Maria Almeida

Universidade de So Paulo
Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz
Avaliao microbiolgica de alfaces (Lactuca sativa) em restaurantes

self-service no Municpio de Limeira - SP
Maria Teresa Trov de Almeida
Dissertao apresentada para obteno do ttulo de

Mestre em Cincias. rea de concentrao: Cincia e
Tecnologia de Alimentos
Piracicaba
2006
Maria Teresa Trov de Almeida

Nutricionista
Avaliao microbiolgica de alfaces (Lactuca sativa) em restaurantes

self-service no Municpio de Limeira - SP
Orientador:
Prof. Dr. CLUDIO ROSA GALLO
Dissertao apresentada para obteno do ttulo de

Mestre em Cincias. rea de concentrao: Cincia e
Tecnologia de Alimentos
Piracicaba
2006
Dados Internacionais de Catalogao na Publicao (CIP)

DIVISO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAO - ESALQ/USP
Almeida, Maria Teresa Trov de

Avaliao microbiolgica de alfaces (Lactuca sativa) em restaurantes self-service no
municpio de Limeira-SP / Maria Teresa Trovo de Almeida. - - Piracicaba, 2006.
91p. : il.
Dissertao (Mestrado) - - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, 2006.
1. Alface 2. Contaminao de alimentos 3. Higiene de alimentos 4. Microbiologia de

alimentos 5. Restaurantes 6. Segurana alimentar I. Ttulo
CDD 664.8
Permitida a cpia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte O autor
Dedico este trabalho ao meu marido Jos Luiz, ao meu

filho Vctor Luiz e minha me Encarnao pela
compreenso, apoio e incentivo durante todo o tempo de
execuo deste projeto.
AGRADECIMENTOS
Agradeo imensamente:
- a Deus por me ajudar a superar as dificuldades vividas durante a elaborao deste
trabalho;
- ao Prof. Dr. Cludio Rosa Gallo pela orientao, apoio, incentivo e amizade;
- ao Prof. Dr. Carlos Tadeu dos Santos Dias pela cooperao e orientao;
- ao Laboratrio de Microbiologia de Alimentos da ESALQ-USP pela contribuio com
os materiais utilizados;
- ao Centro Estadual de Educao Tecnolgica Paula Souza pela concesso do
afastamento parcial para cumprimento dos crditos obrigatrios do curso de PsGraduao de Cincia e Tecnologia de Alimentos;
- s tcnicas do Laboratrio de Microbiologia: Ceclia, Denise e Rose pela ajuda e
orientao;
- s bibliotecrias: Bia, Midiam e Raquel pelo atendimento e orientao; e
- s colegas: Cristiane, Giovana, ris, Jacqueline, Lilia, Maria Rita e Michele pelo apoio e
amizade.
Pode-se viver no mundo uma vida magnfica quando se sabe

trabalhar e amar: trabalhar pelo que se ama e amar aquilo em
que se trabalha. Leon Tolsti
SUMRIO
RESUMO...........................................................................................................................8
ABSTRACT........................................................................................................................9
LISTA DE FIGURAS........................................................................................................10
LISTA DE TABELAS........................................................................................................14
1 INTRODUO..............................................................................................................15
2 REVISO BIBLIOGRFICA........................................................................................18
2.1 Fatores envolvidos no consumo do produto..............................................................18
2.2 Microrganismos de interesse na presente pesquisa.................................................21
2.2.1 Coliformes a 45C...................................................................................................21
2.2.2 Salmonella spp.......................................................................................................21
2.2.3 Staphylococcus coagulase positiva........................................................................23
2.2.4 Aerbios mesfilos.................................................................................................25
2.3 Importncia de higienizao e desinfeco de folhosos...........................................26
2.3.1 Processo de higienizao de utenslios, bancadas e mesas de apoio..................27
2.3.2 Higienizao dos vegetais folhosos.......................................................................27
3 MATERIAL E MTODOS.............................................................................................30
3.1 Obteno de amostras..............................................................................................30
3.2 Anlises microbiolgicas...........................................................................................31
3.3 Preparo das amostras...............................................................................................31
3.4 Microrganismos analisados.......................................................................................32
3.4.1 Nmero mais provvel (NMP) de coliformes totais e fecais...................................32
3.4.2 Pesquisa de Salmonella spp..................................................................................34
3.4.3 Enumerao de Staphylococcus coagulase positiva.............................................38
3.4.4 Contagem total de microrganismos aerbios mesfilos em placas.......................40
3.5 Procedimento das anlises microbiolgicas do produto sob desinfeco em
soluo clorada e em soluo de vinagre.......................................................................41
3.6 Anlise estatstica......................................................................................................42
4 RESULTADOS E DISCUSSO....................................................................................43
4.1 Caracterizao..........................................................................................................43
4.2 Coliformes totais e coliformes a 45C........................................................................48
4.3 Aerbios mesfilos....................................................................................................50
4.4 Salmonella spp..........................................................................................................51
4.5 Staphylococcus coagulase positiva...........................................................................52
4.6 Anlises microbiolgicas realizadas com amostras aps a desinfeco no
Laboratrio de Microbiologia de Alimentos da ESALQ...................................................77
5 CONCLUSES.............................................................................................................81
REFERNCIAS...............................................................................................................83
RESUMO
Avaliao microbiolgica de alfaces (Lactuca sativa) em restaurantes self service
no Municpio de Limeira SP.
Amostras da hortalia alface, pronta para consumo e sem adio de temperos,
foram obtidas de sete restaurantes de padro self-service, que servem refeio por
quilograma. O total de 35 amostras foi coletado em dias alternados e diretamente do
balco de distribuio desses restaurantes na cidade de Limeira-SP. As amostras
foram analisadas com o objetivo de conhecer as condies microbiolgicas de
hortalias folhosas cruas servidas em locais de mesmo padro. Para a realizao das
anlises foram estabelecidos parmetros microbiolgicos, considerando a pesquisa das
seguintes bactrias: coliformes totais, coliformes a 45oC, Salmonella spp, contagem
total de aerbios mesfilos e Staphylococcus coagulase positiva. Os resultados foram
bastante heterogneos, com grande variao nas contagens para coliformes totais,
coliformes a 45oC, e nmeros elevados nas contagens de aerbios mesfilos. Os
dados obtidos mostraram que 31 (88,6%) amostras analisadas apresentaram nveis
elevados de coliformes totais, com variao entre 102 NMPg-1 e 105 NMPg-1 e apenas 4
(11,4%) das amostras apresentaram nveis reduzidos, entre <2 e 8,0 x 101 NMPg-1. Em
relao s bactrias coliformes a 45oC, 14 (40%) das amostras apresentaram
contaminao, consideradas em desacordo com a legislao vigente da Agncia
Nacional de Vigilncia Sanitria ANVISA (BRASIL, 2001) que estabelece limites de
at 102 NMPg-1. Nenhuma amostra revelou-se positiva para Salmonella spp, atendendo
aos parmetros estabelecidos pela ANVISA (BRASIL, 2001) de ausncia em 25g de
produto. Foi detectado Staphylococcus coagulase positiva em 21 (60%) das amostras
considerando contagens superiores a 103 UFCg-1, que o limite mximo tolerado pela
ANVISA (BRASIL, 2001) para outros alimentos, j que para hortalias in natura no h
meno de padres. Deste total de 21 amostras, 2 (9,5%) apresentaram contagens de
104 UFCg-1. Os 7 locais tiveram amostras com contagens totais de aerbios mesfilos
elevadas, entre 105 e 107 UFCg-1: em 6 (17,1%) das amostras as contagens ficaram
entre 105 e 106 UFCg-1 e 29 (82,8%) apresentaram resultados superiores a 106 UFCg-1.
Destas 29 amostras, 11 (37,9%) estiveram acima da 107 UFCg-1. Amostras da hortalia
de mesmo lote foram submetidas a procedimentos higinicos, utilizando soluo
clorada e soluo de vinagre e posterior anlise. Os resultados apresentaram redues
entre 98% e 99% nas contagens das bactrias. Pelos dados obtidos, considera-se que
h falhas decorrentes de prticas inadequadas de manipulao com ausncia ou
deficincia de sanificao, sendo necessrio treinamento de funcionrios e proprietrios
dos locais, visando correo dos problemas, para que se obtenha a qualidade
microbiolgica adequada do produto e assegure a sade do consumidor.
Palavras-chave: Self-service; Salada de alface sem adio de tempero; Avaliao
microbiolgica; Bactrias; Contaminao; Higiene e sade
ABSTRACT
Microbiological analysis of lettuces (Lactuca sativa) at self-service restaurants in
the city of Limeira SP.
Lettuce samples, ready for consumption and without addition of seasoning, were
obtained from seven self-service restaurants which serve food per kilogram. The total of
35 samples was collected on alternate days and directly from food counters at those
restaurants in the city of Limeira/SP. Samples were analyzed with the objective to find
out the microbiological conditions of the raw leafy vegetables served in self-service
restaurants. To carry out the analysis, microbiological standards were set considering
the research on the following bacteria: total coliforms, coliforms at 45oC, Salmonella spp,
total counting of aerobic mesophiles and Staphylococcus coagulase positive. The
results were very heterogeneous due to the great variation on counting for total
coliforms, coliforms at 45oC, as well as the high level of the numbers of aerobic
mesophiles. The data obtained showed that 31 (88.6%) samples presented high level of
total coliforms, varying between 102 NMPg-1 and 105 NMPg-1 and only 4 (11.4%)
samples presented reduced level, between < 2 and 8.0 x 101 NMPg-1. Considering the
coliform bacteria at 45oC, 14 (40%) samples presented fecal contamination and this is at
variance with the current legislation of the National Agency of Sanitary Vigilance
ANVISA (BRAZIL, 2001), which establishes limits up to 102 NMPg-1. No samples
showed to be positive for Salmonella spp, following the ANVISA (BRAZIL, 2001)
standards which establish absence in 25g of product. Staphylococcus coagulase
positive was detected in 21 (60%) samples considering counting superior to 103 UFCg-1,
which is the maximum limit tolerated by ANVISA (BRAZIL, 2001) for other foods, as for
leafy vegetables in natura there are no standards. From this total of 21 samples, 2
(9.5%) showed 104 UFCg-1. The seven self-service restaurants showed high level for
total counting of aerobic mesophiles, between 105 and 107 UFCg-1: 6 samples (17.1%)
showed counting between 105 and 106 UFCg-1 and 29 (82.8%) presented results above
106 UFCg-1. From these 29 samples, 11 (37.9%) were above 107 UFCg-1. Leafy
vegetables samples from the same batch underwent to hygienic procedures using a
chlorine solution and a vinegar solution for posterior analysis. The results showed
reduction of the bacteria counting between 98% and 99%. The data obtained show that
there is inappropriate food handling with absence of or deficiency of sanitation,
indicating a training need for the staff and shop owners, so that problems can be
corrected to obtain products with appropriate microbiological quality and to assure
consumers health.
Key-words: Self-service; Lettuce salad without seasoning; Microbiological analysis;
Bacteria; Contamination; Hygiene and health
10
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 -
Procedimento para preparo das diluies.................................................. 32
Figura 2 -
Contagem de Coliformes totais e Coliformes fecais pelo mtodo do

nmero mais provvel (NMP)..................................................................... 33
Figura 3 -
Kit 1-2 Test para Salmonella spp. da Bio Control.................................... 35
Figura 4 -
Imunobanda caracterstica de positividade para Salmonella..................... 36
Figura 5 -
Procedimento para deteco de Salmonella spp....................................... 37
Figura 6 -
Deteco de Staphylococcus coagulase positiva....................................... 39
Figura 7 -
Procedimento analtico para deteco de aerbios mesfilos................... 40
Figura 8 -
Percentual de amostras em acordo e em desacordo comparados ao

limite permitido pela RDC n 12 de 02.01.01, referente ao NMPg-1 de
coliformes a 45Cg-1 (Local A).................................................................... 55
Figura 9 -
Percentual de amostras com resultados em acordo e em desacordo

comparados ao limite da especificao microbiolgica adotada para o
estudo, referente contagem total em placas para aerbios mesfilos
(Local A)..................................................................................................... 55
Figura 10 - Percentual de amostras com resultados em acordo e em desacordo

estudo, referente a Staphylococcus coagulase positiva (Local A)............. 56
11
Figura 11 - Percentual de amostras em acordo e em desacordo comparados ao

coliformes a 45Cg-1 (Local B).................................................................... 57
(Local B)..................................................................................................... 58
estudo, referente a Staphylococcus coagulase positiva (Local B)............. 59
coliformes a 45Cg-1 (Local C).................................................................... 60
(Local C)..................................................................................................... 61
estudo, referente a Staphylococcus coagulase positiva (Local C)............. 62
coliformes a 45Cg-1 (Local D).................................................................... 63
12

(Local D)..................................................................................................... 64
estudo, referente a Staphylococcus coagulase positiva (Local D)............. 65
coliformes a 45Cg-1 (Local E).................................................................... 66
(Local E)..................................................................................................... 67
estudo, referente a Staphylococcus coagulase positiva (Local E)............. 68
coliformes a 45Cg-1 (Local F).................................................................... 69
(Local F)..................................................................................................... 70
13

estudo, referente a Staphylococcus coagulase positiva (Local F)............. 70
coliformes a 45Cg-1 (Local G).................................................................... 72
(Local G)..................................................................................................... 73
estudo, referente a Staphylococcus coagulase positiva (Local G)............. 73
Figura 29 - Percentual de adequao dos resultados das anlises microbiolgicas
apresentados pelos 07 locais, envolvidos no estudo................................. 75
Figura 30 - Ilustrao das condies microbiolgicas dos locais em relao aos
microrganismos estudados......................................................................... 77
14
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 -
Resultados das anlises microbiolgicas................................................... 43
Tabela 2 -
Locais e datas das coletas......................................................................... 45
Tabela 3 -
Horrios das coletas nos 07 locais............................................................ 46
Tabela 4 -
Nmero de pessoas por local nos horrios das coletas............................. 46
Tabela 5 -
Produto picado por local e coleta............................................................... 47
Tabela 6 -
Temperatura ambiente por local e coleta................................................... 48
Tabela 7 -
Coeficiente de variao (%)....................................................................... 75
Tabela 8 -
Comparativo entre os locais atravs da mdia, segundo as variveis,

coliformes totais, coliformes 45C, aerbios mesfilos e Staphylococcus
coagulase positiva...................................................................................... 76
Tabela 9 -
Resultados das anlises microbiolgicas do produto aps desinfeco

no Laboratrio de Microbiologia de Alimentos da ESALQ......................... 78
15
1 INTRODUO
A alimentao tende a ser mais diversificada quando so considerados fatores

como: aumento de renda, situao geogrfica e abastecimento de alimentos.
A sade e a alimentao so produtos de uma relao ecolgica onde a
economia e a educao desempenham papel preponderante.
O consumo de alimentos deve promover satisfao, ser disponvel e diversificado
em quantidade e qualidade nutricional, alm de ser livre de contaminaes que possam
levar ao desenvolvimento de doenas de origem alimentar.
Nas ltimas dcadas, a situao do pas relacionada aos hbitos alimentares tem
sofrido modificaes. A rpida urbanizao da populao brasileira e a sua
concentrao nas grandes metrpoles vm revolucionando a alimentao do brasileiro.
A refeio fora de casa passa a dominar a alimentao no Brasil.
A falta de tempo disponvel para a preparao dos alimentos e/ou para o
consumo vem despertando a preferncia dos consumidores por refeies mais
convenientes no que se refere facilidade de aquisio e preparo. Este fato explica a
abertura dos restaurantes de padro self-service, segmento em alto crescimento. Este
crescimento apresenta pontos positivos, tais como: a variedade de opes, a rapidez de
atendimento e, s vezes, o custo mais acessvel. Entretanto, alguns fatores preocupam
profissionais da rea de alimentao quanto insegurana dos alimentos, devido ao
maior tempo de exposio em temperaturas inadequadas, alm de erros e excessos
cometidos pela clientela na composio dos pratos.
Essa mudana de comportamento trouxe expanso do mercado de alimentos,
atingindo setores da agricultura, indstria e comrcio.
Calcula-se que o potencial
terico das refeies coletivas no Brasil seja superior a 40 milhes de unidades

diariamente, o que indica que o segmento ainda tem muito a crescer, conforme a
Associao Brasileira das Empresas de Refeies Coletivas ABERC (2005).
Atualmente, com o crescente interesse do meio cientfico e da populao em
geral no que diz respeito ao tratamento e/ou preveno de doenas atravs da
16
alimentao, uma nova categoria de alimentos, batizados de alimentos funcionais ou

nutracuticos, tem sido adequadamente pesquisada.
Dentre os vrios alimentos/nutrientes pesquisados, certamente as fibras
alimentares so as que tm recebido maior ateno devido s suas propriedades
funcionais cientificamente comprovadas.
A partir da dcada de 1970, a fibra passou a ter importncia como constituinte
necessria de uma dieta normal, em funo dos primeiros estudos epidemiolgicos que
mostravam a incidncia de doenas crnicas intestinais nos pases desenvolvidos do
ocidente, como: constipao, diverticulites e cncer do intestino grosso, as quais foram
relacionadas insuficincia de fibra na dieta. A preveno e atenuao de doenas
cardiovasculares, diabetes e obesidade, tais como determinadas respostas fisiolgicas
foram consideradas posteriormente como evidncias associadas ingesto de fibra
alimentar (CORRA, 2002).
Os vegetais folhosos destacam-se entre os alimentos ricos em fibra e observa-se
que os hbitos alimentares quanto ao consumo de folhosos vem melhorando. Pode-se
perceber a preocupao de redes de fast food em lanar, junto com outras novidades,
pratos base de folhosos como alternativa para os consumidores adeptos e
freqentadores de tais locais. Neste contexto, os restaurantes de padro self-service
tm cada vez mais ampliado a opo em torno de folhosos, apresentando-os crus e
sem adio de molhos gordurosos, propiciando desta forma realmente uma alternativa
ao consumidor j bem mais preocupado com a sade.
A higiene destes alimentos de extrema importncia e caracteriza-se pelos
processos que os tornam adequados para o consumo, envolvendo para isso a
utilizao de tcnicas e produtos para limpeza e desinfeco.
Para garantir a segurana destes alimentos a Resoluo - RDC n 12, de 02 de
janeiro de 2001 da Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria ANVISA (BRASIL, 2001),
estabeleceu padres microbiolgicos em relao s bactrias Salmonella spp e
Coliformes a 45C. Segundo tais padres, hortalias cruas no devem apresentar
Salmonella spp em 25 g de produto e para Coliformes a 45C a tolerncia para amostra
indicativa de 102 NMPg-1.
17
Considerando o envolvimento da bactria Staphylococcus aureus em surtos de

intoxicao alimentar, as amostras de alfaces, coletadas nos locais em estudo desta
pesquisa, foram submetidas s anlises microbiolgicas para a deteco dessas
bactrias atravs do mtodo tradicional para a estimativa das unidades formadoras de
colnias por grama de produto.
A tolerncia para amostra indicativa teve como parmetro para contagem em
placas 103 UFCg-1, que o limite mximo tolerado para outros alimentos crus, uma vez
que a ANVISA (BRASIL, 2001) no menciona padro dessas bactrias para alfaces.
Na literatura, a International Commission on Microbiological Specifications for
Foods - ICMSF (1978) e Leito (1981) recomendam alguns grupos de microrganismos
para a avaliao microbiolgica, incluindo microrganismos no patognicos cuja
presena em maior ou menor nmero indicativa das condies da matria-prima e do
processamento utilizado. So includos neste grupo microrganismos mesfilos e
psicrotrficos.
Considerando as caractersticas do alimento em estudo, foram realizadas
anlises microbiolgicas para contagem padro em placas de microrganismos aerbios
mesfilos, adotando-se como parmetro a tolerncia de at 106 UFCg-1, visto que
valores acima deste podem indicar: exposio contaminao ambiental; permanncia
por tempo prolongado em temperatura inadequada de refrigerao; e armazenamento
em temperatura morna, que so fatores que colaboram para a perda da qualidade do
produto com provvel deteriorao.
Dado o interesse pelo consumo alimentar de folhosos crus e a preocupao com
a qualidade microbiolgica, o presente trabalho teve os objetivos de levantar a situao
da presena de bactrias patognicas e/ou indicadoras de condies higinicosanitrias em alfaces e identificar possveis falhas nos locais de amostragem para,
dependendo do interesse dos proprietrios dos estabelecimentos, tentar implementar
sistemas de controle de qualidade dos alimentos oferecidos. Se tal contato direto com
os proprietrios no acontecer, espera-se que tais resultados se tornem de domnio
pblico para que possam servir de subsdios aos rgos responsveis com a finalidade
de intensificar treinamentos, orientaes e autuaes.
18
2 REVISO BIBLIOGRFICA
2.1 Fatores envolvidos no consumo do produto
Os alimentos de origem vegetal so geralmente consumidos na sua forma crua e

tm recebido, cada vez mais, preferncia na dieta humana. Entretanto, a busca por
uma alimentao mais saudvel vem aumentando o risco de transmisso de doenas
veiculadas por estes alimentos, em funo das condies em que o produto exposto
durante o perodo de produo e distribuio (GARG; CHUREY; SPLITTSTOESSER,
1990; MADDEN, 1992).
O perfil microbiolgico de alimentos vegetais depende de diversos fatores que
vo desde as etapas de produo primria at o seu preparo para o consumo final
(BRACKETT, 1992). O solo parece ser o responsvel pela maioria das contaminaes,
seguido da utilizao de gua no tratada para irrigao e condies imprprias de
lavagem e estocagem (ODUMERU et al., 1997).
A qualidade e segurana microbiolgica desses alimentos podem tambm ser
comprometidos por manipulao incorreta e utilizao de equipamentos no sanitizados
que contribuem para o aumento das populaes microbianas e contaminao cruzada
por patognicos. Procedimentos de corte e retirada de casca levam, geralmente, ao
aumento do nmero de microrganismos e a diminuio da vida til (BRACKETT, 1992).
Storck e Dias (2003) relataram que preparaes, como saladas, ficam expostas
nos bufs de vrios restaurantes, por longo perodo e, na maioria das vezes, sob uma
temperatura inadequada, ou seja, acima de 10C, colocando em dvida a qualidade da
refeio servida.
O binmio tempo-temperatura constitui-se em um fator muito importante na
distribuio de refeies, devendo ser monitorado diariamente com o auxlio de
termmetros, sendo que o responsvel pelo restaurante deve estar consciente desta
necessidade (SILVA JUNIOR, 2002).
19
Andr et al., (1999), verificaram a temperatura de saladas de vegetais com

maionese em restaurantes comerciais self-service, que servem por quilograma, e
encontraram temperaturas que variaram entre 14,7C e 34,2C, revelando que todas as
amostras apresentavam-se com valores de temperatura acima de 10C, no
obedecendo aos critrios preconizados para armazenamento de pratos frios.
O controle inadequado da temperatura dos alimentos uma das causas mais
freqentes de enfermidades transmitidas pelos alimentos ou da deteriorao destes
FAO (2003).
Estudos realizados por Storck e Dias (2003) mostraram que o hbito de realizar
as refeies fora de casa est se tornando cada vez mais rotineiro e uma das formas
para atender esta demanda so os restaurantes self-service, que servem por
quilograma.
Os proprietrios destes locais, por serem leigos em sua maioria, no tm
preocupao de praticar sistemas de controle que assegurem um padro de qualidade
aos alimentos oferecidos nesses estabelecimentos (DAMASCENO et al., 2002).
Conforme Gonalves (1998), a maioria dos casos de doenas de origem
microbiana, transmitidas por alimentos, est relacionada ao mau acondicionamento dos
mesmos, contaminao cruzada, deficiente higiene pessoal e de equipamentos,
manipuladores infectados, entre outros.
As toxinfeces alimentares, enfermidades causadas pela ingesto de alimentos
contaminados e/ou substncias txicas, constituem um importante problema sanitrio
cujo dimensionamento dificultado no Brasil devido a no obrigatoriedade de
notificao dos surtos (EIROA, 1989).
Frutas e vegetais consumidos crus so associados s doenas de origem
alimentar. A higienizao com gua diminui, mas no elimina a contaminao.
Recentemente, surtos tm ocorrido com frutas e outros vegetais frescos, processados
em condies sanitrias insatisfatrias, conforme o Center for Disease Control and
Prevention CDC (2006).
Em pases desenvolvidos, os registros demonstram que 60% dos surtos de
toxinfeco alimentar so causados pelo consumo de alimentos contaminados servidos
em restaurantes (LIMA; MELO; SENA, 1998).
20
Os alimentos, h muito tempo, tm sido alvo de preocupao de rgos

governamentais e epidemiolgicos em virtude de suas propriedades. Buscando
minimizar esses problemas, normas so ditadas pelos rgos governamentais
competentes,
envolvendo
colheita,
conservao,
manipulao,
transporte,
armazenamento e distribuio dos alimentos nas diversas etapas do processo de

produo (BOULOS; BUNHO, 1999).
A segurana o atributo de qualidade mais desejvel. Assim, os produtos
hortcolas devem ser isentos de toda e qualquer substncia qumica que possa causar
danos sade do consumidor. Os padres de qualidade pr-estabelecidos por leis
federais ou estaduais visam preservao da sade pblica, com base na preveno
do desenvolvimento de microrganismos patognicos ou prejudiciais, bem como a
proteo contra a presena de substncias txicas ou contaminantes, que podem ser
resduos de defensivos ou de outros produtos (CHITARRA, 2000).
Prticas higinicas eficientes so necessrias em cada etapa da cadeia
alimentar, desde a produo at o consumo dos alimentos.
Na literatura, so encontradas citaes que revelam a ausncia de boas prticas
de manipulao para saladas cruas servidas em restaurantes, fato este que se constitui
em risco sade do consumidor (DAMASCENO et al., 2002; NASCIMENTO;
MARQUES, 1998; PAL et al., 2002; SIQUEIRA et al., 1997). Estas constataes
apontam para a necessidade de promover uma avaliao das condies higinicosanitrias desses locais.
O sistema de Anlise dos Perigos e Pontos Crticos de Controle (APPCC) uma
proposta sistematizada de identificao, determinao e controle de perigos, tendo as
Boas Prticas de Fabricao (BPF) como pr-requisitos (APPCC, 1997).
21
2.2 Microrganismos de interesse na presente pesquisa
2.2.1 Coliformes a 45C
Coliformes a 45C so bactrias na forma de bastonetes Gram-negativos, no

esporognicos, aerbios ou anaerbios facultativos, capazes de fermentar a lactose
com produo de gs, em 24 horas a 44,5 - 45,5C, sendo membros do grupo das
bactrias coliformes fecais (SILVA; JUNQUEIRA; SILVEIRA, 2001).
A definio tem como princpio, indicar apenas os coliformes originrios do trato
gastrintestinal. Atualmente, reconhece-se que o grupo dos coliformes fecais abrange
pelo menos trs gneros: Escherichia, Enterobacter e Klebsiella, dos quais dois
(Enterobacter e Klebsiella) incluem cepas de origem no fecal (SILVA; JUNQUEIRA;
SILVEIRA, 2001).
Os microrganismos causadores de doenas alimentares podem ser transmitidos
pelos dedos de manipuladores de alimentos com hbitos de higiene insatisfatrios, por
insetos voadores ou rasteiros e tambm pela gua (JAY, 2005).
Estudos desenvolvidos por Siqueira et al. (1997), em saladas cruas servidas em
restaurantes, detectaram a presena de coliformes fecais em nveis acima dos
tolerados, indicando condies insatisfatrias para o produto.
Damasceno et al. (2002) e Pal et al. (2002) analisaram hortalias frescas e
saladas cruas em restaurantes de padro self-service e constataram a presena de
coliformes fecais em nveis insatisfatrios quando comparados legislao vigente.
2.2.2 Salmonella spp
Salmonelas so bactrias na forma de bacilos Gram-negativos, no esporulados.

O gnero compreende cerca de 2.000 sorotipos (HAYES,1993).
22
Segundo Jay (2005), algumas mudanas ocorreram na taxonomia de

Salmonella, sendo que todas as espcies foram agrupadas em apenas duas espcies:
a Salmonella entrica e a S. bongori, e 2.000 ou mais sorovares foram divididos em
cinco subespcies ou grupos.
O gnero Samonella pertence famlia Enterobacteriaceae, sendo anaerbios
facutativos, com produo de gs a partir de glicose (exceto S. typhi) e capazes de
utilizar o citrato como nica fonte de carbono. A maioria mvel, pela presena de
flagelos peritrquios, exceo feita S. pullorum e S. gallinarum, que so imveis
(FRANCO; LANDGRAF, 2003).
A taxonomia do gnero Salmonella baseada na composio de seus antgenos
de superfcie, que so os antgenos somticos (O), os flagelares (H) e os capsulares
(Vi). O antgeno O localiza-se na frao lipopolissacardica (LPS) da membrana externa.
Essa frao constituda de um lipdeo, denominado lipdio A, responsvel pelo efeito
txico (endotoxina). Os antgenos H so de natureza protica. Os antgenos O e Vi so
termorresistentes, no sendo destrudos pelo aquecimento a 100C por 2 horas e os
antgenos H so termolbeis (FRANCO; LANDGRAF, 2003).
As salmonelas multiplicam-se em temperaturas entre 7C e 49,5C, sendo 37C a
temperatura tima para desenvolvimento, na qual em 4 horas, o alimento contaminado
pode transformar-se em alimento infectante. Abaixo de 7C, para a maioria dos
sorotipos, no h multiplicao (GERMANO; GERMANO, 2003).
Alimentos mais comumente envolvidos em surtos por Salmonella so os
produtos lcteos (leite e queijos cremosos), ovos (pudins, gemadas, licores de ovos,
maionese), carnes e produtos derivados de bovinos, de sunos e de aves. Ainda so
apontados como responsveis pela ocorrncia de surtos de salmonelose: peixes,
camares, levedura de cerveja, coco, molho e tempero de salada, sobremesas
recheadas com cremes, gelatina em p, manteiga de amendoim, cacau, chocolate em
p, suco de laranja no pasteurizado (GERMANO; GERMANO, 2003).
Seres humanos podem disseminar salmonelas para outros seres humanos.
Portadores assintomticos e pessoas doentes, que excretam salmonelas nas fezes,
podem contaminar suas mos. Se pessoas com as mos contaminadas estiverem
envolvidas na preparao de alimentos, elas podem inocular a Salmonella. Se o
23
alimento for estocado em local no refrigerado por algumas horas, a bactria pode
multiplicar-se, alcanando nmero suficiente para causar doena naqueles que o
ingerirem (PELCZAR; CHAN ; KRIEG, 1997).
Pal et al. (2002), avaliando amostras de hortalias frescas em restaurantes selfservice, encontraram Salmonella em saladas de alface.
Damasceno et al. (2002) e Azerdo; Conceio e Stamford (2004) estudaram as
condies higinicas de restaurantes e de saladas cruas por eles servidas e no
detectaram a presena dessa bactria no produto.
2.2.3 Staphylococcus coagulase positiva
De acordo com Martins (2000), os estafilococos so cocos Gram-positivos,

catalase positivos, que tendem a formar agrupamentos semelhantes a cachos de uva.
Atualmente o gnero Staphylococcus composto por aproximadamente 27 espcies,
algumas mais freqentemente associadas a uma ampla variedade de infeces de
carter oportunista, tanto em seres humanos quanto em animais. Entre elas se
destacam, em patologia humana, as espcies: Staphylococcus aureus, Staphylococcus
epidermidis,
Staphylococcus
saprophyticus
Staphylococcus
haemolyticus.
Tradicionalmente os estafilococos so divididos em duas categorias: coagulase

positivos e negativos. Entre os que so considerados coagulase positivos,
Staphylococcus aureus representa a espcie com maior probabilidade de envolvimento
em infeces humanas.
Os estafilococos so bactrias mesfilas que apresentam crescimento em
temperatura na faixa de 7C a 47,8C; as enterotoxinas so produzidas entre 10C e
46C, com tima produo entre 40C e 45C. Os extremos de temperatura dependem
de outros parmetros que devem encontrar-se em condies timas. Considera-se que
surtos de intoxicao alimentar so provocados por alimentos que permaneceram neste
intervalo de temperatura por tempo varivel, de acordo com o nvel de inculo e
temperatura de incubao. De modo geral, quanto mais baixa for a temperatura, maior
24
ser o tempo necessrio para a produo de enterotoxina. Em condies timas, a

enterotoxina torna-se evidente entre quatro e seis horas (FRANCO; LANDGRAF, 2003).
As bactrias deste gnero toleram concentraes de 10% a 20% de NaCl e
nitratos, tornando os alimentos curados veculos potenciais para as mesmas (FRANCO;
LANDGRAF, 2003).
Em relao ao pH, S. aureus cresce na faixa de 4,0 a 9,8, com o timo entre
6,0 e 7,0 (FRANCO; LANDGRAF, 2003).
De acordo com Franco e Landgraf (2003), quando se considera a Aa (Atividade
de gua), os estafilococos so os nicos capazes de crescerem em valores inferiores
aos normalmente considerados mnimos para as bactrias no-halfilas. O valor
mnimo da Aa considerado de 0,86 apesar de, sob condies ideais, esta bactria j
ter se desenvolvido em Aa de 0,83.
Conforme a ICMSF (1996), a bactria S.aureus compete mal com outras
bactrias e por isto raramente causa intoxicao alimentar em produtos crus; uma
exceo o leite cru de vaca com mastite.
Hobbs e Roberts (1993) relatam que a ocorrncia dos primeiros surtos por
toxinfeces estafiloccicas foram provocadas pela contaminao proveniente das
mos e falhas no tempo e na temperatura que permitiram a multiplicao da bactria.
Os alimentos tambm podem ser contaminados por S.aureus atravs de prticas
higinicas inadequadas em qualquer etapa do processamento, portanto o controle
obtido protegendo os alimentos (ICMSF, 1996).
Durante anos a bactria S. aureus foi considerada a nica espcie do gnero
Staphylococcus capaz de produzir enterotoxinas, bem como de produzir coagulase, at
que outras espcies produtoras de coagulase, tais como S. hyicus e S. intermedius,
foram identificadas e, inclusive, surtos de intoxicao foram atribudos a estas duas
espcies (SILVA; GANDRA, 2004).
Compatibilizando a legislao brasileira a estes fatores, e devido a grande
semelhana fenotpica entre as trs espcies de Staphylococcus, foram estipulados
limites para presena de estafilococos coagulase positiva em alimentos pela Agncia
Nacional de Vigilncia Sanitria - ANVISA (BRASIL, 2001), enquanto que a anterior,
25
Portaria 451, de 19 de setembro de 1997, estipulava parmetros para contagens de S.

aureus.
Como caracterstica da doena, S. aureus causa intoxicao proveniente da
ingesto do alimento contendo a toxina pr-formada. Deste modo, o agente causal no
a bactria em si, mas vrias toxinas (A, B, C1, C2, C3, D, E) formadas por esta
bactria, conhecidas como enterotoxinas. Atualmente, sabe-se que as espcies S.
intermedius e S. hyicus tambm so capazes de produzir tais toxinas (FRANCO;
LANDGRAF, 2003).
O perodo de incubao mdio da doena de duas a quatro horas (de 30
minutos a 8 horas). O incio dos sintomas , geralmente, rpido e de natureza aguda,
variando com o grau de suscetibilidade do indivduo, concentrao da enterotoxina no
alimento, quantidade consumida do alimento e o estado pregresso do paciente
(GERMANO; GERMANO, 2003).
Os principais sintomas so nuseas, vmitos, clicas abdominais e diarria. Em
geral no h febre. Nos casos mais graves pode ocorrer cefalia e prostrao. A
recuperao, na maior parte dos casos, d-se de 24 a 48 horas (GERMANO;
GERMANO, 2003).
Pal et al. (2002), em estudo de avaliao microbiolgica de frutas e hortalias
frescas em restaurantes self-service, detectaram duas cepas de Staphylococcus
produtoras de enterotoxinas, isoladas de salada de alface.
2.2.4 Aerbios mesfilos
Os microrganismos aerbios mesfilos no esto diretamente relacionados com

a sade do homem, sendo sua presena ou contagem indicadora de deteriorao ou
contato excessivo ambiental (SILVA JUNIOR, 2002).
Azerdo; Conceio e Stamford (2004), ao realizarem estudo com o objetivo de
caracterizar a qualidade higinico-sanitria das refeies servidas no Restaurante
Universitrio de Joo Pessoa (RUJP) Campus I, verificaram que 10 (31,25%)
26
amostras positivas (incluindo arroz, carne guisada, farofa de cuscuz, feijo, lingia e
salada crua) apresentavam elevada contagem de bactrias aerbias mesfilas com
valores mximos oscilando entre 8x102 a 8x105 UFCg-1.
Segundo Franco e Landgraf (2003), a contagem elevada desse grupo de
bactrias nos alimentos no perecveis indicativa do uso de matria-prima
contaminada ou processamento insatisfatrio, sob o ponto de vista sanitrio. Em
relao aos alimentos perecveis, pode indicar abuso durante o armazenamento em
relao ao binmio tempo/temperatura. A deteriorao de alimentos pode ser causada
por nmeros elevados, considerando-se que alteraes nos alimentos so detectveis
em contagens superiores a 106 UFCg-1.
Leite Jnior et al. (2000) fizeram aluso ao fato da elevada presena de bactrias
mesfilas em carne de sol, o que para eles indica que o produto foi preparado com
matria-prima altamente contaminada, que o processamento foi insatisfatrio do ponto
de vista sanitrio e que o alimento foi mantido em condies inadequadas de tempo e
temperatura. Contagens de aerbios mesfilos elevadas, as quais possuem
temperaturas timas de crescimento prximas a do corpo humano, significam que pode
ter ocorrido multiplicao de bactrias patognicas de origem humana ou animal.
2.3 Importncia da higienizao e desinfeco de folhosos
A higiene dos alimentos se caracteriza, principalmente, por processos pelos

quais os alimentos se tornam higinica e sanitariamente adequados para o consumo,
abrangendo a utilizao de tcnicas de processamento, utilizando o calor ou o frio para
a garantia dos produtos, e tambm o uso de tcnicas e produtos para limpeza e
desinfeco de vrios gneros de alimentos (SILVA JUNIOR, 2002).
Segundo Andrade e Macdo (1996), o uso de sanificantes visa eliminar
microrganismos patgenos das superfcies de equipamentos e utenslios que entram
em contato com alimentos, contribuindo para melhoria da qualidade microbiolgica e
27
higinico-sanitria dos alimentos, evitando riscos sade do consumidor pela

veiculao de patgenos.
Como procedimentos gerais para este tipo de produto, ou seja, folhosos crus, a
ABERC (2001) recomenda preparar um local prprio para higienizao, como
bancadas, cubas, panelas e monoblocos, fazendo a desinfeco destes locais.
2.3.1 Processo de higienizao de utenslios, bancadas e mesas de apoio
Visando garantir a adequada manuteno da higiene de utenslios, bancadas e

mesas de apoio, os quais entram em contato direto com o produto, a ABERC (2001)
considera necessrio seguir criteriosamente alguns procedimentos de higiene, os quais
compreendem desde a retirada de resduos, aplicao de gua e detergente com
posterior enxge e desinfeco utilizando soluo clorada a 200ppm por 15 minutos
ou borrifar lcool 70%.
2.3.2 Higienizao dos vegetais folhosos
Estudo realizado por Leito et al. (1981) mostrou a eficcia da higienizao de

verduras, sendo que a lavagem inicial das folhas resultou na eliminao de 74% da
microbiota bacteriana. A eficincia do hipoclorito de sdio a 200ppm entre 15 e 20
minutos resultou na eliminao de 93,2% para contagem total em placas e 94,5% para
coliformes totais. Quando analisados comparativamente, o vinagre diludo a 2% com
imerso entre 15 e 20 minutos foi mais eficiente que o cloro, apresentando redues de
98,0% para contagem total em placas e 99,8% para coliformes totais.
A seguir esto relacionadas as etapas
adequada higienizao e desinfeco de folhosos.
consideradas necessrias para a
28
Conforme Leito et al. (1981) e Silva Junior (2002), depois de desprezadas as

partes estragadas, deve-se lavar em gua corrente potvel folha a folha e em seguida
deve-se proceder a etapa de desinfeco.
Considerando a Portaria no 6 do Centro de Vigilncia Sanitria, So Paulo, de 10
de maro de 1999 CVS-6 (SO PAULO,1999) so recomendadas as seguintes
diluies: 10 mL (1 colher de sopa rasa) de gua sanitria para uso geral a 2,0%-2,5%
em 1 litro de gua ou 20 mL (2 colheres de sopa rasa) de hipoclorito de sdio a 1% em
1 litro de gua. Na soluo clorada, o produto deve permanecer em imerso de 15 a 20
minutos, com posterior enxge.
A soluo clorada a 200ppm deve ser substituda a cada lote imerso ou ser
reutilizada quando o monitoramento da soluo indicar um mnimo de 100ppm de cloro
ativo. Para que possa ser reutilizada, a soluo no deve ter muitos resduos nem
apresentar turvao, de acordo com a ABERC (2001).
Estudos realizados por Garg; Churey e Splittstoesser (1990); Beuchat
et al. (1998), utilizando cloro como sanitizante em folhas de alface, mostraram
resultados satisfatrios na eliminao de microrganismos.
Outras solues base de cloro podem ser utilizadas, desde que sejam idneas,
observando-se as recomendaes do fabricante e verificando-se a adequao da
concentrao final de cloro em ppm. Todos os produtos devem estar registrados no
Ministrio da Sade, segundo a ABERC (2001).
Segundo a ABERC (2001), o vinagre, quando utilizado, no constitui uma etapa
de desinfeco, apenas de limpeza. Permite uma reduo de larvas e insetos que ficam
aderidos s folhas e minimiza o gosto de cloro resultante da desinfeco.
Conforme Arruda (1996), aps a imerso em soluo clorada, deve-se em caso
de verduras utilizar tambm a desinfeco em soluo de cido actico que tem como
objetivo a reduo de microrganismos, parasitas e seus ovos.
O efeito do cido actico sobre a contaminao de vegetais foi estudado por
Leito et al. (1981), Eiroa; Porto (1996) e Entani et al. (1998), sendo constatados bons
resultados na reduo de patgenos.
29
A exposio de folhas de alface na concentrao de vinagre a 2%, por perodo

de 30 minutos, comprometeu em parte as caractersticas do folhoso, causando
murchamento parcial (LEITO et al.,1981).
A maior parte dos cidos orgnicos eficaz na reduo dos valores de pH (pH
5,5) que ao penetrarem na clula bacteriana, acidificam seu interior, danificando-a ou
destruindo-a (SMULDERS et al., 1986).
Estudos de Cherrington et al. (1991) mostraram que, alm de afetar o pH
intracelular e o metabolismo bacteriano, os cidos orgnicos causam alterao do DNA.
Diferentes bactrias respondem de modo desigual aos cidos orgnicos, conforme
demonstram os trabalhos de Glass e Doyle (1991), Erickson e Jenkins (1991) e
Erickson et al. (1993), os quais constataram que a Listeria monocytogenes era mais
resistente ao cido actico do que a Samonella spp.
Alm da correta higienizao e desinfeco do produto, os locais devem
implementar as Boas Prticas e o Sistema de Anlise de Perigos e Pontos Crticos de
Controle (APPCC), os quais segundo Silva Junior (2002), so, sem dvida, as
ferramentas atuais mais eficientes para controle de perigos ao consumidor em toda a
cadeia de produo de alimentos.
30
3 MATERIAL E MTODOS
3.1 Obteno das amostras
O presente trabalho foi constitudo de coleta de folhosos crus (alfaces) prontos

para o consumo e sem tempero, servidos em quilograma em sete diferentes
restaurantes self-service, na cidade de Limeira SP.
Esta amostragem representa cerca de 60% dos estabelecimentos de mesmo
padro existentes no municpio.
Entre os locais pode-se considerar 01 de grande porte, 03 de mdio porte e 01
de pequeno porte, localizados na regio central da cidade e outros 02 de pequeno porte
localizados fora da regio central, afastados aproximadamente 2 quilmetros da rea
central da cidade.
As amostras foram coletadas nas embalagens descartveis existentes nos
estabelecimentos, diretamente no balco de distribuio, na quantidade de 300 gramas,
com cinco coletas em cada estabelecimento, totalizando 35 amostras, que foram
analisadas em duplicatas.
As coletas foram realizadas no perodo de 14.02.05 a 13.06.05, sendo 5 coletas
em cada local. O produto foi coletado nos diferentes locais em diferentes horrios entre
11h00m e 12h30m.
As embalagens onde as amostras foram coletadas receberam identificao e
foram mantidas armazenadas em bolsa trmica, contendo pedras de gelo a uma
temperatura de 3C a 4C, at o momento das anlises microbiolgicas.
Na 4 coleta os locais B e G tiveram seu produto submetido desinfeco em
soluo clorada e soluo de vinagre, seguido das anlises microbiolgicas; o mesmo
procedimento ocorreu com os locais A, C, D, E e F durante a 5 coleta.
As amostras coletadas foram transportadas ao Laboratrio de Microbiologia de
Alimentos, do Departamento de Agroindstria, Alimentos e Nutrio da ESALQ - USP
em Piracicaba, onde foram analisadas.
31
3.2 Anlises microbiolgicas
Foram realizadas as anlises microbiolgicas em duplicata para a estimativa do

Nmero Mais Provvel (NMP) de coliformes a 45C e para presena/ausncia de
Salmonella spp, bactrias para as quais existem padres estabelecidos pela ANVISA
(BRASIL, 2001) e tambm para Staphylococcus coagulase positiva, aerbios mesfilos
e coliformes totais para uma melhor avaliao das condies higinico-sanitrias das
amostras.
As
anlises
microbiolgicas
foram
realizadas
atravs
de metodologias
tradicionais para bactrias coliformes totais, coliformes a 45C e aerbios mesfilos,

descritas por Silva; Junqueira e Silveira (2001) e Swanson; Petran e Hanlin (2001); e
Staphylococcus coagulase positiva de acordo com Lancette e Bennett (2001).
As anlises microbiolgicas para Salmonella foram realizadas conforme mtodo
oficial aprovado pela Association of Official Analytical Chemists AOAC (2000).
3.3 Preparo das amostras
Para as anlises de coliformes totais, coliformes a 45, aerbios mesfilos e

Staphylococcus coagulase positiva fez-se as diluies das amostras. Foram utilizados
50 gramas de cada amostra de alface para 450mL de gua peptonada a 0,1%
esterilizada e posteriormente homogeneizados em liquidificador esterilizado, obtendo-se
assim a diluio de 10-1. A partir dessa diluio, foram feitas diluies em srie at a
obteno da diluio 10-6, sempre se transferindo 10mL de cada diluio para frascos
esterilizados contendo 90mL de gua peptonada 0,1% (Figura 1).
Para a anlise de Salmonella, as amostras foram submetidas ao prenriquecimento, onde foram pesados 25 gramas de cada amostra de alface e
transferidos para um erlenmeyer contendo 225mL de Caldo Lactosado esterilizado,
conforme (Figura 5).
32
(10-1)
10
mL
10
mL
50 g
10
mL
10
mL
10
mL
Alface
450mL H2O
peptonada
90mL H2O
peptonada
90mL H2O
peptonada
90mL H2O
peptonada
90mL H2O
peptonada
90mL H2O
peptonada
(10-2)
(10-3)
(10-4)
(10-5)
(10-6)
Figura 1 Procedimento para preparo das diluies
3.4 Microrganismos analisados
3.4.1 Nmero mais provvel (NMP) de coliformes totais e fecais
O Nmero Mais Provvel de coliformes totais e fecais foi determinado pelo

mtodo clssico de fermentao da lactose, atravs da tcnica dos tubos mltiplos de
acordo com Silva; Junqueira e Silveira (2001) e Swanson; Petran e Hanlin (2001).
Esta tcnica permite a recuperao de clulas injuriadas atravs de um
enriquecimento e compreende duas fases distintas: a fase do teste presuntivo e a fase
do teste confirmativo, onde se determina a populao de coliformes totais e fecais.
Para o teste presuntivo selecionou-se cinco sries de tubos de ensaio contendo
tubos de Durham e Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST), identificando-se as diluies de
10-1 a 10-5 e os respectivos locais, adicionando 1,0 mL da diluio correspondente por
tubo de ensaio. As cinco sries de tubos foram incubadas a 35C por 24-48 horas. Aps
o perodo de incubao, os tubos que apresentaram produo de gs devido
fermentao da lactose do meio foram considerados positivos no teste presuntivo. Os
tubos que aps 48 horas no apresentaram nenhuma alterao nos tubos de Durham,
foram considerados negativos.
33
Com auxlio de ala de nquel-cromo foram realizadas inoculaes a partir dos

tubos positivos do teste presuntivo para tubos contendo Caldo Verde Brilhante Lactose
Bile (CVBLB) e tubos com caldo EC. Os tubos CVBLB foram incubados em estufa a
35C/24-48h para teste confirmativo de coliformes totais e os tubos EC em banho-maria
a 44,5-45C/24h para teste confirmativo de coliformes fecais. Aps os respectivos
perodos de incubao, verificou-se a produo de gs nos tubos de Durham colocados
nos meios de cultivo do teste confirmativo e a partir destes tubos positivos (gs) foi feita
a consulta Tabela de Thomas (1942), apud Swanson; Petran e Hanlin (2001) para a
estimativa do NMP de coliformes totais e coliformes a 45C.
Os resultados obtidos foram comparados com os padres da legislao vigente
para o produto, segundo a ANVISA (BRASIL, 2001).
Teste Presuntivo
10-1
10-2
10-3
10mL
10mL
1 mL
1 mL
10-4
10-5
10mL
1 mL
10mL
1 mL
1 mL
Meio Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST) - Estufa 35C/24 - 48h
(continua)
Figura 2 Estimativa de coliformes totais e coliformes fecais pelo mtodo do nmero mais provvel
(NMP)
34
Teste Confirmativo
Tubo positivo do
teste presuntivo
EC
CVBLB
Banho Maria
Estufa
44,5 - 45C/24h
35C/24 48h
(Teste confirmativo para coliformes a 45C/fecais)
(Teste confirmativo para coliformes totais)
(concluso)
Figura 2 Estimativa de coliformes totais e coliformes fecais pelo mtodo do nmero mais provvel
(NMP)
3.4.2 Pesquisa de Salmonella spp
Para as anlises microbiolgicas de pesquisa de Salmonella spp tm sido

bastante utilizados mtodos rpidos de deteco, com resultados obtidos no prazo de
24-36 horas.
35
No desenvolvimento deste estudo utilizou-se o mtodo Salmonella 1-2 TEST, da

BioControl. Trata-se de um mtodo oficial aprovado pela AOAC (2000) recomendado
para a deteco presuntiva das espcies mveis de Salmonella em alimentos.
Figura 3 Kit 1-2 Test para Salmonella spp. da BioControl
O princpio se baseia na observao da imobilizao pelos anticorpos

polivalentes H (flagelar contidos no meio de motilidade, com o desenvolvimento de uma
banda visual bem definida chamada de imunobanda), (Figura 4).
36
Figura 4 Imunobanda caracterstica de positividade para Salmonella
Foi feito um pr-enriquecimento de cada amostra analisada, incubando-se 25

gramas de alface em um erlenmeyer contendo 225mL de Caldo Lactosado. Os frascos
foram incubados por 1824h a 35C. Decorrido o perodo de incubao foi feito o
enriquecimento seletivo, transferindo-se 1mL do pr-enriquecimento para um tubo de
ensaio contendo 9mL de soluo Caldo tetrationato verde brilhante ativado com iodoiodeto, sendo incubado por 6 horas em banho-maria, a 42C (Figura 5).
Aps o perodo de incubao do enriquecimento seletivo, procedeu-se o preparo
dos kits 1-2 Test da seguinte forma: posicionou-se a tampa preta para cima, retirando-a
e removeu-se o plug da cmara usando uma pina estril; desprezou-se o contedo
deste compartimento e inoculou-se 1,5mL da soluo caldo tetrationato preparado
separadamente; os kits foram posicionados com a tampa branca para cima retirando-a
e cortando a ponta interna desta tampa; adicionou-se 1 gota de anticorpo, princpio
responsvel pela aglutinao e formao do gel que se forma junto da tampa branca.
Os kits foram incubados a 35C por 1430 horas. Aps o perodo de incubao
observou-se a formao ou no de imunobanda que caracteriza a positividade do teste
para a bactria Salmonella.
Os resultados obtidos foram comparados com os padres da legislao vigente
para o produto conforme a ANVISA (BRASIL, 2001).
37
Preparo da amostra
10-1
225 mL de caldo
Lactosado
25g
ALFACE
Homogeinizao
Pr-enriquecimento
da amostra
Estufa 35C-24h
Enriquecimento Seletivo
10-1
1 mL
Banho-Maria
42C/6h
9 mL de caldo
tetrationato verde
Pr-enriquecimento da
amostra
brilhante ativado com

iodo iodeto
1,5 mL
Pipetar 1,5 mL da
amostra enriquecida
e inocular na cmara
previamente vazia
Girar o
plug e
remov-lo
Caldo tetrationato
incubado a 42C
Tampa branca
Aplicar 1
gota do
reativo 2
(Anticorpos)
Ponta que forma o menisco
Cortar
esta
ponta
Descartar esta ponta
Figura 5 Procedimento para deteco de Salmonella spp
Estufa 35C 14-30 h
38
3.4.3 Enumerao de Staphylococcus coagulase positiva
Para a contagem presuntiva de Staphylococcus coagulase positiva foi utilizado o

mtodo de contagem direta em placas, com semeadura em superfcie e espalhamento
com ala de Drigalsky descrito por Lancette e Bennett (2001).
Das diluies 10-1 e 10-2 preparadas previamente conforme o item 3.3, foram
retiradas para cada amostra de alface dos 7 locais, alquotas de 0,3 + 0,3 + 0,4mL
totalizando 1mL de 10-1, alquotas de 0,1mL de 10-1 e 0,1mL de 10-2, e inoculadas na
superfcie de placas de Petri contendo o meio gar Baird-Parker (BPA), previamente
preparadas. O inculo foi espalhado com ala de Drigalsky at que todo o excesso de
lquido fosse absorvido. Aps a secagem completa, as placas foram invertidas e
incubadas a 35C por 24-48 horas (Figura 6).
Para a contagem presuntiva utilizaram-se todas as placas contendo de 30 a 300
colnias e com o auxlio de uma lupa em um contador de colnias, foram contadas as
colnias tpicas, ou seja, pretas, circulares, pequenas, com bordas perfeitas, lisas,
convexas e rodeadas por um halo transparente e/ou uma zona transparente. Tambm
foram escolhidas algumas colnias que no preenchiam todos os requisitos
mencionados, para a realizao da prova de produo de coagulase.
Para o teste de coagulase, retirou-se a colnia suspeita do meio BPA com o
auxlio de uma ala nquel-cromo e transferiu-se para tubos de 10 x 100mm (estreis)
com 0,5mL de Coagu-Plasma (plasma de coelho) com EDTA, misturando-os
lentamente em movimentos circulares e se incubou a 37C, observando-se no prazo de
4h at 24h a formao de um cogulo, que caracteriza a positividade da prova.
Os resultados obtidos foram comparados em relao tolerncia de 103 UFCg-1,
estabelecida para este estudo.
39
10-2
10-1
90 mL H2O
pep.
10 mL
0,3mL
0,3mL
0,4mL
0,1mL
0,1mL
Meio gar Baird-Parker (BPA) Estufa 35C/24h
Colnias tpicas
0,5 mL plasma de coelho - ETDA

Estufa
37C/4-24h
Figura 6 Deteco de Staphylococcus coagulase positiva
Coagulao Teste (+)
40
3.4.4 Contagem total de microrganismos aerbios mesfilos em placas
Para a contagem total de aerbios mesfilos foi utilizado o mtodo de

plaqueamento em profundidade. Foram selecionadas as diluies 10-4, 10-5 e 10-6 das
diluies preparadas previamente conforme item 3.3, das quais retirou-se alquotas de
1mL, inoculando em placas de Petri previamente esterilizadas, conforme Swanson;
Petran e Hanlin (2001). A cada placa inoculada foi adicionado de 15 a 20mL do meio
Plate Count Agar (PCA), previamente fundido e resfriado at a temperatura de 45C, de
acordo com Silva; Junqueira e Silveira (2001). Com as placas em superfcie plana e
atravs de movimentos circulares suaves e em movimento na forma de oito o inculo foi
misturado.
Aguardou-se a completa solidificao do meio, invertendo as placas e
incubando a 35C por 48 horas (Figura 7).

Para a contagem das colnias foram selecionadas as placas que continham
entre 30 e 300 colnias. A contagem foi feita com o auxlio de uma lupa, em um
contador de colnias. As anlises foram feitas em duplicata e obtida a mdia aritmtica
das contagens das UFCg-1.
Os resultados obtidos foram comparados com os padres estabelecidos para o
estudo (at 106 UFCg-1).
10-4
1 mL
1 mL
PCA
10 6
10-5
PCA
Plaqueamento em profundidade
Estufa 35C/48h
Figura 7 Procedimento analtico para deteco de aerbios mesfilos
1 mL
PCA
41
3.5 Procedimento das anlises microbiolgicas do produto sob desinfeco em

soluo clorada e em soluo de vinagre
Preparao da amostra:
Em laboratrio as amostras de alface foram higienizadas com gua destilada e
esterilizada.
A soluo clorada foi preparada usando-se um litro de gua destilada e
esterilizada com a adio de 10mL de gua sanitria com 2,0-2,5% de cloro, conforme
a Portaria CVS-6 (SO PAULO, 1999). O pH da gua sanitria com 2,0-2,5% de cloro
foi medido, obtendo-se pH de 12,8 e posteriormente mediu-se o pH da soluo clorada
(diluio 1%), que resultou em 10,0. De acordo com Silva Junior (2002), o pH da gua
sanitria deve ser de 13,5 no produto puro e 11,5 quando diludo a 1%.
Cada amostra de alface foi colocada em imerso de soluo clorada por 15
minutos em um Becker previamente esterilizado. Aps o tempo determinado ocorreu o
enxge das amostras em gua destilada e esterilizada.
Como etapa de finalizao as amostras foram colocadas em soluo de vinagre
a 2% por 15 minutos, sem posterior enxge. Tal procedimento baseou-se nas
orientaes de Arruda (1996) e em estudo desenvolvido por Leito et al. (1981) com
cido actico, na forma de vinagre.
Aps o processo de desinfeco foram realizadas as anlises microbiolgicas
para os microrganismos coliformes totais, coliformes a 45C, Staphylococcus coagulase
positiva e aerbios mesfilos.
Os resultados foram comparados com os padres da ANVISA (BRASIL, 2001),
para coliformes a 45C, enquanto para aerbios mesfilos e Staphylococcus coagulase
positiva os padres de referncia utilizados foram os estabelecidos para o estudo.
42
3.6 Anlise estatstica
Os resultados obtidos nas anlises microbiolgicas foram submetidos anlise

da varincia, com testes de comparao mltipla de Tukey, obtendo-se a comparao
entre as mdias dos locais. Os valores gerados pelos testes de Tukey so resultantes
da aplicao da frmula log10 (varivel + 0,5), onde ocorreu a transformao dos
valores devido heterogeneidade de varincia e detectou-se a diferena entre as
mdias dos locais em relao aos microrganismos coliformes a 45C, pelo sistema
computacional SAS (2002-2003). Posteriormente foram submetidos anlise Biplot
(GABRIEL, 1971).
43
4 RESULTADOS E DISCUSSO
4.1 Caracterizao
A microbiota de vegetais retirados da terra deve ser a mesma do solo onde

esses vegetais cresceram, embora ocorram excees. A alta quantidade de gua
presente nos vegetais favorece a deteriorao bacteriana e o baixo contedo de
carboidratos e gorduras sugere que uma boa parte dessa gua est disponvel. A
mdia do pH dos vegetais est dentro dos limites de crescimento de vrias bactrias,
por isso o fato de que estas so os agentes de decomposio mais comuns nos
vegetais.
O potencial de oxirreduo relativamente alto dos vegetais e sua baixa
toxidade sugerem que as bactrias aerbias e anaerbias facultativas so mais

importantes do que as anaerbias (JAY, 2005).
As contagens totais de bactrias em hortalias so utilizadas como parmetros
da carga microbiana presente, no indicando se a populao tem efeito benfico ou
prejudicial. Contudo servem como um alerta das condies de higiene durante a
manipulao e armazenamento, como tambm dos potenciais riscos oferecidos sade
do consumidor (BRASIL, 1997; BRASIL, 2001; ICMSF, 1980).
Na Tabela 1 esto representados os resultados das anlises microbiolgicas
realizadas na presente pesquisa.
Tabela 1 Resultados das anlises microbiolgicas
(continua)
Coletas
e
Locais
Coliformes
-1
Totais NMPg
Coliformes a
-1
45C NMPg
Microrganismos
Staphylococcus
Aerbios
coagulase
-1 Salmonella spp
-1 mesfilos UFCg
positiva UFCg
Local A
1.........
2.........
3.........
4.........
5.........
5,4 x 10
3,3 x 10
5,4 x 10
2,2 x 10
3,5 x 10
1,4 x 10
5,0 x 10
2,4 x 10
9,0 x 10
5,0 x 10
7,0 x 10
4,5 x 10
3,0 x 10
2,1 x 10
3,1 x 10
ausente em 25g
ausente em 25g
ausente em 25g
ausente em 25g
ausente em 25g
1,8 x 10
2,0 x 10
7,7 x 10
7,9 x 10
8,2 x 10
44

(continuao)
Coletas
e
Locais
Coliformes
-1
Totais NMPg
Coliformes a
-1
45C NMPg
Microrganismos
Staphylococcus
Aerbios
Salmonella spp
coagulase
-1
-1 mesfilos UFCg
positiva UFCg
Local B
3
9,2 x 10
9,2 x 10
1.........
9,2 x 10
2.........
9,2 x 10
3.........
4.........
5.........
9,2 x 10
5,4 x 10
1,9 x 10
8,0 x 10
3,5 x 10
1,1 x 10
2,0 x 10
2,2 x 10
2,2 x 10
1,6 x 10
2,6 x 10
3,6 x 10
6,5 x 10
2,0 x 10
1,3 x 10
ausente em 25g
ausente em 25g
ausente em 25g
ausente em 25g
ausente em 25g
ausente em 25g
ausente em 25g
ausente em 25g
ausente em 25g
ausente em 25g
ausente em 25g
ausente em 25g
ausente em 25g
ausente em 25g
ausente em 25g
ausente em 25g
ausente em 25g
ausente em 25g
ausente em 25g
ausente em 25g
ausente em 25g
ausente em 25g
ausente em 25g
ausente em 25g
ausente em 25g
1,5 x 10
1,8 x 10
5,1 x 10
1,0 x 10
Local C
1.........
2.........
3.........
4.........
5.........
1,6 x 10
9,2 x 10
9,2 x 10
1,4 x 10
3,5 x 10
1,3 x 10
2,0 x 10
<2
2,8 x 10
9,2 x 10
8,8 x 10
7,5 x 10
4,5 x 10
1,6 x 10
1,4 x 10
2,5 x 10
1,9 x 10
5,0 x 10
4,0 x 10
Local D
1.........
2.........
9,2 x 10
1,6 x 10
2,0 x 10
<2
2,0 x 10
3.........
4,6 x 10
4.........
2,4 x 10
5.........
9,6 x 10
<2
2,0 x 10
1,2 x 10
1,7 x 10
8,8 x 10
3,6 x 10
1
2,2 x 10
2,0 x 10
7,0 x 10
1,2 x 10
2,5 x 10
6,2 x 10
Local E
1.........
2,4 x 10
<2
2,7 x 10
2.........
1,7 x 10
3.........
1,6 x 10
4.........
5.........
4,9 x 10
1,5 x 10
2,6 x 10
1,1 x 10
1,4 x 10
2
2,8 x 10
<2
4,8 x 10
2,0 x 10
5,0 x 10
8 x 10
1,5 x 10
<2
4,1 x 10
8,0 x 10
1,9 x 10
1,5 x 10
8,4 x 10
2,7 x 10
Local F
1.........
2,3 x 10
2.........
1,7 x 10
3.........
4.........
5.........
5,0 x 10
<2
<2
<2
1,7 x 10
<2
1,2 x 10
4,0 x 10
3
2
1,6 x 10
2,8 x 10
5,9 x 10
2,5 x 10
45

(concluso)
Coletas
e
Locais
Coliformes
-1
Totais NMPg
Microrganismos
Staphylococcus
Aerbios
coagulase
-1 Salmonella spp
-1 mesfilos UFCg
positiva UFCg
Coliformes a
-1
45C NMPg
LOCAL G
3
2,0 x 10
4,0 x 10
1.........
5,4 x 10
2.........
5,4 x 10
3.........
4.........
1,6 x 10
2,4 x 10
9,0 x 10
1,0 x 10
5,7 x 10
1,4 x 10
6,0 x 10
3,0 x 10
2,0 x 10
6,5 x 10
ausente em 25g
ausente em 25g
ausente em 25g
ausente em 25g
ausente em 25g
9,7 x 10
3,0 x 10
5.........
1,7 x 10
<2
2,3 x 10
9,2 x 10
-1
-1
Mdias de 2 repeties, expressas em NMPg e UFCg de alface.
A higiene dos vegetais muito importante porque, assim como o ser humano
necessita de alimentos com uma quantidade de microrganismos patognicos
compatveis com a sua resistncia imunolgica, no devem ser ingeridos resduos de
produtos detergentes ou desinfetantes que possam interferir na fisiologia digestiva,
causando transtornos que simulam gastrenterites intoxicativas, resultando em uma falsa
intoxicao alimentar e propiciando aparecimento de sintomas alrgicos ou de m
digesto (SILVA JUNIOR, 2002).
Os aspectos que merecem destaque no trabalho em questo esto reportados
nas Tabelas apresentadas a seguir.
Tabela 2 - Locais e datas das coletas
Datas das coletas

3
14/02
14/03
04/04
02/05
06/06
14/02
14/03
04/04
02/05
06/06
14/02
14/03
04/04
02/05
06/06
14/02
14/03
25/04
30/05
06/06
14/02
28/03
25/04
30/05
13/06
28/02
28/03
25/04
30/05
13/06
28/02
28/03
25/04
30/05
13/06
Locais
46
Percebe-se que as coletas foram realizadas em etapas diferentes, considerandose 02 grupos de estabelecimentos, sendo o 1 grupo (A, B, C e D) e o 2 grupo (E, F e
G).
O local D, por ocasio das 3 e 4 coletas, no oferecia alface, portanto essas
amostras foram coletadas posteriormente junto com as dos locais E, F e G.
Tabela 3 - Horrios das Coletas nos 07 locais
Locais
Horrios das Coletas

3
11h15min
11h45min
11h35min
12h15min
11h10min
11h30min
12h15min
11h10min
11h30min
12h00min
11h45min
12h00min
11h25min
11h45min
12h15min
12h20min
11h30min
11h40min
11h30min
11h30min
12h45min
11h10min
12h25min
11h05min
11h10min
11h15min
11h50min
12h20min
12h25min
12h00min
12h00min
11h35min
11h10min
11h15min
12h20min
Para realizao das coletas cumpriram-se horrios diferenciados, procurando

seguir os horrios de abertura e de maior fluxo de atendimento.
Tabela 4 Nmero de pessoas por local nos horrios das coletas
Locais
N de Pessoas/Local e Coleta
1
10
10
35
45
06
02
15
03
01
07
03
20
04
03
16
02
01
01
01
01
15
04
15
16
10
08
03
04
07
05
05
06
04
03
08
Nota-se que o fluxo de pessoas variou bastante de uma coleta para outra entre
os locais. Este fato pode ser atribudo ao rodzio de horrios e disponibilidade dos
47
horrios dos consumidores. possvel perceber que os restaurantes A, B, C e E

apresentaram o maior nmero de freqncia durante as coletas.
Na Tabela 5 apresentada a forma de apresentao da alface nas refeies, ou
seja, picada ou no.
Tabela 5 - Produto picado por local e coleta
Locais
Produto cortado por coleta

2
3
4
(1)
(2)
(1)
Inclui o local e a coleta do folhoso oferecido picado.
(2)
Inclui o local e a coleta do folhoso oferecido no picado.
Entre as 35 coletas realizadas durante o estudo, percebe-se que em 54,3% das

amostras o folhoso encontrava-se cortado.
Em muitas cozinhas a higiene, de modo geral, to precria que, aps o corte
de vegetais crus para o consumo, ocorre uma contaminao to grande quanto antes
do processo de higiene (SILVA JUNIOR, 2002).
Entre os estabelecimentos, pode-se notar que os locais B, D e G, durante as
cinco coletas ofereceram a hortalia cortada (Tabela 5).
Comparando-se os trs locais que tiveram 100% das amostras coletadas com o
folhoso cortado, pode-se perceber nas Figuras correspondentes que os mesmos
apresentaram percentuais bem diferentes de inconformidade com os padres
microbiolgicos estabelecidos para bactrias coliformes a 45C: B (100%), D (20%) e G
(20%). Desta forma pode-se considerar que o fato do vegetal estar picado no foi a
nica causa que levou no conformidade dos resultados, considerando que provveis
falhas nos procedimentos de higiene e armazenamento ps-higienizao, contriburam
com estes resultados.
48
Na Tabela 6 menciona-se a temperatura ambiente durante as cinco coletas.

Tabela 6 Temperatura ambiente durante as coletas
Locais
Temperatura ambiente/ Local e coletas

1
35C
30C
30C
25C
25C
35C
30C
30C
25C
25C
35C
30C
30C
25C
25C
35C
30C
25C
25C
25C
35C
30C
30C
25C
20C
30C
30C
25C
25C
20C
30C
30C
25C
25C
20C
Percebe-se que entre a 1. e a 5. coletas a temperatura ambiente manteve-se

como um fator favorvel (20C - 35C) ao desenvolvimento de bactrias mesfilas, para
todos os locais de amostragem.
4.2 Coliformes totais e coliformes a 45C
Embora no existam informaes na legislao brasileira quanto aos limites de

contagens toleradas para coliformes totais, tais anlises foram realizadas considerandose que os resultados positivos indicam as ms condies higinicas do local, do
produto e o risco da presena de patgenos fecais.
Para o local A, as contagens de coliformes totais estiveram entre 102 e 103
NMPg-1, o local B apresentou contagens entre 103 e 105 NMPg-1, os locais C e D entre
103 e 104 NMPg-1, local E entre 101 e 104 NMPg-1, local F teve variao entre <2 e 104
NMPg-1 e o local G apresentou contagens maiores com variaes entre 101 e 106
NMPg-1 (Tabela 1).
Considerando os resultados mencionados para coliformes totais, observa-se que
os sete locais pesquisados apresentaram contagem elevada para tais bactrias, sendo
que 31 (88,6%) amostras tiveram os nveis de contagem elevados e apenas 4 (11,4%)
49
apresentaram nveis reduzidos, encontrados respectivamente nos locais E, F e G com

resultados que variaram entre < 2 e 8,0 x 101 NMPg-1 (Tabela 1).
De acordo com os resultados das anlises evidenciam-se condies higinicas
insatisfatrias, podendo-se considerar que os 7 locais praticam de forma incorreta a
higienizao do produto (Tabela 1).
Apesar de no existirem os padres para contagem de coliformes totais para
hortalias in natura, os resultados evidenciam a higiene insatisfatria no processamento
do produto, constituindo-se, com certeza, um fator de risco ao consumidor.
Para coliformes a 45C, a ANVISA (BRASIL, 2001) estabelece o limite mximo
de 102 NMPg-1.
Do total de amostras analisadas, 14 (40%) apresentaram-se fora dos padres
estabelecidos pela legislao.
O local B teve as 5 coletas com resultados em desacordo aos padres vigentes
(Tabela 1).
Nascimento e Marques (1998), ao analisarem saladas in natura servidas em
restaurantes, observaram que 100% das amostras pesquisadas encontravam-se fora
do padro estabelecido pela legislao para coliformes fecais, sendo encontrados
valores que oscilaram de 9,3 x 101 a 4,1 x 105 NMPg-1, entre os quais encontrou-se a E.
coli.
Pal et al. (2002), em estudo de avaliao microbiolgica de frutas e hortalias
frescas, servidas em restaurantes self-service, encontraram 12 (80,0%) das 15
amostras de hortalias analisadas, em condies insatisfatrias. Destas, 7 ou seja,
53,3% eram amostras de alface com contagens de coliformes fecais acima do limite
mximo (102 NMPg-1), estabelecido pela ANVISA (BRASIL, 2001).
Siqueira et al. (1997), constataram que 44% das amostras de saladas cruas de
restaurantes industriais apresentavam-se em condies higinicas insatisfatrias, sendo
que 7% destas encontravam-se em condio potencial de causar toxinfeco alimentar.
Damasceno et al. (2002) analisaram as condies higinico-sanitrias de
restaurantes self-service e de saladas cruas por eles servidas e observaram que 8,33%
das amostras estavam em desacordo com a legislao em relao a E. coli. Este
resultado, quando confrontado com outros, considerado baixo sendo justificado pelo
50
elevado teor de cloro existente na gua utilizada para higienizao dos vegetais em
todos os estabelecimentos que fizeram parte do estudo.
Em anlise de alfaces coletadas em feiras livres da cidade de So Paulo, Franco
e Hoefel (1983) detectaram contagem elevada de coliformes fecais entre indetectvel e
103 NMPg-1, sendo que das 34 amostras analisadas, 16 (47,1%) apresentaram-se
contaminadas por E.coli.
Na presente pesquisa, 9 (25,7%) das amostras atingiram contaminaes de 103
NMPg-1 e 1 (2,86%) de 105 NMPg-1
para
coliformes a 45C, evidenciando que a
qualidade destas amostras esteve prxima a de um produto sem tratamento,

oferecendo risco potencial ao consumidor quanto presena de patgenos entricos.
Considerando os resultados de coliformes totais e coliformes a 45C,
evidenciam-se condies higinico-sanitrias precrias e portanto, a necessidade de
interveno no processo de produo, manipulao e mtodos de conservao do
alimento, principalmente em relao aos aspectos higinicos.
4.3 Aerbios mesfilos
A legislao no prev limites para a contagem total de aerbios mesfilos para

hortalias frescas in natura, portanto utilizou-se como base a recomendao de Morton
(2001) para contagem de bactrias aerbias mesfilas em vegetais congelados e
similares, com valores mximos de 105 106 UFCg-1.
Para o estudo foi estabelecida uma especificao microbiolgica com parmetros
adotados de at 106 UFCg-1, j que na literatura so feitas vrias citaes de que
alimentos que apresentam contagens totais de microrganismos aerbios acima de 106
UFCg-1 comeam a apresentar sinais de deteriorao (FRANCO; LANDGRAF, 2003;
MORTON, 2001).
Os 7 locais estudados apresentaram contagens totais superiores ao limite de 106
UFCg-1, com 29 (82,8%) amostras fora dos padres adotados, estando destas 11
(37,9%) com contagens acima de 107 UFCg-1 (Tabela 1).
51
Pal et al. (2002), em estudo desenvolvido com hortalias frescas (53,3% eram
amostras de alface), obtiveram elevadas contagens de bactrias aerbias mesfilas
com valores oscilando entre 2,0 x 105 UFCg-1 e 2,7 x 107 UFCg-1.
A presena de bactrias aerbias mesfilas tambm foi relatada por Azerdo;
Conceio e Stamford (2004), com 100% das amostras de saladas cruas contaminadas
com nveis de 8,0 X 105 UFCg-1.
Observando os resultados obtidos nesta pesquisa, verifica-se que as amostras
de alface analisadas apresentaram valores elevados na contagem de bactrias
aerbias mesfilas, indicando alta contaminao da hortalia para o consumo, podendo
atribu-los a um produto com contaminao inicialmente alta, procedimentos de higiene
insatisfatrios e condies inadequadas de temperatura de acondicionamento ps
higienizao e durante o perodo de exposio do produto no balco de distribuio.
4.4 Salmonella spp
No se detectou Salmonella em nenhuma das amostras de alface dos 7 locais.

Tais resultados colocam as amostras analisadas de acordo com a Resoluo da
ANVISA (BRASIL, 2001), que estabelece para hortalias in natura a ausncia de
Salmonella em 25 gramas de produto, visando a preservao da sade pblica.
Damasceno et al. (2002) avaliando as condies higinico-sanitrias de
restaurantes do tipo self-service, constataram a ausncia de Salmonella em 25 gramas
em amostras de saladas cruas analisadas, ressaltando terem constatado elevado teor
de cloro na gua de lavagem dos vegetais.
De acordo com Azerdo; Conceio e Stamford (2004), 100% das amostras de
saladas cruas analisadas em um restaurante universitrio estavam dentro dos padres
exigidos pela legislao vigente, embora constatado em algumas amostras elevada
contagem de aerbios mesfilos, o que tambm ocorreu na presente pesquisa.
52
Pal et al. (2002), avaliando 15 amostras de saladas com hortalias frescas em

restaurantes self-service, encontraram 4 (26,7%) das saladas cruas em desacordo com
a legislao para Salmonella, sendo destas 1 (6,7%) salada de alface.
Conforme pesquisa em amostras de saladas in natura, realizada por Nascimento
e Marques (1998), 100% das amostras atenderam aos padres estabelecidos pela
legislao para Salmonella.
Considerando-se as elevadas contagens de aerbios mesfilos encontradas
nessa pesquisa, mesmo no tendo sido detectada Salmonella, pode-se dizer que os
estabelecimentos devem se adequar s prticas de higiene e manipulao que
envolvem o produto.
4.5 Staphylococcus coagulase positiva
A deteco de Staphylococcus coagulase positiva, tambm no prevista na

legislao para este tipo de produto, foi realizada atravs de anlises microbiolgicas
de contagem total em placas e posterior teste de coagulase.
Em relao a alimentos, a deteco de bactrias do grupo de Staphylococcus
coagulase positiva muito importante pelas seguintes razes: primeiro, porque sua
presena em alimentos processados pode indicar deficincia de processamento ou
condies higinicas inadequadas do processo; segundo, porque suas enterotoxinas,
uma vez presentes no alimento, podero causar intoxicao alimentar (SILVA;
GANDRA, 2004).
Embora
no
existam
na
legislao
brasileira
vigente
padres
para
Staphylococcus coagulase positiva para hortalias frescas in natura, no que diz respeito
quantidade desses microrganismos pode-se dizer que a tolerncia para alimentos, de
modo geral, de at 103 UFCg-1, conforme a ANVISA (BRASIL, 2001).
Para a presente pesquisa adotou-se a especificao microbiolgica com
parmetros baseados em padres estabelecidos para hortalias congeladas e similares
de 103 UFCg-1, conforme ANVISA (BRASIL, 2001). Realizando-se as anlises
53
microbiolgicas de contagem total em placas e posterior teste de coagulase, os 7 locais

apresentaram resultados fora dos limites propostos para o estudo, com 21 (60%) das
amostras em desacordo com aos padres de referncia.
O teste de produo de coagulase livre considerado padro para a
identificao de S. aureus e o teste de produo de termonuclease tambm usado
como auxiliar para distino entre S.aureus e outras espcies de estafilococos
(BASCOMB; MANAFI, 1998).
Conforme pesquisa de Carvalho e Serafim (1996) com 44 manipuladores de
alimentos de restaurante universitrio, foi encontrada a presena de S. aureus,
respectivamente em 34,7% na orofaringe e 47,8% na regio nasal e nas mos. A
presena de S. epidermidis foi igualmente elevada aparecendo em todas as regies
estudadas.
Pal et al. (2002) observaram em seu estudo de avaliao microbiolgica de
frutas e hortalias frescas de restaurantes self-service que do total de 30 amostras
analisadas, 16 (53,3%) estavam contaminadas por Staphylococcus aureus, sendo que
2 (13,3%) de 15 amostras de hortalias tratavam-se de salada de alface, as quais
apresentaram
cepas produtoras
de
enterotoxinas.
Uma
delas,
produtora
de
enterotoxina A e B, sendo detectada contagem de 3,0 x 102 UFCg-1 e a outra produtora

de enterotoxina A com contagem de 1,1 x103 UFCg-1.
Azerdo; Conceio e Stamford (2004) encontraram em seu estudo valores
mximos de 7,0 x 102 UFCg-1 em 100% das amostras coletadas de salada crua, em
restaurante universitrio de Joo Pessoa, para a bactria Staphylococcus aureus.
Comparando os resultados desta pesquisa com as citaes, evidencia-se que
nos 7 locais em que ocorreu o estudo, o produto apresentou nvel elevado de
contaminao por Staphylococcus coagulase positiva, podendo ser indicativo de
manipulao excessiva e inadequada alm de manuteno do produto em
temperaturas no recomendadas por um longo perodo.
A seguir so apresentados os resultados das anlises microbiolgicas e
aspectos que envolvem as condies em que o produto era oferecido ao consumidor
nos 7 locais pesquisados.
54
Local A
O local A serve em mdia 200 refeies por dia, oferecendo diversificao de
pratos frios, em torno de 20 opes, sendo que destas, quatro so sempre folhosos,
incluindo a alface. Os pratos frios apresentam-se dispostos em balco de distribuio
refrigerado com temperatura de 8C, adequada de acordo com as recomendaes da
Portaria CVS-6 (SO PAULO, 1999), considerando condutas e critrios para
distribuio de alimentos frios, sendo o mximo de 10C por at 4 horas.
As coletas foram realizadas em datas e horrios diferenciados, incluindo o incio,
meio e final do perodo de distribuio (Tabelas 2 e 3).
Entre as coletas, em trs delas o folhoso foi coletado j picado, enquanto que em outras
duas a alface encontrava-se em folhas inteiras (Tabela 5).
Durante as cinco coletas percebeu-se que o funcionrio responsvel pela
pesagem dos pratos e reposio das preparaes junto ao balco, tanto para o local A
quanto para os locais B, C, D, E e G, usava avental fechado de cor branca, proteo
para os cabelos, sapatos fechados e no usava adornos, atendendo requisitos
propostos pela Portaria CVS-6 (SO PAULO, 1999). No local F, tal funcionrio no
fazia o uso de proteo para os cabelos, o que coloca o local em desacordo com a
legislao.
As Figuras 8, 9 e 10 mostram os percentuais de amostras em acordo e em
desacordo com os padres microbiolgicos para o local A.
55
COLIFORMES A 45C
20%
80%
J Fora J Dentro
Figura 8 Percentual de amostras em acordo e em desacordo comparados ao limite permitido pela RDC
-1
-1
n 12 de 02.01.01, referente ao NMPg de coliformes a 45Cg
O percentual de 20% de anlises fora dos padres microbiolgicos para

coliformes a 45C e a contagem de coliformes totais entre 2,2 x 102 e 5,4 x 103 UFCg-1
indicam que os procedimentos higinico-sanitrios foram insatisfatrios para o produto.
O percentual de 20% resultou da 3 coleta, realizada no horrio das 11h30min, com
nmero de 35 pessoas no local (Tabelas 2, 3, 4), em dia de temperatura ambiente de
27C, sem chuvas nos dias que antecederam a coleta, estando a verdura neste dia
cortada (Tabela 5).
AERBIOS MESFILOS
40%
60%
J Fora J Dentro
Figura 9 Percentual de amostras com resultados em acordo e em desacordo comparados ao limite da

especificao microbiolgica adotada para o estudo, referente contagem total em placas
para aerbios mesfilos
56
Para aerbios mesfilos, 3 (60%) amostras estiveram fora da especificao

microbiolgica, resultantes das 1, 2 e 5 coletas, sendo que a 1 e a 5 coletas foram
feitas bem prximas do horrio de abertura do estabelecimento, indicando que, pela
alta contagem, provavelmente o produto tenha ficado exposto temperatura ambiente
anteriormente distribuio, ou que o mesmo j tenha vindo com alta contaminao
bacteriana e que os procedimentos de higienizao no surtiram o efeito desejado.
STAPHYLOCOCCUS COAGULASE POSITIVA
40%
60%
J Fora J Dentro
especificao microbiolgica adotada para o estudo, referente a Staphylococcus coagulase
positiva
Para Staphylococcus coagulase positiva 3 (60%) das amostras estavam fora dos
parmetros estabelecidos, sendo as 2, 4 e 5 coletas. As 2 e 4 coletas foram
realizadas com cerca de 1 hora aps a abertura do local. Na 2 coleta o folhoso
encontrava-se cortado, fato que associado ao tempo de exposio no balco pode ter
contribudo para a alta contagem dessas bactrias.
Os percentuais encontrados fora dos limites microbiolgicos para as bactrias
em estudo indicam a necessidade de intensificao nos procedimentos higinicosanitrios para o produto e melhor acondicionamento em temperaturas adequadas.
57
Local B
O local B oferece em mdia 150 refeies por dia, com pratos frios
diversificados, acondicionados em balco de distribuio refrigerado com temperatura
de 8C, oferecendo cerca de 10 opes, incluindo dois folhosos por dia.
As coletas foram realizadas em horrios alternados com o intuito de realizar o
rodzio de horrios entre as cinco coletas, permitindo resultados de coletas prximas ao
incio e final da distribuio. Estes horrios estiveram entre 11h10min e 12h15min, com
nmeros de refeies de 2 a 16 pessoas no momento da coleta (Tabelas 3 e 4).
Durante as cinco coletas o local sempre ofereceu o folhoso cortado/picado
(Tabela 5).
Nas Figuras 11, 12 e 13 esto representadas as amostras em acordo e em
desacordo aos padres microbiolgicos para o local B.
COLIFORMES A 45C
100%
J Fora J Dentro
Figura 11 Percentual de amostras em acordo e em desacordo comparados ao limite permitido pela

-1
-1
RDC n 12 de 02.01.01, referente ao NMPg de coliformes a 45Cg
Os resultados das 1, 2 e 3 coletas em relao aos coliformes totais tiveram

contagens de 103 NMPg-1, a 4 coleta de 105 NMPg-1 e a
(Tabela1), ou seja, bastante elevadas.
5 coleta de 104 NMPg-1
58
O percentual de 100% de anlises fora dos padres microbiolgicos para

coliformes a 45C indica que os procedimentos higinico-sanitrios foram falhos e ainda
um agravante que o fato de se cortar o vegetal, processo que dependendo da
precariedade da higiene do local, leva a uma contaminao to grande quanto a
anterior ao processo de higiene, conforme Silva Junior, 2002.
AERBIOS MESFILOS
100%
J Fora J Dentro
O percentual de 100% de anlises fora da especificao microbiolgica para

aerbios mesfilos indica que provavelmente houve falhas no processo de higienizao
associado ao armazenamento inadequado anteriormente distribuio, visto que o
local mantm a hortalia em balco refrigerado, com temperatura de 8C.
59
40%
60%
J Fora J Dentro
positiva
Entre as coletas, 2 (40%) apresentaram contagem elevada para Staphylococcus

coagulase positiva.
Este percentual resultou das 1 e 5 coletas, realizadas com
aproximadamente 45 minutos aps a abertura do local.

O percentual apurado das anlises indica que o local B realiza de modo
inadequado os procedimentos de higiene do produto. O fato de servir o folhoso sempre
cortado pode ter agravado as condies microbiolgicas do produto quando comparado
aos demais locais. Portanto tornam-se urgentes melhores condies de higiene e
sanificao para que a contaminao detectada no local seja reduzida e o produto
esteja adequado ao consumo.
Local C
O local C oferece em mdia 150 refeies por dia, tambm possui pratos frios
diversificados, sendo saladas preparadas com molhos diversos, acondicionadas em
balco refrigerado a 8C, oferecendo cerca de 10 opes. Entre os pratos frios so
oferecidos todos os dias dois tipos de folhosos, os quais ficam fora do
acondicionamento refrigerado, colocados apenas sobre o balco de distribuio, em
temperatura ambiente e sem proteo (Tabela 6).
60
Nas cinco coletas realizadas no local, o folhoso alface sempre foi oferecido em
folhas inteiras, assim como o outro folhoso, normalmente rcula, tambm servido em
folhas inteiras.
As coletas foram realizadas em horrios diferentes, entre 11h25min e 12h15min,
conforme a Tabela 3. No decorrer destes horrios constatou-se a presena de 2 a 20
pessoas no local (Tabela 4).
Nas Figuras 14, 15 e 16 encontram-se representadas as condies de
conformidade
no
conformidade
das
amostras
em
relao
aos
padres
microbiolgicos para o local C.
COLIFORMES A 45C
20%
80%
J Fora J Dentro
-1
-1
As anlises para coliformes totais apresentaram resultados nas 1 e 4 coletas de

104 NMPg-1 e nas 2, 3 e 5 coletas de 103 NMPg-1 (Tabela 1).
O percentual das anlises para coliformes a 45C foi de 4 (80%) das amostras
fora do padro microbiolgico, estabelecido pela ANVISA (BRASIL, 2001).
As altas contagens, tanto para coliformes totais quanto para coliformes a 45C,
evidenciam prticas incorretas de higiene. Em nenhuma das coletas encontrou-se o
vegetal cortado (Tabela 5).
61
AERBIOS MESFILOS
20%
80%
J Fora J Dentro

Para a contagem de aerbios mesfilos, 4 (80%) amostras analisadas estiveram

fora da especificao microbiolgica adotada para o estudo.
Destaca-se para o local C a gravidade do produto ser oferecido totalmente fora
das condies adequadas de temperatura, conforme as recomendaes da Portaria
CVS-6 (SO PAULO, 1999) a qual indica a temperatura de at 10C para distribuio
de alimentos frios e tambm o fato de ser sempre apresentado em recipientes de
tamanho relativamente grande, o que diminui o nmero de reposies do folhoso no
balco.
62
40%
60%
J Fora J Dentro

positiva
Considerando
especificao
microbiolgica
de
103
UFCg-1
para
Staphylococcus coagulase positiva neste estudo, 3 (60%) das amostras no atenderam

ao padro adotado, sendo representadas
atravs das 1, 4 e 5 coletas, com o
produto coletado cerca de 45 minutos aps a abertura do local para o consumo.

O quadro de resultados obtidos indica que o local precisa melhorar os mtodos
de higiene e acondicionar o folhoso em balco refrigerado, conforme as orientaes da
Portaria CVS-6 (SO PAULO, 1999) durante a distribuio, visando reduzir as altas
contagens de bactrias mesfilas e Staphylococcus coagulase positiva, alm de
oferecer o folhoso em recipientes menores para proporcionar rpido consumo,
possibilitando as reposies e menor risco de contaminao.
Local D
O local D oferece em mdia 80 refeies por dia entre consumo no local e
distribuio de refeies individuais, os chamados marmitex ou a granel.
Cerca de cinco pratos frios so oferecidos diariamente, entre eles os folhosos,
incluindo sempre a alface. Os mesmos so acondicionados em balco refrigerado
63
atravs de placas de gelo, podendo considerar que a temperatura estivesse tambm

em torno de 8C, porm o termostato no se encontrava exposto.
Durante as cinco coletas, o folhoso encontrava-se cortado (Tabela 5).
O horrio de abertura do local iniciava-se a partir das 11h30min e as coletas
sempre iniciaram a partir deste horrio. O rodzio de horrios foi compreendido entre
11h30min e 12h20min, observando-se de 1 a 2 pessoas no local (Tabelas 3 e 4).
Os folhosos eram oferecidos pelo local em recipientes com quantidades
pequenas, dificultando coletas mais prximas ao final da distribuio.
As Figuras 17, 18 e 19 apresentam os percentuais de amostras em acordo e em
desacordo com os padres microbiolgicos propostos para o estudo.
COLIFORMES A 45C
20%
80%
J Fora J Dentro
-1
-1
As anlises para coliformes totais apresentaram resultados com contagens nas

1, 3 e 5 coletas de 103 NMPg-1 e nas 2 e 4 coletas contagens de 104 NMPg-1
(Tabela 1). Embora as cinco coletas tenham apresentado nveis elevados para
coliformes totais, indicando a necessidade de adequao nas prticas higinicas, os
ndices de contaminao fecal foram adequados em 4 (80%) das amostras, conforme
ANVISA (BRASIL, 2001).
64
AERBIOS MESFILOS
100%
J Fora J Dentro

Os resultados das anlises em relao especificao microbiolgica para

aerbios mesfilos ficaram fora dos padres nas 5 (100%) amostras, indicando a
necessidade de melhor higienizao do produto e/ou
armazenamento do vegetal aps a higienizao.
maiores cuidados no
65
20%
80%
J Fora J Dentro

positiva
Entre as 5 coletas, o local D apresentou apenas 1 (20%) das amostras em

conformidade ao padro microbiolgico para
Staphylococcus coagulase positiva,
decorrente da 2 coleta, realizada s 11h30min, logo na abertura do local, quando no

momento havia 1 pessoa se servindo no balco.
Com exceo da 1 coleta, realizada s 12h20min, as demais ocorreram
praticamente no horrio de abertura, com nmeros de pessoas no local tambm igual
ao da 2 coleta.
Nas cinco coletas, o folhoso foi oferecido cortado, fato que pode ter induzido a
contaminao bacteriana, em funo da maior manipulao.
De acordo com os resultados apresentados pelo local D, pode-se dizer que h
falhas no controle de temperatura adequada para o vegetal anteriormente
distribuio, devendo ainda reduzir a prtica de oferecer o produto cortado, diminuindo
o risco de contaminao, bem como checar a eficcia do processo de higienizao do
produto.
66
Local E
O local E oferece em mdia 100 refeies por dia entre consumo no local e
refeies do tipo marmitex.
So oferecidas seis opes de pratos frios. O balco de distribuio para os
mesmos no refrigerado, permanecendo os pratos frios em temperatura ambiente,
conforme Tabela 6. Durante as coletas pde-se perceber que os recipientes que
mantm a hortalia so de tamanhos pequenos o que torna a reposio mais
constante. Durante duas coletas foi possvel presenciar a reposio da hortalia no
balco e perceber que as mesmas estavam armazenadas sob refrigerao, estimandose temperatura inferior a 10C, percebida atravs do contato com a embalagem.
Durante as coletas foi realizado o revezamento de horrios, que ficou entre
11h05min e 12h25min, percebendo-se fluxo de 4 a 16 pessoas, nos diferentes horrios
(Tabelas 3).
Nas figuras 20, 21 e 22 esto representados os resultados das anlises do Local
E, obtidos durante a presente pesquisa.
COLIFORMES A 45C
20%
80%
J Fora J Dentro

-1
-1
As anlises para coliformes totais tiveram resultados variando entre as coletas,

ou seja, na 1 coleta contagem de 103NMPg-1, nas 2, 3 e 4 coletas de 104NMPg-1 e
67
na 5 coleta contagem de 101NMPg-1. Considerando estes valores, conclui-se que a

higienizao do produto feita de modo incorreto.
Em relao contaminao fecal, o local teve 1 (20%) das amostras em
desacordo com a ANVISA (BRASIL, 2001), decorrente da 3 coleta realizada no horrio
das 12h25min, com 15 pessoas no local.
AERBIOS MESFILOS
100%
J Fora J Dentro

Quanto aos padres microbiolgicos estabelecidos para contagem total de

aerbios mesfilos, o local E apresentou as 5 (100%) amostras em desacordo ao limite
proposto para o estudo, mostrando que deve-se manter o produto sob temperatura
adequada, durante o perodo de exposio, bem como monitorar o processo de
higienizao.
68
20%
80%
J Fora J Dentro

positiva
Entre as 5 coletas realizadas no local E apenas 1 (20%) das amostras esteve

dentro dos padres microbiolgicos propostos pelo estudo, fato que pode ser atribudo
pequena rea de circulao, permitindo a aglomerao das pessoas ao redor do
balco de distribuio, falta de proteo para o mesmo, assim como falta de
refrigerao durante a exposio.
O local E encontrava-se inadequado em relao aos critrios de distribuio dos
pratos frios, acontecendo em temperatura ambiente. Conforme Portaria CVS-6 (SO
PAULO, 1999) os alimentos frios expostos ao consumo imediato devem ser distribudos
no mximo a 10C por at 4 horas, para que no ocorra multiplicao microbiana e
estejam protegidos de novas contaminaes.
Local F
O local oferece F aproximadamente 100 refeies por dia, distribudas no local.
As seis opes de pratos frios eram expostas em balco refrigerado a uma
temperatura de 8C.
69
Os horrios de coletas mantiveram-se entre 11h15min e 12h25min, com clientes

entre 3 e 8 pessoas (Tabelas 3 e 4).
As Figuras 23, 24 e 25 representam os valores obtidos nas anlises
microbiolgicas para o local F.
COLIFORMES A 45C
20%
80%
J Fora J Dentro

-1
-1
As anlises para coliformes totais resultaram em contagens que variaram entre

as coletas, sendo que nas 1 e 2 coletas foram obtidas contagens de 104 NMPg-1, na
3 de 101 NMPg-1, na 4 coleta contagem < 2 NMPg-1 e na 5 de 102 NMPg-1. As
contagens encontradas em 3 das 5 coletas foram baixas considerando-se que alguns
aspectos positivos estavam envolvidos, como: higienizao adequada, boa qualidade
da gua utilizada na higienizao e adequado armazenamento anterior distribuio.
O percentual para coliformes a 45C ficou fora do padro proposto pela
legislao em apenas 1 (20%) das amostras coletadas.
70
AERBIOS MESFILOS
40%
60%
J Fora J Dentro
Quanto aos resultados para aerbios mesfilos, 3 (60%) amostras apresentaramse fora
dos padres estabelecidos para o estudo, sendo resultantes das 1, 2 e 5
coletas. Os horrios de coleta estiveram entre 11h10min e 12h45min. A coleta de maior

contagem bacteriana foi a 1, realizada aps 01h45min da abertura do local.
40%
60%
J Fora J Dentro

positiva
71
Para Staphylococcus coagulase positiva, o local teve 3 (60%) das 5 coletas de

acordo com a especificao adotada para o estudo.
O local F deve procurar atender s normas da legislao, conforme a Portaria
CVS-6 (SO PAULO, 1999) quanto ao uso do uniforme adequado para os funcionrios
e implementar os procedimentos higinico-sanitrios para adequar-se aos padres
microbiolgicos em relao aos coliformes a 45C. Deve tambm melhorar os critrios
de temperatura a fim de conseguir reduzir a contaminao por aerbios mesfilos e
Staphylococcus coagulase positiva.
Local G
O local G oferece aproximadamente 100 refeies por dia entre o consumo no
local e comercializao de refeies do tipo marmitex.
Entre as seis opes de pratos frios, duas delas so de folhosos, sendo oferecidas em
balco refrigerado em temperatura de 8C.
Os horrios das coletas ocorreram entre 11h10min e 12h20min e nas 05 coletas
o folhoso foi oferecido j cortado (Tabelas 3 e 5).
Entre as coletas, a freqncia da clientela teve variao de 3 a 8 pessoas
(Tabela 4).
O local G, assim como o local B, ofereceu em todas as coletas o folhoso cortado.
As Figuras 26, 27 e 28, ilustram os resultados das anlises microbiolgicas do
local G.
72
COLIFORMES A 45C
20%
80%
J Fora J Dentro
-1
-1
As anlises para coliformes totais tiveram resultados extremos, pois na 3 coleta

a contagem foi de 1,6 x 106 NMPg-1, enquanto que na 5 coleta a contagem foi de 1,7 x
101 NMPg-1. As 1, 2 e 4 coletas tiveram contagens de 103 NMPg-1 (Tabela 1),
considerando desta forma que o local precisa padronizar os procedimentos de higiene.
O percentual de anlises para coliformes a 45C teve 1 (20%) das amostras fora
dos limites estabelecidos pela legislao, sendo este percentual obtido na 3 coleta.
O local G, da mesma forma que os locais B e D, apresentou sempre a hortalia
alface picada para ser servida ao pblico e as anlises mostraram resultados bem mais
satisfatrios em contrapartida daquelas encontradas para os outros dois locais. Assim,
somente a manipulao maior para picar o produto, alm da maior exposio dos
tecidos internos ao ar e provvel contaminao no justificam as maiores
contaminaes nos locais B e D. Outros fatores como melhor higienizao e condies
de armazenamento e distribuio, com certeza, tm um papel importante no controle da
proliferao microbiana.
73
AERBIOS MESFILOS
20%
80%
J Fora J Dentro
Quanto aos resultados das anlises para aerbios mesfilos, os resultados

mostraram 4 (80%) das amostras fora da especificao estabelecida para o estudo.
Este resultado foi obtido nas 1, 2, 3 e 4 coletas, tanto em horrios prximos
abertura do local quanto por volta de uma hora aps a abertura, o que indica a
necessidade de melhor acondicionamento sob refrigerao e melhor higienizao.
40%
60%
J Fora J Dentro

positiva
74
De acordo com os resultados para Staphylococcus coagulase positiva, 3 (60%)

amostras estiveram fora dos limites propostos para o estudo. Este resultado foi obtido
nas 3, 4 e 5 coletas, em horrios prximos abertura do local e tambm com
1h20min aps a abertura, indicando a necessidade de correo nos critrios de
temperatura adotados no acondicionamento do produto e diminuio da incidncia de
vegetal cortado, buscando reduzir a manipulao.
Devido
as grandes variaes nas contagens microbianas encontradas, nas
amostras analisadas dos 7 locais amostrados, pode-se admitir que h falhas na

padronizao dos procedimentos higinicos, problemas no manuseio ps-colheita e/ou
no armazenamento anterior distribuio, rotatividade de fornecimento do vegetal,
problemas na qualidade da gua de irrigao do produto, ou seja, hipteses que
podem justificar a causa de um alto ndice de contaminao, refletindo nos resultados
das anlises do produto.
Como colocado, so hipteses a serem consideradas, uma vez que no foi feito
um monitoramento dessas etapas para uma avaliao que tornasse possvel apontar,
de fato, a(s) causa(s) das altas porcentagens de amostras com contagens microbianas
elevadas (> 103 UFCg-1 de Staphylococcus coagulase positiva e > 1,0 X 106 UFCg-1 de
bactrias mesfilas totais), alm das porcentagens de amostras que se apresentam
com valores de coliformes a 45C acima dos padres microbiolgicos legais vigentes
ANVISA (BRASIL, 2001).
A Figura 29 apresenta os percentuais de adequao dos 7 estabelecimentos,
considerando
pesquisadas.
os
resultados
das
anlises
microbiolgicas
para
as
bactrias
75
Avaliao Microbiolgica de Alfaces ( Lactuca sativa ) servidas em

Restaurantes Self-Service - Limeira,SP
100
90
Adequao (%)
80
70
60
50
40
30
20
10
0
A
Locais
Coliformes a 45C Staphylococcus coagulase positiva Aerbios mesfilos Salmonella spp
Figura 29 - Percentual de adequao dos resultados das anlises microbiolgicas apresentados pelos 07
locais, envolvidos no estudo
Observando a Figura 29, as amostras que apresentaram melhores condies

microbiolgicas e, portanto, em melhores condies para o consumo humano,
considerando-se apenas os parmetros microbiolgicos, foram coletadas no local F.
Tabela 7 - Coeficiente de variao (%)
Microrganismos
Coliformes Totais
86,86
200,14
28,25
11,74
115,54
138,22
221,31
Coliformes a 45C
201,77
164,72
131,51
189,31
188,23
223,60
219,93
Staphylococcus coagulase positiva
80,77
180,29
107,86
66,02
73,63
142,94
83,24
Aerbios mesfilos
124,40
112,81
109,92
40,50
114,98
112,83
92,27
A anlise da varincia apresentou um elevado coeficiente de variao entre as

35 amostras analisadas para os microrganismos estudados.
76
O alto grau de variao entre as amostras indica que as condies

microbiolgicas das mesmas no apresentaram uniformidade no decorrer das anlises.
A variao na contaminao por microrganismos pode ser justificada por
diversos fatores como: produto altamente contaminado, higienizao inadequada e
armazenamento incorreto do produto ps processamento.
Tabela 8 Comparativo entre os locais atravs da mdia, segundo as variveis: coliformes totais,
coliformes a 45C, aerbios mesfilos e Staphylococcus coagulase positiva
Locais
(1)
Staphylococcus coagulase Aerbios

-1
-1
positiva UFCg
mesfilos UFCg
3,1578 a
6,4508 a
Coliformes totais
-1
NMPg
3,1743 a
Coliformes 45C
-1
NMPg
(1)
1,9810 ab
4,3933 a
4,0468 a
3,1704 a
6,5516 a
4,0483 a
2,2007 ab
3,4378 a
6,6054 a
3,9107 a
0,8939 b
3,4954 a
7,0065 a
3,6822 a
0,8907 b
3,2299 a
6,6618 a
2,4452 a
0,5398 b
2,5348 a
6,1943 a
3,6585 a
1,5416 ab
3,3212 a
6,8659 a
Mdias de locais seguidas de mesma letra no diferem entre si pelo teste de Tukey em nvel de 0,05
de probabilidade.
De acordo com a Tabela 8, o local B apresentou a maior mdia entre os locais

para bactrias coliformes a 45C, comprovando os resultados anteriores anlise
estatstica.
77
g Coliforme a 45C
g Staphylococcus coagulase positiva
g Coliformes totais
g Aerbios mesfilos
Figura 30 Grfico biplot das condies microbiolgicas dos locais em relao aos microrganismos
estudados
Atravs da anlise Biplot, Gabriel (1971), os locais A e F mostraram os menores

valores nas contagens de coliformes totais, o local E mostrou-se o de melhor
adequao aos padres microbiolgicos para coliformes a 45C, o local B apresentou
alta prevalncia de bactrias coliformes a 45C, conforme j demonstrado em
resultados anteriores, o local F teve as menores contagens para Staphylococcus
coagulase positiva e o local G apresentou as maiores contagens para aerbios
mesfilos quando comparados entre si.
A variao na contaminao por microrganismos entre os locais pode ser
justificada por fatores associados manipulao, estrutura fsica e temperatura de
armazenamento anterior e posterior higienizao.
4.6 Anlises microbiolgicas realizadas com amostras aps desinfeco no

Laboratrio de Microbiologia de Alimentos da ESALQ
Complementando o estudo, foram realizadas anlises microbiolgicas com o

produto submetido desinfeco, segundo Leito et al. (1981); Portaria CVS-6 (SO
PAULO, 1999) e Silva Junior (2002).
78
Como as anlises microbiolgicas para Salmonella tiveram resultados negativos

no produto coletado diretamente dos estabelecimentos, para os testes com as amostras
submetidas desinfeco, o referido microrganismo no foi analisado, sendo realizadas
as anlises para coliformes totais, coliformes a 45C, contagem total de aerbios
mesfilos e Staphylococcus coagulase positiva.
Na Tabela 9, esto representados os resultados obtidos nas anlises
microbiolgicas do produto aps a desinfeco.
Tabela 9 - Resultados das anlises microbiolgicas do produto aps desinfeco no Laboratrio de
Microbiologia de Alimentos da ESALQ
Microrganismos
Locais
Coliformes
Coliformes a
-1
Totais NMPg
-1
45C NMPg
Staphylococcus coagulase
-1
positiva UFCg
Aerbios
Coletas
mesfilos
-1
UFCg
A
B
C
<2
1,6X10
0,3X10
2,3X10
7,0X10
<2
0,4X10
0,6X10
<2
6,2X10
0,4X10
4,9X10
1,1X10
<2
1,0X10
1,3X10
<2
<2
1,1X10
0,3X10
<2
<2
1,1X10
1,8X10
<2
0,5X10
1,1X10
4,6X10
Comparando os resultados das anlises dos produtos do mesmo lote, porm

submetidos desinfeco, percebe-se que houve redues considerveis na contagem
dos microrganismos.
Para coliformes totais, a contagem regrediu para 102NMPg-1 e < 2NMPg-1, com
variaes de 80% a 99% de reduo; para coliformes a 45C, o decrscimo atingiu
99%; para Staphylococcus coagulase positiva de 84% a 99% e para aerbios mesfilos
de 80% a 98%, valores que tornam o produto seguro para o consumo humano em
relao aos parmetros microbiolgicos analisados.
Fica claro que, pelos resultados obtidos no teste de desinfeco, se a alface foi
submetida ao processo de desinfeco no local de preparo e oferta (restaurantes), o
procedimento no foi executado de maneira satisfatria, uma vez que, com a
79
desinfeco no Laboratrio de Microbiologia da ESALQ - USP, os mesmos lotes que

haviam
mostrado
contaminaes elevadas
nas
determinaes
microbiolgicas
realizadas, apresentaram redues muito altas nessas contagens, muitas vezes

atingindo redues de 98-99%.
Estudos semelhantes presente pesquisa, envolvendo a sanificao de
hortalias, foram desenvolvidos mostrando o efeito do cloro e do vinagre na reduo de
patgenos.
Beuchat et al (1998), utilizando concentraes de 50 a 200ppm de cloro para
sanitizar frutas e vegetais frescos, bem como produtos minimamente processados em
escala comercial, submeteram a alface a uma concentrao de 200ppm de cloro por 10
minutos com posterior enxge, atingindo resultados de mais de 98% de reduo na
contaminao de aerbios mesfilos.
Concentraes maiores de cloro foram avaliadas por Garg; Churey e
Splittstoesser (1990), em hortalias sanitizadas em soluo contendo 300mgL-1 de cloro
livre. Esses autores observaram uma reduo de trs ciclos logartmicos na contagem
de bactrias em folhas de alface, mas o efeito no foi observado em outras hortalias,
como cenouras e repolho roxo.
Concentraes elevadas de cloro foram implicadas como causa de descolorao
de frutas e vegetais, aumento da corroso de equipamentos, e responsveis por formar
cloraminas volteis que representam risco sade dos trabalhadores, por provocarem
irritaes na pele e nos pulmes (HURST, 1995).
Park e Lee (1995) encontraram que concentraes altas de cloro promoveram
diminuio na contagem padro de microrganismos em agrio fresco, porm houve
perda significativa da qualidade da hortalia quando essa foi tratada com 300mgL-1 ou
mais de cloro. Alm disso, tratamentos imprprios base de cloro podem no eliminar
patgenos, como por exemplo a Listeria monocytogenes (BRACKETT, 1987).
Observaes de Porto (2001) obtidas a partir de estudo realizado com amostras
de alface intencionalmente contaminadas por L. monocytogenes e posteriormente
submetidas ao tratamento com agentes sanificantes base de cloro, mostraram que o
dicloroisocianurato de sdio foi o que apresentou melhor eficincia na reduo deste
microrganismo.
80
Entani et al. (1998), estudaram o efeito do cido actico (2,5%), obtendo

redues que foram de 2,0 x 106 UFCmL-1 a < 2,0 x 101 UFCmL-1, na populao de
E.coli O 157:H7.
Eiroa e Porto (1996) avaliaram a eficincia do vinagre a 6% em alfaces e
obtiveram redues de 5 ciclos logartmicos contra o Vibrio cholerae, no sendo obtido
resultado semelhante para coliformes totais, coliformes fecais e aerbios mesfilos.
Leito et al. (1981) observaram a reduo de 99,9% da microflora bacteriana
contaminante da alface, decorrentes de efeito conjugado da lavagem e desinfeco,
recomendando ainda que para maior garantia do produto, a aquisio de hortalias seja
feita sob rgidas especificaes quanto ao aspecto higinico-sanitrio.
Como garantia do produto pode-se sugerir o uso do sistema APPCC,
compreendendo produo, distribuio e consumo de alimentos, sendo a sanificao
um ponto de controle efetivo para reduo/eliminao de patgenos e bactrias em
geral.
Pelos dados obtidos na presente pesquisa fica a recomendao de que os
rgos de controle devem realizar fiscalizaes com maior freqncia e desenvolver
programas de treinamento para os proprietrios e funcionrios de restaurantes para
orientao e conscientizao quanto garantia das preparaes oferecidas nos locais.
Tais atitudes, se no eliminarem, com certeza reduziro bastante os riscos de doenas
alimentares que a populao que consome tais produtos estar exposta.
81
5 CONCLUSES
Atravs dos resultados das anlises microbiolgicas do vegetal folhoso alface

(Lactuca sativa) nos 7 estabelecimentos envolvidos no estudo, pode-se notar diferenas
que envolvem aspectos estruturais do estabelecimento e de manipulao, com reflexos
na qualidade microbiolgica do produto.
Comparando os locais percebe-se que os estabelecimentos com maior nmero
de refeies servidas (B e C) apresentaram os maiores ndices de contaminao para o
produto, considerando coliformes a 45C.
O local B esteve 100% fora da adequao, servindo o produto sempre
contaminado por coliformes a 45C em nveis superiores aos tolerados pela legislao.
Os locais D e E apresentaram os maiores nveis de contaminao do produto
por Staphylococcus coagulase positiva.
Pelas altas contagens de aerbios mesfilos encontradas em muitas das
amostras analisadas (106 107UFCg-1), fica evidente que melhores processos de
higienizao e/ou sanificao devem ser efetuados no produto, bem como mais
ateno na temperatura de armazenamento/oferecimento do produto.
Os locais D e E tiveram 80% de adequao em relao aos coliformes a 45C,
conforme a legislao.
Os locais C e E ofereciam o folhoso fora da temperatura de refrigerao, no
cumprindo as normas de armazenamento durante a distribuio, conforme a Portaria
CVS-6 (SO PAULO,1999), cuja temperatura deve ser de at 10C para alimentos
frios.
O local F atendeu em 80% aos limites para coliformes a 45C, 60% de
adequao aos parmetros estabelecidos para Staphylococcus coagulase positiva e
40% de adequao nos resultados para aerbios mesfilos, mostrando-se assim como
o estabelecimento de melhores condies para o consumo do produto.
O local G, em todas as coletas, apresentou o produto j cortado, indicando maior
manipulao. Mesmo assim, apenas 1 coleta (20%) esteve fora dos limites
estabelecidos para coliformes a 45C pela legislao.
82
Os locais B, D e G, durante as 7 coletas, ofereceram o folhoso cortado (picado),

porm houve divergncia nos resultados em relao aos coliformes a 45C. Enquanto o
local B teve todos os resultados (100%) fora do padro exigido pela legislao, os
locais D e G tiveram apenas 1 (20%) amostra com resultado fora do padro exigido.
Todas as 35 amostras de alface dos 7 restaurantes amostrados no
apresentaram contaminao por Salmonella em 25 g do produto, o que as coloca de
acordo com a legislao vigente da ANVISA (BRASIL, 2001) para este parmetro
microbiolgico.
Considerando os resultados das anlises com o produto aps desinfeco no
Laboratrio de Microbiologia de Alimentos da ESALQ - USP, pode-se notar a eficincia
da mesma e, portanto, a necessidade dos procedimentos de desinfeco para reduo
das contagens microbiolgicas visando um padro higinico-sanitrio satisfatrio,
conforme estabelecido pela Portaria CVS-6 (SO PAULO, 1999).
Observando os 7 locais do estudo notou-se que a legislao estabelecida pela
Portaria CVS-6 (SO PAULO, 1999) para os estabelecimentos em questo no
seguida de acordo.
83
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Maria Almeida

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Maria Almeida

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Universidade de So Paulo

Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz

Avaliao microbiolgica de alfaces (Lactuca sativa) em restaurantes

Maria Teresa Trov de Almeida

Dissertao apresentada para obteno do ttulo de

Maria Teresa Trov de Almeida

Avaliao microbiolgica de alfaces (Lactuca sativa) em restaurantes

Dissertao apresentada para obteno do ttulo de

Dados Internacionais de Catalogao na Publicao (CIP)

Almeida, Maria Teresa Trov de

1. Alface 2. Contaminao de alimentos 3. Higiene de alimentos 4. Microbiologia de

Dedico este trabalho ao meu marido Jos Luiz, ao meu

Pode-se viver no mundo uma vida magnfica quando se sabe

Procedimento para preparo das diluies.................................................. 32

Contagem de Coliformes totais e Coliformes fecais pelo mtodo do

Kit 1-2 Test para Salmonella spp. da Bio Control.................................... 35

Imunobanda caracterstica de positividade para Salmonella..................... 36

Procedimento para deteco de Salmonella spp....................................... 37

Deteco de Staphylococcus coagulase positiva....................................... 39

Procedimento analtico para deteco de aerbios mesfilos................... 40

Percentual de amostras em acordo e em desacordo comparados ao

Percentual de amostras com resultados em acordo e em desacordo

Figura 10 - Percentual de amostras com resultados em acordo e em desacordo

Figura 11 - Percentual de amostras em acordo e em desacordo comparados ao

Figura 18 - Percentual de amostras com resultados em acordo e em desacordo

Figura 25 - Percentual de amostras com resultados em acordo e em desacordo

Resultados das anlises microbiolgicas................................................... 43

Locais e datas das coletas......................................................................... 45

Horrios das coletas nos 07 locais............................................................ 46

Nmero de pessoas por local nos horrios das coletas............................. 46

Produto picado por local e coleta............................................................... 47

Temperatura ambiente por local e coleta................................................... 48

Coeficiente de variao (%)....................................................................... 75

Comparativo entre os locais atravs da mdia, segundo as variveis,

Resultados das anlises microbiolgicas do produto aps desinfeco

A alimentao tende a ser mais diversificada quando so considerados fatores

Calcula-se que o potencial

terico das refeies coletivas no Brasil seja superior a 40 milhes de unidades

alimentao, uma nova categoria de alimentos, batizados de alimentos funcionais ou

Considerando o envolvimento da bactria Staphylococcus aureus em surtos de

2.1 Fatores envolvidos no consumo do produto

Os alimentos de origem vegetal so geralmente consumidos na sua forma crua e

Andr et al., (1999), verificaram a temperatura de saladas de vegetais com

Os alimentos, h muito tempo, tm sido alvo de preocupao de rgos

armazenamento e distribuio dos alimentos nas diversas etapas do processo de

2.2 Microrganismos de interesse na presente pesquisa

2.2.1 Coliformes a 45C

Coliformes a 45C so bactrias na forma de bastonetes Gram-negativos, no

2.2.2 Salmonella spp

Salmonelas so bactrias na forma de bacilos Gram-negativos, no esporulados.

Segundo Jay (2005), algumas mudanas ocorreram na taxonomia de

2.2.3 Staphylococcus coagulase positiva

De acordo com Martins (2000), os estafilococos so cocos Gram-positivos,

Tradicionalmente os estafilococos so divididos em duas categorias: coagulase

ser o tempo necessrio para a produo de enterotoxina. Em condies timas, a

Portaria 451, de 19 de setembro de 1997, estipulava parmetros para contagens de S.

2.2.4 Aerbios mesfilos

Os microrganismos aerbios mesfilos no esto diretamente relacionados com

2.3 Importncia da higienizao e desinfeco de folhosos

A higiene dos alimentos se caracteriza, principalmente, por processos pelos

higinico-sanitria dos alimentos, evitando riscos sade do consumidor pela

2.3.1 Processo de higienizao de utenslios, bancadas e mesas de apoio

Visando garantir a adequada manuteno da higiene de utenslios, bancadas e

2.3.2 Higienizao dos vegetais folhosos