Diagnstico Molecular das Doenas Neurodegenerativas

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Os avanos do conhecimento cientfico, nos ltimos anos, nas reas da Gentica e da Neurocincia, tm modificado, de forma rogressiva, o uso de ferramentas moleculares !ue ermitem a identifica"o r e s#sintomtica de doenas neurodegenerativas e tm gerado ers ectivas de novas ossi$ilidades tera uticas% O diagnstico molecular consiste na avalia"o da estrutura dos com onentes do DN& 'cido deso(irri$onuclico), resente na maioria das clulas do nosso organismo% &s altera*es nesta molcula odem ser de diferentes e(tens*es, como a erda de grandes or*es do DN&, a sim les troca de um de seus com onentes ou outros rearran+os mais com le(os% ,m decorrncia de uma muta"o, um gene ode dei(ar de e(ercer a sua fun"o ou ad!uirir fun*es distintas da original, levando ao a arecimento de doenas% -om rela"o . investiga"o molecular, as doenas neurodegenerativas odem ser classificadas em dois gru os distintos/ a!uelas cu+as ferramentas moleculares ossi$ilitam identificar altera*es em genes !ue s"o reconhecidas como causadoras da atologia 'doenas associadas . insta$ilidade de re eti*es trinucleotdicas e Doena de 0a1#2achs) e a!uelas, cu+a investiga"o do DN& ermite somente identificar marcadores $iolgicos de susce ti$ilidade . doena 'Doena de 3ar4inson, Doena de &l5heimer e ,sclerose Mlti la)%

Doenas associadas . insta$ilidade de re eti*es trinucleotdicas ,stas doenas constituem um gru o de neuro atias hereditrias clinicamente heterogneas, cu+o mecanismo mutacional consiste na am lifica"o de e!uenas se!6ncias re etidas do DN&, o !ue fa5 com !ue os genes corres ondentes aumentem de tamanho% ,stas e( ans*es levam os genes a rodu5irem rotenas anormais, as !uais assumem uma fun"o neurot(ica, !ue gera a erda rogressiva dos neur7nios do sistema nervoso central% & herana de re eti*es

instveis causa vrias desordens neurolgicas humanas !ue incluem a doena de 8untington '8D), a atrofia dentatoru$ral# alidoluisiana 'D93:&);sndrome de 8a<#9iver, a atrofia muscular es ino$ul$ar '2=M&), a ata(ia de >riedreich e as ata(ias es inocere$elares dos ti os ?, @, A, B e ?@ '2-&?, 2-&@, 2-&A, 2-&B e 2-&?@, res ectivamente) e do ti o C '2-&C), tam$m conhecida como doena de Machado#Dose h 'DMD)% ,m grande arte destas doenas ocorre uma rela"o linear inversa entre o nmero de re eti*es e a idade de manifesta"o dos sintomas da doena, muitas ve5es associado ao fen7meno de anteci a"o gentica, !ue consiste na manifesta"o mais severa e recoce da doena com o assar dasgera*es% -om e(ce"o da 2=M& e da ata(ia de >riedreich, todas as outras doenas ossuem adr"o de herana autoss7mico dominante, o !ue significa !ue indivduos de am$os os se(os s"o igualmente afetados e o risco de um 'a) filho 'a) de um indivduo afetado a resentar a doena de EFG% O diagnstico molecular conclusivo reali5ado atravs da determina"o do nmero de re eti*es anormais resente no gene associado . doena% -om rela"o .s ata(ias es inocere$elares, o uso de ferramentas moleculares ossi$ilita tam$m a diferencia"o entre as diversas formas, tendo em vista !ue o diagnstico reali5ado somente com $ase clnica se torna muito dificultado em virtude da so$re osi"o dos sinais sugestivos%

Doena de 0a1#2achs & doena de 0a1#2achs uma doena neurodegenerativa rogressiva rara e fatal at os E anos de idade, causada or um defeito no gene da he(osaminidase, en5ima res onsvel elo meta$olismo de li deos do sistema nervoso central% & doena ossui herana autoss7mica recessiva, o !ue significa di5er !ue indivduos de am$os os se(os s"o igualmente ro ensos a a resentar a doena e !ue, na maioria das ve5es, as crianas afetadas s"o filhas de um casal no !ual tanto o ai !uanto a m"e ossuem uma de suas duas c ias do gene defeituosa% Desta forma, o diagnstico molecular ermite n"o somente a confirma"o do diagnstico $io!umico nos indivduos afetados, reali5ado ela dosagem en5imtica, como tam$m o aconselhamento gentico de casais de transmissores% No caso da Doena de &l5heimer, da Doena de 3ar4inson e da ,sclerose Mlti la, o conhecimento cientfico e as metodologias dis onveis, at o momento, ermitem somente a identifica"o de

marcadores genticos de redis osi"o, ou se+a, altera*es em genes !ue odem ter um envolvimento direto ou indireto com a doena, mas !ue n"o s"o os nicos fatores ca a5es de desencadear a desordem%

Doena de &l5heimer Os rimeiros genes associados ao desenvolvimento da doena de &l5heimer foram os da rotena recursora do amilide '33&) e o da rotena a oli o rotena , '&3O,)% O PPA est locali5ado no cromossomo @?, e rodu5 a fonte da rotena $eta#amilide, constituinte rimrio das lacas amilides !ue se de ositam em grande !uantidade no cre$ro das essoas com a doena de &l5heimer% D o APOE, !ue intervm no rocessamento do colesterol, est situado no cromossomo ?H e tem trs formas comuns/ APOE-e2; APOE-e3 e APOE-e4% ,studos o ulacionais tm demonstrado uma re onderIncia da forma APOE-e4 em essoas afetadas ela doena de &l5heimer de diferentes etnias% 9ecentemente, vrios outros genes, dentre eles o PSEN1, PSEN2, TNF-a, o PSEN1 e o CYP46, todos envolvidos direta ou indiretamente na de osi"o cere$ral das rotenas $eta#amilides, foram reconhecidos dentre os determinantes genticos ara a doena de &l5heimer% Outros fatores de risco ara o desenvolvimento da doena de &l5heimer incluem histria familiar, idade avanada, e( osi"o fsica a metais como o alumnio e o 5inco, uso de estrognio 're osi"o hormonal) e a resena concomitante da 2ndrome de Do<n% & investiga"o molecular utili5ando estes marcadores genticos ara a confirma"o do diagnstico clnico + est dis onvel em alguns ases% JKer tam$mL

Doena de 3ar4inson O mal de 3ar4inson uma doena neurolgica rogressiva, !ue causa a deteriora"o das clulas da regi"o cere$ral res onsvel elo controle dos movimentos, afetando os movimentos e causando tremores e enri+ecimento muscular, geralmente a artir dos EF anos% Na maioria dos casos de 3ar4inson, a doena n"o hereditria, ou se+a, n"o transmitida de uma gera"o a outra% ,ntretanto, essoas !ue tenham algum familiar r(imo afetado a resentam susce ti$ilidade maior a manifestar a doena, a ontando ara um com onente gentico% &t o momento, vrios genes foram im licados

nas diferentes formas da doena de 3ar4inson, incluindo altera*es nos genes da alfa#sinucleina 'SNCA), da esterase u$i!uitina car$o(i terminal :? 'UCHL1) e da ar4ina, todas associadas .s formas familares e altera*es no gene da sinfilina#?, associadas aos casos es ordicos% 9ecentemente, falhas no gene LRRK2 foram reconhecidas como sendo res onsveis or uma orcentagem de casos de mal de 3ar4inson su erior ao encontrado ara as outras muta*es ligadas . doena% O gene LRRK2 est locali5ado no cromossomo ?@ e res onsvel ela rodu"o da rotena dardarina, cu+a fun"o ainda n"o foi elucidada% &lm disso, e(istem evidncias de !ue muta*es do DN& mitocondrial tam$m ossam contri$uir ara o desencadeamento dos sintomas% & heterogeneidade de genes envolvidos na manifesta"o da doena de 3ar4inson somada . escasse5 de informa*es so$re os mecanismos moleculares !ue levam . desordem, restringe a sua investiga"o molecular . rocura de marcadores de susce ti$ilidade . doena% JKer tam$mL

,sclerose Mlti la & esclerose mlti la uma doena auto#imune de causa desconhecida, orm com um im ortante com onente gentico, o !ue a$re caminhos ara !ue no futuro marcadores genticos ossam ser a licados no diagnstico desta condi"o% &tualmente, os critrios ara se esta$elecer o diagnstico da esclerose mlti la s"o unicamente clnicos% ,ntretanto, o conhecimento cientifico est sendo direcionado ara a identifica"o de marcadores $iolgicos, !ue constitui o rimeiro asso ara !ue estratgias de diagnstico e tera uticas se+am delineadas% & evolu"o dinImica das ferramentas moleculares tem ossi$ilitado n"o somente diagnosticar com recis"o um nmero cada ve5 maior de doenas genticas, como tam$m, detectar indivduos assintomticos% ,stas essoas, geralmente, s"o familiares de indivduos cu+o diagnstico molecular confirmou a resena de uma muta"o es ecfica e, desta forma, a resentam uma redis osi"o gentica aumentada ara o desenvolvimento osterior da desordem% 2endo assim, de e(trema im ortIncia entender !ue/ ?% Muitos dos e(ames moleculares dis onveis ara a detec"o de doenas neurodegenerativas ainda est"o em fase de

esta$elecimento e se torna necessria a reali5a"o rvia de am los estudos o ulacionais ara assegurar a real contri$ui"o dos genes mutantes em articular ara o desenvolvimento da doena% 3ortanto, a esar da diversidade de es!uisas reali5adas mundialmente so$re os mecanismos moleculares envolvidos com o desencadeamento das diferentes formas de doenas neurodegenerativas, ainda s"o escassas as doenas !ue odem ter o seu diagnstico firmado atravs da anlise molecular% No =rasil, a situa"o se torna ainda mais crtica devido ao nmero restrito de centros !ue oferecem e(ames genticos ara as doenas neurodegenerativas% @% Os e(ames !ue usam marcadores moleculares de redis osi"o sugerem !ue, caso alguma altera"o se+a encontrada e, se a mesma estiver associada a outros fatores de risco 'histria familiar, sinais clnicos, fatores am$ientais), o indivduo ter uma maior ro$a$ilidade de desenvolver a doena neurodegenerativa% C% O diagnstico molecular r#sintomtico de e(trema im ortIncia ara o monitoramento recoce dos sinais clnicos indicativos da doena neurodegenerativa, de maneira !ue medidas rofilticas odem ser direcionadas, minimi5ando as conse!6ncias da doena ou at mesmo im edindo a sua manifesta"o% O diagnstico r#sintomtico tem tra5ido im lica*es ticas, sicolgicas e sociais muito eculiares, a ontando ara a necessidade urgente da intera"o multidisci linar de geneticistas, siclogos e neurologistas visando melhorias na inter reta"o dos resultados moleculares e de imagens cere$rais, rognstico, acom anhamento clnico e sicolgico regular ' r e s#e(ames), tera ia e aconselhamento familiar% M medida !ue cresce nosso conhecimento so$re as causas $iolgicas !ue levam .s doenas neurodegenerativas, mais erguntas, muitas delas ainda sem res ostas, surgem na comunidade cientfica% Nsto refle(o da com le(idade do sistema nervoso, considerado o tecido do cor o humano onde odemos encontrar o maior nmero de genes em funcionamento% 3or isso, deve#se ter em mente !ue a manuten"o do funcionamento de um sistema t"o com le(o n"o re!uer um ou dois genes, mas milhares de genes integrados harmoniosamente so$ uma variedade de estmulos

am$ientais% ,m contraste, o mau funcionamento de um nico gene, or mais sim les !ue se+a, ode interrom er este $alano e gerar um efeito catastrfico%

229 Diagnstico molecular da to(o lasmose/ revis"o Molecula !"a#$o%"% o& 'o(o)la%*o%"%+ e,"e&licia Oom alic#-risto?, @, CP -onstana =ritto@P Octavio >ernandesC 1. Professora de Parasitologia do Departamento de Medicina Preventiva y Social, Decanato de Medicina, Universidad Centroccidental Lisandro lvarado, !ar"#isimeto, Vene$#ela. 2. Pes"#isadora associada do Departamento de !io"#%mica e !iologia Molec#lar, &nstit#to 's(aldo Cr#$ da )#nda*+o 's(aldo Cr#$ ,)&'C-U./, -io de 0aneiro. 1. Pes"#isador tit#lar do Departamento de Medicina 2ropical, &nstit#to 's(aldo Cr#$ da )&'C-U.3 gestor m4dico diagn5sticos da m4rica. 0 !ras Patol Med La6 7 v. 81 7 n. 8 7 p. 22991: 7 agosto 2;;: 1 unitermos 4e1 <ords resumo to<oplasmose infecta mil=>es de pessoas no m#ndo inteiro, sendo "#e a preval?ncia da infec*+o =#mana na maioria dos pa%ses est@ entre 8;A e :;A. Bo !rasil essa ta<a a#menta at4 C;A, dependendo da @rea est#dada. Ba maioria dos =ospedeiros a infec*+o 4 assintom@tica. m#l=er gr@vida com sorologia negativa pode contri6#ir para o incremento da mor6idade, transmitindo o 2o<oplasma gondii para o feto, atrav4s da placenta, se ad"#irir to<oplasmose ag#da d#rante a gravide$. ' diagn5stico da to<oplasmose ag#da 4 6aseado na detec*+o de &gM anti92o<oplasma gondii circ#lante. alta sensi6ilidade das t4cnicas sorol5gicas at#ais tro#<e a realidade da presen*a de &gM resid#ais conf#ndindo m#itas ve$es o diagn5stico final. Besse sentido, as t4cnicas molec#lares, tais como a rea*+o em cadeia da polimerase ,PC-/, podem aD#dar a #ma mel=or interpreta*+o do estado real da intera*+o parasitoE=omem, em6ora seDam ainda po#co validadas para #so na rotina de diagn5stico la6oratorial da to<oplasmose. 0o(o lasmose 0o(o lasma gondii Diagnstico 3-9 a$stract

Toxoplasmosis infects millions of people worldwide. The prevalence of human infection in many countries is estimated in approximately 40% to 50%. In Brazil this rate increases up to 80% dependin! on the studied area. The ma"ority of human hosts present the infection as asymptomatic carriers. #erolo!ically ne!ative pre!nant women may contri$ute to a hi!her mor$idity of the disease due to parasite transmission to the fetus via placenta if acute toxoplasmosis is ac%uired durin! pre!nancy. The dia!nosis of acute toxoplasmosis has relied on the evidence of circulatin! anti&parasite I!'. The hi!h sensitivity of the present serolo!ical techni%ues has $rou!ht results of residual I!' eventually confoundin! final dia!nosis. In this scenario the molecular techni%ues such as the polymerase chain reaction ()*+, may promote a $etter interpretation of the real status of human-parasite interaction althou!h they have not $een extremely validated for routine use in the dia!nosis of toxoplasmosis. To(o)la%*o%"% To(o)la%*a #o$!"" ."a#$o%"% PCR 3rimeira su$miss"o em ?@;FE;FE Qltima su$miss"o em @E;FB;FE &ceito ara u$lica"o em @B;FB;FE 3u$licado em @F;FR;FE &90NGO D, 9,KN2SO RE/0E1 PAPER Nntrodu"o ' 2o<oplasma gondii foi desco6erto "#ase ao mesmo tempo por Bicolle e Mancea#<, na 2#n%sia, e por Splendore, no !rasil, em 19;C,:1, F:/. G #m proto$o@rio intracel#lar, "#e pode parasitar os mais diversos tecidos de v@rios mam%feros e aves. Se# ciclo de vida 4 con=ecido desde finais da d4cada de 19F;, em6ora m#itos pormenores da infec*+o ainda precisem ser esclarecidos,8/. to<oplasmose 4 #ma $oonose de distri6#i*+o #niversal "#e acomete mil=>es de pessoas no m#ndo. Hm diversos pa%ses, t?m sido descritas soropreval?ncias "#e variam de 1:A a C:A na pop#la*+o =#mana,19/. Hm crian*as, a soropreval?ncia 4 relativamente 6ai<a, a#mentando de acordo com a idade, com a e<posi*+o a mais fatores de risco d#rante o transcorrer da vida,1, 11, FI/. Bo !rasil, a soropreval?ncia tem sido determinada entre 21; :;A e C;A,11/. Hm -ecife essa ta<a 4 de F8A e I9A,11/3 no -io de 0aneiro se o6servo# #ma soropreval?ncia de I9A3 em Mana#s, de I1A3 em S+o Pa#lo, de FCA3 e entre ind%genas 6rasileiros, vario# de :2A a F:A,1/.

parasitose pode se apresentar de diversas formas no organismo =#mano, por4m est#dos sorol5gicos indicam "#e mais de C;A das infec*>es prim@rias por T. !ondii s+o assintom@ticas,I1/. Para "#e a to<oplasmose cong?nita possa ocorrer, a infec*+o prim@ria deve se apresentar d#rante a gravide$,F, 1I/. ssim, a m#ltiplica*+o dos ta"#i$o%tas pode ser acompan=ada da infec*+o da placenta, levando J possi6ilidade de transmiss+o vertical. Bo feto, o parasito se aloDa em c4l#las do sistema fagoc%tico9monon#clear, dando origem Js estr#t#ras intermedi@rias denominadas pse#docistos3 espal=a9se por via sangK%nea o# linf@tica para "#al"#er 5rg+o o# tecido, incl#indo sistema nervoso central e ol=os, pelos "#ais tem #m tropismo maior,89/. s m#l=eres com infec*+o crLnica por T. !ondii n+o contaminam se#s fil=os d#rante o per%odo intra9#terino, e tam64m n+o e<istem provas de "#e a to<oplasmose em etapa crLnica seDa ca#sa de a6ortos. 's casos de reativa*+o da infec*+o pelo T. !ondii, ca#sados por im#noss#press+o materna, poderiam levar J infec*+o do feto d#rante a gravide$, :2/. ' s#cesso da infec*+o fetal depende de fatores como vir#l?ncia do 2. gondii, desenvolvimento placent@rio, idade gestacional e carga parasit@ria, entre o#tros,1/. D#rante o primeiro trimestre da gesta*+o, a infec*+o pelo T. !ondii pode levar a morte fetal. Bo seg#ndo trimestre, pode ocasionar a c=amada t4trade de Sa6in, em "#e o feto apresenta =idrocefalia, com macro o# microcefalia ,em :;A dos casos/, retinocoroidite ,em 9;A dos pacientes com infec*+o/, calcifica*>es cere6rais ,em F9A/ e retardo mental o# pert#r6a*>es ne#rol5gicas ,em F;A dos casos/3 o rec4m9nascido tam64m pode apresentar les>es iniciais como n5d#los miliares disseminados por todo o enc4falo, o# em torno de focos necr5ticos3 os ventr%c#los cere6rais podem estar dilatados e as les>es cere6rais podem se calcificar. Do mesmo modo, o#tras altera*>es oc#lares ainda podem acontecer, como gra#s vari@veis de degenera*+o e edema de retina, les>es vasc#lares da cor5ide, ne#rite 5ptica, microftalmo, nistagmo, estra6ismo, entre o#tras. Hntre as manifesta*>es ne#rol5gicas podem ser citadas as pert#r6a*>es psicomotoras, conv#ls>es, opist5tono, etc. s crian*as "#e so6revivem J to<oplasmose cong?nita s+o, na maioria das ve$es, mentalmente retardadas,2F/. manifesta*+o cl%nica da to<oplasmose no momento do nascimento 4 infre"Kente, por4m 4 a forma mais grave de apresenta*+o no neonato. Hla pode se apresentar como infec*+o generali$ada, com =epato e esplenomegalia, miocardite, pne#monia, icter%cia, n#m rec4m9nascido de aspecto premat#ro, o "#e geralmente corresponde a infec*>es tardias d#rante a gravide$. s infec*>es cong?nitas, na s#a maioria, s+o assintom@ticas no momento do

nascimento, por4m a "#ase totalidade dos neonatos com tais doen*as apresentam se"Kelas em alg#m momento da vida, principalmente complica*>es de tipo oc#lar o# do sistema nervoso central. M#itos casos de retinocoroidite na vida ad#lta podem ser conse"K?ncia de #ma to<oplasmose cong?nita assintom@tica no momento do nascimento,F/. ' diagn5stico definitivo de to<oplasmose cong?nita pode ser dif%cil em crian*as nascidas de m+es nas "#ais foi diagnosticada o# s#speitada a infec*+o d#rante a gravide$. Materiais para investiga*+o do parasito o# amostras de sang#e seriadas podem n+o estar dispon%veis e, em adi*+o, o diagn5stico sorol5gico 4 complicado pela presen*a de &gM materna antito<oplasma, a "#al pode ser detectada no sang#e da crian*a d#rante o primeiro ano de vida,8C/. maior parte dos casos de to<oplasmose p5s9natal o# ad"#irida n+o e<i6e #m "#adro cl%nico definido. Bos indiv%d#os im#nocompetentes a parasitose cost#ma ser assintom@tica, 12/ o# oligossintom@tica, en"#anto nos pacientes im#nocomprometidos ,portadores de N&V, neoplasias, transplantados, entre o#tros/ podem ocorrer "#adros de gravidade vari@vel, capa$es de provocar a morte. G considerada #ma das maiores ca#sas de mor6imortalidade em pacientes com s%ndrome de im#nodefici?ncia ad"#irida , &DS/,2;, 28, 81/. ' sistema im#nol5gico desenvolve im#nidade =#moral ativada pelo sistema complemento, preferencialmente com anticorpos &gM e &g , no caso de transmiss+o oral mediada pela ingest+o de oocistos mad#ros,12, 19/, e posteriormente com &gM e &gH. &gM aparece apro<imadamente na primeira o# na seg#nda semana ap5s a infec*+o, alcan*ando #m pico em seis a oito semanas, "#ando ent+o declina. Pode permanecer no paciente at4 "#atro a seis meses ap5s o in%cio da infec*+o por T. !ondii ,etapa considerada ag#da o# recente/ o# persistir em t%t#los 6ai<os por mais de 12 meses, sendo considerada &gM resid#al,11/. &gM se encontra tam64m presente desde o in%cio da parasitose, por4m n+o desaparece totalmente, mantendo n%veis no soro por toda a vida, em6ora possam ser mais 6ai<os. Hssa etapa e"#ivale J fase crLnica o# latente da doen*a. Para se ter certe$a do momento da infec*+o to<opl@smica em "#e se encontra #m indiv%d#o, 4 necess@ria a reali$a*+o de testes sorol5gicos "#e detectem anticorpos anti9 T. !ondii, O'MP L&C9C-&S2', . et al. Diagn5stico molec#lar da to<oplasmoseP revis+o 7 0 !ras Patol Med La6 7 v. 81 7 n.8 7 p. 22991: 7 agosto 7 2;;: 211 do tipo &gM e &gM, principalmente. presen*a de altos n%veis de &gM, assim como a persist?ncia de &gM d#rante per%odos longos de tempo, complica a interpreta*+o dos testes sorol5gicos e a discrimina*+o entre casos ag#dos e crLnicos,11, 1F, 1C/.

Diagnstico la$oratorial infec*+o pelo T. !ondii pode ser diagnosticada indiretamente, atrav4s de m4todos sorol5gicos, e diretamente, por rea*+o em cadeia da polimerase ,PC-/, =i6rida*+o, isolamento e anatomopatologia,:1/. 2orologia ' primeiro teste dispon%vel para detectar anticorpos espec%ficos anti9T. !ondii foi a rea*+o de Sa6in9)eldman ,dye test/. Cin"Kenta anos depois da s#a descri*+o, ainda 4 considerado #m teste de refer?ncia com ta<as altas de sensi6ilidade e especificidade. Hntretanto, a s#a #tili$a*+o tem sido restrita pelo #so o6rigat5rio de to<oplasma vivo, o "#e tra$ graves pro6lemas de 6iosseg#ran*a,::/. ' sorodiagn5stico 4 vastamente #sado nos e<ames de rotina da gr@vida para se prevenir a to<oplasmose cong?nita. Diferentes t4cnicas t?m a propriedade de detectar esses anticorpos no sang#e dos pacientes. 2estes como im#nofl#oresc?ncia, =emoagl#tina*+o, immunosor$ent a!!lutination assay ,&S M /, enzyme&lin.ed immunosor$ent assay ,HL&S / o# microparticle enzyme immunoassay ,MH& / t?m papel principal no cen@rio do diagn5stico da infec*+o pelo T. !ondii,1, 11, 12, :1, F1/. 2?m sido evidentes certas limita*>es desses m4todos, #ma ve$ "#e s+o descritas fal=as ao detectar &gM e &gM d#rante a fase ativa da infec*+o, e tem sido demonstrado "#e esses anticorpos podem n+o ser prod#$idos d#rante as primeiras semanas da parasitemia,:;/. Sendo assim, o risco de to<oplasmose cong?nita pode n+o ser detectado nesses casos. Mais recentemente evidencio#9se "#e a avide$ da &gM pelo ant%geno de T. !ondii ,"#e mede a capacidade de liga*+o entre esse anticorpo e se# ant%geno/ medida pela afinidade f#ncional a#menta com o passar do tempo,8I/. &sso, seg#ndo a opini+o de v@rios a#tores, 4 #m marcador informativo J medida "#e a 6ai<a avide$ da &gM poderia ser interpretada como indicador do diagn5stico de infec*+o to<opl@smica recente, em com6ina*+o com #m painel de o#tros e<ames,:1/, por4m ainda 4 evidente #ma e<tensa Danela de valores indeterminados,2I, :9/. De ig#al forma, o diagn5stico sorol5gico da to<oplasmose 4 complicado em pacientes im#nocomprometidos, fetos, rec4m9nascidos, receptores de 5rg+os transplantados e principalmente, em pacientes com &DS. Besses casos e nas gestantes com diagn5stico sorol5gico pres#ntivo de fase ag#da, a detec*+o direta do parasito pode ser proposta,8;, 82/. ' s#rgimento do v%r#s da im#nodefici?ncia =#mana ,N&V/ tem incrementado a necessidade de diagn5sticos mais sens%veis e eficientes para infec*>es oport#nistas. to<oplasmose latente tem o risco de se transformar em encefalite to<opl@smica nesses pacientes,81, 82/. Do mesmo modo, tem se incrementado a necessidade de diagn5sticos

precoces para detectar a reag#di$a*+o de to<oplasmose latente em pacientes com o#tros tipos de im#noss#press+o, tais como cQncer, transplante de 5rg+os e o#tras,8:/. Nsolamento ' isolamento do parasito de sang#e o# o#tros fl#idos corporais demonstraria #ma poss%vel infec*+o ag#da,:1/. M4todos tradicionais de detec*+o direta do parasito como diagn5stico ine"#%voco s+o dificilmente reali$@veis nessa doen*a, devido J ampla dissemina*+o do se# agente ca#sal e ao se# tropismo por v@rias c4l#las do organismo =#mano, gerando negatividade repetida na pes"#isa direta do to<oplasma, 1, :I, I2/. De ig#al forma, sa6e9se "#e a parasitemia 4 detect@vel de forma intermitente em alg#ns pacientes,21, 1:, 88/. Por ser #m parasito intracel#lar o6rigat5rio, a c#lt#ra in vitro 4 complicada de ser mantida, tem c#sto elevado e necessita de longo tempo para fornecer res#ltado, m#itas ve$es s5 sendo efetiva em menos de :;A dos casos. ' isolamento do parasito pode ser feito com a inoc#la*+o em cam#ndongos, o "#e 4 mais sens%vel, por4m re"#er de tr?s a seis semanas e man#ten*+o de animais em 6iot4rios,29, 11, 19, 8:, :;/. Mtodos moleculares D#rante os Rltimos 1: anos, o diagn5stico de agentes infecciosos incl#i o #so de tecnologia "#e envolve os @cidos n#cl4icos. ' diagn5stico de organismos parasit@rios 4 o Rltimo campo da micro6iologia cl%nica "#e incorporo# essas t4cnicas, devido aos c#stos altos dos ensaios de 6iologia molec#lar e Js 6ai<as preval?ncias dessas infec*>es em pa%ses "#e est+o na vang#arda da 6iotecnologia. presen*a do parasito pode ser demonstrada atrav4s de se#s componentes antig?nicos o# de segmentos de DB . Hm 19C:, a estrat4gia para se amplificar #m alvo genLmico mediante a replica*+o do DB in vitro foi descrita,F1/. ' ensaio da PC- 4 #ma t4cnica #tili$ada em testes cl%nicos para O'MP L&C9C-&S2', . et al. Diagn5stico molec#lar da to<oplasmoseP revis+o 7 0 !ras Patol Med La6 7 v. 81 7 n.8 7 p. 22991: 7 agosto 7 2;;: 212 detec*+o de altera*>es gen4ticas o# infec*>es por diferentes agentes etiol5gicos,22/. van*os recentes no con=ecimento do genoma do T. !ondii tornaram poss%vel a #tili$a*+o da PC- para a detec*+o do parasito,8, I2/. mostras de sang#e testadas para se investigar parasitemia por ensaios de PC-, amplificando9se segmentos dos genes !1 e P1; de T. !ondii, mostraram o potencial da t4cnica para o diagn5stico n+o9invasivo da to<oplasmose disseminada,21, 21, 1C, F8, I;/. Diferentes pares de iniciadores para replica*+o in vitro dirigidos a diferentes alvos t?m sido #tili$ados. ' primeiro a ser testado e mais amplamente #sado 4 o gene !1, "#e se encontra repetido em 1: c5pias no genoma do

proto$o@rio parasito. Diversos gr#pos designaram v@rios iniciadores "#e se anelam em diferentes locali$a*>es do gene,9, 2C, 8F, :8, FC, F9/. ' gene !1 poss#i #m taman=o de 2,2O6, foi isolado e descrito por !oot=royd et al. ,19CI/, demonstrando ter #ma nat#re$a repetitiva no genoma. !#rg et al. ,19C9/ demonstraram a alta sensi6ilidade da PC- na detec*+o de apenas #m parasito presente no lisado cel#lar #sando o gene !1 como alvo de amplifica*+o. 0#nto a 1;; mil c4l#las =#manas, esses a#tores conseg#iram detectar at4 #m Rnico parasito. 's res#ltados mostravam a alta especificidade do gene !1 do T. !ondii e a caracter%stica de ser #ma regi+o conservada em todas as cepas testadas. 's res#ltados descritos s#gerem "#e o DB do parasito pode ser detectado diretamente do creme le#cocit@rio. -ecentemente fico# demonstrada a 6ai<a especificidade desse sistema, #ma ve$ "#e foi evidenciada a co9amplifica*+o de o#tras se"K?ncias9alvo nos cromossomos =#manos. B+o o6stante, ainda contin#a sendo o alvo mais #sado no diagn5stico de parasitemia,88/. Hm est#dos citados por Song e -emington ,1991/ e reali$ados por 2=#llie$ et al., foi demonstrado "#e a sensi6ilidade e a especificidade da PC- amplificando o gene !1 de parasitos presentes no l%"#ido amni5tico foi de 1;;A, em contraste com a inoc#la*+o de sang#e fetal o# l%"#ido amni5tico em cam#ndongos e c#lt#ras. possi6ilidade de reali$ar a PC- para detectar T. !ondii em sang#e =#mano, como teste diagn5stico, tem sido descrita,1C/. ssim, a PC- revol#ciono# o diagn5stico pr49natal de to<oplasmose cong?nita, #ma ve$ "#e limita o #so de m4todos invasivos no feto,81, :1, FF/. Um o#tro alvo tam64m amplamente #sado 4 o gene P1;, "#e se encontra representado como c5pia Rnica codificando para o principal ant%geno de s#perf%cie do proto$o@rio. Diferentes pares de iniciadores foram ig#almente propostos para esse gene,21, 19, F2, I1/. Ba literat#ra, protocolos "#e empregam a PC- convencional ,"#alitativa/ para a detec*+o de genes em c5pia Rnica, como o gene P1;, aparecem menos sens%veis,1;/. '#tras se"K?ncias9alvo tam64m t?m sido #tili$adas comoP 1/ o gene codificante para o -B da s#6#nidade menor ri6ossLmica, "#e se encontra repetido em 11; c5pias por genoma3 2/ #m fragmento de :29p6 presente em 2;; a 1;; c5pias por c4l#la3 1/ os genes de c5pia Rnica codificantes para T e T t#6#lina3 e 8/ #m aparente segmento repetitivo de DB n+o9codificante ,2M-1H/,8, 1;, 18, 1I/. Diversos est#dos demonstram a capacidade da PCem amplificar fragmentos espec%ficos de DB a partir de fl#idos corporais diferentes,2, :I, I;/, tais como sang#e,8, :, 9, 21, 21, 82, 81, 8F, F8, FF/, l%"#ido amni5tico,29, 11, 1F, :8/, li"#or,2;, FF, F9/, =#mor a"#oso,I, C, 1C/, fl#ido de lavado 6ronco9alveolar,F;/ e

at4 #rina,2:/. Por o#tro lado, a PC- s5 ser@ positiva em casos de parasitemia3 assim, em casos de to<oplasmose cere6ral o# p#lmonar, a PC- ser@ de #tilidade apenas "#ando =o#ver dissemina*+o o# passagem do parasito para o sang#e, tal como ocorre na etapa ag#da dessa parasitose,81/. Bos casos de 6ai<a parasitemia pode ser o m4todo de escol=a, permitindo a detec*+o do parasito e apontando #ma interpreta*+o mais e<ata da etapa de infec*+o pelo T. !ondii, indispens@vel para a preven*+o do nascimento de #ma crian*a com to<oplasmose cong?nita3 assim como na terapia farmacol5gica e no apoio psicol5gico re"#erido por #ma f#t#ra m+e com pro6a6ilidades de ter esse diagn5stico. Por o#tro lado, nos pa%ses nos "#ais o a6orto terap?#tico 4 permitido, a6ortos desnecess@rios poderiam ser evitados,19/. M#itos a#tores t?m avaliado a PC- como t4cnica de diagn5stico de encefalite to<opl@smica,18/, to<oplasmose p#lmonar e at4 to<oplasmose cong?nita, #sando diferentes protocolos, todos eles s#gerindo estarem corretos e podendo ser indicados. Hsses e<citantes res#ltados s#gerem "#e infec*>es fetais podem ser diagnosticadas cedo na gravide$, atrav4s da an@lise de l%"#ido amni5tico, sem a necessidade de o6ten*+o de amostras de sang#e fetal o# de procedimentos mais invasivos,:F, I1/. B#merosos ensaios t?m sido desenvolvidos, mas nen=#m foi s#ficientemente otimi$ado e validado com #m nRmero grande de indiv%d#os,8, 88, I;/. Seg#ndo !astien ,2;;2/, o diagn5stico por PC- para a to<oplasmose est@ longe de ser padroni$ado e ainda n+o se tem #m consenso "#e defina as condi*>es do m4todo. l4m de o#tros fatores, a sensi6ilidade e a especificidade da PC- dependem n+o s5 da se"K?ncia9alvo no DB do parasito, mas tam64m dos pares de iniciadores de amplifica*+o desen=ados. &n9 O'MP L&C9C-&S2', . et al. Diagn5stico molec#lar da to<oplasmoseP revis+o 7 0 !ras Patol Med La6 7 v. 81 7 n.8 7 p. 22991: 7 agosto 7 2;;: 211 feli$mente, po#co tem sido p#6licado para o Toxoplasma !ondii na literat#ra nesse sentido. pesar das raras propostas de PC- para o diagn5stico de to<oplasmose, elas n+o s+o consens#ais, e mais compara*>es s+o necess@rias para se conseg#ir #ma mel=or padroni$a*+o. PC- em tempo real foi recentemente introd#$ida para o diagn5stico da to<oplasmose. Bessa metodologia s+o com6inados os tempos de amplifica*+o e detec*+o n#ma mesma fase,1:, :F/. t4cnica pode ser #sada para estimar a concentra*+o de parasitos no fl#ido corporal e no caso de l%"#ido amni5tico 4 capa$ de contri6#ir precocemente para o progn5stico da to<oplasmose cong?nita, ao permitir avaliar a concentra*+o de parasitos no mesmo,:F, :C/. Com esse cen@rio, os res#ltados o6tidos por -omand et al. ,2;;8/ mostram

e<celente rela*+o entre carga parasit@ria, per%odo da infec*+o materna e risco de infec*+o fetal, a6rindo novas perspectivas para a valori$a*+o da PC- em tempo real como #m ensaio "#e pode contri6#ir significantemente na orienta*+o diagn5stica e terap?#tica por parte dos o6stetras e infectologistas,:C/. PC- "#antitativa tam64m pode prover dados adicionais "#e a#<iliam na escol=a de tratamento espec%fico. carga parasit@ria pode ser determinada e relacionada com a sintomatologia e o tratamento. Hsse e<ame 4 de #tilidade para o monitoramento da efic@cia do tratamento e pode aD#dar no entendimento da patog?nese da reativa*+o da to<oplasmose,1:/. PC- em tempo real 4 #ma metodologia r@pida, sens%vel e "#antitativa de detec*+o do T. !ondii em amostras cl%nicas. ' ensaio pode ser #sado na rotina de la6orat5rios em com6ina*+o com testes sorol5gicos. G partic#larmente Rtil em pacientes com &DS, #ma ve$ "#e a capacidade destes em gerar &gM se encontra limitada, al4m da dific#ldade encontrada para a interpreta*+o dos est#dos sorol5gicos. 's ensaios "#antitativos pela PC- parecem ser apropriados para o diagn5stico da to<oplasmose e o monitoramento terap?#tico,1:, :C/. Por4m mais est#dos s+o necess@rios para e<plorar o potencial dessa t4cnica no diagn5stico da to<oplasmose,88, :;/. pesar de todos esses esfor*os, perg#nta9se ainda se o diagn5stico da to<oplasmose #tili$ando t4cnicas molec#lares de amplifica*+o de DB 4 ine"#%voco. -elatos de pacientes &gM9negativos com PC- positivas est+o presentes na literat#ra, desconfiando9se de falsa positividade o# se considerando parasitemia na fase crLnica da doen*a,2C/. V@rios casos de PC- positivas em pacientes assintom@ticos s+o referidos e se descon=ece o valor preditivo positivo do teste,8;, 88, 8F/. -onclus*es ' diagn5stico da to<oplasmose 4 ainda =oDe 6aseado na sorologia, e as t4cnicas molec#lares se encontram em etapas recentes de avalia*+o. G m#ito cedo para determinar #ma t4cnica padr+o9o#ro diferente da sorologia, #ma ve$ "#e os diferentes sistemas descritos na literat#ra se mostram efetivos mas nem sempre reprod#t%veis, o# com 6ai<a especificidade. 's m4todos disc#tidos anteriormente t?m nos a#<iliado grandemente no diagn5stico da to<oplasmose. Por4m, devem ser interpretados no conte<to da sit#a*+o cl%nica U =ist5ria do paciente e sintomatologia U associados aos res#ltados dos o#tros e<ames reali$ados. )alta m#ito ainda a percorrer nesse m#ndo da 6iologia molec#lar encamin=ada J aplica*+o de #ma t4cnica para o diagn5stico de #ma parasitemia t+o po#co con=ecida como a prod#$ida pelo Toxoplasma !ondii.

&s ectos recentes no diagnstico molecular da 8e atite P#6licado por Marcos Kinhal em : de D#n=o, 2;;C PM disc#te o diagn5stico da Nepatite C em re#ni+o cient%fica. ' Departamento de Patologia Cl%nica da ssocia*+o Pa#lista de Medicina , PM/ promove, em 2F de D#n=o, a partir das 2;=, #ma -e#ni+o Cient%fica de tema spectos recentes no diagn5stico molec#lar da Nepatite C. &nflama*+o do f%gado ca#sada por infec*+o pelo V%r#s da Nepatite C ,VNC/, transmitido geralmente atrav4s de sang#e contaminado, a Nepatite C pode levar J cirrose, J ins#fici?ncia =ep@tica e ao cQncer de f%gado. infec*+o 4 em geral crLnica, pois o sistema im#nol5gico n+o 4 capa$ de eliminar o v%r#s do organismo espontaneamente ap5s a infec*+o ag#da U a fase inicial da doen*a. Con=ecida como epidemia silenciosa por atingir cada ve$ mais indiv%d#os e por apresentar sintomas leves o# a#sentes, a Nepatite C cost#ma rece6er #m diagn5stico tardio "#e geralmente ocorre apenas "#ando s+o reali$ados e<ames de rotina o# de triagem para a doa*+o de sang#e. ' tratamento 4 feito pela com6ina*+o de #ma prote%na c=amada interferon, "#e ini6e o v%r#s e protege as c4l#las sadias, com #m medicamento con=ecido por ri6avirina. De acordo com patologista cl%nico, Dr. 0o+o -enato -e6ello Pin=o, "#e ministrar@ a re#ni+o, o tema ser@ e<planado, pois a =epatite C 4 #ma infec*+o presente em todas as pop#la*>es do m#ndo "#e se apresenta com fase ag#da assintom@tica seg#ida de fase crLnica m#itas ve$es grave, na "#al em geral ocorre s#a identifica*+o. re#ni+o tratar@ ainda dos m4todos de detec*+o e "#antifica*+o do -B ,Vcido -i6on#cl4ico, mol4c#la "#e constit#i o genoma viral, respons@vel por sinteti$ar, codificar e transportar as prote%nas virais/ do VNC e das aplica*>es das metodologias de identifica*+o e tratamento da doen*a.

!i6liografia =ttpPEE(((.revistavigor.com.6rE2;;CE;FE;:Easpectos9recentes9no9diagnostico9 molec#lar9da9=epatite9cE =ttpPEE(((.scielo.6rEpdfED6pmlEv81n8Ea;1v81n8.pdf =ttpPEE(((.ivdn.#frD.6rEW6XivdnXv;1X;1XDoencasX;1XdiagnosticoX;1.=tm

=ttpPEEla6oratoriogene.infoEMenomicaEDiagnostico9molec#larEla6oratorio;1X<9 fragilXdiagnosticoXmolec#lar.=tm =ttpPEEia=.iec.pa.gov.6rEia=Ef#llte<tEpcEartigosE2;;IED6raspatolmedla62;;Iv81n1p 19I.pdf

S%ndrome do retardo mental associado ao Y9fr@gil s%ndrome do retardo mental associado ao Y9fr@gil 4 a ca#sa mais com#m dos retardos mentais =eredit@rios e, depois da s%ndrome de Do(n, a seg#nda ca#sa gen4tica mais com#m de retardo mental na infQncia, com #ma incid?ncia de 1 em 1:;; em meninos e 1 em 2;;; em meninas. Hla 4 associada ao retardo mental tanto em meninos ,mais grave/ "#anto em meninas ,mais leve/ e afeta em m4dia #m rec4m nascido em cada 2 mil. Clinicamente, al4m do retardo mental nos meninos, a s%ndrome est@ associada a #m dismorfismo facial discreto, a#mento do taman=o das orel=as e desenvolvimento p5s9 p#6eral de macroor"#idismo. B+o =@ dismorfismos nas m#l=eres afetadas. grande importQncia do recon=ecimento cl%nico e diagn5stico espec%fico da s%ndrome do Y9fr@gil vem do fato de "#e virt#almente todos os casos s+o =eredit@rios e familiais. ' diagn5stico de #ma crian*a com a s%ndrome do Y9 fr@gil esta6elece #ma oport#nidade valiosa de fa$er est#dos na fam%lia, para identificar o#tros afetados e portadoras, e de fa$er #m aconsel=amento gen4tico eficiente levando J preven*+o de novos casos. &nfeli$mente, o diagn5stico cl%nico da s%ndrome do Y9fr@gil na infQncia 4 dif%cil por ca#sa da inespecificidade dos sinais cl%nicos. m#ta*+o "#e ca#sa a s%ndrome do Y9fr@gil 4 a e<pans+o de #m microssat4lite com repeti*>es CMM na regi+o promotora do gene /'+&0. Hm indiv%d#os normais, esta regi+o varia de : a 82 repeti*>es. Hm pacientes com a s%ndrome do Y9fr@gil, esta regi+o apresenta consider@vel e<pans+o para mais de 2;; repeti*>es. Hstas grandes e<pans>es ca#sam metila*+o da regi+o promotora e conse"Kente repress+o do gene /'+&0. Uma pe"#ena propor*+o de pacientes com a s%ndrome do Y9fr@gil apresenta m#ta*>es na se"#?ncia do gene /'+&0. N@ 6asicamente dois tipos de testes la6oratoriais "#e permitem o diagn5stico da s%ndrome do Y9fr@gilP testes cromossLmicos e testes molec#lares. ' valor relativo destes testes depende da sit#a*+o espec%fica. Por e<emplo, para #ma crian*a do se<o masc#lino com retardo mental e po#co o# nen=#m dismorfismo, est@ indicado o est#do cromossLmico completo com pes"#isa espec%fica adicional de Y9fr@gil. grande vantagem deste teste 4 "#e ele tam64m permite o diagn5stico de o#tras altera*>es cromossLmicas "#e podem ser a verdadeira ca#sa do retardo mental. desvantagem 4 de "#e ele 4 relativamente dispendioso e apresenta #ma percentagem pe"#ena, mas significativa, de res#ltados falso9positivos e falso9negativos para a s%ndrome do Y9fr@gil. Por o#tro lado, para #ma menina com retardo mental 4 recomend@vel

fa$er diretamente o teste molec#lar 6aseado no #so de sondas de DB ,m4todo de So#t=ern/, D@ "#e neste caso o est#do cromossLmico para pes"#isa de Y9fr@gil tem fre"#?ncia alt%ssima de res#ltados falso negativos. Pes"#isas recentes reali$adas no MHBH 9 BRcleo de Men4tica M4dica permitiram o desenvolvimento de novos testes molec#lares, 6aseados na PC,-ea*+o em Cadeia da Polimerase/, "#e apresentam sensi6ilidade e especificidade de virt#almente 1;;A para diagn5stico da s%ndrome do Y9fr@gil em afetados do se<o masc#lino ,Naddad et al., 19913 Naddad et al., 19993 Pena e St#r$eneWer, 1999/. s grandes vantagens destes testes s+o rapide$ e 6ai<o c#sto. 2am64m, como os testes s+o 6aseados na PC-, "#antidades m#ito pe"#enas de DB s+o necess@rias, permitindo #sar a coleta de esfrega*o 6#cal, f@cil e indolor, ao inv4s da coleta de sang#e. G nossa opini+o estes testes de triagem deveriam ser reali$ados em toda crian*a masc#lina com retardo mental em "#em se s#speite #m diagn5stico de s%ndrome do Y9 fr@gil o# "#e n+o apresente #ma s#speita diagn5stica espec%fica.
1

Diagnstico molecular da tuberculose pulmonar

Molecular diagnosis of pulmonary tuberculosis
Nelma Cristina Sousa de Assis1, Maria Luiza Lopes2, Ninarosa Calzavara Cardoso3, Maurim lia Mes!uita da Costa", Cint#a de $liveira Sousa", %arla &al ria 'atista Lima( M) tuberculosis Tuberculosis antigen b IS6110 Nested-PCR PCR

#
1. Mestranda do Programa de Ps-Graduao em Sade, Sociedade e Endemias na Amaznia da Uni ersidade !edera" do Par# $U!PA%. &. Pes'uisadora res(ons# e" (e"o )a*oratrio de Mico*act+rias da Seo de ,acterio"ogia e Mico"ogia $Se*ac% do -nstituto E andro ./agas $-E.%, Secretaria de 0igi"1ncia em Sade $S0S%, Minist+rio da Sade $MS%. 2. M+dica (neumo"ogista da re3er4ncia em (neumo"ogia do .entro de Sade Esco"a do Marco, Uni ersidade Estadua" do Par# $Ue(a%. 5. Pes'uisadoras da Se*ac6-E.6S0S6MS. 7. Pes'uisadora res(ons# e" (e"o )a*oratrio de ,io"ogia Mo"ecu"ar da Se*ac6-E.6S0S6MS. 8ra*a"/o rea"izado no )a*oratrio de ,io"ogia Mo"ecu"ar da Se*ac6-E.6S0S6MS. A(oio 3i nanceiro9 !undo Estadua" de .i4ncia e 8ecno"ogia da Secretaria E:ecuti a de .i4ncia e 8ecno"ogia do Par#, con 4nio entre Secretaria E:ecuti a de .i4ncia, 8ecno"ogia e Meio Am*iente $Sectam%, !undo 8ecno"gico $!untec%, MS, .onse"/o ;aciona" de <esen o" imento .ient=3i co e 8ecno"gico $.;P'% e -E. n o 1>&6&>>5.
? ,ras Pato" Med )a* @ . 52 @ n. 1 @ (. 1-A @ 3e ereiro &>>A

unitermos *e# +ords

resumo
A reao em cadeia da (o"imerase $P.B% e suas ariaCes, como a nested-P.B, t4m sido destacadas como t+cnicas mo"ecu"ares (romissoras (ara o diagnstico r#(ido da tu*ercu"ose $8,%. ;o (resente estudo a a"iou-se a nested-P.B uti"izando-se como marcadores mo"ecu"ares a se'D4ncia -SE11> e o ant=geno * a("icados ao diagnstico da 8,. !oram su*metidas a *aci"osco(ia, cu"tura e nested-P.B 12E amostras c"=nicas de (acientes com sus(eita de 8,. F diagnstico de tu*ercu"ose (u"monar 3oi atri*u=do a 11E (acientes e, desses, GA 3oram mu"ti*aci"ares e 111 a(resentaram cu"tura (ositi a (ara M. tuberculosis. As reaCes de nested-P.B identi3i caram A>H $ant=geno *% e G5H $-SE11>% dos casos (auci*aci"ares. Fs a"ores de sensi*i"idade determinados (ara cu"tura, nested-P.B do -SE11> e ant=geno * 3oram G7H, GIH e IEH, res(ecti amente. A es(eci3i cidade 3oi de 1>>H, 17H e 57H (ara cu"tura, nested-P.B do -SE11> e ant=geno *, res(ecti amente. F diagnstico mo"ecu"ar da tu*ercu"ose de e estar 3undamentado na an#"ise conJunta de #rios (ar1metros, como *aci"osco(ia, cu"tura, mani3estaCes c"=nicas, (ro a tera(4utica e /istria (r+ ia de tu*ercu"ose.
M tuberculosis ,uberculose ant-geno b .S/110 Nested12C3

2C3

abstract
Chain reaction of polimerase (PCR) and its variations such as the nested-PCR have been outstanding as promising molecular techniques for the fast diagnosis of the tuberculosis (TB). n the present stud! the nested-PCR "as evaluated using as molecular mar#ers the sequence $%&&' and the antigen b applied to the diagnosis of TB. (ne hundred and thirt! si) clinical samples of patients "ith suspicion of TB "ere submitted to the baciloscopia* culture and nested-PCR. The diagnosis of pulmonar! tuberculosis "as attributed to &&% patients* of these* +, "ere multi-bacilli and &&& presented positive culture for M. tuberculosis. The nested-PCR reactions identifi ed ,'- (antigen b) and +.- ( $%&&') of the acid-fast smear negative cases of tuberculosis. The sensibilit! values determined for culture* and nested-PCR of $%&&' and antigen b "ere +/-* +0- and 0%-* respectivel!. The specifi cit! "as &''-* &/- and ./- for culture* nested-PCR of $%&&' and antigen b* respectivel!. The molecular diagnosis of the tuberculosis should be based in the combined anal!sis of several parameters* as the baciloscopia* culture* clinical manifestations* therapeutic proves and previous histor! of tuberculosis.
2rimeira submiss4o em 0"51050/ 6ltima submiss4o em 2751150/ Aceito para publica84o em 2951150/ 2ublicado em 2050250:

A3,.;$ $3.;.NAL !RI"IN#$ P#P%R

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*aci"osco(ia, cu"tura e P.B. As amostras 3oram encamin/adas no (er=odo de outu*ro de &>>& a a*ri" de &>>5. A *aci"osco(ia 3oi rea"izada (e"o m+todo de Kie/"-;ee"sen, en'uanto a cu"tura 3oi 3eita em meio )LMnestein-?ensen a(s tratamento com "auri"su"3ato de sdio, segundo o Manual de Bacteriologia da Tuberculose$A%. F <;A mico*acteriano 3oi e:tra=do diretamente do escarro a(s 3" uidi3i cao com ;-aceti"ciste=na a &> mg6m" e tratado com (roteinase N e 3eno"-c"oro3rmio. .ada 1 m" do escarro 3oi tratado com 1 m" de ;-aceti"ciste=na, /omogeneizado, incu*ado a 2Ao. (or 1& /oras a(ro:imadamente e centri3ugado (or 1> minutos a 7.>>> r(m. Ao (reci(itado adicionaram-se 1>> O" de tam(o de /omogeneizao $trisP.) 1 M, (P IQ ;a." 1 MQ #cido eti"enodiaminotetrac+tico RE<8AS >,7 M, (P IQ sacarose%, 1>> O" de tam(o de "ise $tris-P.) 1 M, (P GQ E<8A 1> mM, (P IQ sucrose &>H, dodeci" su"3ato de sdio RS<SS 1>H% e 7 O" de (roteinase N $1> mg6m"%. Essa mistura 3oi incu*ada a 7Eo. (or 1& /oras. T tem(eratura am*iente, 3oram adicionados &>> O" de 3eno"-c"oro3rmio-#"coo" isoami" $&79&591%, de(ois /omogeneizados (or 1> minutos e centri3ugados a 12.>>> r(m (or 1> minutos. A e:trao 3oi re(etida com &>> O" de c"oro3rmio#"coo" isoami" $&591%. F so*renadante 3oi trans3erido (ara outro tu*o e adicionaram-se 2> O" de acetato de sdio $2 M, (P 5,I% e 17> O" de iso(ro(ano" (ara (reci(itao do <;A. F <;A 3oi, ento, "a ado com 7>> O" de etano" a A>H, seco a 2Ao. e ressus(enso em tam(o E<8A. As reaCes de nested-P.B (ara cada se'D4ncia a" o $-SE11> e ant=geno *% 3oram rea"izadas (ara um o"ume de 7> O" contendo 1 mM a &,7 mM de Mg."&, >,1& mM de cada deso:inuc"eot=deo, &>> ng de cada iniciador, g"icero" a 1>H, tam(o da 8a' 1U, >,7 U da enzima 8a' <;A (o"imerase $-n itrogen% e &> a 1>> ng do <;A a" o. As se'D4ncias dos iniciadores (ara os res(ecti os <;A a" os e as condiCes da P.B esto descritas na ,abela 1. Fs (rodutos am("i3i cados 3oram su*metidos V e"etro3orese em ge" de agarose a 1H, corados com 1 Og6m" de *rometo de et=dio e isua"izados em transi"uminador de "uz u"tra io"eta. F crit+rio (ara de3i nio de caso de tu*ercu"ose 3oi a *aci"osco(ia (ositi a ou o iso"amento do es(+cime (or cu"ti o, ou c"=nica de tu*ercu"ose com (ro a tera(4utica (ositi a. A an#"ise dos resu"tados 3oi 3eita a a"iando-se o =ndice de #appa $% na eri3i cao de concord1ncia$&5% entre os casos de tu*ercu"ose e os m+todos de diagnstico. Essa an#"ise

3oi rea"izada (or meio do (rograma ,ioEstat 2.>$&%. A sensi*i"idade e a es(eci3i cidade 3oram ca"cu"adas, segundo !"etc/er et al.$1>%, com(arando os testes diagnsASS-S, ;. .. S. et al. <iagnstico mo"ecu"ar da tu*ercu"ose (u"monar @ ? ,ras Pato" Med )a* @ . 52 @ n. 1 @ (. 1-A @ 3e ereiro &>>A

.ntrodu84o
A anos no cam(o da *io"ogia mo"ecu"ar t4m gerado no as t+cnicas (ara o diagnstico de in3ecCes (or meio da deteco de se'D4ncias nuc"eot=dicas es(ec=3i cas dos microrganismos $ 11%. A reao em cadeia mediada (e"a (o"imerase $P.B% tem se destacado como uma das mais (romissoras t+cnicas mo"ecu"ares (ara o diagnstico r#(ido de doenas in3ecciosas$5%. Em*ora a P.B sim("es seJa *astante ti" (ara deteco do M. tuberculosis, um (rocedimento 'ue associa duas P.B $nested-P.B% conci"ia maiores sensi*i"idade e es(eci3i cidade$1E%. MiWazaXi et al.$1E%, ao ana"isarem a t+cnica de diagnstico da tu*ercu"ose (or nested-P.B, re"ataram um "imite de deteco (ara a (rimeira P.B de 1>& U!. com aumento de mi" ezes a(s a segunda reao e sensi*i"idade de at+ >,1 U!.. F custo da P.B na rotina + 3act= e", considerando 'ue o diagnstico r#(ido em (acientes (auci*aci"ares (ermite instituir o tratamento es(ec=3i co o mais (recocemente (oss= e", diminuindo assim as 3ontes *aci"=3eras e, com e"as, a in3eco (e"o M. tuberculosis, (ortanto reduzindo a cadeia de transmisso. F desen o" imento e a (adronizao, (r(rios (ara o teste, tornam seu custo mais acess= e", tendo em ista 'ue essa tecno"ogia de e ser reser ada (ara centros de re3er4ncia na in estigao de casos 'ue demandem diagnsticos r#(idos$7%. 0#rios e"ementos re(etiti os de <;A 'ue contri*uem (ara a ariao gen+tica de ce(as 3oram desco*ertos em M. tuberculosis. Um de"es + a se'D4ncia de insero -SE11>$&I%, 'ue + um e"emento gen+tico de 1.27> (ares de *ases 'ue est# e:c"usi amente (resente nas es(+cies do com("e:o M. tuberculosis$1&* &G, 2>% em di3erentes nmeros de c(ias e integrado em #rios s=tios cromossmicos. A"+m da -SE11>, outras se'D4ncias a" o t4m sido uti"izadas no diagnstico mo"ecu"ar da tu*ercu"ose, como genes 'ue codi3i cam (rote=nas de 2&X<a, 2I X<a, E7 X<a, a (rote=na MP,E5 e os genes dna1 e mtp .'$I, 17, 1E, &>, &7, &A%. F (resente tra*a"/o a a"iou a nested-P.B, uti"izando como a" os mo"ecu"ares a se'D4ncia -SE11>$G, 5% e o gene 'ue codi3i ca uma (rote=na de 2I X<a $ant=geno *% $1, 1E% a("icados ao diagnstico da tu*ercu"ose.

Material e m todo
!oram ana"isadas 12E amostras de escarro de (acientes encamin/ados do .entro de Sade Esco"a do Marco $.SEM% ao )a*oratrio de 8u*ercu"ose do -nstituto E andro ./agas $PA% com sus(eita c"=nica de tu*ercu"ose (ara a rea"izao da

2 Seqncias dos iniciadores e condies da PCR Alvos Seqncia dos iniciadores Produto amplifi cado Ciclos
IS6110 e antgeno b1 Externos (Del Portillo et al., 1996) 5-CGG G CGG!GCG! G!GG-" 5-G !GG CCGCC GGGC!!GC-" 9#$ %b 9$oC & 1 'in 6"oC & 1 'in $0x ()oC & 1 'in Internos (*ollela et al., 1999) 5-CC!GCG GC! GGC G!C GG-" 5-C!CG!CC GCGCCGC!!CGG-"

1)" %b 9$oC & 1 'in 6)oC & 1 'in $0x ()oC & 1 'in ntgeno b1 Externos (+i,a-a.i et al., 199") 5- CC CCG GCGG!!CGCC!G -" 5-G !C!GCGGG!CG!CCC GG!-" $00 %b 9$oC & 1 'in 6"oC & 1 'in $0x ()oC & 1 'in Internos (+i,a-a.i et al., 199") 5-!G CG!!GGCGG G CCG-" 5- !GG!GCCC!GG! C !G-" "$0 %b 9$oC & 1 'in 51oC & 1 'in $0x ()oC & 1 'in

,abela 1 Comparao entre os resultados de cultura, baciloscopia e nested-PCR para o ant !eno b Cultura positiva Cultura ne!ativa "aciloscopia positiva "aciloscopia ne!ativa "aciloscopia positiva "aciloscopia ne!ativa #otal
/-PC0 %ara antgeno b %ositi1o #6 11 )2 1) 111 /-PC0 %ara antgeno b negati1o 11 " 0 11 )5 Casos 3e t4ber54lose22 9( 1$ ) " 116 !otal 3e 5asos in1estiga3os 9( 1$ ) )" 1"6
23m um caso houve contamina45o da cultura e em outro* cultura negativa6 22os casos de tuberculose foram defi nidos usandose como crit7rios a baciloscopia positiva* ou isolamento do esp7cime por cultivo* ou cl8nica de tuberculose com prova terap9utica positiva.

,abela 2
ticos $*aci"osco(ia, cu"tura, nested-P.B (ara o ant=geno * e nested-P.B (ara o -SE11>% com os casos de tu*ercu"ose. F (roJeto 'ue deu origem a este tra*a"/o 3oi su*metido e a(ro ado (e"o .omit4 de Ytica em Pes'uisa do -nstituto E andro ./agas $Protoco"o .EP6-E. Z ;o >>I6&>>5, a(ro ado em && de dezem*ro de &>>5%. !oram o*ser ados os cuidados necess#rios (ara (reser ar a "i*erdade de consentimento dos (acientes en o" idos.

3esultados
Entre os 12E casos in estigados, 11E 3oram caracterizados como tu*ercu"ose (e"os crit+rios adotados. A cu"tura 3oi (ositi a em 111 amostras, sendo GA (ositi as e 15 negati as $,abela 2%. Em duas amostras com *aci"osco(ia (ositi a, uma a(resentou contaminao da cu"tura e outra no mostrou crescimento no cu"ti o. Esses dois casos 3oram considerados tu*ercu"ose, *em com outros tr4s casos com resu"tados de cu"tura e *aci"osco(ia negati os, a(resentando dados c"=nico-radio"gicos sus(eitos, 'ue a(resentaram me"/ora c"=nica a(s tratamento. A nested-P.B 3oi (ositi a em 111 amostras (ara o ant=geno * e em 121 (ara a -SE11>. As re"aCes entre os resu"tados o*tidos em cu"tura, *aci"osco(ia e nested-P.B

so mostradas nas ,abelas 2 e 3. A nested-P.B (ara o -SE11> identi3i cou G5H dos casos de tu*ercu"ose (auci*aci"ar $<igura%. Entre as an#"ises, a nested-P.B (ara a -SE11> a(resentou a maior sensi*i"idade e a menor es(eci3i cidade $,abela "%. A an#"ise de concord1ncia entre os casos considerados tu*ercu"ose e os resu"tados o*tidos (e"a cu"tura e (e"a nested-P.B, di3erenciando os marcadores mo"ecu"ares, so a(resentados na ,abela (.
ASS-S, ;. .. S. et al. <iagnstico mo"ecu"ar da tu*ercu"ose (u"monar @ ? ,ras Pato" Med )a* @ . 52 @ n. 1 @ (. 1-A @ 3e ereiro &>>A

5 Comparao entre os resultados de cultura, baciloscopia e nested-PCR para $S%&&' Cultura positiva Cultura ne!ativa "aciloscopia positiva "aciloscopia ne!ativa "aciloscopia positiva "aciloscopia ne!ativa #otal
/-PC0 %ara IS6110 %ositi1o 96 1$ )2 19 1"1 /-PC0 %ara IS6110 negati1o 1 0 0 $ 5 Casos 3e t4ber54lose22 9( 1$ ) " 116 !otal 3e 5asos in1estiga3os 9( 1$ ) )" 1"6
23m um caso houve contamina45o da cultura e em outro* cultura negativa. 22(s casos de tuberculose foram defi nidos usando-se como crit7rios a baciloscopia positiva* ou isolamento do esp7cime por cultivo* ou cl8nica de tuberculose com prova terap9utica positiva.

,abela 3 (alores de sensibilidade )S*, especifi cidade )+*, falso-positivo e falso-ne!ativo para as &,% amostras de escarro analisadas pelos m-todos molecular e convencional .-todos dia!n/sticos S + 0also-positivo 0also-ne!ativo
C4lt4ra 1116116 (957) )06)0 (1007) 0 5 /-PC0 antgeno b 1006116 (#67) 96)0 ($57) 11 16 /-PC0 IS6110 11$6116 (9#7) "6)0 (157) 1( )
$ensibilidade: propor45o dos indiv8duos com a doen4a que t9m um teste positivo para ela* ou se;a* capacidade de detectar o bacilo em amostras contaminadas6 especifi cidade: propor45o dos indiv8duos sem a doen4a que t9m um teste negativo para ela* ou se;a* capacidade de n5o detectar o bacilo em amostras n5o contaminadas.

,abela " Resultados de concord1ncia dos testes dia!n/sticos em relao aos casos considerados tuberculose Cultura $S%&&' )&2, pb* Ant !eno b ),3 45a* Pos 6e! Pos 6e! Pos 6e!
Casos 3e t4ber54lose Pos /eg 111 0 5 )0 11$ 1( )

" 100 11 16 9 !otal Con5or38n5ia obser1a3a (7) Con5or38n5ia es%era3a (7) 9n3i5e 3e kappa () Inter%reta:;o () 1"6 96," ()," 0,#6() <orte 1"6 #6 #),( 0,19)5 =e1e 1"6 #0,1 ()," 0,)#)# =e1e
Pos: positivo* <eg: negativo.

,abela (
<igura = Percentuais de positividade dos m7todos de diagn=stico (cultura e nested-PCR) nos casos de tuberculose paucibacilar 1I 1E 15 1& 1> I E 5 & > N>mero de casos Cultura 1: 1: 1: 1/ 1"
?72@A ?:0@A ?9"@A

12 N12C3 ant-g) b N12C3 .S/110 Amostras paucibacilares Amostras positivas para cultura e nested12C3
ASS-S, ;. .. S. et al. <iagnstico mo"ecu"ar da tu*ercu"ose (u"monar @ ? ,ras Pato" Med )a* @ . 52 @ n. 1 @ (. 1-A @ 3e ereiro &>>A

Discuss4o e conclusBes
A an#"ise dos resu"tados o*tidos identi3i cou a nested-P.B (ara -SE11> como a t+cnica mo"ecu"ar de maior sensi*i"idade $GIH% 'uando em com(arao com a P.B (ara o gene codi3i cante do ant=geno * $IEH%. ;o Amazonas, FgusXu e Sa"em$1G% o*ti eram (ositi idade de G&H e IAH na P.B 'uando uti"izaram como marcador mo"ecu"ar o -SE11> e o ant=geno *, res(ecti amente, (ara o diagnstico da tu*ercu"ose (u"monar. Segundo os autores, de ido V se'D4ncia -SE11> estar (resente em m"ti("as c(ias no genoma do M. tuberculosis, /# uma maior sensi*i"idade da P.B em com(arao com am("i3i caCes de se'D4ncias de c(ias

nicas $2IX<a, E7X<a, MP,E5%, mesmo 'uando essas so su*metidas a nested-P.B. [uero" et al.$&2% uti"izaram P.B (ara am("i3i car um 3ragmento de 1&2(* da se'D4ncia de insero -SE11> e o*ti eram (ositi idade em GAH dos 1>7 (acientes com diagnstico c"=nico de tu*ercu"ose. Fs autores re"atam, ainda, 'ue todos os casos de cu"tura (ositi a ti eram P.B (ositi o. ;o (resente estudo, 15 amostras de escarro com cu"tura (ositi a a(resentaram resu"tado negati o na P.B (ara o ant=geno *, e uma tam*+m a(resentou resu"tado negati o (ara a -SE11>. Esse 3ato (ode ter sido causado (e"a (resena de su*st1ncias ini*idoras da enzima <;A (o"imerase ou (e"o e:austi o (rocesso de e:trao. F*ser a-se 'ue um dos (ontos im(ortantes (ara o uso da P.B no diagnstico + a o*teno de <;A de 'ua"idade a (artir de amostras c"=nicas. A 'ua"idade do escarro tam*+m (ode in3" uenciar diretamente na (ositi idade da P.B. [uanto mais re(resentati a do trato res(iratrio in3erior 3or a amostra, me"/or ser# o rendimento da deteco mo"ecu"ar$2%. Su33Ws et al.$&E% a a"iaram a P.B como 3erramenta (ara o diagnstico da tu*ercu"ose (u"monar (or meio da am("i3i cao de uma regio de 1AI (* da se'D4ncia -SE11> do M. tuberculosis, no entanto re"ataram (ositi idade em 55H das amostras de escarro com diagnstico c"=nico e radio"gico de tu*ercu"ose. A *ai:a sensi*i"idade 3oi Justi3i cada (e"a introduo de su*st1ncias ini*idoras durante o (rocedimento de e:trao com s="ica-guanidinatiocianato. ,o""e"a et al.$5% de3endem a "a agem e:austi a do <;A o*tido de escarro (ara e"iminao de su*st1ncias ini*idoras da enzima 8a' <;A (o"imerase. F (rocedimento de e:trao de <;A mico*acteriano uti"izado neste tra*a"/o en o" eu #rias eta(as (ara (uri3i cao do <;A, entretanto di ersas 3oram as (ossi*i"idades de (erda do <;A, desde a esco"/a da (oro mais ade'uada do escarro a ser tra*a"/ada at+ a (erda durante trans3er4ncia da 3rao a'uosa a(s (artio em "='uidos imisc= eis, centri3ugao, "a agens e secagem (ro"ongada. Fs dados a(resentados neste tra*a"/o re e"am um e"e ado nmero de resu"tados 3a"so-(ositi os usando o -SE11> $1E casos% ou o ant=geno * $G casos% como marcadores mo"ecu"ares. 8ais resu"tados (odem ser atri*u=dos a contaminao da reao de am("i3i cao (or <;A $am("icons%, (resena de organismos no- i# eis em (acientes tratados ou (acientes com recidi a de tu*ercu"ose. F a" o (ara a P.B no + um microrganismo i o como nas t+cnicas de cu"ti o de c+"u"as, mas uma mo"+cu"a de <;A 'ue (ode estar (resente em uma amostra sem a(resentar signi3i cado c"=nico. Pacientes com (assado de tu*ercu"ose (odem manter <;A do microrganismo (or a"gum tem(o$E%. Segundo Mor#n et al. $&>>>%, resu"tados (ositi os na P.B (odem re3" etir uma in3eco ati a (or M. tuberculosis ou (assado de tu*ercu"ose$1A%. Em seis casos, negati os na *aci"osco(ia e cu"tura, a nested-P.B (ermitiu constatar situao de (assado de tu*ercu"ose $tr4s casos (ositi os (ara a se'D4ncia -SE11>, dois casos (ositi os (ara o ant=geno * e um caso (ositi o (ara os dois a" os mo"ecu"ares%. Esses (acientes 3oram acom(an/ados (or at+ tr4s anos e em nen/um de"es 3oi diagnosticada tu*ercu"ose nos anos seguintes. A introduo de #cidos nuc"+icos contaminantes na mistura da reao (ode ocorrer (or contaminao cruzada em uma amostra contendo um grande nmero de mo"+cu"as-a" o, (or contaminao de reagentes com <;A deri ado de amostras (re iamente ana"isadas e (or acmu"o de (rodutos de P.B $am("icons% no "a*oratrio, de ido V

re(etida am("i3i cao do mesmo a" o. .ada reci(iente de P.B, a(s am("i3i cao, (ode conter a(ro:imadamente 1>1& c(ias de um am("iconQ assim, mesmo um diminuto aerosso" (ode conter um nmero signi3i cati o de contaminantes $1I, &1, &&%. Segundo No: et al.$12%, o risco da contaminao (or am("icons (ode ser remo ido (e"o uso da uraci"-;-g"WcosW"ase $U;G% e da incor(orao da deso:iuridina tri3os3ato $dU8P% no "ugar da deso:itimidina tri3os3ato $d88P%. A U;G atua na degradao dos am("icons contaminantes. <esse modo, es(erase reduzir as reaCes 3a"so-(ositi as, com conse'Dente aumento da es(eci3i cidade da P.B (ara amostras c"=nicas. Para ;oord/oeX et al.$1I%, o uso da dU8P-U;G ser# e3eti o em e itar a contaminao das amostras com am("icons a(enas se nen/uma contaminao (r+ ia ti er ocorrido. A(esar das (recauCes es(eciais tomadas (ara e itar contaminao de so"uCes no desen o" imento dos ensaios deste tra*a"/o, situaCes no identi3i cadas (odem ter inter3erido na *ai:a es(eci3i cidade da nested-P.B a("icada neste estudo.
ASS-S, ;. .. S. et al. <iagnstico mo"ecu"ar da tu*ercu"ose (u"monar @ ? ,ras Pato" Med )a* @ . 52 @ n. 1 @ (. 1-A @ 3e ereiro &>>A

E
A ocorr4ncia de resu"tados 3a"so-(ositi os (ode ser e itada 'uando a"gumas medidas de (re eno so seguidas, como9 a% de3i nir am*ientes es(ec=3i cos (ara e:trao, (re(aro das reaCes de am("i3i cao e e"etro3oreseQ *% autoc"a ar a #gua e so"uCes usadas na P.BQ c% a"i'uotar e estocar os reagentes usados em uma #rea "i re de (rodutos de P.BQ d% usar "u as "im(as durante a rea"izao dos (rocedimentosQ e% uti"izar (onteiras com *arreira ao mani(u"ar (rodutos de P.BQ 3% adicionar a amostra de <;A na P.B em am*iente distante do "oca" de (re(arao da reaoQ g% usar contro"es negati os 'ue seJam mani(u"ados desde a e:trao do <;AQ /% usar contro"es negati os a cada cinco ou 1> amostras tra*a"/adas$E, 15%. 8odos esses cuidados 3oram o*ser ados (e"a nossa e'ui(e. F uso da nested-P.B (ara o -SE11> (ermitiu identi3i car mais de G>H dos casos de tu*ercu"ose (auci*aci"ar. A dis(oni*i"idade de uma 3erramenta como a P.B + de grande uti"idade (ara au:i"iar em situaCes (auci*aci"ares 'ue e:igem diagnstico r#(ido, e dessa 3orma, (ossa contri*uir (ara a instituio da tera(4utica. ;o entanto, antes 'ue tais e:ames se incor(orem V rotina diagnstica, de em-se rea"izar estudos com(arati os e contro"ados (ara otimizao da t+cnica, sem dei:ar de considerar a 3re'D4ncia dos marcadores mo"ecu"ares esco"/idos. .onc"ui-se 'ue a nested-P.B (ode ser uti"izada como 3erramenta au:i"iar no diagnstico da tu*ercu"ose, (or+m associada a outros m+todos e sem dei:ar de considerar o /istrico de tu*ercu"ose do (aciente. Portanto, o diagnstico com tu*ercu"ose de e estar 3undamentado na an#"ise conJunta de #rios (ar1metros, como *aci"osco(ia, cu"tura, mani3estaCes c"=nicas e a (ro a tera(4utica, assim como a P.B, 'ue + mais uma metodo"ogia V dis(osio do diagnstico r#(ido, desde 'ue uti"izada com rigoroso contro"e de 'ua"idade.