Descoberta da estrutura do DNA

e da natureza do cdigo gentico

sequncia de bases dos genes?

funo e regulao dos genes?
manipulao da informao gentica?

Tecnologia do DNA recombinante

DNA recombinante
DNA que resulta da juno (no natural)
de DNA proveniente de duas fontes diferentes

Algumas tcnicas utilizadas para

produzir DNA recombinante
Corte do DNA em locais especficos utilizando enzimas de restrio
facilita isolamento e manipulao

Electroforese em gel de agarose a separao electrofortica o mtodo

mais utilizado para estimar o tamanho de fragmento de DNA ou RNA.
Clonagem utilizando vectores ou PCR uma molcula copiada de maneira
a gerar muitas molculas iguais
Hibridao baseia-se na capacidade que uma sequncia de cidos nucleicos
tem de se ligar a uma sequncia complementar e serve para identificar uma
determinada sequncia
Sequenciao determinao da sequncia de bases, permite identificar
genes e deduzir a sequncia (e no s) das protenas

Produo de DNA recombinante

descoberta de 2 tipos de enzimas

Enzimas de restrio

DNA ligases

cortam o DNA em locais especficos gerando um

conjunto reprodutvel de fragmentos de DNA

Restabelecem as ligaes fosfodiester entre os

grupos fosfato 5 e hidroxilo 3, numa reaco
dependente de ATP

Enzimas de restrio
isoladas de bactrias (destriem DNA de fagos)
nome tem origem no nome do organismo do qual foi isolada

ex. EcoRI Escherichia coli, R estirpe RY13, I ordem de identificao

reconhecem sequncias de 4 8 nucleotdeos

locais de restrio

seq. curtas podem ocorrer em qualquer molcula longa de DNA

uma dada enzima de restrio vai cortar uma dada molcula de DNA
sempre nos mesmos locais, produzindo sempre o mesmo conjunto de
fragmentos de DNA

Enzimas de restrio

enzima de restrio + metilase sistema que protege o DNA do hospedeiro e

destri DNA estranho

Enzimas de restrio
muitos locais de restrio so repeties invertidas a sequncia das
duas cadeias igual quando lida de 5 para 3 sequncias palindrmicas
muitas cortam o DNA em ziguezague deixando extremidades de
cadeia nica extremidades coesivas

- permite o emparelhamento de caudas de diferentes

fragmentos de DNA cortados com a mesma enzima
- os dois fragmentos emparelhados podem depois ser unidos
pela enzima DNA ligase com consumo de ATP

Enzimas de restrio
Exemplos

Corte a direito; extremidades de cadeia dupla

(Hpa I)
Corte em ziguezague; extremidades de cadeia
simples e protuberantes - extremidades coesivas
(Sticky ends)
EcoRI e HindII a 5, PstI a 3

Enzimas de restrio

37C

Enzimas de restrio

37C

Temperatura e tampo tm que

ser adequados
37C
Tampo R

37C
Tampo O

37C
Tampo R

30C

1 unidade - quantidade
nec. para digerir
1 g DNA numa hora

DNA ligase
As extremidades obtidas por corte com uma
determinada enzima (compatveis) emparelham e a sua
ligao com a DNA ligase reconstitui a molcula de
DNA
Para refazer a ligao fosfodiester necessrio ATP
Ligar ext. cortadas a direito mais complexo
DNA
ligase
lig. fosfodiester

Tb se pode modificar as extremidades de modo a torn-las

compatveis