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Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)

• Cromatografia líquida que emprega pequenas colunas, preenchidas com materiais especialmente preparados (FE) e uma FM que é eluída sob altas pressões.

• Requer somente que a amostra seja solúvel na FM, independente de sua volatilidade (só não analisa gases).

• Permite qualquer mecanismo de separação (adsorção, partição, troca iônica, exclusão) de acordo com a FE utilizada.

• Limitações: alto custo de instrumentação e operação; falta de detector universal sensível; treinamento de operação demorado.

Onde é aplicada?

• Controle de qualidade e de produção na indústria.

• Análise de medicamentos.

• Determinação de substâncias ativas em matrizes biológicas.

• Análise de polímeros sintéticos.

• Separação e purificação de biopolímeros.

• CROMATOGRAMA: mostra a variação com o tempo de uma medida x, proporcional à concentração da substância eluída.

t = 0

t = t Ri

t = t M

t’ Ri = t Ri – t M

h

o

A

W

injeção

tempo de retenção (tempo entre a injeção e a eluição da concentração máxima do soluto i)

tempo morto

tempo de retenção relativo

altura do pico (distância entre a linha base e

máximo do pico)

área do pico

largura do pico na base (base do triângulo)

• FATOR DE CAPACIDADE

k = t R – t M / t M

– Para uma substância em condições cromatográficas constantes:

t R = constante / k = constante

– Quanto maior a retenção, maior k.

– A medida de k é muito freqüente: para avaliar a retenção e/ou para ajustar a separação.

k

= 2 a 10

poucos componentes

k

= 0,5 a 20

muitos componentes

– O valor de k pode ser alterado modificando-se a força de eluição da FM.

FATOR DE SELETIVIDADE

α = k 2 / k 1

– Para haver separação

– Quanto maior α, maior a separação.

α NÃO depende da força de eluição do solvente, mas da afinidade do soluto pela FM e pela FE.

k 2 k 1 ou α >1.

– Diminuição da força da fase móvel aumento de k

MAS: em geral não aumenta a seletividade!

(aumento proporcional para todos os solutos)

– Para variar α: mudança da FM mudança do pH da FM mudança da FE

PARÂMETROS IMPORTANTES PARA A ESCOLHA DA FM

• Força de eluição do solvente (polaridade)

• Seletividade (tipo / grupo do solvente)

PARA A ESCOLHA DA FM • Força de eluição do solvente (polaridade) • Seletividade (tipo /

Representação esquemática de um sistema CLAE

Representação esquemática de um sistema CLAE

As principais características que devem ser levadas em conta na escolha de um equipamentos para CLAE são:

• Versatilidade

• Rapidez

• Reprodutibilidade e Estabilidade

• Sensibilidade

Fases estacionárias usadas em CLAE

• Materiais ideais:

máxima capacidade de amostra no menor tempo; melhor resolução; fácil introdução na coluna; pequena queda de pressão; baixo custo.

• Partículas dos materiais empregados:

dimensões pequenas; forma regular; diâmetros uniformes; porosas ou peliculares (superficialmente porosas); podem conter fases quimicamente ligadas à sua superfície.

Colunas de separação

Colunas de separação

Materiais de preenchimento das colunas

Materiais de preenchimento das colunas

Fases Estacionárias

Na cromatografia por adsorção/partição a FE deve ser semelhante às substâncias que devem ser retidas nela.

Fase Normal:

FE polar e FM apolar

às substâncias que devem ser retidas nela. Fase Normal: FE polar e FM apolar Fase Reversa

Fase Reversa

FE apolar e FM polar

às substâncias que devem ser retidas nela. Fase Normal: FE polar e FM apolar Fase Reversa

INTERAÇÕES COM FE POLAR

• Retenção de solutos por interações polares é facilitada por solventes não polares (ou pouco polares).

• Eluição de solutos de FE polar é facilitada por solventes polares e alta força iônica (alta concentração de íons).

INTERAÇÕES COM FE APOLAR

• Retenção de solutos por interações apolares é facilitada por solventes polares.

• Eluição de solutos de FE apolar é facilitada por solventes não polares ou pouco polares.

Exemplo: força de eluição H 2 O > hexano em FE polar

força de eluição hexano > H 2 O em FE apolar

Modificação

Grupo ligado à sílica

Aplicações

Modificação Grupo ligado à sílica Aplicações

Modificação

Grupo ligado à sílica

Aplicações

Modificação Grupo ligado à sílica Aplicações

Fases móveis usadas em CLAE

• Podem ser: solventes orgânicos; soluções aquosas; misturas

• Composição constante (sistema isocrático); composição variável (eluição por gradiente de concentração)

• Características

– bom solvente para as amostras ideal: solvente da amostra = eluente caso contrário: miscíveis

– baixa reatividade

– baixa viscosidade

– segurança: atóxico; não corrosivo

– alto grau de pureza

– compatibilidade com o detector utilizado Ex.: detector UV-VIS solvente transparente ao λ itilizado

Metanol e acetonitrila mais usados

– forças semelhantes, mas através de interações diferentes:

MeOH – pontes de H Acetonitrila – interações dipolo

– Vantagens:

• Acetronitrila – menos viscosa

• MeOH – menos tóxico

de H Acetonitrila – interações dipolo – Vantagens: • Acetronitrila – menos viscosa • MeOH –

Força do solvente (série eluotrópica)

Força do solvente (série eluotrópica)

CUIDADOS COM A FM

• Não pode ter material particulado

obstrui o filtro de entrada da coluna (diâmetro do

poro menor que o diâmetro das partículas da FE)

aumenta pressão do sistema

• Todo solvente deve ser pré-filtrado e degaseificado

grande maioria dos problemas diários é devido

a ar na coluna (alteração na pressão)

• Degaseificação:

– agitador mecânico (lento)

– filtração à vácuo

– ultrassom (15 minutos é suficiente)

As técnicas da CLAE

Cromatografia líquido-sólido ou por adsorção

O mecanismo de separação da CLS baseia-se na competição que existe entre as moléculas da amostra e as da fase móvel em ocupar os sítios ativos na superfície de um sólido (FE).

1º molécula da FM deslocada molécula do

soluto ser adsorvida

É importante que as partículas da FE tenham

grande área superficial (grande nº de sítios ativos).

Cromatografia líquido-líquido ou por partição

O mecanismo de separação da CLL baseia-se nas diferentes solubilidades que apresentam os componentes da amostra na FM e na FE.

Os componentes + solúveis na FE são

seletivamente retidos por ela, enquanto os – solúveis

são transportados mais rapidamente pela FM.

Inconveniente: solubilidade da FE na FM.

Solução: materiais que contenham a FE

quimicamente ligada a um suporte sólido.

Cromatografia líquida com fase ligada (CLFL)

O mecanismo de separação principal da CLFL baseia-se na partição . FE com grupos de superfície ativos: adsorção

Variando a natureza dos grupos funcionais da FE é possível obter diferentes tipos de seletividade.

Limitação: a quantidade de FE que é possível ligar a um suporte (geralmente partículas de sílica) é limitada quantidades pequenas de amostras.

Aplicação: moléculas de baixa ou média polaridade, não iônicas, de MM < 2000 e solúveis em solvente orgânico.

Cromatografia por exclusão (CE)

A CE efetua a separação de acordo com o tamanho efetivo das moléculas.

FE = material inerte cujos poros têm tamanho controlado.

As moléculas pequenas podem penetrar na

maioria dos poros e apresentam um maior t R .

MM = 1000 até vários milhões

Aplicação: moléculas de alta MM (polímeros)

Cromatografia por troca iônica (CTI)

Na CTI a FE é, normalmente, uma resina de poliestireno entrecruzada com divinilbenzeno, a qual são ligados grupos iônicos.

Exemplo: resina trocadora de cátions: -SO 3 resina trocadora de ânions: -NR 3 +

-

Os grupos têm um contra-íon (com carga oposta) que pode ser deslocado por íons da FM de carga similar a ele.

Exemplo: resina trocadora de cátions

M + + R-SO 3 - Na + Na + + R-SO 3 - M +

FE para CLAE com fase ligada

• A superfície da sílica que é o suporte mais popular, pode ser modificada por um destes caminhos, entre outros:

a) Formação de ligação siloxano (Si-O-SiR 3 ) por reação

do grupo silanol com um organoclorosilano:

Si-OH + R 3 SiCl Si-O-SiR 3 + HCl

b) Formação da ligação em duas etapas:

silanol + cloreto de tionila cloreto cloreto + organometálico grupo orgânico diretamente ligado à superfície da sílica

Si-OH + SOCl Si-Cl + SO 2 + HCl

Si-Cl + Ri Si-R + LiCl

Detectores usados em CLAE

• Detector ideal:

– Alta sensibilidade e baixo limite de detecção.

– Resposta rápida a todos os solutos.

– Insensibilidade a mudanças na temperatura e na vazão da FM.

– Resposta independente da FM.

– Resposta linear com a quantidade de soluto.

– Não destruição do soluto.

– Informação qualitativa do pico desejado.

Detector por absorvância nas regiões do ultravioleta e do visível

• Seu funcionamento baseia-se na absorção de luz pela da amostra ao passar através dela qualquer radiação eletromagnética; normalmente isso ocorre na região do ultravioleta até o infravermelho em um dado λ.

λ variável: detector espectrofotométrico 1 ou 2 λ’s fixos: detector fotométrico (254 e 280nm)

• Sensibilidade: até 0.001 unidades de absorvância

• Limite de detecção: até 10 -9 g

• Quando muda a fase móvel (gradiente) que absorve no UV cela de referência para compensar variação

Detector por índice de refração

• É o segundo mais usado em CLAE.

• Acompanha continuamente a diferença de índice de refração entre a FM pura e o efluente que sai da coluna contendo os componentes da amostra.

• Para solutos que não absorvem no UV ou visível.

• Resposta universal, mas sensibilidade moderada (10 -6 g 10 -7 unidades de índice de refração)

• Para observar essa diferença é necessário um controle de temperatura de 0,001°C.

• Outro problema: sensibilidade às variações de vazão e mudanças na composição da FM, o que impede o uso de gradientes (não há par de solventes com ir idênticos)

Exemplo 1 : Fase reversa – efeito da coluna Retenção de hidrocarbonetos aromáticos a) Coluna

Exemplo 1:

Fase reversa – efeito da coluna

Retenção de

hidrocarbonetos

aromáticos

a) Coluna C8

b) coluna C18

Hidrocarbonetos

aromáticos:

benzeno naftaleno fluoreno antraceno

1,2-benzantraceno