ANDREAS KAROLY GOMBERT

Anlise de Redes Metablicas em

Saccharomyces cerevi si ae





Tese apresentada Escola
Politcnica da Universidade de
So Paulo para obteno do
ttulo de Doutor em Engenharia.








So Paulo
2001


ANDREAS KAROLY GOMBERT






Anlise de Redes Metablicas em
Saccharomyces cerevi si ae





Tese apresentada Escola
Politcnica da Universidade de
So Paulo para obteno do
ttulo de Doutor em Engenharia.

rea de Concentrao:
Engenharia Qumica

Orientador:
Beatriz Vahan Kilikian


So Paulo
2001




























Gombert, Andreas Karoly
Anlise de Redes Metablicas em
Saccharomyces cerevisiae. So Paulo, 2001.
122 p. + apndice

Tese (Doutorado) - Escola Politcnica da
Universidade de So Paulo. Departamento de
Engenharia Qumica.

1. Anlise de fluxos metablicos 2.
Represso por glicose 3. Saccharomyces cerevisiae
I. Universidade de So Paulo. Escola Politcnica.
Departamento de Engenharia Qumica II. t

Dedico esta tese aos meus pais, ao
meu irmo e a minha av, que so a
razo, o apoio e o amor, sempre.
AGRADECIMENTOS

Uma tese no fruto do trabalho solitrio, pelo contrrio, ela
resultado da dedicao de vrias pessoas. Por isto, aqui vo alguns
agradecimentos queles que deram sua contribuio, maior ou menor,
para que este objetivo fosse atingido.
Em primeiro lugar, gostaria de agradecer Profa. Beatriz Vahan
Kilikian pela orientao, pelo apoio, pelo estmulo, pela dedicao, pelo
exemplo, que vm desde o meu trabalho de mestrado e, principalmente,
pelo incentivo constante s minhas atividades.
Desde a elaborao do plano de trabalho, at os instantes finais
desta tese, o Prof. Jens Nielsen teve participao importantssima. Por
aceitar-me em seu laboratrio, por orientar-me num desconhecido
campo e por estimular-me sempre, um muito obrigado, ou como eles
dizem: mange tak!.
Ao Dr. Bjarke Christensen devo um agradecimento especial, pois
ele foi efetivamente quem me iniciou em Anlise de Redes Metablicas.
Alm disto, perto ou distante, ele prestou grande auxlio nos clculos de
fluxos metablicos, sempre com incomparvel sapincia e
inteligentssimo humor.
Agradeo tambm ao Dr. Peter Ktter, o qual, apesar de no
termos nos encontrado pessoalmente, providenciou, de forma eficiente e
rpida, os mutantes utilizados neste trabalho
s tcnicas Jette, Tina, Vibeke e Bettina, muito obrigado pelo
apoio tcnico, sempre preciso e pontual, no laboratrio.
s secretrias Birgitte, Susanne, Kirsten, Bitten e Trine, agradeo
pelo apoio administrativo e burocrtico, muito necessrio quando se
trabalha numa sociedade estrangeira. Aprendi com os dinamarqueses
como os trmites podem ser muito menos burocrticos.
A todos os colegas do Center for Process Biotechnology, em
especial a Margarida e Jochen, por colaborarem, apoiarem, ajudarem,
pedirem, perguntarem, responderem, rirem e sorrirem, sempre que
necessrio, um agradecimento especial.
Profa. Maria Cndida e ao Prof. Aldo Tonso, por apoiarem
minhas atividades, tanto na esfera ideolgica, quando na prtica, muito
obrigado.
Finalmente (last but not least), agradeo CAPES por conceder-
me a bolsa de doutorado sanduche (BEX 1098/98-5), sem a qual todo
este trabalho teria uma cara bem diferente. Este agradecimento inclui
aquele cidado brasileiro que, provavelmente sem sab-lo, teve parte de
seus impostos convertida nesta bolsa e em meu salrio como docente.
ERRATA

- pg. iv: na lista de smbolos, incluir OD
600
=DO
600
=densidade ptica a 600 nm
- pg. 5: onde se l a diferentes concentraes de glicose, leia-se a concentraes
de glicose mais elevadas
- pg. 6: complementando a legenda da Figura 2.1. Nas elipses, encontram-se nomes
de protenas de S. cerevisiae. Nos retngulos, so indicados nomes de genes de S.
cerevisiae (para informaes sobre as protenas e genes indicados, favor referir-se a
www.proteome.com)
- pg. 11: onde se l a jusante, leia-se cadeia abaixo
- pg. 18: aps ... no h acmulo de metablitos internos)., incluir A hiptese de
pseudo estado estcionrio uma boa aproximao para condies de crescimento
balanceado, pois normalmente o valor do fluxo molar de formao e consumo de um
metablito muito superior ao valor da concentrao molar deste metablito. Portanto,
grandes variaes na concentrao de um metablito no levam a grandes diferenas
entre os fluxos molares de formao e de consumo deste metablito.
- pg. 50: onde se l taxa de diluio, leia-se vazo especfica
- pg. 51: onde se l porosidade, leia-se dimetro de poro
- pg. 67: onde se l valor constante, leia-se valor constante de marcao
- pgs. 67 e 68 : onde se l cintica de incorporao de primeira ordem, leia-se
cintica de primeira ordem de lavagem de biomassa no marcada, dada pela equao
u k
dt
du
= , onde u =biomassa no marcada e k =constante
- pg. 71: na legenda da Figura 4.5, onde se l fossem, leia-se seriam
- pg. 73: na Tabela 4.4.1, onde se l SFL, leia-se MAR
- pg. 78: na 18 linha do 1 pargrafo, onde se l leucina, leia-se isoleucina
- pgs. 84, 100, 101 e 102: nas legendas das Figuras 4.7, 4.11, 4.12 e 4.13, onde se l
Fluxos, leia-se Fluxos molares relativos
- pg. 86: onde se l 0,51 mol/g/h, leia-se 0,51 mmol/g/h
- pg. 91: aps ... gene HXK1 (ROSE et al, 1991; KRAAKMAN et al, 1999),
incluir , e pela enzima glicoquinase.
- pg. 105: onde se l Como os dados relativos ao mutante snf1 no so confiveis,
nota-se ..., leia-se Os clculos relativos ao mutante snf1 devem ser rejeitados. Nota-se
...
- pg. 106: aps ... observada nas atividades respiratrias., incluir Aparentemente,
na falha do sensor, a clula no detecta a presena de glicose.
- pg. 109: eliminar o item - h indcios de que a enzima mlica sofre algum tipo de
regulao por glicose.
- pg. 110: onde se l para cercar melhor o problema, leia-se para melhor
investigar o problema
- no texto em geral: onde se l randmico(as), leia-se aleatrio(as)
i
SUMRIO
NOMENCLATURA iii
RESUMO v
ABSTRACT vi
1. INTRODUO 1
1.1. Objetivos 4
2. REVISO BIBLIOGRFICA 5
2.1. Represso por glicose em Saccharomyces cerevisiae 5
2.2. Histrico e aplicaes da Anlise de Fluxos Metablicos 13
2.3. Fundamentos tericos da Anlise de Fluxos Metablicos 18
2.3.1. Balano de metablitos 18
2.3.2. Balano de istopos 26
2.3.3. Modelagem matemtica 27
2.3.4. O caminho para a Anlise de Redes Metablicas 33
2.4. Medida da marcao em metablitos intracelulares por GC-MS 35
2.4.1. Introduo 35
2.4.2. Espectrometria de massa 35
2.4.3. Anlise de fragmentos de aminocidos e carboidratos por GC-MS 39
3. METODOLOGIA 45
3.1. Cepas 45
3.1.1. Preservao 47
3.2. Cultivos 47
3.2.1. Inculo 47
3.2.2. Cultivos descontnuos 48
3.2.3. Cultivos contnuos 50
3.2.4. Solues 51
3.2.5. Esterilizao 51
3.2.6. Tratamento de amostras 51
3.2.7. Tratamento matemtico dos dados 55
ii

4. RESULTADOS E DISCUSSO 61
4.1. Cultivos realizados 61
4.2. Validao da Metodologia 63
4.3. Represso por glicose na cepa referncia 71
4.3.1. Velocidades especficas e fatores de converso 71
4.3.2. Identificao de redes metablicas: inspeo qualitativa dos dados de
marcao
72
4.3.3. Anlise de fluxos metablicos 82
4.4. Represso por glicose em diferentes mutantes 89
4.4.1. Velocidades especficas e fatores de converso 89
4.4.2. Identificao de redes metablicas: inspeo qualitativa dos dados de
marcao
93
4.4.3. Anlise de fluxos metablicos 98
5. CONCLUSES 108
5.1. Represso por glicose na cepa referncia 108
5.2. Represso por glicose em diferentes mutantes 109
5.3. Consideraes finais 109
6. REFERNCIAS 112
APNDICE A-1






iii
NOMENCLATURA

Metablitos

3PG ou G3P 3-fosfoglicerato
ACA acetaldedo
AcCOA acetil coenzima A
ACE acetato
AKG -cetoglutarato
AMP monofosfato de adenosina
ATP trifosfato de adenosina
cAMP monofosfato de adenosina cclica
C1 unidades de 1 carbono
CO ou CO2 dixido de carbono
DNA cido desoxirribonuclico
E4P eritrose-4-fosfato
F6P frutose-6-fosfato
FADH2 flavina adenina dinucleotdeo (forma reduzida)
FUM fumarato
G6P glicose-6-fosfato
GA3P gliceraldedo-3-fosfato
GLC glicose
GLYC glicerol
ICI isocitrato
MTHF tetrahidrofolato de metila
NADH nicotinamida adenina dinucleotdeo (forma reduzida)
NADPH fosfato de nicotinamida adenina dinucleotdeo
(forma reduzida)
OAA oxaloacetato
PEP fosfoenolpiruvato
PHB poli-hidroxibutirato
PKA protena quinase A
PYR piruvato
R5P ribose-5-fosfato
RNA cido ribonuclico
RU5P ribulose-5-fosfato
S7P sedoeptulose-7-fosfato
SUC succinato
SUCCOA succinil coenzima A
X5P xilulose-5-fosfato

Subscritos
cyt citosslico
mit mitocondrial

iv
Aminocidos

Ala alanina
Arg arginina
Asn asparagina
Asp aspartato
Cys cistena
Gln glutamina
Glu glutamato
Gly glicina
His histidina
Ile isoleucina
Leu leucina
Lys lisina
Met metionina
Phe fenilalanina
Pro prolina
Ser serina
Thr treonina
Trp triptofano
Tyr tirosina
Val valina

Demais abreviaturas

AFM anlise de fluxos metablicos
ARM anlise de redes metablicas
DMFDMA dimetilacetal-(N,N-)-dimetilformamida
ECF cloroformiato de etila
EMP Embden-Meyerhof-Parnas (via metablica)
GC-MS Cromatografia gasosa-Espectrometria de massa
GPA glicose pentaacetato
IQDM inspeo qualitativa dos dados de marcao
MAR marcao
NMR Ressonncia Magntica Nuclear
PM peso molecular
PP Pentoses Fosfato (via metablica)
TCA cidos Tricarboxlicos (via metablica, ciclo)
TFAA anidrido do cido trifluoroactico

Smbolos

D vazo especfica (h
-1
)
DO
600
densidade tica a 600 nm

max
velocidade especfica mxima de crescimento (h
-1
)
Y
x/s
fator de converso substrato a clulas (g/g)
v
RESUMO

Anlise de Redes Metablicas foi aplicada cepa de
Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D, e a alguns mutantes
interrompidos em genes que codificam para protenas regulatrias
envolvidas no fenmeno de represso por glicose.

Todas as cepas foram cultivadas em aerobiose, em meio mnimo
contendo [1-
13
C]glicose como substrato limitante. As clulas eram
recolhidas em situao de crescimento balanceado e submetidas
hidrlise, seguida de derivao e posterior injeo da amostra resultante
num cromatgrafo gasoso acoplado a um espectrmetro de massa, para
anlise da marcao em alguns fragmentos de metablitos
intracelulares. Estes dados serviram como base para a identificao da
atividade de algumas vias metablicas no metabolismo central de S.
cerevisiae. Alm disto, utilizando-os juntamente com um modelo
estequiomtrico, foi possvel obter uma estimativa para os fluxos no
metabolismo central na cepa referncia e nos mutantes estudados.

Num primeiro momento, a metodologia foi validada para cultivos
contnuos e descontnuos. Calculou-se um desvio padro para a medida
da marcao em cada fragmento de metablito detectado pela
metodologia empregada. Na cepa referncia, observou-se que o ciclo de
Krebs opera de forma cclica em clulas que respiram e de forma no
cclica em clulas que apresentam metabolismo respiratrio-
fermentativo. Verificou-se que uma maior parte da glicose consumida
desviada para a via das pentoses fosfato no primeiro caso, em relao
ao segundo. Foram encontradas evidncias para a biossntese de glicina
atravs da enzima treonina aldolase e para a atividade da enzima
mlica. A ausncia das protenas Mig1 e Mig2 no altera os padres de
crescimento, produo de etanol e de marcao em metablitos
intracelulares de S. cerevisiae. J a ausncia de Hxk2, Reg1 ou Grr1
provoca alvio na represso por glicose, observado pelo aumento das
atividades respiratrias.
vi
ABSTRACT

Metabolic Network Analysis was applied to the reference strain
CEN.PK113-7D of Saccharomyces cerevisiae, as well as to some mutants
disrupted in genes which code for regulatory proteins involved in the
glucose repression cascade.

All strains were cultivated under aerobic conditions, using
minimal medium with [1-
13
C]glucose as the limiting substrate. Cells
were harvested under balanced growth conditions and submitted to
hydrolysis, derivatization and injection of the sample into a gas
chromatograph coupled to a mass spectrometer for analysis of the
labeling pattern in some fragments of intracellular metabolites. These
data were used for identifying the activity of some pathways in the
central metabolism of S. cerevisiae. Furthermore, using the data
together with a stoichiometric model, it was possible to estimate the
fluxes in the central metabolism of the reference strain and in the
mutant strains.

First, the methodology was validated for batch and continuous
cultivations. Standard deviations were calculated for the measurement
of the fractional labeling in each of the detected fragments. In the
reference strain, it was observed that the Krebs cycle operates in a
cyclic manner in respiratory cells, whereas it operates in a non cyclic
manner under respiro-fermentative metabolism. It was also seen that a
greater part of the glucose consumed by the cells enters the pentose
phosphate pathway in the former than in the later case. Evidence for
the activity of the threonine aldolase and the malic enzyme catalyzed
reactions was also found. The absence of the Mig1 and Mig2 proteins
does not alter the growth, ethanol formation and labeling pattern of
intracellular metabolites in S. cerevisiae. In contrast, the absence of
Hxk2, Reg1, or Grr1 provoques a relief in glucose repression, which was
observed by an increased respiratory activity.





1
1. INTRODUO

O processo de doutoramento que resulta nesta tese foi realizado
no modo chamado sanduche. Numa primeira etapa, no Departamento
de Engenharia Qumica (DEQ) da Escola Politcnica (EP) da
Universidade de So Paulo (USP), foram cumpridos crditos em
disciplinas e foi definido o tema a ser pesquisado na etapa seguinte, a
qual se desenvolveu no Center for Process Biotechnology (CPB),
Department of Biotechnology (IBT), Technical University of Denmark
(DTU). Finalmente, a terceira e ltima etapa deste doutoramento
consistiu no tratamento final dos dados e redao desta tese, a qual foi
realizada no DEQ/EP/USP.
Um momento crucial neste processo foi, sem dvida, a definio
do assunto a ser pesquisado. As muitas buscas e leituras realizadas
levaram gerao, em conjunto com a Profa. Beatriz V. Kilikian, do
DEQ/EP/USP, e o Prof. Jens Nielsen, do CPB/IBT/DTU, do projeto
intitulado Metabolic Flux Analysis of Saccharomyces cerevisiae, o qual
foi aprovado pela CAPES, agncia que patrocinou a etapa desenvolvida
no exterior.
Os dois aspectos principais que caracterizam este trabalho
encontram-se identificados no prprio ttulo do projeto inicial. De um
lado, o modelo de estudo: a levedura Saccharomyces cerevisiae. De
outro, a ferramenta utilizada para estudar este modelo: a Anlise de
Fluxos Metablicos.
Em relao levedura S. cerevisiae, o aspecto abordado foi a
chamada represso por glicose. S. cerevisiae utilizada em processos
industriais para a obteno de vrios produtos, a saber: levedura de
panificao, po, bebidas alcolicas, lcool combustvel e protenas
heterlogas. Nestes processos, os meios de cultivo utilizados como
fonte de nutrientes para S. cerevisiae podem ser o melao de cana-
de-acar ou de beterraba, hidrolisados de matrias amilceas ou
celulsicas, dentre outros. Todos estes meios contm, em diferentes


2
quantidades e propores, um certo nmero de fontes de carbono,
usualmente uma mistura de acares (mono e dissacardeos) (OLSSON;
NIELSEN, 2000). Glicose est sempre presente nestes meios de cultura
e, sendo o monossacardeo mais abundante no planeta, provocou a
adaptao do metabolismo dos microrganismos terrestres a sua
deteco e consumo (JOHNSTON, 1999). De fato, um dos fenmenos
regulatrios mais observados em microrganismos a chamada
represso catablica, ou simplesmente represso por glicose
(GANCEDO, 1998). O nmero de artigos cientficos dedicados a este
tema ilustra a importncia e abrangncia do mesmo. Nos ltimos cinco
anos, somente em termos de represso por glicose na levedura S.
cerevisiae, pelo menos seis revises foram publicadas (RONNE, 1995;
ENTIAN; SCHLLER, 1997; GANCEDO, 1998; CARLSON, 1999;
JOHNSTON, 1999; THEVELEIN; DE WINDE, 1999). Apesar de
importante na natureza, como forma de reduzir os gastos de energia
atravs da adaptao do metabolismo ao consumo da fonte de carbono
mais importante, a represso por glicose pode ser bastante indesejada
no mbito industrial. Este fenmeno afeta negativamente parmetros
como produtividade e rendimento, os quais so essenciais para a
viabilidade e bom desempenho dos processos.
Em relao a Anlise de Fluxos Metablicos (AFM), trata-se de
uma ferramenta de anlise do metabolismo. Sendo o metabolismo o
conjunto de todos os processos qumicos que ocorrem numa clula
(MADIGAN et al, 1997), de extrema importncia estud-lo a fundo
para entender como devemos manipular o genoma e as condies de
cultivo de um organismo, no sentido de melhorar os processos de
obteno de produtos de interesse para o homem. Uma das estratgias
mais utilizadas no melhoramento de organismos tem sido a induo
randmica de mutaes e subseqente seleo dos mutantes mais
promissores, os quais so identificados por processos de "screening". No
entanto, o rpido desenvolvimento da gentica molecular,
principalmente da tecnologia do DNA recombinante, vem possibilitando


3
um melhoramento gentico mais dirigido, atividade denominada
engenharia metablica (STEPHANOPOULOS et al, 1998). Atualmente,
encontram-se disponveis protocolos experimentais para praticamente
qualquer manipulao gentica a ser introduzida em organismos de
importncia industrial. No entanto, ainda no est to bem resolvida a
questo de qual a melhor forma de se aplicar estes protocolos, ou seja,
quais genes devem ser modificados e de que maneira. A dificuldade
reside no fato de que as clulas vivas so extremamente complexas, de
modo que uma determinada modificao gentica raramente produz
nica e exclusivamente o efeito desejado. Desta forma, importante que
se compreenda a complexa relao existente entre as vrias reaes e
mecanismos regulatrios que fazem parte do metabolismo celular,
quando se objetiva obter um organismo produtor com caractersticas
melhoradas.
O primeiro passo a ser seguido para um melhor entendimento dos
mecanismos celulares a observao do sistema sob diferentes
condies, residindo neste ponto a importncia dos chamados estudos
fisiolgicos. Ao mesmo tempo, uma anlise detalhada torna-se
complicada medida em que a maioria das reaes metablicas ocorre
dentro do ambiente celular e usualmente as medidas experimentais,
como o consumo de substratos e a formao de produtos, so
realizadas no meio extracelular. Se por um lado as medidas
intracelulares so bem mais complexas do ponto de vista experimental,
o grau de entendimento da estrutura da rede metablica, a qual
formada por inmeras reaes, est diretamente relacionado
disponibilidade e qualidade destas medidas. O desafio de se
compreender o metabolismo celular, baseando-se exclusivamente em
informaes sobre as trocas materiais entre os ambientes intra e
extracelular, assemelha-se tentativa de se compreender o
funcionamento de uma fbrica utilizando-se unicamente dados sobre as
matrias-primas utilizadas e os produtos que saem da mesma. A falta
de medidas que podem ser relacionadas aos fenmenos que ocorrem


4
nos processos celulares portanto um dos grandes obstculos
compreenso dos mesmos. Neste contexto, a utilizao de substratos
marcados isotopicamente em cultivos de laboratrio facilita a tarefa da
obteno de quantidades mensurveis no material biolgico em estudo,
o que pode ser utilizado para o entendimento mais detalhado do
funcionamento do metabolismo celular. Estas medidas, juntamente com
exerccios de modelagem matemtica, permitem que fluxos metablicos
sejam quantificados, contribuindo de forma significativa ao estudo, no
somente qualitativo, mas tambm quantitativo, do metabolismo celular.
Dentro deste esprito, a parte experimental deste doutoramento
consistiu na realizao de cultivos da levedura S. cerevisiae em reator
de pequeno volume, utilizando-se meio de cultura contendo glicose
marcada com carbono 13. Atravs de medidas da marcao em alguns
metablitos intracelulares e da modelagem matemtica do metabolismo,
foi possvel quantificar fluxos metablicos. No somente as condies
ambientais foram variadas nos cultivos realizados, mas tambm as
cepas. Diferentes mutantes de S. cerevisiae, interrompidos em genes
regulatrios envolvidos no fenmeno de represso por glicose, foram
utilizados.

1.1. Objetivos

Verificar a influncia de diferentes condies de represso por
glicose no metabolismo central (via de Embden-Meyerhof-Parnas, via
das pentoses fosfato, ciclo dos cidos tricarboxlicos e reaes
adjacentes) de Saccharomyces cerevisiae atravs da Anlise de Fluxos
Metablicos.






5
2. REVISO BIBLIOGRFICA

2.1. Represso por glicose em Saccharomyces cerevisiae

A represso por glicose pode ser definida como o controle da
expresso gnica, na etapa de transcrio, que ocorre quando as clulas
so submetidas a diferentes concentraes de glicose. Genes envolvidos
em diferentes funes celulares so afetados pela represso por glicose.
As principais funes so as seguintes (ENTIAN; SCHLLER, 1997;
CARLSON, 1999):
- utilizao de dissacardeos;
- metabolismo de galactose;
- respirao (ou cadeia respiratria);
- ciclo dos cidos tricarboxlicos;
- utilizao de diferentes fontes de carbono;
- gliconeognese;
- ciclo do glioxilato;
- -oxidao (ou funes do peroxissomo).
Apesar de ter sido amplamente observada por muitas dcadas, os
mecanismos atravs dos quais a represso por glicose ocorre no esto
completamente elucidados. O gatilho ou sinal inicial, atravs do qual a
glicose detectada pelas clulas, ainda no foi identificado, mas h
fortes evidncias de que a fosforilao da glicose intracelular a glicose-
6-fosfato pela enzima hexoquinase exerce um papel essencial na
represso por glicose (KRAAKMAN et al, 1999). Por outro lado, h
evidncias de que a concentrao de glicose mais importante do que o
fluxo de consumo de glicose (o que de certa forma contraditrio ao
resultado anterior) no fenmeno de represso por glicose (MEIJER et al,
1998).


6
I ra2 I ra1
acidificao intracelular
Ras
Gpa2
Cyr1
CAP
adenilato ciclase
GLICOSE
iminncia da trans-
ferncia de fosfato
atividade
cataltica
GLICOSE-6-P
ATP
ADP
cAMP
Tpk1- 3 Bcy1
protena quinase A
AMP
AMP
Cdc25
Sdc25
?
Pde1 Pde2
sinal
SCF
protena
Grr1
contedo de trealose
e glicognio
resistncia ao
stress
crescimento
gliclise
Rgt 1
ativador de transcrio
requerido para desrepresso
de genes respiratrios
e do ciclo TCA, como
CIT1 e QCR8
HAP4
X
Snf 1
Snf 4
Reg1
Glc7
?
Mig1/2
genes de transporta-
dores de hexoses
HXT
X
Mig1/2
Gal83
Sip1
Sip2
CAT8
X
Mig1/2
Cat 8
Sip4
PCK1, FBP1, etc
CSRE
Sip4
genes gliconeognicos
PCK1, FBP1, etc
CSRE
Cat 8
?
gliconeognese
genes de utilizao
de acares
SUC,MAL,etc
X
Mig1/2 Mig1/2
Rgt 1
HXT
X
Hxk2 Gpr1

FIGURA 2.1 Elementos que fazem parte da represso por glicose. Setas normais indicam ativao/induo. Setas com final reto
indicam inativao/represso. esquerda, est representada a via cAMP-PKA, direita a via principal.


7
H pelo menos duas vias de transduo de sinal na represso por
glicose em S. cerevisiae: a chamada via principal (da qual faz parte a
protena Mig1) e a via cAMP-protena quinase A (cAMP-PKA),
anteriormente conhecida como via Ras-cAMP (CARLSON, 1999;
JOHNSTON, 1999; THEVELEIN; DE WINDE, 1999) (FIGURA 2.1). No
primeiro caso, foi recentemente demonstrado que o papel da enzima
hexoquinase 2 na represso por glicose est relacionado formao de
um intermedirio de transio estvel na iminncia da reao de
transferncia do radical fosfato (de uma molcula de ATP para uma
molcula de glicose), o que gera uma modificao conformacional na
enzima (KRAAKMAN et al, 1999). Esta modificao seria um sinal, que
ento transduzido de alguma forma para uma protena quinase
chamada Snf1, provavelmente por fosforilao (CARLSON, 1999). A
protena Snf1, por sua vez, interage com a protena Mig1, a qual se liga
ao DNA (FIGURA 2.2). Para isto, a protena Mig1 recruta a atividade de
duas outras protenas, chamadas Tup1 e Cyc8 (ou Ssn6) (WU;
TRUMBLY, 1998). Mig1 responsvel pelo reconhecimento de uma
seqncia especfica na regio promotora de genes reprimidos por
glicose, enquanto que as protenas Tup1 e Cyc8 so as que efetivamente
reprimem a transcrio, impedindo que a RNA polimerase se ligue ao
DNA (KLEIN et al, 1998). As seqncias especficas reconhecidas pela
protena Mig1 so ricas em GC (NEHLIN; RONNE, 1990). Alm da
protena Mig1, existe outra protena, chamada Mig2, que se liga a este
tipo de seqncias especficas em S. cerevisiae e promove represso
parcial do gene SUC2 (LUTFIYYA; JOHNSTON, 1996; LUTFIYYA et al,
1998). O funcionamento da represso atravs de Mig1 depende da
localizao intracelular desta protena, a qual por sua vez est
relacionada a sua fosforilao e ao estado (ativo ou inativo) da protena
Snf1 (STLING; RONNE, 1998; TREITEL et al, 1998) (FIGURA 2.3).



8
genes MAL
Mig1
Cyc8
Tup1
UAS(MAL)
Mal63
MAL63

FIGURA 2.2 Esquema do mecanismo de represso pela protena Mig1. A
represso pode ocorrer tanto pela ligao de Mig1 regio promotora do gene (na
figura esto representados os genes para utilizao da maltose), como pela ligao de
Mig1 regio promotora do ativador de transcrio do gene (no caso da figura, Mal63
um ativador de transcrio dos genes MAL).

Snf1 Snf1 Snf1 Snf1
glicose alta glicose alta glicose alta glicose alta
Snf1 inativa Snf1 inativa Snf1 inativa Snf1 inativa
Snf1 Snf1 Snf1 Snf1
Mig1 Mig1 Mig1 Mig1
P PP P
ncleo ncleo ncleo ncleo
citoplasma citoplasma citoplasma citoplasma
inativa inativa inativa inativa
inativa inativa inativa inativa
ligao ao DNA ligao ao DNA ligao ao DNA ligao ao DNA
Mig1 Mig1 Mig1 Mig1
Snf1 Snf1 Snf1 Snf1
glicose baixa glicose baixa glicose baixa glicose baixa
Snf1 ativa Snf1 ativa Snf1 ativa Snf1 ativa
Snf1 Snf1 Snf1 Snf1
ncleo ncleo ncleo ncleo
citoplasma citoplasma citoplasma citoplasma
ativa ativa ativa ativa
ativa ativa ativa ativa
Mig1 Mig1 Mig1 Mig1
P PP P
Mig1 Mig1 Mig1 Mig1
P PP P

FIGURA 2.3 Esquema da localizao intracelular da protena Mig1. Quando Snf1
est inativa (glicose alta), Mig1 no est fosforilada e migra para o ncleo, ligando-se
ao DNA de genes reprimidos por glicose, promovendo represso de sua transcrio.
Quando Snf1 est ativa (glicose baixa), Mig1 fosforilada, migrando para o
citoplasma, aliviando a represso.

A protena quinase Snf1 tem um papel central na via principal de
represso por glicose. Sabe-se que esta protena ativada quando
glicose exaurida do meio e que isto ocorre por fosforilao, mas no se


9
sabe exatamente o que promove esta ativao. Sabe-se que o estado de
ativao da protena Snf1 depende de uma srie de fatores, dentre eles:
a interao com a protena Snf4, a interao das regies catalticas e
regulatrias da prpria protena Snf1 e a ligao fsica s protenas
Sip1, Sip2 e Gal83 (GANCEDO, 1998; LUDIN et al, 1998; CARLSON,
1999; VINCENT; CARLSON, 1999) (FIGURA 2.4).

Snf4 Snf4 Snf4 Snf4
Sip1 Sip1 Sip1 Sip1
Sip2 Sip2 Sip2 Sip2
Gal83 Gal83 Gal83 Gal83
glicose alta glicose alta glicose alta glicose alta
complexo Snf1 inativo complexo Snf1 inativo complexo Snf1 inativo complexo Snf1 inativo
Snf1 Snf1 Snf1 Snf1
R RR R
C CC C
S
n
f
4
S
n
f
4
S
n
f
4
S
n
f
4
Sip1 Sip1 Sip1 Sip1
Sip2 Sip2 Sip2 Sip2
Gal83 Gal83 Gal83 Gal83
glicose baixa glicose baixa glicose baixa glicose baixa
complexo Snf1 ativo complexo Snf1 ativo complexo Snf1 ativo complexo Snf1 ativo
Snf1 Snf1 Snf1 Snf1
Glc7- Glc7- Glc7- Glc7-
Reg1 Reg1 Reg1 Reg1
R RR R
C CC C
P PP P

FIGURA 2.4 Esquema de funcionamento da protena Snf1. Quando glicose alta,
a regio regulatria de Snf1 impede que a regio cataltica promova a fosforilao de
Mig1. Quando glicose baixa, Snf4 se liga regio regulatria de Snf1, liberando a
regio cataltica para promover a fosforilao de Mig1. Sugere-se que a protena
fosfatase tipo 1, que possui uma regio cataltica codificada pelo gene GLC7 e uma
regio codificada por REG1 que direciona Glc7 para o complexo Snf1, responsvel
pela desfosforilao do complexo, levando-o de volta ao estado inativo (num mutante
reg1, o complexo Snf1 est sempre ativo). Para se tornar ativo, o complexo deve ser
fosforilado, mas ainda no se conhece a quinase que fosforila Snf1.

Para ilustrar a complexidade dos sistemas regulatrios celulares,
interessante observar que algumas protenas da cascata de represso
por glicose esto envolvidas em vrias funes celulares. Observa-se na
FIGURA 2.4 que a protena fosfatase Reg1-Glc7 est envolvida na
desfosforilao/ inativao da protena Snf1. Alm disto, Reg1-Glc7
tambm desfosforila Hxk2 (ALMS et al, 1999), no fenmeno de
represso por glicose. No entanto, sabe-se que a deleo de REG1


10
tambm afeta o acmulo de glicognio (HUANG et al, 1996), que a
protena fosfatase 1 est envolvida no metabolismo do inositol (SHIRRA;
ARNDT, 1999) e que a mesma essencial para manter a represso do
gene ADH2 (lcool desidrogenase 2) (DOMBEK et al, 1999).
Outro elemento que faz parte da represso por glicose o ativador
de transcrio Hap4. Esta protena forma um complexo com as
protenas Hap2, Hap3 e Hap5, direcionando-as aos promotores de genes
envolvidos no ciclo de Krebs (como CIT1, que codifica a enzima citrato
sintase) e da cadeia respiratria (como citocromos e enzimas do tipo
citocromo oxidase e citocromo redutase), ativando sua transcrio
(ROSENKRANTZ et al, 1994; BLOM et al, 2000).
No caso de genes envolvidos em gliconeognese, sabido que,
alm de serem reprimidos por glicose, a expresso dos genes ICL1
(isocitrato liase), MLS1 (malato sintase), FBP1 (frutose1,6 bisfosfatase) e
PCK1 (fosfoenolpiruvato carboxiquinase) dependente de induo por
uma via que envolve a protena Cat8. Estes genes tm em suas regies
promotoras um stio de ativao de transcrio chamado CSRE (carbon
source-responsive element). Para que estes genes sejam expressos,
necessrio que Snf1 esteja ativa. No se sabe se Cat8 capaz de ligar-se
diretamente s regies CSRE, mas sabe-se que a protena Sip4 se liga a
estas regies (VINCENT; CARLSON, 1998; RAHNER et al, 1999). A
ativao de Cat8 requer modificao ps-traducional, dada por
fosforilao (RANDEZ-GIL et al, 1997). Alm disto, sabe-se que Cat8
est envolvida na ativao de outras funes celulares, alm da
gliconeognese (BOJUNGA; ENTIAN, 1999).
Alm dos elementos descritos acima, h vrios outros envolvidos
na represso por glicose. Um deles merece ateno, a protena Grr1,
que tem uma funo central na deteco das condies nutricionais e
que afeta a expresso dos genes SUC2 (invertase), HXT (envolvidos no
transporte de hexoses) e MAL (envolvidos no metabolismo de maltose),
entre outros (BAILEY, WOODWORD, 1984; FLICK; JOHNSTON, 1991;
ZCAN et al, 1994). Analogamente a outras protenas, Grr1 est


11
envolvida em outras funes celulares, como por exemplo na regulao
do ciclo celular (LI; JOHNSTON, 1997).
Na segunda via de transduo de sinal na represso por glicose, a
via cAMP-PKA, a enzima hexoquinase 2 tambm exerce um papel chave,
mas neste caso este papel diferente daquele proposto para a via
principal (conforme descrito acima) (FIGURA 2.1). Na via cAMP-PKA, o
papel da Hxk2 est diretamente ligado ao cataltica desta enzima, e
no formao de um intermedirio (KRAAKMAN et al, 1999). Para o
restante da via cAMP-PKA em S. cerevisiae, foi recentemente proposto
um novo modelo de funcionamento. Segundo este modelo, o sinal no
transmitido da glicose enzima adenilato ciclase (que catalisa a sntese
de cAMP) via as protenas Ras, mas sim via o chamado sistema GPCR, o
qual envolve as protenas Gpr1 e Gpa2. Esta via afeta algumas das
funes celulares tambm afetadas pela via principal, havendo portanto
elementos comuns a ambas as vias. Os elementos a jusante da protena
quinase A (PKA), a qual por sua vez responde a diferentes nveis de
cAMP (determinados pela atividade da enzima adenilato ciclase), ainda
no foram identificados (THEVELEIN; DE WINDE, 1999).
Observa-se assim que o fenmeno de represso por glicose
envolve vrias vias de transduo de sinal, paralelas e complementares,
as quais envolvem vrios elementos, que muitas vezes esto envolvidos
em outras funes celulares. Alm disto, no se sabe exatamente o
papel de todos estes elementos e provavelmente h elementos que ainda
no foram caracterizados. Ainda assim, para facilitar a visualizao das
muitas informaes reunidas nesta reviso, procurou-se identificar os
elementos envolvidos na represso por glicose em S. cerevisiae e suas
interaes na FIGURA 2.1.
Sabe-se que os genes reprimidos por glicose no so sempre
controlados por uma nica via regulatria. Vias adicionais existem e
provavelmente variam de acordo com a funo celular na qual o gene
est envolvido. No entanto, a maioria dos dados existentes na literatura
sobre os efeitos fisiolgicos da represso por glicose so apresentados


12
em termos da expresso do gene SUC2. Este gene, envolvido na
utilizao de sacarose por S. cerevisiae, muito provavelmente no ir
responder a diferentes concentraes de glicose de forma anloga a
genes envolvidos em outras funes celulares como respirao,
gliconeognese, funes peroxissomais, etc. Poucos dados podem ser
encontrados na literatura sobre delees em genes envolvidos na
represso por glicose e suas conseqncias no metabolismo central de
S. cerevisiae, tema do presente trabalho.


13
2.2. Histrico e aplicaes da Anlise de Fluxos Metablicos

A Anlise de Fluxos Metablicos (AFM) pode ser definida como a
quantificao dos fluxos no metabolismo de um determinado
organismo, sob condies definidas. O resultado desta anlise uma
fotografia do metabolismo, no sendo possvel obter informaes
ligadas dinmica do sistema. Desta forma, a importncia da AFM
reside na possibilidade de se comparar diferentes fotografias, cada
uma delas representando uma determinada condio de cultivo. Alm
disto, a AFM pode ser aplicada como forma de caracterizao fenotpica
de diferentes mutantes de um organismo, comparando-se para esta
finalidade as fotografias dos diferentes mutantes, todos na mesma
condio de cultivo. Em termos matemticos, o problema resume-se
(nos casos mais simples) a encontrar a soluo para um sistema linear
de equaes algbricas, as quais representam a estequiometria das
reaes metablicas consideradas. Por esta razo, alguns autores
preferem utilizar o termo Balano de Fluxos Metablicos ou ainda
Anlise do Balano de Fluxos (VARMA; PALSSON, 1994).
Os primeiros trabalhos que fizeram uso de um modelo
estequiomtrico para a interpretao de dados experimentais datam de
dcadas passadas (AIBA; MATSUOKA, 1979; PAPOUTSAKIS; MEYER,
1985). No entanto, somente com o trabalho de HOLMS (1986), a AFM foi
introduzida como uma tcnica de anlise do metabolismo e mais tarde,
com o trabalho de VALLINO; STEPHANOPOULOS (1990), esta tcnica
foi sistematizada atravs do uso de lgebra linear e clculo matricial.
No incio da dcada de 90, o rpido avano das tcnicas de
biologia molecular e, principalmente, da tecnologia do DNA
recombinante, aumentou muito o espectro de aplicaes desta
tecnologia em vrios setores da biotecnologia, como por exemplo no
melhoramento de organismos utilizados na obteno de produtos de
interesse para o homem. Nesta poca, o termo engenharia metablica
foi introduzido por BAILEY (1991), que o definiu da seguinte forma:


14
engenharia metablica o melhoramento das atividades celulares
atravs da manipulao de funes enzimticas, de transporte e
regulatrias das clulas, fazendo uso da tecnologia do DNA
recombinante. Quase na mesma poca, CAMERON; TONG (1993)
definiram engenharia metablica como a modificao racional do
metabolismo intermedirio utilizando-se tcnicas de DNA
recombinante. Mais recentemente, STEPHANOPOULOS et al (1998)
propuseram a seguinte definio em seu livro texto: engenharia
metablica o melhoramento dirigido da formao de produto ou de
propriedades celulares atravs da modificao de reaes bioqumicas
especficas ou da introduo de novas reaes fazendo uso da
tecnologia do DNA recombinante. Observa-se assim que a engenharia
metablica envolve anlise e modificao de vias metablicas, e que o
resultado final sempre o metabolismo modificado com um
determinado propsito. Definido o propsito, deve-se estabelecer as
modificaes genticas a serem introduzidas no organismo. Nesta etapa,
essencial realizar uma anlise detalhada do metabolismo, lanando
mo de vrias ferramentas analticas e matemticas, como por exemplo
a anlise de expresso gnica em termos de mRNA, a medida das
concentraes de metablitos intracelulares, a caracterizao de
protenas e a anlise de vias metablicas (OSTERGAARD et al, 2000)
(FIGURA 2.5). Neste ponto, observa-se que h uma interface entre
engenharia metablica e bioinformtica, medida em que anlises do
genoma, transcriptoma, proteoma e metaboloma fornecero informaes
importantssimas para a anlise do metabolismo (EDWARDS;
PALSSON, 1998; BASSETT JR et al, 1999; PANDEY; MANN, 2000).
Para a anlise de vias metablicas, uma das ferramentas mais
eficientes a Anlise de Fluxos Metablicos (NIELSEN, 1998). A AFM
traz informaes preciosas sobre o funcionamento do metabolismo de
um organismo numa determinada condio e pode ser utilizada, em
conjunto com outras ferramentas analticas e matemticas, para se
atingir os objetivos da engenharia metablica (FIGURA 2.5).


15
ENGENHARIA METABLICA


Clonagem
Microrganismos e
eucariotos superiores
DNA alvo
Transformao
cassete de deleo
geneX rep Marker rep geneX
Biologia
molecular
-1
Medida da
concentrao
de metablitos
Anlise de
vias
metablicas
Anlise da
expresso gnica
Experimentos
de fermentao
Caracterizao
de protenas
4.3
Glucose
TCA
Pyruvate
PP-Pathway
EMP-Pathway
Acetaldehyde
Ethanol
5.6
5.1
1.7
7.6
0.4
3.6
A
n

l
i
s
e
S

n
t
e
s
e
0 5 10 15 20 25 30 35 40
nC
Minutes
45 50
10
Glc-1-P
Fru-6-P
Glu-1,6-dP
Fru-1,6-dP
Gal-6-P
Glu-6-P
Man-6-P
0
2.5
5
7.5
10
12.5
0 10 20 30 40
Time(h)
D
W

&

G
a
l
a
c
t
o
s
e

(
g
/
L
)
0
0.5
1
1.5
2
2.5
E
t
h
a
n
o
l

(
g
/
L
)

FIGURA 2.5 Representao dos componentes de anlise e sntese em engenharia
metablica. Na parte de anlise, ferramentas analticas e matemticas so utilizadas
para investigar o metabolismo, dando subsdios para as modificaes genticas a
serem introduzidas na parte de sntese. Aps realizadas as modificaes, retorna-se
parte de anlise para verificar o efeito das mesmas. Este processo iterativo ocorre at
que um determinado propsito seja atingido. (Adaptado de OSTERGAARD et al, 2000,
com permisso do autor).


16

possvel extrair uma srie de informaes sobre o metabolismo
atravs da aplicao da AFM. Estas informaes podem ser divididas
em alguns casos tpicos, os quais encontram-se ilustrados abaixo com
alguns exemplos da literatura:
a identificao de possveis ns rgidos (rigid nodes) na rede
metablica de Corynebacterium glutamicum, os quais constituem
potenciais stios de modificaes genticas a serem introduzidas para
a otimizao da produo de lisina (STEPHANOPOULOS; VALLINO,
1991; VALLINO; STEPHANOPOULOS, 1993). Variando-se as
condies de operao do reator, possvel verificar qual o efeito de
diferentes vazes especficas na distribuio dos fluxos metablicos
pelos diferentes ns do metabolismo, o que serve para identificar as
reaes que limitam o fluxo por uma determinada via metablica;
a identificao da existncia de vias diferentes daquelas
normalmente esperadas numa determinada condio de cultivo,
como a atividade de algumas enzimas em Saccharomyces cerevisiae
(NISSEN et al, 1997);
o clculo de fluxos extracelulares no medidos e a identificao de
erros nas determinaes analticas (STEPHANOPOULOS et al, 1998);
o clculo do rendimento terico mximo para um determinado par
substrato/produto (JRGENSEN et al, 1995);
a anlise da insero de vias alternativas e/ou da superexpresso ou
deleo de algum(s) gene(s) na distribuio dos fluxos metablicos, o
que caracteriza praticamente a simulao de modificaes genticas
previamente a sua introduo na clula (JRGENSEN et al, 1995;
NISSEN, 1999).
Alm dos exemplos acima, so apresentadas na TABELA 2.1
aplicaes recentes de AFM. A diversidade dos sistemas biolgicos
investigados ilustra o amplo espectro e os potenciais de aplicao da
AFM.


17
TABELA 2.1 Exemplos recentes de aplicaes da Anlise de Fluxos Metablicos (GOMBERT; NIELSEN,
2000)
Sistema investigado Tipo de anlise Aplica-
o*
Principais resultados da anlise Referncia
Produo de proteases alcalinas por
B. licheniformis
AFM +
programao
linear
(a) Projeto de uma estratgia de transfernica de oxignio em biorreator
para a produo de proteases alcalinas (no verificado
experimentalmente)
ALIK et al (1999)
Mutantes de E. coli que no contm
a via de produo de acetato (genes
ackA-pta)
AFM (b) Mutaes em ambos os genes ackA-pta e nuo (codificam para a
NADH:ubiquinona desidrogenase) so requeridas para a reduo do
fluxo atravs da reao catalisada pela enzima piruvato-formiato-liase
YANG et al (1999)
E. coli expressando o gene da
acetolactato sintase de B. subtilis
AFM (b) Reduo da formao de acetato e aumento da formao de acetona,
que menos txica ao crescimento e formao de protenas heterlogas
ARISTIDOU et al
(1999)
E.coli expressando o operon phb de
R. eutropha
AFM +
programao
linear
(b)

Para maximizar o rendimento de PHB, as disponibilidades tanto de
acetil CoA como de NADPH devem ser aumentadas (resultados
experimentais no esto de acordo com as previses da AFM)
SHI et al (1999)
Produo de piruvato por
T. glabrata
AFM (a) A produo de piruvato principalmente afetada pelos fluxos atravs
das reaes catalisadas pelas enzimas piruvato desidrogenase e
piruvato descarboxilase. Uma estratgia de alimentao de tiamina e a
influncia do oxignio dissolvido no acmulo de piruvato tambm foram
investigados
HUA et al (1999)
Produo de IgG contra fribronectina
humana por clulas de hibridoma
murino
AFM (a) Interpretao da multiplicidade de estados estacionrios (diferentes
concentraes celulares na mesma taxa de diluio) como diferentes
formas de utilizao de piruvato no ciclo de Krebs
FOLLSTAD et al
(1999)
Fermentao de Z. mobilis selvagem
e recombinante em glicose, frutose e
xilose
AFM +
experimentos
de marcao
(a)
(b)
Sntese de ribose-5-fosfato ocorre principalmente via reao catalisada
pela enzima transcetolase. Evidncias para a operao reversvel das
enzimas ribose-5-fosfato isomerase, fosfoglicoisomerase e ribulose-5-
fosfato epimerase. Identificao de atividade da enzima xiluloquinase
como a etapa controladora da velocidade de produo de etanol em Z.
mobilis recombinante
DE GRAAF et al
(1999)
Produo de PHB em culturas
mistas de L. delbrueckii e
A. eutrophus
AFM (a) NADPH gerado na reao catalisada pela enzima isocitrato
desidrogenase em A. eutrophus usado principalmente na converso de
-cetoglutarato a glutamato quando NH3 abundante, enquanto que
em baixas concentraes de NH3 o NADPH utilizado na formao de
PHB
KATOH et al (1999)
Co-metabolismo de citrato e glicose
em B. subtilis
AFM (a) Alimentao simultnea de citrato e glicose reduz a formao de cidos
e aumenta a converso substrato a clulas devido atenuao do fluxo
pela enzima piruvato quinase
GOEL et al (1999)
Remoo biolgica de fsforo
(enhanced biological phosphorous
removal, EBPR)
AFM +
programao
linear
(a) Provavelmente a primeira tentativa de aplicao de AFM a uma culturta
mista e indefinida. A degradao de polmeros e o consumo ou liberao
de fosfato e acetato num sistema EBPR foram simulados pelo modelo,
mas os resultados diferiram em at 55% em relao aos dados
experimentais
PRAMANIK et al
(1999)
*Aplicao:
(a) mesmas clulas sob diferentes condies de cultivo
(b) diferentes mutantes nas mesmas condies de cultivo


18
2.3. Fundamentos tericos da Anlise de Fluxos Metablicos

2.3.1. Balano de metablitos

A AFM aplicada atravs de um modelo estequiomtrico que
representa o metabolismo do organismo nas condies de estudo. As
reaes que fazem parte deste modelo matemtico podem ser
normalmente encontradas na literatura, em livros texto e artigos
cientficos de bioqumica, havendo s vezes a necessidade de se
confirmar alguma reao especfica para o organismo/condies
estudados atravs de anlises experimentais. O modelo estequiomtrico
baseia-se na aplicao de balanos de massa aos metablitos
considerados, sendo que para os metablitos internos assume-se a
hiptese de pseudo estado estacionrio, o que significa que as reaes
de formao de cada um destes metablitos internos balanceiam as
reaes de consumo do respectivo metablito (ou que no h acmulo
de metablitos internos). Alguns metablitos, como substratos e
produtos, quando includos no modelo, tm acmulo no nulo e a eles
no se aplica esta hiptese. O problema pode ser representado
matematicamente por:

0 = v S (2.1)

onde S a chamada matriz estequiomtrica e v o vetor de fluxos (que
contm os fluxos a serem determinados). Para ilustrar a aplicao desta
equao, ser utilizado o exemplo de rede metablica representado na
FIGURA 2.6. Aplicando-se balanos de massa aos 5 metablitos da
rede, obtm-se:
A:
4 1 1
b b v + =
B: 0
3 2 1
= + v v v
C:
2 2
b v = + (2.2)
D: 0
4 3
= + v v
E:
3 4
b v = +


19

v -> fluxo interno
b -> fluxo de fronteira
v
3
A
E
C B
v
1
v
2
b
1
b
4
4
b
2
b
3
fronteira do sistema
D
pool
intracelular
v
4

FIGURA 2.6 - Esquema de rede metablica consistindo de 5 metablitos internos e
8 fluxos. As fronteiras do sistema esto indicadas em tracejado. O pool intracelular
indicado pode ser por exemplo de protenas.

Colocando as equaes 2.2 no formato matricial da equao 2.1,
temos:

=
0 1 0 0 1 0 0 0
0 0 0 0 1 1 0 0
0 0 1 0 0 0 1 0
0 0 0 0 0 1 1 1
1 0 0 1 0 0 0 1
S (2.3)

[ ]
T
b b b b v v v v v
4 3 2 1 4 3 2 1
= (2.4)

Este sistema linear contm 5 equaes linearmente
independentes e 8 incgnitas: os fluxos internos v1 a v4 e os fluxos de
fronteira b1 a b4. Portanto, um sistema indeterminado com trs graus
de liberdade e torna-se necessrio impor trs restries a este sistema
para que os fluxos possam ser calculados. Isto normalmente realizado
atravs da medida de alguns dos fluxos do vetor v. No caso da FIGURA
2.6, poder-se-ia medir os fluxos b1 a b3 (que corresponderiam, por
exemplo, ao consumo de substrato e formao de produtos de
fermentao) e o sistema se tornaria determinado. A medida de outro
conjunto de 3 fluxos poderia ser utilizada, porm experimentalmente


20
mais difcil medir fluxos internos que fluxos de fronteira. Para obter a
soluo deste sistema linear, agora determinado, conveniente utilizar
lgebra matricial, separando-se o vetor v em dois vetores: vm, que
contm os fluxos medidos e vc, que contm os fluxos a serem
calculados. Analogamente, os elementos da matriz estequiomtrica S
que correspondem aos fluxos medidos so realocados numa matriz Sm e
o restante numa matriz Sc. Desta forma, a equao 2.1 pode ser
reescrita como:

0 = + =
c c m m
v S v S v S (2.5)

onde:

=
4
4
3
2
1
3
2
1
0 1 0 0 0
0 1 1 0 0
0 0 0 1 0
0 0 1 1 1
1 0 0 0 1
, ,
1 0 0
0 0 0
0 1 0
0 0 0
0 0 1
b
v
v
v
v
v e S
b
b
b
v S
c c m m


Sempre que o sistema linear de equaes em estudo for
determinado, a matriz Sc ser quadrada e o problema do clculo de
fluxos pode ser resolvido atravs da seguinte equao:

( )
m m c c
v S S v =
1
(2.6)

Conforme mencionado acima, no caso da FIGURA 2.6, a escolha
do conjunto de fluxos medidos b1 a b3 arbitrria. Como difcil medir
fluxos internos (v1 a v4 no exemplo acima), alguma das medidas b1 a b3
poderia ser substituda pela medida do fluxo b4 (atravs por exemplo da
determinao do teor de protena intracelular). O sistema resultante
seria igualmente determinado e a resoluo dada de modo anlogo ao
indicado na equao 2.6, substituido-se adequadamente os elementos
das matrizes Sm, vm, Sc e vc. No caso de haver mais medidas disponveis


21
que o nmero de graus de liberdade do sistema (por exemplo, se todo o
conjunto de fluxos b1 a b4 puder ser determinado experimentalmente), o
mesmo se tornar sobredeterminado, o que significa que h um maior
nmero de equaes do que o estritamente necessrio para resoluo
do sistema. Este grau de redundncia pode ser utilizado para verificar a
consistncia dos balanos de massa, a preciso das determinaes
experimentais dos fluxos medidos e a validade da hiptese de pseudo
estado estacionrio. Neste caso, a matriz Sc no ser quadrada e
portanto no pode ser invertida. No entanto, a soluo do problema
dada de forma anloga ao apresentado na equao 2.6, utilizando-se a
pseudo inversa da matriz Sc (STEPHANOPOULOS et al, 1998). No caso
de haver menos medidas disponveis que o nmero de graus de
liberdade do sistema, o mesmo permanecer indeterminado e o
problema do clculo de fluxos metablicos s poder ser resolvido se
restries adicionais forem introduzidas ou se um critrio de otimizao
for imposto (por exemplo, a maximizao do crescimento). Neste caso,
pode-se utilizar algum dos algoritmos de programao linear disponveis
para definir o conjunto de fluxos que satisfaa a uma determinada
funo objetivo (VARMA; PALSSON, 1994) (FIGURA 2.8).
interessante observar que, para que este tipo de anlise do
metabolismo seja coerente, torna-se necessrio incluir no modelo
estequiomtrico os balanos de co-fatores, como as coenzimas NADH e
NADPH, alm de ATP. No exemplo da FIGURA 2.6 no foram includos
co-fatores, com o intuito de simplificar a apresentao da metodologia.
No caso de NADH e NADPH, sabe-se que as reaes que geram estes co-
fatores na forma reduzida devem balancear as reaes que geram suas
respectivas formas oxidadas. As restries impostas ao sistema por
estes balanos de xido-reduo so normalmente sujeitas a incertezas,
principalmete sob aerobiose, em funo da variao da razo P/O (ou o
nmero de moles de ATP gerado por mol de oxignio consumido) na
cadeia respiratria, o que faz com que estas restries no sejam
sempre realistas. No caso de ATP, deve-se sempre incluir no modelo


22
uma reao de consumo do excesso de ATP, j que as clulas sempre
produzem mais ATP do que necessitam, perdendo uma parte sob a
forma de calor. Alm disto, reaes que consomem ATP, como as que
fazem parte dos chamados ciclos fteis e o transporte de metablitos
entre os vrios compartimentos celulares, no so usualmente levadas
em considerao no modelo estequiomtrico.
Alm das aproximaes acima, outra limitao que pode surgir
atravs da aplicao desta anlise ocorre quando a rede metablica em
estudo apresenta duas vias paralelas que levam de um determinado
metablito interno a outro. Este problema pode ser ilustrado pelo
exemplo da rede metablica da FIGURA 2.6, se for includa a reao v5
(FIGURA 2.7). Observa-se que o metablito C pode ser formado a partir
de B pela via que envolve a reao v2 ou pela via que envolve as reaes
v3 a v5.

v -> fluxo interno
b -> fluxo de fronteira
v
3
A
E
C B
v
1
v
2
b
1
b
4
4
b
2
b
3
fronteira do sistema
D
pool
intracelular
v
4
v
5

FIGURA 2.7 - Esquema de rede metablica consistindo de 5 metablitos internos e
9 fluxos. As fronteiras do sistema esto indicadas em tracejado. O pool intracelular
indicado pode ser por exemplo de protenas. Esta rede obtida a partir da rede
apresentada na FIGURA 2.6, incluindo-se a reao do metablito E para o metablito
C.

Neste caso, traduzindo a rede da FIGURA 2.7 para a forma da
equao 2.1, obtm-se:



23

=
4
3
2
1
5
4
3
2
1
0 1 0 0 1 1 0 0 0
0 0 0 0 0 1 1 0 0
0 0 1 0 1 0 0 1 0
0 0 0 0 0 0 1 1 1
1 0 0 1 0 0 0 0 1
b
b
b
b
v
v
v
v
v
v e S (2.7)

Neste caso, o sistema linear apresenta 5 equaes linearmente
independentes e 9 incgnitas, concluindo-se que o grau de liberdade do
sistema igual a 4. No entanto, no possvel determinar os fluxos v1 a
v5, medindo-se os 4 fluxos de fronteira b1 a b4. Isto ocorre porque a
matriz Sc gerada neste caso (conforme equao 2.5) seria singular e
portanto no poderia ser invertida (a equao 2.6 no poderia ser
aplicada). Isto decorrncia da estrutura da rede metablica da
FIGURA 2.7, que, conforme mencionado acima, tem duas vias paralelas
que levam do metablito B ao metablito C. A nica forma de se
resolver este problema atravs da imposio de restries adicionais
(como a hiptese do funcionamento ou no de algumas vias
metablicas) ou atravs da escolha de um conjunto diferente de fluxos
medidos. Se forem escolhidos os fluxos b1 a b3 e o fluxo v5, o sistema se
tornaria determinado e a matriz Sc gerada neste caso no seria singular,
podendo-se resolver o problema atravs da equao 2.6. No entanto,
pode ser experimentalmente muito complicado medir v5, pois um fluxo
interno.
De uma forma geral, a AFM pode ser aplicada medindo-se o
consumo de substratos e a formao de produtos num cultivo,
utilizando-se estes valores como restries ao modelo estequiomtrico.
Devido caracterstica das redes metablicas dos organismos vivos,
possvel obter um sistema determinado e portanto calcular os fluxos
(desde que no sejam includas reversibilidades nas reaes do modelo


24
estequiomtrico, o que geraria singularidade na matriz Sc). Existem
algumas alternativas adicionais, mais elaboradas, quanto forma de se
analisar uma rede metablica, partindo-se da matriz estequiomtrica S.
A realizao de experimentos com traadores isotpicos, que agrega o
balano de istopos ao balano de metablitos, uma delas (ver item
2.3.2). Outra possibilidade a aplicao de anlise convexa, atravs da
qual possvel calcular os chamados modos de fluxo elementares, os
quais trazem importantes informaes sobre a estrutura da rede
metablica. Esta anlise tem, inclusive, potencial de aplicao dentro
do escopo da anlise funcional (CORNISH-BOWDEN; CRDENAS, 2000;
GOMBERT; NIELSEN, 2000; SCHUSTER et al, 2000) (FIGURA 2.8).




25
informao bioqumica
bases de dados na internet
livros texto
artigos recentes p/ informao especfica
experimentos (eventualmente)
.
:
P 6 F
P 6 G
GLC
. ... . 0 0
: ::: : : :
. ... . 1 0
0 ... . 1 1
0 ... . 0 1
S

=
matriz estequiomtrica
h
x
k
p
g
i
reaes
}
m
e
t
a
b

l
i
t
o
s
equao de balanos de massa
sistema linear indeterminado
solues particulares
restries: medida de alguns fluxos anlise da estrutura de redes metablicas
sistema linear
determinado
lgebra linear
funo objetivo
programao linear
restries adicionais:
traadores isotpicos
soluo numrica
modos elementares
de fluxo
anlise convexa
vetores base
espao nulo
A
B
C
E
D
S v = 0

FIGURA 2.8 Princpios de modelagem estequiomtrica para AFM. Primeiramente,
a matriz estequiomtrica definida em funo da rede metablica em estudo. Em
seguida, a matriz estequiomtrica multiplicada pelo vetor de fluxos, definindo a
equao de balanos de massa. Finalmente, pode-se manipular a matriz
estequiomtrica de diferentes formas, dependendo do objetivo da anlise. A) possvel
impor restries medindo-se alguns fluxos, de modo que o sistema se torne
determinado e resolvido por lgebra linear simples. B) Se restries adicionais so
impostas atravs da medida da marcao em alguns metablitos intracelulares, pode-
se combinar o balano de metablitos com o balano de istopos e o sistema ser
resolvido numericamente. Neste caso, melhores estimativas para os fluxos so
normalmente obtidas. C) Se as restries no so suficientes para tornar o sistema
determinado, pode-se aplicar programao linear (otimizao) para encontrar o
mximo ou mnimo de uma funo objetivo. D) Ao invs de calcular solues
particulares, possvel obter informaes sobre a estrutura de redes metablicas
atravs da aplicao de anlise convexa, calculando-se os chamados modos
elementares de fluxo. E) Outra alternativa o clculo de vetores que formam a base do
espao nulo correspondente matriz estequiomtrica, desde que estes vetores tenham
um significado bioqumico.


26
2.3.2. Balano de istopos

Os problemas e limitaes da AFM, conforme descritos no item
anterior, os quais levam geralmente singularidade da matriz Sc,
podem ser contornados aplicando-se restries ao sistema atravs da
realizao de experimentos com traadores isotpicos (CHRISTENSEN;
NIELSEN, 1999). Experimentos que utilizam substratos marcados,
como por exemplo glicose 100% marcada no carbono 1 ([1-
13
C]glicose),
permitem que balanos de massa sejam aplicados a tomos de carbono
individuais, os quais so diferenciados dos outros por serem mais
pesados. Desta forma, restries adicionais so aplicadas ao sistema
alm daquelas impostas pelos balanos em torno dos metablitos, e a
necessidade de balancear co-fatores e ATP dispensada. Para esta
finalidade, torna-se necessrio identificar e quantificar estes tomos
marcados no momento em que as clulas encontram-se num estado
fisiolgico bem definido, normalmente o estado estacionrio de um
cultivo contnuo ou a fase exponencial de um cultivo descontnuo. Esta
quantificao pode ser obtida atravs de NMR ou GC-MS (SZYPERSKI,
1998). O princpio da aplicao do balano de istopos encontra-se
ilustrado na FIGURA 2.9.












FIGURA 2.9 - Princpio de aplicao do balano de metablitos ( esquerda) e de
istopos ( direita). Duas reaes, com fluxos x e y, levam formao do produto Z, o
qual pode ser quantificado (80 unidades arbitrrias). A marcao nos metablitos est
indicada pelos retngulos e os valores so dados em porcentagem. Utilizando-se o
balano de metablitos somente, no possvel quantificar os fluxos x e y. Agregando-
se o balano de istopos, calcula-se o valor dos fluxos x e y, ambos iguais a 40
(adaptado de CHRISTENSEN; NIELSEN, 1999).

x x x y x x x y x x x y x x x y x x x y
80
x y
80
10%
50%
30%
Z
Z
Y X X
Y


27
2.3.3. Modelagem matemtica

Ao contrrio dos sistemas lineares obtidos atravs da aplicao da
AFM convencional, os modelos matemticos que representam a
combinao dos balanos de metablitos com os balanos de istopos
so no-lineares. Ganha-se portanto em preciso na estimativa dos
fluxos metablicos, mas ganha-se tambm em termos de complexidade
do equacionamento matemtico, o que significa que mtodos numricos
mais sofisticados devem ser utilizados. Atravs de um exemplo simples,
ilustrado na FIGURA 2.10, possvel verificar como a soluo obtida
neste casos (CHRISTENSEN; NIELSEN, 2000).
Na rede metablica indicada na FIGURA 2.10, no possvel
obter uma quantificao completa dos fluxos atravs de um simples
balano de massa em torno dos metablitos intracelulares, mesmo que
as velocidades de formao dos produtos Bp e Cp e a velocidade de
consumo do substrato S sejam conhecidas. Isto pode ser observado
atravs da aplicao de balanos de massa aos metablitos
intracelulares (equao 2.8), o que gera um sistema indeterminado, se
valores numricos forem introduzidos no lugar das variveis r4 e r5. Por
outro lado, se o substrato S for especificamente marcado em um dos
dois tomos de carbono, o conjunto completo de fluxos r1 a r5 pode ser
determinado, se as marcaes dos dois tomos do produto Cp forem
medidos. A rotina para estimativa dos fluxos funciona da seguinte
maneira. Primeiramente, so estabelecidos os balanos de massa em
torno dos metablitos A, B e C:


100 0
0
0
1 2
2 3 4
1 3 5
=
=
+ =
r r
r r r
r r r
(2.8)




28
S
A
B
C B
p
C
p
100
r
2
r
5
r
1
r
3
r
4

S
1
-S
2
A
1
-A
2
B
1
-B
2
C
1
-C
2
B
1,p
-B
2,p
C
1,p
-C
2,p
100
r
2
r
5
r
1
r
3
r
4
FIGURA 2.10 - O substrato S, composto de 2 carbonos (S1 e S2), convertido nos
produtos Bp e Cp atravs dos intermedirios A, B e C. O consumo de S
arbitrariamente fixado em 100. As transies dos tomos de carbono esto indicadas
direita. O ponto-chave desta rede metablica que a origem dos tomos de carbono no
composto C depende da utilizao relativa das vias de consumo do substrato S, j que
a reao de A para B inverte a ordem destes tomos. (Adaptado de CHRISTENSEN;
NIELSEN, 2000).

Fazendo-se as devidas substituies, pode-se representar o
conjunto total de fluxos, rtot, em funo de dois fluxos apenas, os quais
passam a ser denominados fluxos independentes:

r
r
r
r
r
r
r
r
r
r r
r r
tot
=

1
2
3
4
5
1
1
3
1 3
1 3
100
100
(2.9)

Analogamente aos balanos de massa em torno dos metablitos,
pode-se aplicar balanos de massa em torno dos tomos de carbono
individuais, sendo S1, S2, A1, A2, a marcao nos tomos de carbono
S1, S2, A1, A2, , respectivamente:



29
+ =
+ =
+ =
+ =
+ =
+ =
( )
( )
( )
( )
r r A S
r r A S
r A r r B
r A r r B
r A r B r C
r A r B r C
1 2 1 1
1 2 2 2
2 2 3 4 1
2 1 3 4 2
1 1 3 1 5 1
1 2 3 2 5 2
100
100
0
0
0
0
(2.10)

Agrupando-se as equaes acima sob a forma de um produto de
matrizes, obtm-se:

+
+
+
+

( )
( )
( )
( )
r r
r r
r r r
r r r
r r r
r r r
A
A
B
B
C
C
S
S
1 2
1 2
2 3 4
2 3 4
1 3 5
1 3 5
1
2
1
2
1
2
1
2
0 0 0 0 0
0 0 0 0 0
0 0 0 0
0 0 0 0
0 0 0
0 0 0
100
100
0
0
0
0
(2.11)

Utilizando-se notao matricial, a equao 2.11 pode ser
transformada na equao 2.12, na qual todas as marcaes encontram-
se no vetor X:

v X M = (2.12)

Desta forma, dado um conjunto de fluxos (matriz M), a equao
2.12 pode ser resolvida para as marcaes, por simples inverso da
matriz M:

v M X =
1
(2.13)

importante neste ponto diferenciar o termo marcao, quando
aplicado a um tomo de carbono individual (por exemplo na posio 3
do piruvato), do mesmo termo quando aplicado a uma molcula inteira,
por exemplo o piruvato com todos os seus carbonos. No primeiro caso, a
marcao indica a proporo de tomos de carbono na posio 3 do


30
piruvato que so marcados, ou seja, que possuem massa 13. No
segundo caso, a marcao indica o nmero mdio de tomos de carbono
marcados por molcula de piruvato. Deve-se observar que a marcao
em uma molcula igual soma das marcaes nos seus tomos de
carbono individuais. Uma ilustrao simples apresentada na FIGURA
2.11.

C3
C1
C2
C3
C1
C2
C3
C1
C2
C3
C1
C2
C3
C1
C2
C3
C1
C2
C3
C1
C2
C3
C1
C2
C3
C1
C2
C3
C1
C2
FIGURA 2.11 Ilustrao do conceito de marcao. Os tomos em negro tm
massa 13 e os tomos em branco tm massa 12. Considerando a distribuio
isotopomrica hipottica de uma molcula de 3 tomos de carbono, se h um total de
10 molculas numa amostra, observa-se que a marcao no C1 (carbono 1) igual a
0,8, pois em 8 das 10 molculas existentes, o carbono que ocupa a posio 1 tem
massa 13. Analogamente, a marcao em C2 igual a 0,3 e em C3 igual a 0,0.
Conclui-se que a marcao na molcula toda igual a 0,8 + 0,3 + 0,0 = 1,1.

O algoritmo numrico utilizado para o clculo dos fluxos
metablicos funciona da seguinte forma. Faz-se uma primeira
estimativa dos fluxos independentes (no caso do exemplo acima, os
fluxos r1 e r3), calcula-se o conjunto inteiro de fluxos (equao 2.9),
substitui-se estes fluxos na matriz M e, conhecendo-se o consumo de
substrato (vetor v), calcula-se o vetor X atravs da equao 2.13. A
marcao em cada composto medido (por GC-MS, por exemplo)
calculada somando-se as marcaes nos tomos de carbono individuais
presentes neste composto. (Para um composto A qualquer de 2
carbonos, se as marcaes so A1 = 0,15 e A2= 0,42, a marcao na
molcula ser 0,57.) Em seguida, um erro calculado comparando-se
os valores calculados com os valores medidos. Ao mesmo tempo, um
erro calculado comparando-se os fluxos calculados r4 e r5 com os
valores medidos. O erro total ento minimizado por um algoritmo
evolucionrio (SCHMIDT; ISAACS, 1995), o qual gera novas estimativas


31
para os fluxos independentes a cada iterao, at que um conjunto de
fluxos que atenda a um determinado critrio seja obtido. Este critrio
pode ser, por exemplo, um erro mximo. Um esquema do processo de
minimizao do erro entre as medidas experimentais e os resultados
dos clculos a cada iterao apresentado na FIGURA 2.12.
Os algoritmos evolucionrios so tcnicas de otimizao diretas,
isto , no fazem uso do clculo de derivadas. Elementos bsicos de
evoluo biolgica so aplicados, assumindo-se portanto que mudanas
randmicas nas propriedades de um sistema iro ocasionalmente gerar
uma melhoria. Desta forma, pequenas mudanas so provocadas
randomicamente no sistema e o desempenho do sistema alterado
comparado ao sistema original para selecionamento do melhor entre
ambos. O melhor sistema passa ento a ser o sistema original e novas
mudanas so provocadas randomicamente. Estes algoritmos so
chamados evolucionrios devido a sua analogia com a teoria da seleo
natural proposta por Charles Darwin, segundo a qual mutaes
ocorrem aleatoriamente em sistemas biolgicos, aps o que sobrevivem
os mais fortes. As principais vantagens da utilizao deste tipo de
algoritmo na estimativa de parmetros em modelos bioqumicos
complexos so sua fcil implementao e a capacidade de resolver
problemas sofisticados num tempo razovel sem encontrar
complicaes numricas (SCHMIDT; ISAACS, 1995). Um esquema do
funcionamento deste tipo de algoritmo apresentado na FIGURA 2.13.
Apesar de mais complexa, a modelagem matemtica de
experimentos que fazem uso de traadores isotpicos possibilita a
soluo de problemas que no podem ser resolvidos pela modelagem de
experimentos que no fazem uso de traadores (como o exemplo da
FIGURA 2.10). Uma comparao entre as duas abordagens feita por
SCHMIDT et al (1998). Alm disto, possvel incluir fluxos reversveis,
compartimentao e channeling (MARX et al, 1996), o que torna a
anlise do metabolismo bem mais completa. Normalmente, a
modelagem feita em estado estacionrio, pois esta condio simplifica


32
tanto a formulao quanto a resoluo do problema matemtico
(SAUER et al, 1997; MARX et al, 1996) e portanto a metodologia pode
ser aplicada a cultivos contnuos em estado estacionrio
(CHRISTENSEN; NIELSEN, 1999).

EXPERIMENTO
MODELO
estimativa inicial
de fluxos
independentes
fluxos dependentes
marcaes
calculadas
fluxos medidos
marcaes
medidas
erro
+
-
+
-
+
+
erro
Minimizao
algoritmo
evolucionrio
erro total
nova estimativa
de fluxos
independentes
FIGURA 2.12 Esquema do processo iterativo utilizado neste trabalho para a
estimativa de fluxos metablicos em experimentos com substrato marcado. O processo
terminado quando um erro aceitvel atingido.



33
estimativa inicial
dos parmetros
simulao do
experimento
clculo do erro
melhoria do
desempenho
?
descarte destes
parmetros
armazenamento dos
novos parmetros
mutao
o erro pequeno
o suficiente
?
FIM
no
sim
sim
no

FIGURA 2.13 Esquema de um algoritmo evolucionrio para a estimativa de
parmetros. O desempenho pode ser medido pela soma dos quadrados dos erros entre
os valores medidos e os dados simulados. (Adaptado de SCHMIDT; ISAACS, 1995).

2.3.4. O caminho para a Anlise de Redes Metablicas

A capacidade de investigao de redes metablicas tem
aumentado nos ltimos anos, principalmente em funo do
desenvolvimento de mtodos analticos e de mtodos matemticos cada
vez mais poderosos. Portanto, as possibilidades de se extrair
informaes de redes metablicas cada vez mais complexas, utilizando-
se uma combinao do balano de metablitos (como na Anlise de
Fluxos Metablicos tradicional, item 2.3.1) com experimentos que fazem
uso de substratos marcados, so cada vez maiores. Informaes como a


34
identificao de vias metablicas, a compartimentao de metablitos e
enzimas, a anlise de ciclos fteis, o channeling metablico e a
reversibilidade de reaes so alguns exemplos dos resultados que
podem ser obtidos atravs da combinao destas tcnicas, o que vai
muito alm de uma simples quantificao dos fluxos metablicos de um
organismo numa determinada condio. Sugere-se ainda que este tipo
de anlise pode ter um papel importante em anlise funcional, aspecto
de extrema relevncia dada a alta velocidade com que genomas
completos de organismos vm sendo publicados (CORNISH-BROWN;
CRDENAS, 2000). Por esta razo, o termo Anlise de Fluxos
Metablicos talvez no represente exatamente a amplitude desejada e
sugere-se que o termo Anlise de Redes Metablicas seja mais
apropriado para caracterizar este tipo de anlise (CHRISTENSEN;
NIELSEN, 1999).



35
2.4. Medida da marcao em metablitos intracelulares por GC-MS

2.4.1. Introduo

Uma das principais tcnicas analticas utilizadas neste trabalho
a combinao da cromatografia gasosa com a espectrometria de massa
(GC-MS). Seu papel central na medida da marcao em alguns
aminocidos e carboidratos de S. cerevisiae. Esta informao pode ser
utilizada para deduzir a marcao nos tomos de carbono dos
precursores destes aminocidos e carboidratos (precursores so
metablitos desviados das vias metablicas centrais para as rotas de
biossntese). Os valores de marcao obtidos atravs desta
determinao analtica so utilizados no clculo de fluxos metablicos.
A cromatografia gasosa uma tcnica bastante conhecida e
difundida, tanto nos meios de pesquisa, quanto no meio industrial para
o controle de qualidade em processos. Suas principais vantagens so a
alta sensibilidade, reprodutibilidade e rapidez. considerada a tcnica
mais importante para a separao de compostos de baixa polaridade
(WILSON, 1994). No ser dada aqui uma descrio detalhada desta
tcnica analtica, pois a mesma j bem conhecida e descrita na
literatura. Alm disto, a etapa cromatogrfica apenas separa os
compostos da mistura, enquanto que a espectrometria de massa
responsvel pelas medidas de marcao.

2.4.2. Espectrometria de massa (SILVERSTEIN et al, 1991; GORDON, 1994)

Espectros de massa, de infravermelho, de ressonncia magntica
nuclear e de ultravioleta so freqentemente utilizados (de forma
complementar ou independente) na identificao de compostos
orgnicos. Essencialmente, a molcula a ser analisada submetida a
campos de energia e a resposta da molcula a estes campos gravada
na forma de espectros.



36
Princpio de deteco

A forma de espectrometria de massa (MS) mais utilizada a de
impacto de eltrons (EI), na qual as molculas a serem analisadas,
encontrando-se na fase gasosa, so bombardeadas por um feixe de
eltrons e o resultado do impacto dos eltrons gravado como um
espectro de ons positivos separados com base nas suas diferentes
relaes massa/carga (m/z). A maioria destes ons apresenta apenas
uma carga positiva. A espectrometria de massa, quando de alta
resoluo, fornece como resultado uma frmula molecular nica,
podendo-se utiliz-la, portanto, para identificar os componentes de uma
mistura. Isto possvel devido ao fato de as massas atmicas dos
elementos que compem uma molcula no serem nmeros inteiros.

O espectro de massa

Espectros de massa so normalmente obtidos utilizando-se um
feixe de eltrons de energia 70 eV. O evento mais simples que ocorre a
remoo de um eltron da molcula na fase gasosa, por um eltron do
feixe, formando-se um on molecular, o qual um ction radical (M
.+
).
No caso do metanol, a formao do on molecular pode ser representada
por:

CH3OH + e
-
CH3OH
.+
+ 2e
-
(2.14)
m/z = 32

O ponto representa o eltron desemparelhado. Muitos destes ons
moleculares so desintegrados em 10
-10
10
-3
s, resultando, no caso
mais simples, num fragmento carregado positivamente e num radical
(equao 2.15). Desta forma, diferentes ons fragmentados so formados
e cada um deles pode ser clivado gerando fragmentos menores.


37
Utilizando-se ainda o metanol como exemplo, pode-se representar
alguns fragmentos:

CH3OH
.+


CH2OH
+
(m/z 31) + H
.
(2.15)



CH3OH
+


CH3
+
(m/z 15) +
.
OH (2.16)

CH2OH
+


CHO
+
(m/z 29) + H2 (2.17)

Se alguns dos ons moleculares (parentais) permanecerem
intactos o suficiente para que sejam detectados, observa-se no espectro
um pico correspondente ao on molecular. importante que este pico
seja reconhecido, pois o mesmo fornece a massa molecular do composto
analisado.
Um espectro de massa (FIGURA 2.14) portanto a representao
das massas dos fragmentos carregados (incluindo o on molecular) em
funo de suas concentraes relativas. Ao pico mais intenso no
espectro (denominado pico base) atribudo o valor 100%, enquanto os
outros picos apresentam intensidades relativas a este pico base. Alm
disto, o pico correspondente ao on molecular normalmente o pico de
maior massa, com exceo dos picos relativos aos istopos.

Cromatografia gasosa - Espectrometria de massa (GC-MS)

Em muitos casos, torna-se interessante a utilizao de um
cromatgrafo gasoso (GC) acoplado a um espectrmetro de massa (MS),
pois a concentrao da amostra no gs de arraste aumentada. Os
tempos de anlise so suficientemente rpidos, permitindo que vrios
espectros de massa sejam obtidos a partir da eluio de um simples
pico do cromatgrafo gasoso.


38

FIGURA 2.14 - Espectro de massa do n-butano, obtido por ionizao de impacto de
eltrons (EI). A abundncia relativa uma escala normalizada de 0 a 100%. O pico
base (43) tem a intensidade 100% e os outros so calculados relativamente a este. O
pico de maior massa (58) corresponde ao on molecular, enquanto os outros
correspondem a fragmentos (reproduzido de GORDON, 1994)

Derivados

Se um determinado composto tem baixa volatilidade ou se sua
massa molecular no pode ser determinada, possvel preparar um
derivado adequado, o qual deve ter as seguintes caractersticas:
volatilidade aumentada, um modo de clivagem previsvel, um padro de
fragmentao simplificado e um aumento de estabilidade do on
molecular. Compostos que contm muitos grupos polares podem
apresentar baixa volatilidade (p.e. acares, peptdeos e alguns cidos
carboxlicos). A acetilao de grupos hidroxila e amina, assim como a
metilao de cidos livres so algumas das possibilidades de se
aumentar a volatilidade de compostos, tornando-se possvel a
identificao de picos correspondentes aos mesmos.






39
2.4.3. Anlise de fragmentos de aminocidos e carboidratos por GC-MS
(CHRISTENSEN; NIELSEN, 1999b; SZYPERSKI, 1998)

Os esqueletos de carbono dos aminocidos tm sua origem em
metablitos que fazem parte das vias metablicas centrais (EMP, TCA e
PP), sendo bem conhecidas as vias biossintticas que levam formao
dos aminocidos a partir de seus respectivos precursores. Sabe-se
tambm que a frao de carboidratos na biomassa de S. cerevisiae tem
origem nas molculas de glicose-6-fosfato da via de EMP. Sendo assim,
conhecendo-se o padro de marcao nos tomos de carbono dos
aminocidos e carboidratos (atravs de medidas por GC-MS), os quais
so resultantes da hidrlise de protenas e polissacardeos,
respectivamente, possvel deduzir o padro de marcao nos
respectivos metablitos precursores. A vantagem de se medir a
marcao nos aminocidos que os mesmos se encontram em grande
proporo na biomassa, enquanto que os metablitos precursores
encontram-se em quantidades muito pequenas. Alm disto, o turnover
destes precursores muito rpido, impossibilitando medidas diretas na
maioria dos casos, diferentemente dos aminocidos, que representam
um pool mais estvel frente a variaes ambientais.

Biossntese de Aminocidos

Cerca da metade dos 20 aminocidos que fazem parte da
estrutura das protenas (tambm chamados proteinognicos)
sintetizada atravs de reaes simples, a partir de intermedirios das
vias metablicas centrais, quais sejam:
1. o ciclo de Krebs, ou ciclo dos cidos Tricarboxlicos (TCA);
2. a via glicoltica, ou via de Embden-Meyerhof-Parnas (EMP);
3. a via das Hexoses Monofosfato, ou via das Pentoses Fosfato (PP).
A maioria dos aminocidos chamados essenciais (pois no so
sintetizados pelos seres humanos, devendo ser obtidos a partir da dieta)
apresenta vias biossintticas mais complexas. Microrganismos como


40
Escherichia coli e Saccharomyces cerevisiae possuem as enzimas
necessrias sntese de todos os 20 aminocidos.
Em todos os casos, os precursores das vias biossintticas de
formao de aminocidos so os seguintes:
1. -cetoglutarato (AKG) e oxaloacetato (OAA), da via TCA;
2. 3-fosfoglicerato (3PG), fosfoenolpiruvato (PEP) e piruvato (PYR), da via
EMP;
3. eritrose-4-fosfato (E4P) e ribose-5-fosfato (R5P), da via PP.
4. acetil coenzima A (AcCOA).
Na TABELA 2.2 encontra-se descrita a correspondncia entre os
tomos de carbono das molculas precursoras e dos respectivos
aminocidos oriundos destas molculas.

TABELA 2.2 - Correspondncia entre os aminocidos de
S. cerevi si ae e seus precursores (ZUBAY, 1988)*
amino-
cido
n
o
de
tomos
de C
precur-
sores
n
o
de
tomos
de C
correspondncia dos
tomos de C
Ala 3 PYR 3 PYR1,2,3 Ala1,2,3
Asp 4 OAA 4 OAA1,2,3,4 Asp1,2,3,4
Glu 5 AKG 5 AKG1,2,3,4,5 Glu1,2,3,4,5
Gly 2 3PG 3 3PG1,2 Gly1,2
Ile 6 OAA
PYR
4
3
OAA1,2,3,4
PYR2,3


Ile1,2,6,4
Ile3,5
Leu 6 PYR
AcCoA
3
2
PYR2,2,3,3
AcCoA1,2


Leu3,4,5,6
Leu1,2
Lys 6 AKG
AcCOA
5
2
AKG2,3,4,5
AcCoA1,2


Lys3,4,5,6
Lys1,2
Phe 9 E4P
PEP
4
3
E4P1,2,3,4
PEP1,2,3,2,3


Phe6,7,8,9
Phe1,2,3,4,5
Pro 5 AKG 5 AKG1,2,3,4,5 Pro1,2,3,4,5
Ser 3 3PG 3 3PG1,2,3 Ser1,2,3
Thr 4 OAA 4 OAA1,2,3,4 Thr1,2,3,4
Val 5 PYR 3 PYR1,2,2,3,3 Val1,2,3,4,5
*somente esto indicados os aminocidos que apresentam pelo menos um fragmento
que segue os critrios de aceitao do mtodo de deteco apresentados por
CHRISTENSEN; NIELSEN (1999b)

Em alguns casos, como na biossntese de serina, glicina e
treonina, no existe somente uma nica via biossinttica, o que
significa que os tomos de carbono destes aminocidos podem ser
oriundos de outras molculas, alm das indicadas na Tabela 2.2. Este


41
fato ocorre, pois descobriu-se recentemente que a enzima treonina
aldolase, ativa no crescimento em glicose, catalisa a reao reversvel de
converso de treonina em glicina (LIU et al, 1997; MONSCHAU et al,
1997). Desta forma, os tomos de glicina e serina podem ser oriundos
do oxaloacetato (alm do 3-fosfoglicerato) e os tomos de treonina
podem ser oriundos do 3-fosfoglicerato (alm do oxaloacetato). Em
outros casos, como na biossntese de alanina, sabe-se que a mesma
ocorre a partir do piruvato, mas no se sabe se a sntese ocorre
exclusivamente no citoplasma ou se parte da biossntese ocorre na
mitocndria. Isto se deve ao fato de haver duas enzimas putativas do
tipo alanina aminotransferase que catalisam a reao de converso de
piruvato a alanina, sendo uma citosslica e outra mitocondrial. Estes
dados so obtidos por similaridades de seqncias, resultantes da
disponibilidade dos dados gerados pelo seqenciamento do genoma de
S. cerevisiae. Para estudar esta e outas questes fisiolgicas,
experimentos especficos devem ser realizados.
Em complementao aos dados da TABELA 2.2, encontra-se na
FIGURA 2.15 um esquema simplificado do metabolismo central de S.
cerevisiae, indicando quais precursores levam formao de quais
aminocidos.

Fragmentao

Uma caracterstica da metodologia de determinao da marcao
em aminocidos por GC-MS o fato de que no apenas os derivados de
aminocidos so detectados, mas tambm alguns fragmentos dos
mesmos, devido fragmentao que ocorre no espectrmetro de massa
(FIGURA 2.16). Isto representa um aumento na quantidade de
informao obtida, pois torna-se possvel comparar dados de diferentes
fragmentos de um mesmo aminocido, deduzindo-se a partir da a
marcao em tomos de carbono individuais dos precursores (FIGURA
2.17). Alm disto, utilizando-se diferentes derivaes, possvel


42
comparar o padro de marcao nos mesmos fragmentos de
aminocidos obtidos pelas diferentes derivaes, o que serve para
confirmar as medidas.

G6P R5P
E4P
3PG
PEP
PYR
OAA
AcCOA
AKG
His
Ser
Gl y
Trp
Tyr
Phe
Cys
Ala
Leu
Val
Lys Gln
Glu Pro
Arg
Ile
Thr
Met Asp
Asn

FIGURA 2.15 - Aminocidos proteinognicos de S. cerevisiae e seus precursores do
metabolismo central. Os aminocidos detectados pela metodologia empregada neste
trabalho (indicados na TABELA 2.2) esto sombreados.

A metodologia empregada neste trabalho a mesma descrita por
CHRISTENSEN; NIELSEN (1999b). Os dois tipos de derivaes
utilizados para aminocidos usam os agentes ECF (cloroformiato de
etila) e DMFDMA (dimetilacetal- (N,N-)-dimetilformamida). Nas FIGURAS
2.18 e 2.19 possvel observar cromatogramas com os picos
correspondentes aos aminocidos detectveis pela metodologia
empregada, juntamente com os principais padres de fragmentao.


43

FIGURA 2.16 Fragmentao de uma molcula de alanina. Alanina (esquerda)
derivatizada a ster metil alanina N-(N,N-)-dimetilmetileno, que gera o on molecular
do aminocido derivatizado (centro) e um fragmento consistindo dos tomo de C2 e C3
da molcula original de alanina (direita). (Reproduzido de CHRISTENSEN; NIELSEN,
1999b com permisso dos autores).


FIGURA 2.17 Espectros de massa correspondentes ao on molecular e a um
fragmento de on da alanina derivatizada conforme a FIGURA 2.16. O fragmento
esquerda contm os tomos de C2 e C3 da alanina e o fragmento direita contm os 3
tomos de alanina. As marcaes em ambos os fragmentos podem ser medidas por
GC-MS. Subtraindo-se a marcao no fragmento esquerda da marcao no
fragmento direita, obtm-se a marcao no tomo C1 da alanina. (Reproduzido de
CHRISTENSEN; NIELSEN, 1999b com permisso dos autores).

Outras formas de derivao podem ser utilizadas para
aminocidos, como por exemplo derivao por MTBSTFA ((N-)-t-
butildimetilsilil-(N-)-metil-trifluoroacetamida), conforme proposto por
DAUNER; SAUER (2000). No entanto, em todos os casos, no so todos
os aminocidos que podem fornecer informaes anlise, pois durante
a hidrlise da biomassa previamente derivao, aminocidos como
cistena e triptofano so destrudos oxidativamente e outros, como


44
asparagina e glutamina, perdem radicais amina e so convertidos a
aspartato e glutamato, respectivamente.


Figura 2.18 - Cromatograma dos aminocidos derivados por ECF obtidos do
hidrolizado de biomassa de P. chrysogenum. Os tempos de reteno correspondem a
Ala (4,05), Gly (4,25), Val (4,74), Ser (4,88), Leu (5,14), Ile (5,19), Pro (5,47), Thr (5,62),
Asp (6,07), Glu (6,48), Phe (6,88), Lys (8,36). Os padres de fragmentao mais
comuns encontram-se indicados direita: A, sem fragmentao, B, perda do grupo
ster e C, perda da cadeia lateral. O fragmento B o mais freqente (reproduzido de
CHRISTENSEN; NIELSEN, 1999b).


Figura 2.19 - Cromatograma dos aminocidos derivados por DMFDMA obtidos do
hidrolizado de biomassa de P. chrysogenum. Os tempos de reteno correspondem a
Ala (6,09), Gly (6,30), Val (7,25), Asp (10,96), Glu (11,70), Phe (12,13), Lys (13,24). Os
padres de fragmentao mais comuns encontram-se indicados direita: D, sem
fragmentao, E, perda do grupo ster e F, perda da cadeia lateral. O fragmento E o
mais freqente (reproduzido de CHRISTENSEN; NIELSEN, 1999b).

45
3. METODOLOGIA

3.1. Cepas

Todas as cepas da levedura Saccharomyces cerevisiae utilizadas
neste trabalho foram obtidas a partir da cepa referncia CEN.PK113-
7D. Somente cepas haplides foram utilizadas. Suas principais
caractersticas encontram-se descritas na TABELA 3.1.

TABELA 3.1 - Cepas utilizadas
Cepa mu-
tante
detalhes delees referncia
CEN.PK113-7D - MAL2-8
c
SUC2 - VAN DIJKEN
et al (2000)
T468 mig1 MAL2-8
c
SUC2 mig1::MEL1 KLEIN et al
(1999)
T475 mig1
mig2
MAL2-8
c
SUC2 mig1::MEL1 mig2::URA3 KLEIN et al
(1999)
CEN.PK506-1C snf1 MAL2-8
c
SUC2 cat1(4,1899)::loxP-Kan-loxP este trabalho
CEN.PK507-5B snf4 MAL2-8
c
SUC2 cat3(4,966)::loxP-Kan-loxP este trabalho
CEN.PK513-3A grr1 MAL2-8
c
SUC2 cat80(4,2883)::loxP-Kan-loxP este trabalho
CEN.PK514-2B reg1 MAL2-8
c
SUC2 hex2(131,4092)::loxP-Kan-loxP este trabalho
CEN.PK517-1A hap4 MAL2-8
c
SUC2 hap4(41,1617)::loxP-Kan-loxP este trabalho
CEN.PK520-6B hxk2 MAL2-8
c
SUC2 hxk2(4,1458)::loxP-Kan-loxP este trabalho

A cepa CEN.PK113-7D a cepa atualmente mais utilizada em
pesquisas biotecnolgicas na Europa. Foi escolhida como referncia,
dentre vrias possibilidades, a partir de estudos realizados por grupos
europeus. O motivo desta escolha permitir a comparao entre os
resultados obtidos em diferentes laboratrios (VAN DIJKEN et al, 2000).
Como o objetivo dos trabalhos de pesquisa em biotecnologia
otimizar as caractersticas celulares para aplicaes industriais,
esforos multidisciplinares so requeridos, o que exige o trabalho de
diferentes profissionais, como geneticistas, biologistas moleculares,
fisiologistas e engenheiros bioqumicos. Cada um destes profissionais
tem seus requerimentos especficos de trabalho. Se por um lado os
engenheiros bioqumicos e os fisiologistas procuram trabalhar com
cepas que apresentam um bom desempenho em termos de velocidades

46
de crescimento, de formao de produto e alta converso, os
geneticistas e os biologistas moleculares preferem cepas que
apresentam alto grau de esporulao e alta eficincia de transformao.
Desta forma, o que tem ocorrido historicamente que diferentes cepas
de levedura tm sido utilizadas por estes diferentes grupos de
profissionais, o que dificulta a comparao e interpretao de
resultados. Cabe aqui ressaltar que caractersticas genticas e
fisiolgicas de S. cerevisiae variam muito entre diferentes cepas.
Aparentemente, no existe uma cepa ideal para estudos
biotecnolgicos. Cepas como a CBS8066, que tem um timo
desempenho fisiolgico, tem caractersticas genticas desfavorveis,
como baixa eficincia de transformao e o fato de ser heterozigota para
alguns marcadores auxotrficos. Cepas como a X2180 tem timo
desempenho gentico, mas caractersticas fisiolgicas desfavorveis,
como baixa velocidade de crescimento em glicose. Tomando como base
as caractersticas indicadas na TABELA 3.2, um estudo conjunto
realizado entre vrios laboratrios da Europa elegeu a cepa CEN.PK113-
7D como referncia a ser utilizada para pesquisa em biotecnologia.
A cepa CEN.PK113-7D uma cepa haplide (MATa), prototrfica,
obtida a partir da cepa diplide CEN.PK122, sendo que ambas
apresentam caractersticas muito similares. A famlia CEN.PK foi
construda dentro de um projeto de pesquisa interdisciplinar alemo,
patrocinado pela fundao Volkswagen, o qual teve como objetivo
atender s necessidades de fisiologistas, geneticistas e engenheiros. As
cepas CEN.PK foram obtidas a partir de duas cepas de laboratrio,
atravs de uma srie de cruzamentos e retrocruzamentos. Por todos
estes motivos, ao longo deste trabalho, emprega-se o termo cepa
referncia e no cepa selvagem para a cepa CEN.PK113-7D. No entanto,
importante ressaltar que todos os mutantes utilizados so
prototrficos e isognicos em relao cepa referncia. A cepa
referncia encontra-se disponvel na maioria dos laboratrios de
biotecnologia da Europa. A maioria dos mutantes utilizados neste

47
trabalho foi obtida do laboratrio do Dr. Peter Ktter, do Institut fr
Mikrobiologie der Johann Wolfgang Goethe-Universitt Frankfurt.
Alguns mutantes (mig1 e mig1mig2, vide TABELA 3.1) j se
encontravam disponveis nos laboratrios do CPB/IBT/DTU.

TABELA 3.2 - Caractersticas desejadas para uma cepa referncia
em biotecnologia
Crescimento rpido em meio mineral suplementado somente com vitaminas
Ampla gama de fontes de nitrognio e carbono para crescimento
Alta converso da fonte de carbono a biomassa
Crescimento rpido, respiratrio em aerobiose em quimiostatos limitados por
glicose
Crescimento em meio definido sob condies estritamente anaerbias
Alta eficincia de esporulao, viabilidade de esporos e eficincia de "mating"
Alta eficincia de transformao
Estabilidade gentica
Boa produo de protenas heterlogas, tanto intra- como extracelularmente

3.1.1. Preservao

As cepas eram conservadas em placas contendo meio YPD (Yeast
Extract, Peptone, Dextrose), contendo (em g/L): extrato de levedura,
10; peptona, 20; glicose, 20; agar, 20. Repiques eram feitos a cada 30
dias, aproximadamente. As primeiras placas foram obtidas a partir das
cepas congeladas a 80
o
C em tubos contendo meio YPD com glicerol
(em g/L): extrato de levedura, 8; peptona, 16; glicose, 16 e glicerol, 200
mL/L.

3.2. Cultivos

3.2.1. Inculo

A partir das placas (descritas no item 3.1.1), clulas eram
transferidas com uma ala de platina para frascos de 500 mL do tipo
Erlenmeyer, com chicanas. Estes frascos continham 100 mL do
seguinte meio (em g/L): glicose, 10,0; (NH4)2SO4, 7,5; KH2PO4, 14,4;

48
MgSO4.7H2O, 0,48; soluo de elementos trao, 2,0 mL/L; soluo de
vitaminas, 1,0 mL/L; pH ajustado para 6,5. Aps cerca de 24 h num
incubador rotativo a 30
o
C, 150 min
-1
, as clulas desta cultura eram
utilizadas para inocular o reator numa proporo tal que a DO600 inicial
fosse de 0,15. Nestas condies, o reator era sempre inoculado com um
volume de inculo em torno de 1 a 2% do volume total de meio, com
clulas em fase exponencial de crescimento.

3.2.2. Cultivos descontnuos

Os cultivos descontnuos foram realizados em reatores de 300 mL
de volume total, sendo que 200 mL era o volume ocupado pelo meio
durante os ensaios (FIGURA 3.1). O meio de cultura (VERDUYN et al,
1992) era composto de (em g/L): (NH4)2SO4, 5,0; KH2PO4, 3,0;
MgSO4.7H2O, 0,5; soluo de elementos trao, 1,0 mL/L; soluo de
vitaminas, 1,0 mL/L. Nos cultivos realizados com substrato marcado,
foi utilizada [1-
13
C]glicose como fonte de carbono e energia, numa
concentrao inicial de 5,0 g/L. Nos cultivos sem substrato marcado,
glicose naturalmente marcada (1,1% em cada tomo de carbono) foi
utilizada. As principais caractersticas de cada cultivo esto indicadas
na TABELA 4.1. Em todos os casos, o pH era controlado em 5,0 0,05
atravs de adio controlada de NaOH 0,05N. A temperatura era
controlada em 30
o
C atravs da circulao de gua da camisa do reator
por um banho termostatizado. Para garantir condies de aerobiose, ar
comprimido e filtrado era introduzido por uma agulha mergulhada no
lquido, aps borbulhamento em soluo de NaOH 2N, para garantir
eliminao de eventuais traos de CO2 no gs de entrada, o que poderia
prejudicar a anlise de fluxos metablicos. O contedo do reator era
continuamente agitado magneticamente rotao de 900 min
-1
, o que
garantia condies de mistura perfeita e uma concentrao de oxignio
dissolvido sempre acima de 70% da saturao com ar.


49


FIGURA 3.1 Fotografia do reator utilizado para cultivos com substrato marcado.
O reator denominado HPBRG4.1 (High-Performance Bioreactor Generation 4.1).

Devido ao pequeno volume dos reatores utilizados para
experimentos com substrato marcado, o que poderia gerar dvidas
quanto s medidas de concentrao celular em termos de biomassa
seca de clulas (item 3.2.6.2), foram realizados alguns cultivos
descontnuos em reatores de 4 L de volume til, com o objetivo de se

50
confirmar parmetros do tipo max e Yx/s obtidos nos reatores pequenos.
Estes reatores (de fabricao prpria do CPB/IBT/DTU) eram equipados
com duas turbinas tipo Rushton, e as condies de pH, temperatura e
concentrao de oxignio dissolvido eram iguais s utilizadas nos
reatores pequenos. A nica diferena que o pH era controlado atravs
da adio de uma soluo de NaOH 2N. O meio de cultura tambm era
o mesmo, com exceo da concentrao inicial de glicose, que nos casos
dos reatores de 4 L foi de 10 g/L (nestes casos sempre foi utilizada
glicose naturalmente marcada).

3.2.3. Cultivos contnuos

Os cultivos contnuos sempre foram realizados nos reatores de
300 mL descritos acima (FIGURA 3.1) e tinham incio com um cultivo
descontnuo. No entanto, o volume de trabalho nestes casos era de 150
ou 200 mL. As condies de pH, temperatura, aerao e agitao
empregadas, foram iguais s descritas no item acima (para detalhes
sobre os ensaios, ver TABELA 4.1). A taxa de diluio sempre foi de 0,1
h
-1
, sendo tanto a alimentao e a retirada de meio (por um tubo
ajustado ao nvel desejado) feitos por operao ininterrupta de bombas
Watson-Marlow, modelo 101 U/R. O meio de cultura de alimentao era
anlogo ao descrito acima, mas com concentrao de glicose
(naturalmente marcada) de 2 g/L. Quando o estado estacionrio
fisiolgico era atingido (normalmente, 4 ou 5 tempos de residncia aps
o incio do processo contnuo, o que era determinado por medidas de
DO600 e posteriormente confirmado por medidas de concentrao de
metablitos extracelulares), o meio de alimentao era substitudo por
outro meio anlogo, mas com 2 g/L de [1-
13
C]glicose no lugar da glicose
naturalmente marcada. Esperava-se ento mais 4 ou 5 tempos de
residncia at que o estado estacionrio isotpico fosse atingido (o que
era determinado por medidas de DO600 e posteriormente confirmado por

51
medidas de concentrao de metablitos extracelulares e de marcao
nos metablitos intracelulares).

3.2.4. Solues

Os meios de cultura utilizados incluem uma soluo de elementos
trao e uma soluo de vitaminas (VERDUYN et al, 1992). A composio
da soluo de elementos trao (em g/L): EDTA, 15,0; ZnSO4.7H2O,
4,5; MnCl2.2H2O, 0,84; CoCl2.6H2O, 0,30; CuSO4.5H2O, 0,30;
Na2MoO4.2H2O, 0,40; CaCl2.2H2O, 4,5; FeSO4.7H2O, 3,0; H3BO3, 1,0;
KI, 0,10. A composio da soluo de vitaminas (em g/L): D-biotina,
0,05; pantotenato de clcio, 1,0; cido nicotnico, 1,0; mio-inositol,
25,0; cloreto de tiamina, 1,0; cloreto de piridoxol, 1,0; cido para-
aminobenzico, 0,20.

3.2.5. Esterilizao

Todos os componentes do meio de cultura e os reatores eram
esterilizados em autoclave a 121
o
C por 25 min, com exceo da soluo
de vitaminas, a qual era esterilizada por filtrao atravs de membrana
0,22 m de porosidade.

3.2.6. Tratamento de amostras

Ao longo dos cultivos descontnuos, eram retiradas amostras de
hora em hora, o que gerava um total de cerca de 10 amostras. Nos
cultivos contnuos, amostras eram retiradas cerca de duas vezes por
tempo de residncia. As amostras eram retiradas por um fino tubo de
ao, com volume morto de cerca de 0,3 mL. Em cada amostragem,
desprezava-se cerca de 0,5 mL e retirava-se 1 mL em cubeta
espectrofotomtrica, para medida de DO600 em Espectrofotmetro
Shimadzu (Japo), modelo CL-720. Aps esta medida, a amostra era

52
filtrada atravs de membrana de acetato 0,45 m Osmonics
(Minnetonka, MN) e congelada a 20
o
C para futura determinao da
concentrao de metablitos extracelulares (item 3.2.6.1).
Os cultivos descontnuos eram interrompidos ao final da fase
exponencial de crescimento, aps pelo menos 4 tempos de gerao. Os
cultivos contnuos eram interrompidos quando o estado estacionrio
isotpico era atingido. Em ambos os casos, o contedo do reator (150
ou 200 mL, dependendo do caso) era transferido rapidamente para um
frasco em banho de gelo. Cerca de 40 mL eram utilizados para
determinao da concentrao celular por biomassa seca de clulas
(item 3.2.6.2). Nos casos em que foi utilizado substrato marcado, o
restante do contedo do reator era filtrado sob vcuo, atravs de
membrana de nitrocelulose 0,45 m Gelman Sciences (Ann Harbour,
MI), lavado duas vezes com gua destilada e a massa mida de clulas
era congelada imediatamente a 80
o
C e posteriormente utilizada para a
determinao da marcao em metablitos intracelulares (item 3.2.6.3).
Alm das anlises descritas acima, em alguns cultivos contnuos
foram retiradas amostras na sada do reator ao longo dos experimentos.
Isto era realizado em tubos de centrfuga de 50 mL, em banho de gelo.
Aps cerca de uma hora (tempo suficiente para recolher em torno de 15
mL de amostra), os tubos eram levados centrifugao a 4
o
C, 3000g
por 10 min. Em seguida, o sobrenadante era desprezado, o pellet
ressuspendido em gua destilada, centrifugado novamente e o pellet
resultante transferido para tudos tipo Eppendorf utilizando-se 1,5 mL
de gua destilada. Estes tubos eram subseqentemente centrifugados a
4
o
C, 5000g por 5 min e o pellet resultante era congelado a 80
o
C para
futura determinao da marcao em metablitos intracelulares (item
3.2.6.3).
Conforme mencionado no item 3.2.2, nos cultivos descontnuos
realizados em reatores de 4 L, no foi utilizado substrato marcado. No
entanto, amostras de maior volume eram retiradas periodicamente do
reator para determinao da concentrao celular por biomassa seca de

53
clulas (item 3.2.6.2) e da concentrao de metablitos extracelulares
(item 3.2.6.1).

3.2.6.1. Determinao da concentrao de metablitos extracelulares

Glicose, etanol, glicerol, acetato, succinato e piruvato eram
separados numa coluna de excluso inica Aminex HPX-87H BioRad
(Hercules, CA) a 65
o
C, utilizando-se H2SO4 5 mM como fase mvel a
uma vazo de 0,6 mL/min. Glicose, etanol, glicerol e succinato eram
detectados num refratmetro diferencial Waters 410 (Millipore, Milford,
MA). Acetato e piruvato eram detectados por absorbncia a 210 nm
num detector Waters 486. Os dois detectores estavam conectados em
srie.

3.2.6.2. Determinao da concentrao celular por biomassa seca de clulas

Um volume entre 20 mL e 50 mL de amostra era filtrado sob
vcuo atravs de membrana de nitrocelulose 0,45 m Gelman Sciences
(Ann Harbour, MI) (previamente seca em forno de microondas a 180W
por 10 min), lavado duas vezes com gua destilada e levado ao forno de
microondas numa potncia de 180W por 15 min. A diferena entre a
massa da membrana contendo a biomassa seca de clulas e a massa da
membrana sem clulas, era ento dividida pelo volume utilizado na
filtrao, obtendo-se a concentrao celular em gramas de biomassa
seca por litro. Para que esta determinao seja precisa, deve-se utilizar
um volume de amostra tal que a biomassa seca de clulas retidas na
membrana esteja em torno de 50 mg (OLSSON; NIELSEN, 1997). A
anlise era feita em duplicata no caso de cultivos contnuos e nica no
caso dos cultivos descontnuos.




54
3.2.6.3. Determinao da marcao em metablitos intracelulares

Para a anlise da marcao nos fragmentos de metablitos
intracelulares de S. cerevisiae, cerca de 20 mg de massa mida de
clulas congeladas a 80
o
C eram transferidos para 800 L de HCl 6M. A
mistura era ento separada em duas fraes. Uma delas, de cerca de
700 L, era usada para a determinao da marcao em fragmentos de
aminocidos. A outra frao, de cerca de 100 L, era utilizada para a
determinao da marcao na glicose intracelular. A primeira frao era
submetida a hidrlise a 105
o
C por um perodo entre 12 e 24 h. Em
seguida, cerca de 800 L de gua destilada eram adicionados
amostra, a qual era centrifugada a 3000g por 5 min para separao dos
fragmentos de clulas. O sobrenadante era ento separado em fraes
de 200 L, as quais eram levadas secagem a 105
o
C. Aps isto, as
amostras secas eram derivatizadas separadamente por dois agentes,
quais sejam o cloroformiato de etila (ECF) e o dimetilacetal-(N,N-)-
dimetilformamida (DMFDMA). Em ambos os casos, o protocolo descrito
por CHRISTENSEN; NIELSEN (1999b) foi utilizado. A nica diferena
que no foi utilizada adio de anidrido trifluoroactico (TFAA) no
presente trabalho. A segunda frao de amostra (de cerca de 100 L,
conforme descrito acima), era hidrolisada durante apenas 20 a 30 min a
105
o
C. Em seguida, 100 L de gua destilada eram adicionados
amostra e a derivatizao da glicose presente na amostra a glicose
pentaacetato (GPA) era realizada de acordo com o protocolo descrito por
CHRISTENSEN; NIELSEN (2000).
Em todos os casos, as amostras derivatizadas eram injetadas
num cromatgrafo gasoso acoplado a um espectrmetro de massa (GC-
MS) (Hewlett-Packard, modelo HP-G1723A). O espectrmetro de massa
era do tipo detector seletivo de massa (EI). Pelo menos duas injees
eram realizadas para cada derivatizao e as condies empregadas
encontram-se descritas por CHRISTENSEN; NIELSEN (1999b). O
resultado da anlise constitudo por uma srie de clusters, cada um

55
deles correspondente s intensidades dos isotopmeros de massa de um
nico fragmento de aminocido (ou do fragmento de glicose, no caso da
derivatizao da glicose) (ver item 2.4.2 da reviso bibliogrfica para
uma descrio dos princpios da metodologia). Estas intensidades eram
corrigidas em funo da marcao natural dos tomos agregados aos
fragmentos devido ao processo de derivatizao (LEE et al, 1991; LEE et
al, 1992). Finalmente, a marcao de cada fragmento era calculada de
acordo com a seguinte frmula:


3 1
3
3 1
2
3 1
1
3 1
0
3 1
3
3 1
2
3 1
1
3 1
0 3 1
. 3 . 2 . 1 . 0
) (

+ + +
+ + +
=
m m m m
m m m m
Ala MAR
[3.1]

Na equao acima, est indicada a frmula de clculo da
marcao no fragmento de alanina que contm os 3 tomos de carbono
do aminocido. Os ndices superiores indicam os tomos de carbono
presentes no fragmento e mn representa a intensidade corrigida do
isotopmero de massa que contm n tomos de carbono marcados.
importante notar que a marcao em um fragmento, calculado
conforme a equao 3.1 a partir das medidas por GC-MS, igual
soma das marcaes nos tomos de carbono presentes no fragmento.
Portanto, se MAR(Ala
1-3
) e MAR(Ala
1-2
) podem ser medidos, torna-se
possvel calcular a marcao no tomo C3 da alanina subtraindo-se o
segundo valor do primeiro.

3.2.7. Tratamento matemtico dos dados

Os dados de marcao, obtidos conforme o descrito no item
3.2.6.3, so usados como dados de entrada para uma rotina
matemtica numrica, a qual utilizada para calcular os fluxos no
metabolismo central de S. cerevisiae. Confome descrito por
CHRISTENSEN; NIELSEN (2000) e apresentado com detalhes no item
2.3.3 da reviso bibliogrfica, a cada iterao da rotina numrica, uma

56
estimativa feita para o conjunto de fluxos. Esta estimativa utilizada
para calcular as marcaes nos metablitos intracelulares atravs de
um modelo matemtico que representa as vias metablicas centrais de
S. cerevisiae. Em seguida, dois erros so gerados: o primeiro
comparando-se os valores das marcaes calculadas com as marcaes
medidas e o segundo comparando-se os valores dos fluxos calculados
com os fluxos medidos (alternativamente, pode-se utilizar dados de
composio da biomassa de S. cerevisiae, disponveis na literatura,
como fluxos medidos). Se a soma destes dois erros for menor que o erro
armazenado, a estimativa para o conjunto de fluxos utilizada nesta
iterao considerada a melhor at o momento. Caso contrrio, esta
estimativa descartada. Em seguida, uma nova iterao iniciada a
partir de uma nova estimativa para o conjunto de fluxos. O processo
segue at que um erro aceitvel seja atingido.
O modelo matemtico um elemento central neste processo
iterativo. Este modelo do tipo estequiomtrico (GOMBERT; NIELSEN,
2000) e inclui as principais reaes do metabolismo central de S.
cerevisiae. As equaes que fazem parte deste modelo, assim como as
correspondentes transies de tomos de carbono nas reaes
individuais do metabolismo, encontram-se indicadas no Apndice. As
vias metablicas consideradas so as centrais: a via EMP, a via PP e o
ciclo TCA. Alm destas, so includas algumas reaes adicionais,
baseando-se em conhecimentos bioqumicos especficos de S. cerevisiae
e nos resultados de marcao obtidos nos experimentos realizados
neste trabalho (ver seo Resultados e Discusso para detalhes). Dividir
alguns metablitos em diferentes compartimentos celulares
importante para ajustar os valores de marcao calculados aos valores
medidos (CHRISTENSEN; NIELSEN, 2000). Desta forma, oxaloacetato,
acetil coenzima A e piruvato foram separados em dois pools cada, um
citosslico e outro mitocondrial. A reao anaplertica catalisada pela
enzima piruvato carboxilase foi includa no modelo como citosslica
(HAARASILTA; TASKINEN, 1977; WALKER et al, 1991), a reao

57
catalisada pela enzima treonina aldolase foi includa como uma rota
alternativa de biossntese de glicina (LIU et al, 1997; MONSCHAU et al,
1997) e a reao catalisada pela enzima mlica foi includa como
mitocondrial, pois h evidncias de que esta reao ocorre quando S.
cerevisiae cresce em glicose (BOLES et al, 1998).
Em termos da excreo de metablitos, dos principais produtos
formados em cultivos de S. cerevisiae (etanol, acetato, glicerol,
succinato e piruvato), as excrees de succinato e piruvato no foram
consideradas no modelo, pois representam uma frao muito pequena
(< 0,1%) do carbono consumido pelas clulas sob forma de glicose.
Em termos da drenagem de precursores para biossntese (o que
corresponde aos chamados fluxos medidos), diferentes composies, em
termos de macromolculas, foram consideradas para a biomassa da
cepa referncia de S. cerevisiae, dependendo da condio de cultivo. Os
valores foram obtidos da literatura e encontram-se indicados na
TABELA 3.3. Nota-se que uma composio diferente foi considerada
para clulas cultivadas em quimiostato a 0,1 h
-1
em relao a clulas
cultivadas a max em processo descontnuo (em ambos os casos, glicose
o substrato limitante). Isto se deve basicamente ao fato de que o teor
de protena aumenta e o teor de carboidratos diminui com o aumento
da velocidade especfica de crescimento de S. cerevisiae. No entanto, em
ambos os casos, assumiu-se que a composio de cada tipo de
macromolcula independente da condio de cultivo. Assim, a
composio da protena de S. cerevisiae em termos de aminocidos foi
considerada independente da condio de cultivo e foi obtida de OURA
(1983). Analogamente, assumiu-se que a composio lipdica
independente da condio de cultivo e foi obtida de BRUINENBERG et
al (1983) e OURA (1983). A frao de carboidratos foi assumida como
sendo um polmero de glicose e que o nico precursor drenado para sua
biossntese a glicose-6-fosfato. Os cidos nuclicos foram assumidos
como sendo exclusivamente RNA, j que a frao de DNA corresponde a
apenas 0,3% da biomassa seca (OURA, 1983). Levando-se tudo isto em

58
considerao, a drenagem de precurores para biossntese na cepa
referncia de S. cerevisiae foi calculada e encontra-se apresentada na
TABELA 3.4.
Finalmente, para o clculo da composio da biomassa dos
mutantes utilizados neste trabalho, foi assumido que a composio
funo exclusiva da velocidade especfica de crescimento. Desta forma,
para obter os valores apresentados na TABELA 3.5, utilizou-se simples
interpolao dos valores da TABELA 3.3, considerando-se as
velocidades especficas de crescimento de cada mutante. Apesar de
estas hipteses serem fortes, considerou-se faz-las, pois foi
demonstrado que perturbaes na composio da biomassa no alteram
significativamente o conjunto final de fluxos calculados (DAAE; ISON,
1999). Com os valores da TABELA 3.5, calculou-se a drenagem de
precursores para biossntese nos diferentes mutantes estudados
(TABELA 3.6). Os valores apresentados nas TABELAS 3.4 e 3.6 foram
utilizados na rotina numrica de estimativa de fluxos metablicos,
conforme descrito no item 2.3.3 da reviso bibliogrfica.

TABELA 3.3 Composio celular nas diferentes condies de
cultivo estudadas
macro-
molcula
D= =0,1 h
-1

(quimiostato)
max=0,37 h
-1
(descontnuo)
referncias
protena 42% 51%
ERTUGAY; HAMAMCI
(1997) VERDUYN (1991)
lipdeos 7% 7%
NISSEN et al (1997)
OURA (1972)
VAN GULIK; HEIJNEN
(1995)
carboidratos 40% 27%
KENZI; FIECHTER
(1972)
RNA 7% 11%
OURA (1983)
VERDUYN (1991)
cinzas 4% 4%
NISSEN et al (1997)
OURA (1983)







59
TABELA 3.4 Precursores drenados para biossntese na cepa
referncia*
D= =0,1 h
-1

(quimiostato)
max=0,37 h
-1
(descontnuo)
ACCOAcyt
ACCOAmit
2,44
0,311
2,50
0,378
AKG 1,07 1,30
C1 0,327 0,397
E4P 0,277 0,337
GLY
SER
G3P(lipdeos)
0,407
0,202
0,091
0,494
0,245
0,091
G6P 2,47 1,67
THR
OAA(outros)
0,403
0,589
0,490
0,715
P5P 0,318 0,464
PEP 0,555 0,674
PYR 1,83 2,22
*valores em mmol de precursor por g de biomassa seca

As equaes que fazem parte do modelo podem variar de um caso
para outro, dependendo da condio de cultivo e do mutante analisado.
O modelo apresentado no Apndice foi gerado para a cepa referncia
CEN.PK113-7D e foi tambm o que levou a melhores resultados com os
mutantes. importante notar que o modelo utilizado em cada caso a
verso final de frutos de tentativas e erros, ou seja, tenta-se fazer os
clculos com diferentes modelos, e aquele que apresentar o menor erro,
aceito como o melhor, desde que a bioqumica e a fisiologia de S.
cerevisiae no sejam desrespeitadas. Este procedimento caracterstico
da Anlise de Redes Metablicas conhecido como identificao de
redes metablicas (CHRISTENSEN; NIELSEN, 1999) ou, conforme
denominado no item 4.3.2, inspeo qualitativa dos dados de marcao.







60
TABELA 3.5 Composio celular dos diferentes mutantes
estudados*
macro-
molcula
snf1 snf4 hxk2 hap4 grr1 reg1
(h
-1
) 0,34 0,34 0,32 0,30 0,27 0,18
protena
50,0% 50,0% 49,3% 48,7% 47,7% 44,7%
lipdeos
7,0% 7,0% 7,0% 7,0% 7,0% 7,0%
carboidratos
28,4% 28,4% 29,4% 30,4% 31,8% 36,1%
RNA
10,6% 10,6% 10,3% 10,0% 9,5% 8,2%
cinzas
4,0% 4,0% 4,0% 4,0% 4,0% 4,0%
*considerou-se que a composio celular dos mutantes mig1 e mig1mig2 igual da
cepa referncia

TABELA 3.6 Precursores drenados para biossntese nos mutantes*
mutante snf1 snf4 hxk2 hap4 grr1 reg1
(h
-1
) 0,34 0,34 0,32 0,30 0,27 0,18
ACCOAcyt
ACCOAmit
2,50
0,370
2,50
0,370
2,49
0,365
2,49
0,361
2,48
0,353
2,46
0,331
AKG 1,27 1,27 1,26 1,24 1,21 1,14
C1 0,389 0,389 0,384 0,379 0,371 0,348
E4P 0,330 0,330 0,325 0,322 0,315 0,295
GLY
SER
G3P(lipdeos)
0,484
0,240
0,091
0,484
0,240
0,091
0,477
0,237
0,091
0,472
0,234
0,091
0,462
0,229
0,091
0,433
0,214
0,091
G6P 1,75 1,75 1,81 1,88 1,96 2,23
THR
OAA(outros)
0,48
0,701
0,48
0,701
0,473
0,691
0,468
0,683
0,458
0,668
0,429
0,626
P5P 0,449 0,449 0,438 0,427 0,409 0,362
PEP 0,660 0,660 0,651 0,643 0,630 0,590
PYR 2,18 2,18 2,15 2,12 2,08 1,95
*valores em mmol de precursor por g de biomassa seca


61
4. RESULTADOS E DISCUSSO

4.1. Cultivos realizados

As principais caractersticas dos ensaios (cultivos em biorreator)
realizados so apresentadas na Tabela 4.1. A ordem de apresentao
segue a numerao dos ensaios e cronolgica. Os ensaios cujos
resultados no puderam ser aproveitados no aparecem na Tabela 4.1.

Tabela 4.1 - Principais caractersticas dos ensaios realizados*
Ensaio Objetivo Cepa de
S. cerevi si ae
S0
(a)

(g/L)
Substrato
marcado
ANGO8a
ANGO8b
Descontnuo
Verificar a reprodutibilidade de
cultivos realizados no reator
HPBRG4.1
(b)
.
CEN.PK 113-7D
(referncia)
5,0 -
ANGO9
Descontnuo
Determinar o padro de marcao
nos metablitos intracelulares na
cepa referncia em crescimento
exponencial, em situao de
represso por glicose.
CEN.PK 113-7D
(referncia)
5,0 [1-
13
C]glicose
ANGO10
Descontnuo
Determinar o padro de marcao
nos metablitos intracelulares no
mutante mig1 em crescimento
exponencial, em situao de
represso por glicose.
T468
(mig1)
5,0 [1-
13
C]glicose
ANGO11
Contnuo
Determinar o padro de marcao
nos metablitos intracelulares na
cepa referncia, na ausncia de
represso por glicose.
Verificar o nmero de tempos de
residncia necessrios para se
atingir o estado estacionrio
isotpico.
Verificar a reprodutibilidade da
metodologia de determinao da
marcao em metablitos
intracelulares de S. cerevisiae por
GC-MS.
CEN.PK 113-7D
(referncia)
2,0
(c)
[1-
13
C]glicose
MDSANGO
Incubador
rotativo
Verificar a reprodutibilidade e
preciso da metodologia de
determinao da marcao em
metablitos intracelulares de
S. cerevisiae por GC-MS.
CEN.PK 113-7D
(referncia)
10,0 -
ANGO12
Descontnuo
Verificar a converso substrato a
biomassa seca.
CEN.PK113-7D
(referncia)
5,0 -
5,0 -
descontnuo
2,0
(c)
[1-
13
C]glicose
ANGO13
Descontnuo
+ Contnuo
Verificar a converso substrato a
biomassa seca e determinar o
padro de marcao nos
metablitos intracelulares do
mutante mig1, na ausncia de
represso por glicose.
T468
(mig1)
contnuo
ANGO15
Descontnuo
Determinar o padro de marcao
nos metablitos intracelulares do
mutante mig1mig2 em
crescimento exponencial, em
situao de represso por glicose.
T475
(mig1mig2)
5,0 [1-
13
C]glicose

62


Tabela 4.1 (continuao)
Ensaio Objetivo Cepa de
S. cerevi si ae
S0
(a)

(g/L)
Substrato
marcado
CEN.PK113-7D
(referncia)
10,0 -

ANGO16a
T468
(mig1)
10,0 -

ANGO16a
(d)

ANGO16b
(d)

Descontnuo
Confirmar os valores dos
parmetros max e Yx/s em cultivos
descontnuos.

ANGO16b
ANGO17a
ANGO17b
Descontnuo
Confirmar a validade da utilizao
de cultivos descontnuos para
experimentos com substrato
marcado (verificao da hiptese
de estado pseudo estacionrio).
CEN.PK506-1C
(snf1)
5,0 [1-
13
C]glicose
CEN.PK506-1C
(snf1)
10,0 -

ANGO18a
T475
(mig1mig2)
10,0 -

ANGO18b
CEN.PK113-7D
(referncia)
10,0 -

ANGO18a
(d)

ANGO18b
(d)
ANGO18c
(d)

Descontnuo
Confirmar os valores dos
parmetros max e Yx/s em cultivos
descontnuos.

ANGO18c
CEN.PK507-5B
(snf4)
5,0 [1-
13
C]glicose

ANGO19a
CEN.PK513-3A
(grr1)
5,0 [1-
13
C]glicose

ANGO19a
ANGO19b
Descontnuo
Determinar o padro de marcao
nos metablitos intracelulares dos
mutantes snf4 e grr1 em
crescimento exponencial, em
situao de represso por glicose.
ANGO19b
ANGO20
Descontnuo
Determinar o padro de marcao
nos metablitos intracelulares do
mutante reg1 em crescimento
exponencial, em situao de
represso por glicose.
CEN.PK514-2B
(reg1)
5,0 [1-
13
C]glicose
CEN.PK517-1A
(hap4)
5,0 [1-
13
C]glicose

ANGO21a
CEN.PK520-6B
(hxk2)
5,0 [1-
13
C]glicose

ANGO21a
ANGO21b
Descontnuo
Determinar o padro de marcao
nos metablitos intracelulares dos
mutantes hap4 e hxk2 em
crescimento exponencial, em
situao de represso por glicose.
ANGO21b
(a)
O substrato limitante foi sempre glicose
(b)
HPBRG4.1 o nome dado ao reator: High-Performance Bioreactor Generation 4.1
(c)
Em cultivos contnuos, este valor indica a concentrao de substrato na alimentao

(d)
Estes cultivos foram realizados em reatores de 4L de volume til
*todos os ensaios foram realizados em aerobiose

63
4.2. Validao da Metodologia

Com o objetivo de verificar a reprodutibilidade de cultivos
realizados no reator HPBRG4.1 (High-Performance Bioreactor
Generation 4.1), foram realizados alguns ensaios, tratando-se
simplesmente de cultivos da levedura S. cerevisiae sem substrato
marcado. Estes cultivos foram realizados em aerobiose, conduzidos de
forma descontnua e em meio contendo inicialmente 5 g/L de glicose (os
detalhes das condies de cultivo encontram-se na seo Metodologia).
Os resultados do ensaio ANGO8, com dois cultivos realizados em
paralelo, so apresentados nas Figuras 4.1 e 4.2.

0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 2 4 6 8 10 12
tempo (h)
e
t
a
n
o
l

(
g
/
L
)

e

O
D
6
0
0
0
1
2
3
4
5
6
g
l
i
c
o
s
e

(
g
/
L
)
OD ango8a OD ango8b ETH ango8a ETH ango8b GLC ango8a GLC ango8b

Figura 4.1 Concentrao celular, de glicose e etanol. Os dados apresentados so
de dois cultivos realizados em paralelo (ensaio ANGO8, Tabela 4.1)

Como possvel observar nas Figuras 4.1 e 4.2, os dois cultivos
realizados em paralelo no ensaio ANGO8, apresentam resultados
bastante similares entre si, tanto em termos de crescimento celular,
como de consumo do substrato limitante e formao de produtos
extracelulares.
Com o objetivo de verificar a reprodutibilidade da metodologia de
determinao da marcao em fragmentos de aminocidos e na glicose

64
intracelular, desenvolvida e validada por CHRISTENSEN; NIELSEN
(1999b) e CHRISTENSEN; NIELSEN (2000), respectivamente, para um
fungo filamentoso, alguns experimentos especficos foram realizados,
quais sejam MDSANGO e ANGO11 (Tabela 4.1).

0
0,04
0,08
0,12
0,16
0,2
0 2 4 6 8 10 12
tempo (h)
c
o
n
c
.

(
g
/
L
)
SUC ango8a GLYC ango8a ACE ango8a PYR ango8a
SUC ango8b GLYC ango8b ACE ango8b PYR ango8b

Figura 4.2 Concentrao de succinato, glicerol, acetato e piruvato. Os dados
apresentados so de dois cultivos realizados em paralelo (ensaio ANGO8, Tabela 4.1)

No experimento MDSANGO, clulas de S. cerevisiae foram
cultivadas em incubador rotativo, em frascos tipo erlenmeyer com
chicanas, com glicose naturalmente marcada como substrato limitante
(o que significa que a marcao de 1,1% em cada tomo de C, pois o
carbono existente na natureza tem uma abundncia de 98,9% em
12
C e
1,1% em
13
C). O meio de cultura utilizado foi o descrito no item 3.2.1.
Trs frascos foram utilizados, sendo que ao final dos cultivos, a
biomassa de cada frasco foi filtrada separadamente e hidrolisada. A
amostra do frasco N
o
1 foi hidrolisada durante 13 horas, a do frasco N
o

2 durante 16 horas e a do frasco N
o
3 durante 19 horas. Procedeu-se
com a derivatizao dos aminocidos e, para cada derivatizao, as
anlises por GC-MS foram realizadas em dois instantes diferentes:
imediatamente aps a derivatizao (amostras 1a, 2a e 3a) e no mnimo
24 horas aps a derivatizao (amostras 1b, 2b e 3b). Todos estes

65
procedimentos tiveram como objetivo introduzir vrias fontes de erro na
metodologia, para verificar se alguma das etapas teria influncia
significativa nos resultados finais. Os principais resultados do
experimento MDSANGO so apresentados na Tabela 4.2, na qual os
valores mdios correspondem mdia das medidas nas amostras 1a,
2a, 3a, 1b, 2b, e 3b, conforme descrito acima. Nota-se que, de uma
maneira geral, as mdias calculadas apresentam um valor inferior s
mdias esperadas correspondentes, as quais so obtidas considerando-
se a marcao natural de 1,1% em cada tomo de carbono. No entanto,
os desvios relativos calculados so baixos, quase sempre menores que
10%, o que significa que as medidas, com exceo de 3 ou 4
fragmentos, so reprodutveis. Para determinar se realmente existe uma
tendncia de as medidas serem mais baixas do que na realidade
deveriam ser, ou se este problema ocorre apenas para esta faixa de
valores de marcao baixos, tentou-se realizar um experimento no qual
as clulas eram continuamente alimentadas com meio contendo 10% de
glicose totalmente marcada [U-
13
C6]glicose e 90% de glicose
naturalmente marcada. Neste experimento, esperar-se-ia que todos os
metablitos intracelulares apresentassem marcao de 11,1% em cada
tomo de carbono, aps atingido o estado estacionrio isotpico, em vez
de 1,1%, conforme realizado no experimento MDSANGO. Este
experimento no foi bem sucedido e terminou-se por tomar como base
os dados de um experimento anlogo realizado por CHRISTENSEN;
NIELSEN (1999b), os quais comprovam que no h uma tendncia de
os valores medidos serem mais baixos do que deveriam ser. Deve-se
ainda levar em conta que muitas variveis foram introduzidas em todo o
processo de amostragem, hidrlise e derivatizao neste experimento
MDSANGO, o que no ocorre normalmente nos cultivos e nas
amostragens realizados em biorreator.






66
Tabela 4.2 Mdias, desvios padro e desvios relativos, calculados
a partir dos dados de marcao do ensaio MDSANGO
Fragmento
(a)
mdia mdia de 6 desvio padro desvio
esperada
(b)
medidas de 6 medidas relativo (%)
(c)
Ser175 2,2 1,5 0,4 29%
Ser132 2,2 1,6 0,1 5%
Gly175 2,2 1,7 0,2 12%
Gly144 2,2 1,7 0,1 8%
Gly85 1,1 1,0 0,1 6%
Ala116 2,2 1,9 0,1 3%
Ala99 2,2 2,2 0,1 4%
Ala158 3,3 3,1 0,2 6%
Leu158 5,5 5,2 0,1 2%
Val144 4,4 4,2 0,1 2%
Val143 2,2 2,1 0,1 5%
Val127 4,4 4,4 0,2 4%
Val186 5,5 5,1 0,3 6%
Asp188 3,3 2,8 0,1 5%
Asp115 1,1 0,7 0,1 20%
Asp216 4,4 4,0 0,1 3%
Ile158 5,5 5,0 0,1 2%
Thr175 2,2 1,4 0,1 7%
Thr146 3,3 3,6 0,3 9%
Pro142 4,4 4,0 0,1 2%
Lys156 5,5 5,4 0,1 1%
Glu143 2,2 3,0 0,3 11%
Glu230 5,5 5,4 0,4 7%
His327 6,6 4,5 0,7 15%
Phe192 8,8 18,5 4,9 27%
Phe143 2,2 2,3 0,1 3%
Glc331 6,6 5,5 0,5 8%

(a) para detalhes sobre os fragmentos, vide rodap da Tabela 4.5
(b)considerando marcao natural de 1,1% em cada tomo de carbono
(c)
mdia
padro desvio
relativo desvio =

O experimento ANGO11 teve como objetivos, dentre outros,
verificar o nmero de tempos de residncia necessrios para se atingir o
estado estacionrio isotpico num cultivo contnuo e verificar a
reprodutibilidade da metodologia de determinao da marcao em
metablitos intracelulares de S. cerevisiae por GC-MS. Estes objetivos
foram atingidos atravs do acompanhamento da incorporao da marca
nos metablitos intracelulares, conforme descrito no item 3.2.6. Os
principais resultados encontram-se na Figura 4.3. Nota-se que h um
perodo varivel de incorporao da marca nos diferentes fragmentos
analisados. Apesar disto, pode-se dizer que 4 ou 5 tempos de residncia
so suficientes para que o estado estacionrio isotpico seja atingido,
pois a partir deste instante, todos os fragmentos parecem apresentar

67
um valor constante, at a amostra final, com quase 10 tempos de
residncia. Sendo assim, definiu-se como 5 o nmero de tempos de
residncia a ser utilizado neste tipo de ensaio. Alm disto, demonstra-se
que a amostragem na sada do reator uma boa alternativa
amostragem de todo o volume do reator, o que tornaria possvel, com
um cultivo apenas, atingir diferentes estados estacionrios isotpicos,
aumentando a capacidade de gerao de resultados. Neste caso, porm,
a medida da concentrao celular em termos de massa seca de clulas
ficaria comprometida, pois no seria possvel retirar um volume de meio
do reator suficiente para esta anlise. Nota-se ainda, na Figura 4.3, que
uma cintica de incorporao de primeira ordem pode ser utilizada para
aproximar o fenmeno de incorporao da marca, conforme indicado
para o fragmento Asp216. Utilizando-se cintica de primeira ordem,
calcula-se que a marcao em cada fragmento ter o valor de 99,4% do
valor em estado estacionrio isotpico, aps 5 tempos de residncia.
Finalmente, aproveitou-se a grande quantidade de dados de marcao
disponveis para cada fragmento, para calcular o erro da medida da
marcao. Os resultados so apresentados na Tabela 4.3 e refletem a
alta reprodutibilidade das medidas, pois os desvios relativos calculados
(a partir de no mnimo 6 medidas de marcao em estado estacionrio
isotpico para cada fragmento) so muito baixos, quase em todos os
casos menores que 5%.
A avaliao da reprodutibilidade das medidas de marcao,
conforme realizada utilizando-se os dados do experimento ANGO11,
apresentada na Tabela 4.3, mais apropriada do que a avaliao
realizada com os dados do experimentos MDSANGO, apresentada na
Tabela 4.2. Isto ocorre porque a metodologia sempre aplicada a
experimentos com substrato marcado, e portanto, os valores de
marcao sero quase sempre significativamente maiores que os valores
de marcao natural (1,1% em cada tomo de carbono), conforme
utilizado no experimento MDSANGO. O que ocorre que, de forma
anloga a qualquer determinao analtica, a impreciso da medida

68
0
10
20
30
40
50
0 2 4 6 8 10
Nmero de tempos de residncia
M
a
r
c
a

o

(
%
)
Ser132
Ala116
Ala99
Ala158
Asp115
Thr175
Glu143

0
20
40
60
80
100
120
0 2 4 6 8 10
Nmero de tempos de residncia
M
a
r
c
a

o

(
%
)
Leu158
Val144
Val127
Val186
Asp188
Asp216
Ile158
Thr146
Pro142
Lys156
Glu230
His327
Phe192
Glc331
primeira

0
2
4
6
8
10
0 2 4 6 8 10
Nmero de tempos de residncia
M
a
r
c
a

o

(
%
)
Ser175
Gly175
Gly144
Gly85
Val143
Phe143

Figura 4.3 Marcao nos fragmentos de metablitos intracelulares em funo do
nmero de tempos de residncia (ensaio ANGO11). Os dados so apresentados em trs
grficos apenas para facilitar a visualizao. No grfico do meio, uma curva
correspondente cintica de incorporao de primeira ordem apresentada para o
fragmento Asp216

69
Tabela 4.3 Mdias, desvios padro e desvios relativos, calculados
a partir dos dados de marcao do ensaio ANGO11
Fragmento
(a)
valor mdio desvio padro desvio relativo (%)
(b)
Ser175 3,1 0,6 17,9%
Ser132 33,8 0,5 1,5%
Gly175 5,9 0,3 5,5%
Gly144 6,2 0,3 4,9%
Gly85 3,7 0,1 3,9%
Ala116 36,0 0,3 0,7%
Ala99 36,0 0,2 0,6%
Ala158 38,5 0,5 1,3%
Leu158 106,1 0,7 0,6%
Val144 73,3 0,3 0,4%
Val143 6,9 0,3 4,0%
Val127 73,1 0,4 0,5%
Val186 74,9 0,8 1,1%
Asp188 57,1 0,3 0,5%
Asp115 12,0 0,3 2,9%
Asp216 64,4 0,4 0,6%
Ile158 93,7 0,4 0,4%
Thr175 17,8 0,8 4,3%
Thr146 54,5 1,0 1,9%
Pro142 85,5 0,4 0,5%
Lys156 117,2 0,3 0,2%
Glu143 39,9 0,6 1,6%
Glu230 100,1 0,8 0,8%
His327 57,1 1,7 3,0%
Phe192 90,6 2,9 3,2%
Phe143 3,0 0,1 1,9%
Glc331 91,0 1,7 1,8%

(a) para detalhes sobre os fragmentos, vide rodap da Tabela 4.5
(c)
mdia
padro desvio
relativo desvio =


aumenta para valores muito baixos a serem analisados. Em suma, para
cultivos contnuos, o erro da medida da marcao em cada fragmento
analisado ser aquele indicado na Tabela 4.3.
No caso de cultivos descontnuos, nos quais as clulas so
retiradas do reator em fase exponencial de crescimento, e no em
estado estacionrio, a situao diferente. Apesar de o crescimento
exponencial ser uma situao de crescimento balanceado, ela
diferente de um estado estacionrio. Para avaliar a validade de se
utilizar clulas em crescimento exponencial de um cultivo descontnuo
para aplicao da metodologia de determinao da marcao em
metablitos intracelulares, realizou-se o ensaio ANGO17 (Tabela 4.1).

70
Neste ensaio, dois cultivos nas mesmas condies foram realizados em
paralelo. Em um deles, as clulas foram retiradas num instante da fase
exponencial e no outro, duas horas mais tarde (Figura 4.4).

0,1
1
10
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
tempo (h)
O
D
6
0
0
9 h
11 h

Figura 4.4 Concentrao celular em funo do tempo (ensaio ANGO17). O instante
de retirada de clulas em cada cultivo, para anlise da marcao nos metablitos
intracelulares, est indicado pela seta correspondente.

Os resultados de marcao dos cultivos realizados no ensaio
ANGO17 encontram-se indicados na Figura 4.5. Os dados do cultivo
ANGO17b, no qual as clulas foram colhidas com 11 h de cultivo (5,4
geraes aps a inoculao), so apresentados em funo dos dados do
cultivo ANGO17a, no qual as clulas foram colhidas com 9 h de cultivo
(4,6 geraes aps a inoculao). Nota-se que os dados so muito
prximos entre si e que portanto pode-se aplicar a metodologia a clulas
retiradas em fase exponencial de cultivos descontnuos. SAUER et al
(1999) obtiveram resultado anlogo para Escherichia coli. Estes autores
verificaram que, durante a fase exponencial de um cultivo descontnuo,
as marcaes em metablitos intracelulares permaneciam constantes,
mesmo aps o incio da fase estacionria. Ao longo deste trabalho,
adotamos um mnimo de 4 geraes aps a inoculao para a retirada
de clulas.
Uma ltima e importante forma de se avaliar a reprodutibilidade
da metodologia de determinao da marcao nos metablitos

71
intracelulares de S. cerevisiae atravs da anlise de alguns dos dados
apresentados na Tabela 4.5, conforme discutido no item 4.3.2.

0
20
40
60
80
100
120
0 20 40 60 80 100 120 140
marcao 9h (%)
m
a
r
c
a

o

1
1
h

(
%
)

Figura 4.5 Dados de marcao em fragmentos de metablitos intracelulares. Os
dados do cultivo ANGO17b, no qual as clulas foram colhidas com 11 h de cultivo, so
apresentados em funo dos dados do cultivo ANGO17a, no qual as clulas foram
colhidas com 9 h de cultivo. Os pontos indicam as medidas experimentais, enquanto a
reta representa a situao em que os resultados de ambos os cultivos fossem
idnticos.


4.3. Represso por glicose na cepa referncia (GOMBERT et al, 2001)

Os resultados dos ensaios ANGO9 e ANGO11 permitem fazer uma
comparao entre clulas de S. cerevisiae crescendo exponencialmente
com velocidade especfica mxima (metabolismo respiratrio-
fermentativo) e clulas crescendo numa velocidade especfica bem
abaixo da mxima num quimiostato (metabolismo respiratrio).

4.3.1. Velocidades especficas e fatores de converso

Os principais resultados dos ensaios ANGO9 e ANGO11, em
termos de medidas realizadas fora do ambiente celular, so
apresentados na Tabela 4.4.


72
Tabela 4.4 Velocidades especficas de crescimento e fatores de
converso para a cepa referncia CEN.PK113-7D*
Ensaio ANGO9 ANGO11
Forma de operao
do reator
descontnua contnua
Metabolismo respiratrio-
fermentativo
respiratrio
max / D (h
-1
) 0,37 0,11
Yx/s (g/g) 0,105 0,52
Yacetato/s (mol/mol) 0,065 ~0
Yglicerol/s (mol/mol) 0,055 ~0
Yetanol/s (mol/mol) 1,56 ~0
*os fatores de converso de glicose a piruvato e de glicose a succinato foram sempre
menores que 0,01 mol/mol. Os parmetros max e Yx/s foram determinados nos
reatores de 4 L. Os valores da velocidade especfica mxima de crescimento calculados
a partir dos dados de densidade ptica (absorbncia) foram iguais nos ensaios
realizados nos reatores de 4 L e nos reatores de 200 mL. Os fatores de converso de
glicose aos metablitos medidos tambm foram similares nos dois tipos de reator
utilizados.

Observa-se que no cultivo contnuo, toda a glicose utilizada para
formao de biomassa e CO2, enquanto que no cultivo descontnuo a
converso a biomassa cerca de cinco vezes menor e a maior parte da
glicose consumida pelas clulas convertida a etanol. Os valores
obtidos esto de acordo com dados de literatura (VERDUYN, 1991).

4.3.2. Identificao de redes metablicas: inspeo qualitativa dos dados de
marcao

Previamente utilizao dos dados de marcao nos metablitos
intracelulares de S. cerevisiae para o clculo de fluxos metablicos,
interessante inspecionar estes dados de forma qualitativa. Esta tarefa
denominada Inspeo Qualitativa dos Dados de Marcao (IQDM) e
consiste basicamente em utilizar os dados de marcao medidos, para
verificar a atividade de algumas vias que fazem parte do metabolismo
central de S. cerevisiae. Para isto, deve-se comparar o que se conhece
sobre o funcionamento destas vias, que consiste basicamente do que
est disponvel na literatura, com os dados de marcao obtidos,
observando se h coerncia entre ambos. Levando-se em conta os
fragmentos de aminocidos e glicose intracelular analisados neste

73
TABELA 4.4.1 Pequeno guia para IQDM*
Funo
metablica
Fragmentos
analisados
t. de C
precursores
Como olhar para os fragmentos?
Via PP Glc331
Ser132
Ala116(99)
Glc1-6
Ser2-3
Ala2-3
SFL Glc1-6 fluxo via PP
SFL Ser2-3 fluxo via PP
SFL Ala2-3 fluxo via PP
Treonina
Aldolase
(TA)
Ser175
Gly175(144)
Thr175
Ser1-2
Gly1-2
Thr1-2
Se MAR
(b)
Gly1-2 tem valor intermedirio
entre Ser1-2 e Thr1-2 atividade TA
Via TCA Asp115 Oaa2 MAR
(b)
Oaa2 ciclo TCA
Enzima
Mlica
(MAE) 1
(a)

Val144(127)2
Ala116(99)
Pyr2-3(mit)
Pyr2-3
Se MAR
(b)
Pyr2-3(mit) via Val maior que
MAR
(b)
Pyr2-3 via Ala fluxo MAE
Enzima
Mlica
(MAE) 2
(a)

Val143
Phe143
Pyr1-2(mit)
Pep1-2

Se MAR
(b)
Pyr1-2(mit) maior que MAR
(b)

Pep1-2 fluxo MAE

TABELA 4.4.1 (continuao)
Funo
Metablica
Observaes A IQDM
conclusiva?
Melhores exemplos
(ver item 4.4.2)
Via PP As 3 observaes devem
ocorrer simultaneamente,
pois so interdependentes.
Sim. snf1
Treonina
Aldolase
(TA)
A marca em Thr1-2 pode
ser passada at Ser1-2,
devido reversibilidade de
SHM
(c)
.
Sim, se as
marcaes no
estiverem prximas
marcao natural.
reg1
grr1
Via TCA Thr175 deve seguir a
tendncia de Asp115.
Sim.
Enzima
Mlica
(MAE) 1
(a)

Leu158 deve seguir a
tendncia de Val144(127).
Provavelmente. No
se sabe com certeza
se a sntese de Ala
citosslica.
reg1
Enzima
Mlica
(MAE) 2
(a)

Pep considerado um
metablito citosslico.
Provavelmente. Se as
marcaes so
iguais, no h fluxo
pela MAE.
snf4
(no h fluxo pela MAE)
* Inspeo Qualitativa dos Dados de Marcao
(a) A princpio, existe a possibilidade de as enzimas fosfoenolpiruvato carboxiquinase
e enzima mlica estarem ambas ativas ao mesmo tempo, de modo que no seja
possvel observar esta ocorrncia atravs dos dados de marcao. Mede-se a
marcao em OAAcyt (via Asp e Thr), PEP (via Phe), PYRcyt (via Ala?) e PYRmit (via
Val). Se ambas as enzimas estiverem ativas, as seguintes transies de tomos de
C ocorrero:
PEP1,2,3 PYRcyt1,2,3 (via piruvato quinase)
PYRcyt1,2,3 PYRmit1,2,3 (via transportador)
OAAcyt1,2,3 PEP1,2,3 (via PEP carboxiquinase)
OAAmit1,2,3 OAAcyt1,2,3 (via transporte)
OAAcyt1,2,3 OAAmit1,2,3 (via transporte)
OAAmit1,2,3 MAL1,2,3(via reversibilidade da enzima malato desidrogenase)
MAL1,2,3 PYRmit1,2,3 (via enzima mlica)
Estas transies indicam que possvel que PEP carboxiquinase e enzima mlica
estejam ativas ao mesmo tempo e que as marcaes nos tomos C1 e C2 dos
fragmentos indicados sejam todas iguais.
(b) Marcao (ver item 3.2.6.3 para detalhes)
(c) Serina Hidroximetil Transferase

74
trabalho, h basicamente quatro funes metablicas centrais, sobre as
quais possvel obter informaes: o ciclo TCA, a via PP, a enzima
treonina aldolase e a enzima mlica. Os detalhes da IQDM so
apresentados na Tabela 4.4.1.
O exerccio da IQDM importante para a definio exata das
reaes que fazem parte da rede metablica, o que auxiliar na
formulao do modelo estequiomtrico que ser subseqentemente
utilizado para o clculo de fluxos.
Os resultados de marcao nos metablitos intracelulares de S.
cerevisiae para os ensaios ANGO9 e ANGO11 so apresentados na
Tabela 4.5. possvel observar, atravs dos dados apresentados na
Tabela 4.5, que um nmero considervel de fragmentos de
aminocidos, alm da glicose intracelular, pode ser analisado pela
tcnica empregada. Estes dados de marcao nos aminocidos refletem
as marcaes nos precursores das vias metablicas centrais, pois so
bem conhecidas as vias de biossntese dos aminocidos a partir de seus
respectivos precursores (ZUBAY, 1988). sabido, por exemplo, que
alanina sintetizada a partir de piruvato por uma nica reao
catalisada pela enzima alanina aminotransferase. Nesta reao, os
tomos de carbono 1, 2 e 3 do piruvato so convertidos nos tomos 1, 2
e 3 da alanina, respectivamente. De maneira anloga, possvel saber
como os tomos de outros precursores das vias metablicas centrais
so incorporados nos aminocidos detectados pela anlise empregada,
conforme indicado na Tabela 4.5, mesmo que haja mais que uma
reao catalisando a sntese do aminocido.
Conforme mencionado no item 4.2, alguns dos dados da Tabela
4.5 podem ser utilizados para verificar a acurcia das medidas
experimentais. sabido que os aminocidos alanina e valina so ambos
derivados do piruvato. De acordo com os valores de marcao medidos e
a correspondncia de tomos de carbono, verifica-se que todos os dados
de marcao para os fragmentos destes dois aminocidos esto de
acordo entre si. Por exemplo, a marcao no fragmento Ala116 (ou

75
Tabela 4.5 Dados de marcao nos metablitos intracelulares de
S. cerevi si ae (ensaios ANGO9 e ANGO11)
marcao no
fragmento (%)
m
e
t
a
b

l
i
t
o

peso
molecular do
isotopmero
no marcado
(a)

tomos de C
no fragmento
medido
precursor
reportado
(b)

Correspondn-
cia de tomos de
C reportada
(b)
ANGO
9
descon-
tnuo

ANGO
11
con-
tnuo

Glc 331

1,2,3,4,5,6 G6P 1,2,3,4,5,6 98,2 91,0

Ser 175
#

132
#

1,2
2,3
1,2
2,3
2,3
44,3
3,1
33,8
Gly 175
#

144
*

85
*

1,2
1,2
2
3-PG
1,2
1,2
2
2,2
2,4
1,3
5,9
6,2
3,7
Ala 116
#

99
*

158
*

2,3
2,3
1,2,3
2,3
2,3
1,2,3
45,2
45,1
46,8
36,0
36,0
38,5
Val 144
#

143
*

127
*

186
*

2,3,4,5
1,2
2,3,4,5
1,2,3,4,5
PYR
2,2,3,3
1,2
2,2,3,3
1,2,2,3,3
90,6
6,9
90,2
93,0
73,3
6,9
73,1
74,9
Leu 158
#
2,3,4,5,6 PYR + AcCoA 2,2,3,3 + 2 130,1 106,1
Asp 188
#

115
*

216
*

2,3,4
2
1,2,3,4
2,3,4
2
1,2,3,4
49,9
2,0
51,7
57,1
12,0
64,4
Thr 175
#

146
#

1,2
2,3,4
OAA

1,2
2,3,4
2,9
47,6
17,8
54,5
Ile 158
#
2,3,4,5,6 OAA + PYR 2,3,4 + 2,3 95,1 93,7
Glu 143
*

230
*

1,2
1,2,3,4,5
1,2
1,2,3,4,5
43,9
95,2
39,9
100,1
Pro 142
#
2,3,4,5
AKG
2,3,4,5 87,1 85,5
Lys 156
#
2,3,4,5,6 AKG + AcCOA 2,3,4,5 + 2 125,7 117,2
PEP 1,2 2,5 3,0 Phe 143
*

192
#

1,2
2,3,4,5,6,7,8,9
E4P + PEP 1,2,3,4 + 2,2,3,3 111,9 90,6
(a) os ndices superiores indicam o tipo de agente utilizado na derivatizao: GPA, #
ECF, * DMFDMA. Os detalhes esto descritos na seo Mtodos.
(b) precursores so sempre molculas que fazem parte das chamadas vias
metablicas centrais: a via EMP, a via PP, o ciclo TCA e reaes anaplerticas
(ZUBAY, 1988).

Ala99) corresponde metade da marcao no fragmento Val144 (ou
Val127) em ambos os cultivos. Analogamente, a marcao no fragmento
Asp188 pode ser comparada quela no fragmento Thr146, pois ambos
fragmentos derivam dos mesmos tomos de carbono do oxaloacetato.
Neste caso, h uma pequena diferena entre os valores, se forem
considerados os desvios padro indicados na Tabela 4.3. Esta diferena,
como ser discutido mais adiante no texto, pode ocorrer devido
compartimentao do oxaloacetato (existncia deste metablito em mais
de um compartimento celular).

76
A seguir, uma anlise de diferentes aspectos do metabolismo de
S. cerevisiae ser apresentada, baseando-se nos resultados de
marcao apresentados na Tabela 4.5.

4.3.2.1. Biossntese de glicina

No caso de glicina, imagina-se que o precursor de sua biossntese
a serina, que por sua vez sintetizada a partir do 3-fosfoglicerato
(ZUBAY, 1988), sendo este portanto o precursor drenado a partir das
vias metablicas centrais (Figura 4.6). No entanto, os resultados do
quimiostato indicam que a marcao no fragmento Gly175 (ou Gly144)
maior que o valor obtido para o fragmento Ser175 (Tabela 4.5). Isto
um forte indcio de que h outra rota de biossntese de glicina, alm
daquela a partir de 3-fosfoglicerato, rota esta que contribui para o
aumento na marcao deste aminocido. Em S. cerevisiae, a inativao
de trs genes necessria para que haja auxotrofia em relao a glicina
(McNEIL et al, 1994). Dois destes genes, denominados SHM1 e SHM2,
codificam para a enzima serina hidroximetiltransferase mitocondrial e
citosslica, respectivamente. O terceiro gene, denominado GLY1, no
tinha sua funo elucidada, at que recentemente dois estudos
paralelos demonstraram que o gene GLY1 codifica para a enzima
treonina aldolase, que catalisa a quebra de treonina em glicina e
acetaldedo (LIU et al, 1997; MONSCHAU et al, 1997). Portanto, existem
duas vias de sntese de glicina em clulas de S. cerevisiae crescendo em
glicose: uma, a partir do 3-fosfoglicerato, e outra, a partir do
oxaloacetato via treonina. Quando S. cerevisiae cresce em substratos
no fermentveis, como etanol e acetato, uma terceira via a principal
responsvel pela sntese de glicina. Neste caso, glioxilato convertido
em glicina atravs de uma reao catalisada pela enzima alanina-
glioxilato-aminotransferase (MONSCHAU et al, 1997), cujo gene ainda
no foi clonado. Como esta via no opera sob crescimento em glicose, a
anlise feita aqui indica atividade da enzima treonina aldolase e

77
portanto esta reao foi includa no modelo matemtico utilizado para o
clculo de fluxos (ver Apndice).
O metabolismo das coenzimas de folato outro ponto de interesse
a ser dicutido. Quando os clculos de fluxos foram realizados pela
primeira vez para o quimiostato, a reao correspondente
descarboxilao da glicina foi includa no modelo. Os clculos levaram
ao valor zero para o fluxo por esta reao. Este resultado est de acordo
com dados de literatura, os quais indicam que a gerao de unidades de
C
1
O
O
C
H
2
C
H
2
3
NH
3
+
O H C
1
O
O
C H
2
2
NH
3
+
Serina Glicina
serina-
hidroximetil-transferase
THF Metileno-
THF
C
1
O
O
C
H
2
C
H
3
NH
3
+
C H
3 4
OH
C
1
O
O
C2
O
H
treonina
aldolase
alanina-glioxilato-
aminotranferase
Treoni na
Glioxilato
Piruvato Alanina
Acetaldedo

Figura 4.6 As trs possveis vias de biossntese de glicina em S. cerevisiae.


um carbono ocorre principalmente na reao catalisada pela enzima
serina hidroximetiltransferase, e que a quebra da glicina pelo sistema
GCV (Glycine Cleavage System) somente ocorre quando o primeiro
est inativo (McNEIL et al, 1996). Desta forma, a reao foi excluda do
modelo (conforme apresentado no Apndice), principalmente por causa
dos baixos valores de marcao obtidos para os fragmentos de glicina
no cultivo descontnuo (Tabela 4.5), valores estes que correspondem
marcao natural do carbono (1,1% em
13
C) e que poderiam gerar
complicaes numricas na rotina de estimativa de fluxos em torno
deste ponto do metabolismo.

78
4.3.2.2. Compartimentao do piruvato

Os aminocidos que possuem tomos de carbono oriundos do
piruvato so valina, alanina, isoleucina e leucina (estes dois ltimos
tambm possuem tomos de carbono oriundos de outros precursores).
Sabe-se que valina sintetizada a partir de piruvato mitocondrial, j
que a primeira reao da via biossinttica de valina, catalisada pela
enzima acetolactato sintase (Ilv2), ocorre na mitocndria (FALCO et al,
1985). No caso da alanina, sintetizada a partir de piruvato por uma
nica reao catalisada pela enzima alanina aminotransferase, no se
pode afirmar em que compartimento ocorre a reao. Segundo as bases
de dados (por exemplo: YPD database, www.proteome.com), existem
duas alanina aminotransferases putativas, uma citosslica (YDR111C) e
outra mitocondrial (YLR089C). Neste trabalho, assumiu-se que a
biossntese de alanina a partir de piruvato citosslica, pois este o
caso da maioria dos aminocidos sintetizados a partir de uma simples
reao de transaminao. No caso da isoleucina, a primeira reao de
sua via biossinttica catalisada pela enzima Ilv2, a mesma enzima da
primeira reao da via biossinttica da valina. Portanto, o piruvato
desviado para biossntese de leucina mitocondrial. A biossntese de
leucina ocorre a partir do -cetoisovalerato, um intermedirio da via
biossinttica da valina. Portanto, o piruvato drenado para a sntese de
leucina tambm mitocondrial.
Devido aos diferentes compartimentos nos quais os aminocidos
da famlia do piruvato so sintetizados (conforme discutido no pargrafo
acima), decidiu-se dividir o pool de piruvato celular em um pool
citosslico e outro mitocondrial no modelo estequiomtrico utilizado
para o clculo de fluxos metablicos. Tambm foi includa uma reao
de transporte de piruvato do citossol para a mitocndria (Apndice).






79
4.3.2.3. Compartimentaao da acetil coenzima A

As marcaes nos aminocidos derivados de mais de um
precursor, como por exemplo leucina, isoleucina, lisina e fenilalanina,
tambm podem ser utilizadas para obter informaes interessantes
sobre o metabolismo. Subtraindo-se a marcao no fragmento Val127
(ou Val144) da marcao no fragmento Leu158, obtm-se a marcao
no tomo C2 da acetil coenzima A (39,9% no cultivo descontnuo e
33,0% no cultivo contnuo). Estes valores representam a marcao no
tomo C2 da acetil coenzima A na mitocndria, pois a reao de
incorporao da acetil coenzima A na via biossinttica da leucina,
catalisada pela enzima -isopropilmalato sintase (Leu4), ocorre na
mitocndria (HAMPSEY et al, 1983; RYAN et al, 1973). Subtraindo-se a
marcao no fragmento Pro142 da marcao no fragmento Lys156,
tambm possvel calcular a marcao no tomo C2 da acetil coenzima
A (38,6% no cultivo descontnuo e 31,7% no cultivo contnuo). Neste
caso, os valores representam provavelmente a marcao no tomo C2
da acetil coenzima A no ncleo celular, pois a reao de incorporao
da acetil coenzima A na via biossinttica da lisina, catalisada pelas
duas formas da enzima homocitrato sintase (Lys20 e Lys21), ocorre no
ncleo (CHEN et al, 1997). Apesar disto, para no incluir um terceiro
compartimento no modelo estequiomtrico utilizado para clculo de
fluxos metablicos (Apndice), esta acetil coenzima A foi includa como
citosslica, para diferenci-la da acetil coenzima A mitocondrial. No
caso dos dados calculados acima, no h diferena significativa entre as
marcaes na forma mitocondrial e na forma no mitocondrial da acetil
coenzima A. No entanto, a incluso desta compartimentao no modelo
estequiomtrico importante, pois pode levar a resultados
interessantes, como no caso da identificao de uma via de degradao
de cido fenoxiactico em Penicillium chrysogenum (CHRISTENSEN;
NIELSEN, 2000).


80
4.3.2.4. Enzima mlica

Com relao marcao na fenilalanina, a qual sintetizada a
partir de eritrose-4-fosfato e fosfoenolpiruvato, observa-se que o
fragmento Phe143, que derivado dos tomos C1 e C2 do
fosfoenolpiruvato, tem uma marcao menor que aquela no fragmento
Val143, o qual derivado dos tomos C1 e C2 do piruvato (Tabela 4.5),
tanto no cultivo contnuo como no descontnuo. Esta observao d
indcios para a atividade de uma segunda via de formao de piruvato,
alm daquela catalisada pela enzima piruvato quinase. BOLES et al
(1998) demonstraram que, apesar de no se conhecer exatamente sua
funo, a enzima mlica (Mae1) ativa em clulas de S. cerevisiae
crescendo em glicose. Esta enzima catalisa a converso de malato em
piruvato na mitocndria, e poderia portanto explicar as diferenas
observadas nas marcaes no piruvato e no fosfoenolpiruvato, como
indicado acima. Sendo assim, a reao catalisada pela enzima mlica
foi includa no modelo para clculo de fluxos metablicos (Apndice).

4.3.2.5. Ciclo dos cidos tricarboxlicos (ciclo TCA)

Comparando-se os dados de marcao do cultivo descontnuo
com os correspondentes dados do cultivo contnuo, observam-se vrias
diferenas. No primeiro caso, fica evidente que o metabolismo opera na
forma respiratria-fermentativa e que o ciclo TCA no opera como um
ciclo propriamente dito, mas sob a forma de dois ramos. Isto pode ser
deduzido a partir da marcao no tomo C2 do aspartato, que igual a
2,0% (Tabela 4.5), indicando que este tomo de C no pode ter origem
no -cetoglutarato. Os dados indicam que este tomo deve ser gerado a
partir do piruvato atravs da reao anaplertica catalisada pela enzima
piruvato carboxilase, a qual citosslica (HAARASILTA; TASKINEN,
1977; WALKER et al, 1991). Considerando-se esta reao anaplertica e
o ciclo TCA, h no metabolismo de S. cerevisiae somente duas

81
possibilidades para a origem do tomo C2 do aspartato (que reflete o
tomo C2 do oxaloacetato): no tomo C2 do piruvato ou nos tomos C3
e C4 do -cetoglutarato (neste caso h duas opes devido simetria de
alguns intermedirios do ciclo TCA, como o succinato). Como as
marcaes nos fragmentos de prolina e glutamato (derivados do -
cetoglutarato) so muito mais altas que a marcao no aspartato,
conlui-se que o C2 do oxaloacetato somente pode vir do piruvato, que
tem sua marcao refletida nos fragmentos de valina, que por sua vez
apresenta marcaes baixas em seus tomos C1 e C2. Ao contrrio do
cultivo descontnuo, as clulas no quimiostato crescem com
metabolismo puramente respiratrio. Neste caso, o tomo C2 do
aspartato apresenta uma marcao de 12,0%, indicando que o mesmo
, ao menos em parte, gerado a partir do -cetoglutarato (devido aos
altos valores de marcao nos fragmentos de prolina e glutamato e aos
baixos valores de marcao nos fragmentos de valina).

4.3.2.6. Via das pentoses fosfato (via PP)

Outra observao interessante que os aminocidos que tm sua
origem em precursores como o 3-fosfoglicerato e o piruvato, da via EMP,
apresentam marcaes mais baixas no quimiostato que no cultivo
descontnuo (Tabela 4.5). Isto devido ao fato de o fluxo pela via PP ser
mais alto no primeiro caso. Um alto fluxo por esta via requerido
quando o fator de converso de glicose a biomassa alto, em funo da
maior necessidade de NADPH para reaes de biossntese. Um alto fluxo
pela via PP provoca uma diminuio nos valores de marcao nos
intermedirios da via EMP, pois a descarboxilao do 6-fosfogluconato
que ocorre na reao catalisada pela enzima 6-fosfogluconato
desidrogenase (uma das primeiras reaes da via PP) remove
justamente o tomo de C que carrega a marca introduzida no meio de
cultura sob a forma de [1-
13
C]glicose. Alm disto, a marcao no
fragmento de glicose-6-fosfato mais alta no cultivo descontnuo do que

82
no quimiostato, devido ao fato de o fluxo pela via PP ser menor no
primeiro caso, o que faz que menos frutose-6-fosfato seja convertida a
glicose-6-fosfato pela reversibilidade da reao catalisada pela enzima
glicose-6-fosfato isomerase, o que finalmente ocasiona uma menor
diluio da marca na glicose-6-fosfato.

4.3.3. Anlise de fluxos metablicos

A anlise acima, denominada identificao de redes metablicas,
foi realizada atravs da inspeo das marcaes medidas nos
fragmentos de metablitos intracelulares de S. cerevisiae. Esta anlise
tem um carter qualitativo ou, na melhor das hipteses, semi-
quantitativo. No entanto, se estes dados de marcao forem combinados
com um modelo matemtico adequado, torna-se possvel quantificar os
fluxos pelo metabolismo central de S. cerevisiae. Desta forma, pode-se
comparar de maneira quantitativa clulas crescendo num quimiostato a
0,1 h
-1
com clulas crescendo exponencialmente num cultivo
descontnuo com max = 0,37 h
-1
. O processo de estimar fluxos
caracteriza-se pela busca do modelo estequiomtrico que descreve de
forma mais adequada o metabolismo em estudo, num processo de
tentativa e erro com base em conhecimento bioqumico e hipteses
adequadas (estas so necessrias para definir detalhes bioqumicos no
conhecidos e para evitar complicaes numricas nos clculos). O
modelo que se mostrou mais adequado o apresentado no Apndice, o
qual pode ser utilizado para ambas as condies de cultivo estudadas,
conforme indicado no item 4.3.1.
Os fluxos estimados para as duas condies de cultivo so
apresentados na Figura 4.7. Na Tabela 4.6, os valores das marcaes
medidas so apresentados juntamente com os valores calculados pela
rotina numrica utilizada para a estimativa de fluxos. A comparao
entre estes dois conjuntos de valores d uma indicao da preciso dos
clculos realizados. possvel observar que quase todas as marcaes

83
calculadas, utilizando-se o modelo matemtico apresentado no
Apndice, so iguais s marcaes medidas, se for considerado um erro
absoluto de uma unidade na medida da marcao. As reversibilidades
so indicadas na Figura 4.7 em termos dos fluxos de intercmbio
normalizados:

lquido interc
interc
interc
v v
v
v
+
=
] 1 , 0 [
[4.1]

onde Vinterc o fluxo de intercmbio (fluxo 2 na Figura 4.8) e Vlquido o
fluxo lquido (fluxo 1 na Figura 4.8).
As reversibilidades das reaes catalisadas pelas transaldolases e
transcetolases da via PP no esto indicadas na Figura 4.7, pois o
nmero de medidas de marcao em fragmentos de aminocidos
derivados de metablitos desta via no permite uma estimativa precisa
destes valores. No entanto, os valores dos fluxos lquidos por estas
reaes podem ser estimados com relativa confiana (os valores obtidos
no sofreram alterao quando diferentes clculos foram realizados).
Uma primeira observao que pode ser feita a partir dos dados da
Figura 4.7 com relao ao fluxo pela via PP. Nota-se que o valor de
44,2 para o quimiostato bem maior que o valor de 16,2 obtido no
cultivo descontnuo (ambos valores so relativos a um consumo de 100
unidades arbitrrias de glicose). Conforme mencionado acima, isto est
de acordo com a maior necessidade de NADPH para reaes anablicas
no caso do cultivo contnuo, no qual o fator de converso de glicose a
clulas maior (Yx/s = 0,5 g/g). No cultivo descontnuo, apesar de o
contedo protico das clulas ser maior (Tabela 3.3), o que exige maior
quantidade de NADPH para a sntese de aminocidos, o catabolismo de
glicose gera principalmente etanol e o fator de converso de glicose a
clulas ficou em torno de 0,1 g/g. No entanto, se a velocidade especfica
de consumo de glicose (15,9 mmol/g/h no cultivo descontnuo e 1,17
mmol/g/h no quimiostato) for multiplicada pelo correspondente fluxo
pela via PP (que um dado relativo), conforme indicado acima,

84
Glicose
G6P
F6P
via PP
G3P
Biomassa
PYR
Biomassa
Glicerol
PEP
ACA
OAA Thr
Ser Gly
AcCoA ACE
Etanol
0.5
1.8
2.8
22.2
0(1)
0.8(0)
0.9
3.7
1.4
5.4
1.4
4.7
0.9(1)
2.9(0)
0.9
4.4
0.9
3.6
1.5
5.4
168.1
41.7
1.2
5.0
177.6
122.1
179.9
127.1
91.0
60.3
81.0(0.93)
33.6(0.97)
100
100
5.3
0
0.2
0.8
10.2
42.4
7.0
42.3
4.7
12.1
10.0
26.7
16.2
44.2
6.6
27.6
1.1
4.0
157.9
0
4.2
22.8
Acetato
3.3
0
OAA
MAL
2-KG
AcCoA
Biomassa
FUM
mi tocndria
2.5
10.8
0.4
43.5
0
49.1
0(1)
49.1(0.83)
0.5
18.4
4.7
36.2
2.5
59.9
2.8
19.5
1.7
7.0
0.7
2.8
ciclo TCA
1.9
48.9
Biomassa
3.2
12.4
PYR

Figura 4.7 Fluxos no metabolismo central de S. cerevisiae. Os valores em negrito
correspondem ao cultivo descontnuo e os valores em itlico correspondem ao cultivo
contnuo. Reversibilidades so indicadas pelos dados em parnteses, sob a forma de
fluxos de intercmbio normalizados (equao 4.1).


85
metablito
A
metablito
B
fluxo de intercmbio (2) = fluxo direto - fluxo lquido
fluxo lquido (1) = fluxo direto - fluxo reverso
fluxo direto
fluxo reverso
1 2
Reao reversvel de converso do metablito A em B

Figura 4.8 Definio de fluxo de intercmbio e fluxo lquido numa reao
reversvel.


Tabela 4.6 Marcaes medidas e marcaes calculadas nos
cultivos contnuo e descontnuo com a cepa referncia
CEN.PK113-7D
contnuo descontnuo fragmento
(a)

calculado medido calculado medido
Glc331 91,1 91,0 98,5 98,2
Gly175 6,2 5,9 2,9 2,2
Gly144 6,2 6,2 2,9 2,4
Gly85 3,2 3,7 1,4 1,3
Ser175 3,5 3,1 2,9 2,3
Ser132 34,4 33,8 44,3 44,3
Ala116 34,4 36,0 43,9 45,2
Ala99 34,4 36,0 43,9 45,1
Ala158 36,6 38,5 46,2 46,8
Leu158 105,1 106,1 128,4 130,1
Val144 72,7 73,3 87,9 90,6
Val143 7,7 6,9 5,6 6,9
Val127 72,7 73,1 87,9 90,2
Val186 76,2 74,9 90,2 93,0
Asp188 58,9 57,1 53,2 49,9
Asp115 10,3 12,0 3,3 2,0
Asp216 65,4 64,4 55,4 51,7
Ile158 95,2 93,7 97,1 95,1
Glu143 40,2 39,9 42,7 43,9
Glu230 99,6 100,1 96,0 95,2
Pro142 85,2 85,5 87,9 87,1
Lys156 118,1 117,2 128,4 125,7
Phe192 91,8 90,6 110,3 111,9
Phe143 3,5 3,0 3,0 2,5
(a)
para detalhes sobre os fragmentos, vide rodap da Tabela 4.5. Os fragmentos de
treonina no foram includos nos clculos.


86
possvel observar que o fluxo pela via PP, em termos absolutos, na
realidade maior no cultivo descontnuo (2,57 mmol/g/h) do que no
quimiostato (0,51 mol/g/h). Isto significa que as clulas consomem
glicose com maior velocidade no cultivo descontnuo em relao ao
contnuo. Isto ocorre devido a um maior fluxo global pelas vias
glicolticas em clulas com metabolismo respiratrio-fermentativo em
relao a clulas com metabolismo respiratrio.
Poucos valores podem ser encontrados na literatura para o fluxo
pela via PP em S. cerevisiae. GANCEDO; LAGUNAS (1973) reportam que
a via PP responde por apenas 2,5% do catabolismo de glicose em clulas
crescendo em glicose e amnia. Este valor foi obtido a partir de medidas
de radioatividade no CO2 produzido por clulas crescendo em frascos
agitados, em meio contendo glicose marcada com
14
C. Devido
reversibilidade da reao catalisada pela enzima glicose-6-fosfato
isomerase, este mtodo tende a subestimar o valor do fluxo pela via PP.
A quantidade de NADPH requerida para formao de biomassa foi
estimada em 831 mmol (BRUINENBERG et al, 1983) ou 931 mmol
(OURA, 1983) para 100 g de massa seca de clulas. Utilizando-se estes
valores, possvel fazer uma estimativa do fluxo pela via PP,
imaginando-se que esta a nica via de gerao de NADPH. Para um
fator de converso de glicose a clulas de 0,5 g/g, para cada 100 mmol
de glicose consumidos, 9 g de massa seca de clulas so formados e
74,8 mmol ou 83,8 mmol de NADPH so requeridos. Como cada
molcula de glicose-6-fosfato que entra na via PP gera duas molculas
de NADPH, um fluxo de 37,4 ou 41,9 mmol por 100 mmol de glicose
pode ser calculado para a via PP, valores que esto muito prximos aos
44,2 estimados neste trabalho. Aplicando-se o mesmo raciocnio ao
cultivo descontnuo, com um fator de converso de glicose a clulas de
0,1 g/g, o fluxo calculado para a via PP fica entre 7,5 e 8,4. Neste caso,
o valor estimado pela metodologia empregada neste trabalho maior
(16,2).

87
importante notar que a anlise feita neste trabalho baseada
em dois pontos principais. Primeiro, no fato de que possvel medir a
marcao na glicose-6-fosfato com alto grau de confiabilidade. Segundo,
no fato de que a reversibilidade da reao catalisada pela enzima
glicose-6-fosfato isomerase foi includa nos clculos.
Com relao ao ciclo TCA, observa-se que o mesmo opera de
forma cclica em clulas retiradas do quimiostato, e na forma de dois
ramos em clulas retiradas do cultivo descontnuo, um ramo que leva a
-cetoglutarato e outro que leva a fumarato. No foi encontrada
nenhuma referncia anterior na literatura a esta observao in vivo. O
ponto exato de interrupo do ciclo, localizado entre -cetoglutarato e
fumarato, no pode ser determinado pela metodologia empregada neste
trabalho, pois no h nenhuma medida da marcao em fragmentos de
succinato e/ou succinil coenzima A e portanto estes metablitos no
foram includos no modelo. Os dados da Figura 4.7 mostram que o
fluxo que leva do -cetoglutarato ao fumarato zero em clulas com
metabolismo respiratrio-fermentativo e que o fluxo lquido que leva de
fumarato a oxaloacetato tambm zero, apesar de haver um fluxo de
intercmbio neste caso. A compartimentao do oxaloacetato, conforme
consta do modelo apresentado no Apndice, foi importante para que as
marcaes calculadas pudessem ser ajustadas s marcaes medidas
(Tabela 4.6), assim como a incluso das reaes catalisadas pela enzima
piruvato carboxilase e pela enzima mlica em diferentes
compartimentos.
Conforme mencionado no item anterior, a incluso da enzima
mlica no modelo estequiomtrico foi a nica forma de compensar a
diferena entre a marcao no fosfoenolpiruvato e no piruvato. Apesar
de medidas de atividade enzimtica e Northern blot indicarem que o
fluxo pela enzima mlica provavelmente maior num cultivo
descontnuo velocidade especfica de crescimento mxima em relao
a um quimiostato a 0,1 h
-1
(BOLES et al, 1998), os resultados
apresentados na Figura 4.7 indicam o inverso, ou seja, um fluxo maior

88
na condio de quimiostato. importante ter em mente que anlises do
tipo Northern blot refletem apenas a concentrao dos mRNAs, e no
a atividade da enzima. Por outro lado, medidas de atividade enzimtica
no extrato celular (in vitro) no refletem necessariamente o que ocorre in
vivo. No entanto, as reais causas das diferenas observadas entre os
resultados apresentados por BOLES et al (1998) e aqueles obtidos neste
trabalho, assim como o prprio papel da enzima mlica no crescimento
de S. cerevisiae em glicose, ainda no foram esclarecidos.
A formao de glicina por duas diferentes vias, pela enzima
hidroximetiltransferase (Shm1/2) e pela enzima treonina aldolase
(Gly1), foi includa no modelo. Os resultados apresentados na Figura
4.7 indicam que h uma maior contribuio da enzima Shm1/2 para a
sntese de glicina em relao contribuio da enzima Gly1. No
entanto, resultados de literatura indicam que o crescimento de S.
cerevisiae reduzido de forma mais dramtica quando a expresso do
gene GLY1 anulada, do que quando a expresso de ambos os genes
SHM1 e SHM2 anulada (McNEIL et al, 1994).



89
4.4. Represso por glicose em diferentes mutantes

Aps a anlise realizada na cepa referncia CEN.PK113-7D,
passou-se investigao do metabolismo central em diferentes
mutantes desta cepa. Cada mutante continha uma interrupo num
gene codificador de uma protena envolvida na cascata de represso por
glicose, conforme apresentado na Tabela 3.1 (somente o mutante
mig1mig2 continha interrupes em dois genes). Desta forma, torna-se
possvel verificar o efeito da ausncia de cada uma destas protenas na
atividade de algumas vias metablicas e na distribuio de fluxos pelo
metabolismo central de S. cerevisiae.

4.4.1. Velocidades especficas e fatores de converso

As velocidades especficas mximas ( max) dos mutantes, obtidas
durante a fase exponencial de cultivos descontnuos, so apresentadas
na Figura 4.9.

0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4

(
1
/
h
)
R
S
m
i
g
1
m
i
g
1
m
i
g
2
s
n
f
1
s
n
f
4
h
x
k
2
h
a
p
4
g
r
r
1
r
e
g
1

Figura 4.9 Velocidades especficas mximas de crescimento de diferentes
mutantes de S. cerevisiae. A primeira coluna corresponde cepa referncia.

90
Os dados apresentados nas Figuras 4.9 e 4.10, alm dos dados
da Tabela 4.7, correspondem aos seguintes ensaios (conforme Tabela
4.1): ANGO9 (RS), ANGO13 (mig1), ANGO15 (mig1mig2), ANGO17 (snf1),
ANGO19a (snf4), ANGO19b (grr1), ANGO20 (reg1), ANGO21a (hap4) e
ANGO21b (hxk2).
Os dados da Figura 4.9 mostram que a interrupo simples de
MIG1, SNF1 ou SNF4, ou a interrupo conjunta de MIG1 e MIG2 no
tm um grande efeito no valor da velocidade especfica mxima de
crescimento de S. cerevisiae, a qual nestes casos permanece acima de
90% do valor para a cepa referncia. De acordo com os dados da Figura
4.10, os fatores de converso glicose a etanol e glicose a clulas tambm
no sofreram grandes alteraes nestes mutantes em relao cepa
referncia, ficando dentro de uma faixa de variao de 20%. No caso das
protenas Snf1 e Snf4, que devem estar presentes e ativas para que haja
desrepresso em clulas de S. cerevisiae (TREITEL et al, 1998;
CARLSON, 1999), de se esperar que a interrupo de seus respectivos
genes no cause grandes mudanas no crescimento em situao de
represso por glicose, pois, neste caso, estas protenas estariam
inativas. No caso da ausncia de Mig1, que tem um papel importante e
comprovado na represso da transcrio do gene SUC2 (KLEIN et al,
1998; WU; TRUMBLY, 1998), de certa forma surpreendente que o
mutante apresente velocidade de crescimento e fatores de converso
similares cepa referncia, pois seria esperado que na ausncia de
Mig1, no haveria mais ligao desta protena aos stios promotores de
genes reprimidos por glicose, liberando sua transcrio. Sendo assim,
ou h outra protena que se liga aos stios de ligao de Mig1, como por
exemplo a protena Mig2, ou h outros mecanismos / vias regulatrias
que controlam o funcionamento do metabolismo central de S.
cerevisiae, alm da via que envolve Mig1. Esta ltima hiptese mais
plausvel, pois no duplo mutante mig1mig2 no se observaram
mudanas significativas no crescimento e produo de etanol (Figuras
4.9 e 4.10). Observaes similares j haviam sido feitas por KLEIN et al

91
(1999) com relao ao metabolismo de dissacardeos e galactose, mas
no com relao ao metabolismo central.

0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,1 0,2 0,3 0,4
Y
x/s
(g/g)
Y
e
/
s

(
g
/
g
)
snf1
mig1
snf4
mig1mig2
hxk2
reg1
grr1
RS
hap4

Figura 4.10 Fatores de converso substrato a etanol em funo dos respectivos
fatores de converso substrato a clulas em diferentes mutantes de S. cerevisiae.


A interrupo simples de HXK2, HAP4 ou GRR1 tm um ligeiro
efeito negativo no valor da velocidade especfica mxima de crescimento
de S. cerevisiae, a qual nestes casos permanece entre 70% e 85% do
valor para a cepa referncia (Figura 4.9). No caso do mutante hxk2,
observa-se pelos dados da Figura 4.10 que h uma aparente
desrepresso das clulas devido ao maior acmulo de biomassa e ao
menor acmulo de etanol em relao cepa referncia. Estes mutantes
so viveis, pois a reao de converso de glicose a glicose-6-fosfato
ocorre pela reao catalisada pela enzima hexoquinase I, codificada pelo
gene HXK1 (ROSE et al, 1991; KRAAKMAN et al, 1999). No caso do
mutante hap4, no seria de se esperar que o valor de max diminusse,
pois Hap4 um ativador de transcrio de genes respiratrios e do ciclo
TCA, cuja transcrio reprimida por glicose via protena Mig1
(ROSENKRANTZ et al, 1994). Nota-se, na Figura 4.10, que os fatores de
converso glicose a clulas e glicose a etanol neste mutante so muito

92
prximos aos valores da cepa referncia. No caso do mutante grr1,
observou-se ao microscpio que as clulas encontravam-se mais
alongadas que o normal em S. cerevisiae (resultados no apresentados),
o que est de acordo com os dados apresentados por FLICK;
JOHNSTON (1991). Estes autores tambm observaram reduo na
velocidade de crescimento de S. cerevisiae quando o gene GRR1
interrompido, mas no quantificaram esta reduo. Observa-se pela
Figura 4.10 que ocorre significativa desrepresso na ausncia da
protena Grr1, pois a produo de etanol 46% menor e a formao de
biomassa 146% maior que na cepa referncia. Alm de estar envolvida
na via de represso por glicose, atuando como uma espcie de sensor
(JOHNSTON, 1999), a protena Grr1 participa do maquinrio de
protelise e tambm do ciclo celular (LI; JOHNSTON, 1997).
A interrupo do gene REG1 provoca uma drstica diminuio no
valor da velocidade especfica mxima de crescimento de S. cerevisiae
(cerca de 50%), o que tambm foi observado por HUANG et al (1996).
Alm disto, tambm provoca desrepresso das funes respiratrias, j
que a formao de biomassa 100% maior e a produo de etanol 54%
menor que na cepa referncia. A protena Reg1 direciona a protena
fosfatase Glc7 para o complexo Snf1, desfosforilando-o (Figura 2.4). O
complexo Snf1, quando desfosforilado, encontra-se na forma inativa.
Desta forma, se a expresso de REG1 abolida, no ocorre
desfosforilao do complexo Snf1 e o mesmo se mantm na forma ativa,
bloqueando a atividade de Mig1, o que pode ser a explicao para o
alvio da represso no mutante reg1.
Os dados da Figura 4.10 mostram que as cepas que apresentam
os maiores fatores de converso substrato a biomassa so as que
apresentam os menores fatores de converso substrato a etanol,
havendo praticamente uma tendncia linear decrescente entre os dois
parmetros. Os mutantes hxk2, reg1 e grr1 poderiam, a princpio, ser
considerados menos reprimidos por glicose que as outras cepas

93
estudadas (inclusive a referncia), j que suas capacidades
fermentativas so menores e suas capacidades respiratrias maiores.
De uma forma geral, observa-se que a eliminao da expresso de
genes que codificam protenas da parte inferior da cascata de represso
por glicose (Figura 2.1), como Mig1, Mig2 e Hap4, no provoca grande
alvio na represso. Nestes casos, o papel das protenas est
razoavelmente bem definido na literatura e provavelmente existem
cascatas em paralelo que garantem a represso das funes
metablicas centrais, mesmo quando estas protenas esto ausentes
das clulas. Por outro lado, a interrupo de genes que codificam
protenas da parte superior da cascata de represso por glicose, como
Hxk2 e Grr1, provoca um maior alvio na represso. Nestes casos, o
papel das protenas ainda no est muito bem estabelecido e as
mesmas esto envolvidas em vrios pontos da cascata de represso por
glicose, alm de fazerem parte de outras funes celulares.
Para estudar de forma mais aprofundada a atividade do ciclo TCA
e de outras vias no metabolismo central de S. cerevisiae, as marcaes
em metablitos intracelulares foram medidas em todos os mutantes
analisados. Os resultados so apresentados e discutidos no item 4.4.2.

4.4.2. Identificao de redes metablicas: inspeo qualitativa dos dados de
marcao

Os dados de marcao em metablitos intracelulares de S.
cerevisiae, medidos nos mutantes analisados, so apresentados na
Tabela 4.7.

4.4.2.1. Atividade do ciclo dos cidos tricarboxlicos (TCA)

A marcao no fragmento Asp115 est diretamente relacionada
atividade do ciclo TCA, pois esta marcao reflete o tomo C2 do
oxaloacetato (Tabela 4.4.1). Este tomo pode ser originrio do tomo C2
do piruvato (via piruvato carboxilase) ou dos tomos C3 e C4 do

94
Tabela 4.7 Marcao em metablitos intracelulares de mutantes
de S. cerevi si ae
Marcao no fragmento (%)
F
r
a
g
m
e
n
t
o

P
M

d
o

i
s
o
t
o
p

m
e
r
o

n

o

m
a
r
c
a
d
o

(
a
)

t
o
m
o
s

d
e

C

n
o

f
r
a
g
m
e
n
t
o

m
e
d
i
d
o

P
r
e
c
u
r
s
o
r

r
e
p
o
r
t
a
d
o
(
b
)

C
o
r
r
e
s
p
o
n
d

n
c
i
a

r
e
p
o
r
t
a
d
a

d
e

t
o
m
o
s

d
e

C

(
b
)


RS

mig1

mig1
mig2

snf1

snf4

grr1

reg1

hxk2

hap4
Glc 331

1,2,3,4,5,6 G6P 1,2,3,4,5,6 98.2 99.9 99.1 83.8 98.1 100.1 101.0 96.5 97.9
Ser 175
#

132
#

1,2
2,3
1,2
2,3
2.3
44.3
3.6
43.7
2.0
42.9
1.8
37.3
1.8
44.9
2.5
42.8
6.1
40.2
0.9
41.6
2.1
44.0
Gly 175
#

144
*

85
*

1,2
1,2
2
3-PG
1,2
1,2
2
2.2
2.4
1.3
3.6
4.1
1.9
1.6
2.6
1.3
2.2
2.5
1.4
2.6
3.0
1.6
4.2
4.5
2.6
8.5
8.7
5.6
2.6
2.9
1.6
2.4
2.9
1.6
Ala 116
#

99
*

158
*

2,3
2,3
1,2,3
2,3
2,3
1,2,3
45.2
45.1
46.8
44.4
44.1
45.8
44.6
44.3
46.5
39.1
39.4
41.2
46.0
46.6
48.5
46.5
47.2
49.8
46.5
46.2
52.0
43.7
43.9
45.6
45.6
45.7
47.7
Val 144
#

143
*

127
*

186
*

2,3,4,5
1,2
2,3,4,5
1,2,3,4,5
PYR
2,2,3,3
1,2
2,2,3,3
1,2,2,3,3
90.6
6.9
90.2
93.0
nd
(c)

6.2
89.2
91.8
89.3
7.8
87.7
90.9
78.0
6.5
77.2
79.2
92.3
8.0
91.2
93.9
94.7
11.4
95.5
97.8
98.1
24.4
98.9
104.7
87.9
6.9
87.0
90.6
90.7
9.2
91.7
91.8
Leu 158
#
2,3,4,5,
6
PYR +
AcCoA
2,2,3,3 +
2
130.1 126.9 127.9 112.4 127.1 135.6 135.1 126.0 130.1
Asp 188
#

115
*

216
*

2,3,4
2
1,2,3,4
2,3,4
2
1,2,3,4
49.9
2.0
51.7
50.3
2.0
52.3
49.9
2.8
52.5
43.5
1.9
46.0
50.5
2.2
53.4
56.9
6.1
61.4
59.0
14.6
67.4
51.2
3.1
55.0
49.1
3.0
51.8
Thr 175
#

146
#

1,2
2,3,4
OAA

1,2
2,3,4
2.9
47.6
4.6
52.3
3.6
45.5
3.2
43.7
3.0
48.7
8.5
54.9
21.4
58.8
4.8
50.6
3.9
47.0
Ile 158
#
2,3,4,
5,6
OAA +
PYR
2,3,4 +
2,3
95.1 94.9 96.0 82.4 96.3 103.8 109.2 96.1 95.1
Glu 143
*

230
*

1,2
1,2,3,4,5
1,2
1,2,3,4,5
43.9
95.2
43,0
95.4
38.3
96.6
37.4
83.8
44.8
91.6
46.9
120.8
42.8
110.0
43.3
106.8
45.1
92.7
Pro 142
#
2,3,4,5
AKG
2,3,4,5 87.1 86.3 86.5 75.4 81.3 102.7 95.0 91.7 84.1
Lys 156
#
2,3,4,5,
6
AKG +
AcCoA
2,3,4,5 +
2
125.7 122.6 124.3 109.0 114.3 142.8 129.3 126.3 121.8
PEP 1,2 2.5 2.2 2.5 4.4 7.8 7.7 5.8 3.3 5.0 Phe 143
*

192
#

1,2
2,3,4,5,
6,7,8,9
E4P +
PEP
1,2,3,4 +
2,2,3,3
111.9 110.9 110.4 97.3 115.3 109.8 105.9 104.4 115.7
(a) ndices superiores indicamo tipo de derivatizao utilizada: GPA, # ECF, * DMFDMA. Referir-se seo Metodologia
para detalhes.
(b) Precursores so molculas do metabolismo central, que envolve: a via EMP, a via PP , o ciclo TCA e reaes adjacentes. As
informaes foramobtidas de umlivro texto de bioqumica (ZUBAY, 1988).
(c) No determinado.

-cetoglutarato (via ciclo TCA). Neste segundo caso, h duas
possibilidades, devido simetria de alguns intermedirios do ciclo TCA,
como o succinato e o fumarato. Na cepa referncia, a marcao no
fragmento Asp115 de 2,0%. Como a marcao no fragmento Glu143
(que reflete o correspondente fragmento do -cetoglutarato) bem maior
que este valor (43,9%), e como a marcao em Val143 (que reflete o
correspondente fragmento do piruvato) 6,9%, possvel concluir que o
ciclo TCA no opera na forma de um ciclo, mas sob a forma de dois
ramos (GOMBERT et al, 2001). Observaes similares podem ser feitas
para todos as outras cepas analisadas, com exceo dos mutantes grr1
e reg1, as quais apresentam marcaes de 6,1% e 14,6% no fragmento

95
Asp115, respectivamente. Isto uma indicao de que h desrepresso
nestes dois mutantes. No entanto, o fragmento Val143 apresenta
marcaes de 11,4% e 22,4% nos mutantes grr1 e reg1,
respectivamente, o que significa que existe a possibilidade de a reao
catalisada pela enzima piruvato carboxilase estar contribuindo para a
formao de oxaloacetato. Considerando-se os maiores valores para o
fator de converso substrato a biomassa e os menores valores para o
fator de converso substrato a etanol nos mutantes grr1 e reg1,
juntamente com os dados de marcao obtidos, pode-se concluir que h
desrepresso na atividade do ciclo TCA. Um resultado surpreendente
a marcao de 3,1% no fragmento Asp115, no caso do mutante hxk2.
Este dado indica que provavelmente no h desrepresso da atividade
do ciclo TCA neste mutante, apesar de o fator de converso substrato a
biomassa ser mais alto e o fator de converso substrato a etanol ser
mais baixo que na cepa referncia (Figuras 4.9 e 4.10). Sabe-se que a
protena Hxk2 tem um papel central na parte superior da cascata de
represso por glicose (KRAAKMAN et al, 1999), o que significa que a
interrupo do gene HXK2 tem efeitos pleiotrpicos no metabolismo de
S. cerevisiae, os quais no so totalmente conhecidos.

4.4.2.2. Atividade da via das Pentoses Fosfato (PP)

As marcaes nos fragmentos Glc331, Ser132 e Ala 116 (ou
Ala99) esto diretamente relacionadas atividade da via PP (Tabela
4.4.1). Valores baixos de marcao nestes trs fragmentos indicam alto
fluxo pela via PP, devido eliminao do tomo de C marcado na reao
catalisada pela enzima 6-fosfogluconato desidrogenase, nas primeiras
etapas da via PP (desde que o substrato utilizado nos cultivos seja [1-
13
C]glicose). No caso do fragmento Glc331, a diminuio da marcao se
d tambm devido reversibilidade da reao catalisada pela enzima
glicose-6-fosfato isomerase, que converte frutose-6-fosfato no marcada
(gerada pela via PP, juntamente com gliceraldedo-3-fosfato) em glicose-

96
6-fosfato. A partir dos dados da Tabela 4.7, possvel observar que o
mutante snf1 apresenta maior fluxo pela via PP em relao cepa
referncia, pois os fragmentos Glc331, Ser132 e Ala116 (ou Ala 99)
apresentam valores de marcao mais baixos. Sabe-se que Snf1 uma
protena quinase que fosforila Mig1 quando o nvel de glicose baixo na
clula, aliviando a represso causada pela ligao desta protena aos
stios promotores de genes reprimidos por glicose. No entanto, parece
difcil especular sobre como a funo de Snf1 poderia ser relacionada
atividade da via PP. Anlises complementares, como a medida da
expresso de genes em todo o genoma de S. cerevisiae (por chips de
DNA, por exemplo), poderiam auxiliar no esclarecimento desta
observao experimental.

4.4.2.3. Treonina aldolase

As marcaes nos fragmentos Ser175, Gly175 (ou Gly 144) e
Thr175 so diretamente relacionadas atividade da enzima treonina
aldolase, que representa uma segunda rota biossinttica de glicina (LIU
et al, 1997; MONSCHAU et al, 1997) (Tabela 4.4.1). Se a marcao em
Gly175 (ou Gly144) assumir um valor intermedirio entre as marcaes
em Ser175 e Thr175, glicina est sendo formada por ambas as vias
biossintticas, a partir de serina e a partir de treonina. Neste caso, os
mutantes grr1 e reg1 so aqueles para os quais a situao mais clara,
ou seja, a marcao nos tomos C1 e C2 da glicina deriva parcialmente
de serina e parcialmente de treonina. Na cepa referncia e nos demais
mutantes, difcil obter informao a respeito desta funo metablica,
pois as medidas experimentais assumem valores muito prximos
marcao natural (1,1% de
13
C em cada posio).





97
4.4.2.4. Enzima mlica

As marcaes nos fragmentos Val144 (ou Val127), Ala116 (ou
Ala99), Val143 e Phe143 esto relacionadas atividade da enzima
mlica (Tabela 4.4.1). Se a metade do valor da marcao no fragmento
Val144 (ou Val127) for maior que a marcao no fragmento Ala116 (ou
Ala99), h uma indicao de que a enzima mlica encontra-se ativa, j
que o piruvato drenado para biossntese de valina mitocondrial
(FALCO et al, 1985), enquanto que no sabido em que compartimento
ocorre a biossntese de alanina (h duas enzimas alanina
aminotransferase putativas, uma no citossol e outra na mitocndria). Se
alanina ao menos parcialmente formada no citossol, a enzima mlica
poderia contribuir para as diferentes marcaes nos fragmentos de
valina e alanina. Alm disto, se a marcao em Val143 (que reflete os
tomos C1 e C2 do piruvato) for maior que a marcao em Phe143 (que
reflete os tomos C1 e C2 do fosfoenolpiruvato), existe tambm
indicao de atividade da enzima mlica, pois esta a nica reao que
pode levar formao de piruvato em clulas sob crescimento em
glicose, alm da reao catalisada pela enzima piruvato quinase. No
mutante reg1, a marcao em Val144 (ou Val127) corresponde a mais
que o dobro da marcao em Ala116 (ou Ala99), indicando atividade da
enzima mlica. Nos demais mutantes, difcil afirmar que a enzima
mlica no est ativa, pois no se sabe exatamente em que
compartimento alanina sintetizada. A marcao no fragmento Val143
maior que a marcao em Phe143 em todas as cepas analisadas, com
exceo do mutante snf4, indicando que neste ltimo provavelmente a
enzima mlica est inativa. Considerando-se o papel da protena Snf4
na cascata de represso por glicose, como moduladora da atividade de
Snf1, atravs da ligao com o stio regulador desta, difcil especular
sobre a ligao entre Snf4 e a enzima mlica.



98
4.4.3. Anlise de fluxos metablicos

Aps feita a identificao de redes metablicas, ou inspeo
qualitativa dos dados de marcao (IQDM), procurou-se definir a rede
metablica adequada para o clculo de fluxos metablicos em cada um
dos mutantes. Os clculos de fluxos, que no fundo consistem da
minimizao da funo objetivo representada pela somatria dos erros
entre medidas experimentais e dados calculados pelo modelo (conforme
descrito no item 3.2.7), foram realizados vrias vezes para cada
mutante, utilizando-se diferentes redes metablicas. Partindo-se da
rede metablica indicada no Apndice, verificou-se o efeito das
seguintes variaes:
- incluso da reao gliconeognica catalisada pela enzima
fosfoenolpiruvato carboxiquinase;
- excluso da reao catalisada pela enzima mlica.
Em todos os casos, os melhores resultados foram obtidos com a rede
metablica indicada no Apndice, ou seja, sem a reao catalisada pela
enzima fosfoenolpiruvato carboxiquinase e incluindo a reao catalisada
pela enzima mlica.
Alm disto, procurou-se excluir as medidas de alguns fragmentos
de aminocidos, com o objetivo de obter erros menores ao final do
processo de minimizao. Verificou-se que a no incluso das medidas
nos fragmentos Ile158, Pro142, Lys156 e Phe143 contribuiu para a
diminuio do erro em alguns casos. A excluso do fragmento Ile158,
que reflete os tomos C2, C3 e C4 do oxaloacetato citosslico e C2 e C3
do piruvato mitocondrial, no representa perda de informao, pois a
marcao nestes mesmos tomos j inferida via fragmentos de valina
e treonina (Tabela 4.7). A excluso do fragmento Pro142, que reflete os
tomos C2 a C5 do -cetoglutarato, no representa perda de
informao, pois a medida realizada no glutamato tambm reflete os
tomos de C do -cetoglutarato. No caso de Lys156, que reflete os
tomos C2 a C5 do -cetoglutarato e o tomo C2 da acetil coenzima A,

99
perde-se somente a informao sobre a marcao neste ltimo tomo,
pois a marcao nos tomos do -cetoglutarato j feita via fragmentos
de glutamato. No entanto, a excluso do fragmento Phe143 leva perda
de importante informao sobre a medida da marcao nos tomos C1 e
C2 do fosfoenolpiruvato, ponto-chave das vias glcoltica e
gliconeognica. Desta forma, os fluxos metablicos calculados no
serviro para uma anlise precisa sobre esta parte do metabolismo.
Para realizar tal anlise, deve-se ter medidas mais precisas em
fragmentos de aminocidos que refletem os tomos de C do
fosfoenolpiruvato. Os resultados apresentados a seguir foram obtidos
com ou sem a incluso das medidas nos fragmentos acima (vide Tabelas
4.8, 4.9 e 4.10 para verificar quais medidas foram excludas no clculo
de fluxos em cada mutante).
Para os clculos de fluxos metablicos nos mutantes, fez-se a
hiptese de que no h reaes gliconeognicas ocorrendo (as medidas
realizadas no podem comprovar este fato, conforme descrito no rodap
da Tabela 4.4.1). Para que genes gliconeognicos sejam expressos,
necessrio que a protena Snf1 esteja ativa (VINCENT; CARLSON, 1998;
RAHNER et al, 1999). Sendo assim, provvel que isto no ocorra em
nenhum dos mutantes analisados, pois Snf1 inativa quando os nveis
de glicose so no-limitantes (Figura 2.4). Outra hiptese foi feita com
relao produo de glicerol. Assumiu-se que a produo de glicerol
nos mutantes foi a mesma que se observou na cepa referncia (Tabela
4.4). Em funo de problemas analticos, no se conseguiu medir
glicerol a partir de uma determinada etapa do trabalho, justamente
quando foi iniciada a anlise dos mutantes. A produo de glicerol
uma restrio importante a ser imposta ao sistema, pois ela reflete o
balano de xido-reduo de S. cerevisiae, j que a reao catalisada
pela enzima glicerol-3-fosfato desidrogenase muito utilizada pelas
clulas para reoxidao da coenzima NADH.
Levando-se em conta todas as consideraes acima, os fluxos
metablicos foram calculados para os mutantes snf1, snf4, grr1, reg1,

100
hxk2 e hap4. Os dados so apresentados nas Figuras 4.11, 4.12 e 4.13.
Para os mutantes mig1 e mig1mig2 no foram realizados clculos, pois
os dados de marcao e a produo de metablitos extracelulares foram
muito parecidos aos da cepa referncia, o que significa que os fluxos
metablicos so iguais.
Glicose
G6P
F6P
via PP
G3P
Biomassa
PYR
Biomassa
Glicerol
PEP
ACA
OAA Thr
Ser Gly
AcCoA ACE
Etanol
0.8
0.8
6.0
6.0
0.3(0)
0.3(0)
1.7
1.7
2.4
2.4
2.2
2.2
1.3(0)
1.3(0.42)
2.0
2.0
1.6
1.6
2.7
2.7
148.3
144.7
2.3
2.3
170.1
160.9
172.3
163.2
88.7
78.8
82.4(0.92)
52.2(0.95)
100
100
5.3
4.4
0.3
0.3
8.6
15.1
8.5
14.1
2.6
12.7
6.3
26.4
11.6
41.8
16.7
10.2
1.8
1.8
140.1
130.0
8.5
8.5
Acetato
0.2
0.9
OAA
MAL
AKG
AcCoA
Biomassa
FUM
mitocndria
4.4
4.4
5.6
0.1
0
0
0(1)
0(1)
2.1
6.4
14.5
12.2
4.4
4.4
0
5.6
8.0
1.4
1.3
1.3
ciclo TCA
3.2
4.2
Biomassa
5.6
5.6
PYR
snf4
snf1

Figura 4.11 Fluxos no metabolismo central de S. cerevisiae. Os valores em negrito
correspondem ao mutante snf4 e os valores em itlico correspondem ao mutante snf1.
Reversibilidades so indicadas pelos dados em parnteses, sob a forma de fluxos de
intercmbio normalizados (equao 4.1).


101


Glicose
G6P
F6P
via PP
G3P
Biomassa
PYR
Biomassa
Glicerol
PEP
ACA
OAA Thr
Ser Gly
AcCoA ACE
Etanol
1.5
1.2
13.1
12.0
0.6(0)
0.5(0.38)
3.1
2.3
4.5
3.4
4.0
3.0
2.5(0)
1.9(0)
3.7
2.8
3.1
2.3
4.8
3.5
86.7
120.4
4.2
3.2
148.8
155.1
153.0
158.3
80.8
82.7
76.0(0.93)
77.6(0.93)
100
100
5.3
5.3
0.6
0.5
16.6
54.4
16.6
24.5
1.3
1.7
4.8
5.0
10.9
10.3
24.2
27.8
3.4
2.6
70.7
66.5
16.5
13.3
Acetato
0
30.0
OAA
MAL
AKG
AcCoA
Biomassa
FUM
mitocndria
8.1
6.2
32.0
11.8
21.6
15.1
21.6(0.73)
15.1(0.81)
3.6
65.3
19.7
87.0
29.7
21.2
0.2
11.2
8.0
15.5
2.4
1.8
ciclo TCA
34.4
4.3
Biomassa
10.4
7.9
PYR
grr1
reg1

Figura 4.12 Fluxos no metabolismo central de S. cerevisiae. Os valores em
negrito correspondem ao mutante grr1 e os valores em itlico correspondem ao
mutante reg1. Reversibilidades so indicadas pelos dados em parnteses, sob a forma
de fluxos de intercmbio normalizados (equao 4.1).

102
Glicose
G6P
F6P
via PP
G3P
Biomassa
PYR
Biomassa
Glicerol
PEP
ACA
OAA Thr
Ser Gly
AcCoA ACE
Etanol
1.1
0.6
8.2
4.4
0.4(1)
0.2(0)
2.2
1.1
3.1
1.6
2.8
1.4
1.7(0.72)
0.9(0)
2.6
1.3
2.1
1.1
2.5
1.8
122.4
162.0
2.9
1.5
159.7
174.1
162.6
175.6
82.6
88.7
69.7(0.93)
77.5(0.93)
100
100
5.2
5.3
0.4
0.2
21.6
9.4
11.2
8.2
5.8
5.2
12.9
11.2
22.2
18.1
15.7
9.8
2.4
1.2
101.2
152.8
11.2
5.8
Acetato
10.4
1.2
OAA
MAL
AKG
AcCoA
Biomassa
FUM
mitocndria
5.7
2.9
16.3
1.3
9.1
0
9.1(0.64)
0(1)
0
5.9
10.1
12.8
14.7
2.9
0
2.4
4.4
4.0
1.6
0.8
ciclo TCA
19.2
1.0
Biomassa
7.3
3.7
PYR
hxk2
hap4

Figura 4.13 Fluxos no metabolismo central de S. cerevisiae. Os valores em
negrito correspondem ao mutante hxk2 e os valores em itlico correspondem ao
mutante hap4. Reversibilidades so indicadas pelos dados em parnteses, sob a forma
de fluxos de intercmbio normalizados (equao 4.1).


Os dados das Figuras 4.11, 4.12 e 4.13 devem ser analisados em
comparao aos dados em negrito da Figura 4.7, os quais representam
os fluxos metablicos na cepa referncia, nas mesmas condies de
cultivo. Para verificar a acurcia dos clculos, so apresentados nas

103
Tabelas 4.8, 4.9 e 4.10 os dados de marcao medidos e os calculados,
para cada mutante. Pode-se tambm verificar quais medidas de
marcao foram utilizadas como dados de entrada para a rotina de
clculo de fluxos metablicos, em cada caso.

Tabela 4.8 Marcaes medidas e marcaes calculadas nos
cultivos descontnuos com as cepas snf1 e snf4
snf1 snf4 fragmento
(a)

calculado medido calculado medido
Glc331 88,4 83,8 100,8 98,1
Gly175 3,5 2,2 4,0 2,6
Gly144 3,5 2,5 4,0 3
Gly85 1,9 1,4 1,4 1,6
Ser175 2,6 1,8 3,9 1,8
Ser132 38,1 37,3 45,1 44,9
Ala116 37,8 39,1 45,1 46,0
Ala99 37,8 39,4 45,1 46,6
Ala158 38,9 41,2 47,7 48,5
Leu158 112,3 112,4 128,9 127,1
Val144 75,6 78,0 90,2 92,3
Val143 7,0 6,5 9,7 8,0
Val127 75,6 77,2 90,2 91,2
Val186 78,3 79,2 93,5 93,9
Asp188 53,6 43,5 53,5 50,5
Asp115 6,1 1,9 2,1 2,2
Asp216 57,1 46,0 56,2 53,4
Glu143 36,3 37,4 44,1 44,8
Glu230 87,8 83,8 97,7 91,6
Pro142 75,7 75,4 - m.n.u.
(b)

(a)
para detalhes sobre os fragmentos, vide rodap da Tabela 4.5.
(b)
medida no utilizada.

Os dados das Tabelas 4.8, 4.9 e 4.10 indicam que as marcaes
calculadas apresentaram valores muito prximos aos valores medidos
em todos os mutantes analisados, com exceo do mutante snf1. Neste
caso, foi muito difcil conseguir um bom ajuste e terminou-se por
aceitar os fluxos indicados na Figura 4.11. Nota-se que a produo de
etanol indicada na figura para o mutante snf1, 130 moles para 100
moles de glicose (= 0,33 g/g glicose), no corresponde ao dado de
entrada, de 0,38 g/g glicose (Figura 4.10), o que reflete a dificuldade em
se encontrar um mnimo na rotina de clculo de fluxos. Por isto, os
dados relativos ao mutante snf1 devem ser analisados com muito


104
Tabela 4.9 Marcaes medidas e marcaes calculadas nos
cultivos descontnuos com as cepas grr1 e reg1
grr1 reg1 fragmento
(a)

calculado medido calculado medido
Glc331 100,7 100,1 102,2 101,0
Gly175 4,6 4,2 8,9 8,5
Gly144 4,6 4,5 8,9 8,7
Gly85 1,9 2,6 4,7 5,6
Ser175 3,7 2,5 4,2 6,1
Ser132 45,1 42,8 45,0 40,2
Ala116 45,1 46,5 45,0 46,5
Ala99 45,1 47,2 45,0 46,2
Ala158 47,6 49,8 47,9 52,0
Leu158 136,3 135,6 135,5 135,1
Val144 94,7 94,7 97,4 98,1
Val143 10,1 11,4 24,3 24,4
Val127 94,7 95,5 97,4 98,9
Val186 99,1 97,8 106,1 104,7
Asp188 58,3 56,9 59,9 59,0
Asp115 4,3 6,1 14,1 14,6
Asp216 62,2 61,4 68,0 67,4
Ile158 - m.n.u.
(b)
108,5 109,2
Glu143 46,7 46,9 42,3 42,8
Glu230 118,7 120,8 108,8 110,0
Pro142 104,2 102,7 96,6 95,0
(a)
para detalhes sobre os fragmentos, vide rodap da Tabela 4.5.
(b)
medida no utilizada.

Tabela 4.10 Marcaes medidas e marcaes calculadas nos
cultivos descontnuos com as cepas hxk2 e hap4
hxk2 hap4 fragmento
(a)

calculado medido calculado medido
Glc331 98,1 96,5 98,9 97,9
Gly175 2,5 2,6 2,8 2,4
Gly144 2,5 2,9 2,8 2,9
Gly85 0,9 1,6 1,6 1,6
Ser175 2,9 0,9 2,2 2,1
Ser132 41,7 41,6 44,5 44,0
Ala116 42,0 43,7 44,5 45,6
Ala99 42,0 43,9 44,5 45,7
Ala158 44,2 45,6 45,6 47,7
Leu158 125,6 126,0 130,1 130,1
Val144 86,8 87,9 88,9 90,7
Val143 8,5 6,9 9,3 9,2
Val127 86,8 87,0 88,9 91,7
Val186 90,7 90,6 91,2 91,8
Asp188 55,6 51,2 53,7 49,1
Asp115 1,3 3,1 3,8 3,0
Asp216 57,8 55,0 55,3 51,8
Ile158 99,0 96,1 - m.n.u.
(b)

Glu143 44,4 43,3 44,3 45,1
Glu230 107,0 106,8 97,2 92,7
Pro142 92,9 91,7 88,9 84,1
(a)
para detalhes sobre os fragmentos, vide rodap da Tabela 4.5.
(b)
medida no utilizada.

105
cuidado. Os principais resultados obtidos, agrupados por funo
metablica, so apresentados na Tabela 4.11.

TABELA 4.11 Fluxos por algumas funes metablicas nos
mutantes analisados*
funo
metablica
RS
(a)
snf1 snf4 grr1 reg1 hxk2 hap4
via PP 16,2 41,8 11,6 10,9 10,3 22,2 18,1
treonina
aldolase
0(1) 0,3(0) 0,3(0) 0,6(0) 0,5(0,38) 0,4(1) 0,2(0)
ciclo TCA 0 0 0 21,6 15,1 9,1 0
enzima
mlica
1,7 1,4 8,0 8,0 15,5 4,4 4,0
* os dados so em mmoles por 100 mmoles de glicose. As setas para cima indicam
aumento do fluxo relativamente cepa referncia. As setas para baixo indicam
diminuio do fluxo. Os valores entre parnteses so os fluxos de intercmbio
normalizados (equao 4.1).
(a)
cepa referncia (dados em negrito da Figura 4.7).

Como os dados relativos ao mutante snf1 no so confiveis,
nota-se que, de uma forma geral, h uma diminuio no valor do fluxo
pela via PP (Tabela 4.11). Isto ocorre provavelmente devido
composio da biomassa dos mutantes, a qual assume uma frao
protica sempre menor que a da cepa referncia (Tabela 3.5), havendo
assim uma menor necessidade de gerao da coenzima NADPH para
biossntese de aminocidos. O mutante hap4 apresenta um valor muito
prximo ao da cepa referncia para o fluxo pela via PP. J no mutante
hxk2, este fluxo ligeiramente maior que na cepa referncia. Isto
poderia ser devido ao maior fator de converso substrato a clulas neste
mutante em relao cepa referncia. No entanto, no caso dos
mutantes grr1 e reg1, este valor tambm maior e o fluxo pela via PP
menor. Desta forma, difcil encontrar uma relao entre desrepresso
e o fluxo de glicose desviado pela via PP.
Com relao rota biossinttica de glicina, via treonina aldolase,
os clculos indicam que h uma pequena tendncia de aumento no
fluxo lquido por esta reao nos mutantes, em relao cepa referncia
(Tabela 4.11). No entanto, difcil afirmar que este fato realmente ocorre

106
in vivo, pois os valores de marcao nos fragmentos Gly175(ou 144),
Ser175 e Thr175 (ou Asp115) so todos muito baixos, prximos
marcao natural (1,1% de
13
C em cada posio).
Com relao atividade do ciclo TCA, resultados bastante
interessantes e confiveis puderam ser obtidos. Os dados mostram que
nos mutantes hxk2, grr1 e reg1 (principalmente nestes dois ltimos),
houve desrepresso em relao cepa referncia. Isto significa que a
atividade respiratria maior nestes mutantes que na cepa referncia,
dado que pode ser de grande interesse industrial nas aplicaes em que
se deseja minimizar a formao de etanol (produo de biomassa ou de
protenas heterlogas). Desrepresso da atividade respiratria tambm
foi observada quando o gene do ativador de transcrio Hap4 foi
superexpresso em S. cerevisiae (BLOM et al, 2000). Desta forma, nota-
se que a deleo e/ou superexpresso de genes regulatrios
ferramenta importantssima dentro da Engenharia Metablica
(STEPHANOPOULOS et al, 1998; OSTERGAARD et al, 2000). A ausncia
da protena Reg1, a qual inativa o complexo Snf1 por desfosforilao
quando glicose no-limitante, deixa este complexo permanentemente
ativo (Figura 2.4), inibindo a atuao da protena Mig1 (Figura 2.3), a
qual reprime a transcrio de genes do ciclo TCA e respiratrios.
Portanto, no mutante reg1, esta pode ser a causa da desrepresso
observada. No caso do mutante grr1, como o papel da protena Grr1
ainda no bem conhecido (sabe-se que a mesma atua como uma
espcie de sensor e que est envolvida na represso do gene SUC2;
FLICK; JOHNSTON, 1991), torna-se difcil conhecer a causa da
desrepresso observada nas atividades respiratrias. No entanto,
interessante observar que a interrupo de GRR1 pode ser usada como
forma de desreprimir a atividade respiratria de S. cerevisiae. A
ausncia da protena Hxk2, que tem um papel central no fenmeno de
represso por glicose, estando envolvida tanto na via principal
(CARLSON, 1999; JOHNSTON, 1999), como na via cAMP-PKA
(THEVELEIN; DE WINDE, 1999), tambm causa desrepresso das

107
atividades respiratrias, ainda que em menor grau que a ausncia de
Reg1 ou Grr1 (Figuras 4.12 e 4.13). A interrupo conjunta de genes
regulatrios pode ser testada como forma de se desreprimir ainda mais
as atividades respiratrias de S. cerevisiae.
A enzima mlica no essencial para o crescimento de S.
cerevisiae (BOLES et al, 1998) e sua ausncia no afeta o crescimento
sob condies de laboratrio (WYSOCKI et al, 1999). No entanto,
observou-se que a mesma est ativa quando as clulas crescem
aerobicamente em glicose (BOLES et al, 1998) e que h fluxo por esta
reao (GOMBERT et al, 2001; Figura 4.7). Devido s variaes
observadas no fluxo por esta reao nos mutantes analisados (Tabela
4.11), pode-se deduzir que esta enzima sofre algum tipo de regulao
por glicose. Observa-se que na ausncia das protenas Reg1 e Grr1, as
quais aparentemente mais afetam os fluxos metablicos em represso
por glicose, dentre os mutantes analisados, a atividade calculada para a
enzima mlica foi 4 e 7 vezes mais altas que na cepa referncia,
respectivamente. Alm disto, pode-se observar tambm que h uma
aparente relao entre a diminuio do fluxo pela via PP e o aumento do
fluxo pela enzima mlica, o que vai ao encontro de seu possvel papel na
gerao de NADPH intramitocondrial (BOLES et al, 1998).




108
5. CONCLUSES

5.1. Represso por glicose na cepa referncia

- Anlise de redes metablicas (ARM) foi aplicada a clulas de S.
cerevisiae crescendo em aerobiose, com glicose como substrato
limitante. Atravs desta anlise, foi possvel comparar o metabolismo
de clulas crescendo em cultivo descontnuo (condio de
metabolismo respiratrio-fermentativo) com o metabolismo de
clulas crescendo em quimiostato (condio de metabolismo
respiratrio).
- Num primeiro momento, a metodologia, que inclui cultivos em reator
especialmente projetado, medida de marcao em metablitos
intracelulares por GC-MS e modelagem matemtica, foi validada
para cultivos contnuos e descontnuos, tendo sido possvel calcular
um desvio padro para as medidas.
- A primeira etapa da ARM, a identificao de redes metablicas, levou
a observaes qualitativas sobre a biossntese de glicina, que inclui a
reao catalisada pela enzima treonina aldolase.
- Alm disto, os dados de marcao levaram incluso da reao
catalisada pela enzima mlica e da compartimentao dos
metablitos piruvato, acetil coenzima A e oxaloacetato no modelo
estequiomtrico.
- O ciclo TCA opera de forma cclica em clulas que respiram e de
forma no cclica em clulas que apresentam metabolismo
respiratrio-fermentativo.
- Uma maior parte da glicose consumida desviada para a via PP em
clulas que respiram do que em clulas que apresentam
metabolismo respiratrio-fermentativo, o que est de acordo com as
necessidades de NADPH nas vias anablicas.



109
5.2. Represso por glicose em diferentes mutantes

- a interrupo de MIG1 ou a interrupo conjunta de MIG1 e MIG2
no alteram os padres de crescimento, produo de etanol e o
metabolismo central de S. cerevisiae;
- os mutantes hxk2, reg1 e grr1, que apresentaram menor produo
de etanol e maior formao de biomassa, em relao cepa
referncia, foram os que apresentaram maior desrepresso das
atividades do ciclo TCA / respiratrias. Esta desrepresso coincide
com a diminuio da velocidade especfica de crescimento e com a
localizao destas protenas na parte superior da cascata de
represso por glicose;
- h indicos de que a enzima mlica sofre algum tipo de regulao por
glicose.

5.3. Consideraes finais

Considerando-se que:

- fluxos intracelulares so grandezas no mensurveis (o que se faz
neste tipo de anlise estimar fluxos, utilizando-se um modelo
estequiomtrico e impondo-se restries ao sistema, que so as
medidas de fluxos extracelulares e de marcaes em alguns
fragmentos de metablitos intracelulares);
- necessrio fazer hipteses fortes em alguns casos, como sobre a
composio da biomassa dos mutantes de S. cerevisiae (vide item
3.2.7) e sobre a formao de glicerol nestes mutantes;
- nem sempre todas as medidas de marcao utilizadas como dados
de entrada na rotina de clculo de fluxos so includas (a razo pela
qual deixar estas medidas de lado leva melhoria do processo de
minimizao no bem conhecida).


110
Chega-se seguinte concluso: a Anlise de Redes Metablicas,
principalmente na forma em que foi aplicada em relao aos mutantes
neste trabalho, no comprobatria, mas indicativa. Deve ser utilizada
em conjunto com outros tipos de anlise para cercar melhor o
problema. Outras anlises que poderiam ser utilizadas de forma
complementar Anlise de Redes Metablicas incluem:

- Anlise por Northern Blot / tecnologia de chip de DNA (identificam
a presena de transcritos, mRNAs, mas no identificam traduo,
modificaes ps-traducionais e modulao da atividade de
protenas);
- Medida da atividade de -galactosidase em protenas de fuso
(identificam transcrio e traduo, mas a atividade enzimtica
medida no reflete necessariamente a da protena original, portanto
no so identificadas modificaes ps-traducionais e modulao da
atividade protica);
- Medida de fluorescncia em fuses de protenas com GFP, green
fluorescent protein (consideraes anlogas ao item anterior);
- Medida da atividade enzimtica em extratos celulares (identificam
transcrio e traduo, identificam a presena da enzima, mas as
medidas no refletem necessariamente o que ocorre in vivo, devido
aos diferentes ambiente in vitro e in vivo, como disponibilidade de
subtratos, coenzimas, etc. Este tipo de medida no serve para
protenas sem funo enzimtica);
- Anlise do proteoma por eletroforese bi-dimensional e espectrometria
de massa (identificam transcrio e traduo, alm de eventos ps-
traducionais, identificam a concentrao da enzima no extrato
celular, no sua atividade. Vrias protenas celulares no so
identificadas por este mtodo, devido baixa sensibilidade).

A utilizao conjunta do maior nmero possvel das ferramentas
analticas indicadas acima em mutantes de S. cerevisiae o caminho

111
mais apropriado para se obter informaes sobre o papel de uma
determinada protena, dentro do escopo da genmica funcional. A
Anlise de Redes Metablicas tem papel importante, pois a nica,
dentre as possibilidades relacionadas acima, que tem a capacidade de
refletir o funcionamento do metabolismo in vivo.





112
6. REFERNCIAS
1. AIBA, S.; MATSUOKA, M. Identification of metabolic model: citrate
production from glucose by Candida lipolytica. Biotechnology
and Bioengineering, v. 21, p. 1373-1386, 1979.
2. ALMS, G.R.; SANZ, P.; CARLSON, M.; HAYSTEAD, T.A.J. Reg1p
targets protein phosphatase 1 to dephosphorylate hexokinase II in
Saccharomyces cerevisiae: characterizing the effects of a
phosphatase subunit on the yeast proteome. EMBO Journal, v.
18, p. 4157-4168, 1999.
3. ARISTIDOU, A.A.; SAN, K.Y.; BENNETT, G.N. Metabolic flux analysis
of Escherichia coli expressing the Bacillus subtilis acetolactate
synthase in batch and continuous culture. Biotechnology and
Bioengineering, v. 63, p. 737-749, 1999.
4. BAILEY, J.E. Toward a science of metabolic enginering. Science, v.
252, p. 1668-1675, 1991.
5. BAILEY, R.B.; WOODWORD, A. Isolation and characterization of a
pleiotropic glucose repression resistant mutant of Saccharomyces
cerevisiae. Molecular and General Genetics, v. 193, p. 507-512,
1984.
6. BASSETT JR, D.E.; EISEN, M.B.; BOGUSKI, M.S. Gene expression
informatics its all in your mine. Nature Genetics Suppl., v. 21,
p. 51-55, 1999.
7. BLOM, J.; TEIXEIRA DE MATTOS, M.J.; GRIVELL, L.A. Redirection
of the respiro-fermentative flux distribution in Saccharomyces
cerevisiae by overexpression of the transcription factor Hap4p.
Applied and Environmental Microbiology, v. 66, p. 1970-1973,
2000.
8. BOJUNGA, N.; ENTIAN, K.-D. Cat8p, the activator of gluconeogenic
genes in Saccharomyces cerevisiae, regulates carbon source-
dependent expression of NADP-dependent cytosolic isocitrate
dehydrogenase (Idp2p) and lactate permease (Jen1p). Molecular
and General Genetics, v. 262, p. 869-875, 1999.
9. BOLES, E.; DE JONG-GUBBELS, P.; PRONK, J.T. Identification and
characterization of MAE1, the Saccharomyces cerevisiae structural
gene encoding mitochondrial malic enzyme. Journal of
Bacteriology, v. 180, p. 2875-2882, 1998.
10. BRUINENBERG, P.M.; VAN DIJKEN, J.P.; SCHEFFERS, A. A
theoretical analysis of NADPH production and consumption in
yeasts. Journal of General Microbiology, v. 129, p. 953-964,
1983.
113
11. CAMERON, D.C.; TONG, I.-T. Cellular and metabolic engineering.
Applied Biochemistry and Biotechnology, v. 38, p. 105-140,
1993.
12. CARLSON, M. Glucose repression in yeast. Current Opinion in
Microbiology, v. 2, p. 202-207, 1999.
13. CHEN, S.; BROCKENBROUGH, J.S.; DOVE, J.E.; ARIS, J.P.
Homocitrate synthase is located in the nucleus is the yeast
Saccharomyces cerevisiae. Journal of Biological Chemistry,
v. 16, p. 10839-10846, 1997.
14. CHRISTENSEN, B.; NIELSEN, J. Metabolic network analysis: a
powerful tool in metabolic engineering. Advances in
Biochemical Engineering / Biotechnology, v. 66, p. 209-
231, 1999.
15. CHRISTENSEN, B.; NIELSEN, J. Isotopomer analysis unsing GC-
MS. Metabolic Engineering, v. 1, p. 282-290, 1999b.
16. CHRISTENSEN, B.; NIELSEN, J. Metabolic network analysis on
Penicillium chrysogenum using
13
C-labeled glucose.
Biotechnology and Bioengineering, v. 68, p. 652-659, 2000.
17. CORNISH-BOWDEN, A.; CRDENAS, M.L. From genome to
cellular phenotype a role for metabolic flux analysis? Nature
Biotechnology, v. 18, p. 267-268, 2000.
18. ALIK, P.; ALIK, G; TAKA, S.; ZDAMAR, T.H. Metabolic flux
analysis for serine alkaline protease fermentation by Bacillus
licheniformis in a defined medium: effects of the oxygen
transfer rate. Biotechnology and Bioengineering, v. 64, p.
151-167, 1999.
19. DAAE, E. B.; ISON, A.P. Classification and sensitivity analysis of a
proposed primary metabolic reaction network for Streptomyces
lividans. Metabolic Engineering, v. 1, p. 153-165, 1999.
20. DAUNER, M.; SAUER, U. GC-MS analysis of aminoacids rapidly
provides rich information for isotopomer balancing.
Biotechnology Progress, v. 16, p. 642-649, 2000.
21. DE GRAAF, A.A.; STRIEGEL, K.; WITTIG, R.M.; LAUFER, B.;
SCHMITZ, G.; WIECHERT, W.; SPRENGER, G.A.; SAHM, H.
Metabolic state of Zymomonas mobilis in glucose-, fructose-,
and xylose-fed continuous cultures as analysed by
13
C- and
31
P-NMR spectroscopy. Archives of Microbiology, v. 171, p.
371-385, 1999.
114
22. DOMBEK, K.M.; VORONKOVA, V.; RANEY, A.; YOUNG, E.T.
Functional analysis of the yeast Glc7-binding protein Reg1
identifies a protein phosphatase type I-binding motif as
essential for repression of ADH2 expression. Molecular and
Cellular Biology, v. 19, p. 6029-6040, 1999.
23. EDWARDS, J.S.; PALSSON, B.O. How will bioinformatics
influence metabolic engineering? Biotechnology and
Bioengineering, v. 58, p. 162-169, 1998.
24. ENTIAN, K. D.; SCHLLER, H.-J. Glucose repression (carbon
catabolite repression) in yeast. In: Zimmermann, F.K.; Entian,
K.-D., eds. Yeast Sugar Metabolism. Lancaster, Technomic,
1997. p. 409-434.
25. ERTUGAY, N.; HAMAMCI, H. Continuous cultivation of bakers
yeast: change in cell composition at different dilution rates and
effect of heat stress on trehalose level. Folia Microbiologica, v.
42, p. 463-467, 1997.
26. FALCO, S. C.; DUMAS, K.S.; LIVAK, K.J. Nucleotide sequence of
the yeast ILV2 gene which encodes acetolactate synthase.
Nucleic Acids Research, v. 13, p. 4011-4027, 1985.
27. FLICK, J.S., JOHNSTON, M. GRR1 of Saccharomyces cerevisiae is
required for glucose repression and encodes a protein with
leucine-rich repeats. Molecular and Cellular Biology, v. 11, p.
5101-5112, 1991.
28. FOLLSTAD, B.D.; BALCARCEL, R.R.; STEPHANOPOULOS, G.;
WANG, D.I.C. Metabolic flux analysis of hybridoma continuous
culture steady state multiplicity. Biotechnology and
Bioegineering, v. 63, p. 675-683, 1999.
29. GANCEDO, J. M. Yeast carbon catabolite repression.
Microbiology and Molecular Biology Reviews, v. 62, p. 334-
361, 1998.
30. GANCEDO, J. M.; LAGUNAS, R. Contribution of the pentose-
phosphate pathway to glucose metabolism in Saccharomyces
cerevisiae: a critical analysis of the use of labelled glucose.
Plant Science Letters, v. 1, p. 193-200, 1973.
31. GOEL, A.; LEE, J.; DOMACH, M.M.; ATAAI, M.M. Metabolic
fluxes, pools, and enzyme measurements suggest a tighter
coupling of energetics and biosynthetic reactions associated
with reduced pyruvate kinase flux. Biotechnology and
Bioengineering, v. 64, p. 129-134, 1999.
115
32. GOMBERT, A.; NIELSEN, J. Mathematical modelling of
metabolism. Current Opinion in Biotechnology, v. 11, p.
180-186, 2000.
33. GOMBERT, A.K.; DOS SANTOS, M.M.; CHRISTENSEN, B.;
NIELSEN, J. Network identification and flux quantification in
the central metabolism of Saccharomyces cerevisiae under
different conditions of glucose repression. Journal of
Bacteriology, v. 183, p. 1441-1451, 2001.
34. GORDON, D.B. Mass spectrometric techniques. In: WILSON, K.,
WALKER, J.M. eds. Principles and techniques of practical
biochemistry. 4. ed. Cambridge, Cambridge University
Press, 1994. p. 381-424.
35. HAARASILTA, S.; TASKINEN, L. Location of three key enzymes of
gluconeogenesis in bakers yeast. Archives of Microbiology, v.
113, p. 159-161, 1977.
36. HAMPSEY, D.M.; LEWIN, A.S.; KOHLHAW, G.B.
Submitochondrial localization, cell-free synthesis, and
mitochondrial import of 2-isopropylmalate synthase of yeast.
Proceedings of the National Academy of Sciences USA, v.
80, p. 1270-1274, 1983.
37. HOLMS, W.H. The central metabolic pathways of Escherichia coli:
relationship between flux and control at a branch point,
efficiency of conversion to biomass, and excretion of acetate.
Current Topics in Cellular Regulation, v. 28, p. 69-105,
1986.
38. HUA, Q.; YANG, C.; SHIMIZU, K. Metabolic flux analysis for
efficient pyruvate fermentation using vitamin auxotrophic
yeast of Torulopsis glabrata. Journal of Bioscience and
Bioengineering, v. 87, p. 206-213, 1999.
39. HUANG, D.; CHUN, K.T.; GOEBL, M.G.; ROACH, P.J. Genetic
interactions between REG1/HEX2 and GLC7, the gene
encoding the protein phosphatase type I catalytic subunit in
Saccharomyces cerevisiae. Genetics, v. 143, p. 119-127, 1996.
40. JOHNSTON, M. Feasting, fasting and fermenting. Trends in
Genetics, v. 15, p. 29-33, 1999.
41. JRGENSEN, H.; NIELSEN, J.; VILLADSEN, J.; MLGAARD, H.
Metabolic flux distributions in Penicillium chrysogenum during
fed-batch cultivations. Biotechnology and Bioengineering, v.
46, p. 117-131, 1995.
116
42. KATOH, T.; YUGUCHI, D.; YOSHII, H.; SHI, H.; SHIMIZU, K.
Dynamics and modeling on fermentative production of poly (-
hydroxybutyric acid) from sugars via lactate by a mixed
culture of Lactobacillus delbrueckii and Alcaligenes eutrophus.
Journal of Biotechnology, v. 67, p. 113-134, 1999.
43. KLEIN, C. J. L.; RASMUSSEN, J.J.; RNNOW, B.; OLSSON, L.;
NIELSEN, J. Investigation of the impact of MIG1 and MIG2 on
the phisiology of Saccharomyces cerevisiae. Journal of
Biotechnology, v. 68, p. 197-212, 1999.
44. KLEIN, C. J. L.; OLSSON, L.; NIELSEN, J. Glucose control in
Saccharomyces cerevisiae: the role of MIG1 in metabolic
functions. Microbiology, v. 144, p. 13-24, 1998.
45. KRAAKMAN, L.S.; WINDERICKX, J.; THEVELEIN, J.M.; DE
WINDE, J.H. Structure-function analysis of yeast hexokinase:
structural requirements for triggering signalling and catabolite
repression. Biochemical Journal, v. 343, p. 159-168, 1999.
46. KENZI, M.T.; FIECHTER, A. Regulation of carbohydrate
composition of Saccharomyces cerevisiae under growth
limitation. Archives of Mikrobiology, v. 84, p. 254-265, 1972.
47. LEE, W. -N. P.; BERGNER, E.A.; GUO, Z.K. Mass isotopomer
pattern and precursor-product relationship. Biological Mass
Spectrometry, v. 21, p. 114-122, 1992.
48. LEE, W. -N. P.; BYERLEY, L.O.; BERGNER, E.A.; EDMOND, J.
Mass isotopomer analysis: theoretical and practical
considerations. Biological Mass Spectrometry, v. 20, p. 451-
458, 1991.
49. LI, F.N.; JOHNSTON, M. Grr1 of Saccharomyces cerevisiae is
connected to the ubiquitin proteolysis machinery through
Skp1: coupling glucose sensing to gene expression and the cell
cycle. EMBO Journal, v. 16, p. 5629-5638, 1997.
50. LIU, J.-Q.; NAGATA, S.; DAIRI, T.; MISONO, H.; SHIMIZU, S.;
YAMADA, H. The GLY1 gene of Saccharomyces cerevisiae
encodes a low-specific L-threonine aldolase that catalyzes
cleavage of L-allo-threonine and L-threonine to glycine.
Expression of the gene in Escherichia coli and purification and
characterization of the enzyme. European Journal of
Biochemistry, v. 245, p. 289-293, 1997.
51. LUDIN, K.; JIANG, R.; CARLSON, M. Glucose-regulated
interaction of a regulatory subunit of protein phosphatase 1
with the Snf1 protein kinase in Saccharomyces cerevisiae.
117
Proceedings of the National Academy of Sciences USA, v.
95, p. 6245-6250, 1998.
52. LUTFIYYA, L.L.; IYER, V.R.; DERISI, J.; DEVIT, M.J.; BROWN,
P.O.; JOHNSTON, M. Characterization of three related glucose
repressors and genes they regulate in Saccharomyces
cerevisiae. Genetics, v. 150, p. 1377-1391, 1998.
53. LUTFIYYA, L.L.; JOHNSTON, M. Two zinc-finger-containing
repressors are responsible for glucose repression of SUC2
expression. Molecular and Cellular Biology, v. 16, p. 4790-
4797, 1996.
54. MADIGAN, M.T.; MARTINKO, J.M.; PARKER, J. Brock Biology of
Microorganisms. 8. ed. Upper Saddle River, Prentice-Hall,
1997.
55. MARX, A.; DE GRAAF, A.A.; WIECHERT, W.; EGGELING, L.;
SAHM, H. Determination of the fluxes in the central
metabolism of Corynebacterium glutamicum by nuclear
magnetic resonance spectroscopy combined with metabolic
balancing. Biotechnology and Bioengineering, v. 49, p. 111-
129, 1996.
56. MCNEIL, J. B.; MCINTOSH, E.M.; TAYLOR, B.V.; ZHANG, F.;
TANGT, S.; BOGNAR, A.L. Cloning and molecular
characterization of three genes, including two genes encoding
serine hydroxymethyltransferases, whose inactivation is
required to render yeast auxotrophic for glycine. Journal of
Biological Chemistry, v. 269, p. 9155-9165, 1994.
57. MCNEIL, J.B.; BOGNAR, A.L.; PEARLMAN, R.E. In vivo analysis of
folate coenzymes and their compartmentation in
Saccharomyces cerevisiae. Genetics, v. 142, p. 371-381, 1996.
58. MEIJER, M. M. C.; BOONSTRA, J.; VERKLEIJ, A.J.; VERRIPS,
C.T. Glucose repression in Saccharomyces cerevisiae is related
to the glucose concentration rather than the glucose flux.
Journal of Biological Chemistry, v. 273, p. 24102-24107,
1998.
59. MONSCHAU, N.; STAHMANN, K.-P.; SAHM, H.; MCNEIL, J.B.;
BOGNAR, A.L. Identification of Saccharomyces cerevisiae
GLY1 as a threonine aldolase: a key enzyme in glycine
biosynthesis. FEMS Microbiology Letters, v. 150, p. 55-60,
1997.
60. NEHLIN, J. O.; RONNE, H. Yeast Mig1 repressor is related to the
mammalian early growth response and Wilms tumour finger
proteins. EMBO Journal, v. 9, p. 2891-2898, 1990.
118
61. NIELSEN, J. Metabolic engineering: techniques for analysis of
targets for genetic manipulations. Biotechnology and
Bioengineering, v. 58, p. 125-132, 1998.
62. NISSEN, T. Optimisation of ethanol production in
Saccharomyces cerevi si ae by metabolic engineering.
Denmark, 1999. 239 p. Thesis (Ph.D.) - Technical University of
Denmark.
63. NISSEN, T.; SCHULZE, U.; NIELSEN, J.; VILLADSEN, J. Flux
distributions in anaerobic, glucose-limited continuous cultures
of Saccharomyces cerevisiae. Microbiology, v. 143, p. 203-
218, 1997.
64. OLSSON, L.; NIELSEN, J. On-line and in situ monitoring of
biomass in submerged cultivations. Trends in Biotechnology,
v. 15, p. 517-522, 1997.
65. OLSSON, L.; NIELSEN, J. The role of metabolic engineering in the
improvement of Saccharomyces cerevisiae: utilization of
industrial media. Enzyme and Microbial Technology, v. 26,
p. 785-792, 2000.
66. OSTERGAARD, S.; OLSSON, L.; NIELSEN, J. Metabolic
engineering of Saccharomyces cerevisiae. Microbiology and
Molecular Biology Reviews, v. 64, p. 34-50, 2000.
67. STLING, J.; RONNE, H. Negative control of the Mig1p repressor
by Snf1-dependent phosphorylation in the absence of glucose.
European Journal of Biochemistry, v. 252, p. 162-168,
1998.
68. OURA, E. The effect of aeration on the growth energetics and
biochemical compostition of bakers yeast, with an
appendix: Reactions leading to the formation of yeast cell
material from glucose and ethanol. Helsinki, 1972. 124 p.
Thesis (Ph.D.) - Helsinki University.
69. OURA, E. Biomass from carbohydrates. In: Rehm, H.-J.; Reed, G.
eds. Biotechnology. Weinheim, Verlag Chemie, 1983.
70. ZCAN, S.; SCHULTE, F.; FREIDEL, K.; WEBER, A.; CIRIACY, M.
Glucose uptake and metabolism in grr1/cat80 mutants of
Saccharomyces cerevisiae. European Journal of
Biochemistry, v. 224, p. 605-611, 1994.
71. PANDEY, A., MANN, M. Proteomics to study genes and genomes.
Nature, v. 405, p. 837-46, 2000.
119
72. PAPOUTSAKIS, E.T.; MEYER, C.L. Equations and calculations of
product yields and preferred pathways for butanediol and
mixed-acid fermentations. Biotechnology and
Bioengineering, v. 27, p. 50-66, 1985.
73. PRAMANIK, J.; TRELSTAD, P.L.; SCHULER, A.J.; JENKINS, D.;
KEASLING, J.D. Development and validation of a flux-based
stoichiometric model for enhanced biological phosphorous
removal metabolism. Water Reasearch, v. 33, p. 462-476,
1999.
74. RAHNER, A.; HIESINGER, M.; SCHLLER, H.-J. Deregulation of
gluconeogenic structural genes by variants of the
transcriptional activator Cat8p of the yeast Saccharomyces
cerevisiae. Molecular Microbiology, v. 34, p. 146-156, 1999.
75. RANDEZ-GIL, F., BOJUNGA, N., PROFT, M., ENTIAN, K.-D.
Glucose derepression of gluconeogenic enzymes in
Saccharomyces cerevisiae correlates with phosphorylation of
the gene Cat8p. Molecular and Cellular Biology, v. 17, p.
2502-2510, 1997.
76. RONNE, H. Glucose repression in fungi. Trends in Genetics, v.
11, p. 12-17, 1995.
77. ROSE, M; ALBIG, W; ENTIAN, K.D. Glucose repression in
Saccharomyces cerevisiae is directly associated with hexose
phosphorylation by hexokinase PI and hexokinase PII.
European Journal of Biochemistry, v. 199, p. 511-518,
1991.
78. ROSENKRANTZ, M.; KELL, C.S.; PENNELL, E.A.; DEVENISH, L.J.
The HAP2,3,4 transcriptional activator is required for
derepression of the yeast citrate synthase gene, CIT1.
Molecular Microbiology, v. 13, p. 119-131, 1994.
79. RYAN, E. D.; TRACY, J.W.; KOHLHAW, G.B. Subcellular
localization of the leucine biosynthetic enzymes in yeast.
Journal of Bacteriology, v. 116, p. 222-225, 1973.
80. SAUER, U.; LASKO, D.R.; FIAUX, J.; HOCHULI, M.; GLASER, R.;
SZYPERSKI, T.; WTTRICH, K.; BAILEY, J.E. Metabolic flux
ratio analysis of genetic and environmental modulations of
Escherichia coli central carbon metabolism. Journal of
Bacteriology, v. 181, p. 6679-6688, 1999.
81. SAUER, U.; HATZIMANIKATIS, V.; BAILEY, J.E.; HOCHULI, M.;
SZYPERSKI, T.; WTHRICH, K. Metabolic fluxes in riboflavin-
producing Bacillus subtilis. Nature Biotechnology, v. 15, p.
448-452, 1997.
120
82. SCHMIDT, K.; ISAACS, S.H. An evolutionary algorithm for initial
state and parameter estimation in complex biochemical
models. In: COMPUTER APPLICATIONS IN BIOTECHNOLOGY,
6., Garmisch-Partenkirchen, 1995. CAB6: proceedings.
Garmisch-Partenkirchen, Germany, Pergamon, 1995. p. 239-
242.
83. SCHMIDT, K.; MARX, A.; DE GRAAF, A.A.; WIECHERT, W.;
SAHM, H.; NIELSEN, J.; VILLADSEN, J.
13
C tracer
experiments and metabolite balancing for metabolic flux
analysis: comparing two approaches. Biotechnology and
Bioengineering, v. 58, p. 254-257, 1998.
84. SCHUSTER, S.; FELL, D.A.; DANDEKAR, T. A general definition
of metabolic pathways useful for systematic organization and
analysis of complex metabolic network. Nature
Biotechnology, v. 18, p. 326-332, 2000.
85. SHI, H.; NIKAWA, J.; SHIMIZU, K. Effect of modifying metabolic
network on poly-3-hydroxybutyrate biosynthesis in
recombinant Escherichia coli. Journal of Bioscience and
Bioengineering, v. 87, p. 666-677, 1999.
86. SHIRRA, M.K.; ARNDT, K.M. Evidence for the involvement of the
Glc7-Reg1 phosphatase and the Snf1-Snf4 kinase in the
regulation of INO1 transcription in Saccharomyces cerevisiae.
Genetics, v. 152, p. 73-87, 1999.
87. SILVERSTEIN, R.M.; BASSLER, G.C.; MORRILL, T.C.
Spectrometric Identification of Organic Compounds. 5. ed.
New York, John Wiley, 1991.
88. STEPHANOPOULOS, G.; ARISTIDOU, A.A.; NIELSEN, J.
Metabolic Engineering. San Diego, Academic Press, 1998.
89. STEPHANOPOULOS, G.; VALLINO, J.J. Network rigidity and
metabolic engineering in metabolic overproduction. Science, v.
252, p. 1675-1681, 1991.
90. SZYPERSKI, T.
13
C-NMR, MS and metabolic flux balancing in
biotechnology research. Quarterly Reviews in Biophysics, v.
31, p. 41-106, 1998.
91. THEVELEIN, J.M.; DE WINDE, J.H. Novel sensing mechanisms
and targets for the cAMP-protein kinase A pathway in the
yeast Saccharomyces cerevisiae. Molecular Microbiology, v.
33, p. 904-918, 1999.
92. TREITEL, M. A.; KUCHIN, S.; CARLSON, M. Snf1 protein kinase
regulates phosphorylation of the Mig1 repressor in
121
Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology, v.
18, p. 6273-6280, 1998.
93. VALLINO, J.J.; STEPHANOPOULOS, G. Flux determination in
cellular bioreaction networks: applications to lysine
fermentations. In: Sikdar, S .K.; Bier, M.; Todd, P, eds.
Frontiers in Bioprocessing. Boca Raton, CRC Press, 1990. p.
205-219.
94. VALLINO, J.J.; STEPHANOPOULOS, G. Metabolic flux
distributions in Corynebacterium glutamicum during growth
and lysine overproduction. Biotechnology and
Bioengineering, v. 41, p. 633-646, 1993.
95. VAN DIJKEN, J.P. et al. An interlaboratory comparison of
physiological and genetic properties of four Saccharomyces
cerevisiae strains. Enzyme and Microbial Technology, v. 26,
p. 706-714, 2000.
96. VAN GULIK, W.M.; HEIJNEN, J.J. A metabolic network
stoichiometry analysis of microbial growth and product
formation. Biotechnology and Bioengineering, v. 48, p. 681-
698, 1995.
97. VARMA, A.; PALSSON, B.O. Metabolic flux balancing: basic
concepts, scientific and practical use. Bio/Technology, v. 12,
p. 994-998, 1994.
98. VERDUYN, C. Physiology of yeasts in relation to biomass yields.
Antonie van Leeuwenhoek, v. 60, p. 325-353, 1991.
99. VERDUYN, C.; POSTMA, E.; SCHEFFERS, W.A.; VAN DIJKEN,
J.P. Effect of benzoic acid on metabolic fluxes in yeasts: a
continuous-culture study on the regulation of respiration and
alcoholic fermentation. Yeast, v. 8, p. 501-517, 1992.
100. VINCENT, O.; CARLSON, M. Sip4, a Snf1 kinase-dependent
transcriptional activator, binds to the carbon souce-responsive
element of gluconeogenic genes. EMBO Journal, v. 17, p.
7002-7008, 1998.
101. VINCENT, O.; CARLSON, M. Gal83 mediates the interaction of the
Snf1 kinase complex with the transcription activator Sip4.
EMBO Journal, v. 18, p. 6672-6681, 1999.
102. WALKER, M. E.; VAL, D.L.; ROHDE, M.; DEVENISH, R.J.;
WALLACE, J.C. Yeast pyruvate carboxylase: identification of
two genes encoding isoenzymes. Biochemical and
Biophysical Research Communications, v. 176, p. 1210-
1217, 1991.
122
103. WILSON, K. Chromatographic techniques. In: WILSON, K.;
WALKER, J.M. eds. Principles and Techniques of Practical
Biochemistry. 4. ed. Cambridge, Cambridge University
Press, 1994. p. 462-529.
104. WU, J.; TRUMBLY, R.J. Multiple regulatory proteins mediate
repression and activation by interaction with the yeast Mig1
binding site. Yeast, v. 14, p. 985-1000, 1998.
105. WYSOCKI, R.; VAN DYCK, E.; FAIRHEAD, C.; FOURY, F. Mass-
murdering: deletion of twenty-three ORFs from Saccharomyces
cerevisiae chromosome XI reveals five genes essential for
growth and three genes conferring detectable mutant
phenotype. Gene, v. 229, p. 37-45, 1999.
106. YANG, Y.T.; BENNETT, G.N.; SAN, K.Y. Effect of inactivation of
nuo and ackA-pta on redistribution of metabolic fluxes in
Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering, v. 65, p.
291-297, 1999.
107. ZUBAY, G. Biochemistry. 2. ed. New York, Macmillan, 1988.

A- 1
APNDICE

Modelo matemtico (estequiomtrico) utilizado para clculo de
fluxos metablicos em todas as cepas de Saccharomyces cerevisiae
estudadas neste trabalho. O formato de apresentao o do arquivo
utilizado para clculos em MATLAB (The Mathworks, Inc.). As letras
minsculas indicam as transies dos tomos de C em cada reao.

% Consumo de glicose
GLC -> G6P
abcdef abcdef

% Via EMP
G6P -> F6P
abcdef abcdef
F6P +G6P -> G6P + F6P
abcdef ghijkl abcdef ghijkl
F6P -> G3P + G3P
abcdef cba def
G3P -> PEP
abc abc
PEP -> PYRCYT
abc abc

% Via PP
G6P -> CO + P5P
abcdef a bcdef
P5P +P5P -> S7P + G3P
abcde fghij fgabcde hij
S7P + G3P +P5P + P5P -> P5P + P5P + S7P + G3P
fgabcde hij klmno pqrst abcde fghij klpqrst mno
S7P + G3P -> F6P +E4P
abcdefg hij abchij defg
F6P + E4P +S7P + G3P -> S7P + G3P +F6P + E4P
abchij defg klmnopq rst abcdefg hij klmrst nopq
P5P +E4P -> F6P + G3P
abcde fghi abfghi cde
F6P + G3P +P5P +E4P -> P5P +E4P +F6P + G3P
abfghi cde jklmn opqr abcde fghi jkopqr lmn

% Formao de etanol, acetato e glicerol
PYRCYT -> ACA +CO
abc bc a
ACA -> ETH
ab ab

A- 2
ACA -> ACE
ab ab
G3P -> GLYC
abc abc

% Formao de AcCoA no citossol
ACE -> ACCOACYT
ab ab

% Reao anaplertica (citosslica)
PYRCYT + CO -> OAACYT
abc d abcd

% ciclo TCA (considerando embaralhamento dos tomos de C devido simetria
do succinato)
PYRMIT -> ACCOAMIT + CO
abc bc a
OAAMIT + ACCOAMIT -> ICIT
abcd ef dcbafe
ICIT -> AKG + CO
abcdef abcef d
AKG -> FUM + CO
abcde bcde a
FUM +FUM -> OAAMIT + OAAMIT
abcd efgh abcd hgfe
OAAMIT -> FUM
abcd abcd

% Transportes
OAAMIT -> OAACYT
abcd abcd
OAACYT -> OAAMIT
abcd abcd
ACCOACYT -> ACCOAMIT
ab ab
PYRCYT -> PYRMIT
abc abc

% Metabolismo de Thr, Ser e Gly
G3P -> SER
abc abc
SER -> GLY + C1
abc ab c
SER + GLY + C1 -> SER + GLY + C1
abc de f def ab c
A- 3
OAACYT -> THR
abcd abcd
THR -> GLY + ACA
abcd ab cd
GLY + ACA + THR -> THR + GLY + ACA
ab cd efgh abcd ef gh

% Enzima mlica (descarboxilao mitocondrial de MAL)
OAAMIT -> PYRMIT + CO
abcd abc d

% Drenagem de intermedirios para biossntese de macromolculas
G6P -> G6POUT
abcdef abcdef
P5P -> P5POUT
abcde abcde
E4P -> E4POUT
abcd abcd
G3P -> G3POUT
abc abc
PEP -> PEPOUT
abc abc
PYRCYT -> PYRCYTOUT
abc abc
PYRMIT -> PYRMITOUT
abc abc
OAACYT -> OAACYTOUT
abcd abcd
AKG -> AKGOUT
abcde abcde
ACCOACYT -> ACCOACYTOUT
ab ab
ACCOAMIT -> ACCOAMITOUT
ab ab
SER -> SEROUT
abc abc
GLY -> GLYOUT
ab ab
C1 -> C1OUT
a a
GLYC -> GLYCOUT
abc abc
THR -> THROUT
abcd abcd

A- 4
% Produtos excretados
ETH -> ETHOUT
ab ab
ACE -> ACEOUT
ab ab

% formao de CO2
CO -> COOUT
a a