,664 216,56-X

216,56-159,15

X=178,256 g sac/L de soluo. Passando este valor para %p/v temos 17,82g de sac./100ml de soluo.

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Como temos 18 %p/v a soluo dever ser diluda. Para isto calcularemos a quantidade de gua que dever ser usada.

Balano Volumtrico Global: V1 + V2 = V3

Balano por Componente: Sacarose: 0,18 . V1 = 0,178 . 30000 V1 = 29666,6 Litros %sac1 . V1 = %sac3 . V3

V1 + V2 = V3 29666,6 + V2 = 30000

V2 = 333,4 L de gua

Portanto a quantidade de gua necessria para a diluio dessa soluo de: 333,4 L de gua.

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