Diagnstico molecular no laboratrio clnico

Reao em cadeia da polimerase

Diagnstico molecular das doenas
genticas

Histria do diagnstico molecular

In other words, if an adenine forms one
member of a pair, on either chain, then on
these assumptions the other member must
be thymine; similarly for guanine and
cytosineIf only specific pairs of bases can
be formed, it follows thatthe sequence
on the other chain is automatically
determined
Watson, J.D. and Crick, F.H.C. (1953) Molecular
structure of nucleic acids. Nature171, 737

Era do diagnstico molecular

Desenvolvimento do PCR reao em cadeia da
polimerase

Amplificao dos genes
a) diagnstico pela presena do gene
b) Preparao para outras etapas diagnsticas
c) Quantificao da expresso gnica

Importncia na pesquisa cientfica (biologia molecular)

Descoberta da estrutura bsica do DNA

Como os genes eram estudados antes do PCR?

1980: Tcnicas de hibridizao: desordens

linfoproliferativas

Objetivos do diagnstico molecular

1. Doenas genticas
2. Doenas infecciosas
a) organismos de cultivo difcil
Mycobacterium tuberculosis
Legionella pneumophilia
b) organismos de cultivo impossvel
Vrus da hepatite B
Papiloma vrus humano
c) agentes altamente infecciosos
Francisella tularensis
Brucella sp
Coccidioidis immitis

Por que o diagnstico das doenas genticas to

especializado?

d) Agentes infecciosos presentes em baixo nmero de

cpias
HIV
Citomegalovrus em rgos transplantados
e) Deteco do agente infeccioso in situ
Toxoplasma gondii
Helicobacter pylori
f) Agentes infecciosos presentes em espcimes pequenos
Lquido intra-ocular
3. Anlise forense
4. Paternidade reversa
5. Predisposio ao cncer
6. Farmacogentica

Objetivos do Projeto Genoma Humano na rea

Genes e doenas

Fentipos peculiares

Descoberta tardia; interveno teraputica

Necessidade tecnolgica

Sndromes diversas

Aconselhamento gentico

1. Diagnstico molecular de doenas

2. Aconselhamento gentico
3. Desenvolvimento de testes genticos
4. Conhecimento de novas doenas
5. Estudo da herana
mendeliana no homem

Organizao do genoma humano

Densidades gnicas

Genoma: 3 bilhes de pares de base

Cromossomo (mdia): 150 milhes
Gene (mdia): 50 mil
Regio codificadora: 3 mil (5-6 xons por gene)
Unidade codificadora: 3
Densidade gnica: varivel

Doenas genticas
1. Anormalidades cromossmicas
2. Mutao gnica em regies codificantes ou
regulatrias
3. Doenas polignicas e multifatoriais
4. Importncia do diagnstico preditivo e interveno
5. Polimorfismo e genotipagem

TESTES GENTICOS
1. Baseados em PCR
2. Tcnicas de Hibridizao
3. Microarranjos de DNA
4. Sequenciamento de cidos nuclicos
5. Citogentica molecular

Reao em cadeia da polimerase

I was working for Cetus, making

oligonucleotides.They were heady
times. Biotechnology was in flower
and one spring night while the
California buckeyes were also in
flower I came across the
polymerase chain reaction. I was
driving with Jennifer Barnett to a
cabin I had been building in
northern California.
She and I had worked and lived
together for two years. She was an
inspiration to me during that time
as only a woman with brains, in the
bloom of her womanhood, can be.
That morning she had no idea
what had just happened. I had an
inkling. It was the first day of the
rest of my life.

Mullis e Faloona, 1987. Specific

synthesis of DNA in vitro via a
polymerase-catalyzed chain reaction

Prmio Nobel de Qumica em 1993

Kary Mullis: o gnio excntrico da
biologia molecular, que revolucionou
o mundo...

Qual foi a grande idia de K. Mullis ?

PCR

Permite a amplificao in vitro de um segmento de DNA
delimitado por oligonucleotdeos inciadores

Componentes da reao
a) DNA molde

Quantidade

Volume

Qualidade (mtodo de extrao)
b) Nucleotdeos

Mistura de desoxinucleotdeos trifosfatados: dNTP

DNA polimerases termoestveis

Alta concentrao de dNTPs

Por que termoestveis ?

Favorece a incorporao incorreta

Diversas enzimas com caractersticas diferentes

Fidelidade, processividade e tamanho do fragmento

Concentrao na reao: entre 20-200

M

Taq DNA polimerase

Escolher a enzima adequada ao propstico

Variedade de polimerases disponveis

Tampo da enzima

Qual a concentrao de enzima que deve ser
utilizada?
a) Pouca enzima = pouco produto

Cloreto ou sulfato de magnsio (fornecido; 50 mM)

Tampes podem conter magnsio

Padronizao do PCR: concentrao de magnsio

b) Muita enzima = reduo da especificidade

Testar: 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5 mM na reao

Usar entre 0,5 a 2,5 U por reao. Em geral 1 U

suficiente

Baixa concentrao de Mg
Aumento da especificidade

Alta concentrao de Mg

1960 Thomas Brock, microbiologista. Como K.

Mullis fazia?

Estabiliza a ligao do primer,

aumenta a sensibilidade mas
pode reduzir a especificidade

Oligonucleotdeos iniciadores (Primers)

Por que necessrio um primer?

Quantos so necessrios ? Por qu?

O primer tem orientao ?

Primer sense e antisense

Outras caractersticas importantes de um bom

par de primers

Usualmente 2 primers

Sntese em suporte slido por empresas especializadas

Caractersticas de um bom primer
a) especfico para a sequncia
b) no deve ligar-se a si prprio = formao de hairpins
c) no deve ligar-se ao outro primer = formao de dmeros
d) tamanho = entre 20-30 nucleotdeos (influencia na Tm)
e) contedo de GC = entre 50 a 60%

Para diagnstico, recomenda-se que os primers estejam
distante 150-500 nucleotdeos

Vrios programas na internet para o desenho de primers

Os primers no devem ser complementares na poro 3,

para evitar a dimerizao
A presena de G, C, GC ou CG na poro 3melhora a
ligao ao DNA alvo
Na poro 3no deve existir mais de 3 C ou G, pois isso
pode favorecer a incorporao incorreta de nucleotdeos
em razo da estabilidade de anelamento

1. Desenho dos primers: ESPECFICOS PARA O

OBJETIVO

b) Exportar a sequncia no formato adequado

Situao problema: diagnstico neonatal da Galactosemia

severa
a) Obteno da sequncia do gene de interesse no GenBank

Quanto utilizar de cada primer na reao?

A REAO

Em geral 0,1-1 M

O primer recebido liofilizado. Como preparar a
soluo estoque?

Como preparar a soluo de trabalho?

Como armazenar?

Como converter M para pmol de primer?

Termociclador

10


Como definir o nmero de ciclos?

Amplificao de um segmento de DNA

Padronizao da reao de PCR

Em geral, 25-35 ciclos

a) Quantidade de DNA molde

Depende da quantidade de molculas de DNA na amostra

original

b) Quantidade de dNTPs
c) Quantidade de DNA polimerase
d) Quantidade de magnsio
e) Quantidade de primers
f) Qualidade da gua a ser utilizada
g) Volume da reao
h) Ordem de adio dos componentes
i) Definio das temperaturas do processo

11

Temperatura de Desnaturao

Definio da temperatura de anelamento

Desnaturao inicial : IMPORTANTE !

Definio de Tm do primer

Desnaturao de cada ciclo

Varia com a salinidade

Relaciona-se com a meia-vida da DNA polimerase

empregada

Tm= 2x(A+T) + 4x(G+C)

Quanto maior a temperatura, maior a especificidade

Anelamento: sempre de 5 a 10C abaixo da Tm

Amostras ricas em GC. Por qu?

Primers no devem possuir mais que 5C de diferena de

Tm

Por exemplo, Taq DNA polimerase perde muito da

atividade acima de 93C

Amplificao inespecfica? Aumentar Tm

Geralmente 94-95C

Tempos: Inicial: 2 minutos; ciclos: 30 segundos

No h amplificao? Reduzir Tm

E o Mg? Determinar em condio de Tm fixa

A medida que a temperatura de anelamento aumenta,

pareamentos imperfeitos so desfeitos e a
especificidade da reao tambm aumenta.
No entanto, em temperaturas de anelamento muito
elevadas podem dificultar a estabilizao e ligao do
primer ao molde
Baixas concentraes de primers ou primers muito
longos necessitam de temperaturas de anelamento
diferenciadas

Quanto tempo dura a etapa de anelamento?

30 segundos a 1 minuto (no mximo)

12

Temperatura de Extenso

Uso de aditivos (enhancers)

a temperatura tima da DNA polimerase empregada

Para amostras com elevado contedo de GC, pode-se

adicionar alguns reagentes (a 10% do volume de reao) para
reduzir a Tm da sequncia alvo:

Por exemplo, para Taq DNA polimerase, 72C

Tempo de extenso: depende do tamanho do fragmento e
da capacidade de polimerizao da enzima

Geralmente; 1 Kb = 1 minuto

Quanto maior o tempo de extenso, maior a sensibilidade

Produtos truncados

Extenso final

Uria, dimetilsulfxido, glicerol, formamida ou

dimetilformamida

Quando a sequncia muito grande, usa-se formamida ou
DMSO.

Quando a quantidade de DNA molde muito pequena,
emprega-se polietilenoglicol para promover reassociaes
macromoleculares por excluso

A albumina do soro bovino pode estabilizar a DNA
polimerase

Deteco do produto de amplificao

Eletroforese em gel
a) Princpio do mtodo
b) Componentes da tcnica
c) Polmeros mais utilizados
d) Mtodos de visualizao do DNA

13

Estratgias diagnsticas

Genotipagem
Objetivos e fundamentos: polimorfismos e mutaes

1. PCR-RFLP

Diagnstico gentico
Risco neonatal

Aplicvel quando a mutao presente em

um gene cria ou elimina um stio que
pode ser reconhecido por uma
endonuclease de restrio

Necessrio saber a sequncia do gene e
da mutao, assim como elaborar o
mapa de restrio dos alelos

Enzimas de restrio

Usos

PCR-RFLP
Restriction
fragment
lenght
polymorfism

14

Diagnstico da anemia falciforme por mutao no gene

codificador da -globina

Pesquisa da mutao de ponto G1691A no fator V Leiden

Quais os gentipos?

Mutao de ponto no xon 10

Significado da mutao conhecida

A troca dos nucleotdeos cria um stio de restrio
extra, que reconhecido pela enzima Mnl I

Esse alelo causa aumento do risco de trombose
venosa e trombofilia durante a gravidez
Alelo selvagem: digesto forma 3 fragmentos: 67 e 116
pares de base
Alelo mutado: digesto forma 2 fragmentos: 67 e 153
pares de base

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PCR-RFLP para genotipagem Duffy

306pb

100 bp

FY B
86pb

400pb

FY A
96pb

210pb

Ban I
novo stio

86pb

Alguns exames realizados

392 pb

300pb

306pb

200pb

210pb

100pb

96pb
86pb

Talassemias e anemia falciforme

Fator V Leiden (PCR-RFLP)
Polimorfismos da protrombina (PCR-RFLP)
Distrofias musculares de Duchene e Becker
Pesquisa molecular em X-frgil para meninos
Pesquisa de 51 mutaes na fibrose cstica
Pesquisa da mutao DF508
Pesquisa da mutao C766T de MTHFR (Tubo neural)

Ban I

stio comum

2. PCR-AFLP

Detecta o alelo mutante quando existe
diferena de tamanho do produto
amplificado a partir do alelo normal e
do alelo mutante

uma tcnica simples e muito
utilizada

16

Tcnicas de
Hibridizao

1. Fundamento do mtodo
2. Dots e blottings
3. Southern, Northern e Western
4. Aplicaes

O que a sonda de DNA?

1. Deteco de uma sequncia especfica de DNA

por hibridizao DNA/DNA em membrana

Sequncia de nucleotdeos que complementar ao

DNA algo

A sonda pode ser especfica para a regio contendo a
mutao ou pode ser projetada para outras regies do
gene

Marcao da sonda

Desenho da sonda e sntese

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Anlise de
polimorfismo por
Southern blottingRFLP

Exemplo: Pesquisa do
X-frgil para meninas

PCR-RFLP e deteco por hibridizao DNA/DNA

Exerccio: PCR-RFLP detectado por Southern blotting

vrios alelos

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Hibridizao para deteco de delees

gnicas

2. Hibridizao alelo-especfica (PCR-ASO)

Uma sonda de DNA pode hibridizar com o alelo
amplificado por PCR

A hibridizao ocorre em condies de alta
estringncia

A sonda marcada com radiao ou reagente
fluorescente.

Os produtos de PCR so hibridizados com as
sondas em um suporte slido

Dot blotting

Uso: Mutao especfica da fibrose cstica F508

Reviso

19

Tcnica
Tcnica

20