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Validacao Inmetro PDF
Validacao Inmetro PDF
DOQ-CGCRE-008
Reviso: 01 MARO/2003
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Documento de carter orientativo
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S UMRIO
1 Objetivo
2 Campo de Aplicao
3 Responsabilidade
4 Documentos de Referncia
5 Introduo
6 Definies
7 Questes relevantes quanto utilizao de mtodos analticos
8 Validao de mtodos
9 Planejamento de validao
10 Documentao de mtodos validados
11 Caractersticas de desempenho de mtodos
11.1 Especificidade e seletividade
11.2 Faixa de trabalho e faixa linear de trabalho
11.3 Linearidade
11.4 Sensibilidade
11.5 Limite de deteco
11.6 Limite de quantificao
11.7 Exatido e tendncia (bias)
11.7.1 Materiais de referncia certificados (MRC)
11.7.2 Programas interlaboratorias
11.7.3 Comparao de mtodos
11.8 Preciso
11.8.1 Repetitividade
11.8.2 Reprodutibilidade
11.8.3 Preciso intermediria
11.8.4 Comparao da preciso entre mtodos
11.8.5 Recuperao
11.9 Robustez
11.10 Incerteza de medio
12 Itens revisados
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1. OBJETIVO
Este documento tem como objetivo auxiliar laboratrios na tarefa de demonstrar que um mtodo
de ensaio qumico, nas condies em que praticado, tem as caractersticas necessrias para a
obteno de resultados com a qualidade exigida.
2. CAMPO DE APLICAO
4. DOCUMENTOS DE REFERNCIA
Bruce, P., M inkkinen P., Riekkota M .L. Practical Method Validation: Validation Sufficient for
an Analysis Method. M ikrochim. Acta. 128, 93-106. 1998
CFR Title 40 - Part 136 - Guidelines Establishing Test Procedures for the Analysis of Pollutants
Appendix B Definition and Procedure for the Determination of the Method Detection Limit.
Revision 1.11.
INM ETRO DOQ-DQUAL-006, abril 2001 - Orientaes para Adoo da NBR ISO/IEC 17025
Pelos Laboratrios e Credenciados e Postulantes ao Credenciamento
EAL.- P11. Validation of Test Methods - General principles and concepts. EAL European
cooperation for Accreditation of Laboratories. 1997.
EURACHEM . The Fitness for Purpose of Analytical Methods. A laboratory Guide to Method
Validation and Related Topics. 1ed. 1998
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GARFIELD, F.M . Quality Assurance Principles for Analytical Laboratories. AOAC. Arlington.
1997.
GREEN, J.M . A Practical Guide to Analytical Method Validation. Analytical Chemistry. 1996.
(68) 305A-309A
INM ETRO/ABNT. Guia para a Expresso da Incerteza de Medio, 1998, 2 Ed. Brasileira do
ISO Guide to the Expression of Uncertainty in Measurements.
ISO 3534-1:1993 - Statistics - Vocabulary and Symbols - Part 1: Probability and general
statistical terms
ISO 3534-2:1993 - Statistics - Vocabulary and Symbols - Part 2: Statistical quality control
ISO 5725-1:1994. Accuracy (trueness and precision) of Measurement Methods and Results -
Part 1: General principles and definitions
ISO 5725-2:1994. Accuracy (trueness and precision) of Measurement Methods and Results -
Part 2: basic method for the Determination of Repeatability and Reprodutibility of a Standard
Measurement Method.
ISO 5725-3:1994. Accuracy (trueness and precision) of Measurement Methods and Results -
Part 3: Intermediate Measures of Precision of a Standard Measurement Method.
ISO 5725-4:1994. Accuracy (trueness and precision) of Measurement Methods and Results -
Part 4: Basic Methods for the Determination of the Trueness of a Standard Measurement
method.
ISO 5725-6:1994. Accuracy (trueness and precision) of Measurement Methods and Results -
Part 6: Use in Practice of Accuracy Values.
ISO 78-2:1999 Chemistry Layout for standards Part 2: Methods of chemical analysis.
NATA. Technical Note 17. Format and Content of Test Methods and Procedures for Validation
and Verification of Chemical Test Methods. 1997.
RELACRE. Guia Relacre 13. Validao de Mtodos Internos de Ensaio em Anlise Qumica.
Portugal. 2000
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5. INTRODUO
fundamental que os laboratrios disponham de meios e critrios objetivos para
demonstrar, atravs da validao, que os mtodos de ensaio que executam conduzem a resultados
confiveis e adequados qualidade pretendida. Se um mtodo existente for modificado para
atender aos requisitos especficos, ou um mtodo totalmente novo for desenvolvido, o
laboratrio deve se assegurar de que as caractersticas de desempenho do mtodo atendem aos
requisitos para as operaes analticas pretendidas.
O laboratrio, ao empregar mtodos de ensaios qumicos emitidos por organismos de
normalizao, organizaes reconhecidas na sua rea de atuao ou publicados em livros e/ou
peridicos de grande credibilidade na comunidade cientfica, necessita demonstrar que tem
condies de operar de maneira adequada estes mtodos normalizados, dentro das condies
especficas existentes nas suas instalaes antes de implant-los.
.
6. DEFINIES
As definies gerais referentes qualidade so dadas na NBR ISO 9000, enquanto o ABNT ISO
/IEC Guia 2 estabelece definies especificamente relacionadas normalizao, certificao e
credenciamento de laboratrio. As definies do ABNT ISO/IEC Guia 2 e do VIM so
preferidas quando as definies dadas so diferentes na NBR ISO 9000.
6.1 VALIDA O
Comprovao, atravs do fornecimento de evidncia objetiva, de que os requisitos para uma
aplicao ou uso especficos pretendidos foram atendidos. (NBR ISO 9000).
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- Especificidade e Seletividade
- Linearidade
- Sensibilidade
- Limite de deteco
- Limite de quantificao
- Preciso
- Robustez
- Incerteza de medio
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Uma amostra, de maneira geral, consiste dos analitos a serem medidos, da matriz e de
outros componentes que podem ter algum efeito na medio, mas que no se quer quantificar. A
especificidade e a seletividade esto relacionadas ao evento da deteco. Um mtodo que produz
resposta para apenas um analito chamado especfico. Um mtodo que produz respostas para
vrios analitos, mas que pode distinguir a resposta de um analito da de outros, chamado
seletivo. Entretanto, os termos especificidade e seletividade so freqentemente utilizados
indistintamente ou com diferentes interpretaes.
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Vrios testes e suas estatsticas correspondentes podem ser utilizados para o estudo da
seletividade dependendo da disponibilidade do analito, da matriz sem o analito e de amostras de
referncia nas concentraes de interesse. Se a matriz da amostra sem analito ou um grupo
satisfatrio de amostras de referncia esto disponveis, podem ser aplicados os testes F
(Snedecor) de homogeneidade de varincias e o teste t (Student) de comparao de mdias, ou
ento realizada a anlise dos desvios em relao aos valores de referncia. Normalmente, parte-
se da hiptese em que a matriz no afeta o sinal do analito em nveis de concentraes elevados
ou acima da faixa. Preparam-se dois grupos de amostras de teste, um com a matriz e o outro
sem, ambos os grupos com a concentrao do analito idntica em cada nvel de concentrao de
interesse. O nmero de amostras paralelas em cada nvel de concentrao deve ser maior ou
igual a 7 (sete) para permitir o uso adequado dos modelos estatsticos e proporcionar uma
comparao vlida. Primeiro, faz-se o teste F para verificar se as varincias das amostras podem
ser consideradas iguais, calculando-se:
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s12
F= (1)
s22
2 2
onde s1 e s2 so as varincias de cada amostra, com a maior varincia no numerador. Ao
mesmo tempo, obtm-se o valor de Ftabelado, com (n1-1) graus de liberdade no numerador e (n2-1)
graus de liberdade no denominador; usualmente, adota-se um nvel de confiana de 95%. Tem-
se dois casos:
x 1 e x 2 = mdias das respostas dos analitos em amostras com matriz e sem matriz na
mesma faixa de concentraes,
s1 e s2 = desvios-padro das respostas dos analitos dos dois grupos de amostras, bem
como o valor
x1 x2
t calculado = (2)
1 1
s 2 +
n
1 n2
( n1 1) s 21 + ( n2 1) s22
onde s 2 = e n1 e n2 so os tamanhos das amostras 1 e 2.
(n1 + n2 2)
O valor de ttabelado obtido a partir da tabela da distribuio de Student para (n1 + n2 2) graus de
liberdade e a confiana desejada.
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x1 x2
t calculado = (3)
2 2
s1 s2
+
n1 n2
=
(s12 )2
n1 + s22 n 2
-2
(4)
(s1 n1) + (s 2 n2 )
2 2 2 2
n1 + 1 n2 + 1
x n
t calculado = d (5)
sd
onde:
[(d ]
n 2
di 2 ) x d
xd =
n
(d i1 d i 2 ) sd = i=1
i1
Nas equaes, x d = mdia das diferenas entre as respostas dos pares de analitos;
d i1 , d i 2 = respostas do analito para o par de amostras com matriz e sem matriz; sd = desvio
Se o valor de t calculado for menor que o t tabelado, pode-se concluir que a matriz no
afeta o ensaio. Se o valor de t for maior que o esperado, pode-se concluir que a matriz tem um
efeito estatisticamente significante sobre o resultado do ensaio.
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Dentro da faixa de trabalho pode existir uma faixa de resposta linear e dentro desta, a
resposta do sinal ter uma relao linear com o analito ou valor da propriedade. A extenso
dessa faixa pode ser estabelecida durante a avaliao da faixa de trabalho.
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devem ser praticadas sem o risco de introduzir erros sistemticos (bias). A varincia dos valores
informados deve ser independente da concentrao. Esta independncia deve ser verificada por
um teste estatstico para a linearidade.
Em geral, sero necessrios vrios pontos de calibrao, de preferncia mais que seis,
para determinar a faixa de trabalho. Na Tabela 1 so apresentadas as metodologias para
determinao das faixas de trabalho e linear.
A faixa de trabalho e a faixa linear podem ser diferentes para cada tipo de amostra,
devido ao efeito das interferncias provenientes da matriz.
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N Matriz Procedimento
Replicatas
Observaes:
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y = ax + b (8)
Onde:
x = concentrao;
A linearidade de um mtodo pode ser observada pelo grfico dos resultados dos ensaios
em funo da concentrao do analito ou ento calculados a partir da equao da regresso
linear, determinada pelo mtodo dos mnimos quadrados.
O coeficiente de correlao linear (r) freqentemente usado para indicar o quanto pode
ser considerada adequada a reta como modelo matemtico. Um valor maior que 0,90 ,
usualmente, requerido. O mtodo pode ser considerado como livre de tendncias (unbiased) se o
corredor de confiana da reta de regresso linear contiver a origem.
resduo
t calculado = (9)
sr n
onde:
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n = nmero de pontos
Se o valor de t calculado para um ponto duvidoso de uma curva de calibrao for menor ou igual
ao valor de t unilateral, para a confiana desejada e (n-1) graus de liberdade, considera-se que o
ponto pertence curva e a faixa at ele linear:
dx
S= (10)
dc
Onde:
S = sensibilidade;
dx = variao da resposta;
dc = variao da concentrao.
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Calcular a varincia (s2 ) e o desvio padro (s) das medies em replicata e calcular o LDM
como a seguir:
onde:
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O mtodo analtico deve ser especificado e o LDM para cada analito deve ser expresso
nas unidades apropriadas, de acordo com o preconizado no mtodo analtico. A matriz da
amostra usada para determinar o LDM deve ser identificada.
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- Expressar o LQ como a
concentrao mais baixa do analito
que pode ser determinada com um
nvel aceitvel de incerteza.
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O uso correto dos M RC consiste na sua anlise para avaliar o desempenho do laboratrio.
Quando o valor obtido no estiver dentro do intervalo da incerteza indicado para o valor
certificado, o laboratrio deve procurar as causas desse desvio e tentar elimin-las ou aceit-las,
dependendo do rigor definido para os resultados.
erro relativo;
teste de hipteses;
ndice z (z Score), e
erro normalizado.
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Uma forma de avaliar a exatido do mtodo atravs do clculo do erro relativo (ER),
expresso em percentagem, atravs da expresso:
X lab X v
ER = . 100 (12)
Xv
Onde:
( X lab X v )
Z= (13)
s
Onde:
A avaliao pode ser feita (ISO Guia 43) de acordo com a seguinte escala de pontuao:
IZI 2 = satisfatrio;
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Caso o laboratrio calcule a incerteza do seu resultado (Ulab), o valor verdadeiro (Xv )
deve estar dentro do intervalo de incerteza Xlab. Quando isso no acontece, esse intervalo pode
estar subestimado. Nesses casos empregado o conceito de erro normalizado (En), para avaliar o
desempenho.
( X lab X v )
En = (14)
2
U lab + U ref
2
Onde:
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Existem vrias tcnicas para comparar os resultados obtidos por dois mtodos de ensaio,
entre as quais Testes de Hiptese, Teste de Regresso Linear entre os dois mtodos e Projeto de
Experimentos.
11.8 PRECIS O
A preciso geralmente expressa como desvio padro ou desvio padro relativo. Ambas
repetitividade e reprodutibilidade, so geralmente dependentes da concentrao do analito e,
deste modo, devem ser determinadas para um diferente nmero de concentraes e, em casos
relevantes, a relao entre preciso e a concentrao do analito deve ser estabelecida. O desvio
padro relativo pode ser mais til neste caso, pois foi normalizado com base na concentrao e
deste modo ele praticamente constante ao longo da faixa de interesse, contanto que esta no
seja muito grande.
11.8.1 Repetitividade
M esmo observador;
M esmo local, e
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A partir do desvio padro dos resultados dos ensaios sob condio de repetitividade
aconselhvel calcular o limite de repetitividade r que capacita o analista a decidir se a
diferena entre anlises duplicatas de uma amostra, determinada sob condies de repetitividade,
significante.
r = 2,8 . S r (15)
sendo:
11.8.2 Reprodutibilidade
Preciso sob condies de reprodutibilidade, por exemplo, onde resultados dos ensaios
so obtidos com o mesmo mtodo, variando-se laboratrios, operadores ou equipamentos
denominada preciso intermediria (ver 11.8.3).
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Do mesmo modo que para repetitividade, o limite de reprodutibilidade (R), para um nvel
de confiana de 95%, dado por:
R = 2,8 . S R2 (16)
sendo:
diferentes analistas;
diferentes equipamentos;
diferentes tempos.
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por meio de grfico de controle de amplitude, que podero ser aplicados para
replicatas de amostra e para padres estveis ao longo do tempo;
(y )
1 t n
2
Si ( ) = jk yj (17)
t ( n 1) j =1 k =1
Onde:
intermedirias de preciso podem aparecer entre parnteses, ex: Si (T.O.) significa tempo e
operadores diferentes)
j n da amostra, j = 1, t
k n do ensaio da amostra j, k = 1, n
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1 t
Si ( ) = . ( y j1 y j 2 ) 2 (18)
2.t j =1
Onde:
padres.
1 n
n 1
Si ( ) = ( yk y )2 (19)
k =1
em que Si ( ) o desvio padro de preciso intermediria relativo a esse grupo, onde os smbolos
relativos s condies intermedirias de preciso podem aparecer entre parntesis (Ex: Si (T.O)
significa tempo e Operadores diferentes). Este mtodo revela-se menos eficiente quando
comparado com os anteriores.
Onde:
n n de amostras / padres;
Recomenda-se a leitura da Norma ISO 5725-3 para aprofundar conhecimento nesta rea.
Na Norma ISO 5725-6 so expostos vrios exemplos prticos de estimativa e controle da
preciso intermediria, atravs de grficos de controle.
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11.8.5 Recuperao
A recuperao do analito pode ser estimada pela anlise de amostras adicionadas com
quantidades conhecidas do mesmo (spike). As amostras podem ser adicionadas com o analito em
pelo menos trs diferentes concentraes, por exemplo, prximo ao limite de deteco, prximo
concentrao mxima permissvel e em uma concentrao prxima mdia da faixa de uso do
mtodo. A limitao deste procedimento a de que o analito adicionado no est
necessariamente na mesma forma que a presente na amostra. A presena de analitos adicionados
em uma forma mais facilmente detectvel pode ocasionar avaliaes excessivamente otimistas
da recuperao.
C C2
Recuperao (%) = 1 100 (20)
C3
C3 = concentrao adicionada.
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s +u + w+ y t + v + x + z
Efeito C/c = -
4 4
Calcular todos os 7 pares para obter 7 diferenas, que podem ser ordenados para revelar
aqueles com efeito significante no resultado.
Aps crtica dos resultados obtidos, fazer um controle mais rigoroso dos fatores de maior
influncia.
Outros documentos utilizados para verificao da robustez esto citados nos Documentos
de referncia.
Includo texto complementando o item 11.1.2 e introduzindo os itens 11.2 e 11.2.1 (incio),
que foram inadvertidamente suprimidos na edio da reviso anterior.
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AN EXO
Tnia Simes
EM BRAPA / CTAA
Vanderla de Souza
INM ETRO / Diviso de M etrologia Qumica
Albert Hartmann
M illennium Chemicals
Vera Harcar
Rede de Tecnologia do Rio de Janeiro
Srgio Motta
SENAI / CETIND
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Hlio Lionel
Especialista em Qumica do Petrleo
Kikue Higashi
Especialista em Qumica Ambiental
Reginaldo Ramos
Especialista em Qumica Ambiental
Walderez Bindilatti
Qumica
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