Arthrospira Platensis

UNIVERSIDADE DE SO PAULO
FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS

Programa de Ps-Graduao em Tecnologia Bioqumico-Farmacutica
rea de Tecnologia de Fermentaes
Cultivo de Spirulina platensis por processo

descontnuo alimentado repetitivo utilizando uria
como fonte de nitrognio
MARCELO CHUEI MATSUDO
Dissertao para obteno do grau de

MESTRE
Orientador:
Prof. Dr. Joo Carlos Monteiro de Carvalho
So Paulo
2006
MARCELO CHUEI MATSUDO
Cultivo de spirulina platensis por processo descontnuo

alimentado repetitivo utilizando uria como fonte de nitrognio
Comisso Julgadora
Dissertao para obteno do grau de
MESTRE
Prof. Dr. Joo Carlos Monteiro de Carvalho

Orientador / Presidente
Profa. Dra. Telma Mary Kaneko

1 Examinador
Prof. Dr. Carlos Eduardo Nascimento Sassano

2 Examinador
So Paulo, 25 de julho de 2006
Aos meus pais, Chuken e Hatsuko,

por se dedicarem minha educao.
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Joo Carlos Monteiro de Carvalho, pela orientao, pelos
ensinamentos, pela confiana, pela amizade e por dizer que no final, tudo d certo.
FAPESP (Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo) pela
concesso da Bolsa de Mestrado e do Auxlio a Pesquisa.
Ao Prof. Tit. Sunao Sato, pelo apoio e incentivo.
Profa. Dra. Telma Mary Kaneko pelas sugestes de correo no trabalho.
Aos professores e funcionrios do Departamento de Tecnologia BioqumicoFarmacutica, em especial a Kleber A. de Almeida (Lab. Tecnologia de
Fermentaes), Elza e Miriam (Secretaria-FBT).
Aos funcionrios da Biblioteca do Conjunto das Qumicas.
Aos secretrios da Ps-Graduao - FCF, Jorge Lima e Elaine Ishiko pela
amizade e eficincia no atendimento aos ps-graduandos.
A Raquel Pedrosa Bezerra, pelas discusses, por compartilhar seus
conhecimentos, pela companhia e pelo indispensvel apoio nos experimentos.
Aos amigos ps-graduandos da Faculdade de Cincias Farmacuticas, em
especial a Cinthia (Urso), Lvia, Mayla, Denise, Lucas (Petit) e Andr.
Universidade de So Paulo:
- pela possibilidade de participao no Programa de Aperfeioamento de Ensino na
Faculdade de Cincias Farmacuticas e no Instituto de Cincias Biomdicas.
- pela disponibilizao do CEPEUSP (Centro de Prticas Esportivas), onde alm de
praticar diversos esportes, pude tambm conquistar muitas amizades.
- pela concesso da vaga no CRUSP (Conjunto Residencial).
Aos amigos do Crusp e outros, principalmente Accio, Adalberto, Jony,
Patrcia, Claudinei, Rodrigo, Artemir e Leonardo.
Aos meus pais (Chuken e Hatsuko), irms (Rosa, Elena, Luiza, Rosria, Lcia
e Eliza) e irmo (Marcos) por sempre se preocuparem com a minha formao e
ainda aos meus cunhados (Bernardo, Marcelo, Csar e Mauro), cunhada (Luciana) e
sobrinhos (Adriana, Alessandra, Marina, Daniel, Andr e Lumi) pelo incentivo e
apoio.
Aos amigos da graduao (Instituto de Biocincias de Rio Claro / Unesp),
pelos bons momentos ao longo dos cinco anos do curso de Cincias Biolgicas e
pelo incentivo realizao da Ps Graduao.
Aos amigos do Laboratrio de Microbiologia Industrial que junto com meu
orientador de Iniciao Cientfica, Prof. Dr. Jonas Contiero, me ajudaram a encontrar
o gosto pela cincia.
Por que nos impressionamos e ficamos to obcecados

com coisas e feitos de grandes dimenses,
quando na verdade so as coisas pequenininhas que,
combinadas, tornam as grandes coisas possveis?
(Bradley Trevor Greive)
RESUMO
A cianobactria Spirulina platensis possui alto teor de protena e
vem sendo
cultivada fotoautotroficamente para a produo de biomassa microbiana.

Embora as fontes convencionais de nitrognio utilizadas para a produo de
Spirulina spp. sejam os nitratos, h a possibilidade do emprego de uria,
utilizando o processo descontnuo alimentado, com diminuio do custo de
produo. O emprego do processo descontnuo alimentado repetitivo para o
cultivo desta microalga utilizando a uria como fonte de nitrognio poderia
facilitar os cultivos em escala de produo, pois no haveria a necessidade de
preparo de inculo para cada ciclo de produo, alm de possibilitar o
aumento da produtividade do sistema. Este trabalho tem o objetivo de verificar
o comportamento do cultivo microbiano com este processo, visto que
no
foram encontrados na literatura tais estudos para o cultivo de S. platensis.

Foi verificada a influncia dos parmetros frao de corte, tempo de
alimentao de uria e ciclos de cultivo neste tipo de processo, tendo como
variveis dependentes a concentrao celular mxima (Xm), a produtividade
em clulas (Px) e o fator de converso de nitrognio em clulas (Yx/n), bem
como a composio protica e lipdica da biomassa obtida. Os resultados
obtidos permitem concluir que, de uma forma geral, uma frao de corte de
80% associada a um tempo de alimentao de 6 dias leva a melhores
condies de cultivo com bons resultados nos trs parmetros cinticos (em
mdia, 2101 mg.L-1, 219 mg.L-1.d-1 e 10,3 mg.mg-1 para Xm, Px e Yx/n,
respectivamente), que foram reprodutveis ao longo de 3 ciclos.
Palavras-chave:
repetitivo; uria.
Spirulina
platensis;
processo
descontnuo
alimentado
SUMMARY
Spirulina
platensis,
with
high
protein
content,
can
be
cultivated
photoautotrophically for the microbial biomass production. Although nitrates are

the conventional source of nitrogen for the Spirulina spp. production, there is a
possibility of the use of urea, in a fed-batch process, leading to a cost
reduction. The application of repeated fed-batch process, using urea as
nitrogen source, could propitiate the cultivation of this microorganism in a
production scale, since it would not need to prepare the inoculum for each
production cycle. Moreover, there is a possibility to improve the productivity of
this process. The aim of this work was to verify the behavior of the microbial
cultivation employing this process, since this kind of study for Spirulina
platensis production was not found in literature. The influence of withdrawn
rate, urea feeding time and cultivation cycles were studied, considering
maximum cell concentration (Xm), cell productivity (Px), nitrogen-to-cell
conversion (Yx/n), and protein and total fat contents as dependent variables.
The results show that in general a 80% of withdrawn rate associated with 6
days of feeding time leads to the best cultivation conditions with satisfactory
results of Xm, Px and Yx/n (2101 mg.L-1 , 219 mg.L-1.d-1 and 10.3 mg.mg-1, in
average, respectively), that could be reproduced through the three cycles.
Key words: Spirulina platensis; repeated fed-batch process; urea.
LISTA DE FIGURAS
Pg.
Figura 1
Spirulina platensis (UTEX 1926).....................................
23
Figura 2
Minitanques de PVC para cultivo de S. platensis.......................
37
Figura 3
Curva de calibrao para determinao da concentrao de

Spirulinaplatensis......................................................................
44
Curva de calibrao para determinao da concentrao de

amnia total em meio de cultivo................................................
45
Concentrao celular (X) em funo do tempo para ensaio 1

(Tempo de alimentao: 1 dia; Frao de corte: 20%)...................
47
Concentrao celular (X) em funo do tempo para ensaio 2

(Tempo de alimentao: 3 dias; Frao de corte: 20 %)................
49
Concentrao celular (X) e pH em funo do tempo para ensaio

3 (Tempo de alimentao: 5 dias; Frao de corte: 20 %)...........
51

4 (Tempo de alimentao: 4dias; Frao de corte: 50 %)............
53

5 (Tempo de alimentao: 7dias; Frao de corte: 50 %)............
55

6 (Tempo de alimentao: 10 dias; Frao de corte: 50 %).........
58

7 (Tempo de alimentao: 6 dias; Frao de corte: 80 %)...........
60

63

66
Figura 4
Figura 5
Figura 6
Figura 7
Figura 8
Figura 9
Figura 10
Figura 11
Figura 12
Figura 13
Figura 14

68

11 (Tempo de alimentao: 12 dias; Frao de corte: 95 %).......
71

12 (Tempo de alimentao: 16 dias; Frao de corte: 95 %).......
74
Representao esquemtica da assimilao de bicarbonato por

Spirulina platensis....................................................................
79
Figura 18
Porcentagem de Amnia e Amnio em Funo do pH...............
80
Figura 19
Concentraes relativas de gs carbnico, bicarbonato

carbonato (%) em funo do pH.................................................
81
Esquema da assimilao da amnia proveniente de uria e

nitrato de sdio........................................................................
82
Figura 15
Figura 16
Figura 17
Figura 20
10
LISTA DE TABELAS
Pg.
Tabela 1
Composio de aminocidos de protenas de S. platensis e S.

maxima (mg.g-1 protena bruta Nx6,25) em comparao com o
recomendado pela FAO (Food and Agriculture Organization)
para crianas pr-escolares......................................................
20
Comparao entre produo de protena de Spirulina spp. e de

outras fontes..............................................................................
24
Tabela 3
Matriz de ensaio........................................................................
42
Tabela 4
Concentrao celular (X), valor de pH e concentrao de

amnia total no Ensaio 1...........................................................
46

48

50

52

54

56

amnia total no Ensaio 7..........................................................
59

amnia total no Ensaio 8.........................................................
61

64
Tabela 2
Tabela 5
Tabela 6
Tabela 7
Tabela 8
Tabela 9
Tabela 10
Tabela 11
Tabela 12
11
Tabela 13
Tabela 14
Tabela 15
Tabela 16
Tabela 17
Tabela 18
Tabela 19
Tabela 20
Tabela 21
Tabela 22
Tabela 23
Tabela 24

amnia total ao longo do Ensaio 10............................................
67

69

72
Contedo de protenas e lipdeos na biomassa de Spirulina

platensis obtida nos ensaios realizados......................................
75
Parmetros cinticos: concentrao celular mxima (Xm),

produtividade em clulas (Px) e fator de conversao de
nitrognio em clulas (YX/N ) dos ensaios realizados...................
76
Levantamento de preos de uria e nitrato de sdio (grau

analtico e comercial).................................................................
83
Anlise estatstica de covarincia (ANCOVA) aplicada aos

dados experimentais de concentrao celular mxima
(Xm)..........................................................................................
84
Anlise estatstica de varincia (ANOVA) aplicada aos dados

experimentais de concentrao celular mxima (Xm) em cada
Frao de Corte.........................................................................
86

dados
experimentais
de
produtividade
de
clulas
(Px)...........................................................................................
87

dados experimentais de fator de converso de nitrognio em
clulas (YX/N ).............................................................................
89

dados experimentais de teor de protenas na biomassa
obtida........................................................................................
91

dados experimentais de teor de lipdeos na biomassa obtida......
92
12
SUMRIO
RESUMO........................................................................................................6
SUMMARY ....................................................................................................7
LISTA DE FIGURAS ......................................................................................8
LISTA DE TABELAS ....................................................................................10
1. INTRODUO..................................................................................14
2. OBJETIVOS..... .........................................................................................16
3. REVISO DE LITERATURA......................................................................17
3.1. Aspectos nutricionais e composio da biomassa...................................19
3.2. Distribuio geogrfica e histrico.......................................................... 21
3.3. Classificao e Morfologia ..................................................................... 22
3.4. Produo de Spirulina platensis ............................................................. 23
3.5. Fonte de Nitrognio ............................................................................... 26
3.6. Processos de cultivo .............................................................................. 29
3.6.1 O processo descontnuo alimentado repetitivo ................................31
4. MATERIAL E MTODOS ..........................................................................34
4.1. Microrganismo: ...................................................................................... 34
4.2. Manuteno da Spirulina platensis: ........................................................ 34
4.3. Meio de cultivo: ...................................................................................... 34
4.3.1. Meio padro para cultivo de S. platensis: ............................................ 34
4.3.2. Meio modificado .................................................................................. 35
4.4. Preparo do inculo ................................................................................. 36
4.5. Dispositivo para cultura .......................................................................... 36
4.6. Descrio de um experimento tpico....................................................... 37
4.7. Tcnicas Analticas ................................................................................ 38
4.7.1. Acompanhamento do cultivo................................................................ 38
4.7.1.1. Determinao da concentrao celular ............................................. 38
4.7.1.1.1. Construo da curva de calibrao para
determinao da concentrao celular .......................................................... 38
4.7.1.2. Determinao da concentrao de amnia total ............................... 39
4.7.1 3. Determinao do pH ........................................................................ 39
4.7.2. Avaliao da biomassa obtida ............................................................. 40
4.7.2.1. Lipdeos totais.................................................................................. 40
13
4.7.2.2. Protenas totais ................................................................................ 40

4.8. Experimentos realizados ........................................................................ 41
4.8.1. Processo de cultivo ............................................................................. 41
4.8.2. Planejamento Experimental ................................................................. 41
4.9. FORMA E ANLISE DOS RESULTADOS............................................... 42
4.9.1. Frmulas e mtodos utilizados nos clculos dos
parmetros cinticos ..................................................................................... 43
5. RESULTADOS E DISCUSSO .................................................................44
5.1. Curva de Calibrao para determinao de concentrao celular ........... 44
5.2. Curva de Calibrao para determinao da concentrao de amnia
total .............................................................................................................. 44
5.3. Resultados referentes aos acompanhamentos dos ensaios 1 a 12 ........ 45
5.4. CRESCIMENTO DE Spirulina platensis...................................................77
5.5. SUBSTITUIO DO NITRATO DE SDIO PELA URIA........................ 81
5.6. AVALIAO ESTATSTICA DOS RESULTADOS ................................... 83
5.6.1. Anlise da concentrao celular mxima (Xm) .................................... 84
5.6.2. Anlise da produtividade em clulas (Px) ............................................ 86
5.6.3. Anlise do fator de converso de nitrognio em clulas (Yx/n) ............ 89
5.6.4. Anlise do teor de protenas e lipdeos da biomassa. .......................... 91
6. CONCLUSES .........................................................................................94
7. REFERNCIAS.........................................................................................95
14
1. INTRODUO
A produo de microrganismos fotossintticos, como microalgas e
cianobactrias, tem sido amplamente estudada na biotecnologia, pois esses
microrganismos apresentam um sistema biolgico muito eficiente para a
utilizao da energia solar para a produo de compostos orgnicos
(VONSHAK,
1997).
cianobactrias
Dentre
filamentosas,
eles,
capazes
destacam-se
de
formar
as
Spirulina
naturalmente
spp.,
grandes
colnias em guas superficiais tropicais e subtropicais contendo altos nveis

de carbonato e bicarbonato (TOMASELLI, 1997).
Spirulina um dos gneros mais conhecidos, dentro do grupo de
microrganismos fotoautotrficos, e foi produto de consumo dos Astecas, no
Vale do Mxico, e da populao na regio do Lago Chaad, na frica
(PARADA et al., 1998).
Quando este microrganismo foi re-descoberto pelo chamado mundo
civilizado, seu grande atrativo foi o fato de apresentar excelente fonte
protica e crescimento rpido em ambiente aqutico rico em sais (HAYASHI
et al., 1996). Desde ento, essa cianobactria tem sido usada como
suplemento alimentar por humanos por possuir grande quantidade de
minerais e cidos graxos poliinsaturados como, por exemplo, o cido gama
linolnico. Alm disso, Spirulina spp. so utilizadas como fontes de vitaminas
(especialmente B12), -caroteno, ficocianina e clorofila. Recentemente,
outras substncias e nutrientes foram purificados dessa biomassa, alguns
inclusive
com
grande
importncia
para
indstria
farmacutica
(BOROWITZKA, 1995).
Desde a dcada de 1970, Spirulina platensis comercializada como
um alimento seguro para o consumo humano e aprovada, para a nutrio
humana, por vrios rgos governamentais, agncias de sade e outras
associaes em mais de 80 pases. Baseados nas pesquisas sobre qualidade
e segurana, realizados por dcadas, muitos pases e organizaes tm
estabelecido
padres
de
qualidade
segurana
de
Spirulina
spp..
Atualmente, mais de 70% de Spirulina spp. comercializadas se destinam ao
15
consumo humano, principalmente para fins nutracuticos (BELAY, 1997 e

VONSHAK, 1997).
Enquanto grandes empresas de alguns pases se dedicaram
produo de Spirulina sp. visando atender ao mercado consumidor, centros
de pesquisa em todo o mundo comeam a estud-la sob diversos aspectos
como perfil bromatolgico em clulas cultivadas sob diferentes condies
fsico qumicas; diversificao das fontes de nutrientes para o cultivo e
utilizao da biomassa na biopurificao de efluentes (NUNES et al., 2003).
Este trabalho busca avaliar a viabilidade da aplicao do processo
descontnuo alimentado repetitivo para a produo de Spirulina platensis,
tendo uria como fonte alternativa de nitrognio. Neste tipo de processo, uma
poro de um processo em batelada retirada a determinados intervalos de
tempo e a parte residual da cultura usada como inculo para a prxima
batelada.
Segundo BAJPAI & BAJPAI (1987), alm de poder levar a um
aumento da produtividade do sistema, o processo descontnuo alimentado

repetitivo apresenta a vantagem de no haver necessidade de se preparar
inculo para o segundo e os subseqentes ciclos. Ento, esse pode ser
considerado como um dos eficientes sistemas para produo econmica de
biomassa.
16
2. OBJETIVOS
Verificar a influncia dos parmetros frao de corte, tempo de
alimentao de uria e ciclos de cultivo no processo descontnuo alimentado
repetitivo para produo de S. platensis, tendo como variveis dependentes a
concentrao celular mxima, a produtividade em clulas e o fator de
converso de nitrognio em clulas, bem como a composio protica e
lipdica da biomassa obtida.
17
3. REVISO DE LITERATURA
Segundo BOROWITZKA (1999), o cultivo de microalgas um ramo da
moderna biotecnologia, embora haja registros de cultivo de Chlorella vulgaris
j em 1890. O cultivo de microrganismos fotossintticos um processo
vantajoso devido no s produo de protenas de alto valor biolgico para
nutrio humana e animal, mas tambm para obteno de outros produtos
como pigmentos, lipdeos e vitaminas (AARONSON et al., 1980).
Algumas cianobactrias produzem substncias que podem promover ou
inibir o desenvolvimento microbiolgico. PARADA et al. (1998) determinaram
que meio de cultivo livre de clulas contendo produtos extracelulares de
Spirulina platensis promove o desenvolvimento de bactrias lticas benficas,
como Lactococcus lactis subsp. lactis, in vitro. No entanto, testes ainda
devem ser realizados em ratos e humanos para determinar se esse
complemento alimentar pode ser usado como um tipo de prbitico, para
beneficiar a colonizao intestinal de bactrias lticas e a sade humana.
Ainda enfocando o uso de Spirulina spp. como prebitico, VARGA et al.
(2002) investigaram o efeito da biomassa de Spirulina platensis em
organismos deteriorantes e na flora microbiana caracterstica de leite
fermentado por uma combinao de bactrias starter, Acidophilus-BifidusTermophilus (ABT), durante um armazenamento a 15 o C e 4 o C. Verificaram
que a biomassa da cianobactria exerceu influncia positiva sobre a
viabilidade das bactrias starter ABT, independentemente da temperatura em
que o produto foi armazenado. Alm disso, no se detectou organismos
deteriorantes em nenhuma das amostras, indicando excelentes condies
sanitrias durante o processamento e embalagem do produto. Por fim, a
biomassa de Spirulina platensis aumentou o contedo de aminocidos
essenciais e vitaminas, alm de melhorar a composiao de cidos graxos.
Segundo os autores, a abundncia de componentes bioativos na Spirulina
platensis apresenta grande importncia sob o ponto de vista nutricional, haja
visto que essa biomassa proporciona uma nova oportunidade na produo de
alimentos funcionais derivados do leite.
18
Estudos sobre o uso de algas como trocadores gasosos fotossintticos

para emprego em viagens espaciais tambm foram relatados. MORIST et al.
(2001)
cultivaram
Spirulina platensis em
fotobiorreator contnuo,
para
emprego em alimentos, acreditando que organismos fotossintticos, provendo

material comestvel, possam sustentar a vida do homem em misses
espaciais. Esses pesquisadores desenvolveram um processo de recuperao
da biomassa e verificaram processos de secagem e armazenamento que
pudessem manter suas caractersticas por um maior tempo. De acordo com
os resultados, concluiu-se que preparaes baseadas em Spirulina platensis
podem ser consideradas como uma potencial fonte alimentar para o homem
no espao, pois a biomassa da microalga pode ser eficientemente obtida e
tratada, sendo microbiologicamente segura, alm de manter a composio
qumica e nutricional.
O
cultivo
de
microrganismos
fotossintticos
apresenta
alguns
problemas de implementao devido ao alto custo de extrao e secagem do

produto,
bem
como
presena
de
membrana
celulsica,
de
baixa
digestibilidade. Esse tipo de problema, entretanto, no ocorre quando se

emprega
Spirulina
sp.
(DILLON
et
al.,
1995;
RICHMOND,
1988).
cianobactria Spirulina platensis apresenta tamanho relativamente grande

dos agregados de clulas e parede celular mucopolissacardica, facilmente
digervel (HENRIKSON et al., 1989).
A produo comercial de microalgas em grande escala iniciou-se na
dcada de 1960, no Japo, com o emprego de Chlorella (BOROWITZKA,
1999). Desde ento, a indstria de biotecnologia de microalgas tem se
expandido e diversificado significativamente, e esse crescimento bem
ilustrado pela produo de Spirulina spp. que, segundo BOROWITZKA
(1999), de menos de 30 toneladas em 1975, a produo global desse
microrganismo
aumentou
para
mais
de
2.500
toneladas
em
1998.
Shimamatsu (2004) estima que a produo total anual dessa biomassa seja
de 3000 toneladas.
19
3.1. Aspectos nutricionais e composio da biomassa
O consumo de Spirulina spp. traz benefcios sade humana devido a

sua composio qumica, incluindo compostos como aminocidos essenciais,
vitaminas (especialmente B12), pigmentos naturais (como carotenides,
xantofilas, ficobilinas e clorofila) e cidos graxos essenciais, particularmente
cido -linolnico, um precursor das prostaglandinas do corpo.
Alm do cido -linolnico, podem ser encontrados tambm cido
palmtico, cido palmitolico, cido esterico, cido olico e cido linolico
(SASSANO, 2004). Este autor, cultivando Spirulina platensis em processo
contnuo, utilizando cloreto de amnio como fonte de nitrognio, verificou que
a biomassa obtida em todos os experimentos realizados apresentou uma
grande quantidade de cidos graxos polinsaturados, o que indica a
importncia desses compostos na constituio do microrganismo. Alm disso,
este mesmo trabalho mostra que as diferentes condies de cultivo
empregadas, em processo contnuo, no influenciou no teor do cido
linolnico na biomassa final. Por outro lado, COHEN (1997) mostra que
diferentes cepas de Spirulina apresentam diferentes teores de cido
linolnico.
Esse microrganismo apresenta um satisfatrio contedo balanceado de
aminocidos, contendo inclusive metionina, um aminocido ausente na
maioria das outras microalgas (PARADA et al., 1998; McKASKLE, 2003).
Spirulina spp. so uma das mais ricas fontes proticas de origem
microbiana (55 a 70%), colocando-se bem acima das carnes (15 a 25%)
(DILLON et al., 1995) e da soja (cerca de 40%) (MAEHLER et al., 2003).
Alm disso, o corpo humano assimila por volta de 95% das protenas de
Spirulina
spp.,
ao
passo
que
apenas
cerca
de
20%
das
protenas
provenientes da carne de boi so assimiladas (MAIER et al., 2000). No seu

espectro de aminocidos, todos os aminocidos esto prximos dos padres
estabelecidos pela FAO (Food and Agriculture Organization) , como pode ser
observado na Tabela 1 (DILLON et al., 1995).
20
Tabela 1 Composio de aminocidos de protenas de S. platensis e S. maxima

(mg.g -1 protena bruta Nx6,25) em comparao com o recomendado pela FAO (Food
and Agriculture Organization) para crianas pr-escolares.
Aminicido
S. platensis
S. maxima
22
67
98
71
53
53
48
25
9
3
62
95
73
118
103
57
42
51
17
60
87
63
49
40
41
20
12
49
77
72
99
135
47
39
45
Histidina
Isoleucina
Leucina
Valina
Fenilalanina
Tirosina
Lisina
Metionina
Cistena
Triptofano
Treonina
Alanina
Arginina
cido asprtico
cido glutmico
Glicina
Prolina
Serina
Fonte: DILLON et al. (1995)
FAO
19
28
66
35
63
58
25
11
34
Recentemente, maior ateno vem sendo dada Spirulina spp. pelo

potencial de colorao de seus pigmentos de interesse s industrias
farmacuticas, de cosmticos e de alimentos. Segundo DANESI et al. (2002),
h uma tendncia na substituio de corantes artificiais por produtos
naturais, o que sugere a possibilidade de maior explorao de Spirulina spp.,
pois essa microalga uma das principais fontes de clorofila na natureza. No
Brasil, a clorofila usada em corantes verdes naturais, obtida a partir do
espinafre, que contm aproximadamente 0,6 mg/g (GROSS, 1991) , ao passo
que a biomassa de Spirulina sp. contm 11,5 mg/g (HENRIKSON, 1989)
Atualmente, a maior parte da clorofila produzida e comercializada
obtida por fontes vegetais. H, no entanto, um crescimento no interesse na
rea biotecnolgica para obteno de corantes de outras fontes. Nesse
contexto, o emprego de processos de cultivo microbiano apresenta algumas
vantagens em relao s fontes vegetais, como por exemplo, a possibilidade
21
de um cultivo contnuo e com rpida multiplicao dos microrganismos

(RANGEL-YAGUI et al., 2004).
A possibilidade de incorporar toda a biomassa de Spirulina sp. em
alimentos particularmente interessante, pois alm de promover a colorao
esverdeada, colabora com o enriquecimento do valor nutricional do alimento
(DANESI et al., 2002).
3.2. Distribuio geogrfica e histrico
As Spirulina spp. vivem em meios lquidos especficos ricos em sais

minerais compostos principalmente por bicarbonato e carbonato de sdio,
com pH de 8 a 11. As regies propcias so as tropicais e subtropicais
quentes e ensolaradas, como Mxico, Chade, Etipia, Qunia, Zaire e
Zmbia (ABDIN EL SHERIF & CLMENT, 1982).
A biomassa de Spirulina sp. seca era consumida pela populao asteca
residente nas proximidades do Lago Texcoco na poca da colonizao
espanhola. Tenochtitln (atual cidade do Mxico), densamente povoada na
poca da colonizao espanhola, possua praas e mercados onde a
biomassa desse microrganismo era vendida com o nome de tecuitlatl.
(LACAZ-RUIZ, 2003).
Em estado natural, Spirulina sp. crescia nas guas alcalinas do Lago
Texcoco, ricas em carbonato e bicarbonato, formando aglomerados de
biomassa na superfcie da gua. A biomassa era recolhida com ajuda de uma
malha de tecido e seca ao sol na superfcie das pedras antes de ser
consumida. Da o seu nome tecuitlatl, que significa excreta de pedras no
dialeto local. (CLMENT, 1975)
Sabe-se, atualmente, que a espcie Spirulina maxima existe em estado
semi-natural
no
lago
Texcoco,
sendo
industrialmente
explorada
pela
companhia Texcoco Sosa S.A., desde 1972 (DURAND-CHASTEL, 1980)

Outro lago onde a Spirulina sp. tem sido muito estudada o Chade.
Neste lago, a Spirulina platensis pode se tornar a espcie dominante e tem
22
sido usada como alimento h muito tempo. Em 1940, DANGEARD relatou a

presena de Spirulina platensis neste lago, na ento frica Equatorial
Francesa, hoje, Repblica do Chade. A biomassa dessa cianobactria era
vendida seca em um mercado de Massacory, a 50 km do Lago Chade, para
ser ento utilizada como molho acompanhante da dieta-padro de milhete.
Spirulina platensis est presente tambm nos lagos do vale Rift, a leste da
frica, onde representa a principal fonte alimentar de pequenos flamingos
(Phoenicoptera sp.), habitantes dessa regio. Neste lago, as cianobactrias
so ingeridas pelos coppodos ou pelos cladceros que,
posteriormente,
servem de alimento aos peixes e, finalmente, s aves (LACAZ-RUIZ, 2003).

Em 1963, o Institut Franais du Ptrole (IFP) iniciou estudos com
Spirulina sp. em meio sinttico, a partir das observaes feitas nas colnias
na frica, e concluiu que esse microrganismo possui um crescimento mais
rpido, se comparado ao das plantas superiores; rico em protena; vem
sendo consumido desde tempos imemorveis pelos astecas e tribos do
Chade, e , portanto, atxico (LACAZ-RUIZ, 2003).
3.3. Classificao e Morfologia
O gnero Spirulina pertence famlia Oscillatoriaceae e compreende o

grupo
das
cianobactrias
filamentosas
(microalgas
verde-azuladas).
caracterizado por cadeias de clulas, constituindo um filamento na forma de

espiral, denominado tricoma (Figura 1). Os tricomas so constitudos por
clulas cilndricas, curtas e largas, revestidas por uma fina membrana. Seu
dimetro pode variar de 6 a 12 m, e as estruturas helicoidais formadas por
este filamento podem apresentar dimetros que variam de 30 a 70 m. As
dimenses celulares, o grau de ondulao e o comprimento dos filamentos
variam de espcie para espcie. Esta ltima caracterstica tambm pode
variar conforme as condies ambientais de crescimento (HENRIKSON,
1989; CIFERRI e TIBONI, 1985; TOMASELLI, 1997; PELOSI et al., 1982).
23
Figura 1. Spirulina platensis (UTEX 1926).

Fonte: UNIVERSIDADE DO TEXAS, 2006.
A reproduo de Spirulina spp. ocorre por diviso binria, sendo que

periodicamente tem-se a quebra do tricoma em uma clula intercalria que
perde seu citoplasma e convertida em um necrdio. Esta quebra origina
cadeias curtas de clulas, denominadas hormognios, que diferem dos
tricomas maduros devido falta de motilidade, tamanho celular reduzido e
morfologia diferenciada (CIFERRI e TIBONI, 1985).
Na
verdade,
segundo
TOMASELLI
(1997),
essa
espcie
foi
desconsiderada como membro do gnero Spirulina e includa no gnero

Arthrospira
(da
mesma
ordem
Oscillatoriales)
por
Castenholz
(1989),
oficialmente aceito em Bergeys Manual of Systematic Bacteriology. Mesmo

assim, a designao Spirulina tem se mantido.
3.4. Produo de Spirulina platensis
As Spirulina spp. apresentam muitas vantagens em relao a outros

produtos agrcolas, pois um microrganismo aqutico, no requer solo frtil e
no causa eroso nem contaminao de terras ou guas (MAIER et al.,
2000). A Tabela 2 mostra a rea de terra requerida por outras importantes
fontes de alimentos para a produo de 1 Kg de protena em comparao
24
com a requerida para produzir a mesma quantidade de protena de Spirulina

spp. Observa-se que o cultivo de Spirulina spp. produz 26,6 vezes mais por
rea que a soja e 316,7 vezes mais que a carne de boi, e alm disso, requer
um volume muito menor de gua.
Tabela 2 Comparao entre produo de protena de Spirulina spp. e de outras
fontes.
Fonte de protena a
rea necessria (m 2 )
Spirulina spp.
Soja
Milho
Gros
gua necessria (L)
0,6
2.100
16,0
9.000
22,0
12.500
190,0
105.000
: Valores esto indicados para produo de 1 Kg de protena.

: Produo de 60 Kg de gros para alimentao de bovino que resultar em 1 Kg de
protena animal.
Fonte: MAIER et al. (2000)
b
Os principais fatores que influenciam o crescimento de microrganismos

fotoautotrficos so luz e temperatura.
Observa-se a dependncia do crescimento celular em funo da
intensidade luminosa. Existe, entretanto, um limite denominado ponto de
saturao luminosa, sendo da ordem de 5 a 10 Klux para cianobactrias
(RANGEL-YAGUI et al., 2004; DANESI et al., 2004; MORIST , 2001). O
cultivo sob altas intensidades luminosas responsvel por dois fenmenos
prejudiciais: a fotoinibio, que acarreta num decrscimo no rendimento
mximo de crescimento, e a foto-oxidao, que tem efeitos letais nas clulas,
podendo levar perda total da cultura (JENSEN & KNUTSEN, 1993).
Segundo SAMUELSSON et al. (1985), a fotoinibio tambm pode ocorrer
sob intensidades luminosas moderadas se a taxa fotossinttica estiver
limitada por fatores estressantes, como baixas temperaturas.
A
temperatura
interfere
no
desenvolvimento
do
cultivo
de
cianobactrias e est intimamente associado luz , principalmente em

cultivos ao ar livre (outdoor). A taxa de fixao de CO 2 ou evoluo de O 2
25
(fotossntese ) e respirao da Spirulina
so duas atividades metablicas
altamente dependentes da temperatura (TORZILLO & VONSHAK, 1994)

Outro fator importante no cultivo em larga escala a agitao da
cultura para manter, em meio lquido , as clulas em suspenso, prevenir
sedimentao e homogeneizar minerais, temperatura e luz (BECKER &
VENKATARAMAN , 1980). importante ajustar a velocidade de agitao do
sistema ao tempo de gerao do microrganismo a ser cultivado para evitar o
rompimento de tricomas (LITCHFIELD, 1977). A agitao tambm garante a
eliminao de oxignio supersaturado (RICHMOND, 1983).
Se os nveis de luz e temperatura no so limitantes, outros fatores,
como concentrao de nutrientes, pH e salinidade podem ser alterados
buscando o aumento da produo da biomassa.
Vrios tipos de estudos so conduzidos com o intuito de aumentar a
produo de metablitos especficos ou de biomassa, bem como de reduo
dos custos de produo.
MACEDO & ALEGRE (2001) investigaram a influncia do teor de
nitrognio e da temperatura na produo de lipdeos em cultivo de Spirulina
maxima. Para isso, cultivaram a microalga em meios com 2,5 g/L de NaNO 3 ,
0,2 g/L de NaNO 3 e em ausncia de nitrognio, nas temperaturas de 25 o C e
35 o C. Observaram que houve um aumento de aproximadamente trs vezes
do contedo de lipdeos, quando diminuiu-se o teor de nitrognio e a
temperatura, sugerindo que vivel o cultivo de Spirulina maxima em
condies limitantes visando a produo de lipdeos ricos em cidos graxos
poliinsaturados essenciais.
DANESI
utilizando,
et
al.
(2004)
paralelamente,
estudaram
duas
fontes
cultivo
de
de
Spirulina
nitrognio:
platensis
KNO 3 e
uria.
Empregou-se intensidade luminosa mais alta na fase inicial do cultivo, para

promover o crescimento celular, seguida por uma reduo da intensidade
luminosa para promover o aumento da produo de clorofila. Observou-se
que a reduo da intensidade luminosa de 5 para 2 klux, a partir do 9o ou 13o
dia de cultivo, usando tanto KNO 3 quanto uria como fonte de nitrognio,
eficiente para promoo do aumento da produo total de clorofila pela
26
microalga em at 29%, em comparao com os cultivos com intensidade

luminosa fixa.
De acordo com PIORRECK et al. (1984), a concentrao de clorofila,
na
biomassa
de
Spirulina
platensis,
aumenta
com
acrscimo
da
concentrao de nitrognio no meio de cultivo. Sabe-se ainda que a

quantidade e qualidade do nitrognio disponvel, influenciam tambm o
contedo de protenas, bem como de outros compostos da microalga.
3.5. Fonte de Nitrognio
Spirulina spp. no fixam nitrognio atmosfrico, exceto a Spirulina

labyrinthyformis (uma espcie termoflica), sendo com isto obrigatria a
suplementao deste nutriente no meio de cultivo (CIFERRI & TIBONI, 1985).
Na Spirulina platensis a deficincia de nitrognio durante o perodo de
crescimento leva a um decrscimo na produo de ficocianina e clorofila e a
composio dos cidos graxos pode ser afetada pela condies drsticas de
falta deste nutriente (FUNTEU et al., 1997).
Segundo PIRT et al. (1987), clulas de cianobactrias cultivadas com
carncia de nitrognio perdem suas caractersticas de cor verde azulada.
Em todas as microalgas, nas condies estudadas, o aumento da
quantidade de nitrognio no meio aumenta a quantidade de biomassa
produzida (PIORRECK et al., 1984).
Trabalhos na literatura tm mostrado que o uso de nitrato como fonte
de
nitrognio
garante
altas
concentraes
de biomassa
de
Spirulina
platensis, o que justifica a ampla utilizao dos meios de cultivo de

ZARROUK (1966), PAOLETTI et al. (1975) e SCHLSSER (1982), que
empregam KNO 3 ou NaNO 3. Contudo, sob o ponto de vista econmico, a
busca de fontes de nitrognio mais baratas como uria e sais de amnio
particularmente atrativa.
A utilizao de uria como fonte de nitrognio promove um ganho
energtico devido a sua hidrlise espontnea em meio alcalino, formando
27
amnia, que facilmente assimilada pela Spirulina. No caso do nitrato, o

microrganismo precisa reduzi-lo a nitrito (em uma reao catalisada pela
enzima nitrato redutase) que por conseguinte reduzido em amnia (em uma
reao catalisada pela enzima nitrito redutase). Esse processo de reduo de
nitrito em amnia requer gasto de energia. (HATORI & MYERS, 1966)
Outra vantagem da uria em relao aos nitratos que cada molcula
de uria fornece 2 tomos de nitrognio, ao passo que cada molcula de
NaNO 3, por exemplo, fornece apenas 1 tomo.(DANESI et at., 2002)
Em particular, o uso de uria sob condies alcalinas pode ser
desvantajoso, em processo descontnuo, devido hidrlise deste sal
amnia e conseqente perda por volatilizao (DANESI et al., 2002) ou
devido inibio do crescimento pela toxicidade de amnia a altos nveis
(SASSANO et al., 2004). Por isso, h a necessidade do controle do
suprimento de uria durante o cultivo.
A adio de uria no processo descontnuo alimentado mostrou-se um
excelente protocolo, garantindo nveis satisfatrios desse composto no meio
de
cultivo,
propiciando
sucesso
no
cultivo
de
Spirulina
platensis
(SASSANO et al., 2004). A adio de nutrientes durante o processo

descontnuo alimentado pode ser realizada empregando uma taxa constante
ou varivel de vazo mssica e o regime de adio pode ser contnuo ou
intermitente (CARVALHO & SATO, 2001).
SANCHEZ-LUNA et al. (2004) mostraram que os cultivos de Spirulina
platensis pelo processo descontnuo alimentado, com taxa de alimentao
constante, com regime de adio intermitente e contnuo exibiram resultados
estatisticamente coincidentes. Dessa forma, indicam que, quando a uria
adicionada
com
taxa
constante,
ela
pode
ser
adicionada
de
forma
intermitente, sem que haja prejuzo no desenvolvimento microbiolgico, o que

alm de ser menos trabalhoso, tambm economicamente vantajoso, pois
no necessita de equipamentos para bombeamento constante do nutriente.
DANESI et al. (2002) estudaram os efeitos da adio contnua de uria
e das diferentes temperaturas sobre o crescimento de Spirulina platensis,
cultivado em processo descontnuo alimentado. Observaram que a adio
28
contnua de uria em uma taxa exponencialmente crescente, a 30
C,
possibilitou um ganho de biomassa equivalente a 37% e conseqentemente,

uma maior quantidade de clorofila. Isso com um custo bem menor se
comparado a cultivos com emprego de KNO 3 .
RANGEL-YAGUI et al. (2004) investigaram a influncia da intensidade
de luz e do emprego de uria como fonte de nitrognio sobre o contedo de
clorofila na biomassa de Spirulina platensis. Para isso, realizaram processos
descontnuos alimentados de cultivo empregando uria, com aumento
exponencial de alimentao, em diferentes intensidades de luz, comparando
os resultados com aqueles obtidos em cultivo padro, empregando KNO 3
como fonte de nitrognio. Concluram que a melhor produo de biomassa foi
observada em cultivo com uso de uria como fonte de nitrognio, em
comparao ao emprego de KNO 3. Observaram tambm que a melhor
produtividade de clorofila (o que reflete o balano entre crescimento celular e
concentrao
de
clorofila
na
biomassa) ocorreu com
uria em
uma
concentrao total adicionada de 500 mg/L com intensidade luminosa de

3500 lux.
COSTA et al. (2004) estudaram o desenvolvimento de Spirulina
platensis em gua coletada no Lago Mangueira (RS) suplementado com uria
e bicarbonato de sdio em processo descontnuo alimentado, buscando
reduo do custo de produo. Na verdade, a gua deste lago apresenta os
nutientes fundamentais para Spirulina platensis, mas suporta o crescimento
do microrganismo somente por um perodo de at 300 horas de cultivo,
quando se deve iniciar a adio de nutrientes para prevenir o decrscimo da
concentrao celular. Observaram que na condio em que se adicionou
1,125 mg/L de uria, sem adio de bicarbonato de sdio, a biomassa
produzida
foi
2,67
vezes
maior
em
comparao
ao
ensaio
sem
suplementao de nutrientes, mostrando ser vivel o cultivo de Spirulina

platensis em processo descontnuo alimentado, usando gua do Lago
Mangueira suplementado com uria.
29
3.6. Processos de cultivo
Quando se pensa em executar um processo de cultivo microbiano,

normalmente se imagina preparar um certo meio de cultura que seja
adequado nutrio e desenvolvimento do microrganismo, bem como o
acmulo do produto desejado, colocar este meio de cultura em um biorreator,
adicionar o microrganismo responsvel pelo processo biolgico (inocular) e
aguardar que o processo ocorra. Aps um determinado tempo de cultivo,
imagina-se retirar o meio fermentado do reator e executar as operaes
unitrias necessrias para a recuperao do produto. Essa descrio tpica
de um processo descontnuo simples ou descontnuo tradicional, tambm
chamado de batelada clssica (SCHMIDELL & FACCIOTTI, 2001).
Esse processo o mais seguro quando se tem o problema de
manuteno de condies de assepsia (SCHMIDELL & FACCIOTTI, 2001).
Alm disso apresenta grande flexibilidade de operao, condio de controle
mais estreito da estabilidade gentica do microrganismo e a possibilidade de
se identificar todos os materiais relacionados quando se est desenvolvendo
um determinado lote de produto, o que vital para a indstria farmacutica.
Ademais, o mais utilizado na indstria de alimentos, para produo de
iogurte, chucrute, picles, cerveja, vinho entre outros (CARVALHO & SATO,
2001).
Alm do processo descontnuo, um reator biolgico ainda pode ser
operado em processo semicontnuo, contnuo, ou descontnuo alimentado
(SCHMIDELL & FACCIOTTI, 2001).
O processo semicontnuo a operao em que uma vez colocados no
reator o meio de fermentao e o inculo, as operaes que se seguem
obedecem seguinte ordem: 1) aguarda-se o trmino do cultivo; 2) retira-se
parte do meio fermentado, mantendo-se no reator o restante; 3) adiciona-se
ao reator um volume de meio de cultivo igual ao volume de meio fermentado
retirado na operao anterior. Em outras palavras, o meio fermentado no
retirado na segunda operao serve de inculo ao meio de cultivo adicionado
na terceira operao. Reinicia-se, desse modo, a seqncia de operaes,
30
que ser repetida enquanto no houver queda da produtividade do processo

(BORZANI, 2001).
O processo contnuo realizado por meio de alimentao contnua de
meio de cultura ao reator a uma determinada vazo constante e por uma
retirada contnua de meio de caldo fermentado, de forma a se ter o volume de
reao constante, a fim de que o sistema atinja a condio de estado
estacionrio (steady-state) (PAMBOUKIAN, 2003). Neste caso, o sistema
pode operar por longos perodos de tempo em estado estacionrio,
decorrendo desta situao uma srie de vantagens em relao ao processo
descontnuo tradicional (FACCIOTTI, 2001). Industrialmente, esse processo
empregado no tratamento de efluentes (LI et al., 2005b) e na produo de
etanol (BORZANI, 2001b). Adicionalmente, seu uso tem sido testado para
diversas finalidades, levando a resultados satisfatrios, seja em processos
visando produo industrial ou mesmo em processos para estudos de
comportamento
microbiano
frente
distintas
condies
experimentais
(SASSANO, 2004; PAMBOUKIAN, 2003; DOMINGUES et al., 2005).

O processo descontnuo alimentado definido como uma tcnica em
proessos microbianos, onde um ou mais nutrientes so adicionados ao
fermentador durante o cultivo e em que os produtos a permanecem at o
final do processo (CARVALHO & SATO, 2001b). Em alguns casos, todos os
nutrientes so gradualmente alimentados dorna (YAMANE & SHIMIZU,
1984). Nesse tipo de operao, mudana de volume pode ou no ocorrer,
dependendo da concentrao de substrato no meio de alimentao e da taxa
de evaporao do sistema (CARVALHO & SATO, 2001b).
Algumas das finalidades ao se empregar o processo descontnuo
alimentado so: minimizao dos efeitos do controle do metabolismo celular,
preveno da inibio por substrato ou precursores, minimizao da
formao de produtos de metabolismo txicos, superao de problemas
freqentes de estabilidade em processo contnuo, adequao do processo
fermentativo a condies operacionais, estudo de cintica de processos
fermentativos.
31
Este processo, tambm conhecido como fermentao em batelada

alimentada, tem importncia tanto em escala industrial como em nvel de
pesquisa e permitiu a viabilizao do uso de uria (DANESI et al, 2002;
RANGEL-YAGUI et al, 2004) e cloreto de amnio (CARVALHO et al, 2004) no
cultivo de Spirulina platensis.
O processo descontnuo alimentado apresenta uma diversidade de
aplicaes, permitindo algumas variaes com a finalidade de ajust-lo
produo de diversos produtos obtidos por fermentao. Uma dessas
variaes o processo descontnuo alimentado repetitivo
3.6.1. O processo descontnuo alimentado repetitivo
No processo descontnuo alimentado repetitivo, uma frao constante

de volume da cultura removida a intervalos de tempos fixos, podendo ser
mantido indefinidamente. Este volume retirado destinado separao de
produto fermentado, sendo recomposto at seu valor mximo atravs da
adio
de
novo meio com
uma determinada vazo de alimentao.
Enchimentos e esvaziamentos repetidos de volumes especficos resultam

numa operao cclica de variao de volume, podendo por isso ser
designado tambm como processo descontnuo alimentado cclico. Este tipo
de processo tem sido utilizado industrialmente para produo de levedura e
de antibiticos com o intuito de aproveitar como inculo o microrganismo que
est crescendo com alta velocidade de crescimento e de trabalhar por mais
tempo com clulas que esto na fase produtiva, respectivamente, levando ao
aumento
de
produtividade do sistema (CARVALHO &
SATO, 2001b;
WEIGAND, 1981; MORI, et al., 1983; KELLER & DUNN, 1978).

KUMAR et al. (2000) empregaram o processo descontnuo alimentado
repetitivo para produo de lovastina, um metablito secundrio produzido
por
Aspergillus
terreus,
de
grande
aplicao
no
tratamento
de
hipercolesterolemia. Utilizando maltodextrina como fonte de carbono e gua

de macerao de milho como fonte de nitrognio, obtiveram um aumento de
32
73% na produo de lovastina, em comparao com o processo descontnuo

de cultivo.
GIRIDHAR & SRIVASTAVA (2001) cultivaram Gluconobacter oxydans
em processo descontnuo alimentado repetitivo para converso de D-sorbitol
em L-sorbose, com o objetivo de reduzir o tempo ocioso do biorreator,
processar altas concentraes de sorbitol em um tempo relativamente curto e
com isso otimizar a produtividade da fermentao. O processo descontnuo
inicial foi convertido em processo descontnuo alimentado repetitivo atravs
da retirada de um tero do volume do reator e adio de novo meio com a
mesma concentrao inicial
de sorbitol. Quatro ciclos de retirada e
alimentao foram implementadas, num total de 26 horas. Afirmam que com

isso o tempo no produtivo, que compreende limpeza, esterilizao e
abastecimento do reator, pode ser eliminado, aumentando a produtividade
total do reator e reduzindo o custo da produo. Outra vantagem apontada
que essa tcnica pode ser facilmente adotada pelas condies industriais
existentes sem nenhum gasto adicional na aquisio de novos equipamentos.
BAE et al. (2004) investigaram a produo de xilitol por Saccharomyces
cerevisiae recombinante, contendo gene para xilose redutase, utilizando
processo descontnuo alimentado repetitivo alm de cultivo com reciclo de
clulas. Saccharomyces cerevisiae no consegue metabolizar xilose como
nica fonte de carbono, j que essa levedura no possui enzimas intrnsecas
necessrias para o metabolismo desse acar; por isso, uma suplementao
adequada de glicose, ao longo do processo, necessria para propiciar uma
boa produo de xilitol. A fermentao foi realizada em 1 Litro de meio YPD
suplementado com xilose, temperatura de 30 C, pH 5,0, 1,0 vvm de aerao
e 400 rpm. A concentrao de xilose no meio foi controlada entre 20 e 40 g/L e
a frao de corte foi de 10% com adio de igual volume de meio com 200 g/L
de xilose. Neste trabalho, a introduo do gene XR, para produo de xilitol,
propiciou a converso de xilose em xilitol com um rendimento de 100 %. Alm
disso, a concentrao final e a produtividade de xilitol no processo
descontnuo alimentado repetitivo foram 2,5 e 1,5 vezes maiores que no
processo descontnuo de produo, respectivamente.
33
Foi relatado, tambm, o processo descontnuo alimentado repetitivo na

produo de antibiticos, visando manter constantemente no reator clulas
que esto produzindo estes metablitos. Como relatam LI et al (2005), a
produo industrial de penicilina G tipicamente produzida por este
processo. Esses autores descrevem uma nova estratgia de suplementao
de fsforo para melhorar a fermentao industrial deste antibitico. Aps o
primeiro corte, uma apropriada quantidade de fsforo (somente de fonte
inorgnica ou de fonte mista) foi adicionada ao meio de cultivo. Esse mtodo
se apresentou como um eficiente meio econmico para melhorar a produo ,
levando a um aumento de 16,1% na produo de penicilina G.
Levando-se em conta o cultivo de Spirulina, com alta resistncia a
contaminaes devido s condies de seu cultivo (pH elevado, elevada
salinidade, meio mineral), pode-se deduzir que a aplicao do processo
descontnuo alimentado repetitivo venha a ser vantajosa para o processo de
produo com aumento da produtividade do cultivo e com a diminuio dos
tempos mortos do reator. Este trabalho teve a finalidade deste estudo.
34
4. MATERIAL E MTODOS
4.1. Microrganismo:
A cepa Spirulina platensis UTEX 1926, classificada como Arthrospira

(Spiruina) platensis (Nordstedt) por Gomont (SILVA et al., 1996), foi obtida a
partir da coleo de culturas da Universidade do Texas.
4.2. Manuteno da Spirulina platensis:
A microalga foi mantida em gar inclinado, com adio de 2% de gar

em meio lquido de cultivo padro para Spirulina (item 4.3.1).
4.3. Meio de cultivo:
Foram utilizados dois tipos de meio. Um meio padro para o cultivo de

Spirulina (SCHLSSER et al., 1982) - item 4.3.1, com NaNO 3 como fonte de
nitrognio
(que
foi
utilizado
para
duas
finalidades:
manuteno
do
microrganismo e preparo do inculo); e um meio modificado (item 4.3.2),

onde se utilizou uria como fonte de nitrognio.
4.3.1. Meio padro para cultivo de S. platensis:
O meio mineral padro foi o de Schlsser (SCHLSSER, 1982), cuja

composio, por litro (de gua destilada), a seguinte:
NaHCO 3...........................................................
13,61g
Na2 CO 3............................................................
4,03g
K 2 HPO 4............................................................
0,50g
NaNO 3..............................................................
2,50g
35
K 2 SO 4...............................................................
1,00g
NaCl ..................................................................
1,00g
MgSO 4 .7H 2 O .................................................
0,20g
CaCl 2 .2H 2 O ...................................................
0,04g
*PIV soluo de metais.................
6mL
**Chu soluo de micronutrientes..
1mL
vitamina B 12 (15g/100mL H 2 O).......
1mL
*PIV soluo de metais (em 1 litro de gua destilada):

Na2 EDTA .............
750 mg
FeCl 3 .6H 2 O ..........
97 mg
MnCl 2 .4H 2 O .........
41 mg
ZnCl 2 ...................
5 mg
CoCl 2 .6H 2 O .........
2 mg
Na2 MoO 4 .2H 2 O ....
4 mg
**Chu soluo de micronutrientes (em 1 litro de gua destilada):

Na2 EDTA .............
50,0 mg
H 3 BO 3 ..................
618,0 mg
CuSO 4 .5H 2 O ........
19,6 mg
ZnSO 4 .7H 2 O ........
44,0 mg
CoCl 2 .6H 2 O .........
20,0 mg
MnCl 2 .4H 2 O .........
12,6 mg
Na2 MoO 4 .2H 2 O ....
12,6 mg
4.3.2. Meio modificado
Foi o meio de Schlsser (SCHLSSER , 1982), com substituio do

nitrato de sdio por uria. A massa total de uria adicionada foi uma funo
do tempo total de alimentao (item 4.8.1).
36
4.4. Preparo do inoculo
A Spirulina platensis, mantida em gar, foi colhida com auxlio de ala

de platina, em condies asspticas, em fluxo laminar, e inoculada em 10mL
de meio lquido (em tubo de ensaio). Depois de 15 dias, esse material foi
utilizado para inocular frascos erlenmeyers de 500mL, com 200mL de meio
de cultivo padro (item 4.3.1), previamente autoclavado a 121 C por 15
minutos.
Os frascos erlenmeyers aps o repique foram imediatamente levados a
agitador rotativo, a 100min-1 (FERRAZ, 1986), temperatura de 30 O C e
iluminncia de 6000 lux (DANESI, 2001), fornecida por 6 lmpadas
fluorescentes Sylvania de 40Watts, dispostas a uma distncia de 30cm dos
frascos.
O crescimento celular foi acompanhado, sendo utilizada para inculo
uma suspenso de S. platensis aps 6 a 8 dias de cultivo (PELIZER et al.,
2003),
em
crescimento
exponencial,
isenta
de
contaminao.
Essa
suspenso foi filtrada, lavada com soluo fisiolgica para retirada do NaNO 3
e ressuspensa em meio de cultivo padro isento de NaNO 3 . Esta suspenso
foi o inculo para o cultivo em minitanques, onde foram realizados os estudos
da adio de uria como fonte de nitrognio. No primeiro cultivo, que
constituiu a fase de obteno de biomassa, a concentrao celular inicial (em
massa seca) foi fixada em 50mg/L (PELIZER et al., 2003). Aps o primeiro
corte (item 4.8.2), a concentrao celular inicial no foi mais fixada, sendo
uma funo das condies experimentais adotadas.
4.5. Dispositivo para cultura
Dentre os inmeros sistemas de algacultura descritos na literatura,

adotamos os minitanques de forma alongada (BELAY, 1997). Estes tanques
so construdos de lminas de PVC de cor branca. A movimentao da
cultura foi executada por ps rotativas com freqncia de 18 rotaes por
37
minuto. Na Figura 1 pode-se observar a foto dos minitanques, de formato

alongado com rea de 1226,2 cm 2 .
Figura 2. Minitanques de PVC para cultivo de S. platensis.
4.6. Descrio de um experimento tpico
Foram fixadas as seguintes condies experimentais: freqncia de

rotao das ps rotativas: 18 rpm; geometria dos minitanques; volume de
lquido nos minitanques: 5,0L.
A suspenso de Spirulina (inculo - item 4.4) foi adicionada ao
minitanque e o volume de meio completado at 5,0 L. Este foi o meio de
cultivo isento de NaNO 3 ( item 4.3.2), ao qual se deu a adio de uria de
acordo com o plano de trabalho (item 4.8.2).
Nos cultivos, a massa inicial de uria foi de 0,4 g, condio em que no
se verificou inibio de crescimento para a Spirulina platensis nas condies
deste estudo, com volume de trabalho de 5,0 L (DANESI et. al., 2002). O
volume de cultivo foi constante ao longo de todo o processo, sendo que a
poro perdida por evaporao foi reposta diariamente com gua destilada. A
uria foi adicionada diariamente, de acordo com a equao 1 (item 4.8.1).
38
A temperatura de 28
C foi mantida por meio de resistncias eltricas
controladas por termostatos.

A iluminncia fornecida foi realizada em intensidade de 9000 lux, com a
utilizao de lmpadas fluorescentes de 20 Watts.
4.7. Tcnicas Analticas
Os experimentos foram acompanhados por tcnicas analticas descritas

a seguir:
4.7.1. Acompanhamento do cultivo
4.7.1.1. Determinao da concentrao celular
A concentrao celular foi determinada diariamente por turbidimetria, a

560nm (LEDUY & THERIEN, 1977). Os valores de transmitncia obtidos no
espectrofotmetro foram convertidas em concentrao celular atravs de uma
curva de calibrao.
4.7.1.1.1. Construo da curva de calibrao para determinao da

concentrao celular
A curva de calibrao foi obtida tomando-se um volume de 25 mL de

uma suspenso concentrada, de clulas em fase de crescimento exponencial,
que foi filtrado e lavado, com gua destilada, em uma membrana de acetato
de celulose de 1,2 m, previamente seca a 70 C por 12 h, e previamente
pesada. A amostra foi levada estufa 100 - 105 o C por um perodo de 5 h,
suficiente para que mantivesse uma massa constante. O massa das clulas
foi calculada por diferena dos valores das massas das membranas antes e
depois
da filtrao, e dividido pelo volume filtrado para obter-se a
39
concentrao celular na suspenso. A partir desta mesma suspenso, foram

preparadas diferentes diluies, e alquotas dessas diluies foram levadas
ao espectrofotmetro para leitura da transmitncia a 560nm de comprimento
de onda e caminho ptico de 1cm, com gua destilada como branco. Obtevese, dessa forma, uma curva que relaciona concentrao celular com o
logaritmo da transmitncia.
4.7.1.2. Determinao da concentrao de amnia total
Para acompanhar os nveis de amnia no processo, foram realizadas

medidas em dias alternados, na fase lquida do meio em cultivo, adotando-se
um eletrodo seletivo para amnia conectado a um potencimetro ORION,
modelo 710A. Tendo em vista que o eletrodo s sensvel ao on amnia, e
que no pH de cultivo existe equilbrio entre os ons amnia e amnio, para se
fazer a leitura, foi necessrio elevar o pH da amostra, adicionando-se soluo
de NaOH, para deslocamento do equilbrio, de forma que todo on amnio
fosse convertido em amnia (LEDUY & SAMSON, 1982).
Neste procedimento foi necessria a calibrao do aparelho em todos
os dias em que foram realizadas as determinaes. Isso era feito atravs da
construo
de
uma
curva
que
correlaciona
milivoltagem
lida
no
potencimetro com solues de NH 4 Cl, em diferentes diluies, com

concentraes conhecidas. A partir da equao dessa curva, com a
milivoltagem lida na amostra do cultivo, era calculada a concentrao de
amnia total.
4.7.1 3. Determinao do pH
O pH foi acompanhado, diariamente, por potenciometria, com um

aparelho da marca Metler Toledo.
40
4.7.2. Avaliao da biomassa obtida
Ao final do cultivo, o volume retirado contendo a Spirulina platensis foi

centrifugado, com 3 lavagens sucessivas com gua destilada para remoo
do sal adsorvido s clulas, e, aps secagem com ventilao a 55 C por 12
horas (PELIZER et al., 1999), foi avaliado o teor de protena e de lipdio da
biomassa.
4.7.2.1. Lipdeos totais
A frao lipdica total foi obtida por extrao com solvente orgnico. A
amostra foi triturada em gral e ento transferida para um extrator contnuo de
Soxhlet com refluxo de ter de petrleo por 4 horas, sendo o extrato
recolhido em balo de fundo redondo. Aps esse tempo, o solvente foi
retirado do balo de fundo redondo com auxlio de evaporador rotativo. A
amostra foi submetida a uma nova extrao com clorofrmio-metanol (2:1 v/v)
e esse processo continuou at que o solvente no copo de Soxhlet no
apresentasse colorao. O segundo solvente foi evaporado tambm em
evaporador rotativo e a frao lipdica pde ento ser determinada. O
material
obtido
rene
cidos
graxos,
triglicerdeos,
fosfolipdeos,
carotenides, pigmentos fotossintetizantes, esterides e hidrocarbonetos,

sendo chamados de frao lipdica total (FERRAZ et al., 1986).
4.7.2.2. Protenas totais
O teor protico total na biomassa seca foi determinado pelo clssico

mtodo de KJELDAHL, adotando-se o fator de 6,25 para a converso a partir
dos teores de nitrognio total (OFFICIAL METHODS OF FOOD ANALYSIS,
1984).
Para isso, empregou-se a amostra desengordurada, resultante da
anlise de lipdeos totais, seca e pulverizada. A amostra foi digerida em meio
41
cido, com adio de catalisador,
em bloco digestor a 350 C at que o
material se apresentasse lmpido. Em seguida, a amostra foi levada a um

destilador de nitrognio, adicionando hidrxido de sdio 60%, e recuperando
o nitrognio, na forma amoniacal, em soluo saturada de cido brico. Esse
material foi titulado com HCl 0,02 N, possibilitando o clculo da porcentagem
de protena na biomassa seca.
4.8 EXPERIMENTOS REALIZADOS
4.8.1. Processo de cultivo
Para alimentao da uria, o processo utilizado foi o descontnuo

alimentado com vazo de alimentao constante, de acordo com a seguinte
equao:
Mu = 400 +225 . t
Onde Mu representa a massa de uria adicionada at instante t e 400
representa sua massa inicial, em miligramas. A taxa de alimentao diria foi
de 225 mg/dia (CARVALHO et al., 2004). O tempo total de alimentao (Ta)
foi de 1 a 16 dias, de acordo com a frao de corte do processo (item 5.8.2).
4.8.2. Planejamento Experimental
Os experimentos foram realizados de acordo com o apresentado na

Tabela 1, sendo acompanhados por 3 cortes sucessivos, aps a etapa inicial
de obteno de biomassa.
42
Tabela 3 - Matriz de ensaio
Ensaio
Frao de corte (%)
Tempo de alimentao (dias)
20
20
20
50
50
50
10
80
80
10
80
14
10
95
11
95
12
12
95
16
4.9. FORMA E ANLISE DOS RESULTADOS
A partir dos cultivos, foram calculados os fatores de converso de

nitrognio em clulas e as produtividades em biomassa, de acordo com as
frmulas do item 4.9.1.
As melhores condies de cultivo em relao a concentrao final de
clulas, composio de biomassa e parmetros cinticos (fatores de
converso de nitrognio em clulas e produtividade em clulas) foram
avaliadas com auxlio de anlise de covarincia.
43
4.9.1. Frmulas e mtodos utilizados nos clculos dos parmetros

cinticos
Produtividade em clulas:
P X = (X m X i ) / T c
Onde: P X = produtividade em clulas (mg.L -1 .d -1 )
X m = concentrao celular mxima obtida (mg.L -1 )
X i = concentrao celular inicial (mg.L -1 )
T c = tempo de cultivo (dias)
Fator de converso de nitrognio em clulas:

YX/N = (Xm X i ) . V / N t
Onde: YX/N = Fator de converso de nitrognio em clular (g.g -1 )
X m = concentrao celular mxima obtida (mg.L -1 )
X i = concentrao celular inicial (mg.L -1 )
V = volume do meio (L)
N t = quantidade total de nitrognio adicionado (mg)
44
5. RESULTADOS E DISCUSSO
5.1. Curva de Calibrao para determinao de concentrao celular
A determinao da concentrao celular ao longo dos cultivos foi obtida

atravs da correlao entre o logaritmo da transmitncia da amostra e a
correspondente concentrao celular, em massa seca, apresentada na Figura 2.
600
-1
X (mg.L )
500
400
300
200
100
0
1,2
1,3
1,4
1,5
1,6
1,7
1,8
1,9
Log.Transmitncia
X = -748,29 * Log.Transmitncia + 1499,7

R2 = 0,9957
Figura 3. Curva de calibrao para determinao da
concentrao de Spirulina platensis.
5.2. Curva de Calibrao para determinao da concentrao de amnia

total
Uma curva de calibrao foi construda em todos os dias em que houve

determinao da concentrao de amnia no meio de cultivo. A seguir, na
Figura 3, tm-se um exemplo de curva obtida.
45
log [NH3]
-4
100
-4,2
120
140
160
180
-4,4
-4,6
-4,8
-5
-5,2
milivoltagem (mV)
log [NH3] = -0,0211* milivoltagem - 1,6384
R2 = 0,9941
Figura 4. Curva de calibrao para determinao da

concentrao de amnia total em meio de cultivo.
Neste caso especfico, a maior diluio, 7,2 x 10 -6 M (cujo valor de Log

igual a 5,1426) apresentou uma leitura de 165,85 mV, no eletrodo seletivo
de amnia. E sendo assim, nas amostras que apresentaram leitura de
milivoltagem acima deste valor, no se pde determinar a concentrao de
amnia total. Por isso, nas tabelas de acompanhamento do cultivo (Tabelas 5
a 15), esses valores de concentrao de amnia foram substitudos por ***,
indicando estarem abaixo do valor detectado pela metodologia analtica.
5.3. Resultados referentes aos acompanhamentos dos ensaios 1 a 12
Os resultados referentes aos acompanhamentos dos ensaios so

apresentados nas tabelas (Tabelas 4 a 15). Para cada ensaio, aps as
respectivas tabelas, apresentam-se as correspondentes figuras (Figuras 5 a
16). Na Tabela 16 so apresentados os contedos de protenas e lipdeos
dos ensaios, e na Tabela 17 so apresentados os parmetros cinticos,
calculados de acordo com o apresentado em material e mtodos item 4.9.1.
46
Tabela 4 - Concentrao celular (X), valor de pH e concentrao de amnia total no

Ensaio 1.
Tempo Tempo
X
pH
(dias)
total
(mg.L - 1 )
Fase 1
0
50
9,30
1
180
9,59
2
194
9,76
3
312
9,89
4
503
10,01
5
751
10,24
6
866
10,28
7
1.148
10,03
8
1.230
10,28
9
1.240
10,20
10
1.631
10,01
11
1.983
10,08
12
2.186
9,95
13
2.250
10,02
14
2.287
9,99
15
2.349
10,02
16
2.280
9,80
1 ciclo
0
16
1.824
1
17
2.038
9,95
2
18
2.305
9,89
3
19
2.337
9,86
2 ciclo
0
19
1.734
9,87
1
20
1.806
9,88
2
21
1.955
9,92
3
22
1.977
9,92
3 ciclo
0
22
1.498
9,94
1
23
1.617
9,93
2
24
1.840
10,00
3
25
1.811
10,05
* Fase 1: fase de obteno de biomassa.
- : leitura no realizada.
Amnia Total
(mol.L -1 )
7,28 x 10 -5
1,02 x 10 -4
9,37 x 10 -5
6,00 x 10 -5
3,50 x 10 -5
2,68 x 10 -5
2,58 x 10 -5
5,19 x 10 -5
1,09 x 10 -5
2,00 x 10 -5
3,31 x 10 -5
3,24 x 10 -5
2,99 x 10 -5
47
2500
12
1o ciclo
2o ciclo
2000
11,5
3o ciclo
10,5
pH
X (mg.L-1 )
11
1500
1000
10
500
9,5
X
pH
9
0
10
15
20
25
30
Tempo (dias)
Figura 5. Concentrao celular (X) e pH em funo do tempo para ensaio 1 (Tempo de

alimentao: 1 dia; Frao de corte: 20%).
48

Ensaio 2.
Tempo Tempo
(dias) Total
Fase 1
1ciclo
2ciclo
3 ciclo
X
(mg.L - 1 )
pH
Amnia Total
(mol.L -1 )
50
9,30
1
2
161
194
9,58
9,77
7,84 x 10 -5
324
9,93
497
10,05
3,57 x 10 -5
5
6
776
862
10,10
10,15
5,65 x 10 -5
906
10,20
8
9
1.009
999
10,16
10,10
1,08 x 10 -5
-
10
1.339
10,05
***
11
12
1.546
1.717
10,00
10,09
1,06 x 10 -5
13
2.067
10,14
14
2.213
10,04
1,52 x 10 -5
15
2.219
9,99
16
2.171
9,96
1,05 x 10 -5
16
1.737
17
1.817
9,95
18
1.906
9,89
3,08 x 10 -5
19
2.028
9,90
20
2.129
9,93
1,74 x 10 -5
21
2.115
9,97
21
1.711
9,88
22
1.853
9,92
1,47 x 10 -5
2
3
23
24
1.840
1.988
9,90
9,92
2,22 x 10 -5
25
1.982
9,96
0
1
25
26
1.543
1.632
9,84
9,85
6,56 x 10 -5
27
1.715
9,90
3
4
28
29
1.730
1.804
9,91
9,96
2,74 x 10 -5
-
30
1.906
10,01
1,95 x 10 -5
6
31
1.885
10,02
***: valor abaixo do detectado pela metodologia analtica.
49
12
2500
1o ciclo
2o ciclo
11,5
3o ciclo
2000
10,5
pH
X (mg.L-1 )
11
1500
1000
10
500
9,5
X
pH
9
0
10
15
20
25
30
35
Tempo (dias)

alimentao: 3 dias; Frao de corte: 20 %).
50

Ensaio 3.
Tempo Tempo
X
pH
Amnia Total
(dias) Total (mg.L -1 )
(mol.L -1 )
Fase 1
0
50
1
176
9,45
2
258
9,62
1,61 x 10 -5
3
393
9,77
4
638
9,88
3,59 x 10 -5
5
762 10,10
6
909 10,06
2,36 x 10 -5
7
1.012 10,21
8
1.342 10,24
***
9
1.284 10,26
10
1.642 10,22
***
11
1.660 10,19
12
1.738 10,29
***
13
2.044 10,30
14
2.130 10,24
***
15
2.153 10,20
16
2.162 10,20
***
1 ciclo
0
16
1.730
1
17
1.933
9,95
2
18
2.124
9,90
2,69 x 10 -5
3
19
2.250
9,91
4
20
2.299
9,93
1,84 x 10 -5
5
21
2.349
9,95
6
22
2.433
9,94
1,08 x 10 -5
7
23
2.463
9,95
2 ciclo
0
23
1.960
9,95
1
24
1.988
9,90
***
2
25
2.024
9,91
3
26
2.061
9,89
3,64 x 10 -5
4
27
2.067
9,93
5
28
2.142
9,94
1,38 x 10 -5
6
29
2.237
9,95
7
30
2.250
9,99
1,11 x 10 -5
8
31
2.189
9,98
3 ciclo
0
31
1.740
9,92
1
32
1.874
9,91
3,57 x 10 -5
2
33
2.010
9,94
3
34
2.078 10,00
1,12 x 10 -5
4
35
2.067
9,94
5
36
2.253 10,05
1,99 x 10 -5
6
37
2.265 10,00
7
38
2.258 10,01
7,63 x 10 -5
51
2500
12
3o ciclo
2o ciclo
1o ciclo
11,5
2000
10,5
pH
-1
X (mg.L )
11
1500
1000
10
500
9,5
X
pH
0
9
0
10
15
20
25
30
35
40
Tempo (dias)

52

Ensaio 4.
Tempo Tempo
(dias)
total
Fase 1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
1 ciclo
0
16
1
17
2
18
3
19
4
20
5
21
6
22
2 ciclo
0
22
1
23
2
24
3
25
4
26
5
27
6
28
7
29
3 ciclo
0
29
1
30
2
31
3
32
4
33
5
34
6
35
X
(mg.L -1 )
50
151
186
380
650
680
900
1.038
1.127
1.442
1.681
1.807
1.805
1.939
1.993
2.078
2.072
1.036
1.192
1.193
1.394
1.438
1.615
1.658
954
1.105
1.251
1.295
1.340
1.456
1.514
1.523
774
940
1.060
1.078
1.074
1.268
1.279
pH
9,30
9,45
9,61
9,73
9,84
9,96
10,03
10,15
10,19
10,18
10,20
10,18
10,27
10,27
10,23
10,16
10,20
9,84
9,81
9,90
9,95
9,97
10,00
9,82
9,83
9,83
9,87
9,86
9,92
9,96
9,95
9,74
9,86
9,92
9,98
10,03
10,01
10,05
Amnia Total
(mol.L -1 )
3,78 x 10 -4
2,64 x 10 -5
2,67 x 10 -5
***
***
***
***
***
2,04 x 10 -5
***
***
***
1,75 x 10 -5
1,05 x 10 -5
***
1,81 x 10 -5
***
*Fase 1: fase de obteno de biomassa.

53
2500
12
2000
11,5
2o ciclo
1500
11
3o ciclo
pH
X (mg.L-1 )
1o ciclo
10,5
1000
10
500
9,5
X
pH
0
9
0
10
15
20
25
30
35
40
Tempo (dias)

alimentao: 4dias; Frao de corte: 50 %).
54

Ensaio 5.
Tempo Tempo
X
(dias) Total (mg. L-1 )
Fase 1
0
50
1
167
2
242
3
405
4
652
5
809
6
1.116
7
1.169
8
1.512
9
1.399
10
1.545
11
1.546
12
2.016
13
1.933
14
2.311
15
2.293
16
2.401
1 ciclo
0
16
1.200
1
17
1.322
2
18
1.454
3
19
1.539
4
20
1.507
5
21
1.505
6
22
1.720
7
23
1.800
8
24
1.963
9
25
1.955
2 ciclo
0
25
995
1
26
1.127
2
27
1.129
3
28
1.149
4
29
1.334
5
30
1.505
6
31
1.500
7
32
1.537
8
33
1.629
9
34
1.641
10
35
1.781
11
36
1.824
12
37
1.822
pH
9,30
9,60
9,74
9,94
10,00
10,25
10,28
10,41
10,34
10,29
10,24
10,17
10,28
10,28
10,16
10,10
10,05
9,82
9,83
9,89
9,93
9,98
9,99
9,96
9,95
10,02
9,78
9,83
9,90
9,95
10,01
10,02
10,04
10,07
10,05
10,08
10,11
10,13
10.14
Amnia Total
(mol.L -1 )
1,03 x 10 -5
4,11 x 10 -5
2,41 x 10 -5
***
1,75 x 10 -5
1,02 x 10 -5
1,36 x 10 -5
***
1,32 x 10 -5
***
***
***
1,32 x 10 -5
***
3,16 x 10 -5
2,21 x 10 -5
***
1,52 x 10 -5
-
55
Continuao da Tabela 8
3 ciclo
0
37
851
9,58
1
38
1.145 10,05
2
39
1.185
9,89
7,63 x 10 -5
3
40
1.257
9,95
4
41
1.401
9,99
1,31 x 10 -5
5
42
1.430 10,05
6
43
1.559 10,16
1,02 x 10 -5
7
44
1.711 10,21
8
45
1.743 10,14
1,46 x 10 -5
9
46
1.768 10,09
2500
12
1o ciclo
11,5
2000
2o ciclo
3o ciclo
10,5
pH
X (mg.L-1 )
11
1500
1000
10
500
9,5
X
pH
9
0
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Tempo (dias)

alimentao: 7dias; Frao de corte: 50 %).
56

Ensaio 6.
Tempo Tempo
X
(dias)
Total (mg.L -1 )
pH
Amnia Total
(mol.L -1 )
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
9,30
9,60
9,78
9,94
10,05
10,17
10,27
10,39
10,37
10,33
10,26
10,17
10,29
10,28
10,21
10,11
10,08
9,84
9,85
9,92
10,00
10,02
10,03
10,20
10,06
10,06
10,00
10,05
10,02
3,12 x 10 -5
3,82 x 10 -5
1,88 x 10 -5
***
***
***
***
***
1,32 x 10 -5
***
***
***
3,44 x 10 -5
***
Fase 1
1 ciclo
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
50
161
193
324
504
651
985
1.125
1.181
1.238
1.606
1.847
1.898
1.960
1.993
2.095
2.072
1.036
1.260
1.332
1.332
1.511
1.458
1.580
1.620
1.713
1.755
1.906
1.936
1.943
57
2 ciclo
0
28
1.056 9,78
1
29
1.249 9,82
2
30
1.575 9,89
1,26 x 10 -5
3
31
1.477 9,95
4
32
1.629 10,00
1,88 x 10 -5
5
33
1.613 10,01
6
34
1.671 10,05
***
7
35
1.676 10,04
8
36
1.610 10,38
1,16 x 10 -5
9
37
1.725 10,45
10
38
1.750 9,98
2,19 x 10 -5
11
39
1.853 10,04
12
40
2.103 10,03
***
13
41
2.204 10,04
14
42
2.195 10,04
3 ciclo
0
41
1.124 9,58
1
42
1.230 9,75
***
2
43
1.209 9,80
3
44
1.280 9,98
***
4
45
1.464 10,08
5
46
1.796 10,14
1,66 x 10 -5
6
47
1.966 10,18
7
48
2.030 10,16
1,48 x 10 -5
8
49
2.186 10,01
9
50
2.240 10,29
1,42 x 10 -5
10
51
2.153 10,30
11
52
2.189 10,30
7,92 x 10 -5
12
53
2.171 10,33
58
2500
12
2o ciclo
3o ciclo
11,5
1o ciclo
2000
10,5
pH
X (mg.L-1 )
11
1500
1000
10
500
X
9,5
pH
0
9
0
10
20
30
40
50
Tempo (dias)
59

Ensaio 7.
Tempo
(dias)
Fase 1
1 o ciclo
2 o ciclo
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Tempo
Total
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
16
17
18
19
20
21
22
23
24
24
25
26
27
28
29
30
31
32
X
(mg.L -1 )
50
169
217
319
516
592
879
889
1.120
1.241
1.624
1.703
1.929
2.021
2.089
2.130
2.159
432
787
1.049
1.110
1.272
1.634
1.817
1.805
2.072
429
654
795
1.097
1.272
1.591
1.893
2.005
2.007
pH
9,30
9,60
9,81
9,91
9,98
10,04
10,13
10,28
10,26
10,24
10,22
10,15
10,21
10,24
10,18
10,12
10,07
9,77
9,87
10,04
10,13
10,19
10,18
10,15
10,20
9,69
9,88
10,03
10,02
10,27
10,35
10,34
10,36
10,38
Amnia Total
(mol.L -1 )
2,90 x 10 -5
3,20 x 10 -5
2,30 x 10 -5
***
***
***
***
***
1,10 x 10 -5
***
***
***
1,60 x 10 -5
***
1,50 x 10 -5
1,50 x 10 -5
60
3 o ciclo
0
32
403
9,68
1
33
552
9,89
2
34
768
10,03
***
3
35
1.107
10,38
4
36
1.406
10,38
***
5
37
1.750
10,42
6
38
1.791
10,39
1,70 x 10 -5
7
39
1.966
10,47
8
40
2.225
10,34
***
9
41
2.219
10,35
2500
12
1o ciclo
3o ciclo
2o ciclo
11,5
2000
10,5
pH
X (mg.L-1 )
11
1500
1000
10
500
9,5
X
pH
9
0
10
15
20
25
30
35
40
45
Tempo (dias)
61

Ensaio 8.
Tempo
(dias)
Fase 1
1 o ciclo
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Tempo
Total
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
X
(mg.L -1 )
50
163
222
322
489
601
771
915
896
1.016
1.377
1.629
1.827
1.760
1.988
2.165
2.180
436
720
965
1.100
1.211
1.248
1.387
1.527
1.532
1.627
1.603
1.837
1.939
1.952
pH
9,30
9,59
9,79
9,98
9,98
10,01
10,08
10,12
10,11
10,03
10,06
10,02
10,11
10,08
10,10
10,00
10,00
9,75
9,86
10,00
10,10
10,14
10,16
10,16
10,19
10,12
10,14
10,14
10,10
10,13
Amnia Total
(mol.L -1 )
2,30 x 10 -5
2,00 x 10 -5
2,30 x 10 -5
***
***
***
***
***
7,00 x 10 -4
***
***
***
***
***
-
62
2 o ciclo
0
29
409 9,62
1
30
498 9,90
2
31
792 10,06
3
32
980 10,18
4
33
1.080 10,23
5
34
1.129 10,26
6
35
1.165 10,38
7
36
1.486 10,38
8
37
1.532 10,38
9
38
1.730 10,37
10
39
1.858 10,35
11
40
1.933 10,25
12
41
1.974 10,18
o
3 ciclo
0
41
455 9,43
1
42
554 9,60
2
43
551 9,71
3
44
694 9,90
4
45
865 10,02
5
46
1.014 10,13
6
47
1.257 10,14
7
48
1.386 10,22
8
49
1.448 10,25
9
50
1.740 10,30
10
51
1.786 10,33
11
52
1.822 10,27
12
53
2.021 10,32
13
54
2.002 10,36
***: valor abaixo do detectado pela metodologia
6,30 x 10 -5
***
***
1,40 x 10 -5
***
***
3,50 x 10 -5
1,00 x 10 -5
***
***
***
1,90 x 10 -5
***
analtica.
63
2500
12
1o ciclo
2000
2o ciclo
3o ciclo
11,5
1500
10,5
pH
X (mg.L-1 )
11
1000
10
500
9,5
X
pH
9
0
10
20
30
40
50
60
Te mpo (dias)
Figura 12. Concentrao celular (X) e pH em funo do tempo para ensaio 8 (Tempo
de alimentao: 10 dias; Frao de corte: 80 %).
64

Ensaio 9.
Tempo
(dias)
Fase 1
1 o ciclo
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
Tempo
Total
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
X
(mg.L -1 )
50
172
250
371
532
759
951
1.029
1.084
1.207
1.653
1.921
1.957
2.201
2.237
2.324
2.394
479
787
1.014
1.111
1.265
1.761
1.870
1.905
1.912
1.933
1.988
2.167
2.165
2.095
2.148
2.378
2.327
2.356
pH
9,30
9,61
9,82
9,98
10,02
10,13
10,22
10,29
10,24
10,19
10,12
10,08
10,22
10,17
10,10
9,99
10,00
9,75
9,87
10,00
10,10
10,16
10,17
10,18
10,19
10,18
10,16
10,14
10,12
10,12
10,04
10,08
10,13
10,14
Amnia Total
(mol.L -1 )
***
2,94 x 10 -5
2,24 x 10 -5
***
***
***
***
***
1,22 x 10 -5
***
***
***
***
1,01 x 10 -5
3,28 x 10 -5
2,72 x 10 -5
-
65
2 o ciclo
0
33
424
9,67
1
34
577
9,87
***
2
35
878 10,04
3
36
1.151 10,22
***
4
37
1.452 10,33
5
38
1.804 10,40
***
6
39
1.882 10,42
7
40
2.171 10,29
***
8
41
2.280 10,28
9
42
2.346 10,08
***
10
43
2.323 10,21
11
44
2.391 10,15
***
12
45
2.440 10,16
13
46
2.494 10,18
1,30 x 10 -5
14
47
2.497 10,19
15
48
2.496 10,08
***
16
49
2.493 10,08
3 o ciclo
0
49
483
9,42
1
50
821
9,64
***
2
51
811
9,78
3
52
877 10,00
1,43 x 10 -5
4
53
1.117 10,04
5
54
1.325 10,12
***
6
55
1.390 10,20
7
56
1.535 10,28
1,84 x 10 -4
8
57
1.690 10,32
9
58
1.840 10,34
***
10
59
1.971 10,35
11
60
2.033 10,31
***
12
61
2.061 10,31
13
62
2.089 10,33
1,10 x 10 -5
14
63
2.098 10,29
15
64
2.075 10,29
1,08 x 10 -5
16
65
2.153 10,28
17
66
2.061 10,29
2,75 x 10 -5
66
2500
12
2o ciclo
1o ciclo
3o ciclo
11,5
2000
10,5
pH
X (mg.L-1 )
11
1500
1000
10
500
9,5
X
pH
9
0
10
20
30
40
50
60
70
Te mpo (dias)
67
Tabela 13 Concentrao celular (X), valor de pH e concentrao de amnia total no

Ensaio 10.
Tempo
(dias)
Fase 1
1 o ciclo
2 o ciclo
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Tempo
Total
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
X
(mg.L -1 )
50
172
223
333
603
774
1.122
1.148
1.423
1.450
1.681
2.027
2.071
2.299
2.394
2.440
2.414
121
357
433
555
717
869
1.012
1.208
1.303
1.543
1.687
89
172
307
472
633
834
1.129
1.237
1.502
1.570
1.613
pH
9,30
9,70
9,82
10,01
10,14
10,37
10,40
10,52
10,51
10,45
10,30
10,02
10,35
10,30
10,19
10,08
10,02
9,69
9,80
10,01
10,20
10,33
10,39
10,38
10,43
10,43
10,36
9,53
9,75
9,87
10,09
10,23
10,32
10,38
10,55
10,58
10,49
10,44
Amnia Total
(mol.L -1 )
2,61 x 10 -5
1,95 x 10 -5
2,48 x 10 -5
***
***
***
***
***
1,49 x 10 -5
***
***
***
2,00 x 10 -5
***
3,17 x 10 -5
1,16 x 10 -5
***
***
68
3 o ciclo
0
36
87
9,32
1
37
169
9,51
2
38
268
9,72
7,27 x 10 -5
3
39
445
9,84
4
40
683
9,98
***
5
41
915 10,11
6
42
1.185 10,18
***
7
43
1.272 10,23
8
44
1.379 10,31
***
9
45
1.553 10,34
10
46
1.601 10,38
***
11
47
1.678 10,34
12
2500
11,5
2000
3o ciclo
2o ciclo
11
1500
10,5
pH
X (mg.L-1 )
1o ciclo
1000
10
500
9,5
X
pH
9
0
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Tempo (dias)
69
Tabela 14: Concentrao celular (X), valor de pH e concentrao de amnia total no

Ensaio 11.
Tempo
(dias)
Fase 1
1 o ciclo
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
Tempo
X
Total (mg.L -1 )
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
50
161
293
443
626
737
903
905
1.277
1.270
1.323
1.309
1.604
1.837
2.061
2.250
2.257
113
391
422
530
751
836
1.081
1.309
1.370
1.460
1.680
1.710
1.760
1.905
1.914
pH
Amnia Total
(mol.L -1 )
9,60
9,85
10,04
10,21
10,36
10,40
10,44
10,36
10,26
10,22
10,12
10,07
10,12
10,08
10,09
10,01
9,68
9,80
9,99
10,13
10,24
10,30
10,32
10,41
10,31
10,25
10,20
10,22
10,17
10,19
***
2,24 x 10 -5
1,83 x 10 -5
***
***
1,02 x 10 -5
1,21 x 10 -5
***
1,16 x 10 -5
***
***
***
1,75 x 10 -5
1,45 x 10 -5
3,88 x 10 -5
70
2 o ciclo
0
30
111 9,55
1
31
181 9,83
2
32
314 9,92
3,91 x 10 -5
3
33
421 10,09
4
34
571 10,29
***
5
35
892 10,41
6
36
926 10,13
***
7
37
1.230 10,44
8
38
1.239 10,17
1,28 x 10 -5
9
39
1.331 10,33
10
40
1.603 10,22
8,19 x 10 -5
11
41
1.676 10,21
12
42
1.880 10,22
***
13
43
1.827 10,24
14
44
1.801 10,28
***
3 o ciclo
0
44
91 9,38
1
45
157 9,66
2
46
223 9,75
3,03 x 10 -5
3
47
494 9,90
4
48
601 9,97
***
5
49
796 10,10
6
50
1.113 10,11
1,24 x 10 -5
7
51
1.145 10,29
8
52
1.344 10,25
***
9
53
1.563 10,25
10
54
1.627 10,30
2,36 x 10 -5
11
55
1.723 10,34
12
56
1.663 10,34
1,13 x 10 -5
13
57
1.668 10,29
14
58
1.666 10,30
***
15
59
1.658 10,30
71
12
2500
1o ciclo
2000
11,5
2o ciclo
3o ciclo
10,5
pH
X (mg.L-1 )
11
1500
1000
10
500
9,5
X
pH
0
9
0
10
20
30
40
50
60
Te mpo (dias)
72

Ensaio 12.
Tempo
(dias)
Fase 1
1 o ciclo
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
Tempo
Total
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
X
(mg.L -1 )
50
90
201
316
454
602
800
902
1.196
1.473
1.502
1.514
1.562
1.615
1.817
1.945
2.079
105
279
382
468
660
955
1.042
1.217
1.369
1.460
1.504
1.667
1.720
1.738
1.890
1.895
2.000
1.916
1.919
pH
9,30
9,60
9,70
9,85
9,91
9,98
10,04
10,11
10,19
10,25
10,32
10,38
10,42
10,48
10,50
10,51
10,50
9,60
9,75
9,80
9,95
10,02
10,10
10,20
10,21
10,29
10,35
10,40
10,45
10,49
10,51
10,55
10,59
10,57
10,58
Amnia Total
(mol.L -1 )
3,33 x 10 -4
2,34 x 10 -5
1,74 x 10 -5
***
2,94 x 10 -5
1,0 x 10 -5
1,21 x 10 -5
***
8,67 x 10 -6
***
***
***
1,70 x 10 -5
1,75 x 10 -5
3,13 x 10 -5
3,68 x 10 -5
8,82 x 10 -6
73
2 o ciclo
0
34
114
9,60
1
35
264
9,70
2
36
335
9,81
9,99 x 10 -6
3
37
487
9,99
4
38
716 10,09
***
5
39
865 10,15
6
40
987 10,18
***
7
41
1.150 10,22
8
42
1.320 10,25
***
9
43
1.419 10,30
10
44
1.584 10,35
***
11
45
1.599 10,41
12
46
1.713 10,45
1,25 x 10 -5
13
47
1.855 10,50
14
48
1.820 10,50
1,92 x 10 -5
15
49
1.868 10,59
16
50
1.936 10,59
1,57 x 10 -5
17
51
1.947 10,60
3 o ciclo
0
51
105
9,60
1,96 x 10 -5
1
52
245
9,70
2
53
361
9,65
3
54
474
9,95
9,83 x 10 -5
4
55
704 10,10
5
56
863 10,11
1,70 x 10 -5
6
57
919 10,21
7
58
1.162 10,30
***
8
59
1.311 10,39
9
60
1.394 10,40
***
10
61
1.520 10,45
11
62
1.606 10,50
1,25 x 10 -5
12
63
1.653 10,52
13
64
1.660 10,59
***
14
65
1.762 10,60
15
66
1.865 10,61
1,21 x 10 -5
16
67
1.923 10,60
17
68
1.916 10,62
4,03 x 10 -5
18
69
1.921 10,61
74
2500
12
1o ciclo
3o ciclo
2o ciclo
2000
11,5
10,5
pH
X (mg.L-1 )
11
1500
1000
10
500
X
9,5
pH
0
9
0
10
20
30
40
50
60
70
Tempo (dias)
75
Tabela 16 - Contedo de protenas e lipdeos na biomassa seca de Spirulina

platensis obtida nos ensaios realizados.
Ensaio
1
Fc
20%
Ta
1
Ciclo
o
% Protenas
1
2o
3o
2
20%
3
1o
2o
3o
3
20%
5
1o
2o
3o
4
50%
4
1o
2o
3o
5
50%
7
1o
2o
3o
6
50%
10
1o
2o
3o
7
80%
6
1o
2o
3o
8
80%
10
1o
2o
3o
9
80%
14
1o
2o
3o
10
95%
8
1o
2o
3o
11
95%
12
1o
2o
3o
12
95%
16
1o
2o
3o
* Fc= Frao de corte; Ta= Tempo de alimentao.
56,55
53,85
59,89
62,22
60,17
58,52
60,09
56,56
48,62
59,12
56,29
51,16
57,54
49,95
50,83
57,11
56,48
50,02
49,14
51,14
52,97
53,37
46,03
50,29
48,11
45,29
48,01
45,48
45,08
48,20
45,20
45,01
50,85
45,00
53,03
53,68
%Lipdeos
21,37
21,50
15,81
13,46
15,47
15,28
14,44
15,51
15,44
16,88
16,09
14,88
13,98
18,52
10,06
13,97
11,38
10,30
20,62
19,76
10,50
20,55
12,43
19,18
13,37
10,57
17,61
10,29
10,77
20,95
11,00
10,00
21,26
13,52
17,08
21,90
76
Tabela 17 - Parmetros cinticos: concentrao celular mxima (Xm), produtividade em

clulas (Px) e Fator de Conversao de nitrognio em clulas (YX/N ) dos ensaios
realizados.
Ensaio
Fc (%)
Ta (dias)
Ciclo
Xm
(mg.L -1 )
1
20%
1
1o
2.305
o
2
1.977
o
3
1.840
o
2.129
2
20%
3
1
2o
1.988
o
3
1.906
o
2.433
3
20%
5
1
o
2
2.237
3o
2.253
o
1.615
4
50%
4
1
o
2
1.514
o
3
1.268
1.963
5
50%
7
1o
o
2
1.781
o
3
1.768
o
6
50%
10
1
1.943
2o
2.204
o
3
2.240
o
7
80%
6
1
2.072
o
2
2.005
3o
2.225
o
8
80%
10
1
1.939
o
2
1.933
o
3
2.021
9
80%
14
1o
2.378
o
2
2.497
o
3
2.098
o
1.687
10
95%
8
1
2o
1.613
o
3
1.678
o
11
95%
12
1
1.905
o
2
1.880
3o
1.663
o
12
95%
16
1
2.000
o
2
1.936
o
3
1.923
*Fc= Frao de corte; Ta= Tempo de alimentao.
Px
(mg.L -1 .D -1 )
241
81
171
98
92
73
117
46
103
116
113
99
95
79
102
82
88
112
205
225
228
125
139
131
127
148
115
157
152
145
138
147
131
118
114
114
Y X/N
(mg.mg -1 )
8,2
4,2
5,9
3,9
2,8
3,6
4,9
1,9
3,6
4,8
5,6
4,1
4,1
4,3
5,0
3,7
4,6
4,5
10,0
9,6
11,2
6,1
6,2
6,3
5,7
6,3
4,9
7,6
7,4
7,7
6,2
6,1
5,4
5,1
4,9
4,9
77
5.4. Crescimento de Spirulina platensis
Todos
os
ensaios
iniciaram-se
(Fase
1)
com
concentraes
semelhantes de biomassa, 50 mg/L, e aps 16 dias de cultivo (em condies

semelhantes para todos os ensaios) atingiram-se concentraes celulares
mximas (Xm) que variavam de 2079 a 2440 mg/L (Tabelas 4 a 15). O
coeficiente de variao dos valores de Xm na fase 1 dos 12 ensaios foi de
5,97 %, considerado aceitvel para cultivos microbianos (DANESI et al., 2004
e FRATELLI et al., 2005). Sendo assim, para a aplicao das fraes de corte
no experimento, os valores de biomassa, ao final da Fase 1, eram
equivalentes.
A utilizao do processo descontnuo alimentado para o cultivo de
Spirulina platensis permitiu a obteno de resultados bastante satisfatrios
com o uso de uria como fonte de nitrognio (RANGEL, 2000; DANESI, 2001;
SANCHEZ-LUNA et al., 2003). Houve reduo dos nveis da concentrao de
amnia no decorrer do cultivo, o que
evitou que nveis txicos fossem
alcanados.
Os ensaios de 1 a 12 (Tabelas 4 a 15) comprovam essas informaes,
mostrando um timo aproveitamento da uria como fonte de nitrognio para o
crescimento celular. Foram mantidos, em muitos casos,
valores de Xm
(Concentrao celular mxima) prximos ou acima de 2000 mg.L -1 nos 3

ciclos de cultivos.
Em processo descontnuo alimentado, o nutriente pode ser adicionado
de forma contnua ou intermitente (CARVALHO & SATO, 2001). Em trabalho
prvio SANCHES-LUNA et al. (2004) obtiveram resultados similares entre as
formas de alimentao contnua e intermitente (a cada 24 horas). Por isso,
neste trabalho optou-se por utilizar a forma de adio a cada 24 horas,
facilitando as operaes de trabalho.
Processos descontnuos alimentados podem causar alterao de
volume, com aumento deste durante o cultivo (YAMANE & SHIMIZU, 1984).
Esse aspecto particularmente importante em fermentaes alcolicas por
processo descontnuo alimentado, utilizando caldo de cana-de-acar ou
78
melao, amplamente empregado no Brasil. Neste trabalho, entretanto, apesar

da alimentao com uria, no houve aumento do volume nos tanques de
cultivo. De fato, houve evaporao do meio em todos os cultivos, e o volume
dos tanques foi corrigido diariamente, como mencionado no item IV.6
(Material e Mtodos).
Pelo fato do microrganismo receber nitrato de sdio na fase de princulo, esperava-se uma fase de adaptao (fase lag) quando do incio do
cultivo com uria. No entanto, como mostra os grficos de acompanhamento
do crescimento celular (Figuras 5 na 16), isso no foi observado, mostrando
uma rpida adaptao do microrganismo nova fonte de nitrognio.
Fenmeno semelhante foi observado por DANESI et al. (2002), que
empregaram uria no lugar de KNO3, de meio PAOLETTI (PAOLETTI et al.,
1975). Isso provavelmente ocorre devido hidrlise espontnea da uria em
pH alcalino, ou pela ao da enzima urease (CARVAJAL et al., 1980) ,
formando amnia, que entra por difuso na clula, e a forma preferencial de
captao de nitrognio (BOUSSIBA, 1989).
Para todos os cultivos, observa-se um aumento do pH, acompanhando
o crescimento celular, o que mais pronunciado nos ensaios 4 a 12 (Figuras
8 a 16). Nos ensaios 1, 2 e 3, o aumento do pH s mais evidente na fase de
obteno de biomassa, sendo que a variao no to grande ao longo dos
ciclos (1 o , 2o , e 3 o ), pois a frao de corte de apenas 20% resultou em uma
pequena reduo dos valores de pH, pois se adicionou uma menor parcela de
meio de cultivo novo (que apresenta pH em torno de 9,3) como mostram os
grficos (figuras 5 a 7).
Este fenmeno, de aumento do pH, pode ser explicado pelo consumo
dos ons bicarbonato, como fonte de carbono, durante o crescimento. MILLER
& COLMAN (1980) afirmaram que a forma de carbono preferencialmente
assimilada por cianobactrias o bicarbonato, sendo o pH ideal de cultivo,
aquele que assegure o maior deslocamento do equilbrio qumico no sentido
de sua formao.
Como se pode observar na Figura 17, Os ons bicarbonato so
transportados ativamente do meio de cultivo para o interior das clulas, onde
79
so convertidos a carbonato e gs carbnico. O gs carbnico empregado

na fotossntese e o carbonato liberado para o meio extra-celular (FERRAZ,
1986).
CLULA
2HCO 3 -
CO 2 + CO 3 - 2 + H 2 O
f ot ossntese
ME IO
HC O 3 - + OH -
CO 3 - 2 + H 2 O
Figura 17. Representao esquemtica da assimilao de bicarbonato por

Spirulina platensis.
Fonte: RANGEL-YAGUI, et al. (2004)
Quando o pH atinge a faixa de 10,5, a concentrao celular tende a

estabilizar ou mesmo decrescer (DANESI, 2001). Isso pode ser explicado
pelo fato de que, acima de pH 10,2, a fonte de carbono predominante o
carbonato (RUSSEL, 1982).
O pH, alm de determinar a forma ideal de aproveitamento da fonte de
carbono pela microalga, determina tambm o equilbrio da fonte de nitognio
amoniacal, que pode se apresentar na forma de amnia livre ou protonada
(amnio) (DANESI, 2001). Em pH timo, meio alcalino, a entrada de amnia
na clula primeiramente um processo de difuso direcionado pelo gradiente
de pH e pela assimilao de amnia intracelular (BOUSSIBA, 1989). Outro
fator a ser considerado que, como mostra a Figura 18, elaborada a partir da
aplicao da equao de Henderson-Hasselbach (RUSSEL, 1982), quanto mais
alcalino se torna o meio de cultivo, maior a proporo de amnia em

relao ao amnio, e por conseguinte, maior a perda de amnia por
volatilizao.
80
100
80
Amnia
60
40
Amnio
20
0
6
10
11
12
pH
Figura 18. Porcentagem de Amnia e Amnio em Funo do pH.
A concentrao de amnia total foi medida ao longo dos cultivos, para

verificar a ocorrncia de nveis considerados txicos para o microrganismo.
Os dados so satisfatrios porque, como se pode observar nas tabelas de
acompanhamento
dos
cultivos
(Tabelas
15),
como
comentado
anteriormente, em nenhum momento, a concentrao de amnia total atingiu

valores inibitrios, estando em quase todos os casos entre 10-5 e 10 -6 mol.L -1 ,
abaixo, portanto, da qual BELKIN & BOUSSIBA (1991) indicam como
concentrao inibitria de amnia (10 mM).
Ao final do cultivo, em alguns ensaios, como no ensaio 4, a fase
estacionria pode ter ocorrido devido interrupo da adio de uria. Em
outros, porm, a fase estacionria atingida mesmo antes de se encerrar o
tempo de alimentao, como ocorre nos ensaios 3, 6 e 9, que apresentam
tempos de alimentao mais longos, dentro do grupo de 3 ensaios com
mesmo valor de frao de corte. Nestes casos, provavelmente o crescimento
foi afetado pelo fenmeno do sombreamento. Esse sombreamento ocorre
devido ao aumento da densidade populacional, a ponto de a luz no ser mais
homogeneamente distribuda no meio de cultivo, dificultando a captao por
cada clula. Este um fator preponderante no surgimento da fase
estacionria (RICHMOND, 1988; FERRAZ, 1986).
81
Um segundo fator que pode ter propiciado a interrupo do crescimento

celular so os altos valores de pH (AZOV, 1982). medida em que o valor de
pH se aproxima de 11, ao final do cultivo, a absoro da fonte de carbono
inorgnico dificultada, pois acima de pH 10,2 o carbonato a forma
predominante (RUSSEL, 1982), e o bicarbonado, forma assimilada pelo
microrganismo (BINAGHI et al., 2003), reduz gradativamente, at que em pH
13 se extingue, como mostra a Figura 19.
120
BICARBONATO
100
CARBONATO
80
60
40
CO2
20
0
5
10
11
12
13
14
pH
Figura 19. Concentraes relativas de gs carbnico, bicarbonato e carbonato
(%) em funo do pH
Fonte: SASSANO (2004).
Alm disso, deve-se considerar tambm o estresse (fadiga fsica)

causado
pela
alta
densidade
intensifica os choques entre
populacional.
aumento
populacional
os tricomas, que apresentam membranas
mucopolissacardicas de relativa fragilidade (DANESI, 2001) .
5.5. Substituio do nitrato de sdio pela uria
Embora os meios de cultivo tradicionais para Spirulina platensis

utilizem sais de nitrato como fonte de nitrognio, a utilizao de uria
acarreta em um ganho do ponto de vista energtico. Em meio alcalino, a
82
uria sofre hidrlise gerando amnia, que facilmente aproveitada pelas

clulas. No caso do nitrato, o microrganismo precisa reduz-lo a nitrito e
posteriormente a amnia, processos que envolvem gastos energticos (Hatori
& Myers, 1966), como apresentado no esquema da Figura 20.
H2O
( Ur ia)
CO 2
2NH 3
NH 3
Nitrito
r edut as e
Hidrlise es pontnea em
meio alcalino
e/ou sob ao de
Urease
NO 2 clula
NaNO 3
H2O
Na
NO 3
N i t r at o
r edut as e
NO 3 -
( N i t r at o de s di o)
Figura 20. Esquema da assimilao da amnia proveniente de uria e nitrato de sdio.
Segundo MAHAJAN & KAMAT (1995), a uria tem se mostrado uma

fonte de nitrognio bastante efetiva para a produo de biomassa bem como
para a produo do cido graxo -linolnico. Os mesmos autores verificaram
que dentre diversas fontes de nitrognio estudadas, KNO 3 , NaNO 3 , uria,
NH 4 NO 3 , (NH 4 ) 3 PO 4 e (NH 4 ) 2 SO 4 (nas concentraes de 0,01, 0,03 e 0,05M),
a
uria
concentrao de 0,01M suportou uma maior quantidade de -
linolnico, que foi de 20,8 g/mL.

DAVIS et al. (1953) indica uria como a melhor fonte de nitrognio para
produo de biomassa de Chlorella, pois no propicia contaminao
bacteriana, induz a um crescimento mais rpido que com nitrato, mantm o
pH constante e pode ser adicionado em altas concentraes sem prejudicar o
crescimento.
Alm disso, o nitrognio proveniente da uria cinco vezes mais
barato que o nitrognio proveniente do nitrato de sdio. Sabendo-se que em
um mol de uria (60 g/mol) tem-se 28g de Nitrognio, e que em um mol de
83
NaNO 3 (85 g/mol) tem-se 14g de Nitrognio, possvel saber qual o custo do
Kilograma de Nitrognio proveniente das duas fontes (Tabela 18). Nesta
tabela, foram considerados as mdias dos preos de uria e nitrato de sdio
de grau analtico e comercial em diferentes empresas.
Segundo PIORRECK et al. (1984), o meio de cultura o fator que mais
encarece o cultivo de microalgas, justificando a utilizao da uria como
forma de reduo de custos.
Tabela 18 Levantamento de preos de uria e nitrato de sdio
comercial)
(grau analtico e
Fonte de
Nitrognio
Grau
R$/Kg
R$/Kg de
Nitrognio
Uria
analtico
R$ 9,41
R$ 20,16
comercial
R$ 5,59
R$ 11,98
analtico
R$ 17,19
R$ 104,37
comercial
R$ 10,33
R$ 62,72
NaNO3
*1 real = 0,45 dlar comercial (US$)
5.6. Avaliao estatstica dos resultados
De acordo com ANDERSON et al. (1980), num estudo onde se trabalha

com variveis numricas e categricas, a anlise de covarincia a mais
indicada para ser usada, pois considera o efeito de uma varivel numrica
principal com a devida correo do efeito de uma outra varivel numrica,
intimamente relacionada primeira. No estudo em questo, temos como
variveis
principais
serem
estudadas
frao
de
corte
os
correspondentes ciclos de cultivo. No entanto, a varivel numrica tempo de

alimentao (Ta) um fator que deve ser considerado, pois para cada frao
de corte pode haver um tempo timo para alimentao do cultivo. Em outras
palavras, quando se trabalha com menores fraes de corte, espera-se que
as melhores condies de cultivo se dem com tempos de alimentao mais
84
curtos, se comparados com cultivos onde se trabalha com maiores fraes de

corte.
Assim,
na
avaliao
estatstica
apresentada
seguir,
foram
consideradas como variveis principais a frao de corte (varivel numrica)

e ciclo de cultivo (varivel categrica), enquanto que e o tempo de
alimentao foi considerado como uma covarivel.
5.6.1. Anlise da concentrao celular mxima (Xm)

A anlise de covarincia (ANCOVA) aplicada aos dados de concentrao
celular mxima (Xm) da Tabela 17, est apresentada na Tabela 19.
De acordo com os valores dos nveis descritivos (p) da Tabela 19, pode
ser observado que de uma forma geral, considerando os ensaios 1 a 12, as
variveis tempo de alimentao e frao de corte foram determinantes em
seus resultados. De fato, para cada frao de corte h um tempo de
alimentao mnimo para que seja possvel o acoplamento da adio do
nutriente limitante (uria) com o crescimento celular, de forma que a
concentrao celular seja mantida nos trs ciclos. Assim, o final do cultivo
no seria determinado pela fonte de nitrognio, mas sim pelo efeito de
sombreamento e/ou aumento de pH do meio de cultivo.
Tabela 19 - Anlise
estatstica de covarincia (ANCOVA) aplicada aos dados
experimentais de concentrao celular mxima (Xm).
Fonte
Covarivel:
Ta
Principais efeitos:
Fc
Ciclo
Erro
Total
GL
SQ
QM
703290
703290
24,95
0,000*
3
2
29
35
1545983
92215
817481
2501854
515328
46107
28189
18,28
1,64
0,000*
0,212
GL: graus de liberdade; SQ: soma dos quadrados; QM: quadrado mdio;
Ta: tempo de alimentao (dias); Fc: frao de corte (%); Ciclo: ciclo de
cultivo.
*: Significativo ao nvel de 5% de probabilidade pelo teste F.
85
Considerando a covarivel tempo de alimentao (Ta), observando-se

a Tabela 17 e o valor do coeficiente angular correspondente a Ta obtido pelo
teste t-Student (coeficiente angular = 51,04 mg/L.d), nota-se que Xm foi uma
funo crescente desta. De fato, para a maioria dos ciclos e fraes de corte,
esse comportamento foi verificado.
O mesmo comportamento no foi observado para a varivel frao de
corte. Em mdia, os valores de Xm so equivalentes nos ensaios com 20%
(2119 mg/L) e 80% de frao de corte (2130 mg/L) e h uma queda de 14,5
% nos valores de Xm (em mdia) quando a frao de corte aumenta de 20%
para 50%, e 15,1% quando a frao de corte aumenta de 80% para 95%, o
que refletiu fortemente na anlise estatstica (p < 0,001, Tabela 19).
Quando se observa os ensaios com maiores tempos de alimentao
dentro de cada frao de corte, verifica-se que todos atingem valores de Xm
satisfatrios. A avaliao conjunta dessas duas variveis independentes
(frao de corte e tempo de alimentao) indica que, desde que o tempo de
alimentao seja adequado para suportar o crescimento microbiano durante
todo o seu desenvolvimento, qualquer uma das fraes de corte seriam
igualmente adequadas para atingir altos valores de concentrao celular
mxima. De fato, ao final do terceiro ciclo de cultivo, a diferena de
concentrao celular mxima entre o ensaio 3, 6 e 9 menor que 4%.
Numa segunda anlise, considerando-se os ensaios 7, 8 e 9 (Tabelas
10, 11 e 12), observa-se que na frao de corte de 80%, o menor tempo de
alimentao empregado, 6 dias, j foi o suficiente para atingir valores de Xm
satisfatrios ao longo dos 3 ciclos, embora o ensaio 9 tenha apresentado, em
mdia,
valores de Xm um pouco maiores (9,6%). Aplicando-se anlise de
varincia (ANOVA) para os valores de Xm, separadamente, em cada frao

de corte (Tabela 20), observa-se que o tempo de alimentao uma varivel
independente que s exerce influncia significativa sobre os valores de Xm
nos ensaios com frao de corte de 20%, 50% e 95%, mas no nos ensaios
com frao de corte de 80%.
Ao se avaliar o ciclo de cultivo, considerando os ensaios com 20%,
50% e 95% de frao de corte, quando se emprega menores tempos de
86
alimentao, h uma tendncia de queda nos valores de Xm obtidos no

decorrer dos ciclos (principalmente nos ensaios 1, 4 e 11). J nos ensaios
com maiores tempos de alimentao (ensaios 3, 6 e 12) e em todos os
ensaios com 80% de frao de corte (ensaios 7, 8 e 9), no se observa
grandes variaes de Xm ao longo dos ciclos, o que comprovado quando se
observa que o valor do nvel descritivo (p) igual a 0,212.
Tabela 20 - Anlise estatstica de varincia (ANOVA) aplicada aos dados

experimentais de concentrao celular mxima (Xm) em cada Frao de Corte.
Fonte de variao
Tempo de Alimentao
Ciclo de cultivo
p
Fc=20%
0,019*
0,025*
Fc=50%
0,026*
0,833
Fc=80%
0,132
0,976
Fc=95%
0,025*
0,329
Fc: frao de corte (%).

Os ensaios com 80% de frao de corte (ensaios 7, 8 e 9),

apresentaram os maiores valores de Xm, reprodutveis ao longo dos 3 ciclos
(Tabela 17), com uma mdia de 2130 mg.L-1 . Esse resultado superior aos
valores de Xm obtidos por CARVALHO et al. (2004) e SANCHEZ-LUNA et al.
(2003) que obtiveram 1439 mg.L-1 e 1145 mg.L-1, respectivamente. Isso pode
ser explicado pelo fato de que embora CARVALHO et al. (2004) tambm
tenham empregado intensidade luminosa de 9 klux, como neste trabalho, a
fonte de nitrognio foi NH4 Cl (cloreto de amnio) que propicia maior perda de
amnia por volatilizao. SANCHEZ-LUNA et al. (2003), como no presente
trabalho, empregaram uria como fonte de nitrognio, mas a intensidade
luminosa empregada foi menor (6 klux), o que pode ter levado a um reduzido
Xm.
5.6.2. Anlise da produtividade em clulas (Px)
Considerando que a produtividade em clulas representa a relao

entre concentrao de biomassa formada e o correspondente tempo que
87
levou para atingir o valor mximo da concentrao celular, espera-se desta

varivel uma relao complexa principalmente com a varivel tempo de
alimentao. Fixando-se uma frao de corte, espera-se que se um tempo de
alimentao mais curto empregado, um menor tempo de cultivo ser obtido,
o que confere a possibilidade do aumento da produtividade em clulas.
Esse comportamento nitidamente visvel nos ensaios com 80% de
frao de corte. Nesse caso, o ensaio 7 (Ta=6 dias) apresentou uma
produtividade de 219,33 mg.L-1 .d -1 , em mdia, o que corresponde a quase 1,7
vezes s produtividades dos ensaios 8 (Ta = 10 dias) e 9 (Ta = 14 dias), com
produtividades de 131,66 e 130 mg.L-1 .d -1 , em mdia, respectivamente. Nos
ensaios com 20%, 50% e 95% de frao de corte, ainda que em menor grau,
tambm se percebe que Px uma funo decrescente de Ta, o que
confirmado pelo coeficiente angular associado varivel Ta em sua
influncia em Px (-7,763 mg/L.d2 ). Essa influncia do tempo de alimentao
do cultivo na produtividade em biomassa confirmada pelos valores dos
nveis descritivos (p<0,001) na Anlise de Covarincia (Tabela 21).
Tabela 21 - Anlise estatstica de covarincia (ANCOVA) aplicada aos dados
experimentais de produtividade de clulas (Px).
Fonte
Covarivel:
Ta
Principais efeitos:
Fc
Ciclo
Erro
Total
GL
SQ
QM
16271
16271
15,67
0,000*
3
2
29
35
35657
1585
30121
67534
11886
792
1039
11,44
0,76
0,000*
0,475
cultivo.
Os maiores valores de Px, resultantes do ensaio 7 (mdia dos trs

ciclos igual a 219 mg.L -1 .d-1 Tabela 17) foram superiores aos obtidos por
RANGEL-YAGUI et al. (2004) e
-1
mg.L .d
-1
-1
DANESI et al (2004) que obtiveram 114,4
-1
e 116,6 mg.L .d , respectivamente. Ambos os trabalhos foram
realizados em processo descontnuo alimentado com alimentao de uria
88
exponencialmente crescente. Embora os valores de Xm no tenham sido to

baixos nesses trabalhos (1945 mg.L -1 para o primeiro e 1799 mg.L -1 para o
segundo), as intensidades luminosas de 5,6 klux (RANGEL-YAGUI et al.,
2004) e 5 klux (DANESI et al, 2004) e/ou menores valores de concentrao
celular inicial levaram a cultivos mais longos, de forma que a relao entre a
concentrao celular produzida e o correspondente tempo tenha levado a um
valor menor que o obtido neste trabalho.
A Tabela 21 mostra que, estatisticamente, a frao de corte apresenta
uma significativa influncia sobre a produtividade de biomassa (p < 0,001).
Ao se analisar essa varivel independente, verifica-se que uma frao de
corte de 80% levou a maiores produtividades em biomassa, havendo uma
queda de aproximadamente 29% quando se aplicou 20% de frao de corte,
aproximadamente 39% quando se aplicou 50% de frao de corte, e 16%
quando se aplicou 95% de frao de corte, levando-se em considerao os
valores mdios das produtividades em cada grupo com frao de corte
especfica. BAJPAI & BAJPAI (1988) mostraram que para a produo do
chamado single cell protein (usando culturas de levedura e fungos) por
processo descontnuo alimentado repetitivo, quanto menor a frao de corte,
maior a produtividade de biomassa. Este resultado no foi observado no
cultivo de Spirulina platensis, em que a maior produtividade foi obtida com a
segunda maior frao de corte empregada, 80%.
Quando se aumentou a frao de corte de 80% para 95%, a baixa
concentrao celular no incio de cada ciclo pode ter levado a uma exposio
maior luz, de forma que o fenmeno da fotoinibio (TORZILLO &
VONSHAK, 1994) pde retardar o crescimento das clulas. Provavelmente,
esse fato, associado ao menor nmero de clulas em crescimento exponencial
no incio do ciclo so responsveis pela queda da produtividade em clulas
(Px) nos ensaios 10, 11 e 12, com 95% de frao de corte (Tabela 17).
A diminuio dos valores de produtividade em clulas (Px) nos ensaios
com 20% e 50% de frao de corte pode ser explicada pelo fato de que com
uma menor frao de corte, a concentrao celular, no incio de cada ciclo,
suficientemente alta para causar sombreamento no meio de cultivo.
89
Quanto ao ciclo de cultivo, no se pode observar estatisticamente que

essa varivel levou a algum efeito nos resultados da produtividade em clulas
(p= 0,475; Tabela21). Isso indica que o processo descontnuo alimentado
repetitivo
poderia ser eficientemente empregado no cultivo de Spirulina
platensis, mesmo utilizando uma fonte de nitrognio diferente de nitratos,

como uria, caso deste trabalho.
5.6.3. Anlise do fator de converso de nitrognio em clulas (Yx/n)
Considerando os ensaios 1 a 12, verifica-se que o tempo de

alimentao e a frao de corte so variveis de grande efeito sobre o Fator
de Converso de Nitrognio em clulas (p<0,001 para ambos os casos),
como se observa na Tabela 22. De fato, observando-se os resultados de Yx/n
na Tabela 17, nota-se de uma maneira geral que para cada frao de corte
houve uma tendncia de diminuio de Yx/n com o aumento do tempo de
alimentao (Ta) do cultivo. Esse tipo de comportamento, indicando que Yx/n
uma funo decrescente de Ta j fora observado em trabalho anterior,
utilizando cloreto de amnio como fonte de nitrognio (CARVALHO et al.,
2004), em que menores tempos de alimentao levavam a um melhor
aproveitamento
da
fonte
de
nitrognio,
evitando grandes
perdas
por
volatilizao da amnia.
experimentais de fator de converso de nitrognio em clulas (YX/N ).
Fonte
Covarivel:
Ta
Principais efeitos
Fc
Ciclo
Erro
Total
GL
SQ
QM
42,960
42,960
33,90
0,000*
3
2
29
35
98,452
1,707
36,751
137,068
32,817
0,853
1,267
25,90
0,67
0,000*
0,518
cultivo.
90
Avaliando-se a frao de corte, verifica-se que com o aumento dessa

varivel de 20% para 50% e posteriormente para 80%, h um aumento no
fator de converso de nitrognio em clulas (Tabela 17). Aumentando-se a
frao de corte, a concentrao inicial de clulas em cada ciclo menor, o
que resulta em uma maior produo total de biomassa dentro de cada ciclo.
Provavelmente
esse
um
fator
preponderante
para
um
melhor
aproveitamento da uria na produo de biomassa de Spirulina platensis,

pois nesse caso grande parte do crescimento celular ocorre em condies
no limitantes de luz. Entretanto, com o aumento da frao de corte de 80%
para 95%, h uma queda de aproximadamente 18% nos valores de fator de
converso de nitrognio em clulas (em mdia), o que confirma a idia de
que 80% a frao de corte que leva a um maior aproveitamento da fonte de
nitrognio pelas clulas em um processo de cultivo.
No ensaio 7 (Fc = 80% e Ta = 6 dias) foi possvel obter os maiores
valores de Yx/n, com mdia de 10,3 mg.mg-1 . RANGEL-YAGUI et al (2004)
que empregaram uria como fonte de nitrognio, obtiveram 8,1 mg.mg-1 como
maior valor de Yx/n. Nesse caso, a intensidade luminosa de apenas 5,6 klux
pode explicar o menor valor de Yx/n. J CARVALHO et al. (2004) embora
tenham empregado intensidade luminosa de 9 klux, obtiveram um valor de
Yx/n tambm menor (7,39 mg.mg -1 ) provavelmente decorrente do uso de
NH 4 Cl como fonte de nitrognio. Este sal se dissocia rapidamente no meio de
cutivo, possibilitando uma perda mais rpida da fonte de nitrognio por
volatilizao da amnia.
O fato do fator de converso de nitrognio em clulas no ser uma
funo do ciclo de cultivo indica que a incorporao de nitrognio s clulas
se manteve estvel durante os ciclos de cultivo. Assim, reforaria a idia de
que quando o tempo de alimentao bastante curto, caso dos experimentos
1 e 4, que utilizaram fraes de corte de 20% e 50%, respectivamente, a
concentrao celular seria decrescente ao longo dos ciclos at que houvesse
um equilbrio entre a quantidade de nitrognio adicionada e a quantidade de
clulas formada. No entanto, nesses ensaios, devido aos resultados de
concentrao celular mxima serem pouco expressivos, no se teve a
91
inteno de continu-los por mais ciclos, uma vez que no levariam a

resultados interessantes do ponto de vista de aplicao.
V.6.4 - Anlise do teor de protenas e lipdeos da biomassa.

O conhecimento da composio de alimentos uma informao bsica
para o estabelecimento de diversas aes na rea da sade, prescrio de
diettica individual, realizao de estudos de balano e avaliao no
suprimento e consumo alimentares de um pas (SASSANO, 2004).
Ao final de cada ciclo, a biomassa resultante foi levada estufa para
obteno da massa seca, em que se analisou o teor de protenas e lipdeos.
Como se pode observar na Tabela 16, o contedo de protenas no foi
afetado
utilizao
pelas
de
condies
uria
experimentais.
como
fonte
de
Segundo
nitrognio
RANGEL
no
causa
(2000),
mudanas
significativas no contedo de protenas em relao aos cultivos com KNO 3 . E

neste trabalho, as condies experimentais tambm no exerceram influncia
sobre este parmetro, o que indicado na Tabela 23, em que os valores dos
nveis descritivos so todos muito maiores do que 0,05.
experimentais de teor de protenas na biomassa seca obtida.
Fonte
Covarivel:
Ta
Principais efeitos
Fc
Ciclo
Erro
Total
GL
SQ
QM
17,68
17,68
0,45
0,508
3
2
29
35
214,14
34,36
1139,62
2000,50
71,38
17,18
39,30
1,82
0,44
0,166
0,650
cultivo
Em mdia, o teor de protenas foi de 52,25% 5,16%, estando dentro

do valor esperado para biomassa de Spirulina (VONSHAK, 1997b), que varia
de 50 a 60%, sendo extremamente prximo dos obtidos por MAHAJAN &
92
KAMAT (1995) (54%), quando da realizao de experimentos em condies

no limitadas de nitrognio. Esse valor (52,25% 5,16%) prximo de
resultados obtidos para cultivos de S. platensis a 27o C utililizando nitrato
como fonte de nitrognio (60,5%) (DANESI et al., 2002) ou uria (62,50%
4,67%) (DANESI et al., 2004). Essa diferena se acentua um pouco mais
quando comparado com os resultados obtidos por TOKUSOGLU & NAL
(2003), realizados a 20o C. Estes autores encontraram teores de protena de
63,00% para a biomassa de S.platensis. Por outro lado, obtiveram valores
menores de teores de protena para biomassas de
(47,82%) e Isochrisis galbana
(26,99%).
Chlorella vulgaris
Os valores encontrados neste
trabalho tambm no se distanciam muito dos encontrados por OLIVEIRA et

al. (1999), que obtiveram teor de protenas de 64,35% em biomassa de
Spirulina platensis e 68,67% em biomassa Spirulina maxima, em cultivos a 30
C. Com a reduo da temperatura, estes autores encontraram um aumento
do teor de protenas para 71,56% (S. platensis) e 70,24% (S. maxima), mas,
nesses casos, houve considervel diminuio na produtividade em clulas.
As diferenas encontradas entre os trabalhos com Spirulina podem ser
decorrentes das diferentes condies de cultivo e, como assinala VONSHAK
(1997b), das metodologias analticas adotadas para a medida do teor de
protena da biomassa.
O contedo de lipdeos tambm no foi afetado pelas condies
experimentais, o que pode ser observado na Tabela 24, onde foram obtidos
valores de p iguais a 0,379; 0,571 e 0,785 para Tempo de Alimentao,
Frao de Corte e Ciclo de Cultivo, respectivamente.
experimentais de teor de lipdeos na biomassa seca obtida.
Fonte
Covarivel:
Ta
Principais efeitos
Fc
Ciclo
Erro
Total
GL
SQ
QM
13,23
13,23
0,80
0,379
3
2
29
35
33,80
8,06
480,13
534,92
11,27
4,03
16,56
0,68
0,24
0,571
0,785
cultivo.
93
Em mdia, o teor de lipdeos foi de 15,44% 3,88%, estando dentro da

faixa considerada como tpica para a Spirulina, que vai de 6% a 13%
(COHEN, 1997). O valor encontrado est acima do obtido por OLIVEIRA et al.
(1999), em cultivos de Spirulina spp. a 30 C, correspondentes a 6,96% e
6,20% para biomassas de S. platensis e S. maxima, respectivamente. Por
outro lado, o valor encontrado neste trabalho est bastante abaixo de valores
encontrados por MAHAJAN & KAMAT (1995), utilizando baixas quantidades
de nitrognio. Nestas condies, obtiveram biomassa com alta concentrao
de lipdeos (45% da biomassa seca). Ainda constataram que com altas
quantidades de nitrognio, o teor de lipdeos na biomassa caiu para 20 % da
massa seca, e com isto a quantidade de protena pde subir de 8% para at
54%.
SYRETT
microrganismo
(1962)
descreve
utilizado
que
primeiro
o
para
nitrognio
o
assimilado
crescimento
celular
pelo
e,
posteriormente, para formao de nitrognio orgnico como material de

reserva. Neste trabalho, os teores de protenas variaram de 45,00% a
62,22%, e os teores de lipdeos variaram de 10,00% a 21,90%. Isso indica
que em todos os ensaios, houve disponibilidade de nitrognio suficiente tanto
para o crescimento celular quanto para a produo de nitrognio orgnico, na
forma de protenas, como material de reserva da clula.
94
6. CONCLUSES
Os resultados obtidos pelos ensaios permitem concluir que:
Para fraes de corte de 20%, 50% e 95%, tempos de alimentao mais
longos proporcionam maiores valores de Concentrao celular mxima (Xm),

que podem apresentar reprodutibilidade ao longo dos ciclos de cultivo.
Ensaios com tempos de alimentao mais reduzidos, embora tenham levado
a melhores resultados em termos de Produtividade de clulas (Px) e Fator de
converso de nitrognio em clulas (YX/N), no foram adequados para
manuteno da concentrao celular ao longo de trs ciclos de cultivo.
O mesmo fenmeno no ocorre quando se aplica frao de corte de 80%,
em que no houve grandes variaes, em termos de Xm, entre os 3 tempos

de alimentao aplicados, sendo que o menor tempo de alimentao (ensaio
7, com 6 dias de alimentao) apresentou as melhores condies de cultivo
com valores de Concentrao Celular Mxima satisfatrios ao longo dos 3
ciclos (2072, 2005 e 2225 mg.L -1 ), e maiores valores de Produtividade de
clulas (205, 225 e 228 mg.L-1 .D -1 ) e Fator de Converso de Nitrognio em
Clulas (10,0; 9,6 e 11,2 mg.mg-1 )
As condies de cultivo no afetaram os teores de lipdeos e protenas na
biomassa microbiana.
A aplicao do processo descontnuo alimentado repetitivo, empregando
uria como fonte de nitrognio, pode ser vivel na produo de biomassa de

Spirulina platensis, com alto teor de protenas, reduzindo custos de produo
em termos de matria-prima e processo.
95
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Arthrospira Platensis

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UNIVERSIDADE DE SO PAULO

FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS

Cultivo de Spirulina platensis por processo

MARCELO CHUEI MATSUDO

Dissertao para obteno do grau de

MARCELO CHUEI MATSUDO

Cultivo de spirulina platensis por processo descontnuo

Prof. Dr. Joo Carlos Monteiro de Carvalho

Profa. Dra. Telma Mary Kaneko

Prof. Dr. Carlos Eduardo Nascimento Sassano

So Paulo, 25 de julho de 2006

Aos meus pais, Chuken e Hatsuko,

Por que nos impressionamos e ficamos to obcecados

cultivada fotoautotroficamente para a produo de biomassa microbiana.

foram encontrados na literatura tais estudos para o cultivo de S. platensis.

photoautotrophically for the microbial biomass production. Although nitrates are

Spirulina platensis (UTEX 1926).....................................

Minitanques de PVC para cultivo de S. platensis.......................

Curva de calibrao para determinao da concentrao de

Curva de calibrao para determinao da concentrao de

Concentrao celular (X) em funo do tempo para ensaio 1

Concentrao celular (X) em funo do tempo para ensaio 2

Concentrao celular (X) e pH em funo do tempo para ensaio

Concentrao celular (X) e pH em funo do tempo para ensaio

Concentrao celular (X) e pH em funo do tempo para ensaio

Concentrao celular (X) e pH em funo do tempo para ensaio

Concentrao celular (X) e pH em funo do tempo para ensaio

Concentrao celular (X) e pH em funo do tempo para ensaio

Concentrao celular (X) e pH em funo do tempo para ensaio

Concentrao celular (X) e pH em funo do tempo para ensaio

Concentrao celular (X) e pH em funo do tempo para ensaio

Concentrao celular (X) e pH em funo do tempo para ensaio

Representao esquemtica da assimilao de bicarbonato por

Porcentagem de Amnia e Amnio em Funo do pH...............

Concentraes relativas de gs carbnico, bicarbonato

Esquema da assimilao da amnia proveniente de uria e

Composio de aminocidos de protenas de S. platensis e S.

Comparao entre produo de protena de Spirulina spp. e de

Concentrao celular (X), valor de pH e concentrao de

Concentrao celular (X), valor de pH e concentrao de

Concentrao celular (X), valor de pH e concentrao de

Concentrao celular (X), valor de pH e concentrao de

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Concentrao celular (X), valor de pH e concentrao de

Concentrao celular (X), valor de pH e concentrao de

Concentrao celular (X), valor de pH e concentrao de

Concentrao celular (X), valor de pH e concentrao de

Contedo de protenas e lipdeos na biomassa de Spirulina

Parmetros cinticos: concentrao celular mxima (Xm),

Levantamento de preos de uria e nitrato de sdio (grau

Anlise estatstica de covarincia (ANCOVA) aplicada aos

Anlise estatstica de varincia (ANOVA) aplicada aos dados

Anlise estatstica de covarincia (ANCOVA) aplicada aos

Anlise estatstica de covarincia (ANCOVA) aplicada aos

Anlise estatstica de covarincia (ANCOVA) aplicada aos

Anlise estatstica de covarincia (ANCOVA) aplicada aos

4.7.2.2. Protenas totais ................................................................................ 40

colnias em guas superficiais tropicais e subtropicais contendo altos nveis

Atualmente, mais de 70% de Spirulina spp. comercializadas se destinam ao

consumo humano, principalmente para fins nutracuticos (BELAY, 1997 e