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Contagem de clulas de microalgas

Responsveis

Elaborador: Liah Aira Dias Ferreira

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Coordenador da Qualidade Substituto Coordenador da Qualidade

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1 Referncias
[1] GUILLARD, R. R. L.; SIERACKI, M. S.; Counting cells in cultures with light microscope.
In: ANDERSEN, R. A.; Algal Culturing techniques. Burlington: Elselvier Academic Press,
2005. p. 239-252.
[2]SASSANFAR, M.; MANNING, D.; Introduction to counting cells How to use a
hemocytometer. Cambridge, julho de 2013. Workshop realizado no Instituto de tecnologia
de Massachusetts.
[3] Monitoring Algal populations. Disponvel em:
<http://site.iugaza.edu.ps/mwhindi/files/Lab5_Monitoring-algal-populations.pdf>. Acesso em
16/07/2015.
[4] Algae counting. Disponvel em:< http://site.iugaza.edu.ps/mwhindi/files/Lab5_Monitoring-
algal-populations.pdf>. Acesso em: 16/07/2015.
[5] Cell counts using a improved Neubauer hemaecytometer. Disponvel em
<http://weis.science.oregonstate.edu/files/weis/Protocols/Symbiodinium/Cell%20Counts.pdf>.
Acesso em: 16/07/2015.

N do documento ou sua localizao TTULO DO DOCUMENTO

Intranet/Acesso MQ. Manual da Qualidade, seo XX.

2 Objetivo
Contagem de clulas em um determinado volume de amostra com o auxilio de um
microscpio e um hemacitmetro.

3 Aplicao
As principais aplicaes para este mtodo so a determinao do tamanho de uma
populao de microalgas, assim como a sua taxa de crescimento. O tamanho de uma
populao pode ser estimado pelo nmero de clulas em um determinado volume e a taxa
de crescimento determinada atravs de contagens dirias de forma a se obter uma curva
de crescimento populacional.

4 Procedimento
Materiais necessrios:
Etanol (70 - 95%);
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Iodeto de Potssio (KI);
Iodo (I2);
Acetato de sdio (NaOAc);
Micropipeta de 100L;
Cmara de Neubauer;
Microscpio;
Contador;

4.1 Soluo de Lugol:

A soluo de Lugol comumente utilizada para contagem de microalgas para diversas
finalidades, entre elas imobilizao de clulas e auxilio na distino entre clulas vivas e
mortas, pois as clulas mortas mudam a sua colorao em contato com a soluo. Tambm
pode ser utilizada para preservar amostras coletadas em campo. Sua preparao descrita
no item 4.1.1.
4.1.1 Preparao da soluo de Lugol:
Preparar as duas solues descritas na Tabela 1. Em seguida, misturar as solues. Para
evitar a degradao do iodo, armazenar em frasco mbar bem vedado, em local fresco e ao
abrigo da luz.

Tabela 1
Soluo A Soluo B
Dissoluo 50g de iodeto de potssio e 25g Dissoluo 25g de acetato de de sdio
de iodo em 100 mL de gua em ebulio. (NaOAc) em 250 mL de gua destilada.
Deixa-se em repouso at que a mesma se
encontre em temperatura ambiente.

4.2 Preparaes da amostra

A densidade de clulas ideal para este mtodo entre 5. 10 4 107 clulas/mL. Caso a
densidade de clulas seja maior ou menor que o indicado, a diluio/concentrao da
amostra deve ser realizada.
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4.2.1 Diluio:
A diluio deve ser realizada utilizando um volume conhecido de meio de cultura, de forma a
calcular-se o devido fator de diluio descrito na Equao 1.
4.2.2 Concentrao
Decantar a soluo em uma proveta, numa taxa de 1 hora para cada 10 mm de altura da
proveta. Aps a decantao, remover no mnimo 90% do sobrenadante com cuidado.
Homogeneizar a amostra concentrada. Considerar o fator de concentrao descrito na
Equao 1.
Fd = volume final / volume inicial Equao 1
onde Fd o fator de diluio/concentrao.
4.2.3 Adicionar uma gota da soluo de Lugol para cada 1 mL de amostra.

4.3 Preparao do equipamento

4.3.1 Limpar a cmara de Neubauer e as lminas com etanol, deixar secar naturalmente.
Deve-se tomar cuidado para no encostar os dedos na lmina ao manuse-la.
4.3.2 Posicionar a lmina (1) sobre a cmara de Neubauer conforme indicado na FIGURA
1.
4.3.3 Conecte a cmera fotogrfica na parte superior do microscpio.
4.3.4 Conecte o cabo usb da cmera no computador.
4.3.5 Abra o programa IS cmera.

4.4 Carregamento da amostra

4.4.1 Homogeneizar a amostra.
4.4.2 Com o auxlio de uma micropipeta, adicionar 10 L de amostra cmara de
Neubauer. O ponto para insero da amostra se encontra na borda e ao centro da
cmara (4), conforme indicado na FIGURA 1. Posicionar a pipeta 45 e inserir a
amostra de maneira rpida e delicada.
4.4.3 Posicionar a cmara de Neubauer no microscpio conforme a FIGURA 2.
4.4.4 Verificar no microscpio, com a resoluo de 4X, a presena de bolhas de ar. Se
houverem, lavar a cmara com gua destilada e iniciar o procedimento novamente.
4.4.5 Deixar em repouso por 3 minutos antes de prosseguir com a contagem.

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FIGURA 1 - ELEMENTOS DA CMARA DE NEUBAUER

Legenda: 1- Lmina; 2- Cmara de contagem A; 3- Cmara de contagem B; 4- Ponto de insero da amostra;

FIGURA 2 - POSICIONAMENTO DA CMARA DE NEUBAUER NO MICROSCPIO

4.5 Contagem
Existem vrios mtodos para contagem de clulas. O mtodo utilizado nesse procedimento
realiza a contagem das clulas todos os quatro quadrantes e para as duas cmaras de
contagem (2 e 3), conforme a FIGURA 3.

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4.5.1 Ajustar o contador para zero.
4.5.2 Ajustar a resoluo do microscpio para 10X de forma a visualizar com preciso um
quadrante inteiro.
4.5.3 Contar, com o auxilio do contador, todas as clulas do quadrante distinguindo as
clulas vivas e mortas, reveladas pela soluo de Lugol, com exceo das clulas
contidas nas bordas inferior e direita, conforme ilustrado na FIGURA 4.
4.5.4 Preencher a tabela conforme o modelo descrito no item 4.6.1.
4.5.5 Executar o mesmo procedimento para os trs quadrantes restantes.
4.5.6 Executar o mesmo procedimento para a outra cmara de Neubauer.

FIGURA 3 - QUADRANTES UTILIZADOS PARA A CONTAGEM DE CLULAS.

(FONTE: SASSANFAR, M. 2013.)

FIGURA 4 - CLULAS A SEREM CONTADAS EM UM QUADRANTE.

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As clulas indicadas em verde devem ser contabilizadas e as em vermelho devem ser excludas da contagem.
(FONTE: SASSANFAR, M. 2013.)

4.6 Clculos
4.6.1 Preencher as tabelas Tabela 2 e com os dados do ensaio.
Tabela 2 - Cmara A
QUADRANTE CLULAS VIVAS CLULAS MORTAS TOTAL
1
2
3
4
MDIA

Tabela 3 - Cmara B
QUADRANTE CLULAS VIVAS CLULAS MORTAS TOTAL
1
2
3
4
MDIA

4.6.2 Calcular a mdia entre as Cmaras A e B:

MDIA CLULAS VIVAS MDIA CLULAS MORTAS MDIA TOTAL

4.6.3 Clculo da densidade de clulas:

A densidade de clulas o parmetro utilizado para determinar o tamanho de uma cultura e
definido como o peso de clulas por volume.
DENSIDADE (clulas/mL) = Mdia das clulas (vivas/mortas/totais) x Fd x 104
Fd= Fator de diluio/concentrao = Volume final/ Volume inicial

4.6.4 Clculo da viabilidade das clulas:

A viabilidade das clulas a determinao do porcentual das clulas vivas, baseado no
nmero total de clulas.
VIABILIDADE (%) = (mdia clulas vivas / mdia de clulas totais) x 100

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4.6.5 Curva de crescimento populacional
Realizar a contagem diria de clulas, conforme descrito neste procedimento. Plotar a
concentrao de algas em funo dos dias de cultura.
Exemplo: A tabela 4 apresenta a contagem de clulas durante o perodo de 7 dias para uma
populao hipottica de microalgas. A figura x apresenta a curva de crescimento
populacional para esta mesma populao.

Tabela 4 - Contagens de uma populao de microalgas

Dia 1 2 3 4 5 6 7
n de clulas 1.25 2.14 4.62 11.8 20.5 33.8 35.7
-1
n de clulas = n x mL

FIGURA 5 - CRESCIMENTO POPULACIONAL PARA UMA CULTURA DE MICROALGAS

4.7 Captura de imagens

O programa que acompanha a cmera permite a captura de imagens e a produo de
vdeos.

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4.7.1 Captura de imagem
Focalize a imagem e faa os ajustes de nitidez necessrios com o auxlio do microscpio e
em seguida clique sobre o cone Capture (1), no canto esquerdo superior da tela, conforme
a FIGURA 6. As imagens capturadas aparecem na parte inferior da tela (2) e os arquivos so
salvos automaticamente na pasta do programa.

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FIGURA 6 - INTERFACE DO PROGRAMA DE CAPTURA DE IMAGENS.

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FIGURA 7 IMAGEM DE UMA CULTURA DE MICROALGAS OBTIDA COM A CMERA ACOPLADA AO

MICROSCPIO
4.8 Responsabilidades
SEQNCIA

FUNO
CARGO /

ATIVIDADE

1.

5 Histrico das Revises

REVISO DATA HISTRICO

00 XX/XX Emisso inicial
01 XX/XX

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