Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003 1

Nova tecnologia
no combate ao
Entrevista
mal da vaca louca
Metodologia detecta protenas na rao e evita a contaminao de animais
Entrevista concedida a
Maria Fernanda Diniz

mal da vaca louca, conhecido cientificamente como

BSE (sigla em ingls para encefalopatia
espongiforme bovina), afeta o crebro do animal,
provocando descontrole motor. As clulas morrem
e o crebro fica com a aparncia de uma esponja.
A vaca passa a agir como se estivesse enlouquecida, o que explica
o fato de ser conhecida popularmente como mal da vaca louca.
No h tratamento conhecido para essa doena, que j foi
detectada em cerca de 20 pases da Europa, atingindo mais de 180
mil cabeas de gado. Ao contrrio da maior parte das enfermida-
des, o mal da vaca louca no transmitido por fungos, vrus ou
bactrias, e sim por protenas especficas denominadas prions.
Essa doena nunca foi detectada no Brasil e a sua entrada, certamente,
resultaria em um desastre para o pas, que tem na pecuria um de seus
principais alicerces econmicos, representando ganhos de mais de R$ 55
bilhes por ano. Sem falar que o rebanho brasileiro hoje maior do que a
soma dos rebanhos da Argentina, Paraguai e Uruguai. Diante da necessidade
urgente de conter a sua disseminao, a Empresa Brasileira de Pesquisa
Agropecuria (Embrapa), por meio de uma de suas 40 unidades de pesquisa,
a Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia, localizada em Braslia, DF,
desenvolveu um mtodo para deteco de protenas de origem animal em
raes destinadas a mamferos, especialmente ruminantes, que tem como
objetivo monitorar a qualidade do alimento e evitar a transmisso de doenas
causadas por substncias infecciosas, tais como prions transmissores de
encefalopatias espongiformes transmissveis (TSE), principalmente o mal da
vaca louca.
O mtodo, desenvolvido pela equipe do pesquisador Carlos Bloch Jr h
cerca de trs anos, cuja patente foi depositada pela Embrapa em 2002, utiliza
aparelhos de ltima gerao denominados espectrmetros de massa, para a
deteco das protenas. Para se ter uma idia do grau de modernidade e de
eficincia desses aparelhos, eles possuem tecnologia comparvel que est
sendo usada pelos robs Spirit e Opportunity nas pesquisas que esto sendo
feitas pela NASA no Planeta Marte, para a deteco de outros tipos de
molculas. De acordo com o pesquisador, esses aparelhos so hipersensveis,
com um limite de deteco altssimo, de uma parte por milho, ou seja, se
fizermos uma comparao com uma balana na qual fossem colocadas um
milho de pessoas, o espectrmetro de massa seria capaz de detectar a ausncia
de apenas uma delas.

2 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003

 Para falar sobre essa metodolo-
gia e a sua importncia para a pesqui-
sa agropecuria brasileira, a revista
Biotecnologia, Cincia & Desen-
volvimento entrevistou o pesquisa-
dor da Embrapa Recursos Genticos
e Biotecnologia, Carlos Bloch Jr. Du-
rante a entrevista, ele falou sobre o
mtodo desenvolvido por sua equi-
pe e das vantagens que representa
sobre os outros mtodos utilizados
at o momento, alm dos rumos
dessas pesquisas para o futuro.
BC&D Em que consiste o
mtodo utilizado pela Embrapa
Recursos Genticos e Biotecnolo-
gia e h quanto tempo foi desen-
volvido?
Bloch O mtodo comeou a
ser desenvolvido pela nossa equipe
h cerca de trs anos, foi aperfeioa-
do ao longo de 2001 e em 2002 foi
depositada a patente. O objetivo
desse mtodo avaliar a qualidade
das raes destinadas a ruminantes
e, assim, evitar a transmisso de
TSEs (encefalopatias espongiformes
transmissveis), especialmente a
encefalopatia espongiforme bovina
(BSE), pela deteco de protenas de
origem animal, em particular daque-
las provenientes de restos de carca-
as de animais abatidos que pudes-
sem ser misturados rao. O
desenvolvimento dessa metodologia
compreende trs etapas: a primeira e
mais trabalhosa a extrao do ma-
terial protico para separ-lo, princi-
palmente de lipdeos e dos carboi-
dratos. Em seguida, cada amostra
pode ser analisada em dois tipos de
espectrmetros de massa simultane-
amente, o primeiro analisa em pou-
cos minutos a presena de molculas
de protena animal, como a mioglo-
bina, cadeias alfa e beta da hemoglo-
bina e protenas plasmticas, para
dizer se existe ou no algum indcio
de contaminao. O segundo analisa
e quantifica os seus fragmentos
(peptdeos) derivados de molculas
inteiras de contaminantes, que po-
dem se formar a partir do ataque de
microrganismos e/ou da ao mec-
nica durante o processo de fabrica-
o. A terceira etapa a interpreta-
o dos dados para determinar os
nveis de contaminao e a sua ori-
gem, ou seja, se as molculas conta-
minantes encontradas eram proveni-
entes de bovinos, sunos, eqinos,
ovinos, aves, peixes, etc.
O grande avano propiciado
por essa metodologia o fato
de poder detectar as protenas
inteiras ou fragmentos delas
com uma preciso de uma
parte por milho (PPM).
BC&D Qual a vantagem da
espectrometria de massa sobre
os outros mtodos utilizados para
o controle dessas doenas?
Bloch A espectrometria de
massa um mtodo muito mais sen-
svel, rpido e seguro para se diag-
nosticar a presena desse tipo de
molcula. No toa que voc
encontra espectrmetros de massa
espalhados por locais e em ativida-
des que at bem pouco tempo atrs
no se poderia imaginar. S para
citar alguns exemplos, encontram-se
hoje espectrmetros de massa nos
aeroportos, nos correios, nos espor-
tes, nos tanques e avies de guerra,
sem falar nas misses espaciais. So
esses equipamentos que produzem,
com mais rapidez e eficincia, res-
postas sobre a presena ou no de
explosivos, material de guerra qu-
mica ou biolgica. Atualmente, so
utilizados trs mtodos para monitorar
a qualidade dos alimentos dos rumi-
nantes: o primeiro o de microscopia
tica, que se baseia na procura de
fragmentos de pele, ossos etc. na
rao; o segundo o mtodo ELISA,
que utiliza anticorpos para detectar
as protenas alvo; e o terceiro e mais
novo o mtodo PCR, que detecta o
DNA das protenas por meio de um
primer (um tipo de gene marcador).
Todos esses mtodos apresentam li-
Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
mitaes da mesma natureza, ou seja,
no detectam diretamente a presen-
a de protena. O primeiro, e mais
utilizado ainda hoje na Unio Euro-
pia tambm o mais falho de todos,
j que a microscopia tica no permi-
te a deteco de protenas. O mto-
do ELISA tem como fator limitante o
fato de utilizar anticorpos especficos
para determinadas classes de prote-
nas, o que impede a identificao de
outros grupos; e o terceiro, o de PCR,
esbarra no problema do DNA ser
fragmentado depois do processo de
industrializao, tornando difcil a
sua amplificao para a anlise. Logo,
a espectrometria de massa aparece
como o mtodo mais preciso para a
deteco direta e no indireta de
protenas. O grande avano propici-
ado por essa metodologia o fato de
poder detectar as protenas inteiras
ou fragmentos delas com uma preci-
so de uma parte por milho (PPM).
O que isso significa? Se fizermos uma
analogia com uma balana na qual
so colocadas um milho de pessoas,
o espectrmetro capaz de detectar
a ausncia de apenas uma delas. E os
nveis de deteco esto sendo me-
lhorados cada vez mais. Os ltimos
espectrmetros lanados j tm po-
der de menos de uma parte por
milho, ou seja, menos de uma pes-
soa, se continuarmos a seguir aquela
analogia, e tudo isso com muita rapi-
dez e eficincia automatizveis. A
parte mais demorada desse processo
a primeira etapa, na qual feita a
extrao do material a ser analisado.
Essa etapa pode demorar de 36 a 72
horas, mas comum a todos os
outros mtodos. Em suma, ao que
tudo indica, essa metodologia o
que existe hoje de mais moderno e
seguro para monitorar a qualidade
dos alimentos oferecidos aos rumi-
nantes e, logo, controlar a dissemina-
o das encefalopatias espongifor-
mes transmissveis, ou TSEs, como
so conhecidas.
BC&D As TSE s , entre as
quais a mais nociva a BSE
(encefalopatia espongiforme bo-
vina), ou mal da vaca louca, re-
3
 presentam uma ameaa no ape-
nas para os animais como tam-
bm para os seres humanos.
Como se d a contaminao e
qual o tratamento existente hoje
para essas doenas?
Bloch As encefalopatias es-
pongiformes transmissveis, ou TSEs,
so doenas progressivas e letais que
afetam o sistema nervoso central e se
caracterizam por alteraes anatmicas
localizadas no crebro. Essas altera-
es so um tipo de leso histolgica,
constitudas de vacolos e depsitos
proticos. As TSEs podem resultar de
infeces espontneas, transmisso
hereditria ou exposio a materiais
contaminados. As TSEs incluem: a
BSE, conhecida popularmente como
mal da vaca louca; a scrapie, ou
paraplexia enzotica dos ovinos, que
afeta ovinos e caprinos em muitos
pases h mais de 200 anos; e a
doena de Creutzfeldt-Jakob (CJD)
que afeta seres humanos, principal-
mente com mais de 50 anos de idade.
Essa doena tem distribuio mundi-
al, com incidncia anual de aproxima-
damente um caso por milho e ocorre
de trs formas: espordica (respons-
vel por 85 a 90% dos casos). familiar
(associada a mutaes genticas, re-
presenta 5 a 10% dos casos) e
iatrognica, ou seja, por contamina-
o, (responsvel por menos de 5%
dos casos). Logo, em humanos, a
chance de desenvolver a doena por
contaminao de menos de 5%. Nos
outros 95% dos casos, a doena se
desenvolve naturalmente. Em ovinos
e bovinos, os principais sintomas so
agressividade e falta de coordenao
motora. Em humanos, os principais
sintomas so: mioclonia contrao
muscular brusca e breve e demn-
cia. No existe tratamento conhecido
para a BSE, portanto, a nica forma de
combat-la evitando a contamina-
o. Cerca de 125 casos foram
registrados no mundo em humanos,
segundo os Centros de Controle e
Preveno de Doenas dos Estados
Unidos, e na Europa, aproximada-
mente 100 pessoas morreram em fun-
o dessa doena. Mas, para os ani-
4 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
mais, a situao bem mais sria,
visto que j foi detectada em mais de
20 pases da Europa, atingindo mais
de 180 mil cabeas de gado.
BC&D Ento a BSE tem se
disseminado de forma rpida, es-
pecialmente na Europa. Como se
d a contaminao?
Bloch A natureza do agente
infeccioso da BSE, assim como das
outras TSEs, ainda motivo de
controvrsia. Acredita-se que as
partculas infecciosas responsveis
pela BSE so predominantemente
protenas especficas denominadas
prions, que so compostas, em qua-
se a sua totalidade, de uma
glicoprotena de conformao anor-
mal, que se prende superfcie
externa das clulas. Em outras
palavras, a teoria mais aceita hoje
afirma que o agente infeccioso,
prion, derivado de uma protena
da membrana celular, que sofre
uma mutao e forma um tipo inso-
lvel e patognico de prion. Ainda
hoje no est totalmente esclareci-
do o mecanismo pelo qual essa
protena anormal produz as altera-
es patolgicas no crebro dos
animais ou indivduos afetados.
BC&D Desde que foi diag-
nosticada pela primeira vez no
mundo, como se deu a evoluo
da BSE ao longo dos anos?
Bloch Os primeiros casos de
BSE foram diagnosticados no Reino
Unido, em 1986. No final de 1987,
o Departamento de Epidemiologia
do Laboratrio Veterinrio Central
daquele pas concluiu que a disse-
minao da doena entre os bovi-
nos ocorria mediante o consumo de
farinha de carne e ossos, obtida a
partir de carcaas de animais conta-
minados e incorporada rao ofe-
recida aos bovinos. Essa teoria foi
plenamente confirmada, j que a
proibio do uso daquele produto
na alimentao de ruminantes teve
efeito claro, resultando em reduo
significativa no aparecimento de
novos casos de BSE. Foram levan-
tadas outras possibilidades de con-
taminao, como por exemplo, a
transmisso vertical da vaca para o
bezerro. Mas, o que se sabe de fato
que a epidemia do mal da vaca
louca no teria acontecido se no
houvesse disseminao por meio
da farinha de carne e ossos. Diante
disso, pode-se dizer que se um
bovino contaminado for introduzi-
do num pas ou regio onde no
existe BSE, como o caso do Brasil,
s poder ocorrer uma epidemia se
a carcaa desse animal for utilizada
para produzir farinha destinada
alimentao de ruminantes porque
isso gera um sistema de dissemina-
o e amplificao do agente infec-
cioso na populao animal. Aps
o incio da epidemia no Reino Uni-
do, surgiu a teoria de que os primei-
ros casos de BSE teriam resultado
da utilizao de carcaas de ovinos
contaminados com scrapie na ali-
mentao de bovinos e que uma
mudana no processo industrial de
produo de farinha de carne e
ossos teria diminudo a probabili-
dade de inativao do agente infec-
cioso. Entretanto, foram surgindo
evidncias de que a BSE e a scrapie
so doenas diferentes, embora per-
tencentes ao mesmo grupo. Uma
das evidncias foi obtida a partir da
inoculao experimental de scrapie
em bovinos, que resultou em uma
doena diferente da BSE. Alm
disso, a BSE mantm as suas carac-
tersticas durante toda a epidemia,
mesmo quando transmitida a ou-
tra espcie animal, ao contrrio da
scrapie. Sem falar que essa doena
no pode contaminar seres huma-
nos, como o caso da BSE. Na
verdade, o ponto em comum entre
as TSEs a elevada resistncia a
tratamentos fsico-qumicos de es-
terilizao.
BC&D Mas h indcios de
que a doena possa ter surgido
antes de 1986, no verdade?
Bloch Alguns relatrios tc-
nicos mais recentes indicam que os
casos de BSE diagnosticados a par-
tir de 1986 no teriam sido os pri-
meiros casos da doena que, prova-
velmente, j existia no Reino Unido
anteriormente. Alguns veterinrios
britnicos alegam ter visto casos
semelhantes antes de 1986 que, na
poca, foram diagnosticados como
doenas metablicas comuns em
vacas de alta produo. Mas no h
comprovao cientfica sobre essas
evidncias.
BC&D Ento a causa mais
provvel para a transmisso da
BSE em bovinos est mesmo na
mudana no processo de fabrica-
o de farinha de carne e ossos,
que tornou possvel a reciclagem
do agente infeccioso?
Bloch Essa, sem dvida, a
causa mais provvel para a transmis-
so dessa doena, o que tem repre-
sentado um prejuzo para os produ-
tores em escala mundial, j que as
raes base de farinha de osso,
sangue e carne vinham sendo larga-
mente recomendadas e usadas na
alimentao de animais, como uma
fonte de protena, devido presena
de aminocidos essenciais, minerais
e vitamina B12. Alm disso, essa
forma de aproveitamento uma ma-
neira eficaz de reciclar os subprodutos
proveniente do abate, evitando cus-
tos econmicos e ambientais adicio-
nais. No entanto, como os materiais
base de osso e carnes de animais
mamferos presentes em dietas para
ruminantes foram considerados a pro-
vvel causa da BSE em bovinos, o seu
uso foi proibido na Comunidade Eu-
ropia, nos EUA e tambm no Brasil.
Diante das vantagens desse tipo de
alimentao para os bovinos, vrias
tm sido as tentativas de cessar a
transmisso das TSEs, em particular
da BSE. Alguns trabalhos tm sido
direcionados para a inativao das
partculas infecciosas, favorecendo,
assim, o aproveitamento dos resdu-
os do abate. Outros tm visado elimi-
nar a possibilidade da transmisso
pela deteco de protenas animais
nas raes e a sua rejeio no caso de
teste positivo. Ambas as formas fa-
zem uso de procedimentos analticos
para garantir a ausncia de agentes
causadores das TSEs na alimentao
animal. Dentre esses procedimentos,
esto os que eu j descrevi na ques-
to anterior, ou seja, a microscopia
tica, o mtodo ELISA e as anlises
de DNA por PCR. A complexidade e
especificidade das biomolculas tm
dificultado em muito a aplicao das
tcnicas freqentemente utilizadas
para a identificao e caracterizao
de compostos inorgnicos e orgni-
cos nas raes. Esse fato vem moti-
vando o desenvolvimento de tcni-
cas analticas cada vez mais sofistica-
das e eficientes, com nfase na pre-
ciso requerida pela moderna biotec-
nologia. Dessa forma, chegamos hoje
aos espectrmetros de massa que,
como eu tambm j mencionei antes,
so o que h de mais moderno e
preciso para a deteco de protenas
nas raes de ruminantes.
BC&D E quais so os passos
daqui pra frente, j existe alguma
parceria para repasse dessa
tecnologia iniciativa privada?
Existe alguma demanda do gover-
no brasileiro para que essa
tecnologia se torne obrigatria,
de modo a evitar a entrada do
mal da vaca louca no Brasil?
Bloch Creio firmemente que
antes de nos preocuparmos com
qualquer tipo de avano tecnolgi-
co e sua comercializao, como o
caso desse mtodo, devemos v-lo
como uma ferramenta de trabalho.
Ela s poder servir ao seu prop-
sito e alcanar sua plenitude de uso
se houver a viso clara do objetivo
final que queremos atingir. Ou seja,
se o nosso objetivo final for o lucro
imediato, puro e simples para satis-
fazer acionistas, balanas de paga-
mentos e manuteno dos mesmos
paradigmas de produo vigentes
h dcadas, essa tecnologia ter um
impacto modesto e servir somente
nos momentos de crise, como o que
estamos vivendo hoje, caso contr-
rio cair no esquecimento, como de
Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
fato ela se encontrava, at o
surgimento da BSE nos Estados Uni-
dos. Contudo, se tomarmos a deci-
so de priorizar a vida, a qualidade
e a sanidade dos alimentos que
chegam s mesas dessa gerao e
das prximas, essa tecnologia com
certeza ser de grande utilidade,
no somente no processo de iden-
tificao de contaminantes intenci-
onais ou acidentais, mas poder
didaticamente demonstrar interna-
mente e para o exterior que esse
pas possui tecnologia de alto nvel
para responder a problemas mun-
diais imediatos, bem como para
oferecer alternativas mais inteligen-
tes e com viso de perspectiva para
um setor to importante como o do
agronegcio. No que diz respeito
aos aspectos legais dessa tecnologia,
ela j est patenteada e pronta para
ser licenciada iniciativa privada.
Estamos aguardando propostas de
empresas interessadas em utiliz-
la. Quanto ao governo brasileiro, a
Embrapa e o Ministrio da Agricul-
tura, Pecuria e Abastecimento
(MAPA) esto em entendimento
para discutir a melhor forma de
implement-la e, assim, dar um gran-
de passo para reduzir ainda mais a
possibilidade da presena de prote-
nas animais nas raes. Provavel-
mente, ser por meio de uma porta-
ria que obrigue as empresas a testa-
rem seus produtos. A nossa equipe
da Embrapa Recursos Genticos e
Biotecnologia tem plenas condies
de atender a essas demandas. Se-
ro necessrias apenas algumas
adaptaes nos laboratrios de es-
pectrometria de massa, de forma a
torn-los mais aptos a prestar servi-
os visto que hoje so laboratri-
os de pesquisa alm da contratao
de pessoal especializado. Ns j
atendemos a uma demanda do
MAPA para anlise de 800 amostras
e, dessas, grande parte continha
protenas animais. No final do ms
de fevereiro, teremos uma nova
reunio com a equipe do Ministrio
para fechar essa questo.
___________________________________
O e-mail do Professor Carlos Bloch Jnior :
cbloch@cenargen.embrapa.br
5
 Carta ao Leitor

Prezados Leitores,

J est bem divulgado o problema do mal da vaca

BIOTECNOLOGIA Cincia & Desenvolvimento
KL3 Publicaes
Fundador
Dr. Henrique da Silva Castro
louca no mundo todo, principalmente sobre os surtos
que aconteceram na Europa e dizimaram milhares de
cabeas de gado, causando imenso prejuzo.
Aqui no Brasil, felizmente at agora, fomos poupados,
mas sabemos tambm que pode ser apenas uma
questo de tempo. Por isso mesmo o apoio pesquisa
dessa importante doena primordial para a pecuria
no pas.
Para falar sobre o assunto convidamos o Dr. Carlos
Bloch Jr., que desenvolve, na Embrapa-Cenargen, um
mtodo de combate doena. Confira a entrevista.

Direo Geral e Edio Dr. Henrique da Silva Castro

Ana Lcia de Almeida
E-mail
biotecnologia@biotecnologia.com.br
Nota: Todas as edies da Revista Biotecnologia Cincia &
Home-Page Desenvolvimento esto sendo indexadas para o AGRIS
(International Information System for the Agricultural Sciences
www.biotecnologia.com.br and Technology) da FAO e para a AGROBASE (Base de Dados
da Agricultura Brasileira).
Projeto Grfico
KL3 Publicaes LTDA

SHIN CA 05 Conjunto J
Bloco B Sala 105
Lago Norte - Braslia - DF
Tel.: (061) 468-6099
Fax: (061) 468-3214

Os artigos assinados so de
inteira responsabilidade
de seus autores.

ISSN 1414-4522
Conselho Cientfico
Dr. Aluzio Borm - Gentica e Melhoramento Vegetal
Colaboraram nesta edio:
Dr. Henrique da Silva Castro - Sade;
Dr. Ivan Rud de Moraes - Sade - Toxicologia; Adriano Luiz Tonetti, Alessandra Pereira Fvero, Alexandre
Dr. Joo de Deus Medeiros - Embriologia Vegetal; Patto Kanegae, Ana Paula Pacheco Clemente, Anderson
Dr. Naftale Katz - Sade; Kurunczi Domingos, Antonio Costa de Oliveira, Bruno
Dr. Pedro Jurberg - Cincias; Coraucci Filho, Carla M. Y. Lemos, Celso Omoto, David
Dr. Srgio Costa Oliveira - Imunologia e Vacinas; John Bertioli, Eleni Gomes, Eliane Cristina Gruszka
Dr. Vasco Ariston de Carvalho Azevedo - Gentica de Microorganismos; Vendruscolo, Elza Fernandes de Arajo, Enio Luiz Pedrotti,
Dr. William Gerson Matias - Toxicologia Ambiental. Erica Fuchs, Everaldo Gonalves de Barros, Fbio Rueda
Faucz, Fernando Iraj Flix de Carvalho, Francismar Corra
Conselho Brasileiro de Fitossanidade - Cobrafi Marcelino, Gabrielle Mouco, Gaspar Malone, Glucia Maria
Dr. Lus Carlos Bhering Nasser - Fitopatologia Pastore, Helena Maria Wilhelm, Jorge Fernando Pereira,
Jos Fernandes Barbosa Neto, Juliana Oliveira Lima, Karina
Fundao Dalmo Catauli Giacometti Proite, Karla Thomas Kucek, Luiz Pereira Ramos, Maira
Dr. Eugen Silvano Gander - Engenharia Gentica; Jardim Bernardino, Marcio Antnio Silva Pimenta, Mrcio
Dr. Jos Manuel Cabral de Sousa Dias - Controle Biolgico; de Carvalho Moretzsohn, Mrcio Nitschke, Marcos Barros
Dra. Marisa de Goes - Recursos Genticos de Medeiros, Maria Fernanda Diniz, Maria Jos Arajo
Wanderley, Marisa Vieira de Queiroz, Marta Fonseca
Instituto de Pesquisas Energticas e Nucleares - IPEN Martins, Maurlio Alves Moreira, Melnia Lopes Cornlio,
Dr. Jos Roberto Rogero Monita Fiori de Abreu, Patrcia Messenberg Guimares,
Paulo Alves Wanderley, Paulo Dejalma Zimmer, Paulo
Sociedade Brasileira de Biotecnologia - SBBiotec Henrique Machniewicz, Pilar Ximena Lizarazo Medina,
Dr. Luiz Antonio Barreto de Castro - EMBRAPA Ricardo Antonio Polanczyk, Roberto da Silva, Rodrigo
Dr. Digenes Santiago Santos - UFRGS Barros Rocha, Ronaldo Stefanutti, Rubens Onofre Nodari,
Dr. Jos Luiz Lima Filho - UFPE Samuel Martinelli, Srgio Batista Alves, Soraya Cristina
Dra. Elba P. S. Bon - UFRJ Leal-Bertioli, Valdir Marcos Stefenon.

Entrevista
Nova tecnologia no combate ao mal da vaca louca 2

Pesquisa
Silenciamento Gnico e Transgnicos 8
Deteco de resduos de transgnicos em gros e produtos derivados 14
Bacillus thuringiensis no Manejo Integrado de Pragas 18
Biodiesel 28
Biofertilizantes Lquidos 38
Iniciativas Genmicas 45
Associao de mutaes nos genes BRCA1 e BRCA2 53
Biosurfatantes a partir de resduos agroindustriais 63
Controle de qualidade de ervas medicinais 68
Nitrato Redutase em Fungos Filamentosos 74
Glucoamilase:Estrutura e termoestabilizao 86
Marcadores Moleculares no Melhoramento Gentico de Araucria 95
Micropropagao de Macieira 100
Mtodo Alternativo de Tratamento de Esgotos 109
Amendoim Selvagem 116
Biotica 120
 Silenciamento Gnico
Pesquisa
e Transgnicos
Eliane Cristina Gruszka Vendruscolo
MSc, Melhoramento Gentico Vegetal.
Professora de Gentica/UFPR - Campus Palotina
vendruscolo.1@osu.edu;
egvendru@vn.com.br
8 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
Importncia, mecanismos e modelos do silenciamento gnico
Introduo
A estrutura genmica de plan-
tas pode ser alterada por transfor-
mao gentica durante o processo
de transferncia gnica utilizando-
se Agrobacterium tumefaciens, bio-
balstica e outras tcnicas que inte-
gram parte de um genoma (gene
exgeno) em um outro genoma (no
caso, vegetal). A transgenia tem sido
usada com o propsito de integrar
seqncias gnicas de interesse com
conseqente alterao da expresso
gnica. A expresso desse transgene
nem sempre pode ser predita. Desse
modo, o estudo das conseqncias
dessas transformaes tem-se torna-
do relevante nos ltimos anos
(VOINNET & BAULCOMBE, 1997;
WATERHOUSE et al., 1998;
VAUCHERET et al., 2001).
Vrios termos podem ser en-
contrados na literatura para descre-
ver o silenciamento gnico. Esses
incluem cossupresso, RNAi (RNA
de interferncia) e quelling (inter-
rupo da seqncia gnica) em
leveduras. A cossupresso seria o
termo aplicado ao silenciamento
gnico do gene endgeno pela ao
do RNA do transgene. Aqui ambos
os genes, exgeno e endgeno, so
coordenadamente suprimidos.
Quelling um termo de cossupres-
so usado em Neurospora crassa, e
o RNAi aplicado ao silenciamento
gnico em animais, quando esse
acontece pela ao de uma fita du-
pla de RNA, causando a no transcri-
o nem a traduo de determinado
gene(BAULCOMBE, 2002).
Em vrios experimentos, fo-
ram obtidas evidncias do silencia-
mento gnico em plantas, que leva-
ram concluso que, ao aumentar
o nmero de cpias de um gene de
interesse em particular, poderia re-
duzir a sua expresso (MAZTKE &
MAZTKE, 1995; DEPICKER & VAN
MONTAGU, 1997). WEI et al. (2001)
comentam sobre uma correlao
positiva entre o nmero de insertos
com pobre expresso gnica. Vri-
os transgenes inseridos podem ser
silenciados aps uma (relativamen-
te) longa fase de expresso e po-
dem, s vezes, silenciar a expres-
so (parcialmente) de genes hom-
logos localizados em posies
ectpicas no genoma (FAGARD &
VAUCHERET, 2000). Em alguns ca-
sos, o silenciamento gnico de
transgenes pode desencadear a re-
sistncia a vrus e, em outros casos,
a infeco viral pode silenciar a
expresso de genes endgenos nas
plantas (BAULCOMBE, 1996).
Mecanismos de
silenciamento gnico
O silenciamento gnico, como
processo, corresponde a uma intera-
o entre seqncias homlogas de
DNA ou RNA. At hoje, sabe-se que
o RNA est envolvido em 2 tipos de
silenciamento gnico dependente de
homologia (SGDH): 1) SGPTS (si-
lenciamento gnico ps-transcricio-
nal), onde a degradao de RNAs
homlogos no citoplasma levaria a
no traduo e 2) SGT (silenciamen-
to gnico transcricional), que est
relacionado com o bloqueio na trans-
crio induzido por um RNA anti-
senso derivado do prprio DNA,
que promoveria uma metilao na
regio promotora, a nvel nuclear, e
a homologia para a metilao dirigida
ocorreria nas regies transcritas
(WASSENEGGER, 2000; FAGARD &
VAUCHERET, 2000; VAUCHERET et
al., 2001).
Embora os genes que interagem
podem estar muito prximos no
mesmo cromossomo e iniciar a
inativao em cis, muitos sistemas
estudados envolvem a interao de
seqncias localizadas em diferen-
tes cromossomos ou a trans-
inativao. Ambos os tipos de SGDH
esto freqentemente associados
com metilaes de novo em se-
qncias-especficas do DNA nu-
clear (KOOTER et al., 1999;
WASSENEGGER, 2000).
O mecanismo de silenciamento
gnico transcricional (SGT) estaria as-
sociado a metilaes de novo na regio
do promotor do transgene, que pode-
riam ser meioticamente herdveis
(KOOTER et al., 1999). Essa metilao
seria induzida por pareamento de regi-
es homlogas de DNA ou ainda DNA-
RNA. Esse pareamento constitui o pas-
so inicial para a iniciao do SGPT
(WASSENEGGER & PLISSIER, 1998).
O pareamento induziria a uma
metilao dentro da regio codificante
do transgene, que levaria a uma pre-
matura interrupo de sua transcrio. sistir de mltiplas cpias do transgene
Como resultado dessa sntese irregular
de mRNA, um RNA aberrante (abRNA)
seria formado (WASSENEGGER &
PLISSIER, 1998; HAMILTON &
BAULCOMBE, 1999; MATZKE et al.,
2001).
Estudos recentes tm encontra-
do presena de um RNA de, aproxi-
madamente, 25 nt em sense e
antisense, com homologia ao RNA
alvo, em plantas que apresentam
cossupresso e resistncia a vrus,
mas que no so encontradas em
plantas usadas como controle. Tal
fato contribui para evidenciar que
existem diferentes formas de silenci-
amento, porm todas agindo num
mesmo mecanismo (HAMILTON &
BAULCOMBE, 1999).
A resistncia a vrus seria
explicada pelo fato de estes abRNA
serem o molde para que as RNA
polimerases dependentes de RNA
(RPdR) do hospedeiro (vegetal) pos-
sam sintetizar pequenas molculas
de RNA anti-sense (METTE et al.,
1999; MATZKE et al., 2001;
MLOTSHWA et al., 2002). Esses pe-
quenos RNA antisense agiriam em
trans, em seqncias de RNA com-
plementares (RNA viral), levando
formao de RNA fita dupla (dfRNA).
Um complexo de RNAses especfi-
cas para esses dfRNAs (conhecidas
como Complexo DICER ou RNAses
tipo III, especficas para as dfRNAs),
levariam a degradao dessas mol-
culas hbridas e, em conseqncia,
tornariam a planta resistente ao v-
rus (METZLAFF et al., 1997;
CERUTTI, 2003).
No caso das integraes mlti-
plas, como as cpias do transgene, o
silenciamento se iniciaria por um
pareamento no recproco entre o
transgene e o gene endgeno, ou
entre os transgenes e, como conse-
qncia desse pareamento, o locus
receptor seria metilado, levando a
uma terminao prematura da trans-
crio (ENGLISH & BAULCOMBE,
1996; WASSENEGGER, 2000).
A posio de integrao do
transgene tambm parece ser impor-
tante para o silenciamento pelo fato
de o loci silenciador usualmente con-
muito prximos ao telmero sugere
ligadas. Outro modelo que explica o
silenciamento de transgenes em c-
pias mltiplas e invertidas a forma-
o de um RNA em ala (alRNA),
que, posteriormente, se transforma-
ria em dfRNA pela ao de RNA
nucleases causando o efeito do silen-
ciamento conforme foi descrito aci-
ma (WATERHOUSE et al., 2001). De
modo similar, o dfRNA poderia tam-
bm ser usado como molde para
algumas RNA polimerases que trans-
creveriam molculas de RNA anti-
senso, homlogos aos mRNAs, for-
mando os dfRNAs e continuando o
ciclo de silenciamento por induo
do SGT e SGPT (KOOTER et al.,
1999; FAGARD & VAUCHERET,
2000).
Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
Modelos para explicar o
silenciamento gnico
Vrios autores tm sugerido
modelos para os mecanismos mole-
culares envolvidos no silenciamen-
to gnico, que no so eventos mu-
tuamente exclusivos, mas que po-
dem ser usados individualmente ou
em conjunto para explicar o silenci-
amento gnico.
1. Silenciamento mediado
pelo pareamento DNA-DNA
Esse modelo tem sido proposto
para explicar certos tipos de cossu-
pressso (JORGENSEN, 1990; MEYER
& SAEDLER, 1996); a trans-inativao
(MATZKE & MATZKE; 1990;
CHANDLER & VAUCHERET, 2001) e
a paramutao (MEYER et al., 1993;
CHANDLER & VAUCHERET, 2001).
O pareamento de regies hom-
logas do DNA, devido interao
entre duas seqncias homlogas
numa interfase da meiose, levaria
formao de estruturas em alas, que
seria o precursor da difuso de
metilaes no DNA, induzindo o SGT
(ENGLISH & BAULCOMBE, 1996).
Os transgenes diferem muito em
sua capacidade de trans-inativar cpi-
as homlogas, o que parece estar asso-
ciado capacidade de procurar outras
posies cromossomais com homolo-
gia. A presena de genes silenciadores
que regies telomricas so stios favo-
rveis para a interao com seqncias
homlogas (MEYER & SAEDLER, 2001).
2. Degradao de RNA em
excesso
Em transgnicos, comum o
uso de promotores fortes para se
conseguir a alta expresso do
transgene. Como conseqncia, para
a deteco de planta com o inserto,
so esperados nveis altos do mRNA
do transgene. Nesse modelo, os
abRNA seriam produzidos devido a
uma alta taxa de transcrio do DNA,
com isso, os altos nveis de mRNA. Se
essa taxa de mRNA exceder a taxa de
traduo, pode ocorrer, alm da de-
9
 gradao parcial desses mRNA, a
terminao abrupta da transcrio, o
processamento irregular, originando
abRNAs e induzindo ao SGPT
(WASSENEGGER & PLISSIER, 1998).
Outrossim, o excesso de produ-
o de uma determinada protena pode
transmitir um sinal para a maquinaria
de traduo a fim de induzir a termi-
nao de sua prpria transcrio. As
protenas em excesso seriam marcadas
por ubiquitinas, por fosforilao ou
por outras modificaes ps-transcri-
cionais (HOCHSTRASSER, 1996;
WASSENEGGER & PLISSIER, 1998).
3. Hbridos DNA-RNA
A observao de que o parea-
mento DNA-RNA pode induzir pa-
dres de metilao sugere mudanas
no estado epigentico caracterizado
por um estado especfico de metilao
do DNA ou da estrutura da cromatina,
durante o perodo pr-meitico ou
de hibridizao somtica (MEYER &
SAEDLER, 2001). Estudos indicaram
que fragmentos de RNA poderiam
induzir uma hipermetilao em se-
qncias homlogas (pareamento
DNA -RNA), causando as mudanas
epigenticas. Tal fenmeno foi com-
provado em estudos com plantas
transgnicas que continham o cDNA
dos viriides do PSTV da batata. A
metilao no genoma do viride foi
observada mesmo sem que a
replicao do seu RNA tivesse ocor-
rido (WASSENEGGER et al., 1994;
WASSENEGGER, 2000).
Os transcritos poderiam induzir
a metilao em regies homlogas
de DNA, que seria comum em trans-
formantes, os quais acumulariam
grandes concentraes dos transcri-
tos no ncleo, devido s altas taxas
de traduo e do processamento irre-
gular desses RNAs. Como conseq-
ncia dessa marcao, a protena e
seus produtos, aps degradao, po-
deriam reconhecer seqncias ho-
mlogas surgindo nos ribossomos, e
levando ao trmino prematuro da
transcrio, alm de uma deadenila-
o na posio 3 e, com isso, ao
surgimento dos abRNAs e a induo
do SGPT (JONES et al., 1999).
10 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
4. Modelo mediado por
RNA antisenso
O RNA antisenso parece ser
fundamental nos mecanismos de
cossupresso. As fitas duplas de RNA
seriam alvos gerados pelos promo-
tores presentes no DNA do transgene
e pela ao de RNA polimerases
dependente de RNA ( RPdR)
(LINDBO et al., 1993).
WASSENEGGER & PLISSIER
(1998) ainda propem que esse RNA
poderia surgir devido posio da
seqncia de DNA produtora do
RNA antisenso, prximo a um pro-
motor localizado adjacente a uma
cpia de T-DNA integrado e em
anti-senso .
A produo de RNA antisenso
pelas RPdR dependeria de nveis
especficos do RNA senso e do
acmulo de intermedirios de RNA
(durante o processamento ou trans-
porte). Essa hiptese se baseia no
fato de que as RPdR reconheceriam
os transcritos aberrantes, que seri-
am derivados de transcrio, trans-
porte ou traduo incorreta do
transgene. A produo de abRNA
poderia induzir as mudanas
epigenticas do gene que influenci-
aria o seu processamento (MEYER &
SAEDLER, 1996; WASSENEGGER,
2000).
Certos transgenes somente po-
dem silenciar ou cossuprimir seqn-
cias caso contenham um final 3
homlogo, enquanto certos transgenes
com regies 5 homlogas no so
afetadas (ENGLISH et al., 1996). Essas
observaes sugerem que os transcri-
tos antisenso so feitos preferencial-
mente nas regies 3 do transgene
(WASSENEGGER & PLISSIER, 1998).
O papel da metilao e da
estrutura da cromatina no
silenciamento gnico
Em recentes estudos sobre si-
lenciamento em plantas, a ocorrn-
cia de pareamento entre seqncias
homlogas parece ser condio im-
portante para o silenciamento
(BAULCOMBE & ENGLISH, 1996;
VOINNET et al., 1998). O silencia-
mento em trans seria quando uma
regio metilada teria homologia com
a regio promotora de um determi-
nado gene, dirigindo uma metilao
de novo nessa regio, para induzir o
SGT. Tal fenmeno conhecido
como metilao do DNA dirigida
por DNA (MDdD)(JONES et al., 1999;
METTE et al., 1999; WASSENEGGER,
2000).
Muitos genes eucariticos e ele-
mentos transponveis exibem uma
forte correlao inversa entre den-
sidade de metilao do DNA e ati-
vidade transcricional ou transposi-
cional. Ao certo, no se sabe se a
ao da metilao da citosina alte-
raria a estrutura da cromatina, mas
estudos em plantas demonstram
uma correlao positiva entre o
nmero de cpias do transgene, o
aumento da metilao e a diminui-
o da atividade transcricional
(KUMPATLA et al.,1997).
Em eucariontes, os resduos de
citosina do DNA genmico podem
ser metilados na posio 5da citidina.
As enzimas das DNA metiltransferases
que realizam essa reao tm prefe-
rncias por grupos CpG ou CpNpG.
Em ambos os casos, o DNA recente-
mente replicado, que contm grupos
CpG ou CpNpG hemimetilados, so
fortes substratos para a ao das
DNA metiltransferases. Tal padro
asseguraria as metilaes de manu-
teno e de padres de metilao
pr-existentes nos cromossomos fi-
lhos (ATHERLY et al.,1999).
Em transgenes, esse padro de
metilao no igual. As metilaes
localizadas em resduos de citosina
no esto localizadas em seqnci-
as CpG ou CpNpGp. Os fatores que
especificam esse padro de metilao
no simtrico so ainda uma incg-
nita, mas parece que a metilao do
DNA dirigida por um RNA. No se
sabe se esse RNA seria o sinal em
todos os casos da metilao no
simtrica das citosinas em plantas
(FINNEGAN et al., 1998). Alguns
autores denominam esse fenmeno
de metilao do DNA dirigida por
RNA (MDdR)(WASSENEGGER, 2000;
BAULCOMBE, 2002). Esse padro
tambm no parece ser conservado
durante a meiose, em contraste com
o padro de metilao simtrica
(PARK et al., 1996; LUFF et al.,
1999).
Estudos tm demonstrado que
a metilao do DNA e a estrutura da
cromatina tm um importante papel
no SGT e SGPT. Nessa forma de
silenciamento, a regio promotora
e, s vezes, a regio codificante dos
transgenes silenciados apresentam-
se densamente metilados (KOOTER
et al., 1999). Plantas mutantes para
o gene da protena DDM1, que re-
modela a cromatina, no apresenta-
ram o silenciamento gnico. Isso
indica um possvel papel da
metilao do DNA e da estrutura da
cromatina no estabelecimento e na
manuteno de SGPT. Supe-se que
o aumento da metilao leve
heterocromatizao do DNA e, com
isso, ao difcil acesso s RNA
polimerases, diminuindo a ao
transcricional (YE et al., 1996;
WASSENEGGER & PLISSIER, 1998;
WASSENEGGER et al., 2000).
Embora os modelos atuais pro-
ponham que a produo de um
RNA aberrante, fruto de uma
metilao, seja o causador de uma
finalizao prematura da transcri-
o do mRNA, existem estudos com
linhagens defeituosas de N. crassa
para o gene da metilase da citosina
(dim2) que exibiram a mesma capa-
cidade de silenciamento que a li-
nhagem controle (dim +) (COGONI
& MACINO, 1999). Fato semelhante
foi observado em estudos realiza-
dos com plantas transgnicas de
fumo, onde o gene nptII (neomicina
fosfotransferase) metilado teve a
transcrio e o SGPT normais quan-
do comparado com uma cpia do
gene nptII no metilado e no si-
lenciado (VAN HOUDT et al., 1997).
Tais fatos indicam que a metilao
no parece ser condio sine qua
non para a induo e a manuteno
do SGPT (PARK et al., 1996).
Razes para a ocorrncia do
silenciamento gnico
Diversos autores tm levantado
o papel do silenciamento gnico . O
silenciamento gnico parece estar
envolvido com a defesa a cidos
nuclicos estranhos (COVEY, 2000;
JORGENSEN, 1995; MOURAIN et al.,
2000), com a proteo do genoma
contra a insero de elementos
transponveis (KETTING et al., 1999;
BAULCOMBE, 2002) e com a
regulao da expresso gnica de
famlias de multigenes ou ainda
genes duplicados em plantas
(TANZER et al., 1997; CHANDLER &
VAUCHERET, 2001).
Uma outra questo poderia ser
levantada, se seqncias homlogas
de DNA podem parear e se tornar
silenciadas, como ento explicar que
membros de famlias de genes pode-
riam escapar da inativao? MATZKE
& MATZKE (1995) propem a exis-
tncia de duas maneiras de prevenir
esse pareamento: ou pela divergn-
cia de seqncias encontradas em
alelos (heterozigosidade) ou devido
reduo do comprimento de se-
qncias homlogas, o que sugere
um papel muito importante para os
ntrons, que dividiriam a regio
codificante da protena em segmen-
tos pequenos demais para realizar
um pareamento efetivo.
Parece bastante unnime en-
tre vrios autores que o silencia-
mento gnico tem como funo
principal prevenir a superexpres-
so gnica, controlando o nmero
de cpias de determinado gene ou
ainda ser um mecanismo de defesa
contra a superexpresso de
transgenes (WASSENEGGER &
PLISSIER, 1998; KOOTER et al.,
1999; WASSENEGGER, 2000).
Difuso e amplificao do
silenciamento gnico
Um dos mais importantes aspec-
tos do silenciamento gnico que
este um mecanismo autmato, isto
, pode ser induzido localmente e
pode se espalhar para distantes locais
no organismo (VOINNET et al., 1998;
COVEY, 2000). Esse transporte
sistmico do sinal de silenciamento
parece relacionar-se com um sinal
mvel, no metablico, ainda no
completamente identificado. Esse si-
Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
nal, sendo parte integral do processo
de silenciamento, parece interagir com
protenas de membranas, movendo-
se de clula em clula atravs do
floema (plasmodesmata), assemelhan-
do-se com o padro de infeco de
vrus nas plantas (PALAUQUI et al.,
1997; VOINNET & BAULCOMBE, 1997;
VOINNET et al., 1998; MLOTSHWA
et al., 2002).
O SGPT teria trs fases: incio,
manuteno e difuso propriamen-
te dita. Os transgenes, os vrus e at
mesmo o DNA exgeno (proveni-
ente da transformao) poderiam
iniciar o SGPT. Alguns autores su-
gerem que esse sinal seja na forma
de RNA, mas no conhecido ainda
qual o tipo de RNA que estaria
envolvido: se abRNA, dfRNA ou
ainda o asRNA (METTE et al., 1999;
KOOTER et al., 1999; MATZKE et
al., 2001; MLOSTHWA et al., 2001).
Esse conceito de difuso clula-
clula e de transporte a longas dis-
tncias no pode ser descartado,
visto que o vrus tem seu genoma
composto por RNA e esse RNA di-
funde-se para dentro da planta, po-
dendo se mover de clula-clula
atravs de protenas codificadas pelo
seu prprio genoma (WATERHOUSE
et al., 2001).
Ainda no est completamente
elucidado como o sinal para o silen-
ciamento pode se espalhar sistemi-
camente pela planta e ainda ter seus
efeitos amplificados. O silenciamen-
to parece ser um mecanismo de pre-
veno, como a vacina para os
humanos. Parece sensato estabele-
cer que o silenciamento nada mais
que uma mensagem enviada pelas
clulas j infectadas pelo vrus para
aquelas que ainda no o foram, mas
que estejam na iminncia de o ser,
para que essas preparem suas defe-
sas contra o agente invasor. Se esse
sinal contiver fragmentos da seqn-
cia viral, as clulas receptoras pode-
riam estar preparadas para degradar
qualquer RNA que contivesse essas
seqncias, mesmo antes de o vrus
chegar (RATCLIFF et al., 1997;
WATERHOUSE et al., 2001).
Esse modelo poderia explicar al-
gumas observaes:1) de que plantas
11
 transgnicas com transgenes deriva-
dos de vrus podem apresentar uma
recuperao, isto , apresentar os sin-
tomas da infeco inicial do vrus,
seguida de crescimento sem os sinto-
mas e de resistncia ao vrus. 2) plan-
tas transgnicas apresentando cossu-
presso tendem, inicialmente, a apre-
sentar atividade do transgene, mas
um silenciamento progressivo em te-
cidos em crescimento (WATERHOUSE
et al., 2001).
Consideraes finais
Na ltima dcada, o estudo do
silenciamento gnico cresceu consi-
deravelmente. J existem evidnci-
as de que caractersticas especficas
do DNA, como a metilao e a estru-
tura da cromatina, so importantes
para o fenmeno do silenciamento.
Todavia, o seu mecanismo molecu-
lar ainda no foi totalmente
elucidado, mas, em razo de obser-
vaes funcionais dos RNA anti-sen-
so, abRNA, dfRNA, RNA polimerases
e RNA nucleases, os estudiosos des-
se assunto puderam elaborar mode-
los para os mecanismos de SGDH ,
o SGT e SGPT.
notria a existncia de algu-
mas dificuldades para o estudo do
silenciamento gnico em plantas
transgnicas. Variaes entre as li-
nhas de plantas transgnicas consti-
tuem uma grande barreira para o
completo estudo desses mecanismos.
Duas linhas transgnicas no so
similares pelo fato de o transgene em
cada planta se situar em diferente
domnio no cromossomo, em dife-
rente arranjo e tambm devido
associao com diferentes quantida-
des de DNA do vetor de transforma-
o (IGLESIAS et al., 1997; STAM et
al., 1997).
Apesar das dificuldades, vislum-
bram-se para essa rea da cincia
grandes e importantes descobertas: o
completo entendimento da regulao
gnica, a identificao dos fatores
que podem afetar a expresso gnica
e dos transgenes (talvez se discuta no
futuro algumas propriedades dessa
tecnologia) e, ainda mais, a compre-
enso dos mecanismos evolutivos.
12 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
Agradecimentos
Aos pesquisadores Ivan
Schuster (Coodetec) e Maria Jlia
Corazza Nunes (UEM/PR) pelas
correes e sugestes dadas. Agra-
deo a Deus por tudo.
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13
 Deteco de resduos de
transgnicos em gros e
Pesquisa
produtos derivados
A experincia da Universidade Federal de Viosa

Francismar Corra Marcelino
Mestre em Gentica Molecular, Laboratrio
de Anlises Genticas - AgroGentica
eg34680@vicosa.ufv.br
Marta Fonseca Martins
Doutora em Gentica Molecular, Laboratrio
de Anlises Genticas - AgroGentica
mmartins@tdnet.com.br
Marcio Antonio Silva Pimenta
Doutor em Gentica Molecular,
Universidade Federal de Viosa
marciopimenta@vicosa.ufv.br
Maurilio Alves Moreira
PhD, Bioqumica & Gentica de Plantas,
Universidade Federal de Viosa
moreira@ufv.br
Everaldo Gonalves de Barros
PhD, Biologia Molecular de Plantas,
Universidade Federal de Viosa
ebarros@ufv.br
Ilustraes cedidas pelos autores
Mais de 58 milhes de hectares so
cultivados atualmente no mundo com
espcies transgnicas, sendo a soja, o
milho, o algodo e a canola, as principais
delas. Os pases com as maiores reas
cultivadas com transgnicos so, nesta
ordem, os Estados Unidos, a Argentina, o
Canad e a China. Estes pases respondem
por cerca de 99% da rea total plantada
com cultivos transgnicos. O cultivo de
plantas geneticamente modificadas vem
crescendo rapidamente em vrios pases,
inclusive no Brasil, onde no ms de
setembro foi aprovado, embora com res-
tries, o plantio de soja transgnica para
o ano agrcola 2003/2004 (Medida Provi-
sria 131, de 25 de setembro de 2003).
A demanda por anlises da presen-
a de resduos de transgnicos em mat-
rias-primas e em alimentos tem aumenta-
do significativamente no Brasil, nos lti-
mos dois anos, principalmente aps a
comprovao do cultivo ilegal da soja
transgnica, resistente ao herbicida
glifosato, destacadamente no estado do
Rio Grande do Sul, com sementes prove-
nientes da Argentina. A maior parte das
anlises tem sido demandada por em-
presas exportadoras de gros de soja e de
produtos derivados. Esses produtos so
exportados, na maioria, para a Europa,
Japo e Coria. J antevendo esse cen-
rio, a Universidade Federal de Viosa
(UFV), por intermdio do Instituto de
Biotecnologia (BIOAGRO), desenvolveu
e otimizou metodologias baseadas na
tcnica de PCR (Polymerase Chain
Reaction) para determinar a presena e
quantificar resduos de transgnicos em
amostras de DNA extradas de gros,
bem como de seus produtos derivados.
Recentemente, a AgroGentica, labora-
trio incubado na Incubadora de Empre-
sas de Base Tecnolgica da UFV, foi
credenciado junto ao Ministrio da Agri-
cultura, Pecuria e Abastecimento (MAPA)
- Portaria N 27, de 15 de maio de 2003,
para a deteco de modificao genti-
ca em produtos de origem vegetal.
As modificaes genticas intro-
duzidas que derivam os organismos
geneticamente modificados (OGMs)
podem ser produzidas por pelo me-
nos trs metodologias:

Figura 1 - Representao da construo presente na soja RR (Roundup Ready).

Regio promotora 35S do vrus do mosaico da couve flor, peptdeo de trnsito de
Petnia, gene que codifica a protena EPSPS, que confere a resistncia ao herbicida,
e o terminador do gene da nopalina sintase (NOS).

14 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003

 - tcnicas do DNA recombinante,
utilizando vetores para transforma-
o de plantas;
- tcnicas envolvendo a introduo
direta do material gentico no
organismo;
- fuso celular por mtodos no
naturais.

A construo gentica utilizada para

produzir OGMs consiste de trs elemen-
tos bsicos: o promotor, que controla a
expresso do transgene no organismo;
a regio codificadora, que codifica a
protena de interesse; e a regio
terminadora, que determina o final do
processo de transcrio do gene. Alm
disso, pode ser usado um gene marcador
que serve para selecionar as clulas que,
de fato, foram transformadas. A soja
resistente ao herbicida glifosato, por
exemplo, tem como regio reguladora o
promotor 35S do vrus do mosaico da
couve flor (CaMV); como regio
codificadora, o gene para a protena
EPSPS de Agrobacterium tumefasciens,
que confere a resistncia ao herbicida, e
como regio terminadora, o terminador
do gene da nopalina sintase (NOS),
tambm de Agrobacterium (Figura 1).
A identificao de alimentos geneti-
camente modificados pode ser feita facil-
mente com o auxlio de tcnicas de
Figura 2 - Anlise qualitativa de OGM em amostras de gros de soja. O DNA das amostras foi
extrado pelo mtodo Wizard e amplificado com primers especficos que anelam ou no gene
biologia molecular. OGMs podem ser
da lectina (controle A e B), ou na regio do promotor 35S do CaMV (C e D), ou na regio identificados pela deteco direta do DNA
terminadora NOS (E e F), ou na regio codificadora do gene EPSPS (G e H). Aps a reao de exgeno nele contido, do mRNA corres-
PCR, os produtos amplificados foram separados em gis de agarose. esquerda (A, C, E e G) pondente produzido, da protena resul-
est exemplificado um resultado negativo e direita (B, D, F e H), um resultado positivo. Os
smbolos nas canaletas representam: (), reao de PCR sem DNA (controle); N, soja normal tante ou, ainda, pela caracterstica intro-
(controle); T, soja transgnica (controle); 1, 2 e 3, referem-se a amostras de gros de soja. As duzida. Os principais mtodos analticos
setas indicam as bandas de DNA de interesse. de deteco utilizam a tcnica da reao
em Cadeia da DNA Polimerase (PCR) para
detectar o DNA exgeno, ou mtodos
imunolgicos, como o ELISA, para detec-
tar a protena. O mtodo analtico escolhi-
do deve ser sensvel, confivel,
reprodutvel, minimizando, assim, falsos
positivos e falsos negativos.
Em nosso laboratrio a deteco e
quantificao de resduos de OGMs em
gros, ingredientes e produtos derivados
feita pela tcnica de PCR. Para tal,
necessria a extrao de DNA das amos-
tras e amplificao do fragmento de inte-
resse. Para ser amplificado, o DNA purifi-
cado deve apresentar boa qualidade. Alm
disso, como controle, um gene normal-
mente presente no organismo, amplifi-
cado em uma reao paralela. Para pro-
Figura 3 - Curva de amplificao de uma anlise quantitativa em PCR de tempo real. A dutos que contenham soja na sua compo-
determinao da porcentagem de resduos de OGM baseada na comparao da curva de
amplificao da amostra analisada com as curvas de amplificao de padres certificados sio utilizado o gene da lectina. Para
contendo quantidades conhecidas de OGMs. produtos base de milho, utilizado o

Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003 15

 gene da delta zena. Quando se quer
detectar a presena de OGM em uma
amostra de salsicha, por exemplo, ampli-
fica-se como controle o gene da lectina,
uma vez que a salsicha geralmente con-
tm pelo menos 2% de protena de soja na
sua composio.
O nosso laboratrio procura utili-
zar mtodos validados internacional-
mente nas suas anlises. Para a extrao
de DNA das amostras utilizada a
Figura 4 - Percentual dos diferentes produtos analisados para a deteco de OGMs em 2000. metodologia Wizard, mtodo j valida-
do pela Comunidade Econmica Euro-
pia. O transgene, ou seja, o segmento
de DNA que foi introduzido na planta,
amplificado com primers especficos.
Para a deteco do gene RR (Roundup
Ready) so utilizados primers que se
ligam ou regio do promotor 35S do
CaMV, ou regio codificadora, ou ao
terminador NOS. Aps a reao de PCR
os produtos amplificados so separados
em gis de agarose. Para as anlises
quantitativas, o DNA das amostras
extrado pela metodologia PrepMan-
Ultra e a anlise baseada no mtodo
TaqMan, que utiliza a tcnica de PCR
em Tempo Real, para amplificar a se-
Figura 5 - Percentual dos diferentes produtos analisados para a deteco de OGMs em 2001.
qncia de DNA do promotor 35S, o
qual est presente na maioria dos OGMs
comercializados at o momento. O pro-
cedimento extremamente preciso de-
vido perfeita complementaridade en-
tre os primers usados na reao de PCR,
a sonda TaqMan e as seqncias alvo
de DNA que esto sendo amplificadas.
A fluorescncia liberada durante a rea-
o lida pelo sistema de deteco ABI
PRISM 7000 e os dados gerados so
analisados eletronicamente. Como a
metodologia bastante sensvel, pode-
se detectar, numa dada amostra, uma
contaminao da ordem de 0,01%. No
entanto, devido ao limite de recupera-
Figura 6 - Percentual dos diferentes produtos analisados para a deteco de OGMs em 2002 o do DNA durante o processo de
extrao e tambm aos erros inerentes
ao processo de amostragem, temos tra-
balhado com um nvel de deteco e
quantificao da ordem de 0,1%. Isto ,
uma amostra contendo 0,1% de transg-
nicos classificada como positiva na
nossa anlise, tendo como referncia
um padro certificado. Amostras com
uma contaminao menor que 0,1% so
classificadas como negativas. A Figura 2
mostra os possveis resultados obtidos
em uma anlise qualitativa, enquanto
que na Figura 3 pode ser visualizada
uma curva de amplificao numa anli-
se quantitativa em tempo real. A
Figura 7 - Percentual dos diferentes produtos analisados para a deteco de OGMs em 2003. quantificao de uma determinada amos-

16 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003

tra feita com base na comparao da mente, temos recebido amostras de con- tras desde o ano de 2000. Ao longo dos
sua curva de amplificao com as de dimentos e temperos, leos, amido de anos que temos realizado anlises de
padres certificados contendo quanti- milho, sopas, fub, entre outras. A partir OGM em gros e diferentes tipos de
dades conhecidas de OGMs. de 2001 foram feitas as primeiras anli- alimentos, pudemos observar um au-
Desde o ano de 2000, o laboratrio ses de produtos crneos. A partir de mento gradual no nmero de amostras
vem realizando a deteco de OGMs em 2002 houve um aumento expressivo no positivas, demonstrando que embora
gros e em produtos derivados. Inicial- nmero de anlises para esse tipo de seja proibido o plantio e a comercializa-
mente a demanda era concentrada em produto. Naquele ano, 12,3% do total de o de OGM no pas, estes de alguma
amostras de gros de soja e milho e em amostras analisadas foram de produtos forma esto presentes no mercado, pelo
diferentes tipos de preparaes de pro- crneos. At setembro de 2003 a porcen- menos, desde o ano de 2000. Naquele
tenas de soja. Com o passar dos anos, tagem foi de 7,3%. ano apenas 5% das amostras analisadas
observamos um aumento na demanda As Figuras 4, 5, 6 e 7 mostram a foram positivas para a presena de
pelas anlises bem como uma diversifi- porcentagem de cada classe de produto resduos de OGM. Em 2001, esse
cao das amostras enviadas. Atual- analisado em relao ao total de amos- percentual subiu para 11,5%. Em 2002,
para 28,5%, e at setembro de 2003,
32,3% das amostras apresentaram resul-
tado positivo. A Figura 8 representa de
forma grfica estes resultados.
A porcentagem de amostras positi-
vas dentro de cada classe de produtos
tambm sofreu elevao, principalmente
no caso de gros de soja, farelo de soja e
rao. A porcentagem de amostras de
gros de soja positivas para a presena de
OGM em 2000 foi de 3,89 % com relao
ao total de amostras analisadas. Com
relao apenas s amostras de gros
analisadas, esse percentual foi de 12,96%,
atingindo 35,42%, 31,69% e 64,20%, res-
pectivamente, em 2001, 2002 e 2003. As
amostras de farelo OGM subiram de
1,11% do total de amostras analisadas,
em 2000, para 8,33% em 2003, enquanto
as de rao eram 1,82% em 2001 e 2,3%
Figura 8 - Percentual de amostras positivas para a presena de resduos de OGMs com em 2003. A porcentagem de amostras de
relao ao nmero total de amostras analisadas, entre os anos de 2000 e 2003. produtos crneos contendo resduos de
OGM foi de 7,93% do total de amostras
Qu ad ro 1 - P o rcen tagem d e amo stras po sitivas d en tro d e cad a classe d e amo stras e co m relao ao to tal analisadas e 63,04% com relao ao total
d e amo stras an alisad as
% de % de % de % de % de % de % de % de
de amostras dessa classe de produtos em
amo stras amo stras amo stras amo stras amo stras amo stras amo stras amo stras 2002. Em 2003, esses valores foram de
T ipo d e
po sitivas po sitivas po sitivas po sitivas po sitivas po sitivas po sitivas po sitivas 5,32% e 73,17%, respectivamente. Com
pelo to tal d en tro pelo to tal d en tro pelo to tal d en tro pelo to tal d en tro
A mo stra
de d a classe de d a classe de d a classe de d a classe
relao s amostras de milho e derivados
amo stras an alisad a amo stras an alisad a amo stras an alisad a amo stras an alisad a apenas em 2003 comeamos a detectar
em 2000 em 2000 em 2001 em 2001 em 2002 em 2002 em 2003 em 2003 algumas amostras positivas, o que reflete
So ja gro 3,89 12,96 7,74 35,42 6,16 31,69 9,22 64,20
Diferen tes a presena de outros cultivos transgni-
tipo s d e
0,00 0,0020 0,00 0,00 0,96 3,91 2,13 7,41 cos, que no a soja RR, no mercado
pro ten as
d e so ja
mundial. O Quadro 1 mostra a porcenta-
Farelo d e gem de amostras positivas em relao ao
1,11 11,76 1,37 14,64 7,93 54,72 8,33 54,49
so ja nmero total de amostras analisadas e
P ro d u to s
crn eo s
0,00 0,00 0,00 0,00 7,93 63,04 5,32 73,17 dentro de cada classe de amostras.
Milh o gro 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,06 13,04 Os nossos dados permitem concluir
R ao 0,00 0,00 1,82 21,62 3,56 49,06 2,30 35,14 que no perodo de 2000 a 2003 houve um
Hid ro lisad o
d e so ja
0,00 0,00 0,23 4,76 0,00 0,00 0,18 25,00 aumento gradual da presena de resduos
So pas 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 de transgnicos em gros, ingredientes e
Fu b d e
milh o
0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,18 14,29 alimentos derivados no pas, especialmen-
C o n d imen - te com relao soja. Os dados apontam
to s e 0,00 0,00 0,00 0,00 0,55 36,36 1,42 61,54 tambm para a necessidade de definio
tempero s
Lecitin a d e
de normas claras de rotulagem de alimen-
0,00 0,00 0,00 0,00 0,82 75,00 0,00 0,00
so ja tos. Para esse fim, importante que se
leo s e
0,00 0,00 0,00 0,00 0,27 40,00 0,00 0,00 disponham de laboratrios qualificados
go rd u ras
Ou tro s 0,00 0,00 0,23 2,22 0,27 5,88 2,30 37,14 para realizar esse tipo de anlise.

Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003 17

 Bacillus thuringiensis
Pesquisa no Manejo Integrado de Pragas
Ricardo Antonio. Polanczyk
Engenheiro Agrnomo, Doutorando Programa de
Ps Graduao em Entomologia (Escola Superior de
Agricultura Luiz de Queiroz, ESALQ -USP).
rapolanc@esalq.usp.br
Samuel Martinelli
Engenheiro Agrnomo, Doutorando Programa de
Ps Graduao em Entomologia (Escola Superior de
Agricultura Luiz de Queiroz, ESALQ -USP).
smartine@esalq.usp.br
Celso Omoto
Engenheiro Agrnomo, Prof. Dr. Depto
Entomologia, Fitopatologia e Zoologia Agrcola
(ESALQ-USP).
celomoto@esalq.usp.br
Srgio Batista Alves
Engenheiro Agrnomo, Prof. Dr. Depto
Entomologia, Fitopatologia e Zoologia Agrcola
(ESALQ-USP).
sebalves@esalq.usp.br
Ilustraes cedidas pelos autores
18 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
Do uso convencional em Pulverizao Biotecnologia
1. Introduo
A explorao agrcola intensi-
va, necessria para atender cres-
cente demanda interna por alimen-
tos, aumento do volume de expor-
taes agrcolas e necessidade por ingesto, solubilizao e ativao
produtos como fibras, tem como
fator limitante o impacto negativo
nos ecossistemas. De acordo com
Tilman et al. (2001), diante da con-
tinuidade dos impactos ambientais
globais provocados pela agricultu-
ra, 109 hectares de ecossistemas na-
turais sero convertidos em siste-
mas agrcolas at o ano de 2050. Do
mesmo modo, os agroqumicos, uti-
lizados para o controle de pragas
agrcolas so muitas vezes respon-
sveis por contaminaes do meio
ambiente e intoxicaes de produ-
tores rurais. Portanto, importante
o desenvolvimento e implementa-
o de tticas de controle de pragas
menos agressivas, que estejam de
acordo com as premissas do Mane-
jo Integrado de Pragas, e que, ao
mesmo tempo, proporcionem o re-
torno econmico ao agricultor.
Neste sentido, o controle biol-
gico uma importante estratgia
que, atravs da liberao, incremen-
to e conservao de insetos parasi-
tides, predadores e microrganis-
mos, impede que os insetos-praga
atinjam nveis populacionais capa-
zes de causar dano econmico. Indi-
retamente, diminui o impacto dos
agroqumicos sobre o meio ambien-
te, pois minimiza ou torna desneces-
srio o seu uso. Entre os microrga-
nismos com potencial para serem
empregados no controle biolgico
destaca-se o entomopatgeno
Bacillus thuringiensis (Bt). Esta bac-
tria capaz de produzir incluses
cristalinas durante a esporulao,
que so responsveis pela sua ativi-
dade txica. As suas toxinas, aps a
no intestino do inseto, unem-se s
clulas do epitlio, formando poros
e desestabilizando os gradientes
osmtico e inico, fazendo com que
este cesse a alimentao, morrendo
por inanio ou septicemia (Priest,
2000; Glare & OCallagham, 2000).
Para que a patologia de Bt ocorra
necessrio que o intestino do inseto
permita a eficiente solubilizao do
cristal e que proteases ativem as
protoxinas resultantes desta solubi-
lizao. Estas etapas so essenciais
para que a toxina passe pela mem-
brana peritrfica e se ligue aos re-
ceptores presentes na parede do
intestino mdio do inseto. Em fun-
o da variabilidade gentica, entre
os insetos h diferenas especficas
e no especficas com relao
especificidade dos receptores das
toxinas de Bt. A especificidade do
receptor assume papel vital na defe-
sa do organismo contra esta ao
inseticida, juntamente com a solubi-
lizao do cristal e ativao da toxi-
na. A ausncia de necessidade de
solubilizar o cristal e ativar as toxi-
nas produzidas pelas plantas trans-
gnicas pode influenciar a suscetibi-
lidade dos organismos-alvos e no-
alvos de controle. A morte do inseto,
no caso de produtos base de Bt
uma interao da ao da toxina e
dos esporos; o primeiro fator leva
formao de poros no tecido epitelial,
causando desiquilbrio osmtico e
inico e a segundo causa septicemia
devido germinao dos esporos,
proporcionada pela reduo do pH
intestinal devido ao das toxinas.
No caso de plantas-Bt, a causa da
morte somente a toxina.
As primeiras tentativas de utili-
zao de Bt no controle de pragas
foram feitas na Europa durante a
dcada de 30. Devido aos xitos
iniciais, a produo deste patgeno
comeou na Frana em 1938. Nos
EUA, o interesse por este patgeno
aumentou aps 1950, principalmen-
te para o controle de lepidpteros
(Lambert & Peferoen, 1992; Beegle &
Yamamoto, 1992).
Deve-se salientar que a presso
da opinio pblica quanto sade
humana e preservao do meio ambi-
ente incentivou a utilizao de produ-
tos microbianos, principalmente em
hortalias e frutferas com alto valor
comercial. Em 1970 foi lanado no
mercado o Dipel (Bt kurstaki) que
provou ser 20 a 200 vezes mais poten-
te que outros isolados desta bactria
(Beegle & Yamamoto, 1992). Este
produto, atualmente, utilizado para
o controle de mais de 167 lepidpteros-
praga (Glare & OCallagham, 2000).
Alm disso, em 1976 foi caracterizado
um isolado eficaz para o controle de
insetos da ordem Diptera, denomina-
do Bt israelensis e em 1983 outro letal
para colepteros denominado de Bt
tenebrionis. O sucesso do uso de Bt
no mundo s no maior at agora,
em funo da existncia de inseticidas
qumicos baratos que podem substi-
tu-lo no controle de lepidpteros.
Alm de ser utilizado como
bioinseticida, a partir da metade da
dcada de 1980, foram obtidas as
primeiras plantas transgnicas com
a incorporao dos genes codifica-
dores das protenas txicas de Bt
em plantas de fumo e tomate (Dias,
1992). Segundo Ely (1993), mais de
50 espcies de plantas sofreram
transformaes deste tipo com re-
sultados satisfatrios. Formas
truncadas dos genes que codificam
protenas inseticidas de Bt na sua
forma ativa foram introduzidas e
expressas com sucesso em plantas
de fumo (Vaeck et al., 1987) e
algodo (Perlak et al., 1990). Koziel
et al. (1993), atravs da insero de
uma verso modificada do gene
truncado cry1Ab, conseguiram a ex-
presso da protena Cry1Ab em al-
tos nveis em plantas de milho e,
em testes de campo, foi verificada a
proteo contra o consumo foliar e
perfurao de colmos por Ostrinia
nubillalis, uma importante praga
da cultura do milho nos EUA.
De acordo com Clive (2002),
estima-se que foram ocupados cerca
de 58,7 milhes de hectares com
culturas transgnicas no ano de 2002,
com um aumento de 11,6% em rela-
o ao ano anterior (Figura 1). A
ndia, o maior produtor mundial de
algodo, comercializou algodo-Bt
pela primeira vez em 2002. Tambm,
foi verificado um aumento da rea
pr-comercial de algodo-Bt na Co-
lmbia e em Honduras. O EUA foi o
pas com maior rea plantada, cerca
de 39 milhes de hectares (66%),
seguido pela Argentina (23%), Cana-
d (6%) e China (4%). A China apre-
sentou o maior incremento anual
(40%) entre 2001 e 2002 na rea
plantada com algodo-Bt, ocupando
51% da rea cultivada com esta esp-
cie. Em termos mundiais, o milho
geneticamente modificado ocupou
12,4 milhes de hectares (com au-
mento de 9% em relao rea de
2001), seguido pelo algodo e canola
com 6,8 e 3 milhes de hectares,
respectivamente (Figura 2).
2. Vantagens e Limitaes
O emprego de biopesticidas
base de Bt altamente desejvel em
programas de controle de insetos devi-
Figura 1. Adoo mundial de plantas geneticamente modificadas (GM)
Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
do sua alta especificidade e rpida
degradao do ambiente. No entanto,
de acordo com Vaeck et al. (1987),
independentemente das vantagens do
uso de inseticidas base de toxinas
produzidas pela bactria Bt, o empre-
go destes produtos em escala comerci-
al limitado em funo da instabilida-
de do cristal protico em campo, devi-
do ao da luz ultravioleta e do seu
alto custo de produo. Em relao ao
efeito destas toxinas sobre insetos be-
nficos, Glare & OCallagham (2000)
relatam estudos realizados sobre o
efeito de vrias subespcies e produ-
tos base de Bt sobre 9 ordens de
predadores, distribudos em 25 famli-
as. Em relao aos parasitides, os
mesmos autores enumeram uma srie
de trabalhos realizados com Diptera
(Tachinidae) e Hymenoptera
(Aphelinidae, Braconidae, Chalcididae,
Encyrtidae, Eulophidae, Eupelmidae,
Ichneumonidae, Pteromalidae, Scelio-
nidae e Trichogrammatidae). Em am-
bos os casos, embora os estudos te-
nham mostrado alguma variao nos
resultados, os produtos formulados com
Bt e suas subespcies apresentam pou-
co ou nenhum efeito sobre estes inimi-
gos naturais.
Os benefcios potenciais do uso
de plantas geneticamente modifica-
das como, por exemplo, milho-Bt,
no se limitam apenas reduo na
aplicao de inseticidas de largo
espectro. Estudos mostram a dimi-
nuio dos nveis de micotoxinas
nos gros destas plantas (Munkvold
et al., 1999).
De acordo com Obrycki et al.
(2001), os riscos ou limitaes no
uso das plantas geneticamente mo-
19
 dificadas podem ser agrupados em
trs categorias: troca de material
gentico entre as plantas genetica-
mente modificadas e espcies selva-
gens aparentadas por meio da dis-
perso de gros de plen; a seleo
de indivduos resistentes na popula-
o do inseto-alvo de controle e o
impacto da tecnologia sobre outros
insetos e organismos no-alvos do
controle. Com relao troca de
material gentico, segundo Ellstrand
et al. (1999), as plantas domestica-
das e utilizadas em sistemas agrco-
las no podem ser consideradas
como indivduos evolutivamente se-
parados de seus parentes selvagens.
Dentre as 13 mais importantes esp-
cies utilizadas para a produo de
alimentos, 90% destas formam hbri-
dos com seus parentes selvagens
em algum local dentro de sua rea
de distribuio agrcola. Deste modo,
os centros de origem das espcies
seriam os locais mais suscetveis a
tal fenmeno. A taxa de fluxo gnico
neste caso tende a ser extremamen-
te varivel e as suas conseqncias
evolutivas dependem de sua magni-
tude. A conseqncia evolutiva mais
clara do fluxo gnico a sua tendn-
cia em homogeneizar a composio
gentica das populaes. A taxa de
fluxo gnico pode ser efetivamente
zero entre plantas com incompatibi-
lidade de cruzamento que estejam
isoladas espacialmente ou que no
apresentem sobreposio de suas
pocas de florescimento. Porm, os
autores chamam a ateno em parti-
cular para os agroecossistemas. Em
tais casos, o plantio concentrado de
uma espcie de interesse econmi-
co pode permitir que outras espci-
es (ex: plantas daninhas) sofram
hibridizao e introgresso de genes
vindos do campo de produo agr-
cola. Assim, o fluxo gnico entre as
plantas domesticadas e seus paren-
tes selvagens apresenta potencial-
mente duas conseqncias danosas:
o aumento da capacidade de inva-
so de ambientes por algumas esp-
cies e o aumento do risco de extino
destes parentes selvagens. De acor-
do com Wolfenbarger & Phifer
(2000), modificaes genticas atra-
vs do melhoramento gentico, con-
vencional ou atravs de engenharia
20 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
Figura 2. Taxa de adoo mundial das principais culturas GM em 2002
gentica, de uma espcie cultivada,
ou no, podem produzir mudanas
e promover a habilidade de um or-
ganismo se tornar invasor de dife-
rentes ecossistemas. Deste modo, a
transferncia de plen de plantas de
milho-Bt para plantas selvagens apa-
rentadas uma preocupao decor-
rente da adoo desta tecnologia
(Bergelson et al., 1998). No entanto,
esta transferncia limitada a regi-
es do Mxico e Amrica Central
onde ocorrem plantas do grupo dos
teosntos (Ellstrand et al., 1999).
O impacto das plantas genetica-
mente modificadas sobre a entomo-
fauna benfica comeou a receber
grande ateno aps a publicao de
Losey et al. (1999) na revista Nature.
Este estudo mostrou que o plen do
milho transgnico expressando toxi-
nas de Bt causou mortalidade de
cerca de 50% das lagartas da borbo-
leta monarca (Dannaus plexippus)
(Lepidoptera: Nymphalidae), quatro
dias aps a ingesto. Porm, este
trabalho foi bastante criticado, prin-
cipalmente, por no relatar precisa-
mente a quantidade de toxina utiliza-
da nos bioensaios. Outros estudos,
como os realizados por Leong et al.
(1992) e Hansen & Obrycki (1999)
indicam que este inseto pode ser
afetado pelo milho-Bt, porm os n-
veis de mortalidade so bastante in-
feriores aos verificados por Losey et
al., (1999). Glare & OCallagham
(2000) ressaltam que o comporta-
mento do inseto, migrao a partir de
reas com esta toxina, poderia redu-
zir o efeito da toxina sobre esta
espcie.
Deve-se ressaltar que o im-
pacto das plantas geneticamente
modificadas sobre os organismos
no-alvos do controle pode ser
avaliado atravs de estudos
toxicolgicos e/ou ecolgicos
(Obrycki et al., 2001). Nos estudos
toxicolgicos, o parmetro avalia-
do a mortalidade dos herbvoros
e dos consumidores de plen quan-
do expostos s toxinas de Bt como
realizado por Losey et al. (1999).
Por sua vez, nos estudos ecolgi-
cos so observados os efeitos da
utilizao destas plantas sobre os
demais nveis trficos constituin-
tes de uma cadeia alimentar (her-
bvoros predadores e parasitides).
Ainda existem questionamentos
quanto ao impacto das toxinas pre-
sentes em plantas de milho-Bt so-
bre insetos polinizadores de ou-
tras plantas. Vandenberg (1990)
detectou valores significativos de
mortalidade de abelhas domestica-
das quando expostas soluo de
Bt tenebrionis, o qual considera-
do especfico para colepteros. Ain-
da, segundo Obrycki et al. (2001),
os efeitos das plantas de milho-Bt
tambm deveriam ser avaliados
sobre decompositores presentes no
solo (ex: Collembola) e outros pre-
dadores vertebrados. Estes ltimos
estudos se justificam j que algu-
mas espcies de pssaros e morce-
gos so predadoras de lepidpteros
que freqentemente ocorrem em
campos de milho.
Em relao ao efeito de plan-
tas transgnicas sobre inimigos na-
turais, de acordo com Orr & Landis
(1997), o nmero de predadores e
o parasitismo de massas de ovos
de O. nubilalis no foram adversa-
mente afetados por plantas de mi-
lho-Bt expressando Cry1A(b). En-
tre os predadores foram avaliados
adultos e ninfas do percevejo pre-
dador Orius insidiosus, bem como
adultos e larvas de coccineldeos e
crisopdeos.
Pilcher et al. (1997) conduziram
estudos em laboratrio e campo para
determinar os efeitos de milho-Bt
expressando Cry1A(b) sobre insetos
predadores. No laboratrio, no foi
verificado qualquer efeito detrimen-
tal agudo sobre o desenvolvimento
pr-imaginal e sobrevivncia de
Coleomegilla maculata, O.
insidiosus e Chrysoperla carnea. No
campo, em estudo realizado por dois
anos consecutivos, no foram ob-
servados efeitos adversos sobre a
abundncia de predadores de O.
nubilalis (coccineldeos, crisopdeos
e antocordeos) quando compara-
das a reas de milho no genetica-
mente modificado. Ainda, os nme-
ros de predadores observados an-
tes, durante e aps a liberao dos
gros de plen pelas plantas de
milho-Bt sugerem que movimento
dos inimigos naturais no campo no
foi afetado por este tipo de plen.
Os efeitos de presas alimenta-
das com milho-Bt sobre a mortalida-
de e desenvolvimento de larvas do
predador C. carnea foram estuda-
dos em condies de laboratrio por
Hilbeck et al. (1998a). O predador
foi criado com lagartas de O.
nubilalis, e Spodoptera litorallis ali-
mentadas com milho contendo a
toxina Cry1A(b). Foi observado pro-
longamento no perodo larval de
crisopdeos criadas continuamente
com presas que foram alimentadas
com o milho geneticamente modifi-
cado foi significativamente maior
comparada com a testemunha, bai-
xo valor nutricional. Ainda, foi ob-
servado prolongamento no perodo
larval de crisopdeos criados com
lagartas de O. nubilalis alimentas
com milho geneticamente modifica-
do. Este efeito pode ser atribudo
exposio toxina inseticida em
conjunto com o uso de presas de
baixo valor nutricional.
O desenvolvimento e mortali-
dade de formas larvais do preda-
dor Orius majusculus criadas so-
bre tripes Anaphothrips obscurus,
alimentados com milho genetica-
mente modificado expressando a
d-endotoxina Cry1A(b), foi estu-
dado por Zwahlen et al. (2000). A
atividade inseticida das plantas de
milho Bt foi comprovada atravs
de bioensaios utilizando-se lagar-
tas de O. nubilalis. No houve
diferena significativa na mortali-
dade e no desenvolvimento das
formas imaturas do predador cria-
das em A. obscurus alimentados
com milho transgnico expressan-
do a toxina Cry1A(b), quando com-
parados testemunha criada com
tripes no expostos protena in-
seticida de B. thuringiensis. Os
resultados obtidos no evidencia-
ram efeitos letais ou subletais nos
indivduos de O. majusculus no
modelo de interao tritrfica (mi-
lho Bt herbvoro predador)
elaborado pelos autores. Segundo
os autores, a resposta de O.
majusculus alimentados com tripes
expostos Cry1A(b) pode ser
explicada pela insensibilidade des-
te percevejo toxina ou pela baixa
quantidade de protena inseticida
ingerida pelos tripes que se ali-
mentaram do milho Bt.
AlDeeb & Wilde (2003) no
identificaram diferenas significati-
vas entre parcelas com milho Bt
Cry3Bb1 e o isognico, com relao
ao nmero de insetos no alvos de
controle coletados em armadilhas
do tipo alapo. As inspees visu-
ais de adultos e formas imaturas de
C. maculata , O. insidiosus e
Hippodamia convergens tambm
no mostraram diferenas significa-
tivas entre os materiais testados.
Segundo Al-Deeb et al. (2001), no
houve diferena significativa entre o
nmero de adultos e ninfas de O.
insidiosus em plantas milho Bt ex-
pressando a toxina Cry1A(b) e mi-
lho convencional em condies de
campo, em duas localidades estuda-
das. Ainda os autores conduziram
teste em laboratrio para avaliar os
efeitos de estilo-estigmas de milho-
Bt na mortalidade de formas imatu-
ras de O. insidiosus. Os resultados
Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
mostraram que quando criados con-
tinuamente sobre estilo-estigmas de
milho convencional ou milho Bt as
ninfas deste percevejo predador
apresentaram 100% de mortalidade,
sugerindo que estes insetos sofre-
ram com insuficincia nutricional
nesta dieta. Porm, no houve dife-
rena significativa na mortalidade
das ninfas do percevejo quando ali-
mentadas com estilo-estigmas de mi-
lho-Bt ou convencional e ovos de O.
nubilalis em dias alternados.
Segundo Barton & Dracup et al.
(2000), as prticas agrcolas tm cau-
sado impactos ambientais nos ecos-
sistemas. Deste modo, os riscos e
benefcios em potencial da adoo da
tecnologia de plantas geneticamente
modificadas devem ser ponderados
tomando-se como referencial os im-
pactos ambientais decorridos dos sis-
temas atuais de produo agrcola.
Porm, os riscos ao ambiente das
plantas geneticamente modificadas
devem ser avaliados antes de sua
liberao para o plantio comercial, e
posteriormente as reas ocupadas com
estas culturas devem ser monitoradas.
Portanto, conforme apontado por
Fernandes & Martinelli (2000), os es-
tudos com plantas transgnicas resis-
tentes a insetos em reas extensas
com o objetivo de se determinar quais
so as espcies indicadoras de impac-
to ambiental destas plantas em um
determinado sistema devem ser
priorizados. Ainda h a necessidade
de se padronizar mtodos de avalia-
o e interpretao de resultados, pos-
sibilitando a avaliao destas plantas
por todo o Brasil. Deste modo, estes
resultados poderiam ser levados a
pblico promovendo uma ampla dis-
cusso sobre o tema.
No obstante, a evoluo da re-
sistncia s toxinas presentes nas
plantas geneticamente modificadas
resistentes a insetos uma das prin-
cipais preocupaes para a liberao
comercial destas plantas. De acordo
com Heckel (1997) a partir do mo-
mento em que ocorrer a liberao
para plantio em reas extensas, as
toxinas de Bt representaro um im-
portante fator de mortalidade para as
populaes dos insetos-alvos. Esta
alta presso de seleo pode condu-
zir evoluo da resistncia a estas
21
 toxinas inseticidas nas populaes
dos insetos expostos. Existem vrias
conseqncias negativas no desen-
volvimento de resistncia s toxinas
de Bt. Alm da perda das plantas
transgnicas que expressam tais to-
xinas como opo no controle de
insetos, h o risco de que o uso de
formulaes comerciais de insetici-
das base de Bt no seja mais vivel
para a aplicao em lavouras de mi-
lho ou em outras culturas. Os produ-
tores orgnicos perderiam uma im-
portante opo para o manejo de
pragas, o qual certificado para o seu
sistema de produo. Alm disso, as
possibilidades de substituio destes
produtos de origem biolgica por
outros so mnimas. O aumento da
utilizao de inseticidas sintticos
tambm outra conseqncia em
potencial do desenvolvimento da re-
sistncia s toxinas de Bt (EPA, 1998).
3. Evoluo da Resistncia
a Produtos Base de Bt e
Plantas Geneticamente
Modificadas
A resistncia um fenmeno
pr-adaptativo que se desenvolve
por seleo de indivduos raros que
podem sobreviver aplicao de
um inseticida a uma determinada
dose. Um grande nmero de fatores
genticos, bio-ecolgicos e opera-
cionais influenciam a taxa de evo-
luo da resistncia. Os fatores ge-
nticos incluem a variabilidade na-
tural nas populaes, nmero de
genes envolvidos na manifestao
da resistncia e sua freqncia ini-
cial na populao (Georghiou &
Taylor, 1977), a herana da caracte-
rstica (ex: grau de dominncia) e
custo adaptativo associado resis-
tncia (Van Rie & Ferr, 2000). O
potencial das populaes de inse-
tos em desenvolver resistncia aos
produtos formulados com Bt utili-
zados no controle de pragas uma
das principais ameaas ao emprego
desta estratgia de controle de pra-
gas agrcolas. A evoluo da resis-
tncia dos insetos para inseticidas
qumicos bastante comum, com
mais de 500 espcies sendo resis-
tentes a um ou vrios inseticidas J
para os bioinseticidas comparati-
22 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
vamente mais rara, principalmente J para H. virescens os trabalhos
devido ao fato de que estes so demostraram que os resultados de-
pouco utilizados, se compararmos pendem da linhagem do inseto estu-
com a rea tratada com inseticidas dada. Por exemplo: para a linhagem
qumicos em todo mundo. SEL a herana mostrou-se autoss-
H dois modos de estudar a influ- mica, incompletamente dominante,
ncia da variabilidade em populaes e controlado por vrios fatores ge-
naturais sobre a resistncia a Bt. A nticos (Sims et al., 1991).
primeira envolve os estudo das dife- Em relao ao nmero de genes
renas na suscetibilidade entre e den- envolvidos na resistncia, para P.
tro de populaes. Trabalhos neste xylostella h trabalhos que indicam
sentido foram desenvolvidos por van a ocorrncia de mais de um gene
Frankenhuyzen et al. (1995) e Huang envolvido (Tang et al., 1997). Po-
et al. (1997) para Choristoneura rm, segundo Glare & OCallagham
fumiferana e O. nubilalis, respectiva- (2000), a resistncia deste inseto
mente. Outra estimativa da variabilida- para Cry1Ab mostra-se recessiva
de para genes de resistncia em popu- controlada principalmente por um
laes naturais medir a herdabilidade nico alelo autossmico e recessivo,
(h2) em experimentos laboratoriais a embora isto no seja sempre atribu-
partir de uma amostra da populao. do ao mesmo loci. Tabashnik et
Este ndice representa a proporo da al. (1997) relatou que populaes
variao fenotpica de um determina- do Hawai e Pensilvnia dividem um
do carter responsvel pela variao locus em que uma mutao reces-
gentica. Tabashnik (1994a) estimou o siva associada com a reduzida liga-
h2 para 8 espcies de insetos, com valor o ao receptor confere resistncia
relativamente alto para Plodia extremamente alta a 4 toxinas de
interpunctella, mostrando abaixa vari- Bt. Entretanto, outra populao, das
ao fenotpica e alta variao gentica Filipinas, mostrou um controle
aditiva deste inseto. multilocus, de espectro mais re-
A estimativa indireta da freqn- duzido, e para algumas toxinas de
cia dos alelos de resistncia Bt, a herana gentica no reces-
fornecida por experimentos labora- siva e no est associada com a
toriais que obtiveram xito em sele- reduo da ligao ao receptor. J
cionar populaes resistentes a Bt para Heliothis virescens provvel
(Van Rie & Ferr, 2000). Nestes ca- que um gene principal parcialmen-
sos, pelo menos uma cpia do alelo te recessivo confere resistncia a
de resistncia deve estar presente vrias toxinas: Cry1Aa, Cry1Ab,
para o incio da seleo. Em experi- Cry1Ac e Cry1Fa, causando modifi-
mentos com lepidpteros (Gould et caes no receptor (Gould et al.,
al., 1992; 1995), a freqncia de 1995; Lee et al., 1995).
alelos de resistncia nas populaes Embora a resistncia em labora-
testadas foi relativamente alta (de 1 trio seja obtida em poucas gera-
a 5 x 10-3). es em alguns insetos, ela na
Quanto herana da resistn- maioria dos casos instvel, reduzin-
cia, McGaughey (1985, 1988) mos- do logo aps a diminuio da pres-
traram que para P. interpunctella a so de seleo, como foi observado
herana autossmica de parcial- por Tabashnik et al. (1994) e Tang et
mente a completamente recessiva. al. (1997) para P. xylostella. O custo
O mesmo foi verificado para Plutella adaptativo associado evoluo da
xylostella por Tabashnik et al. (1992) resistncia a causa mais provvel
e Tang et al. (1997). Em outro traba- da instabilidade da resistncia em P.
lho com este mesmo inseto, (Ferr xyllostella. Groeters et al. (1994)
et al., 1991) verificaram que a susce- mostraram tal reduo no custo adap-
tibilidade da prognie F1 depende tativo, sendo que aps 5 geraes, a
do sexo do inseto no cruzamento ecloso das lagartas e fecundidade
parental, ainda que a ligao com o foram reduzidos em 10% na linha-
sexo tenha sido eliminada com base gem resistente em comparao com
na razo sexual 1:1 dos sobreviven- a suscetvel. A compreenso desta
tes da F1 a vrias doses da Cry1Ab. instabilidade pode indicar porque a
 Tabela 1 - Relatos de desenvolvimento de resistncia a produtos base de Bacillus thuringiensis ou
toxinas em laboratrio (modificado de Glare & OCallagham, 2000 e Tabashnik et al., 2003).
Nvel de Resistncia
Inseto Subespcie Toxina(s)
resistncia cruzada
Choriston eura
sotto 3,8 x - -
fumiferan a
Crysomela scripta - acima 5.000 x Cry3Aa Cry1Ba
ten ebrion is 59 x Cry3 -
Ephestia cautella kurstaki 7x - -
Homeoeosoma
kurstaki 1,7 x -
electellum
Heliothis armigera Cry1Ac 13 - 57 x -
H. virescen s kurstaki HD-1 mais de 24 x Cry1 -
kurstaki HD-1 12- 69 x Cry1Ab -
- 50 - 53 x Cry1Ac Cry1Ab, Cry2A
Cry1Aa, Cry1Ab,
- 10.000 x Cry1Ac Cry1F, Cry1B, Cry1C
e Cry2A
Leptin otarsa
Cry3A acima 100 e 400 x
decemlin eata
Ostrin ia n ubilalis - baixo nvel Cry1Ab
kurstaki acima 73 x - -
Pectin ophora
- 3.100 Cry1Ac -
gossypiella
Plodia in terpun ctella kurstaki acima de 250 x - -
thurin gien sis,
kurstaki (Dipel) acima 250 x - kurstaki (menos
HD-1) e galleriae
kurstaki (Dipel) acima de 25 x - -
kurstaki (Dipel) acima 106 x Cry1Ab -
cerca de 875 x Cry1Ab -
kurstaki 140 x - -
aizawai 28 - 61 x - -
en tomocidus 21 x - -
Plutella xylostella kurstaki 15 - 66 x - -
Cry1C, Cry1Aa,
- 22 - 62 x Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1F, Cry1J
Cry1F e Cry2
Cry1C 12.400 -
300 - acima de 6.800
Cry1Ac -
x
Spodoptera exigua kurstaki 1-2 x - -
Cry1Ab, Cry1C,
850 x Cry1C Cry1E/Cry1C, Cry1H
e Cry2A
S. frugiperda kurstaki 4,9 x - -
Cry1D, Cry1E e
S. littoralis aizawai mais de 500 x Cry1C
Cry1Ab
Trichoplusia n i 31 x Cry1Ab Cry1Aa ou Cry1Ac
kurstaki + aizawai 15 x - -
kurstaki HD-1 307 x - -
aizawai HD-112 e HD-1, 198, 133 e
28 e 97 x -
HD-133 HD-1, 112 e 198
en tomocidus HD-
32 x HD-1, 112 e 133 -
198
kurstaki + aizawai 164 e 62-100 x en tomocidus -

Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003 23

 Tabela 2 - Relatos de possvel desenvolvimento de resistncia de insetos
para Bacillus thuringiensis em campo (Glare & OCallagham, 2000).
Inseto Subespcie Nvel de resistncia Toxina(s)
Helicoverpa armigera kurstaki
Heliothis virescen s MVP II
Plodia in terpun ctella kurstaki
Plutella xylostella kurstaki
aizawai
Spodoptera frugiperda kurstaki
evoluo da resistncia ao Bt to
rara e pode auxiliar na elaborao
de estratgias para incrementar a
utilizao deste bioinseticida
(Tabashnik et al., 1994).
A alterao da atividade proteo-
ltica (ativao da toxina) foi verifica-
da em P. interpunctella para Bt
entomocidus e Bt kurstaki (Johnson
et al., 1990; Oppert et al., 1997). Em
trabalho semelhante realizado por
Van Rie et al. (1990), foi observada a
reduo de 50 vezes na afinidade da
toxina pelo receptor. Porm, os auto-
res no verificaram alterao no n-
mero de receptores presentes para
Cry1Ab na linhagem resistente. Estes
dados indicam que a resistncia, nes-
te caso, devida a alteraes no
receptor de Cry1Ab, pois o mesmo
decrscimo de afinidade no foi ob-
servado para Cry1Ca, que possui 3
vezes mais receptores que a outra
toxina. Este elevado nmero de re-
ceptores pode explicar a alta susceti-
bilidade da linhagem selecionada para
Cry1Ca. Para H. virescens foi verifica-
do por Lee et al. (1995) que a ligao
da toxina Cry1Aa ao receptor foi
drasticamente reduzida, mas o mes-
mo no foi verificado para Cry1Ab e
Cry1Ac. Porm, as toxinas do grupo
Cry1A dividem os mesmos recepto-
res nesta espcie de inseto, portanto
Cry1Ac e Cry1Ab tambm se ligam
ao receptor de Cry1Aa. Consequen-
temente foi considerada a hiptese
que o receptor alterado para Cry1Aa
causa resistncia ao 3 subclasses de
Cry1A (Van Rie & Ferr, 2000).
Exemplos de Resistncia de In-
setos a produtos base de Bacillus
thuringiensis:
1) Em laboratrio
Existem vrios relatos de evolu-
o da resistncia a Bt em laboratrio
24 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
- campo (Tabashnik et al., 1997),
Tolerante Cry1Ac
Baixo
25 - 426 x Cry1Ab
3 - 20 x Cry1Ac
1,48 x
(Tabela 1). Para a maioria das esp- possibilidade, porm pouca dife-
cies testadas a resistncia evolui rapi-
damente para Bt kurstaki, Bt
entomocidus e Bt tenebrionis ou Bt
aizawai. Quando a diferena entre
as populaes suscetveis e resisten-
tes menor que 10, no fica claro se
a populao desenvolveu resistn-
cia, propriamente dita, ou se existe
tolerncia entre subgrupos ou
gentipos da espcie em questo
(Glare & OCallagham, 2000).
O primeiro exemplo de resistn-
cia em laboratrio ocorreu com Musca
domestica ao Bt thuringiensis, pro-
vavelmente envolvendo b-exotoxina.
De modo semelhante, trabalhos mos-
traram uma evoluo de resistncia
de 10 da mesma toxina para
Drosophila melanogaster em 30 ge-
raes (Harvey & Howell, 1964; Wil-
son & Burns, 1968; Carlberg &
Lindstrom, 1987).
A partir do primeiro relato de
resistncia de Plodia interpunctella a
d-endotoxina (McGaughey &
Beeman, 1988), vrios relatos de de-
senvolvimento de resistncia em la-
boratrio foram feitos. Em alguns
casos os estudos envolvem a suspen-
so esporo + cristal enquanto que em
outros casos apenas toxina(s). Em
alguns casos nveis elevados de re-
sistncia foram obtidos em apenas
algumas geraes usando-se alta pres-
so de seleo, como por exemplo:
P. interpunctella para Bt kurstaki e P.
xylostella para Bt aizawai Cry1C, de
3 e 6 geraes respectivamente (Glare
& OCallagham, 2000).
2) Em campo
Embora alguns trabalhos reali-
zados em laboratrio com alta pres-
so de seleo de Bt sobre P.
xylostella (traa-das-crucferas) [sic]
no tenha sido verificado alterao
significativa na suscetibilidade
(Devriendt & Martouret, 1976), este
inseto foi o primeiro a mostrar evo-
luo de resistncia para Bt em
sendo, at o momento, o nico
exemplo em que foi verificada a
evoluo da resistncia em campo
de um inseto para Bt, embora para
outras espcies de lepidpteros (Ta-
bela 1) tenha sido sugerido esta
rena na suscetibilidade foi verifi-
cada entre as populaes de campo
(resistente) e a de referncia em
laboratrio (suscetvel). Segundo
Glare & OCallagham (2000), ou-
tros relatos de resistncia deste in-
seto a produtos base de Bt foram
feitos em vrios pases como
Tailndia, Hava, Japo, Coria, Chi-
na, EUA e Amrica Central.
A espcie influencia a probabi-
lidade de evoluo da resistncia
devido variabilidade gentica na
populao e possibilidade de en-
contrar o inculo. Por exemplo, o
hbito migratrio e polfago de
Helicoverpa punctigera leva dilui-
o de qualquer populao resisten-
te devido ao cruzamento de indiv-
duos resistentes com suscetveis,
entretanto, P. xylostella um inseto
com mobilidade limitada, no ocor-
rendo diluio da resistncia, pelo
cruzamento com insetos suscetveis
vindos de outras reas (Glare &
OCallagham, 2000).
A incidncia de resistncia cru-
zada geralmente baixa, mas foi
verificada para vrias toxinas (Ta-
bela 1). Esta parece estar ligada a
composio da toxina do isolado
utilizado. McGaughey & Johnson
(1994) realizam um estudo detalha-
do abordando a resistncia para as
toxinas individualmente aps a se-
leo para resistncia aos isolados
Bt kurstaki (HD-1), Bt aizawai (HD-
112 e 133) e Bt entomocidus (HD-
198). Para P. interpunctella, HD-1
resultou em resistncia para Cry1Ab
e Cry1Ac, mas no para Cry1Aa,
Cry1B, Cry1C e Cry2A. Resistncia
para HD-133 e HD-198 resultou em
resistncia a uma maior gama de
toxinas: Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac,
Cry1B, Cry1C e Cry2A. Os autores
sugeriram que o espectro relativa-
mente limitado de resistncia s
diferentes toxinas em Bt kurstaki
indicou que a resistncia cruzada a
outras subespcies era menos pro-
vvel de ocorrer, portanto produtos
baseados em Bt kurstaki deveriam
ser utilizados primeiro. A resistn-
cia de Heliothis virescens normal-
mente relatada toxina Cry1Ac,
porm existem relatos de resistn-
cia para outras toxinas como:
Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1F e Cry2A
(Gould et al., 1992).
4. Manejo da Resistncia
Os programas de manejo da
resistncia apresentam 3 objetivos
principais: evitar, retardar e rever-
ter a evoluo da resistncia (Croft,
1990). Estes objetivos so os mes-
mos para o manejo da resistncia a
produtos base de Bt sendo mui-
tas tticas baseadas nos princpios
mostrados para plantas genetica-
mente modificadas. No caso das
plantas Bt so preconizadas vrias
estratgias, tais como plantas com
altas doses das toxinas associadas
a reas de refgio, misturas de
plantas com diferentes toxinas, mo-
saicos de plantas geneticamente
modificadas, combinaes de toxi-
nas com diferentes modos de ao,
ou a combinao de plantas ex-
pressando baixas doses das toxi-
nas e controle complementar das
pragas pelos inimigos naturais e a
expresso das toxinas em determi-
nados tecidos ou em um perodo
de ataque mais intenso da praga
(Neppl, 2000).
A estratgia empregada nos
pases com plantio de milho Bt
onde as pragas apresentam hbito
migratrio dos adultos e alta mobi-
lidade nas formas larvais tem sido
a utilizao de plantas expressan-
do altas doses das toxinas associa-
das s reas de refgio. Esta ttica
comeou a ser adotada baseando-
se no princpio de que os insetos
suscetveis poderiam imigrar para
uma rea com predominncia de
insetos resistentes e, por cruza-
mento, diluir os alelos de resistn-
cia na populao da praga. Este
princpio apenas valido com a
expresso das toxinas de Bt em
altas doses de modo que a resis-
tncia seja funcionalmente reces-
siva. Deste modo, apenas restari-
am na rea com plantas genetica-
mente modificadas os indivduos
resistentes. O refgio pode variar
em tamanho e disposio e servir
como reservatrio de insetos sus-
cetveis. O sucesso desta estrat-
gia depende das seguintes condi-
es: que o acasalamento seja ale-
atrio entre os indivduos resisten-
tes e suscetveis, que os insetos
suscetveis migrem da rea de re-
fgio para a rea com as plantas
geneticamente modificadas e exis-
ta sincronia na emergncia de in-
setos entre as duas reas.
Outra estratgia possvel para
a liberao de plantas genetica-
mente modificadas a mistura de
sementes transgnicas e convenci-
onais na forma de linhas da cultura
ou faixas de plantio. Uma rea que
utilize esta estratgia resulta numa
mistura de plantas-Bt e convencio-
nais. Deste modo, o refgio de
plantas convencionais seria dis-
posto internamente na rea com as
plantas transgnicas. Este refgio
interno consistiria no reservatrio
de suscetibilidade para o forneci-
mento de indivduos suscetceis
para acasalamento aleatrio com
os resistentes que restariam nas
plantas geneticamente modifica-
das. A principal limitao deste
mtodo a taxa de movimento
entre plantas nas formas larvais da
praga-alvo de controle. Esta ttica
indicada para casos especficos
nos quais a forma larval da praga
que se encontra nas plantas con-
vencionais no se disperse para
plantas geneticamente modificadas
resistentes causando a morte dos
indivduos suscetveis.
A mistura de sementes na for-
ma de linhas de plantio com semen-
tes convencionais internamente
rea de algodo Bt tm sido utiliza-
da com sucesso no Arizona, EUA,
para o manejo de lagarta rosada
Pectinophora gossypiella. Neste
caso, a lagarta rosada permanece
dentro das mas atacadas o que
limita o movimento das formas
larvais desta espcie entre as plan-
tas garantindo a sobrevivncia dos
indivduos suscetveis. Esta estrat-
Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
gia no seria adequada para o ma-
nejo de S. frugiperda j que est
espcie apresenta alta mobilidade
na sua larval. A tcnica do plantio
em forma de mosaico envolve reas
com plantas Bt expressando dife-
rentes toxinas inseticidas. Deste
modo, os insetos estariam sofrendo
diferentes presses de seleo ao
longo da faixa de plantio de reas
geneticamente modificadas. No
entanto, para que esta estratgia
funcione importante que no ocor-
ra resistncia cruzada entre as toxi-
nas empregadas. Alm disso, exis-
tem crticas quanto possvel efici-
ncia das diferentes reas Bt em
atuarem como reservatrios de sus-
cetibilidade recprocos, o que pos-
sibilitaria a imigrao de indivduos
suscetveis entre as diferentes re-
as para a diluio dos alelos de
resistncia.
Outra alternativa vivel a rota-
o de plantas dispondo deferentes
toxinas inseticidas. Assim como no
caso do mosaico, a resistncia cruza-
da entre as toxinas pode comprome-
ter a eficcia deste mtodo. As bases
tericas na estratgia da rotao so
que o custo adaptativo associado
resistncia leva a reduo da fre-
qncia dos indivduos suscetveis e
a imigrao de indivduos suscet-
veis. (Hoy, 1988).
A expresso da toxina de Bt em
tecidos e estdio fenolgicos ade-
quados especficos uma estratgia
que visa diminuir a presso de sele-
o das plantas-Bt sobre a popula-
o de insetos (Frutos et al., 1999).
Esta estratgia similar ao uso de
reas refgio e mistura de sementes
no sentido que a prpria planta
pode atuar como refgio (Mallet &
Porter, 1992). As plantas poderiam
produzir as toxinas somente quando
o nvel de dano fosse alcanado ou
em determinados tecidos mais pro-
pensos ao ataque. No entanto, esta
estratgia no funcionaria para pra-
gas que atacam todas as partes da
planta. Alm disso, esta ttica
dependente de estudos avanados
em biologia molecular a fim de se
encontrar os promotores especfi-
cos que seriam responsveis pelo
direcionamento da expresso das
toxinas inseticidas.
25
 Embora estudos conduzidos em
laboratrio relatem a casos de resis-
tncia as toxinas de Bt e freqncia
inicial elevada de resistncia, nos
pases que adotam a tecnologia de
plantas Bt no manejo das pragas os
programas de monitoramento no
detectaram ainda aumento na
frequncia de resistncia (Tabashnik
et. al.,2003). Exemplos de progra-
mas de monitoramento estabeleci-
dos e bem sucedidos incluem O.
nubilalis (Estados Unidos 6 anos),
P. gossypiella (Arizona-5 anos),
Helicoverpa armigera (Nordeste da
China-3 anos) e Helicoverpa zea (Ca-
rolina do Norte-2 anos).
Assim, torna-se fundamental o
desenvolvimento de programas de
monitoramento como parte dos pro-
gramas que visem manejar a evolu-
o da resistncia. Entretanto, as
estratgias para o manejo da resis-
tncia somente obtm o xito espe-
rado se forem adequadamente
implementadas. importante que o
agricultor compreenda estas estrat-
gias, alm do monitoramento e as-
sistncia tcnica para o sucesso des-
tes programas (Neppl, 2000). Ainda
so necessrios estudos para otimizar
os resultados obtidos com as estra-
tgias de manejo da resistncia, en-
tre estes, destacam-se as pesquisas
voltadas para os hbitos dos insetos
(migrao e acasalamento) que po-
dem influenciar decisivamente na
viabilidade das tticas empregadas.
Dificilmente pode-se assegurar o
xito destes programas, pois em
campo muitas variveis so soma-
das aos modelos propostos e, atual-
mente, nenhuma das tticas acima
descritas so completamente aceit-
veis em termos de eficcia.
5. Consideraes Finais
O uso das estratgias de mane-
jo implica significativa demanda de
mo-de-obra especializada, princi-
palmente no sentido de monitorar a
evoluo da resistncia em reas
cultivadas com plantas genetica-
mente modificadas expressando
toxinas de Bt. Geralmente, a assis-
tncia tcnica disponvel aos agri-
cultores limita-se a recomendao
de insumos para viabilizar sua ativi-
26 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
dade agrcola, de maneira que os
extensionistas dificilmente atuam
como agentes introdutrios de no-
vas tecnologias e conhecedores do
seu impacto sobre o meio onde
atuam. Alm de determinar o im-
pacto das plantas transgnicas so-
bre o meio ambiente, necessrio
tambm instruir e qualificar tanto o
agricultor como o extensionista so-
bre o potencial desta moderna tti-
ca de controle de pragas. A imple-
mentao de estratgias de manejo
de resistncia e programas de mo-
nitoramento so fundamentais para
a explorao sustentvel da tecno-
logia das plantas Bt. Estas ativida-
des so exigentes em mo-de-obra
treinada e apoio logstico pelos pro-
dutores rurais, rgos de assistn-
cia tcnica, grupos de consultores
envolvidos com a cultura e das
empresas produtoras de sementes
geneticamente modificadas.
Por fim, no correto se pensar
que as plantas geneticamente modi-
ficadas sero a alternativa definitiva
para o controle de pragas. O sistema
planta-inseto deve ser estudado e
avaliada a relao custo x benefcio
da adoo destas plantas genetica-
mente modificadas resistentes a in-
setos. Deve-se conhecer toda a gama
de alternativas existentes e escolher
aquela que melhor viabiliza a ativi-
dade agrcola, porm levando-se em
conta o seu impacto sobre o meio
ambiente em comparao s demais
alternativas disponveis para o con-
trole de pragas.
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27
 Pesquisa
Luiz Pereira Ramos, Ph.D.
Professor Adjunto IV, Departamento de Qumica,
Universidade Federal do Paran
lramos@quimica.ufpr.br
Karla Thomas Kucek, B.Sc.
Mestranda em Qumica Orgnica, Departamento
de Qumica, Universidade Federal do Paran
k.kucek@hotmail.com
Anderson Kurunczi Domingos, B.Sc.
Mestrando em Qumica Orgnica, Departamento
de Qumica, Universidade Federal do Paran
anderson@quimica.ufpr.br
Helena Maria Wilhelm, Ph.D.
Pesquisadora, Unidade Tecnolgica de Qumica
Aplicada, Depto. de Qumica Aplicada, Instituto
de Tecnologia para o Desenvolvimento, LACTEC
helenaw@lactec.org.br
Ilustraes cedidas pelos autores
28 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
Biodiesel
Um projeto de sustentabilidade econmica e scio-ambiental para o Brasil
1 - Introduo
Desde o sculo passado, os com-
bustveis derivados do petrleo tm
sido a principal fonte de energia
mundial. No entanto, previses de
que esse recurso deva chegar ao fim,
somadas s crescentes preocupaes
com o ambiente, tm instigado a
busca de fontes de energia renovvel
(Ghassan et al., 2003).
O Protocolo de Quioto, concebi-
do durante o frum ambiental Rio-92
e ratificado, desde ento, por mais de
93 pases, vem tentando mobilizar a
comunidade internacional para que
promova uma ao conjunta com o incluso social.
objetivo de estabilizar na atmosfera a
concentrao dos gases causadores
do efeito estufa e, assim, limitar a
interferncia antropognica sobre o
sistema climtico global (Greenpeace
International, 2003). Infelizmente, os
termos do referido acordo somente
entraro rigorosamente em vigor
quando o conjunto de seus signatri-
os somar, no mnimo, 55% do total de
pases emissores do globo, algo que
somente ser possvel com a ratifica-
o de, pelo menos, uma das grandes
potncias mundiais, a Rssia ou os
Estados Unidos. Em pronunciamen-
tos recentes, o Presidente da Rssia,
Vladimir Putin, declarou estar ainda
avaliando as condies que levaro o
seu pas a tomar tal deciso, demons-
trando que, apesar da evidncia de
que o acmulo desses gases na at-
mosfera comprometa fortemente o
equilbrio dos diferentes ecossiste-
mas terrestres, interesses geopolticos
e/ou comerciais tm prevalecido so-
bre os mais eloqentes interesses da
humanidade.
O Brasil, apesar de no ser um
grande emissor de gases poluentes,
vem promovendo medidas condizen-
tes com essa nova conjuntura, atra-
vs do desenvolvimento e da atuali-
zao peridica de inventrios naci-
onais sobre o tema (Ministrio da
Cincia e Tecnologia, 2002). No
momento em que o mercado de car-
bono estiver regulamentado, esses
inventrios tero uma importncia
vital para que o pas possa conquistar
espao e usufruir dessa nova estrat-
gia de redistribuio de riquezas e de
Sabe-se que as metas estabele-
cidas pelo Protocolo de Quioto so-
mente podero ser alcanadas pelo
uso sustentado da biomassa para
fins energticos. No entanto, recen-
tes levantamentos demonstram que
apenas 2,2% da energia consumida
no mundo proveniente de fontes
renovveis (Pessuti, 2003), o que
evidencia um extraordinrio poten-
cial para a explorao de outras
fontes. Considerando-se apenas a
biomassa proveniente de ativida-
des agroindustriais, ou seja, resdu-
os agrcolas, florestais e agropecu-
rios, calcula-se que o potencial
combustvel desse material seja
equivalente a, aproximadamente,
6.587 milhes de litros de petrleo
ao ano (Staiss e Pereira, 2001). Di-
ante de todo esse potencial, tem
havido uma crescente dissemina-
o de projetos e de aes voltados
para o uso de leos vegetais e de
resduos urbanos e agroindustriais
para a gerao de energia, particu-
larmente por meio de projetos de
co-gerao (Cenbio, 2003).
2 - leos vegetais como
fonte de energia renovvel
Por se tratar de uma fonte de
energia renovvel e por seu uso
sustentado no provocar danos ao
meio ambiente, a biomassa tem atra-
do muita ateno nos ltimos tem-
pos (Ministrio da Indstria e do
Comrcio, 1985; Ministrio da Cin-
cia e Tecnologia, 2002; U.S.
Department of Energy, 1998). Den-
tre as fontes de biomassa pronta-
mente disponveis, os leos vege-
tais tm sido largamente investiga-
dos como candidatos a programas
de energia renovvel, pois proporci-
onam uma gerao descentralizada
de energia e um apoio agricultura
familiar, criando melhores condi-
es de vida (infra-estrutura) em
regies carentes, valorizando po-
tencialidades regionais e oferecen-
do alternativas a problemas econ-
micos e scio-ambientais de difcil
soluo.
A utilizao de leos vegetais in
natura como combustvel alternati-
vo tem sido alvo de diversos estudos
nas ltimas dcadas (Nag et al., 1995;
Piyaporn et al., 1996). No Brasil, j
foram realizadas pesquisas com os
leos virgens de macaba, pinho-
manso, dend, indai, buriti, pequi,
mamona, babau, cotieira, tingui e
pupunha (Barreto, 1982; Ministrio
da Indstria e do Comrcio, 1985;
Serruya, 1991) e nos testes realizados
com esses leos em caminhes e
mquinas agrcolas, foi ultrapassada
a meta de um milho de quilmetros
rodados (Ministrio da Indstria e do
Comrcio, 1985). No entanto, esses
estudos demonstraram a existncia
de algumas desvantagens no uso di-
reto de leos virgens: (a) a ocorrn-
cia de excessivos depsitos de carbo-
no no motor; (b) a obstruo nos
filtros de leo e bicos injetores; (c) a
diluio parcial do combustvel no
lubrificante; (d) o comprometimento
da durabilidade do motor; e (e) um
aumento considervel em seus cus-
tos de manuteno.
Outros autores (Goering e Fry,
1984; Kobmehl e Heinrich, 1998;
Ghassan et al., 2003) demonstraram
que a alta viscosidade e a baixa
volatilidade dos leos vegetais in
natura podem provocar srios pro-
blemas ao bom funcionamento do
motor. Dentre os problemas que
geralmente aparecem aps longos
perodos de utilizao, destacam-se
a formao de depsitos de carbono
por combusto incompleta, a dimi-
nuio da eficincia de lubrificao
do leo pela ocorrncia de polime-
rizao (no caso de leos poli-insa-
turados) e a atomizao ineficiente
e/ou entupimento dos sistemas de
injeo (Peterson et al., 1983; Pryde,
1983; Ma e Hanna, 1999).
Para resolver as desconformi-
dades descritas acima, houve um
considervel investimento na adap-
tao dos motores para que o uso
de leos vegetais in natura pudes-
se ser viabilizado, particularmente
na produo de energia eltrica em
geradores movidos por motores es-
tacionrios de grande porte. Nesses
casos, o regime de operao do
motor constante e isso facilita o
ajuste dos parmetros para garantir
uma combusto eficiente do leo
vegetal, podendo ser utilizada, in-
clusive, uma etapa de pr-aqueci-
mento (pr-cmaras) para diminuir
a sua viscosidade e facilitar a inje-
o na cmara de combusto. No
entanto, para motores em que o
regime de funcionamento vari-
vel (e.g., no setor de transportes),
foi necessrio desenvolver uma me-
todologia de transformao qumi-
ca do leo para que suas proprieda-
des se tornassem mais adequadas
ao seu uso como combustvel. As-
sim, em meados da dcada de 70,
surgiram as primeiras propostas de
modificao de leos vegetais atra-
vs da reao de transesterificao
(Figura 1), cujos objetivos eram os
de melhorar a sua qualidade de
ignio, reduzir o seu ponto de
Figura 1. Reao de transesterificao de leos vegetais e/ou gorduras animais.
Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
fluidez, e ajustar os seus ndices de
viscosidade e densidade especfica
(Shay, 1993, Stournas et al., 1995;
Ma e Hanna, 1999).
3 - O biodiesel como
alternativa para a matriz
energtica nacional
Por definio, biodiesel um
substituto natural do diesel de pe-
trleo, que pode ser produzido a
partir de fontes renovveis como
leos vegetais, gorduras animais e
leos utilizados para coco de ali-
mentos (fritura). Quimicamente,
definido como ster monoalqulico
de cidos graxos derivados de
lipdeos de ocorrncia natural e
pode ser produzido, juntamente com
a glicerina, atravs da reao de
triacilgliceris (ou triglicerdeos)
com etanol ou metanol, na presen-
a de um catalisador cido ou bsi-
co (Schuchardt et al., 1998; Zagonel
e Ramos, 2001; Ramos, 1999, 2003).
Embora essa tenha sido a definio
mais amplamente aceita desde os
primeiros trabalhos relacionados
com o tema, alguns autores prefe-
rem generalizar o termo e associ-
lo a qualquer tipo de ao que
promova a substituio do diesel
na matriz energtica mundial, como
nos casos do uso de: (a) leos
vegetais in natura, quer puros ou
em mistura; (b) bioleos, produzi-
dos pela converso cataltica de
leos vegetais (pirlise); e (c) mi-
croemulses, que envolvem a inje-
o simultnea de dois ou mais
combustveis, geralmente
imiscveis, na cmara de combus-
to de motores do ciclo diesel (Ma
e Hanna, 1999). Portanto, impor-
tante frisar que, para os objetivos
deste artigo, biodiesel to-somente
definido como o produto da tran-
sesterificao de leos vegetais que
atende aos parmetros fixados pe-
las normas ASTM D6751 (American
Standard Testing Methods, 2003) e
29
 DIN 14214 (Deutsches Institut fr
Normung, 2003), ou pela Portaria
no 255 da ANP (Agncia Nacional
do Petrleo, 2003) que, apesar de
provisria, j estabelece as especi-
ficaes que sero exigidas para
que esse produto seja aceito no
mercado brasileiro. A grande com-
patibilidade do biodiesel com o
diesel convencional o caracteriza
como uma alternativa capaz de aten-
der maior parte da frota de vecu-
los a diesel j existente no merca-
do, sem qualquer necessidade de
investimentos tecnolgicos no de-
senvolvimento dos motores. Por
outro lado, o uso de outros com-
bustveis limpos, como o leo in
natura, as microemulses, o gs
natural ou o biogs requerem uma
adaptao considervel para que o
desempenho exigido pelos moto-
res seja mantido (Laurindo, 2003).
Do ponto de vista econmico, a
viabilidade do biodiesel est relacio-
nada com o estabelecimento de um
equilbrio favorvel na balana co-
mercial brasileira, visto que o diesel
o derivado de petrleo mais consu-
mido no Brasil, e que uma frao
crescente desse produto vem sendo
importada anualmente (Nogueira e
Pikman, 2002).
Em termos ambientais, a ado-
o do biodiesel, mesmo que de
forma progressiva, ou seja, em adi-
es de 2% a 5% no diesel de
petrleo (Ministrio da Cincia e
Tecnologia, 2002), resultar em uma
reduo significativa no padro de
emisses de materiais particulados,
xidos de enxofre e gases que con-
tribuem para o efeito estufa
(Mittelbach et al., 1985). Sendo as-
sim, sua difuso, em longo prazo,
proporcionar maiores expectati-
vas de vida populao e, como
conseqncia, um declnio nos gas-
tos com sade pblica, possibili-
tando o redirecionamento de ver-
bas para outros setores, como edu-
cao e previdncia. Cabe aqui ain-
da ressaltar que a adio de biodiesel
ao petrodiesel, em termos gerais,
melhora as caractersticas do com-
bustvel fssil, pois possibilita a
reduo dos nveis de rudo e me-
lhora a eficincia da combusto
pelo aumento do nmero de cetano
(Gallo, 2003).
Em diversos pases, o biodiesel
j uma realidade. Na Alemanha,
por exemplo, existe uma frota signi-
ficativa de veculos leves, coletivos
e de carga, que utilizam biodiesel
derivado de plantaes especficas
para fins energticos e distribudo
por mais de 1.000 postos de abaste-
cimento. Outros pases tambm tm
desenvolvido os seus programas na-
cionais de biodiesel e, como conse-
qncia, o consumo europeu de bi-
odiesel aumentou em 200.000 ton.
entre os anos de 1998 e 2000. J nos
Estados Unidos, leis aprovadas nos
estados de Minnesotta e na Carolina
do Norte determinaram que, a partir
de 1/1/2002, todo o diesel consu-
mido deveria ter a incorporao de,
pelo menos, 2% de biodiesel em
base volumtrica.
No Brasil, desde as iniciativas
realizadas na dcada de 80, pouco se
investiu nesse importante setor da
economia, mas a reincidncia de tur-
bulncias no mercado internacional
do petrleo, aliada s presses que o
setor automotivo vem sofrendo dos
rgos ambientais, fez com que o
Governo atual iniciasse um novo tra-
balho com vistas utilizar leos ve-
getais transesterificados na matriz
energtica nacional. Esse trabalho foi
recentemente materializado na for-
ma de um programa nacional,
intitulado PROBIODIESEL (Portaria
no. 702 do MCT, de 30 de outubro de
2002), cujo lanamento solene foi
realizado em Curitiba durante a ceri-
mnia de abertura do Seminrio In-
ternacional de Biodiesel (24 a 26 de
outubro, Blue Tree Towers Hotel).
Naquela mesma ocasio, foi tambm
divulgada a criao do CERBIO, Cen-
tro Nacional de Referncia em Bio-
combustveis, nas dependncias do
Tecpar, em Curitiba. A misso do
CERBIO ser a de desenvolver o
conceito de biocombustveis em sua
plenitude, desde a certificao de
produtos at o desenvolvimento tec-
nolgico de novas rotas que contri-
buam para o aumento da viabilidade
e competitividade tcnica do biodiesel
nacional.
Ao longo dos ltimos anos, o
PROBIODIESEL vem se desenvol-
vendo por meio de aes integradas
entre instituies de tecnologia, en-
sino e pesquisa, e empresas e asso-
ciaes direta ou indiretamente liga-
das ao tema, sob a forma de grupos
de trabalho que integram a chamada
Rede Brasileira de Biodiesel. Esse
programa tem como principal obje-
tivo promover o desenvolvimento
das tecnologias de produo e ava-
liar a viabilidade e a competitividade
tcnica, scio-ambiental e econmi-
ca do biodiesel para os mercados
interno e externo, bem como de sua
produo e distribuio espacial nas
diferentes regies do pas (Andrade,
2003; Ministrio da Cincia e Tecno-
logia, 2002).

Tabela 1. Nmero de iodo e composio qumica em cidos graxos de alguns dos principais leos vegetais
e gorduras animais disponveis para a produo de biodiesel (adaptado de Alsberg e Taylor, 1928).
Nmero Principais cidos Graxos
Fonte
de I odo Lurico Mirstico Palmtico Esterico Olico Linolico Linolnico
Sebo bovino 38-46 - 2,0 29,0 24,5 44,5 - -
Banha (sunos) 46-70 - - 24,6 15,0 50,4 10,0 -
Cco 8,10 45,0 20,0 5,0 3,0 6,0 - -
Oliva 79-88 - - 14,6 - 75,4 10,0 -
Amendoin 83-100 - - 8,5 6,0 51,6 26,0 -
Algodo 108-110 - - 23,4 - 31,6 45,0 -
Milho 111-130 - - 6,0 2,0 44,0 48,0 -
Flax 173-201 - 3,0 6,0 - - 74,0 17,0
Soja 137-143 - - 11,0 2,0 20,0 64,0 3,0

30 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003

 4 - Principais matrias-
primas para a produo de
biodiesel
De uma forma geral, pode-se
afirmar que monoalquil-steres de
cidos graxos podem ser produzi-
dos a partir de qualquer tipo de
leo vegetal (Tabela 1), mas nem
todo leo vegetal pode (ou deve)
ser utilizado como matria-prima
para a produo de biodiesel. Isso
porque alguns leos vegetais apre-
sentam propriedades no ideais,
como alta viscosidade ou alto n-
mero de iodo, que so transferidas
para o biocombustvel e que o tor-
nam inadequado para uso direto
em motores do ciclo diesel. Portan-
to, a viabilidade de cada matria-
prima depender de suas respecti-
vas competitividades tcnica, eco-
nmica e scio-ambiental, e pas-
sam, inclusive, por importantes as-
pectos agronmicos, tais como: (a)
o teor em leos vegetais; (b) a
produtividade por unidade de rea;
(c) o equilbrio agronmico e de-
mais aspectos relacionados com o
ciclo de vida da planta; (d) a aten-
o a diferentes sistemas produti-
vos; (e) o ciclo da planta (sazonali-
dade); e (f) sua adaptao territorial,
que deve ser to ampla quanto
possvel, atendendo a diferentes
condies edafoclimticas (Ramos,
1999, 2003).
Dada a grandeza do agrone-
gcio da soja no mercado brasilei-
ro, relativamente fcil e imediado
reconhecer que essa oleaginosa
apresenta o maior potencial para
servir de modelo para o desenvol-
vimento de um programa nacional
de biodiesel. Apenas como exem-
plo, dados divulgados pela Abiove
(Associao Brasileira dos Produ-
tores de leos Vegetais) demons-
tram que o setor produtivo da soja
j est preparado para atender
demanda nacional de misturar at
5% de biodiesel no diesel de petr-
leo, sendo que propores superi-
ores a esta mereceriam uma nova
avaliao para que no haja dvi-
das quanto ao abastecimento de
leo a esse novo setor da econo-
mia. Por outro lado, segundo da-
dos oficiais da Embrapa (Peres e
Junior, 2003), o Brasil apresenta
um potencial de 90 milhes de
hectares disponveis, em reas de-
gradadas e/ou no exploradas, para
a expanso da atual fronteira agr-
cola. Considerando-se apenas a uti-
lizao da soja como matria-pri-
ma para a produo de biodiesel,
sero necessrios apenas 3 milhes
de hectares, ou 1,8 bilhes de li-
tros de leo, para a implementa-
o do B5 (mistura composta de
5% de biodiesel e 95% do petrodi-
esel), o que culminaria na gerao
de cerca de 234 mil empregos dire-
tos e indiretos.
Alm da soja, vrias outras olea-
ginosas (e.g., Tabela 1), que ainda
se encontram em fase de avaliao
e desenvolvimento de suas cadeias
produtivas, podem ser empregadas
para a produo do biodiesel (Pa-
rente, 2003). A regio norte, por
exemplo, apresenta potencial para
uso de dend, babau e soja; a
regio nordeste, de babau, soja,
mamona, dend, algodo e coco; a
regio centro-oeste, de soja,
mamona, algodo, girassol, dend
e gordura animal; a regio sul, de
soja, colza, girassol e algodo; e a
regio sudeste, de soja, mamona,
algodo e girassol (Campos, 2003;
Peres e Junior, 2003). Vrias dessas
oleaginosas j tiveram as suas res-
pectivas competitividades tcnica e
scio-ambiental demonstradas para
a produo de biodiesel, restando,
na maioria dos casos, um estudo
agronmico mais aprofundado que
ratifique os estudos de viabilidade.
Deve-se ainda destacar que a
insero do biodiesel na matriz ener-
gtica nacional representa um po-
deroso elemento de sinergia para
com o agronegcio da cana, cujo
efeito ser extremamente benfico
para a economia nacional (Ramos,
1999, 2003). A produo de etanol
expressiva em, praticamente, to-
das as regies do pas, e o novo
programa somente ter a contribuir
para o aumento da competitividade
do setor, valendo-se, inclusive, da
rede de distribuio j existente e
do excelente desempenho das tec-
nologias desenvolvidas para a ca-
Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
deia produtiva da cana (Campos,
2003). Nesse contexto, o Brasil se
encontra em uma condio que pas
algum jamais esteve na histria do
mundo globalizado. Com a eviden-
te decadncia das fontes fsseis,
nenhuma outra regio tropical tem
porte e condies to favorveis
para assumir a posio de um dos
principais fornecedores de biocom-
bustveis e tecnologias limpas para
o sculo XXI (Vidal, 2000).
5 - O processo de produo
de biodiesel por catlise
homognea em meio
alcalino
A transesterificao de leos ve-
getais ou gordura animal, tambm
denominada de alcolise, pode ser
conduzida por uma variedade de ro-
tas tecnolgicas em que diferentes
tipos de catalisadores podem ser em-
pregados, como bases inorgnicas
(hidrxidos de sdio e potssio e
bases de Lewis), cidos minerais (ci-
do sulfrico), resinas de troca inica
(resinas catinicas fortemente cidas),
argilominerais ativados, hidrxidos
duplos lamelares, supercidos,
superbases e enzimas lipolticas
(lipases) (Schuchardt et al., 1998; Ra-
mos, 2003). No h dvidas de que
algumas dessas rotas tecnolgicas,
particularmente aquelas que empre-
gam catalisadores heterogneos, apre-
sentam vantagens interessantes como
a obteno de uma frao glicernica
mais pura, que no exija grandes
investimentos de capital para atingir
um bom padro de mercado. Porm,
tambm correta a afirmao de que
a catlise homognea em meio alcali-
no ainda prevalece como a opo
mais imediata e economicamente vi-
vel para a transesterificao de leos
vegetais (Zagonel e Ramos, 2001; Ra-
mos, 2003). Um fluxograma simplifi-
cado do processo de produo de
biodiesel, utilizando a transesterifica-
o etlica em meio alcalino como
modelo, encontra-se apresentado na
Figura 2.
Seja qual for a rota tecnolgica
escolhida, a transesterificao de
leos vegetais corresponde a uma
reao reversvel, cuja cintica
31

Figura 2. Fluxograma simplificado de produo de steres etlicos a partir de leos
vegetais e gordura animal.
regida pelo princpio enunciado em
1888 pelo qumico francs Henry-
Louis Le Chatelier (1850-1936) (Fi-
gura 1). Portanto, o rendimento da
reao depender do deslocamen-
to do equilbrio qumico em favor
dos steres, atravs da otimizao
de fatores, tais como a temperatura
de reao, a concentrao e carter
cido-base do catalisador, bem
como o excesso estequiomtrico
do agente de transesterificao (l-
cool). Porm, converses totais se-
ro literalmente impraticveis em
uma nica etapa reacional, pois,
alm de reversvel, tem-se a ocor-
rncia de reaes secundrias como
a saponificao. Para limitar a pre-
sena de triacilgliceris no reagi-
dos alm dos limites tolerados pelo
motor, muitos processos recorrem
32 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
conduo da reao em duas eta-
pas seqenciais, que garantam ta-
xas de converso superiores a 98%.
Por outro lado, a eliminao de
sabes, catalisador residual e
glicerol livre somente possvel
atravs de etapas eficientes de la-
vagem.
De acordo com a literatura, a
reao de obteno do ster metlico
exige um excesso estequiomtrico de
metanol igual a 100% (razo molar
lcool:leo de 6:1), e uma quantidade
de catalisador alcalino equivalente a
0,5% a 1,0% em relao massa de
leo, para que sejam obtidos rendi-
mentos superiores a 95% (Freedman
et al., 1986). No entanto, duas obser-
vaes limitam a simples aplicao de
uma recomendao como esta: (a)
primeiramente, a matria-prima a ser
utilizada em cada regio diferente e
isso implica na necessidade de estu-
dos localizados, que permitam uma
otimizao realstica ligada a avalia-
es confiveis de toda a cadeia pro-
dutiva; e (b) as condies utilizadas
para a reao de metanlise no po-
dem ser transferidas para situaes
em que outros lcoois, como o etanol,
sirvam de modelo. Com efeito, a tran-
sesterificao com metanol tecnica-
mente mais vivel do que a com
etanol comercial, porque a gua exis-
tente no etanol (4%-6%) retarda a
reao. O uso de etanol anidro efeti-
vamente minimiza esse inconvenien-
te (Figura 2), embora no implique
soluo para o problema inerente
separao da glicerina do meio de
reao que, no caso da sntese do
ster metlico, indiscutivelmente
muito mais facilitada (Freedman et al.,
1986; Schuchardt et al., 1998; Ramos,
1999). No entanto, basta um ajuste nas
condies de reao para que a sepa-
rao de fases acontea espontanea-
mente, sendo que a eficincia do
processo de decantao (da frao
glicernica) pode ser acelerada pelo
uso de centrfugas contnuas, auxilia-
das ou no pela adio de compostos
tensoativos (Ramos, 2003).
O processo de produo de bi-
odiesel deve reduzir ao mximo a
presena de contaminaes no pro-
duto, como glicerina livre e ligada,
sabes ou gua (Figura 2). No caso
da glicerina, reaes de desidrata-
o que ocorrem durante a combus-
to podem gerar acrolena, um
poluente atmosfrico muito perigo-
so, que pode, devido a sua
reatividade, envolver-se em reaes
de condensao, que acarretam um
aumento na ocorrncia de depsitos
de carbono no motor (Mittelbach et
al., 1985). Sabes e cidos graxos
livres acarretam a degradao de
componentes do motor, e a umida-
de, desde que acima de um limite
tolervel, pode interferir na acidez
do ster por motivar a sua hidrlise
sob condies no ideais de estoca-
gem. Por essas e outras razes,
imprescindvel que sejam definidas
especificaes rgidas para o biodi-
esel, de forma que o sucesso do
programa no venha a ser compro-
metido por ocorrncias associadas
ao mau controle de qualidade do
produto.
Independentemente da rota
tecnolgica, a aceitao do biodie-
sel no mercado precisa ser assegu-
rada e, para isso, indispensvel
que esse produto esteja dentro das
especificaes internacionalmente
aceitas para o seu uso. No Brasil,
esses parmetros de qualidade en-
contram-se pr-fixados pela Porta-
ria n o. 255 da ANP, cuja proposta foi
baseada em normas j existentes na
Alemanha (DIN) e nos Estados Uni-
dos (ASTM). Tais caractersticas e/
ou propriedades, determinantes dos
padres de identidade e qualidade
do biodiesel, incluem ponto de ful-
gor, teor de gua e sedimentos,
viscosidade, cinzas, teor de enxo-
fre, corrosividade ao cobre, nme-
ro de cetano, ponto de nvoa, res-
duo de carbono, nmero de acidez,
curva de destilao (ou a tempera-
tura necessria para a recuperao
de 90% do destilado), estabilidade
oxidao, teor de glicerina livre e
total, cor e aspecto (Agncia Naci-
onal do Petrleo, 2003). Dentre
esses parmetros, alguns tm mere-
cido crticas da comunidade cient-
fica por no apresentarem aplica-
o direta ao biodiesel, como o
ndice de corrosividade ao cobre e
a curva de destilao. Por essa ra-
zo, a especificao definida pela
portaria ainda provisional e pode-
r ser modificada em funo de
novas argumentaes e dados ex-
perimentais gerados pela comuni-
dade cientfica.
Um aspecto extremamente im-
portante da Portaria no 255 da ANP
est relacionado com as limitaes
que oferece para o aproveitamento
de todos os leos vegetais que se
encontram disponveis no territrio
nacional. No entanto, importante
esclarecer que a especificao defi-
ne a qualidade do produto a ser
utilizado puro, ou seja, sem a sua
diluio com diesel de petrleo.
Por outro lado, se a concepo do
programa nacional a de facultar o
uso de misturas dos tipos de B2 a
B20, restringindo o uso de B100
apenas a situaes especiais (como
na gerao de energia eltrica em
grupo-geradores), talvez fosse ade-
quada (e possvel) a flexibilizao
das especificaes com vistas a uma
maior insero das diferentes olea-
ginosas que compem o conjunto
de alternativas regionais de nosso
territrio. Essa flexibilizao esta-
ria, portanto, restrita somente ao
uso do biodiesel em misturas, va-
lendo-se do fator de diluio que a
razo volumtrica definida pela
mistura proporciona (Ramos, 2003).
Vale ressaltar que a adio de um
biodiesel de qualidade ao diesel,
at um limite de 20% (B20), no
modifica drasticamente as suas pro-
priedades e no o desqualifica pe-
rante a Portaria no. 310 da ANP, cujo
contedo estabelece as especifica-
es para comercializao de leo
diesel automotivo em todo o terri-
trio nacional. Obviamente, tal hi-
ptese precisa ser estudada em to-
das as suas implicaes, pois preci-
sam ser dadas garantias para que a
credibilidade do programa no so-
fra o impacto de serem considera-
das experincias mal sucedidas
possveis falhas no funcionamento
do motor e o subseqente aumento
nos seus custos de manuteno.
Da mesma forma como foram
definidos alguns aspectos agron-
micos essenciais para que um deter-
minado leo vegetal apresente com-
petitividade como matria-prima
para a produo de biodiesel, im-
portantes aspectos tecnolgicos tam-
bm precisam ser atendidos e estes
esto relacionados: (a) complexi-
dade exigida para o processo de
extrao e tratamento do leo; (b)
presena de componentes indesej-
veis no leo, como o caso dos
fosfolipdeos presentes no leo de
soja; (c) ao teor de cidos graxos
poli-insaturados; (d) ao tipo e teor
de cidos graxos saturados; e (e) ao
valor agregado dos co-produtos,
como hormnios vegetais, vitami-
nas, anti-oxidantes, protena e fibras
de alto valor comercial.
Diferentes oleaginosas apre-
sentam diferentes teores em leos
vegetais (Tabela 1) e a complexida-
de exigida para a extrao do leo
pode contribuir negativamente para
Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
a viabilidade do processo (Alsberg
e Taylor, 1928). Oleaginosas de
baixo teor de leo, como a soja,
exigem procedimentos de extrao
caros e relativamente complexos
que praticamente restringem a via-
bilidade dessa matria-prima que-
las regies em que j exista uma
razovel capacidade instalada para
o esmagamento de gros. Porm,
oleaginosas de maior teor em leos
vegetais, cujos processos de extra-
o sejam mais simplificados, cer-
tamente apresentaro melhor com-
petitividade econmica por no exi-
girem a instalao de operaes
unitrias complexas para esse obje-
tivo. Por outro lado, a qualidade do
leo poder exigir uma etapa de
refino para que tambm a qualida-
de no produto final seja garantida.
Esse certamente o caso da soja,
que depende do refino para reduzir
a presena de gomas e fosfolipde-
os no biodiesel. Mais uma vez,
provvel que essa observao te-
nha pouco significado para regies
onde a agroindstria da soja esteja
verticalizada ao leo refinado, mas,
onde no haja esse potencial
agroindustrial, seria desejvel que
as matrias-primas selecionadas
para a produo no apresentas-
sem tal limitao e pudessem sofrer
a alcolise sem exigir a implanta-
o de uma unidade de refino. H
evidncias de que alguns leos ve-
getais podem oferecer essa vanta-
gem, como os de girassol e de
vrias espcies de palmceas (le-
os laurlicos).
O tipo e o teor de cidos graxos
presentes no leo vegetal (Tabela
1) tm um efeito marcante sobre a
estabilidade do biodiesel diante do
armazenamento e da oxidao. Por
exemplo, quedas bruscas na tem-
peratura ambiente promovem o au-
mento da viscosidade e a cristaliza-
o de steres graxos saturados
que, eventualmente, podem causar
o entupimento de filtros de leo e
sistemas de injeo. A tendncia
solidificao do combustvel
medida atravs dos pontos de n-
voa e de fluidez (ou de entupimen-
to), que devem ser tanto mais baixo
quanto possvel. Abaixamentos no
33
 ponto de fluidez, muitas vezes mo-
tivados pela aditivao de inibido-
res de cristalizao (Stournas et
al., 1995; Ramos, 2003), represen-
tam menores restries do biocom-
bustvel variaes de temperatu-
ra, evitando problemas de estoca-
gem e de utilizao em regies
mais frias. Obviamente, esse pro-
blema no exclusivo do biodiesel,
pois o diesel de petrleo contm
parafinas que apresentam tipica-
mente o mesmo comportamento.
A formao de depsitos por
precipitao tambm ocorre em fun-
o do envelhecimento e/ou oxida-
o do biodiesel. Testes realizados
pela Bosch (Dabague, 2003), em
parceria com a ANFAVEA (Associa-
o Nacional dos Fabricantes de
Veculos Automotores), AEA (Asso-
ciao Brasileira de Engenharia
Automotiva) e Sindipeas (Sindica-
to Nacional da Indstria de Compo-
nentes para Veculos Automotores),
constataram que a degradao
oxidativa do biodiesel gera resinifi-
cao que, por aderncia, constitui
uma das principais causas da for-
mao de depsitos nos equipa-
mentos de injeo. Em decorrncia
desse fenmeno, foi tambm ob-
servada uma queda no desempe-
nho, aumento da susceptibilidade
corroso e diminuio da vida til
dos motores.
O rano oxidativo est direta-
mente relacionado com a presena
de steres monoalqulicos insatura-
dos. Trata-se da reao do oxignio
atmosfrico com as duplas ligaes
desses steres, cuja reatividade au-
menta com o aumento do nmero
de insaturaes na cadeia (Moretto
e Fett, 1989). Assim, por ser relati-
vamente insaturado, o biodiesel de-
rivado do leo de soja muito
susceptvel oxidao. Os cidos
linoleico e linolnico, que, juntos,
correspondem a mais de 61% da
composio desse leo, apresen-
tam, respectivamente, duas e trs
duplas ligaes, que podem reagir
facilmente com o oxignio.
A oxidao de leos insatura-
dos representa um processo relati-
vamente complexo que envolve re-
aes entre radicais livres e oxig-
34 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
nio molecular. Todo esse processo
geralmente resumido em trs eta-
pas, denominadas de iniciao, pro-
pagao e finalizao. O processo
de polimerizao pode ser iniciado
por traos de metais, calor (term-
lise), luz (fotlise) ou radicais
hidroxila e hidroperoxila, gerados
pela ciso homoltica de molculas
de gua expostas radiao
(Kumarathasan et al., 1992).
Os perxidos e hidroperxi-
dos produzidos atravs da reao
de auto-oxidao podem se poli-
merizar com outros radicais e pro-
duzir molculas de elevada massa
molar, sedimentos insolveis, go-
mas e, em alguns casos, pode que-
brar a cadeia do cido graxo oxida-
do, produzindo cidos de cadeias
menores e aldedos (Prankl e
Schindlbauer, 1998). Estudos ante-
riores (Clark et al., 1984; Tao, 1995;
System Lab Services, 1997) consta-
taram que a formao desses cidos
pode estar ligada corroso do
sistema combustvel dos motores
porque, devido alta instabilidade
dos hidroperxidos, eles apresen-
tam forte tendncia a atacar
elastmeros.
A maioria dos trabalhos at en-
to realizados sobre a estabilidade
diante da oxidao do biodiesel re-
ferem-se ao estudo de steres
metlicos (Prankl e Schindlbauer,
1998; Ishido et al., 2001; Pedersen e
Ingermarsson, 1999), visto que a
maioria dos pases que instituram o
uso desse biocombustvel no apre-
senta disponibilidade nem infra-es-
trutura para produzir etanol como o
Brasil. Esses trabalhos tm confir-
mado que, de um modo geral, o
biodiesel de natureza metlica se
oxida aps curtos perodos de esto-
cagem, e que sua inrcia qumica
est diretamente relacionada com
os leos vegetais empregados na
sua produo (Prankl e Schindlbauer,
1998).
Um dos meios mais comumente
utilizados para se inferir sobre a
susceptibilidade de um determina-
do leo oxidao a avaliao de matriz energtica precisa ser incenti-
seu nmero de iodo. O nmero de
iodo revela o nmero de insatura-
es de uma determinada amostra e
esse valor constitui um dos parme-
tros de identidade dos leos vege-
tais. Sendo assim, diferentes tipos
de biodiesel apresentam nmeros
de iodo semelhantes aos dos trigli-
cerdeos de origem. No entanto,
deve-se salientar que, quando o
objetivo avaliar a estabilidade
oxidao de um dado leo, as infor-
maes obtidas atravs desse m-
todo no so adequadas, pois o
nmero de iodo no discrimina que
compostos esto contribuindo para
o valor encontrado. Desse modo,
h leos diferentes com nmeros
de iodo semelhantes, porm, com
estabilidades oxidao considera-
velmente distintas. Para se inferir
previses acerca da estabilidade
oxidao de um dado leo , por-
tanto, necessrio que se conhea a
sua composio percentual em ci-
dos graxos, o que s possvel
atravs do emprego de mtodos
cromatogrficos de anlise.
Somente atravs do conheci-
mento pleno das propriedades que
determinam os padres de identi-
dade e a qualidade do biodiesel
que ser possvel estabelecer pa-
rmetros de controle que garanti-
ro a qualidade do produto a ser
incorporado na matriz energtica
nacional.
6 - Aspectos ambientais
relacionados com o uso do
biodiesel
Sabe-se que o aumento na con-
centrao dos gases causadores do
efeito estufa, como o dixido de
carbono (CO2) e o metano (CH4), tem
acarretado srias mudanas climti-
cas no planeta. Efeitos como o au-
mento da temperatura mdia global,
as alteraes no perfil das precipita-
es pluviomtricas e a elevao do
nvel dos oceanos podero ser catas-
trficos frente contnua tendncia
de aumento da populao mundial
(Peterson e Hustrulid, 1998; Shay,
1993). Nesse sentido, a insero de
combustveis renovveis em nossa
vada para frear as emisses causadas
pelo uso continuado de combust-
veis fsseis.
 Vrios estudos tm demonstra-
do que a substituio do diesel de
petrleo por leos vegetais transes-
terificados reduziria a quantidade
de CO2 introduzida na atmosfera. A
reduo no se daria exatamente na
proporo de 1:1, pois cada litro de
biodiesel libera cerca de 1,1 a 1,2
vezes a quantidade de CO2 liberada
na atmosfera por um litro de diesel
convencional. Todavia, diferente-
mente do combustvel fssil, o CO2
proveniente do biodiesel reciclado
nas reas agricultveis, que geram
uma nova partida de leo vegetal
para um novo ciclo de produo.
Isso acaba proporcionando um ba-
lano muito mais equilibrado entre a
massa de carbono fixada e aquela
presente na atmosfera que, por sua
vez, atua no chamado efeito estufa.
Portanto, uma reduo real no
acmulo de CO2 somente ser pos-
svel com a diminuio do uso de
derivados do petrleo. Para cada
quilograma de diesel no usado, um
equivalente a 3,11 kg de CO2, mais
um adicional de 15% a 20%, referen-
te sua energia de produo, deixa-
r de ser lanado na atmosfera. Foi
tambm estimado que a reduo
mxima na produo de CO2, devi-
do ao uso global de biodiesel, ser
de, aproximadamente, 113-136 bi-
lhes de kg por ano (Peterson e
Hustrulid, 1998).
A utilizao de biodiesel no
transporte rodovirio e urbano ofe-
rece grandes vantagens para o meio
ambiente, tendo em vista que a
emisso de poluentes menor que a
do diesel de petrleo (Masjuk e
Sapuan, 1995; Clark et al., 1984).
Chang et al. (1996) demonstraram
que as emisses de monxido e
dixido de carbono e material
particulado foram inferiores s do
diesel convencional, enquanto que
os nveis de emisses de gases nitro-
genados (NOx) foram ligeiramente
maiores para o biodiesel. Por outro
lado, a ausncia total de enxofre
confere ao biodiesel uma grande
vantagem, pois no h qualquer
emisso dos gases sulfurados (e.g.,
mercaptanas, dixido de enxofre)
normalmente detectados no escape
dos motores movidos a diesel.
Outro aspecto de interesse am-
biental est relacionado com as emis-
ses de compostos sulfurados. Sabe-
se que a reduo do teor de enxofre
no diesel comercial tambm reduz a
viscosidade do produto a nveis no
compatveis com a sua especificao
e que, para corrigir esse problema,
faz-se necessria a incorporao de
aditivos com poder lubrificante. Con-
sumada a obrigatoriedade na redu-
o dos nveis de emisso de com-
postos sulfurados a partir da combus-
to do diesel, a adio de biodiesel
em nveis de at 5% (B5) corrigir
esta deficincia viscosimtrica, que
confere mistura propriedades lubri-
ficantes vantajosas para o motor.
Trabalhos j desenvolvidos no
Brasil na dcada de 80, quando
foram utilizados vrios leos vege-
tais transesterificados, tambm de-
monstraram bons resultados quan-
do utilizados em motores de cami-
nhes e tratores, tanto puros quan-
to em misturas do tipo B30 (Minis-
trio da Indstria e do Comrcio,
1985). Mais recentemente, foram
realizados testes no transporte ur-
bano da cidade de Curitiba com
steres metlicos de leo de soja
(Laurindo, 2003). Cerca de 80 mil
litros de biodiesel foram cedidos
pela American Soybean Association
(EUA) e testados na forma da mis-
tura B20, apresentando resultados
bastante satisfatrios em relao ao
controle. Os testes foram realiza-
dos em 20 nibus de diferentes
marcas durante trs meses conse-
cutivos, no primeiro semestre de
1998; ao final dos trabalhos, os
resultados obtidos mostraram uma
reduo mdia da fumaa emitida
pelos veculos de, no mnimo, 35%
(Laurindo e Bussyguin, 1999).
O carter renovvel do biodiesel
est apoiado no fato de as matrias-
primas utilizadas para a sua produo
serem oriundas de fontes renovveis,
isto , de derivados de prticas agrco-
las, ao contrrio dos derivados de
petrleo. Uma exceo a essa regra
diz respeito utilizao do metanol,
derivado de petrleo, como agente
transesterificante, sendo esta a mat-
ria-prima mais abundantemente utili-
zada na Europa e nos Estados Unidos.
Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
Isso significa que a prtica adotada no
Brasil, isto , a utilizao do etanol,
derivado de biomassa, torna o biodi-
esel um produto que pode ser consi-
derado como verdadeiramente
renovvel (Zagonel, 2000). Assim, por
envolver a participao de vrios seg-
mentos da sociedade, tais como as
cadeias produtivas do etanol e das
oleaginosas, a implementao do bio-
diesel de natureza etlica no mercado
nacional abre oportunidades para gran-
des benefcios sociais decorrentes do
alto ndice de gerao de empregos,
culminando com a valorizao do cam-
po e a promoo do trabalhador rural.
Alm disso, h ainda as demandas por
mo-de-obra qualificada para o pro-
cessamento dos leos vegetais, per-
mitindo a integrao, quando neces-
sria, entre os pequenos produtores e
as grandes empresas (Campos, 2003).
5 - Concluso
A intensidade com que o tema
biodiesel tem sido abordado em reu-
nies polticas, cientficas e tecnol-
gicas tem dado testemunho do inte-
resse com que a sociedade e o setor
produtivo vem encarando essa nova
oportunidade de negcios para o
pas. Com efeito, diante de tantos
benefcios, como a criao de novos
empregos no setor agroindustrial, a
gerao de renda, o fomento ao
cooperativismo, a perspectiva de
contribuio ao equilbrio de nossa
balana comercial e pelos compro-
vados benefcios ao meio ambiente,
pode-se dizer que o biodiesel tem
potencial para constituir um dos prin-
cipais programas sociais do governo
brasileiro, representando fator de
distribuio de renda, incluso soci-
al e apoio agricultura familiar. No
entanto, neste momento em que as
bases do programa nacional esto
sendo ainda definidas, o desenvol-
vimento de projetos de cunho cien-
tfico e tecnolgico, que possam
oferecer maior segurana aos nos-
sos tomadores de deciso, , no
mnino, estrategicamente imprescin-
dvel ao pas.
No que diz respeito evoluo
do programa nacional de biocom-
bustveis, algumas aes governa-
35
 mentais poderiam ser de extrema
importncia para acelerar o atendi-
mento s suas principais metas tec-
nolgicas: (a) instalao de uma
unidade-piloto, desinteressada de
qualquer ganho comercial e prefe-
rencialmente estabelecida em par-
ceria com instituies pblicas de
pesquisa e desenvolvimento, para
auxiliarem nos estudos de viabili-
dade tcnica e econmica do biodi-
esel; (b) estabelecimento das espe-
cificaes a serem exigidas para o
licenciamento do produto (proces-
so j iniciado pela ANP, atravs da
Portaria n o. 255); (c) ampliao
dos testes em frota cativa para diri-
mir quaisquer dvidas que ainda
persistam sobre o desempenho e a
viabilidade do biodiesel, particu-
larmente de natureza etlica, seja
puro ou em misturas do tipo B2 a
B20; e (d) abertura de linhas de
financiamento para o desenvolvi-
mento de novas rotas tecnolgicas,
com vistas a simplificar e/ou a
otimizar o processo, a ampliao
das perspectivas para a utilizao
de seus subprodutos e a diversifica-
o da matria-prima para atender
a vocaes regionais.
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37

Pesquisa
Marcos Barros de Medeiros
Doutor em Entomologia - ESALQ/USP
Professor Adjunto Centro de Formao de
Tecnlogos / UFPB - Campus de Bananeiras.
barros@iwpb.com.br;
ciagra@cft.ufpb.br
Paulo Alves Wanderley
Doutor em Agronomia - FCAV/UNESP,
Professor nvel E do Centro de Formao de
Tecnlogos / UFPB - Campus de Bananeiras
Maria Jos Arajo Wanderley
Doutora em Agronomia - FCAV/UNESP,
Bolsista de Desenvolvimento Cientfico Regional
CNPq, UFPB Departamento de Cincias Bsicas e
Sociais, Campus de Bananeiras
Ilustraes cedidas pelos autores
38 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
Biofertilizantes
Lquidos
Processo trofobitico para proteo de plantas em cultivos orgnicos
1 - Introduo
Nos pases desenvolvidos e em
vrios outros em desenvolvimento,
como o Brasil, os organoclorados fo-
ram proibidos para o uso agrcola.
Porm, essa foi apenas uma medida
isolada, uma vez que tais produtos
circulam hoje por toda a biosfera
(Paschoal, 1995). O uso de produtos
qumicos sem a observao da com-
plexidade de fatores que interagem
nos agroecossistemas tem sido a mai-
or causa de desequilbrio nesses siste-
mas, tais como o desenvolvimento de
resistncia ao pesticida, ressurgimen-
to e desencadeamento de pragas se-
cundrias e quebra de cadeias alimen-
tares a partir da eliminao de seus
inimigos naturais (parasitides e pre-
dadores) (Medeiros, 1998).
At 1945 os caros fitfagos eram
tidos como pragas secundrias da
agricultura. No entanto, o desenvol-
vimento destas espcies nocivas vem
atingindo, cada vez mais, uma eleva-
da significao econmica, ao mes-
mo tempo em que sua lista no pra
de crescer. Antes de 1946, havia
apenas 10 espcies de insetos e car-
rapatos resistentes, todas a produtos
inorgnicos minerais. Em 1969 a re-
sistncia foi confirmada para 424 es-
pcies, sendo 97 de importncia
mdica ou veterinria e 127 de im-
portncia agrcola e florestal e de
produtos armazenados (Paschoal,
1979; Chaboussou 1980). Na dcada
de 90, pelo menos 504 espcies de
insetos e caros foram dadas como
resistentes a pelo menos um pesticida.
Destas, 23 espcies so benficas e
481 so nocivas, sendo 283 de impor-
tncia agrcola e 198 de importncia
mdico-veterinria (Georghiou &
Lagunes-Tejeda, 1991).
Uma nova teoria, hoje ampla-
mente difundida, converge ao expli-
car que, alm destes fatores, estes
desequilbrios tambm esto forte-
mente associados ao estado de
protelise dominante nos tecidos da
planta. Estudos comprovam que pro-
dutos qumicos sintticos, tais como
agrotxicos e fertilizantes minerais
solveis, contm substncias que in-
terferem na proteossntese, provocam
o acmulo de aminocidos livres e
acares redutores nos tecidos da plan-
ta, reduzindo sua resistncia s pragas
e doenas (Alves et al., 2001;
Chaboussou, 1999; Tokeshi, 2002).
Segundo Primavesi (1998), trs
condies so necessrias para que
uma planta seja atacada por pragas e
doenas: 1) a planta deve ser defici-
entemente nutrida, oferecendo algu-
ma substncia utilizvel para o agen-
te; 2) o agente possa se multiplicar
livremente sem controle biolgico, o
que ocorre mais facilmente em
monoculturas; 3) o sistema de auto-
defesa da planta deve estar desequi-
librado, em funo da nutrio e do
uso de agrotxicos. Estes princpios
convergem com os fundamentados
por Francis Chaboussou, ento dire-
tor do Institut National de la
Recherche Agronomique (INRA) na
Frana, que em 1979 formulou a
Teoria da Trofobiose. Segundo essa
teoria, todo processo vital est na
dependncia da satisfao das ne-
cessidades dos organismos vivos,
sejam eles vegetais ou animais. Des-
sa forma, a planta, ou mais precisa-
 tao) ou afetando o seu desenvolvi-
mento e reproduo.

2 - Biofertilizantes lquidos
e sua aplicao na
proteo de plantas

Os biofertilizantes possuem com-

postos bioativos, resultantes da
biodigesto de compostos orgnicos
de origem animal e vegetal. Em seu
contedo so encontradas clulas vi-
vas ou latentes de microrganismos
de metabolismo aerbico, anaerbico
e fermentao (bactrias, leveduras,
Figura 01. Simulao da cintica de crescimento celular e da produo de metablitos algas e fungos filamentosos) e tam-
ao longo da fermentao aerbica do biofertilizante no processo de CLC. Metablitos bm metablitos e quelatos organo-
primrios: (Etapas de anabolismo e catabolismo): Acares, aminocidos, cidos
graxos, protenas, lipdeos, bases nitrogenadas (nucleotdeos e cidos nucleicos),
minerais em soluto aquoso. Segundo
precursores moleculares etc. Metablitos secundrios: (Biossntese de macro- Santos & Akiba (1996), os metablitos
molculas de elevado peso molecular): toxinas, antibiticos, fitoreguladores (IAA so compostos de protenas, enzimas,
e giberelinas), cidos graxos de cadeia longa, fosfolipdeos, polissacardeos, terpenos antibiticos, vitaminas, toxinas,
fenis, polifenois, citoquininas, etc. fenis, steres e cidos, inclusive de
ao fitohormonal produzidos e libe-
mente o rgo vegetal, ser atacado et al., 2002) Os adubos minerais rados pelos microrganismos.
somente quando seu estado bioqu- solveis, especialmente os nitroge- Na citricultura paulista, os bio-
mico, determinado pela natureza e nados, e os agrotxicos orgnicos fertilizantes vm sendo produzidos
pelo teor de substncias nutritivas sintticos, que quando absorvidos pelo mtodo de compostagem lqui-
solveis, corresponder s exigncias pelas plantas e translocados em seu da contnua em piscinas escavadas
trficas (de alimentao) da praga ou interior, so capazes de interferir no solo, revestidas de lona plstica
do patgeno em questo. com a fisiologia vegetal, reduzem a de polietileno, com capacidade de
Estudando-se a relao entre o proteossntese, desencadeando pro- at 50 mil litros. No processo so
estado nutricional de plantas e sua cesso de acmulo de aminocidos utilizados gua no clorada e o
resistncia s doenas constatou-se livres e acares redutores, substn- inoculante base de esterco fresco
que toda circunstncia desfavorvel cias prontamente utilizveis pelas bovino, e posteriormente enriqueci-
ao crescimento celular tende a pro- pragas e agentes fitopatognicos, o do com um composto orgnico nutri-
vocar um acmulo de compostos que foi correlacionado positivamen- tivo. O Microgeo um composto
solveis no utilizados, como a- te com o aumento populacional des- orgnico, com registro no Ministrio
cares e aminocidos, diminuindo a ses organismos (Chaboussou, 1985). da Agricultura e certificado pelo IBD,
resistncia da planta ao ataque de Na agricultura orgnica o uso de preparado base de diversas fontes
pragas e doenas (Dufrenoy, 1936). biofertilizantes lquidos, na forma de orgnicas e inorgnicas, sendo enri-
Comprovou-se mais tarde que a ao fermentados microbianos enriqueci- quecido com rochas modas que con-
dos agrotxicos na planta resulta na dos, tm sido um dos processos mais tm cerca de 48% de silicatos de
inibio da proteossntese, resultan- empregados no manejo trofobitico magnsio, clcio, ferro e outros
do num aumento de caros, pulges de pragas e doenas. Essa estratgia oligoelementos, fundamentais para
e lepidpteros e de doenas baseada no equilbrio nutricional estimulao do metabolismo prim-
(Chaboussou, 1999; Tokeshi, 2002). da planta (trofobiose), onde a resis- rio e secundrio das plantas. Segun-
Espcies de pulges, cochonilhas, tncia gerada pelo melhor equil- do Alves et al. (2001) biofertilizantes
cigarrinhas, cigarras, tripes, outros brio energtico e metablico do ve- obtidos com o Microgeo vm sendo
insetos sugadores e vrias espcies getal (Chaboussou, 1985; Pinheiro & utilizados, em pulverizao sobre as
de caros fitfagos, no so capazes Barreto, 1996). Os biofertilizantes fun- plantas, em mais de 8 milhes de ps
de desdobrar protenas em amino- cionam como promotores de cresci- de laranja no estado de So Paulo.
cidos para serem posteriormente mento (equilbrio nutricional) e como A potncia biolgica de um bio-
recombinados convenincia de elicitores na induo de resistncia fertilizante expressa pela grande
cada um. Por isso, eles dependem sistmica na planta. Alm disso, aju- quantidade de microrganismos ali
de aminocidos livres existentes na dam na proteo da planta contra o existentes, responsveis pela libera-
seiva das plantas ou suco celular e ataque de doenas, por antibiose o de metablitos e antimetablitos,
de microrganismos simbiontes (Bettiol et al, 1998) e contra o ataque entre eles vrios antibiticos e
(Chaboussou, 1980; Panizzi & Parra, de pragas, por ao repelente, hormnios vegetais. Castro et al.
1991; Pinheiro & Barreto, 1996; Gallo fagodeterrente (inibidores de alimen- (1992) e Bettiol et al. (1998) isolaram

Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003 39


Figura 2. Produo de biofertilizantes pelo sistema de compostagem lquida contnua
a cu aberto, em recipientes plsticos.
vrias leveduras e bactrias, desta-
cando Bacillus subitilis, reconhecido
produtor de antibiticos. Atualmente
os biofertilizantes vm sendo aplica-
dos em diversas culturas associadas
com o fungo entomopatognico
Beauveria bassiana, importante ini-
migo natural de pragas.
Os efeitos do biofertilizante no
controle de pragas e doenas de plantas
tm sido bem evidenciados. Efeitos
fungisttico, bacteriosttico e repelente
sobre insetos j foram constatados. San-
tos & Sampaio (1993) verificaram uma
propriedade coloidal do biofertilizante
que provoca a aderncia do inseto
sobre a superfcie do tecido vegetal. Os
autores destacaram tambm o efeito
repelente e deterrente de alimentao
contra pulges e moscas-das-frutas.
Medeiros et al. (2000b) verificaram que
o biofertilizante base de contedo de
rmen bovino e o composto orgnico
Microgeo reduziu a fecundidade, per-
odo de oviposio e longevidade de
fmeas do caro-da-leprose dos citros,
Brevipalpus phoenicis, quando pulveri-
zado em diferentes concentraes. Es-
ses mesmos autores comprovaram que
este biofertilizante agiu sinergicamente
com Bacillus thuringiensis e o fungo B.
bassiana, reduzindo a viabilidade dos
ovos e sobrevivncia de larvas do bi-
cho-furo-dos-citros (Ecdytolopha
aurantiana) (Medeiros et al. 2000c).
40 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
Estudos recentes comprovaram a redu-
o de at 95% da fecundidade do caro
rajado Tetranychus urticae, de hbito
polfago, em concentraes entre 5 e
50% (Medeiros et al., 2000a; Berzaghi et
al., 2001). Tambm verificou-se redu-
o de at 64% da populao do pulgo
Aphis sp., quando utilizado o biofertili-
zante (10%) associado aos inseticidas
Boveril e Metarril, 5 kg/ha, em cultivo
de acerola (Medeiros et al., 2001). Apli-
caes do biofertilizante associadas
calda viosa ou com o Bacillus
thuringiensis reduziram significativa-
mente o ataque da traa (Tuta absoluta)
e a broca pequena (Neoleucocinodes
elegantalis) em tomateiros (Picano et
al., 1999; Nunes & Leal, 2001). Tambm
foi constatado menor severidade de
odio e de cigarrinha verde em plantas
de feijoeiro pulverizadas com diferen-
tes misturas de biofertilizantes (Cunha
et al., 2000). Trabalhos conduzidos por
Medeiros (2002) no Laboratrio de Pa-
tologia e Controle Microbiano de Inse-
tos da ESALQ/USP comprovaram que o
biofertilizante lquido reduziu de modo
crnico e significativamente a fecundi-
dade e o potencial de crescimento po-
pulacional e o tempo de desenvolvi-
mento de descendentes dos caros da
leprose dos citros Brevipalpus phoenicis,
criados sobre plantas tratadas com bio-
fertilizantes. O estudo comprovou que
o biofertilizante testado agiu por conta-
to direto e residual e tambm funcionou
de forma sistmica na planta.
A ao antibitica e induo de
resistncia sistmica da planta so
provavelmente os principais meca-
nismos de ao do biofertilizante
sobre a praga (DAndra & Medeiros,
2002). Os fenmenos podem estar
diretamente associados complexa
e pouco conhecida composio qu-
mica e biolgica dos biofertilizantes.
Compostos metablitos (micro e
macromolculas), tais como enzimas,
antibiticos, vitaminas, toxinas, fenis
e outros volteis, steres e cidos,
inclusive de ao fitohormonal tm
sido identificados nos biofertilizan-
tes (Santos, 1992). Um composto
coloidal, de consistncia mucilagino-
sa (goma) e de composio ainda
no conhecida, foi observado por
Medeiros (2002) causando a imobili-
zao e morte do caro B. phoenicis
sobre a folha devido obstruo de
seu sistema digestivo.
3 - Processos envolvidos na
produo de
biofertilizantes
No existe uma frmula padro
para produo de biofertilizantes.
Receitas variadas vm sendo testadas,
utilizando-se componentes minerais
para o enriquecimento do meio de
cultivo (Santos, 1992; Magro, 1994).
O processo de fermentao
complexo e os microrganismos exis-
tentes passam quatro fases distintas
de crescimento celular: 1) Latncia -
Compreende o perodo de adaptao
dos microrganismos, aps o qual as
clulas do incio fermentao. 2)
Crescimento exponencial Nessa fase
ocorre elevado processo de diviso
celular, com a produo de biomassa
e liberao dos metablitos primri-
os: carboidratos, aminocidos,
lipdeos, nucleotdeos, vitaminas e
protenas e enzimas. 3) Fase estacio-
nria As clulas param de se dividir
e as colnias, aps juntarem-se, inici-
am um processo de diferenciao
celular produzindo metablitos se-
cundrios como forma de defesa (an-
tibiticos, toxinas, fenis, cidos or-
gnicos e outras protenas de cadeia
longa, de alto interesse biotecnolgi-
co). 4) Morte Celular-Esgotadas to-

Figura 3. Detalhes do experimento utilizando-se caros de B. phoenicis criados em
arena, sobre a folha a planta de Canavalia ensiformis. Fonte: Medeiros (2002)
das as reservas de energia, as clulas
comeam a morrer numa velocidade
exponencial.
Cada microrganismo participan-
te degrada alimento para outro, numa
relao de interdependncia mtua e
harmnica e, assim, o processo de
fermentao acaba sendo contnuo,
desde que seja alimentado com meio
nutritivo, o que fundamentou o pro-
cesso de compostagem lquida des-
crito por DAndra & Medeiros (2002).
4 - Produo do
biofertilizante pelo
processo de Compostagem
Lquida Contnua (CLC)
4.1 - Dimensionamento da
Produo
Tanques para compostagem do
biofertilizante podem ser utilizados
para volumes de at 1.000 litros, cai-
xas de fibrocimento ou plsticas. Para
volumes maiores constri-se direta-
mente no solo, piscinas com as di-
menses do volume pretendido, e
com a profundidade mxima de um
metro, as quais so revestidas com
lona plstica. A localizao do tanque
deve ser em rea ensolarada, manten-
do-o descoberto. Para o dimensiona-
mento do volume do tanque, dever
ser considerado um consumo dirio
mximo de 10% de biofertilizante, da
sua capacidade. Exemplo: Para um
consumo dirio de 100 litros de bio-
fertilizante, o tanque dever ter o
volume de 1.000 litros.
4.2- CLC com uso de esterco e
composto orgnico enriquecido
Incio da CLC: Para incio da
produo do biofertilizante, adiciona-
se no tanque o esterco fresco de gado
(inoculante), um composto orgnico
enriquecido com minerais (Ex.:
MICROGEO MCO) e gua (no
clorada). No caso do Microgeo,
pesquisado e desenvolvido pela equi-
pe do Laboratrio de Patologia e Con-
trole Microbiano da ESALQ, o preparo
feito nas seguintes propores:1,0
quilo do composto orgnico / 4,0
litros esterco de gado / 20,0 litros gua
(completando o volume ). Exemplo:
Para a produo de 1.000 litros de
biofertilizante, adiciona-se no tanque
50 quilos do composto, mais 200 litros
de esterco de gado de qualquer ori-
gem, completando com gua o
volume de 1.000 litros do tanque.
Agitar duas vezes ao dia manualmen-
te com um rodo, que tambm permi-
tir determinar a espessura da camada
orgnica (biomassa) depositada no
fundo do tanque, com o objetivo de se
quantificar a reposio do esterco de
Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
gado no processo CLC. Iniciar o uso
do biofertilizante com aproximada-
mente 15 dias, aps a mistura inicial
dos insumos. Manuteno da CLC:
Para manter a compostagem em meio
lquido de forma contnua, contabilizar
diariamente os volumes de biofertili-
zante consumidos repondo no tanque
os insumos nas seguintes propores:
a) Reposio do composto orgnico:
para cada 30,0 a 40,0 litros de biofer-
tilizante usado, repor 1,0 quilo do
composto/inoculante. O intervalo de
reposio poder ser semanal at
mensal, ou seja, intervalos menores
quanto maior o volume de biofertili-
zante utilizado. b) Reposio do ester-
co de gado: adicionar um volume de
esterco de gado (fresco) suficiente
para manter a mesma proporo
biomassa/ gua do incio do proces-
so, sempre quando se verificar com
ajuda do rodo a diminuio da cama-
da orgnica no fundo do tanque. c)
Reposio da gua: est em funo do
volume de biofertilizante consumido,
da evaporao e das chuvas. O volu-
me de gua a ser adicionado dever
ser o suficiente para a manuteno do
nvel inicial do tanque. A freqncia
de reposio poder ser diria, usan-
do-se registro bia ou at mensal,
tambm em funo do volume de
biofertilizante usado. Nos perodos de
chuvas, recomenda-se fechar os tan-
ques de at 1.000 litros nos momentos
de ocorrncia delas. Manter descober-
tos os tanques maiores de 1.000 litros,
retirando para uso posterior o volume
do biofertilizante que eventualmente
poder transbordar, armazenando-o
em tambores. importante sempre
manter as propores de composto
inoculante e esterco de gado, descri-
tas acima, evitando o uso do bioferti-
lizante muito diludo (Microbiol, 2001;
DAndra & Medeiros, 2002).
5 - Recomendaes de uso
Segundo Pinheiro & Barreto
(1996), devido aos elevados efeitos
hormonais e altos teores das substn-
cias sintetizadas, o uso de biofertili-
zantes em pulverizaes foliares nor-
malmente so feitos com diluies
entre 0,1 e 5%. Concentraes maio-
res, entre 20 e 50%, foram utilizadas
por Santos & Akiba (1996) com o
41

Figura 4. Caracterizao de cadveres do caro da leprose dos citros Brevipalpus
phoenicis: (a) control, (b) caro morto por ao de contato do biofertilizante; (c) e (d)
Foco microbiano e vista ventral e doral do gnatosoma e pernas anteriores aderidas
por uma substancia coloidal (goma). Fonte: Medeiros (2002).
biofertilizante Vairo. Porm, em
concentraes muito elevadas, o bi-
ofertilizante pode causar estresse fi-
siolgico na planta retardando seu
crescimento, florao ou frutificao.
Isso se deve provavelmente ao ex-
cessivo desvio metablico para pro-
duo de substncias de defesa. Para
hortalias recomendam-se pulveriza-
es semanais, utilizando entre 0,1 e
3 % de concentrao do biofertilizan-
te, considerando que as plantas so
de ciclo vegetativo curto e possuem
maior velocidade de crescimento, com
demanda constante de nutrientes.
Em fruteiras, pulverizaes entre 1 e
5% do biofertilizante com Microgeo
produziram resultados significativos
na sanidade na cultura. Este bioferti-
lizante tambm vem sendo emprega-
do sobre o solo em concentraes de
at 20%. Este quando aplicado sobre
o mato roado, como input
microbiano, capaz de aumentar a
compostagem laminar, isto direta-
mente no campo, acelerando os pro-
cessos bioqumicos e potencializando
maior atividade microbiana sobre o
solo (DAndra & Medeiros, 2002).
As aplicaes de biofertilizantes
devero ser realizadas durante as
fases de crescimento e/ou produo,
evitando-se no florescimento. Deve-
se dar preferncia pelos dias de chu-
42 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
va ou irrigao e os horrios vesper-
tino ou noturno, evitando-se os per-
odos secos e as horas mais quentes
do dia. Altas concentraes do bio-
fertilizante podem provocar na plan-
ta demanda de gua muito maior
para o seu equilbrio. Mesmo assim,
pulverizaes com o biofertilizante,
na diluio de 1%, nos perodos se-
cos so possveis. Apesar de estarem
sob os efeitos do estresse hdrico, as
plantas estaro recebendo energia
entrpica (no utilizvel pelos inse-
tos) e outros fatores de proteo.
6 - Biofertilizantes,
bioinseticidas e
biorremediao
O aumento da populao e a
maior atividade industrial fizeram com
que o problema da poluio do am-
biente atingisse nveis alarmantes.
Alm de contaminao por detritos
pouco biodegradveis, como plsti-
cos e detergentes, soma-se o proble-
ma dos resduos de industrias e, prin-
cipalmente, dos resduos agroindus-
triais, como a vinhaa ou o vinhoto,
resultante da produo de etanol em
grande escala. Estes problemas po-
dem ser atacados pelo desenvolvi-
mento de linhagens microbianas ca-
pazes de degradar ou assimilar esses
compostos para uso como agentes
de biorremediao.
O processo da biorremediao
consiste na descoberta e procriao
de bactrias capazes de comer os
agrotxicos que ficam por muitos anos
no solo e na gua. Estas bactrias
devoram os componentes qumicos
existentes nos venenos, fazendo com
que o produto perca sua capacidade
de poluir o solo, a gua e at mesmo
o organismo humano. Estas bactrias
tambm no so prejudiciais ao meio
ambiente. Caso os resultados da pes-
quisa sejam confirmados, ser um
grande avano para a preservao do
meio ambiente, pois o uso do veneno
um grande vilo que prejudica o
solo, a gua, os animais e o homem
(Azevedo, 1998). Uma sada promis-
sora para esses problemas seria a
multiplicao em massa desses agen-
tes de biodegradao de agentes qu-
micos, em tanques abertos, adotando-
se a tcnica de cultura em composta-
gem lquida contnua. A produo de
biofertilizantes lquidos, base de
resduos oriundos da agricultura e da
indstria, modificados por microorga-
nismos, geraro substratos teis como
fertilizantes de solo e como bioprote-
tores de plantas para a agricultura.
A partir de compostos ricos em
nutrientes, facilmente acessveis e de
baixo custo operacional, como os
resduos slidos e lquidos oriundos
da agricultura e da indstria, poss-
vel a adio de microrganismos (le-
veduras, bactrias e actinomicetos,
por exemplo) previamente selecio-
nadas, com as condies necessrias
de ecologia nutricional, que promo-
verem o rpido crescimento popula-
cional, resultando em alta produo
de massa microbiana.
Tcnicas sofisticadas, porm com
o mesmo princpio, tm sido utiliza-
das em laboratrios, sob condies
controladas em biofermentadores, na
produo lquida de inseticidas base
de microrganismos entomo patog-
nicos (fungos, vrus, bactrias e
nematides) capazes de controlar as
pragas em nveis aceitveis, econ-
micos e ecolgicos (Alves, 1998).
A preocupao em se gerar alter-
nativas ecolgicas ao problema dos
rejeitos lquidos e slidos na agricultu-
ra, transform-los em insumos de bai-
 xo custo e capazes de serem aplicados
na atividade produtiva primria, em
cultivos orgnicos, representa um gran-
de avano na preservao do meio
ambiente. Contudo, sero necessrios
alguns anos de investigao e desen-
volvimento, para que se produzam
metodologias de elevado alcance soci-
al, e grandes esforos no sentido de se
consolidar o emprego desses proces-
sos bioqumicos como forma de se
promover a sustentabilidade dos ambi-
entes agrcolas.

7 - Referncias
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Pesquisa
Aplicaes da cincia genmica no melhoramento de plantas para as regies de vrzea do sul do Brasil
Paulo Dejalma Zimmer, Dr.
Professor do Departamentode de Fitotecnia
FAEM / UFPel
djzimmer@ufpel.tche.br
Gaspar Malone
Doutorando do Programa de Ps Graduao em
Cincia e Tecnologia de Sementes / FAEM / UFPel
malone@gaspar.com.ar
Fernando Iraj Flix de Carvalho, PhD.
Professor do Departamento de Fitotecnia
FAEM / UFPel
carvalho@ufpel.tche.br
Jos Fernandes Barbosa Neto, PhD.
Professor do Departamento de Plantas de Lavoura
Faculdade de Agronomia / UFRGS
jfbn@ufrgs.br
Antonio Costa de Oliveira, PhD.
Professor do Departamento de Fitotecnia
FAEM / UFPel
acosta@ufpel.tche.br
Ilustraes cedidas pelos autores
Iniciativas
Genmicas
melhoramento ge-
ntico de plantas
tem contribudo de
forma decisiva para
o incremento da
produo mundial
de gros (BORLAUG, 1983). Entre-
tanto, a necessidade e os desafios
para as prximas duas dcadas so
imensos, o ganho gentico para a
produtividade est se reduzindo a
cada ano e j no acompanha mais o
aumento da demanda por alimentos
(BORLAUG, 1997; MANN, 1997 e
1999). Atualmente, grandes esfor-
os esto sendo direcionados no
sentido de elucidar o potencial ge-
ntico das espcies cultivadas,
objetivando incrementar a produti-
vidade e a qualidade. Para o lana-
mento de novos cultivares que aten-
dam demanda crescente por ali-
mentos, os programas de melhora-
mento de plantas necessitam de gran-
des mudanas, principalmente no
que tange estrutura, estratgia e
prpria cincia envolvida (STUBER
et al., 1999; KOORNNEEF & STAM,
2001). Alm do foco na qualidade e
na produtividade, o melhoramento
gentico tambm pode ser direcio-
nado no sentido de aumentar a adap-
tabilidade das espcies. Essa tam-
bm pode ser considerada uma for-
ma de incrementar a produo de
alimentos, pois reas marginais po-
dem ser incorporadas ao sistema
produtivo mediante o desenvolvi-
mento de gentipos adaptados. No
Sul do Brasil, h cerca de 6,8 mi-
lhes de hectares de terras baixas,
Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
caracterizadas por solos hidromrfi-
cos, que tm o seu sistema agrcola
alicerado na pecuria extensiva e
no plantio do arroz irrigado. A ex-
plorao inadequada dessa regio,
possivelmente associada s dificul-
dades operacionais, no tem permi-
tido uma apropriada rotao de cul-
turas nem o requerido tempo de
pousio, o que favorece a infestao
da cultura por espcies daninhas,
principalmente o arroz vermelho. A
degradao das caractersticas fsi-
cas do solo provocada pela intensa
movimentao de mquinas e equi-
pamentos extremamente pesados
tambm impe a necessidade de
pousio (Figura 1).
Dessa forma, extensas reas
esto sendo inviabilizadas a cada
ano, tornando-se, muitas vezes, ex-
tremamente rdua a sua recupera-
o. A busca de alternativas para
compor o sistema agrcola regional
tem motivado iniciativas importan-
tes nas Universidades Federais de
Pelotas e do Rio Grande do Sul
(UFPel e UFRGS) e na Embrapa
Clima Temperado (PORTO et al.,
1998). A incluso de novas cultu-
ras, como a aveia, o milho e o
azevm, no sistema agrcola das
reas de vrzea tem recebido aten-
o especial, porm a simples in-
troduo de gentipos no sufici-
ente para a correo, em funo da
inexistncia de constituies gen-
ticas adaptadas condio de en-
charcamento dos locais. Desse
modo, h uma grande demanda por
iniciativas voltadas para a gerao
45
 de variabilidade gentica, seleo de
constituies genticas adaptadas s
condies do ambiente e aumento da
eficincia dos programas de melho-
ramento de plantas.
Advento das Tcnicas
Moleculares
At a dcada de 70, pouco se
conhecia sobre a organizao do
DNA. A composio dos pequenos
segmentos com funo conhecida,
os genes, era a jia mais desejada
naquela poca. Nos ltimos anos,
com o surgimento das tcnicas
moleculares, e entre elas a tcnica
de clonagem molecular, tornou-se
possvel o isolamento e a purifica-
o de pores genmicas. Esses
avanos contriburam para tornar a
molcula de DNA o foco das princi-
pais investigaes nos ltimos anos.
A clonagem molecular consiste no
isolamento e na multiplicao de
molculas de DNA idnticas, e com-
preende, pelo menos, dois estgios
importantes: primeiro, o fragmento
do DNA de interesse, chamado de
inserto, ligado a uma outra mol-
cula de DNA, denominada vetor,
para formar o que se chama de DNA
recombinante; segundo, a molcu-
la do DNA recombinante introdu-
zida numa clula hospedeira com-
patvel, num processo chamado
transformao bacteriana. A clula
hospedeira que adquiriu a molcu-
la do DNA recombinante passa,
ento, a ser chamada transformante
ou clula transformada. Atualmen-
te, as fronteiras da Tecnologia do
DNA recombinante, principalmen-
te para fins comerciais, parecem ser
ilimitadas. Alm dos reflexos dire-
tos, a tecnologia do DNA recombi-
nante proporcionou avanos em
todas as reas da bioqumica, da
fisiologia e da gentica. Esses avan-
os permitiram a caracterizao, a
identificao e a clonagem de uma
srie de genes de enzimas, que se
tornaram ferramentas decisivas para
o surgimento de tcnicas como a de
marcadores moleculares e de se-
qenciamento de DNA, o que con-
46 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
Figura 1 - Sistema de preparao do solo para plantio de arroz pr-germinado em solos
de vrzea, utilizando mquinas extremamente pesadas em solos inundados. Essa
associao afeta negativamente a estrutura fsica do solo. Cortesia Prof. Silmar Peske.
tribuiu para a elucidao de impor-
tantes vias de biossntese.
No que tange aos desafios para
tornar eficiente o melhoramento de
plantas e para incrementar a produ-
o mundial de gros, vrias ferra-
mentas moleculares podem ser in-
corporadas aos programas de melho-
ramento de plantas com o objetivo de
otimizar a obteno de gentipos
superiores, por exemplo, a transgenia
(YE et al., 2000), a seleo assistida
por marcadores (FRARY et al., 2000),
a mutao induzida (MALUSZYNSKI,
1998) e a genmica (LIU, 1998;
McCOUCH, 2001).
A busca por solues para diver-
sificar o sistema agrcola nas reas de
vrzea do sul do Brasil passa pela
elucidao dos mecanismos fisioge-
nticos envolvidos na tolerncia dos
cereais ao encharcamento. Embora j
tenham sido relatadas (DANTAS et al.,
2001), algumas respostas deficin-
cia de oxignio no solo provocada
pelo excesso de gua (encharcamen-
to), ainda permanecem muitas dvi-
das relacionadas com as interaes
genticas que facultam algumas esp-
cies ou variedades a suportarem solos
com hipoxia decorrente do excesso
de gua. A incorporao de tecnologias
moleculares e a formao de
melhoristas treinados para selecionar
genes podero se refletir em grandes
ganhos de eficincia nos programas
de melhoramento de plantas.
Sintenia e Genomas
Modelos
A sintenia caracterizada pela
conservao na ordem e no conte-
do de genes, ou grupos gnicos,
entre espcies relacionadas. Essa
caracterstica tambm denomina-
da colinearidade, e poder ser alta-
mente informativa para estudos
comparativos de funo, ao e
regulao gnica entre diferentes
genomas (Figura 2). Embora no
seja uma condio estvel, pois a
sintenia pode ser perdida no decor-
rer da evoluo, vrios trabalhos
evidenciam a importncia das regi-
es cromossmicas conservadas
para estudos genticos comparati-
vos (BENNETZEN et al., 1998; GALE
& DEVOS, 1998; DEVOS et al., 1999;
FEUILLET & KELLER, 2002).
A sintenia bastante estudada
na famlia Brassicaceae e na famlia
Gramineae, atualmente denomina-
da Poaceae. Essa famlia constitu-
da por muitas espcies, entre elas
algumas das principais espcies agr-
colas como milho, arroz, trigo, sorgo,
cevada, centeio e aveia (cereais).
Alm das variaes fenotpicas e
genotpicas existentes entre os cere-
ais, h muitas variaes na estrutura
desses genomas. A variao pode
ser no nmero de cromossomos, no
nvel de ploidia e no tamanho do
genoma - estimado em pares de

Figura 2 Sintenia entre os genomas do arroz, milho, cevada e trigo. As informaes
provenientes do genoma menor podem ser utilizadas para guiar aes no sentido de
localizar, mapear e clonar genes em genomas maiores. Os pontos em amarelo
indicam o posicionamento de alguns genes e os nmeros indicam o cromossomo
(Modificado de GALE & DEVOS, 1998).
bases (pb), podendo existir genomas
muito grandes como o genoma do
trigo, com cerca de 16 bilhes de
bases, como tambm pode ocorrer
genomas muito pequenos, como o
caso do do arroz, com cerca de 430
milhes de bases. A estratgia atual
est sendo estudar e caracterizar os
sistemas gnicos em genomas pe-
quenos (arabidopsis e arroz) e, con-
siderando a sintenia existente, infe-
rir sobre os genomas grandes (milho
2 500 Mpb, trigo 16 000 Mpb e
cevada - 4 800 Mpb, por exemplo).
Caractersticas de um
Genoma Modelo
A presena de determinadas ca-
ractersticas numa espcie pode
torn-la altamente atraente para a
cincia. Sob esse enfoque, as carac-
tersticas mais atraentes numa esp-
cie vegetal, as quais podero contri-
buir para que ela se torne um mode-
lo, esto relacionadas com a dura-
o do ciclo, com o nmero de
sementes produzidas, com o tama-
nho do seu genoma, com a capaci-
dade de multiplicao em diferentes
ambientes, com a facilidade de ma-
nipulao da polinizao (direcio-
namento de cruzamentos), com a
capacidade de cultivo in vitro e com
a disponibilidade de informaes j
existentes (banco de dados para a
espcie). Essas caractersticas geral-
mente definem a facilidade de se
obterem resultados, bem como o
seu volume e sua qualidade. A pri-
meira espcie vegetal utilizada como
modelo para estudos genticos foi a
ervilha (Pisum sativum L.), quando
Gregor Mendel publicou os resulta-
dos dos primeiros estudos genti-
cos, no ano de 1865. lgico que
naquela poca Mendel no conside-
rou os critrios utilizados atualmen-
te, mas certamente escolheu a ervi-
lha pela familiaridade que ele tinha
com o cultivo daquela espcie. Em-
bora as leis de Mendel no tenham
sido validadas at o seu redescobri-
mento, no incio do sculo XX, cons-
Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
tituram a base cientfica dos estu-
dos realizados at hoje. Na histria
recente da Biologia de Plantas, uma
outra espcie apresentava muitas
caractersticas atraentes e surgia
como modelo entre as dicotiledne-
as; tratava-se da Arabidopsis
thaliana. Essa espcie vegetal
membro da famlia Brassicaceae, a
qual inclui espcies cultivadas como
o repolho, o rabanete e a canola.
Embora a arabidopsis no possua
importncia agronmica, essa esp-
cie apresenta vantagens importan-
tes para a pesquisa bsica em gen-
tica e biologia molecular. Alm dis-
so, ou como conseqncia disso,
essa espcie possui o maior volume
de informao disponvel dentre to-
dos os vegetais. No entanto, o mo-
delo gentico Arabidopsis thaliana
limitava-se principalmente ao siste-
ma gentico das dicotiledneas,
quando um complemento para as
monocotiledneas comeou a ser
procurado. Nos ltimos anos, est
sendo dispensada muita ateno a
uma outra espcie, o arroz (Oryza
sativa L.), por ele possuir tambm
bons atributos para se tornar um
modelo gentico vegetal. Embora
seu genoma seja pouco maior, cerca
de trs vezes maior que o genoma
de Arabidopsis thaliana L., ainda
assim cerca de 40 vezes menor do
que o genoma do trigo (Triticum
aestivum L.). Entretanto, a estrat-
gia de direcionar os esforos para
tornar o arroz um genoma modelo
est alicerada no interesse de se
obter um modelo entre as gramneas,
principalmente aquelas produtoras
de gros, pois, praticamente, todas
as aes dos programas de melhora-
mento de plantas esto voltadas para
produtividade, resistncia a mols-
tias e adaptabilidade. Outro fator
fundamental no interesse de tornar
o arroz um genoma modelo a
existncia de sintenia ou colineari-
dade entre os genomas dessa fam-
lia. Atividades voltadas para a iden-
tificao e a clonagem de genes com
a utilizao de genomas modelos,
como o arroz, so bem mais eficien-
tes do que em genomas grandes.
47
 Portanto, atualmente a estratgia
mais racional ser estudar o arroz,
identificar, clonar e caracterizar seus
genes e, quando tudo estiver
mensurado, atingir os genomas mais
complexos, como os do trigo e do
milho. Dessa forma, os programas de
melhoramento de plantas podero
aumentar em muito sua eficincia.
A particularidade que o arroz
possui, de ser cultivado sob irrigao
por inundao (vrzeas) e sequeiro
(terras altas), tambm torna essa es-
pcie modelo para o entendimento
dos mecanismos que controlam a adap-
tabilidade das plantas. O Centro de
Genmica e Fitomelhoramento (CGF)
da UFPel est buscando, mediante a
utilizao de tecnologias modernas, o
entendimento do sistema de razes do
arroz (modelo gentico). A identifica-
o de mecanismos morfofisiolgicos
e os respectivos controles genticos
permitiro a identificao e a clonagem
dos genes envolvidos. A sintenia e a
utilizao de ferramentas genmicas
adequadas conduziro rpida utili-
zao desse conhecimento para o de-
senvolvimento e lanamento de
gentipos superiores, de diversas es-
pcies que podero ser adaptadas aos
solos encharcados do sul do Brasil.
Seqenciamento de
Genomas
Os primeiros passos para o se-
qenciamento de DNA foram dados
por Sanger, em 1977, com o desenvol-
vimento do mtodo de seqencia-
mento manual conhecido tambm
como mtodo da cadeia interrompi-
da. Hoje o mtodo de Sanger baseia-
se na amplificao, por PCR, de frag-
mentos de DNA clonados previamen-
te dentro de vetores conhecidos. Des-
sa forma, oligonucleotdeos iniciado-
res (primers), complementares se-
qncia do vetor, so utilizados para
amplificar o inserto do DNA a ser
seqenciado. A metodologia foi cha-
mada de cadeia interrompida em
funo de que so utilizados dNTPs
(deoxi-Nucleotdeos Trifosfatos) mo-
dificados, os ddNTPs (dideoxi-Nucle-
otdeos Trifosfatos), os quais, quando
48 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
Figura 3 Esquema representativo do mtodo de seqenciamento desenvolvido por
Sanger (A) e do mtodo de seqenciamento automatizado (B). Consulte o texto para
conferir os detalhes de cada mtodo.
incorporados pela enzima Taq poli- Na ltima dcada, o surgimento
merase (a enzima que amplifica o dos seqenciadores automticos, ali-
DNA), no permitem a incluso do ado elevada capacidade de proces-
nucleotdeo seguinte por no apre- sar informaes que a informtica
sentarem a hidroxila no carbono 3 da proporcionou, revolucionou a
dideoxi-ribose do nucleotdeo genmica, dando origem a bioinfor-
terminador. Portanto, a sntese da mtica. O seqenciamento automti-
molcula de DNA pra nesse ponto co mantm o mesmo princpio do
(Figura 3). mtodo de seqenciamento manual
Pelo mtodo de Sanger, o pro- proposto por Sanger, mas a possibi-
cesso de seqenciamento realizado lidade de utilizar ddNTPs marcados
em quatro reaes independentes. fluorescentemente com cores distin-
Em cada uma delas adicionado um tas para cada um deles (ddCTP,
ddNTP diferente (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddATP e ddTTP) permitiu
ddGTP e ddTTP), geralmente marca- automatizar o processo (veja Figura
dos radiativamente com 32P. Na cpia 3). Outra grande vantagem do se-
de cada fita de DNA, a partir do qenciamento automtico a incor-
molde, as molculas so sintetizadas porao de metodologias laser e pro-
at que incorporem o nucleotdeo gramas computacionais que fazem a
terminador (ddNTP). O acmulo de leitura dos resultados. As molculas
molculas terminadas numa mesma fluorescentes utilizadas nos ddNTPs,
base possibilita sua visualizao no quando sensibilizadas pelo laser, emi-
gel. A gerao aleatria de molculas tem um comprimento de onda, que
terminadas nas bases distintas de uma capturada por uma cmera acoplada
fita molde de DNA permitir o estabe- ao seqenciador. A informao pro-
lecimento da seqncia de nucleot- cessada e transformada em seqnci-
deos do referido molde. A leitura da as nucleotdicas por softwares ade-
seqncia de bases realizada medi- quados.
ante a separao, num gel de poliacri- Devido baixa capacidade de
lamida de alta resoluo, dos frag- produo proporcionada pelo mto-
mentos amplificados por PCR. Nesse do de Sanger, as primeiras seqncias
tipo de tcnica, possvel identificar nucleotdicas foram geradas para es-
cerca de 200 a 300 nucleotdeos. A tudos pontuais, como o estabeleci-
Figura 3 apresenta um esquema sinte- mento da seqncia de alguns genes
tizado dessa metodologia. e de pequenas regies cromossmi-
 Figura 5 Esquema representativo das principais etapas na gerao de bibliotecas
de seqenciamento. A Para seqenciamento estrutural via construo de biblioteca
BAC (Bacterial Artificial Chromosomes). 1 DNA genmico; 2 Alinhamento de
fragmentos de 100 a 200 kb em mapa fsico (Biblioteca BAC); 3 Fragmentao
individual dos BACs; 4 Subclonagem de fragmentos entre 2 e 5 kb. B Para
seqenciamento de ESTs (Expressed sequence tags) ou do transcriptoma. 1 Extrao
de RNA mensageiro; 2 Sntese reversa utilizando RT-PCR; 3 Sntese de cDNA dupla
fita; 4 Clonagem dos cDNAs.

mada de Iniciativa Genoma da Arabi- a subespcie japonica. Essa associa-

Figura 4 Detalhes de um exemplar de
Arabidopsis thaliana L. cultivado em
laboratrio. Cortesia Dra. M. E. Alvarez.
CIQUIB CONICET, Universidad Nacio-
nal de Crdoba Argentina.
cas. medida que foram desenvolvi-
dos os seqenciadores de nucleotde-
os automatizados, a capacidade de
produo de seqncias foi aumenta-
da muito rapidamente. Em funo
disso, surgiram, mediante a associa-
o de grupos de pesquisa, vrias
iniciativas voltadas para o seqencia-
mento de alguns genomas. Os primei-
ros esforos foram direcionados para
alguns microorganismos e, em segui-
da, para a Arabidopsis thaliana (The
Arabidopsis Genome Initiative*, 2000)
e para a Drosophila melanogaster
(ADAMS et al., 2000), dois organis-
mos utilizados como modelo na biolo-
gia. Na seqncia, apresentaremos o
que j foi realizado com o intuito de
gerar informaes genticas das prin-
cipais espcies, com vistas ao melho-
ramento vegetal.
Arabidopsis thaliana - o
genoma da Arabidopis (125 milhes
de nucleotdeos 125 Mpb) foi
seqenciado por uma associao in-
ternacional de pesquisadores cha-
dopsis (The Arabidopsis Genome
Initiative*, 2000). A seqncia, o mapa
e as anotaes disponveis atualmen-
te so resultado de esforos conjun-
tos do TIGR (The Institute for
Genomic Research), MIPS (Munich
Information Center for Protein
Sequences) e TAIR (The Arabidopsis
Information resource). Veja uma foto
dessa espcie vegetal observando a
Figura 4.
Arroz (Oryza sativa L.) Fo-
ram empregados esforos pblicos e
privados para seqenciar essa esp-
cie. O primeiro esforo privado foi
realizado pela Monsanto (PENNISI,
2000). Mais tarde, os resultados gera-
dos seriam somados aos resultados do
IRGSP (International Rice Genome
Sequencing Project). O segundo es-
foro privado, uma associao entre
duas empresas, a Myriad Genetics e a
Syngenta, utilizou o mtodo whole
genome shotgun, e no acrescentou
resultados significativos ao conjunto
de dados disponibilizados pelos ou-
tros projetos (GOFF et al., 2002).
Foram implementados tambm dois
esforos pblicos para o seqencia-
mento do arroz. O primeiro deles, o
Projeto Internacional de Seqencia-
mento do Genoma do Arroz (IRGSP
International Rice Genome Sequencing
Project), teve como objetivo seqenciar
o teve incio no ano de 1997, em
uma reunio do Simpsio Internacio-
nal de Biologia Molecular de Plantas
realizado em Singapura. Naquela oca-
sio, o objetivo da comunidade cien-
tfica era socorrer o idealizador do
projeto de seqenciamento estrutural
do arroz, o RGP (Rice Genome Project)
do Japo. O segundo esforo pblico
foi liderado pela Academia Chinesa
de Cincias (Chinese Academy of
Sciences) de Beijing, China. Esse pro-
jeto iniciou-se em abril de 2000 e, dois
anos mais tarde, seus resultados fo-
ram publicados pela revista Science
(YU et al., 2002). A grande distino
estabelecida entre as subespcies
seqenciadas por esses dois esforos
pblicos foi em relao importncia
econmica e geogrfica que elas apre-
sentam. A subespcie seqenciada
pelo grupo liderado pelos japoneses,
spp japonica, amplamente cultiva-
da no Japo, nos Estados Unidos, na
Coria do Sul e em parte da China. Por
outro lado, a subespcie seqenciada
pelos chineses, spp indica, bastante
cultivada na China e no Sudeste Asi-
tico, bem como no Sul do Brasil. Alm
disso, as estratgias de seqencia-
mento utilizadas pelos dois grupos
foram distintas; enquanto o grupo dos
chineses focava a anotao de genes,
pois utilizou a estratgia whole genome
shotgun, o grupo liderado pelo RGP

Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003 49

 Figura 6 Detalhes de uma lavoura de Figura 8 - Detalhes de uma lavoura de cevada (Hordeum vulgare), safra 2003, da
arroz irrigado do cultivar BRS 7 Taim. Linhagem CEV 97043 da propriedade do Produtor Adelar Crespi.
Cortesia Prof. Silmar Peske.

depararam-se com duas grandes bar- com a inteno de determinar a

Figura 7 Detalhes de uma lavoura de
trigo (Triticum aestivum). Cortesia Prof.
Silmar Peske.
focou, alm da anotao dos genes, a
gerao de informaes precisas ao
nvel de estruturao e organizao
do genoma, pois utilizou a tcnica de
seqenciamento estrutural via cons-
truo de bibliotecas BAC (Bacterial
Artificial Chromosomes) (Figura 5 A).
Veja uma foto dessa espcie vegetal
observando a Figura 6.
Trigo (Triticum aestivum)
os esforos para determinar a se-
qncia de nucleotdeos do trigo
reiras. A primeira delas se refere ao
tamanho do genoma, que , aproxi-
madamente, de 16 bilhes de nucle-
otdeos (16.000 Mpb) - cerca de 40
vezes maior que o genoma do arroz.
A segunda delas que o seu genoma
diferente do do arroz e da
arabidopsis, ambos diplides, en-
quanto o trigo hexaplide. Esses
impedimentos impuseram uma es-
tratgia preliminar para que fossem
determinadas as seqncias trans-
critas: o transcriptoma (bibliotecas
de cDNA) de diferentes estdios do
desenvolvimento da planta (Figura
5 B) Portanto, considerando a estru-
tura e o tamanho do genoma do
trigo essa ao mais lgica do que
pensar num inexeqvel projeto de
seqenciamento estrutural dessa es-
pcie. De uma forma geral, a estra-
tgia visa a gerar seqncias nucle- O primeiro passo para contornar esse
otdicas dos genes transcritos em impedimento foi a produo de ma-
determinados estdios de desenvol-
vimento ou sob determinados
estresses do ambiente. O esboo de
uma associao internacional volta-
da para a gerao dessas informa-
es comeou a ser definido em
1998, com a criao de uma ao
Internacional Cooperativa para a pro-
duo de ESTs (Expressed Sequence
Tags) de trigo. Atualmente, as aes
posio no mapa dos transcritos so
coordenadas pelo International
Triticeae Mapping Initiative. Os prin-
cipais esforos para a criao de
uma coleo de ESTs representati-
vos do trigo esto sendo liderados
pelos EUA (U. S. Wheat Genome
Project), pelo Canad (AAFC
Agriculture and Agri-Food Canada)
e pela Inglaterra (BBSRC
Biotechnology and Biological
Sciences Research Council). Veja uma
foto dessa espcie vegetal obser-
vando a Figura 7.
Cevada (Hordeum vulgare)
os esforos para determinar a se-
qncia de nucleotdeos da cevada
tambm sofrem impedimentos devi-
do ao tamanho do seu genoma ~ 4,8
bilhes de nucleotdeos (4800 Mpb).
pas fsicos do genoma da cevada com
alta densidade de marcadores; isso
proporcionar a realizao de com-
paraes com o genoma do arroz. O
prximo passo ser a criao do
transcriptoma da espcie. Essas deci-
ses esto sendo implementadas em
um esforo combinado entre cientis-
tas da Amrica do Norte (North
American Barley Genome Mapping

50 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003


Figura 9 Detalhes de uma lavoura de milho (Zea mays) e de espigas maduras
(direita inferior). Cortesia Prof. Silmar Peske.
Project, USA e North American Barley
Genome Mapping Project, Canad) e
da Europa (Plant Genome Resource
Centre, Alemanha e Scottish Crop
Research Institute, Inglaterra), para
criar uma biblioteca de ESTs
(Expressed Sequence Tags) o mais
completa possvel (Figura 5 B). Veja
uma foto dessa espcie vegetal ob-
servando a Figura 8.
Milho (Zea mays) a principal
iniciativa para seqenciamento do
genoma do milho foi anunciada em
setembro de 2002 pelo NFS (National
Science Foundation) dos Estados
Unidos. No entanto, h muito tempo
os geneticistas da rea do milho
buscavam somar esforos com esse
objetivo (BENNETZEN et al., 2001).
Quatro fatores contriburam para que
essa iniciativa fosse retardada at
2002. Primeiro, os avanos na
tecnologia de seqenciamento re-
duziram consideravelmente o custo
em comparao com o passado. Se-
gundo, novas metodologias de
fingerprinting, de alta resoluo e
produo, permitiram aumentar a
eficincia na seleo de clones para
o seqenciamento, reduzindo ao m-
nimo a sobreposio de regies
seqenciadas. Terceiro, foram de-
senvolvidas novas metodologias para
preparar fraes do genoma do mi-
lho ricas em genes (YUAN et al.,
2002). Quarto, anlises comparati-
vas do milho com o arroz (Oryza
sativa) ou Arabidopsis sugerem que
a seqncia do genoma dessas duas
espcies no sero suficientes para
entender detalhadamente o conte-
do de genes do milho e sua expres-
so (BENNETZEN et. al., 2001;
CHANDLER & BRENDEL, 2002).
Alm disso, algumas caractersticas
no genoma do milho sempre dificul-
taram a implementao de projetos
de seqenciamento da espcie. Des-
taca-se a existncia de vrias
subespcies importantes (Zea mays
spp. Huehuetenangensis, Zea mays
spp. mays (mayze), Zea mays spp.
mexicana (teosinto), e Zea mays
spp. Parviglumis); o elevado con-
tedo de DNA repetitivo (regies
duplicadas) presente no genoma do
milho (HELENTJARIS, 1995) e o ta-
manho do seu genoma, cerca de
2500 Mpb.
Da mesma forma que est ocor-
rendo na gerao de seqncias
nucleotdicas da cevada e do trigo, o
foco para o milho tambm ser a
gerao de seqncias dos genes (o
transcriptoma). As interaes do sis-
tema gnico podero ser obtidas em
genomas como o arroz, principal-
mente devido ocorrncia da
sintenia entre os cereais. Veja uma
foto dessa espcie vegetal obser-
vando a Figura 9.
Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
Reflexos da Tecnologia na
Produo de Cereais
Os grandes avanos na produ-
o mundial de gros, gerados a
partir de meados do sculo passado,
so decorrentes de uma contribuio
decisiva do melhoramento clssico
de plantas (BORLAUG, 1983). Ao
contrrio do que alguns entusiastas
esperavam, as grandes expectativas
decorrentes das inovaes cientficas
dos ltimos 30 anos no se refletiram
em significativos incrementos na pro-
duo de gros. Para que as
tecnologias moleculares possam ren-
der os resultados esperados, algu-
mas barreiras precisam ser supera-
das. A principal delas diz respeito
mudana de cultura nos programas
de melhoramento de plantas, sendo
necessrio selecionar genes ao invs
de selecionar plantas (KOORNNEEF
& STAM, 2001). Superadas as barrei-
ras culturais, a eficincia na imple-
mentao de ferramentas molecula-
res em programas de melhoramento
de plantas poder ser incrementada
mediante a automatizao dos pro-
cessos de extrao de DNA, a gera-
o de um maior nmero de seqn-
cias ligadas (marcadores) a caracteres
de importncia agronmica e o bara-
teamento dos equipamentos e
insumos utilizados. O treinamento
de novos melhoristas tambm deve-
r merecer ateno especial, pois,
alm da slida formao em melho-
ramento clssico e em estatstica,
recomendado que esses profissio-
nais sejam treinados em gentica
molecular e tcnicas moleculares
aplicadas ao melhoramento de plan-
tas. Principalmente por que atravs
desses novos profissionais que os
programas de melhoramento clssi-
cos podero incorporar as novas fer-
ramentas da biologia molecular.
O setor de melhoramento de
plantas tambm necessita se articu-
lar para melhorar a capacidade de
processamento das informaes j
disponveis, principalmente aque-
las decorrentes dos diferentes proje-
tos de seqenciamento de genomas.
Atualmente, dois fatores contribu-
51
 em para que as informaes dispo-
nveis no sejam aplicadas rotineira-
mente. A primeira delas que h
carncia de bons sistemas de
informtica capazes de trocar infor-
maes com os bancos de dados
com a agilidade requerida; a segun-
da que poucos profissionais esto
habilitados a realizarem buscas e a
fazerem comparaes de seqnci-
as atravs de computadores.
Buscando alternativas para com-
por o sistema agrcola das vrzeas do
Sul do Brasil, sugerimos a implemen-
tao de ferramentas moleculares e
de bons sistemas de informtica para
os programas de melhoramento lo-
cais. Essas aes devem estar volta-
das para a: i) identificao de genes
de tolerncia a estresses abiticos em
genomas modelo (arroz), com pos-
terior caracterizao em espcies de
interesse (trigo, milho, cevada, sorgo,
aveia e azevm); ii) caracterizao
molecular do germoplasma local; iii)
identificao de genes maiores, res-
ponsveis pela adaptao do arroz
ao encharcamento; e, iv) criao de
um banco de mutantes para o sistema
de razes.
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* A autoria deste trabalho dever ser The Arabidopsis Genome Iniative. Uma lista completa dos colaboradores aparece no final do artigo original
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 Associao de mutaes nos
Pesquisa
genes BRCA1 e BRCA2
Associao de mutaes nos genes BRCA1 e BRCA2 causadoras do cncer de mama hereditrio
Paulo Henrique Machniewicz
Bilogo - Faculdades Integradas Esprrita
Especialista em Gentica Humana PUC-PR,
Responsvel pelos laboratrios de Gentica,
Imunologia e Microbiologia do Centro Universitrio
Campos de Andrade - UniAndrade - Curitiba-PR
paulo.mach@bol.com.br
Fbio Rueda Faucz, Dr
Biologo - UFPR
Mestrado em Cincias Biolgicas - UFPR
Doutorado em Gentica - UFPR
Professor adjunto - PUC-PR
Professor Titular - UNICEMP-PR
fabiogenetica@yahoo.com
Ilustraes cedidas pelos autores
Resumo
Cerca de 10% dos cnceres de
mama podem ser associados a muta-
es na linhagem germinativa. Em
1990, foi identificado, no cromosso-
mo 17, o gene BRCA1, composto de
24 exons e codifica para uma protena
de 1.863 aminocidos. Mutaes nes-
te gene so responsveis por metade
de todos os casos familiares de cncer
de mama. J em 1995, identificaram o
BRCA2, com 27 exons, codificando
para uma protena de 3.350 aminoci-
dos. Este gene encontra-se no cro-
mossomo 13. Mutaes neste gene
so responsveis por cerca de 35%
dos casos familiares precoces de cn-
cer de mama. Estes dois genes, asso-
ciados a outras protenas, desencadei-
am a doena que mais mata mulheres.
No Brasil, registram-se cerca de 35.000
novos casos de cncer de mama por
ano. O cncer representa uma proli-
ferao maligna das clulas ou lbu-
los epiteliais que revestem os ductos
ou lbulos da mama. O cncer femini-
no raramente encontrado antes dos
25 anos de idade, exceto em casos
hereditrios. A transmisso heredit-
ria de cncer de mama segue o clssi-
co padro mendeliano de transmisso
autossmica dominante, com 50% das
crianas de carreadoras, herdando mu-
taes BRCA1. As portadoras femini-
nas de mutaes so estimadas a
terem um risco de 85% de desenvolvi-
mento de cncer de mama e ovrio,
com maior incidncia de cncer bila-
teral e mais de 50% dos cnceres de
mama, ocorrendo, antes dos 50 anos.
A prevalncia de mutaes de BRCA1
e BRCA2 ocasionalmente mais alta
Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
que o esperado, devido transmisso
aumentada de algumas mutaes, em
certas populaes, devido ao efeito
do fundador. A populao de Judeus
Askenazi a que representa um exem-
plo claro de mutaes, devido ao
efeito do fundador, por cultivarem
suas tradies de unio restrita. Por
conseqncia, as mutaes encontra-
das nesta populao so iguais em
inmeros pases para onde migraram.
Outras populaes, como Espanhis,
Indianos, Paquista-neses, Russos e at
tribos Aborgines do Canad, tambm
apresentam algumas mutaes que
so mais freqentes e que podem ser
atribudas ao efeito do fundador.
1. Introduo
O nosso organismo constitudo
por trilhes de clulas, que se repro-
duzem pelo processo de diviso celu-
lar. Este um processo ordenado e
controlado, responsvel pela forma-
o, crescimento e regenerao de
tecidos saudveis do corpo. Algumas
vezes, no entanto, as clulas perdem
a capacidade de limitar e comandar
seu prprio crescimento, passando,
ento, a se multiplicarem muito rapi-
damente e de maneira aleatria e
desordenada, formando ndulos.
O cncer surge por causa de
alteraes no DNA, que resulta na
proliferao incontrolvel de clu-
las. A maioria dessas alteraes en-
volve modificaes seqenciais re-
ais de DNA. Elas podem surgir como
conseqncia de erros de replicao
aleatrios, exposio a carcingenos,
ou processos defeituosos de reparo
do DNA.
53
 As leses da mama limitam-se,
predominantemente, ao sexo femi-
nino por possuir uma estrutura ma-
mria mais complexa, volume ma-
mrio maior e extrema sensibilidade
s influncias endcrinas predis-
pem esse rgo a diversas condi-
es patolgicas (COTRAN, KUMAR,
COLLINS, 2001).
As neoplasias constituem as le-
ses mais importantes da mama fe-
minina, apesar de no serem as mais
comuns. Elas podem surgir a partir
de epitlio escamoso, estruturas glan-
dulares e tecido conjuntivo.
Existem trs grupos de influn-
cias importantes no cncer de mama:
Fatores genticos;
Influncias hormonais;
Fatores ambientais.
No Brasil, registram-se 35.000
novos casos de cncer de mama por
ano, 11.000 deles, s no Estado de So
Paulo. Fatores de risco de cncer na
famlia, alimentao rica em gorduras,
incio precoce da menstruao, me-
nopausa tardia, 1 gestao aps os 30
anos e o fato de a mulher nunca ter
engravidado so alguns dos fatores
que influenciam para desenvolver um
tumor maligno na mama.
O cncer de mama representa
uma proliferao maligna das clu-
las epiteliais que revestem os ductos
ou lbulos da mama. considerado
o mais comum em mulheres, poden-
do existir por um longo perodo,
como doena no-invasiva ou
invasiva, mas no-metstica. Este
fato torna-se mais urgente a necessi-
dade do diagnstico precoce e da
conduta apropriada.
Cerca de 10% dos cnceres de
mama podem ser associados a muta-
es na linhagem germinativa. Esta
rea tem sofrido uma elevao not-
vel com a identificao de genes
responsveis por casos em famlias
(BATES, HOCKELMAN, 1982 ).
KING, et al. (1990), usou anlise
gentica de ligao para identificar o
gene BRCA1 localizado no cromos-
somo 17q21. Ele responsvel por
aproximadamente metade de todos
os casos familiares precoces de cn-
cer de mama, bem como pela maioria
dos casos familiares de cncer de
mama e ovrio.
54 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
SCHUTTE, et al. (1995), identifi-
cou um gene na regio 13q12-q13,
com seis mutaes diferentes em fam-
lias com cncer de mama e identificou
como BRCA2. Mutaes nesse gene
so responsveis por aproximadamente
35% dos casos familiares precoces de
cncer de mama. Esto ainda associa-
dos a um risco aumentado de cncer de
mama e de prstata em homens, e de
cncer ovariano e pancretico.
Estes dois genes associados a
outras protenas desencadeiam a do-
ena que mais mata mulheres.
Para que se tenha uma avaliao
precisa do risco de desenvolver um
cncer necessrio que se obtenha
uma histria da paciente, uma
genealogia do cncer precisa, onde
possvel confirmar os tipos de cnce-
res atravs de documentos hospitala-
res e exames.
Devido aos altos custos e difi-
culdades para testar mutaes em
BRCA1 e BRCA2, so realizadas pro-
vas nas mutaes mais provveis
nas populaes. Nas famlias de Ju-
deus as trs principais mutaes de
fundador mais freqentes, 185 del
AG, 5382 ins C em BRCA1 e 617 del
T em BRCA2. Estas trs mutaes
mais freqentes respondem por mais
de 90% da populao. Quando uma
mutao de fundador encontrada,
esta j suficiente para autorizar a
blindagem para todos as trs muta-
es (BAST, et al 2000).
2. Localizao da mama
A mama est localizada entre a
2 e a 6 costela, entre a margem
esternal e a linha medioaxilar. O
tecido mamrio possui trs compo-
nentes principais:
Tecido glandular: organiza-
do em 12 a 20 lobos, onde cada
qual termina num canal que se
abre na superfcie do mamilo.
O tecido glandular sustenta-
do por tecido fibroso, incluindo
os ligamentos suspensrios que
esto conectados tanto pele
quanto fascia que fica por
debaixo da mama.
A gordura circunda a mama e
predomina tanto superficial-
mente, quanto na periferia
(SPENCER, 1991).
Os vasos linfticos de grande
parte da mama drenam para a axila.
A borda anterior da axila formada
pelos msculos peitorais; as bordas
posteriores incluem o subescapular e
o grande dorsal; a borda interna pelo
quadril cortal e msculo denteado
anterior; e a borda externa pela parte
superior do brao.
Os gnglios axilares na parte
alta da axila, perto das costelas e do
denteado anterior. Para dentro deles,
drenam canais provenientes de trs
outros grupos de gnglios linfticos:
1. o grupo peitoral ou anterior;
2. o grupo subescapular (poste-
rior);
3. o grupo lateral;
Convm observar que nem to-
dos os linfticos da mama drenam
para a axila. Dependendo da locali-
zao de uma leso no seio, a disse-
minao pode se processar direta-
mente para os gnglios infraclavicu-
lares, para dentro dos canais profun-
dos existentes no interior do trax ou
do abdmen, e at para a mama
oposta (BATESE, HOCKENAM, 1982).
Na glndula mamria, os lobos
possuem muitas subdivises que
so chamadas de lbulos; estes ter-
minam em dezenas de pequenos
bulbos produtores de leite. Os lo-
bos, lbulos e bulbos so interliga-
dos por tubos finos denominados
ductos. Estes ductos vo at o ma-
milo (papilo), localizado no centro
da rea escura da pele que se cha-
ma aurola.
Somente com o incio da gravi-
dez que a mama assume a
maturao morfolgica e atividade
funcional completa. Aps a cessa-
o da lactao, os lbulos regridem
e sofrem atrofia, havendo uma re-
duo notvel no tamanho total da
mama. A maioria das neoplasias
mamrias no contm tecido
adiposo e, em exames como a ma-
mografia, elas aparecem como mas-
sas de maior densidade, contras-
tando com o estroma circundante.
Por conseguinte, a mamografia
menos sensvel em mulheres jo-
vens, nas quais essas massas po-
dem ser obscurecidas por tecido
denso circundante (COTRAN,
KUMAR, COLLINS, 2001).
3. Sinais visveis de Cncer
Mamrio
BATES, HOCKELMAN, (1982)
descreveram alteraes na mama que
caracterizam um tumor, entre elas
destacam-se:
Produo de fibrose, ou for-
mao de tecido cicatricial;
Sinais de retrao que inclu-
em covas cutneas, alteraes
nos contornos mamrios e acha-
tamento ou desvio do mamilo;
Aparecimento de ndulo ou
endurecimento da mama ou em-
baixo do brao;
Mudanas no tamanho e ou
formato da mama;
Alterao na colorao ou na
sensibilidade da pele da mama
ou da aurola;
Secreo contnua por um
dos ductos;
Retrao da pele da mama ou
do mamilo;
Inchao significativo ou
distoro da pele.
As alteraes no contorno
so identificadas por inspeo
cuidadosa das superfcies nor-
malmente convexas das ma-
mas e comparando uma mama
com a outra.
Edema de pele, produzindo
por bloqueio linftico.
4. Classificao dos tipos
de Cncer de Mama
O cncer de mama subdividi-
do em dois grandes grupos:
Carcinomas: que podem ser
diferenciados em cncer lobular
onde comea nos bulbos (pe-
quenos sacos que produzem
leite); ou cncer dos ductal,
que se formam nos ductos que
levam o leite dos lbulos para o
mamilo (papila).
Sarcomas: formam-se nos
tecidos conjuntivos, onde mais
comum o cncer se dissipar
para outras partes do corpo.
O carcinoma o mais comum.
Ele mais comumente encontrado e
diagnosticado na mama esquerda do
que na mama direita.
Os cnceres so bilatrias ou
seqenciais na mesma mama em 4%
ou mais dos casos. Entre os carcinomas
de mama pequenos o suficiente para
identificar sua rea de origem, cerca de
50% surgem no quadrante superior
externo, 10% em cada um dos
quadrantes restantes e cerca de 20% na
regio central ou subareolar, o local de
origem influncia de modo consider-
vel o padro de metstase linfonodal.
Os carcinomas so divididos em
carcinomas noinflitrantes ou in situ
e carcinomas inflitrantes.
Carcinomas in situ:
Carcinoma ductal in situ;
Carcinoma lobular in situ;
Carcinomas Invasivos (infil-
trante):
Carcinoma ductal infiltrante
sem tipo especfico;
Carcinoma lobular invasivo
ou infiltrante;
Carcinoma medular;
Carcinoma colide;
Carcinoma tubular;
Carcinoma papilar invasivo.
5. Estgios de
desenvolvimento do
Cncer de Mama
Os diferentes tipos de cncer de
mama, quando so diagnosticados e
confirmados com exame laboratorial,
so classificados conforme o seu ta-
manho e presena de metstases nos
linfonodos e a distncia. Esta classi-
ficao foi criada para que o mdico
possa saber indicar qual o tratamento
mais adequado para o paciente (
HARRISON, et al. 1998 ).
TX: tumor primrio que no
pode ser demonstrado.
T0: no existe evidncia de
tumor primrio.
TIS carcinoma in situ: carci-
noma intraductal e carcinoma
lobular in situ.
T1: tumor de at 2 cm.
T1a: tumor de at 0,5 cm.
T1b: tumor 0,5 > 1 cm.
T1c: tumor 1cm > 2 cm.
T2: tumor com mais de 2 cm
e menos de 5 cm.
T3: tumor com mais de 5 cm.
Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
T4: tumor de qualquer tama-
nho com possvel extenso di-
reta a parede do trax.
T4a: extenso a parede do
trax.
T4b: edema, ou ulcerao, ou
ndulos satlites na parede da
mesma mama.
T4c: quando encontra-se T4a
e T4b.
T4d: carcinoma inflamatrio.
Gnglios Linfticos (N)
NX: quando no se pode afirmar
o comprometimento dos gnglios.
N0: sem metstase em gnglios
regionais.
N1: metstase em gnglios axi-
lares unidos uns aos outros e a outras
estruturas.
N3: metstase em gnglios lin-
fticos da mama interna.
Classificao Patolgica
PNX: quando no se pode
excluir a presena de gnglios.
PN0: sem metstase em gn-
glios regionais.
PN1: metstase em gnglios
regionais laterais mveis.
PN1a: somente micrometsta-
ses < 0,2 cm.
PN1b: metstase em gnglios
maiores de 0,2 cm.
PN1b1: metstase de 1 a 3
gnglios > 0,2 < 2 cm.
PN1b2: metstases de 4 ou
mais gnglios > 0,2 a < 2 cm.
PN1b3: quando atravesa a
parede do gnglio < 2 cm.
PN1b4: metstase a gnglios
linfticos de 2 cm ou massa e
dimenso maior.
PN2: metstase em gnglios
axilares unidos uns aos outros e
a outras estruturas.
PN3: metstase em gnglios
linfticos da mama interna.
Metstase a Distncia (M)
MX: presena de metstase
distncia, mas que no pode ser
demonstrado.
M0: no h evidncia de
metstase distncia.
M1: presena de metstase
supraclaviculares.
55
 So considerados cinco estgios
de desenvolvimento de tumor segun-
do o Comit Americano de Cncer.
Estgio 0:Carcinoma ductal in
situ e carcinoma lobular in situ.
Sem evidncia de tumor nos
linfonodos e metstase dis-
tncia.
Estgio 1: Quando o tumor
tem at 2 cm , mas sem qual-
quer evidncia de ter se espa-
lhado pelos gnglios linfticos
prximos.
Estgio 2: Inclui tumores de
at 2 cm, mas com envolvimen-
to de gnglios linfticos, ou,
ento, um tumor primrio de
at 5 cm, com linfonodos axila-
res afetados, porm mveis, sem
metstase distncia, ou tumor
com mais de 5 cm sem compro-
metimento linfonodal nem
metstases distantes.
Estgio 3: Quando o tumor
tem mais de 5 cm e h envolvi-
mento dos gnglios linfticos
da axila do lado da mama afeta-
da.
Estgio 4: Quando existem
metstases distantes, como no
fgado, ossos, pulmo, pele ou
outras partes do corpo.
6. Frequncia e
epidemiologia
O cncer de mama feminino
raramente encontrado antes dos 25
anos de idade, exceto em casos
familiares. A idade habitual que se
identifica gira em torno dos 3080
anos, sendo mais comum na meia
idade e velhice.
Encontra-se entre as doenas
mais comuns e a que mais mata
mulheres no Brasil. Dados do Insti-
tuto Nacional do Cncer I NCA
mostram que foram diagnosticados
neste ano cerca de 30 mil casos
novos e oito mil morreram por causa
da doena.
Este tipo de tumor foi considera-
do o 3 que mais mata no Brasil. A
obteno de uma histria familiar
constitui um fator de risco para de-
senvolvimento do cncer de mama; 5
a 10% dos casos so atribuveis
herana de um gene autossmico
dominante.
56 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
A probabilidade de herana ge-
ntica aumenta se houver vrios pa-
rentes afetados e se for constatada a
ocorrncia do cncer numa idade
jovem.
Dois genes so responsveis pela
maioria dos cnceres de mama here-
ditrio: o BRCA1 e BRCA2.
O BRCA1, localizado no cro-
mos-somo 17, quando mutante,
capaz de produzir alto risco (talvez
at 85% ao longo da vida) de cncer
de mama e tambm de cncer ovari-
ano (talvez50% de risco ao longo da
vida). Cerca de 1/500 mulheres car-
regam uma mutao BRCA1 na linha-
gem germinativa, com freqncia,
dando origem a uma histria familiar
consistente. Homens com mutaes
BRCA1 podem ter um aumento mo-
desto no risco de cncer de prstata.
... h uma srie de heteroge-
neidade mutacional descrito para o
BRCA1, como em geral o caso nos
distrbios genticos. Uma exceo so uma famlia de mulheres jovens,
as populaes Judia Askenazi, em
que um de 100 indivduos carregam
uma deleo 2-pb particular a 185
del AG no BRCA1. 1
Mutaes em outro gene no cro-
mossomo 13, o BRCA2 tambm
confere alto risco de cncer de mama,
e um risco um pouco menor de
cncer ovariano; em homens essas
mutaes tambm os tornam pro-
pensos ao desenvolvimento de cn-
cer de mama.
Estima-se que a freqncia das
Mutaes BRCA 2 seja cerca da
metade da freqncia do BRCA 1 .
Cerca de 1% de Judeus Askenazi
outra vez tem uma mutao comum
h 6174 del T . 2
A incidncia global do cncer de
mama menor em mulheres negras.
As mulheres nesse grupo desenvol-
vem cncer com uma idade mais
avanada e apresentam um aumento
da taxa de mortalidade, em compara-
o com as caucasides.
Os Estados Unidos e a Europa
Setentrional apresentam a maior inci-
dncia da doena.
Tumores de mama associados
ao BRCA1 so mais provveis em
mulheres com filhos, possuem uma
fase S maior, e quantidade elevada
de estrgeno e baixos receptores de
progesterona.
7. Hereditariedade
A transmisso hereditria de cn-
cer de mama segue o clssico padro
mendeliano de transmisso autoss-
mica dominante, com 50% das crian-
as de carreadoras herdando muta-
es BRCA1.
As portadoras femininas de mu-
taes so estimadas a ter um risco
de 85% de desenvolvimento de cn-
cer de mama e/ou ovariano, com
uma maior incidncia de cncer bila-
teral e mais de 50% dos cnceres de
mama ocorrendo antes dos 50 anos.
(BIESECKER, et al. 1993).
... o cncer de mama gentico
incide, geralmente, em mulheres jo-
vens, antes dos 50 anos de idade. A
ocorrncia de mais de 2 casos em
com menos de 50 anos, sugere que
existe a possibilidade de que seja um
defeito gentico na famlia. Alm dis-
so, estes tumores costumam ser bila-
terais; freqente que surjam nas
duas mama, s vezes no ao mesmo
tempo. A ocorrncia de mltiplos ca-
sos em mulheres jovens de tumores
bilaterais, chama a ateno para
que esta seja pela falta de risco .
Outro sinal se d pelo fato de o cncer
de mama estar associado, nestes ca-
sos genticos, ao cncer de ovrio. A
incidncia, em uma mesma famlia,
de uma mutao gentica que pre-
disponha ocorrncia do cncer.
Estes casos constituem, aproximada-
mente, de 6% a 10% dos casos gen-
ticos de cncer de mama. De 90% a
94% no temos uma histria famili-
ar. 3
CROOP, et al (1990), constata-
ram que mutaes na linhagem ger-
minativa do BRCA1 so responsveis
por 2% a 4% de todos os cnceres
mamrios. Embora mais que 90%
deles sejam casos esordicos ocor-
rendo em mulheres sem evidncias
de susceptibilidade hereditria, an-
lises de espcies de tumores mam-
_________________________________________________________________
1
COLLINS,Francis S. 1998.
2
TRENT, Jeffrey M. 1998.
3
Revista Hands n3 , 2002.
rios sugerem que anormalidades kb codificando para uma protena de
somticas adquiridas no BRCA1 pos- 3.418 aminocidos.
sam tambm desempenhar um papel Acredita-se que o BRCA1 e o
em muitos desses cnceres. BRCA2 se comportam como genes
supressores de tumores clssicos, e
8. Estudo de associao que com a perda de uma cpia pre-
dispem o portador ao desenvolvi-
Os dois principais genes respon- mento do cncer (BAST, et al. 2000).
sveis pela transmisso hereditria do WOOSTER, et al. (1994), estuda-
cncer de mama, o BRCA1 e BRCA2, ram o acoplamento do genoma em
codificam protenas de 1.863 e 3.350 15 famlias com alto risco de cncer
aminocidos, respectivamente (Ane- de mama no BRCA1 em 17q21. Esta
xo 03). Ambos os genes so comple- anlise descobriu um segundo lugar
xos formados por mais de 20 exons. suscetvel ao cncer de mama, o
O BRCA1 foi identificado no BRCA2 no cromossomo 13q12q13.
lcus 17q21. Este gene codifica uma O estudo em BRCA2 confere um alto
protena zncica cujo produto pode, risco de cncer de mama e no con-
portanto, atuar como fator de trans- fere um risco substancialmente ele-
crio. (FAUCI, et al 1998) descreveu vado de cncer ovariano, como o
que este gene possui 22 exons codi- risco do BRCA1.
ficantes e 2 exons no-codificantes, Vrias pesquisas indicaram uma
estendendo-se por cerca de 100 kb associao entre BRCA1 e a protena
de seqncia genmica. Seu produto p53, e o encarecimento subseqente
uma protena de 1.863 aminocidos. de atividade de p53 incrimina BRCA1.
O BRCA2, localizado no cro- O BRCA1 forma complexos com
mos-somo 13q12-q13, est associado BRCA2 e Rad 51, que homlogo do
com uma maior incidncia de cncer gene Rec A da E. coli em humanos e
da mama em homens do que em que essencial recombinao nor-
mulheres, (FAUCI, et al 1998). Este mal e estabilidade do genoma (BAST,
gene possui 27 exons dispersos por et al 2000).
70 kb de DNA genmico, e seu trans- O BRCA1 tambm pode fazer
crito estende-se por cerca de 10 12 um papel de regulao na transcri-
Tabela 1: Quadro comparativo mostrando as propriedades e funes dos genes BRCA1 e BRCA2
BCRA1
Cromossomo 17q21
Gene 100kb
Protena 1.863 aminocidos Componente da
holoenzima RNA-polimerase
Funo Supressor tumoral Interage com
protenas nucleares Possvel papel no
reparo do DNA
Mutaes > 500 identificadas
Risco de cncer de mama Mais de 70% aos 80 anos de idade
Idade de incio Idade mais jovem (quarta quinta
dcada de vida)
Risco de outros tumores Risco de cncer ovariano de 30-60% aos
70 anos de idade Prstata, clon.
Mutaes no cncer no - Muito raras (<5%)
familiar
Epidemiologia Mutaes especficas mais comuns em
alguns grupos tnicos (p. ex., presena
de uma mutao em 20 a 30% dos
cnceres de mama em mulheres Judias
Ashkenazi).
Patologia dos cnceres de Maior incidncia:13% de carcinomas
mama medulares e tumores de maior grau
Carcinoma ductal in situ menos
freqente.
Fonte: COTRAN, R.S.; KUMAR,V.;COLLINS,T. 2001.
Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
o, controle do ciclo celular e de-
senvolvimento. O BRCA1 foi associ-
ado com a RNA polimerase holoenzi-
ma 32 e fita CREB33, que implica na
regulao de transcrio.
Em uma mulher que desenvolve
cncer de mama, antes dos 40 anos, a
chance que ela leva uma mutao em
BRCA1 pode ser to alta quanto 10%.
O que no aplicado para BRCA2,
que pode ser associado a uma idade
ligeiramente mais elevada.
A prevalncia de certas muta-
es de BRCA1 e BRCA2 ocasional-
mente mais alta que o esperado,
devido transmisso aumentada de
algumas mutaes, em certas popu-
laes, devido ao efeito do fundador
(BAST, et al. 2000).
Foram identificadas mutaes de
fundador caractersticas para BRCA1
e BRCA2 em famlias de Judeus
Ashkenazi e de descendentes na Is-
lndia, Finlndia, Hungria, Rssia,
Frana, Holanda, Blgica, Sucia, Di-
namarca e Noruega. A maioria dos
estudos realizados em BCRA1 e
BCRA2 foram feitos em caucasides
dos Estados Unidos e Europa (BAST,
et al. 2000).
Significantemente, existem me-
nos dados sobre as taxas de muta-
BCRA2
13q12
70kb
3.418 aminocidos
Supressor tumoral Interage com
protenas nuclearesPossvel papel no
reparo do DNA
>200 identificadas
Mais de 60% aos 70 anos de idade
50 anos; mais idosa do que o BCRA1.
Cncer de mama masculina, ovrio,
bexiga, prstata, pncreas.
<5%
Mutaes especficas mais comuns em
alguns grupos tnicos
Tipos variveis podendo depender de
mutaes especficas.
57
 es de BRCA1 e BRCA2 em famlias
de outros grupos tnicos e raciais
(BAST, et al 2000).
TRAVTIGIAN, et al (1996), ob-
servaram como o BRCA1, a prote-
na de BRCA2 altamente carrega-
da, dos resduos cido ou bsi-
co. Porm, havia poucas pistas so-
bre a funo bioqumica de BRCA2.
Foram observados nveis mais altos
de expresso em mama e timo, e
ligeiramente nveis mais baixos em
pulmo, ovrio e bao. Em estudo
de 18 famlias, em 9 foi observado
a deleo de 3 nucleotdeos que
altera a armao de leitura, e con-
duzem a mutilao da protena
BRCA2. Os autores notaram que o
BRCA2 notavelmente semelhante
a BRCA1. Ambos possuem o exon
11 grande; em ambos a traduo
comea no exon 2; ambos tm su-
cesses de codificao que so ri-
cas em Adenina; e so compostos
de aproximadamente 70 Kb de Dna
genmico. O BRCA2 composto de
27 exons.
WEBER, et al. (1996), estudaram
3 exons de BRCA2 ( exons 10, 11 e
27) em 69 amostras aleatrias de
tumor de mama congelados. Eles
identificaram uma mutao somtica
truncada de BRCA2 em carcinoma
ductal primrio: deleo de 1 par de
bases e substitudas pela adio de 9
aminocidos modernos e terminao
da traduo no cdon 894.
CONNOR, et al. (1997), em seus
estudos com ratos observaram que o
BRCA1 e BRCA2 so altamente ex-
pressos proliferando clulas ao limi-
te de G1/S do ciclo celular da mama
comum vistos em pacientes com
mutaes nestes genes, sugere que
BRCA1 e BRCA2 possam estar agin-
do no mesmo tempo.
SARAN, et al. (1997), identifica-
ram uma interao de protena de
BRCA2 com a protena de DNA con-
serto Rad51. DAVIS, et al. (2001)
mostrou que o BRCA2 faz um papel
duplo na regulao da Rad51, que
uma protena essencial para a recom-
binao homloga e conserto de DNA.
Primeiramente, as interaes de
Rad51 e o BCR3, ou regies de BCR4
do BRCA 2, bloqueiam a formao de
filamentos nucleoproticos por
Rad51. Alteraes para a regio de
BCR3 que imitam mutaes associa-
58 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
das ao cncer de BRCA2 no exibem
este efeito.
Em segundo, o transporte de
Rad51 para o ncleo estava defeituo-
so em clulas que carregam uma
mutao associada ao cncer de
BRCA2. Assim, BRCA2 regula a loca-
lizao intracelular e a habilidade de
ligao de DNA de Rad51.
STRUEWING, et al. (1997), estu-
daram 120 portadoras de mutaes
em BRCA1 e BRCA2. As mutaes
em BRCA1 estudadas eram 185delAG,
e 5382insC; a mutao de BRCA2
estudada era 6174delT. O risco calcu-
lado de cncer de mama em pacien-
tes com at 70 anos era de 56%, de
cncer ovariano 16%; e de cncer de
prstata 16%, no havia diferena
significante no risco de cncer de
clon entre os parentes dos portado-
res. Concluram que de 2% de Judeus
Ashkenazi levam mutaes em
BRCA1 e BRCA2, o que confere um
risco aumentado de cncer de mama,
ovrio e prstata.
NEUHAUSEN, et al. (1998), ana-
lisaram famlias Judias e identificou 3
mutaes mais freqentes, possivel-
mente atravs do efeito do fundador
que so: 185del AG e 5832 ins C em
BRCA1 e 6174 del T em BRCA2.
JERNISTON, et al. (1999), con-
cluram em seus estudos que os por-
tadores do BRCA1 e mutaes do
BRCA2, que tm filhos, esto mais
suscetveis a desenvolverem cncer
de mama, antes dos 40 anos, que as
portadoras que so nulparas. Cada
gravidez aumenta o risco de desen-
volver cncer de mama.
As mutaes da linhagem ger-
minativa do BRCA1 so responsveis
por 2% a 4% de todos os cnceres
mamrios. Embora mais que 90%
deles sejam casos espordicos, ocor-
rendo em mulheres sem evidncias
de susceptibilidade hereditria, an-
lises de espcies de tumores mam-
rios sugerem que anormalidades
somticas adquiridas no BRCA1 pos-
sam tambm desempenhar um papel
em muitos desses cnceres (CROOP,
et al. 1990).
FODOR, et al. (1998) determi-
nando a freqncia do BRCA1 co-
mum e mutaes de BCRA2: 185 del
AG, 5382 ins C e 6174 del T, o DNA
foi analisado para as 3 mutaes
atravs de hibridizao de oligonu-
cleotdeos aleloespecficos (ASO).
Oito pacientes (3%) eram heterozi-
gotos para a mutao 185 del AG,
dois pacientes (0,75%) para 5382 ins
C e oito pacientes (3%) para 6174
del T. O risco vitalcio para cncer
de mama em Judeus Ashkenazi por-
tadores do BCRA1 185del AG ou
BRCA2 6147 del T foram calculadas
para ser 36%, aproximadamente 3
vezes o risco global para a popula-
o em geral.
Na Austrlia, BAHAR, et al.
(2001), encontraram em Judeus
Ashkenazi a mesma prevalncia alta
de 4 mutaes do fundador, da mes-
ma forma que acha em Judeus
Ashkenazi nos Estados Unidos e Isra-
el. As quatro mutaes analisadas era
185 del AG e 5182 ins C em BRCA1;
6174 del T em BRCA2 e 11307K em
APC.
STRUEWING, et al. (1995) de-
clarou que mais de 50 mutaes sem
igual tinham sido descobertas no gene
BRCA1, em indivduos com cncer
de mama e ovrio. Em genealogias
de alto risco, portadoras femininas
de uma mutao de BRCA1 tiveram
80 a 90% de risco vitalcio em cncer
de mama e 40 a 50% de risco de
cncer de ovrio.
STRUEWING, et al. (1995), de-
terminaram a freqncia da mutao
185 del AG em 858 Ashkenazi, que
buscam prova gentica para condi-
es sem conexo para cncer, e em
815 pessoas de referncia no seleci-
onadas pela origem tnica. Eles acha-
ram a mutao 185 del AG em 0,9%
de Ashkenazi . Os resultados sugeri-
am que 1/100 mulheres de descen-
dncia Ashkenazi possam ter alto
risco de desenvolver cncer de mama
ou ovrio.
Entre as 39 mulheres Judias com
cncer de mama antes dos 40 anos,
(FITZ, et al. 1996) acha que 8 (2%)
carregam a mutao 185 del AG.
Em cncer de mama espordico,
(THOMPSON, et al. 1995) acha o
RNAm do BRCA1 em nveis notada-
mente diminudos durante a transcri-
o de carcinoma in situ para cncer
invasivo.
THOMPSON, et al. (1995), acha-
ram que aquela inibio experimen-
tal da expresso de BRCA1 com oli-
gonucleotdeos antisense produziu
crescimento acelerado de clulas nor-
mais e clulas malignas, mas no
teve nenhum efeito em clulas
epiteliais no mamrias. Eles inter-
pretaram estes resultados como indi-
cado que o BRCA1, normalmente
pode servir como um regulador ne-
gativo de crescimento de clulas
epiteliais mamrias.
HEDENFALK, et al. (2001),
usando a tecnologia de microarray
para determinar a expresso de
genes em cncer de mama, foi acha-
do BRCA1 positivos como constata-
do com cnceres de mama BRCA2
positivos. A suspeita de que uma
diferena poderia ser achada veio
do fato que os 2 tipos de tumores
so freqentemente distintos,
histologicamente. Alm disso, tu-
mores com mutaes de BRCA1 so
geralmente negativos para estrge-
no e receptores de progesterona,
considerando que a maioria dos
tumores, com mutaes de BRCA2,
positivo para receptores de
hormnios. Amostras de RNA de
tumores primrios de 7 portadores
da mutao de BCRA1 e 7 portado-
res da mutao de BCRA2 foi com
um microarray de 6.512 clones de
cDNA de 5.361 genes.
ROA, et al. (1996), observaram a
mutao 185 del AG em 1,09% de
aproximadamente 3000 Judeus
Ashkenazi, e a mutao 5382 ins C
em 0,13%, a anlise do BCRA2 em
3.058 indivduos da mesma popula-
o mostraram uma freqncia de
portador de 1,52% pela 6174 del T.
Estes dois alelos so os mais freqen-
tes, que predispem o cncer de
mama hereditrio entre Judeus
Ashkenazi .
BARSADE, et al. (1997), em
estudo com 639 Judeus Iraquianos
saudveis, que so um grupo de
pouco risco para a mutao 185 del
AG, que predominantemente em
Ashkenazi, foram identificados 3 in-
divduos portadores da mutao 185
del AG . As anlises de hapltipo
iraquiano mostram que 2 comparti-
lham um hapltipo em comum com 6
portadores Ashkenazi, e um tero
teve um hapltipo que diferiu por um
nico marcador. Isto sugeriu que a
mutao 185 del AG do BCRA1 pode
ter sugerido antes da disperso das
pessoas judias no Dispora, pela
mesma poca de Cristo.
Alelos mutantes de genes
supressores de tumores, quando her-
dados, predispem os indivduos a
tipos particulares de cncer. Alm
de um envolvimento na suscetibili-
dade herdada para cncer, estes
genes de supresso tumoral so
objetivos para mutaes somticas
em tipos de cncer espordicos. Uma
exceo o BRCA1, que contribui
com uma frao significante de cn-
cer de mama e ovrio, mas sofre
mutao a taxas baixas em cncer
de mama e ovrio espordicos. Este
achado sugere que outros genes
possam ter como objetivo principal
causar mutaes somtica em carci-
noma de mama. O outro gene BRCA2
conta, neste estudo, com uma pro-
poro quase igual a do BRCA1. O
BRCA1 e o BRCA2 se comportam de
forma dominante, tendo em vista
que herda um alelo mutante e tm
um risco maior de desenvolver um
tumor; tumores que eles desenvol-
verem perdem o alelo do tipo selva-
gem atravs da perda da heterogozi-
dade. (TENG, et al. 2002.)
STEPHENSON, em (2003), estu-
dou mulheres com mutaes no
BRCA1 e BRCA2, que tm um risco
mais elevado de desenvolverem cn-
cer de mama, se fizeram uso de
mtodos contraceptivos orais, por,
pelo menos, 5 anos ou antes de 1975
(quando preservativos orais geral-
mente tinham um contedo de estr-
geno mais alto que os produzidos
depois). Estas tm um risco vitalcio
de 50 a 80% de desenvolverem cn-
cer de mama. O estudo contou com
1311 pares de mulheres que eram
portadoras de mutaes danosas, em
um ou ambos genes, a metade de
quem teve cncer de mama e a meta-
de de quem no tiveram.
LLORT, et al. (2002), em seus
estudos com pacientes espanholas,
analisando mutaes em BRCA1 e
BRCA2 tm uma proporo heredit-
ria significativa baixa, no que diz
respeito ao cncer de mama. O espec-
tro mutacional nestes genes muito
grande, com centenas de mutaes de
BRCA diferentes mundialmente infor-
madas. Mutaes devido ao efeito do
fundador tm uma frao significativa
de todas as mutaes de grupos tni-
cos. Em estudo com 35 famlias espa-
nholas que desenvolveram cncer de
Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
ovrio e mama, foram achadas 13
mutaes, das quais se tinham notci-
as de apenas 3, na Espanha. As dez
mutaes modernas so: IVS5+1G>A,
1491delA Leu 1086 Ter, e Gln 895Ter
em BRCA1; Glu 49 Ter, 5373del GTAT,
5947del CTCT, 6672 del TA, 8281 ins
A, e Pro 3039 Leu em BRCA2. Este
estudo, comparado com outros reali-
zados no pas, mostra que das vrias
mutaes encontradas na Espanha,
nenhuma parece ter relao, com efei-
to, do fundador.
KUMAR, et al. (2002), analisa-
ram a sucesso de codificao do
gene BRCA1 e BRCA2 em 14 pacien-
tes de cncer de mama hereditrio
em mulheres Indianas. A anlise foi
realizada em gel de eletroforese sen-
svel (CSGE), seguido de seqencia-
mento. Trs mutaes delas moder-
nas no exon 7, enquanto a outra um
apagamento de par bsico no exon
11 que resulta em mutilao de pro-
tena. A mutao 185 del AG, previ-
amente descrita, em Judeus Askenazi,
tambm foi encontrada nesta popu-
lao. Mesmo este sendo o 1 estudo
realizado com famlias da ndia (14
no total) sugestiona uma baixa
prevalncia, mas com um envolvi-
mento definitivo de mutaes no
gene BCRA1, entre mulheres India-
nas com cncer de mama.
A populao do Paquisto pos-
sui uma taxa de cncer de mama
extremamente alta para populaes
Asiticas e uma das taxas mais altas,
mundialmente, do cncer ovariano.
Neste estudo com 341 casos de cn-
cer de mama, 120 casos de cncer
ovariano e 200 controles femininos.
A prevalncia de mutaes no BRCA1
e BRCA2 em pacientes com cncer
de mama so de 6,7%, de cncer
ovariano so 15,8%. Mutaes no
gene BRCA1 respondem por 84% das
mutaes de cncer ovariano e 65%
das mutaes de cncer de mama. A
maioria das mutaes descobertas
so novas para o Paquisto. Cinco
mutaes de BRCA1: 2080 ins A,
3889 del AG, 4184 del 4, 4284 del AG,
e IVS14 1A>G , e uma mutao de
BRCA2 3337C>T, foram encontradas
em mltiplos casos e representam
fortes candidatos ao efeito do funda-
dor, segundo (LIEDE, et al. 2002).
TERESCHENKO, et al. (2002), es-
tudaram 25 famlias Russas com cn-
59
 cer de mama e ovrio, onde analisa-
ram mutaes nos genes BRCA1 e
BRCA2, usando anlise de heterodu-
plex e multiplex. Alm disso, foram
testadas 22 pacientes com cncer de
mama diagnosticados antes dos 40
anos, sem histria familiar e 6 pacien-
tes com cncer de mama bilateral. A
freqncia de mutaes no BRCA1
era de 16%. Uma mutao de BRCA1,
5382 ins C, foi achada em 3 famlias.
Este estudo juntamente com outro
sugere que 5382 ins C no BRCA1
uma mutao de fundador na popula-
o Russa. No BRCA2 foram encontra-
das 3 mutaes em pacientes com
cncer de mama sem histria familiar,
2 em pacientes jovens e 1 em pacien-
tes com cncer bilateral. Foram en-
contradas 4 mutaes modernas : 695
ins T, 1528 del 4, 9318 del 4, S1099X.
No ano de 2000 foram diagnosti-
cados quase 80.000 casos novos de
cncer de mama na ndia. Embora a
identificao de BRCA1 e BRCA2 au-
mentou a compreenso na gentica
do cncer de mama em populaes de
descendncia da Europa Ocidental, o
papel destes genes no restante da
populao indiana inexplorado. A
anlise de 20 pacientes com cncer de
mama com qualquer histria familiar,
ou idade precoce, conduziu a identi-
ficao de duas variantes (331+1G>T;
4476+2T>C) em BRCA1 (10%)
(SAXENA, et al. 2002).
RUIZ, et al. (2002), analisaram
heteroduplex de pacientes mexica-
nos com cncer de mama, onde
identificaram mutao truncada em
BRCA1 e BRCA2 (3857 del T; 2663
2664 ins A) e oito variantes raras de
significao desconhecida, princi-
palmente no gene BRCA2, um caso
de cncer de mama masculino tam-
bm foi identificada. A maioria das
alteraes parecia ser distinta com
uma nica observada em mais de
uma famlia.
LIEDE, et al. (2002), encontra-
ram duas famlias de descendncia
aborgines, ambas com as mesmas
alteraes de BRCA1 (1510 ins G;
1506 A>G). As famlias representam
duas Aborgines de tribos canaden-
ses, embora uma origem ancestral
comum provvel. Esta a primeira
evidncia de uma mutao de BRCA1,
especfica para pessoas aborgines
do Norte da Amrica.
60 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
A deteco de mutaes nos genes
BRCA1 e BRCA2 feita por tcnicas de
biologia molecular capazes de identifi-
car a alterao de uma nica base na
seqncia de DNA. Devido ao grande
tamanho das seqncias de BRCA1 e 2,
primeiramente, busca-se identificar qual
exon contm o stio mutado, antes de
se proceder ao sequenciamento do
DNA. A seqncia de DNA correspon-
dente aos vrios exons amplificada
por PCR (reao em cadeia da polime-
rase) para a realizao desses testes.
Para o screening inicial de muta-
es, uma tcnica muito utilizada a
de single strand conformation
polymorphism - SSCP, combinada
com heteroduplex analysis. A tcnica
de SSCP baseia-se no fato de que a
conformao tridimensional de frag-
mentos de DNA de fita simples
depende da seqncia de nucleot-
deos, sendo que a diferena de um
nucleotdeo altera o padro de mi-
grao eletrofo-rtica. A tcnica de
heteroduplex analysis deriva da ob-
servao de que, em reaes de PCR, dos no pas mostra que nenhuma tem
onde esto presentes molculas de
DNA selvagens e mutantes, durante
os ltimos ciclos, podem ser forma-
dos heteroduplex entre essas duas
espcies de molculas, os quais tero
um padro de migrao eletrofortica
diferente dos homoduplexes. Utili-
zando-se fragmentos de tamanho en-
tre 100 e 350 pares de bases, a taxa de
deteco de mutaes para o SSCP
como para o heteroduplex analysis, e
a associao dos dois mtodos pode
elevar essa taxa para perto de 100%
(sob condies bem controladas e
processamento semi-automatizado).
Aps a identificao do exon,
que a abriga a mutao, esta carac-
terizada pelo sequenciamento do
DNA. Conhecida a mutao, torna-se
possvel, tambm, por sequenciamen-
to, pesquis-lo em outros membros
da famlia do paciente, com vistas ao
aconselhamento gentico.
9. Discusso
Com a identificao dos dois
principais genes responsveis pelo
cncer de mama hereditrio, o BRCA1
e o BRCA2, a gentica deu um grande
salto em busca da cura de doenas
que so estritamente comuns e que
mais matam mulheres.
Em muitas populaes, algumas
mutaes tornam-se mais freqentes
devido ao efeito do fundador. Uma
das populaes que teve suas muta-
es amplamente estudadas foi o de
Judeus Askenazi, onde cerca de 2%
da populao leva mutaes em
BRCA1 e BRCA2 o que confere um
risco aumentado de cncer de mama,
ovrio e prstata.
Em Judeus Askenazi, as princi-
pais mutaes encontradas devido
ao efeito do fundador e que j
foram descritas em inmeros pa-
ses, so a 185 del AG e 5382 ins C
no gene BRCA1, e no BRCA2 a 6174
del T. A prevalncia alta destas
mutaes de fundador na linhagem
germinativa so responsveis por
2% a 4% de todos os tipos de cncer
mamrio.
Em pacientes Espanholas, das
inmeras mutaes j analisadas em
BRCA1 e BRCA2 tem uma proporo
hereditria significativa baixa. A com-
parao com outros estudos realiza-
relao, com efeito, do fundador.
Em mulheres indianas, 3 muta-
es modernas foram encontradas e
a 185 del AG foi amplamente encon-
trada. Existe uma baixa prevalncia,
mas com um envolvimento definitivo
de mutaes no gene BRCA1.
No Paquisto, dentre as muitas
mutaes j descritas, a 3337 C>T no
BRCA2 representam uma forte
candidata ao efeito do fundador.
Na Rssia, a mutao no BRCA1
5382 ins C foi caracterizada por ser
uma mutao de fundador, e tribos
do Canad tambm tm 2 mutaes
que so estritamente freqentes.
A identificao de portadoras de
mutaes BRCA1 est limitada a um
nmero contado de laboratrios, com
acesso para raras famlias, na qual a
anlise de vrios parentes oferece
informao suficiente para identifi-
car carreadores com um alto grau de
certeza. Com base na taxa de
carreadoras de uma em 200 a 400
mulheres, a demanda para um
rastreamento populacional ser pro-
vavelmente substancial.
A ateno deve ser voltada para
os riscos sociais do teste gentico,
como potencial perda de seguro,
estigmatizao e discriminao do
empregado.
 Uma vez que o gene BRCA1 e
BRCA2 tenham sido identificados e
um teste clnico para mutaes co-
muns esteja disponvel, os proble-
mas levantados no aconselhamento
de uma nica famlia iro assumir
enormes propores. A prevalncia
de carreadoras de mutaes BRCA1,
com um risco de aproximadamente
85% de desenvolverem cncer de
mama, em muito excedem a inci-
dncia de qualquer outra doena
gentica para qual o rastreamento
pr-sintomtico esteja atualmente
disponvel.
O rastreamento para mutao
BRCA1 provavelmente o 1 teste
pr-sintomtico que ter lugar na
prtica clnica geral, e um sucesso
ou falha desses esforos trar um
grande impacto no futuro deste cam-
po, com todo o seu potencial para o
avano da medicina preventiva,
evitando doenas e reduzindo os
custos da sade. Tem-se a esperan-
a de que, com o rastreamento ge-
ntico, a suscetibilidade ao cncer
de mama, muitas armadilhas pos-
sam ser evitadas.
10. Referncias
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 Biosurfatantes a partir de
Pesquisa
resduos agroindustriais
Avaliao de resduos agroindustriais como substratos para a produo de biosurfatantes por Bacillus
Mrcia Nitschke
Doutoranda em Cincia de Alimentos
Faculdade de Engenharia de Alimentos UNICAMP
nitschke@bol.com.br
Glucia Maria Pastore
Profa Dra - Laboratrio Bioqumica de Alimentos
Faculdade de Engenharia de Alimentos UNICAMP
glaupast@fea.unicamp.br
Ilustraes cedidas pelos autores
Introduo
Os surfatantes constituem uma
classe importante de compostos qu-
micos amplamente utilizados em di-
versos setores industriais. Estima-se
que a produo mundial de surfatan-
tes exceda 3 milhes de toneladas
por ano (Banat, 2000), sendo utiliza-
dos principalmente como matria-
prima na fabricao de detergentes
de uso domstico.
A grande maioria dos surfatan-
tes disponveis comercialmente
sintetizada a partir de derivados de
petrleo. Entretanto, o crescimento
da preocupao ambiental dos con-
sumidores combinado com novas
legislaes de controle do meio am-
biente levaram os cientistas a
pesquisar surfatantes biolgicos
como alternativa para os produtos
existentes.
Os biosurfatantes produzidos
por microrganismos vm, nos lti-
mos anos, despertando consider-
vel interesse devido sua natureza
biodegradvel, baixa toxicidade e
diversidade de aplicaes. Entre as
aplicaes comerciais dos biosurfa-
tantes destacam-se a recuperao
do petrleo, biorremediao de
poluentes, formulao de lubrifican-
tes, alm de diferentes utilizaes
na indstria txtil, cosmtica, ali-
mentcia e farmacutica.
Atualmente, os biosurfatantes
ainda no so amplamente utilizados
pela indstria, devido ao seu alto
custo de produo, associado a m-
todos ineficientes de recuperao do
produto e ao uso de substratos caros.
Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
Porm, o problema econmico da
produo de biosurfatantes pode ser
significativamente reduzido por meio
do uso de fontes alternativas de nu-
trientes facilmente disponveis e de
baixo custo.
Uma possvel alternativa para
a produo de biosurfatantes seria
o uso de subprodutos agrcolas ou
de processamento industrial. Atual-
mente, o aproveitamento de res-
duos vem sendo incentivado por
contribuir para a reduo da polui-
o ambiental, bem como por per-
mitir a valorizao econmica dos
resduos que seriam simplesmente
descartados.
O que so biosurfatantes?
Os biosurfatantes possuem uma
estrutura comum: uma poro
lipoflica, usualmente composta por
cadeia hidrocarbonada de um ou mais
cidos graxos, que podem ser
saturados, insaturados, hidroxilados
ou ramificados, ligados a uma poro
hidroflica, que pode ser um ster,
um grupo hidrxi, fosfato, carboxilato
ou carbohidrato (Cameotra & Makkar,
1998; Bognolo, 1999). Os microrga-
nismos produtores distribuem-se em
diversos gneros, sendo a maioria
produzida por bactrias. As princi-
pais classes de biosurfatantes inclu-
em glicolipdios, lipopeptdios e
lipoprotenas; fosfolipdios e cidos
graxos; surfatantes polimricos e sur-
fatantes particulados (Desai &
Desai,1993).
Em relao aos surfatantes con-
vencionais, os biosurfatantes apre-
63
 sentam vantagens como (Bognolo,
1999):
elevada atividade superficial e
interfacial, o que os torna com-
parveis ou superiores aos sint-
ticos (detergentes aninicos
sulfatados) em termos de
efetividade e eficincia;
maior tolerncia a pH, tem-
peratura e fora inica;
biodegradabilidade;
baixa toxicidade.
Os biosurfatantes apresentam
ainda a vantagem de poder ser sin-
tetizados a partir de substratos
renovveis e de possuir grande di-
versidade qumica, possibilitando
aplicaes especficas para cada caso
particular (Desai & Banat, 1997).
Outra vantagem dos biosurfatantes
reside no fato de no serem com-
postos derivados de petrleo, fator
importante medida que os preos
do petrleo aumentam. Alm disso,
a estrutura qumica e as proprieda-
des fsicas dos biosurfatantes po-
dem ser modificadas atravs de ma-
nipulaes genticas, biolgicas ou
qumicas, permitindo o desenvolvi-
mento de novos produtos para ne-
cessidades especficas.
Substratos no convencionais
O sucesso da produo indus-
trial de biosurfatantes depende do
desenvolvimento de processos mais
baratos e do uso de matrias-primas
de baixo custo, uma vez que estas
representam entre 10% a 30% do
custo total (Cameotra & Makkar,
1998). Apesar disso, poucos traba-
lhos tm sido publicados com vistas
a produzir biosurfatantes a partir de
resduos (Tabela 1). A dificuldade
Tab ela 1. E xemplo s d e u tilizao d e resd u o s n a pro d u o d e b io su rfatan tes
Su b strato s
Efluente extrao leo oliva rhamnolipdeos
Residuos refino leo de soja
gua lavagem de batatas
Melao
Soro de leite
gua de turfa
leo de fritura usado
leo lubrificante usado
Soro leite desproteinizado
Manipueira
64 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
na seleo de um resduo est em
encontrar a composio adequada
de nutrientes que permita o cresci-
mento celular e o acmulo do pro-
duto de interesse. Em geral, substra-
tos agroindustriais que contenham
altos nveis de carbohidratos ou de
lipdeos suprem a necessidade de
fonte de carbono para a produo
de biosurfatantes. O estabelecimen-
to de um processo biotecnolgico a
partir desses substratos alternativos
tambm apresenta outra dificulda-
de, que a padronizao devido s
variaes naturais de composio,
bem como os custos de transporte ,
armazenagem e tratamento prvio
necessrios. Entretanto, a utilizao
de resduos pode diminuir os custos
de produo para nveis competiti- 1997b).
vos em relao aos similares obtidos
por via petroqumica e, ao mesmo
tempo, reduzir os problemas ambi-
entais relativos ao descarte e aos
custos do tratamento (Mercade &
Manresa, 1994; Makkar & Cameotra,
1999a; Makkar & Cameotra, 2002).
Finalmente, deve-se considerar que
o Brasil um pas essencialmente
agrcola e que, portanto, a quantida- dos de Bacillus sp. produtores de
de e a facilidade de acesso aos
subprodutos agroindustriais bas-
tante significativa.
Figura 1. Estrutura da surfactina produzida por Bacillus subtilis.
C lasse q u mica Micro rgan ismo
Pseu domonas sp.
rhamnolipdeos P. aeru ginosa
lipopeptdeos B. su bt ilis
lipopeptdeos B. su bt ilis
rhamnolipdeos P. aeru ginosa
lipopeptdeos B. su bt ilis
rhamnolipdeos P. aeru ginosa
glicolipdeos Rhodococcu s sp.
sophorolipdeos C. bombicola
lipopeptdeos B. su bt ilis
Biosurfatantes produzidos por
Bacillus
Algumas bactrias do gnero
Bacillus produzem diversos lipo-
peptdeos que demonstram ativida-
de tensoativa ( Rosenberg & Ron,
1999). As culturas de Bacillus
subtilis produzem um lipopeptdeo
cclico conhecido como surfactina
ou subtilisina (Arima et al., 1968),
considerado um dos mais potentes
biosurfatantes conhecidos (Figura
1). A surfactina tambm demons-
trou atividade anticoagulante, anti-
tumoral, antimicrobiana, e, mais re-
centemente, estudos comprovaram
atividade antiviral e antimicoplas-
ma (Vollenbroich et al, 1997a,
O objetivo deste estudo foi veri-
ficar a potencialidade do uso de subs-
tratos alternativos para a produo
de biosurfatante por isolados de
Bacillus.
Materiais e Mtodos
Foram utilizados cinco isola-
biosurfatante pertencentes cole-
o de culturas do Laboratrio de
Bioqumica de Alimentos. Para a
R efern cia
Mercade et al., 1993
Abalos et al, 2001
Fox & Bala, 2000
Makkar & Cameotra,1997
Koch et al, 1988
Sheppard& Mulligan 1987
Haba et al, 2000
Mercade et al, 1996
Daniel et al, 1998
Santos et al, 1999
produo de biosurfatante foram
utilizados:

melao (3% v/v slidos sol-

veis) pH 6,0;
manipueira (resduo lquido
proveniente da fabricao de fa-
rinha de mandioca) pH 5,8-5,9;
soro de leite (fabricao de
queijo mussarela) pH 6,4 ;
meio sinttico proposto por
Cooper et al. (1981) pH 6,8-6,9.

A manipueira foi tratada previa-

mente com aquecimento a 100C,
por 3 minutos e centrifugao a
10.000 rpm, por 20 minutos, para
remoo de slidos. O pH dos res-
duos no foi ajustado. Os meios Figura 2. Percentagem de reduo na tenso superficial obtida por isolados de Bacillus
foram esterilizados em autoclave a sp. em diferentes substratos.
121C, por 20 minutos.
Uma alada das culturas mantidas
a 4C foi transferida para erlenmeyer de
50 mL, com 20 mL de caldo nutriente e
incubada em agitador rotatrio a 120
rpm, 30C, por 24 horas. Aps, 1 mL de
cada cultura a ser testada foi inoculado
em frascos erlenmeyers de 50 mL con-
tendo 15 mL dos respectivos meios,
que foram incubados em agitador
rotativo tipo shaker a 30C e 150 rpm,
por 72 horas. Os meios foram centrifu-
gados a 10.000 rpm, por 15 minutos, e
o sobrenadante, livre de clulas, utiliza-
do para determinaes analticas.
A tenso superficial foi determi-
nada em tensimetro Krss, modelo
K12, utilizando o mtodo da placa. O
biosurfatante foi isolado do meio de
cultivo por precipitao cida a pH
2,0, seguida de extrao com cloro-
Figura 3. Atividade emulsificante (E24) de soluo de biosurfatante frente diferentes
frmio/metanol (65:15), segundo
hidrocarbonetos. (1) Hexano, (2) Tolueno, (3) Heptano, (4) Decano, (5) Querosene,
Makkar & Cameotra (1999b). A ativi- (6) Tetradecano, (7) Hexadecano, (8) leo de soja, (9) Gordura de cco.
dade emulsificante (E24) foi realizada
em tubos com tampa rosca contendo colocadas em erlenmeyer de 250 mL, Resultados e Discusso
4 mL de soluo aquosa, 1mg/mL de adicionando-se-lhe 20 mL de gua
biosurfatante (obtido em manipueira) (frasco controle) e 20 mL de soluo Os resultados obtidos nos en-
adicionados de 6 mL de hidrocarbo- aquosa 1mg/mL de biosurfatante ob- saios de produo de biosurfatante em
netos, sendo que cada tubo foi sub- tido (frasco teste). Os frascos foram diferentes substratos alternativos so
metido a vortex mximo por 2 minu- agitados a 150 rpm, por 12 horas em mostrados na Figura 2. Nota-se que
tos e deixado em repouso por 24 temperatura ambiente. Retirou-se todos os isolados testados demonstra-
horas. O ndice E24 foi determinado deles o lquido da primeira lavagem e ram capacidade de produzir biosurfa-
medindo-se a altura da camada emul- procedeu-se a uma segunda adio de tante e, conseqentemente, de reduzir
sionada (cm) dividindo-a pela altura 20 mL de gua e biosurfatante, incu- a tenso superficial dos meios testa-
total de lquido x 100. A remoo de bando-os nas mesmas condies aci- dos, sendo que a manipueira forneceu
petrleo de areia contaminada foi ma. O lquido da segunda lavagem foi as maiores percentagens de reduo ,
testada atravs da saturao de 60g de removido e a areia foi retirada do na ordem de 42% , para todos os
areia com 5 mL de petrleo. Pores frasco sendo colocada em estufa a isolados testados; entretanto, o soro de
de 20g da areia contaminada foram 50C at a secagem. leite apresentou uma reduo mdia

Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003 65

 Figura 4. Capacidade de remoo de petrleo de amostra de areia utilizando soluo de biosurfactante.
(1) Biosurfatantes, (2) controle, (3) gua.
Tab ela 2. A tivid ad e
emu lsifican te d o b io su rfatan te
o b tid o em man ipu eira
Hidrocarboneto E 24 (%)
Hexano 66,6
Tolueno 72,7
Heptano 66,6
Decano 70,4
Querosene 70,4
Tetradecano 70,9
Hexadecano 69,0
leo de soja 74,0
Gordura e cco 70,9
Petrleo 69,0
de 10% , ressaltando que o isolado
LB5a no produziu surfatante nesse
resduo. O melao tambm demons-
trou boa potencialidade como substra-
to para produo de biosurfatante pe-
los microrganismos testados e apre-
sentou reduo mdia de, aproxima-
damente, 33%. O meio sinttico utili-
zado como padro foi definido por
Cooper et al. (1981), para a produo
de surfactina por Bacillus subtilis ATCC
21332 e vem sendo utilizado, desde
ento, como uma referncia para a
produo de biosurfatantes de Bacillus. Figura 5 . guas de lavagem da areia impregnada com petrleo.
Nota-se que, apesar de permitir a pro- A1-A2: gua; BS1-BS2: soluo biosurfatante 1mg/mL.
duo de biosurfatante por todos os
isolados, esse meio mostrou resulta- rais como P, K, Mg, Mn, S, Fe, Cu, Zn, et al, 1991). A capacidade emulsificante
dos inferiores (com reduo mdia de Ca (Cereda, 1994). Segundo Cooper et do biosurfatante obtido em manipueira
21,5%) aos da manipueira e do mela- al. (1981), os sais minerais, principal- pelo isolado LB5a foi avaliada atravs
o, sugerindo que estes dois resduos mente Fe e Mn, so fatores nutricionais do ndice E24 com diferentes hidrocar-
possuem uma composio de nutrien- importantes para a produo de surfa- bonetos (Tabela 2). Os ndices obtidos
tes adequada para a produo de bio- tantes por linhagens de Bacillus. A (60%-80%) revelam alta especificida-
surfatantes. presena desses minerais, alm de de do biosurfatante contra todos os
Embora a composio qumica fontes de carbono e nitrognio, seja, hidrocarbonetos testados, formando
varie de acordo com a poca do ano e provavelmente, o principal motivo de emulses estveis do tipo A/O (Figura
com o tipo de cultivar de mandioca, a haver maior produo de biosurfatan- 3). O composto obtido possui potenci-
manipueira possui em sua composio tes nesse resduo. al para uso na biorremediao, recupe-
uma grande quantidade de carbohidra- Em adio tenso superficial, rao de petrleo e emulsificao de
tos (40-60 g/L ) destacando-se ainda a a estabilizao de emulses freqen- leos e gorduras.
presena de frutose, glicose e sacarose, temente utilizada como um indicador Com vistas a avaliar a capacida-
alm de nitrognio (1-2 g/L) e mine- da atividade superficial (Abu-Ruwaida de do biosurfatante produzido em

66 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003

manipueira pelo isolado LB5a em re-
mover petrleo de areia contamina-
da, procedeu-se a um experimento
ilustrado nas Figuras 4 e 5, onde se
observa que a areia tratada com solu-
o de biosurfatante apresenta aspec-
to mais claro e as respectivas guas de
lavagem demonstram maior capaci-
dade de recuperao do petrleo em
relao ao tratamento sem tensoativo.
Concluses
Entre os resduos agroindustriais
testados, a manipueira foi que de-
monstrou a maior potencialidade para
uso como substrato alternativo na
produo de biosurfatantes por isola-
dos de Bacillus, sendo que o compos-
to obtido apresentou capacidade para
uso em biorremediao de poluentes
e em recuperao de petrleo.
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67

Pesquisa
Gabrielle Mouco
Aluna de graduao em Farmcia - UNIP
gabimouco@yahoo.com.br
Maira Jardim Bernardino
Aluna de graduao em Farmcia - UNIP
mjb@ajato.com.br
Melnia Lopes Cornlio, Ph.D
Farmacutica, Ph.D- Qumica de Produtos Naturais
Professora Titular da Disciplina de Farmacognosia
UNIP - Universidade Paulista-SP
melaniacornelio@yahoo.com.br
Ilustraes cedidas pelos autores
68 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
Controle de qualidade
de ervas medicinais
Controle de qualidade de Phyllanthus niruri L. (quebra-pedra)
Introduo
O controle de qualidade da
droga vegetal imprescindvel,
pois muitas espcies vegetais so
vendidas sem nenhuma garantia
de qualidade, o que favorece des-
de a venda de espcies falsificadas
at o armazenamento inadequado
da droga vegetal durante a sua
comercializao. A anlise aqui des-
crita foi realizado com a droga
vegetal adquirida e conhecida po-
pularmente como quebra-pedra. O
controle de qualidade dessa droga
vegetal foi feito a comear da sua
descrio microscpica, para veri-
ficar a autenticidade da espcie a
fim de evitar equvocos. Tambm
foram realizados testes qumicos
para confirmar as principais clas-
ses de seus constituintes qumicos
descritos na literatura (De Souza
et. al., 2002; Duke, 2000). Os inte-
resses teraputicos do Phyllanthus
niruri L. provm principalmente
de suas propriedades diurticas
para o combate de clculos renais.
Devido a isso, esto sendo desen-
volvidos vrios estudos para isolar
a substncia responsvel por tais
propriedades, alm de elucidar a
melhor maneira de tratamento
(Teske et. al., 1995).
Estudos experimentais com as
folhas e as sementes tambm tm
demonstrado a sua ao hipoglice-
miante, antibacteriana e anticance-
rgena. Em ensaios especiais, mos-
trou-se que ativa contra o vrus da
hepatite B in vivo e in vitro. Alm
disso, possui a virtude de dissolver
clculos renais, impedindo a con-
trao do ureter e promovendo a
sua desobstruo. Desenvolve ati-
vidade diurtica pela elevao da
filtrao glomerular e excreo
urinria dos sais de uratos (Tona et.
al., 2001; Teske et. al., 1995; Ogata
et. al., 1992).
Outro estudo realizado mos-
trou o efeito do Phyllanthus niruri
sobre a cristalizao do oxalato de
clcio in vitro. Por meio desse estu-
do, pde-se concluir que o extrato
de quebra-pedra interfere no cres-
cimento e na agregao dos cristais
na urina humana, sugerindo que
essa planta tem um papel potencial
na preveno de clculo renal ou
do desenvolvimento (Barros, 2002;
Freitas et. al., 2002; Campos et. al.,
1999; Dias et. al., 1995).
Materiais e Mtodos
1 - Dados da Amostra
A amostra analisada foi adqui-
rida em uma farmcia comercial e
apresentava as folhas secas em frag-
mentos de 0,5 cm a 1,0 cm.
Apresentava uma colorao
esverdeada que indicava que a
amostra havia passado por proces-
so de secagem.
2 - Controle Fsico
Processo de Catao -
Determinao da Pureza
Esse processo visou a avaliar
se a amostra apresentava material
estranho, partculas que no cor-
respondessem droga analisada. A
quantidade de amostra analisada
foi de 25 g de material vegetal.
3 - Descrio
microscpica
Os fragmentos da parte da fo-
lha foram submetidos a estudo
histolgico, e neles foram realiza-
dos cortes do tipo paradrmico e
transversal
4 - Anlise qumica
As folhas secas foram submeti-
das a processos qumicos de iden-
tificao das seguintes classes de
constituintes qumicos: taninos,
heterosdeos flavanodicos, hetero-
sdeos saponnicos, heterosdeo
antraquinnicos, alcalides e leos
volteis (Costa, 2001).
A seguir sero apresentadas as
metodologias dos ensaios de iden-
tificao das classes dos constitu-
intes qumicos mencionados. Vale
lembrar que so testes qualitativos
com vistas a somente verificar a
presena ou a ausncia do constitu-
inte qumico em questo.
4.1 - Mtodos de Identificao
4.1.1 - Taninos
Os taninos so substncias
polifenlicas, polihidroxiladas, de
alto peso molecular, de origens ve-
getais, capazes de precipitar prote-
nas, pectinas, alcalides e metais
pesados em soluo aquosa (Simes
et. al., 2001).
A estrutura qumica complexa
na sua maioria, apresenta caracters-
ticas adstringentes ao paladar e so
capazes de curtir a pele dos animais,
transformando-a em couro.
Os taninos so slidos, amorfos
na sua maioria, solveis em gua,
lcool, glicerina e polietilenoglicol.
So insolveis em solventes orgni-
cos apolares.
Classifica-se em glicos, hi-
drolisveis, catequnicos ou con-
densados.
Extrao Genrica de Taninos
Pesou-se cerca de 2g da droga
(quebra-pedra) pulverizada;
Extraram-se os taninos com
cerca de 40 mL de gua destilada,
deixando-a ferver durante, aproxi-
madamente, 2 minutos;
Filtrou-se em papel de filtro,
procurando manter o p no fundo
do recipiente;
Repetiram-se mais duas extraes,
com cerca de 10 mL de gua cada;
Filtrou-se novamente, como in-
dicado anteriormente;
Utilizou-se o filtrado para as
reaes de identificao seguintes.
Reao com Cloreto Frrico
Em um tubo de ensaio colo-
cou-se cerca de 1,0 mL da soluo
extrativa e adicionaram-se-lhe 5,0
mL de gua destilada e uma gota de
cloreto frrico 2% (escorrendo-o
pela parede do tubo).
Foi necessrio que se obser-
vasse a formao de um precipita-
do ou o aparecimento de colora-
es: preta, verde, azul, conforme o
tipo de estrutura qumica.
Reao com Soluo Aquosa de
Alcalides
Em um tubo de ensaio colo-
cou-se 1,0 mL da soluo extrativa,
diluda a uma proporo 1:5. Adici-
onaram-se-lhe 5 gotas de cido clo-
rdrico a 5% e 1 ou 2 gotas de
soluo de sulfato de alcalides.
Esperou-se para observar a for-
mao de um precipitado branco
ou castanho esbranquiado.
Reao com Acetato Neutro de
Chumbo
Em um tubo de ensaio colo-
cou-se 1,0 mL da soluo extrativa
diluda na proporo 1:5. Adicio-
naram-se-lhe 1 ou 2 gotas de solu-
o aquosa de acetato neutro de
chumbo a 10%.
Esperou-se para observar a for-
mao de um precipitado castanho
avermelhado volumoso e denso.
Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
Reao com Soluo de Acetato
de Cobre
Em um tubo de ensaio colo-
cou-se cerca de 1,0 mL de soluo
extrativa diluda na proporo de
1:5. Adicionaram-se-lhe 1 ou 2 go-
tas de soluo aquosa de acetato de
cobre a 5%.
Esperou-se para se observar a
formao de um precipitado casta-
nho avermelhado.
Reaes Especficas de
Taninos:
Reao com Acetato de
chumbo e cido Actico
Glacial
Em um tubo de ensaio coloca-
ram-se cerca de 3 mL de soluo
extrativa e adicionaram-se-lhe cer-
ca de 2 ml de cido actico glacial
a 10% e 3 mL da soluo de acetato
de chumbo a 10%.
Esperou-se para observar a for-
mao de um precipitado castanho
avermelhado que indicasse a pre-
sena de taninos glicos.
Obs: A adio de cido actico
impede a precipitao de taninos
catequnicos.
Reao com Reativo de
Wasicky
Eliminou-se o precipitado da
reao com acetato de cobre (ante-
rior) por filtrao e utilizou-se o
filtrado.
Adicionaram-se cerca de 0,5
mL de soluo de poli-metil-amino-
benzaldedo. Esperou-se para ob-
servar a formao de um precipita-
do carmim ou rseo que indicasse a
presena de tanino catequnico.
4.1.2 Saponinas
Saponinas so glicosdeos de
esterides ou terpenos policclicos.
Esse tipo de estrutura, que possui
uma parte lipoflica (triterpeno ou
esteride) e outra hidroflica (a-
cares), determina a propriedade de
reduo da tenso superficial da
69
 gua, caracterstica de suas aes
detergente e emulsificante (Simes
et. al., 2001).
Extrao Genrica das
Saponinas
Em um aparelho de refluxo
colocaram-se 90 mL de extrato aquo-
so 1% da droga.
Adicionaram-se-lhe cerca de 10
mL de cido clordrico.
Deixou-se o processo em re-
fluxo por aproximadamente uma
hora para, em seguida, deslig-lo e
deix-lo esfriar.
Transferiu-se o lquido para um
funil de separao de 200 mL e
adicionaram-se-lhe 50 mL de cloro-
frmio. Repetiu-se a extrao com
clorofrmio por mais duas vezes.
Reduziu-se o volume a 75 mL
em banho-maria.
Processos Gerais de
Identificao de Saponinas
Obs.: Para cada reao de iden-
tificao, evaporou-se cerca de 5
mL da fase orgnica obtida anteri-
ormente.
Reao de Rossol: No tubo de
ensaio onde se realizou a evapora-
o de 5 mL da fase orgnica, adici-
onou-se uma gota de cido sulfri-
co concentrado.
Esperou-se para observar o
aparecimento de uma colorao ver-
melha ou violeta que indicasse a
presena da sapogenina.
Reao de Mitchell: No tubo
de ensaio onde se realizou a evapo-
rao de 5 mL da fase orgnica,
adicionou-se uma gota de cido
sulfrico concentrado e vestgios
de nitrato de prata.
Esperou-se para observar o apa-
recimento de uma colorao aver-
melhada que indicasse a presena
de sapogenina.
Reao de Rosenthalen: No
tubo de ensaio onde se realizou a
evaporao de 5 mL da fase orgni-
ca, adicionaram-se uma ou duas
70 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
gotas de soluo de vanilina a 1%
em cido clordrico.
Esperou-se para observar o
aparecimento de colorao azul que
se desenvolvesse somente a quente.
Reao com Reativo de
Sulfo-vanlico: No tubo de en-
saio onde se realizou a evapora-
o de 5 mL da fase orgnica,
adicionaram-se uma ou duas go-
tas de soluo de vanilina 1% em
cido sulfrico.
Esperou-se para observar o
aparecimento de colorao violeta-
azulada.
Reao de Liebermann: No
tubo de ensaio onde se realizou
a evaporao de 5 mL da fase
orgnica, dissolveu-se o resduo
em 2 mL de cido actico glacial.
Adicionaram-se-lhe 1 ou 2 gotas
de cloreto frrico a 3%. Em se-
guida, verteram-se , pela parede
do tubo, 1 ou 2 mL de cido
sulfrico sem agitar . Na superf-
cie de contato entre os dois l-
quidos, poderia formar-se um
anel com colorao pardo-aver-
melhada ou verde, que indicaria
a presena de derivados esteroi-
dais, ou com colorao azul, que
indicaria a presena de deriva-
dos triterpenides.
4.1.3- Flavonides
Os flavonides, biossintetiza-
dos a partir da via dos fenilpropa-
nides, constituem uma importante
classe de polifenis, presentes com
relativa abundncia entre os
metablitos secundrios de vege-
tais (Simes et. al. 2001).
Extrao Genrica de
Compostos Flavonodicos:
Pesaram-se cerca de 2,0 g da
droga;
Colocada em um bquer, adici-
onaram-se-lhe cerca de 15 mL de
etanol a 75%;
Foi fervida por alguns minutos;
Em seguida, foi esfriada e fil-
trada em papel de filtro;
Reservou-se esse extrato para
executar as reaes gerais de iden-
tificao.
Reaes Genricas de
Identificao de Flavonides
Reao de Shinoda: Adicio-
naram-se cerca de 5 mL do extrato
em um tubo de ensaio que continha
uma pitada de magnsio metlico.
Acrescentaram-se-lhe 0,5 - 1,0 mL
de cido clordrico.
Observou-se o desenvolvimen-
to de colorao rsea-avermelhada
indicaria a presena de flavonis;
violeta indicaria a presena de
flavanonas e laranja indicaria a pre-
sena de flavonas.
Obs.: O desenvolvimento da
cor pode ocorrer imediatamente ou
aps algum tempo.
Reao com Cloreto de Alu-
mnio: Sobre um papel de filtro,
demarcaram-se duas reas A e B.
Depositaram-se em cada uma de-
las algumas gotas do extrato da
droga e esperou-se secar. Em se-
guida, colocou-se em uma das re-
as 1 gota de soluo de cloreto de
alumnio 5% em etanol. Eliminou-
se o etanol. Verificou-se o com-
portamento da substncia nas duas
reas frente luz ultravioleta. Ob-
servou-se o aspecto fluorescente
que indicasse a presena de
flavonides.
Reao com Cloreto Frri-
co: Diluiu-se o extrato com gua na
proporo de 1:5, em seguida, co-
locaram-se em dois tubos de ensaio
5 mL do extrato diludo. Adicionou-
se pela parede de um dos tubos 1
gota de cloreto frrico 2%.
Esperou-se para observar o de-
senvolvimento de cor, que poderia
variar entre verde, amarelo-casta-
nho e violeta, de acordo com o tipo
de composto flavonodico.
Reao com Hidrxido de
Sdio: Diluiu-se o extrato na pro-
poro de 1:5. Colocaram-se 5 mL
desse extrato diludo em um tubo
de ensaio e adicionaram-se-lhe 1
ou 2 gotas de NaOH 5%.
Observou-se o desenvolvimen-
to de colorao amarela, que varia
de intensidade.
4.1.4- Glicosdeos
Antraquinnicos
So compostos naturais encon-
trados sob forma glicosdica ou
livres derivados do ncleo antra-
cnico. Relacionam-se diretamen-
te com antraquinona, uma dicetona
insaturada. Possuem ao catrtica
e so classificadas, como catrtico
estimulante (Akisue, 2002).
Extrao dos glicosdoes
antraquinnicos
Reao de Borntreger: Pesou-
se cerca de 1g da droga, adiciona-
ram-se-lhe cerca de 20 mL de etanol
a 75% e foi aquecida durante 2
minutos em banho-maria.
Em seguida, realizou-se a fil-
trao em funil simples e adicio-
naram-se ao filtrado cerca de 2mL
de cido sulfrico que foi leva-
do ao banho-maria durante 1 mi-
nuto.
Deixou-se o filtrado acidificado
esfriar.
Realizou-se a extrao em um
funil de separao com 10 mL de
acetato de etila, e repetiu-se a ex-
trao por mais duas vezes.
Mediram-se cerca de 5 mL da
fase orgnica e adicionaram-se-lhe
cerca de 1 ou 2 gotas de hidrxido
de amnio.
Esperou-se para observar a for-
mao de uma colorao amarela, terminar o pH).
que indicasse a presena da antra-
quinona na forma reduzida, ou ver-
melha, que indicasse a presena da
antraquinona na forma oxidada.
Reao com Hidrxido de
sdio: Pesaram-se 0,5 g de dro-
ga, que foi colocada em um vidro
de relgio e adicionaram-se-lhe
algumas gotas de hidrxido de
sdio a 0,5%.
Esperou-se para observar o
aparecimento de uma colorao
amarelada, que indicasse a pre-
sena da antraquinona na forma
reduzida, ou de uma colorao
avermelhada que indicasse a pre-
sena da antraquinona na forma
oxidada.
4.1.5 - Alcalides
Os alcalides que contm um
tomo de nitrognio em um anel
heterocclico so chamados de
alcalides verdadeiros e so classi-
ficados de acordo com o sistema
anelar presente na molcula. As
substncias com o tomo de nitro-
gnio que no pertena a um siste-
ma heterocclico so denominados
de protoalcalides.
Compostos nitrogenados com
e sem anis heterocclicos, que no
so derivados de aminocido, so
chamados de pseudoalcalides
(Simes et. al., 2001).
Mtodos de Identificao de
Alcalides
Pesar cerca de 1g da droga em
um bquer, adicionar 30 mL de
soluo de HCL 1,5% e aquecer por
aproximadamente 3 minutos. Em
seguida, filtrar o sobrenadante em
algodo e transferir o filtrado para
um funil de separao.
Testes de Identificao
Alcalinizar o filtrado obtido
anteriormente com soluo de
Hidrxido de Amnio (NH 4OH)
at atingir um pH entre 9 e 10
(utilizar papel tornassol para de-
Em seguida, adicionar ao filtra-
do alcalinizado cerca de 15 mL de
Clorofrmio (CHCl3) e agitar para
que os alcalides presentes passem
para a poro orgnica. Colocar
cinco gotas do extrato em cada
cpsula de porcelana, coloc-las em
uma chapa e esperar secar, aps
isso, dissolver o resduo com 4 go-
tas de soluo de HCl 1,5% em
todas as cpsulas e em cada uma
adicionar o reagente de identifica-
o de alcalides:
Reagente de Sheibler - Adicio-
Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
nar algumas gotas sobre o resduo e
observar desenvolvimento de colo-
rao amarelo claro.
Reagente de Bourchardat - Adi-
cionar algumas gotas sobre o res-
duo e observar o desenvolvimento
de colorao amarelo tijolo.
Reagente de Bertrand - Adicio-
nar algumas gotas sobre o resduo e
observar o desenvolvimento de co-
lorao amarelo tijolo.
Reagente de Mayer - Adicionar
algumas gotas sobre o resduo e
observar desenvolvimento de um
precipitado floculoso branco.
Reagente de Dragendorff - Adi-
cionar algumas sobre o resduo e
observar desenvolvimento de colo-
rao amarelo tijolo.
4.1.6 - leos volteis
Os leos volteis so definidos
como produtos obtidos de partes de
planta por meio da destilao por
arraste com vapor dgua. So mis-
turas complexas de substncias vo-
lteis lipoflicas, geralmente odor-
feras e lquidas (Simes et. al., 2001).
Pesar cerca de 1 g da droga a
ser analisada, colocar em um gral
de vidro, adicionar cerca de 1 mL de
etanol absoluto e triturar. Pingar
uma gota em um papel de filtro,
evaporar e sentir o aroma, o qual
indica a presena de leos volteis.
5 - Resultados
Na amostra continha fragmen-
tos de folhas e caules de tamanhos
que variavam de 0,1 a 1,0 cm de
tamanho.
Observou-se que em 25 g da
amostra que 0,75 g correspondia a
fragmentos de materiais estranhos
planta. A Farmacopia Brasileira
recomenda que a porcentagem de
material estranho de outra parte da
planta tenha um limite de tolerncia
em torno de 10%.
A anlise microscpica da dro-
ga vegetal atravs dos cortes
histolgicos e a sua descrio
macroscpica foram comparadas
com dados da literatura, o que per-
mitiu confirmar que a droga vegetal
71
 Tabela 1- Resultados das reaes indicativas da presena ou ausncia de taninos em P. niruri
Reativos Anacardium occidentale Phyllanthus niruri
Reao com cloreto Frrico (Gerais) PRECIPITADO AZUL -
Reao com Soluo Aquosa de
PRECIPITADO CASTANHO -
Alcalides
Reao com Acetato Neutro de
Chumbo PRECIPITADO CASTANHO -
Reao com Soluo de Acetato de PRECIPITADO CASTANHO -
Cobre
Reao com Acetato de Chumbo e
PRECIPITADO CASTANHO -
cido actico Glacial
Reativo de WASICKY PRECIPITADO ROSA -
Reao com Cloreto Frrico
(Especfica) COLORAO VERDE -
(-) ausncia
Tabela 2- Resultados das reaes indicativas da presena ou ausncia de glicosdeos saponnicos.
Reativos Quilaia saponaria Phyllanthus niruri
Rossol + -
Mitchell + -
Rosenthalen + -
Reativo Sulfo-Vanlico + -
Liebermann + -
(+) presena
(-) ausncia
Tabela 3- Resultado das reaes indicativas da presena ou ausncia de glicosdeos flavanodicos.
Reativos Ginkgo biloba Phyllanthus niruri
Shinoda VERDE (flavonas) VERDE (flavonas)
Cloreto de Alumnio FLORESCNCIA AMARELO- FLORESCNCIAAMARELO-ACASTA-
ACASTANHADO ( flavonol) NHADO (flavonol)
AMARELO-ACASTANHADO
Cloreto Frrico VERDE (flavonas)
(flavonol)
Hidrxido de sdio AMARELA (flavonol) AMARELA (flavonol)
Tabela 4- Resultado das reaes da presena ou ausncia de glicosdeos antraquinnicos.
Reativos Dimorphandra mollis Phyllanthus niruri
Borntreger vermelho vermelho
Hidrxido de Sdio vermelho vermelho
Tabela 5- Resultados das reaes indicativas da presena ou ausncia de alcalides.
Reativos Chichona calisaya Phyllanthus niruri
Sheibler AMARELO CLARO AMARELO CLARO
Bourchardat AMARELO TIJOLO AMARELO TIJOLO
Dragendorff AMARELO TIJOLO AMARELO TIJOLO
Bertrand AMARELO TIJOLO AMARELO TIJOLO
Mayer BRANCO BRANCO
em anlise era mesmo a espcie 5.1 - Saponinas 5.2 - Flavonides
Phyllanthus niruri L (Souza, 2003).
Nos testes realizados para iden- Para as reaes de identifica- Para as reaes de identificao
tificar os taninos, foi usada como o de heterosdeos saponnicos de flavonides, utilizou-se como dro-
droga padro o cajueiro (Anacardium foi utilizada como droga padro a ga padro a Ginkgo (Ginkgo biloba
occidentale), droga vegetal que tem quilaia (Quilaia saponaria) para ). Os resultados das anlises mostra-
como principais constituintes qumi- compar-la com a droga em estudo. ram que a espcie P. niruri apresen-
cos os taninos, e a droga em estudo Os resultados demonstraram que a tou flavonides na sua composio
no indicou a presena de taninos P. niruri no possui saponinas (Ta- qumica, de acordo com que se pode
nos testes realizados (Tabela-1). bela-2). observar na tabela (Tabela-3).

72 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003

 5.3 - Glicosdeos
Antraderivados
Para os resultados das rea-
es indicativas da presena ou
ausncia foi utilizada como droga
padro o faveiro (Dimorphandra
mollis ) e a droga vegetal em
anlise - P. niruri apresentou,
na sua composio qumica,
indicativo da presena de glicos-
deos antraquinnicos na forma
oxidada, como podemos observar
na tabela (Tabela-4).
5.4 - Alcalides
Para as reaes de identifica-
o de alcalides, utilizou-se como
droga padro a quina (Chichona
calisaya) e a espcie P. niruri em
estudo apresentou resultado posi-
tivo na presena dos reativos para
alcalides, como se pode observar
na tabela (Tabela-5).
5.5 - leos Volteis
No teste realizado para indi-
car a presena ou ausncia de
leos volteis, no foi possvel, CAMPOS, A. H., SCHOR, N.
por meio dele, verificar a presen-
a de leos volteis na espcie em
anlise - P. niruri
6 - Discusso
Por meio das anlises realiza-
das, foi possvel identificar a dro-
ga vegetal em estudo como
Phyllanthus niruri (quebra-pe-
dra). Antes de se utilizar qualquer
droga no preparo de medicamen-
tos, deve-se submet-la a uma
anlise rigorosa. A identificao e
a pureza da droga, bem como a
avaliao de seus princpios ati-
vos so tarefas indispensveis
queles que buscam produtos de
qualidade.
De acordo com a literatura, o
Phyllanthus niruri apresenta em
sua constituio substncias como
glicosdeos antraquinnicos, fla-
vonides e alcalides, alm de
outras que no foram investigadas
no presente trabalho, mas que se
sabe fazem parte da constituio
qumica da planta. Acredita-se que
algumas dessas substncias sejam
responsveis pelo efeito terapu-
tico atribudo ao quebra-pedra,
porm no se sabe ao certo qual
dessas substncias especifica-
mente a responsvel por tal pro-
priedade. Assim, os constituin-
tes identificados na anlise
fitoqumica foram suficientes para
afirmarmos que a planta utilizada
era realmente o Phyllanthus
niruri, sendo identificada a droga
como verdadeira.
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Pesquisa
Fungos Filamentosos
O potencial multifuncional da nitrato redutase em pesquisas com biologia molecular de fungos
Jorge Fernando Pereira
Bilogo, MS em Microbiologia Agrcola,
Doutorando em Microbiologia Agrcola;
Universidade Federal de Viosa.
dgfernando@yahoo.com
Juliana Oliveira Lima
Biloga; Mestranda em Microbiologia Agrcola;
Universidade Federal de Viosa.
ju.olima@bol.com.br
Rodrigo Barros Rocha
Bilogo; Mestrando em Gentica e Melhoramento;
Universidade Federal de Viosa.
rodrigobarrosrocha@yahoo.com.br
Pilar Ximena Lizarazo Medina
Bacteriologista; MS em Microbiologia Agrcola;
Doutoranda em Microbiologia Agrcola;
Universidade Federal de Viosa.
pixilime@hotmail.com
Elza Fernandes de Arajo
Biloga; DS em Gentica UFRGS;
Prof Titular do Departamento de Microbiologia;
Universidade Federal de Viosa.
ezfa@ufv.br
Marisa Vieira de Queiroz
Biloga; DS em Gentica e Melhoramento ESALQ-
USP; Professora Adjunta do Departamento de
Microbiologia; Universidade Federal de Viosa.
mvqueiro@ufv.br
Ilustraes cedidas pelos autores
74 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
Introduo
ungos filamentosos podem
metabolizar uma srie de
compostos nitrogenados
para obterem o requeri-
mento nutricional neces-
srio para seu desenvolvi-
mento. Nesses organismos, o meta-
bolismo do nitrognio um processo
altamente controlado por um com-
plexo de protenas reguladoras, que
assegura grande eficincia na utiliza-
o das fontes de nitrognio dispon-
veis. Esse complexo constitudo
por uma srie de protenas que so
requeridas para que vrios compos-
tos secundrios sejam assimilados
quando as fontes preferenciais de
nitrognio, isto , o amnio ou a
glutamina, no esto disponveis
(Caddick et al., 1994; Marzluf, 1997).
Entre os compostos secundrios, o
nitrato inorgnico uma excelente
fonte utilizvel por muitos fungos
filamentosos. Seu transporte para o
meio intracelular mediado pela
permease do nitrato, e aps sua assi-
milao, ocorre a reduo seqencial
do nitrato a nitrito e do nitrito a
amnio, catalisada, respectivamen-
te, pelas enzimas nitrato e nitrito
redutase. O amnio considerado o
ponto de partida para o metabolismo
anablico do nitrognio em fungos e
a sua incorporao em molculas
orgnicas , ento, realizada por dois
sistemas: glutamato desidrogenase
(GDH) ou glutamina sintase (GS)/
Glutaminaamida: 2-oxoglutarato
amino transferase (GOGAT), que pro-
duzem glutamato e glutamina (Griffin,
1994) (Figura 1). A enzima nitrato
redutase de fungos um grande
complexo multiredox, que possui
duas subunidades idnticas, cada uma
composta de trs grupos prostticos
em domnios separados. Na extremi-
dade C-terminal, localiza-se o dom-
nio FAD, mais ao centro da protena,
o domnio heme, e, na extremidade
N-terminal, o domnio molibdnio. A
reao cataltica envolve a transfe-
rncia de um par de eltrons do
NADH ou NADPH para os domnios
FAD, heme e molibdnio e, ento,
para o nitrato. A especificidade pelo
doador de eltrons utilizada para
classificar as nitrato redutases
eucariticas em 3 grupos: NADH-
especfica (EC 1.6.6.1), que est pre-
sente na maioria das plantas superi-
ores e em algumas algas, NADPH-
especfica (EC 1.6.6.2), que encon-
trada em fungos e NAD(P)H-
biespecfica, que encontrada em
algumas plantas e em algumas algas
(Losada, 1976; Shen et al., 1976;
Renosto et al., 1982).
Em 1989, foi descrito o isola-
mento do primeiro gene da nitrato
redutase de fungos filamentosos uti-
lizando-se o organismo modelo
Aspergillus nidulans (Malardier et al.,
1989). Desde ento, genes que codi-
ficam para a enzima nitrato redutase
vm sendo clonados e seqenciados
em diversas espcies de fungos
filamentosos representados por or-
ganismos modelos de estudos gen-
ticos em eucariotos, espcies com
potencial de aplicao industrial ou
com importncia fitopatolgica e
micorrzica. O interesse na clonagem
desse gene baseado, principalmen-
te, no estabelecimento de protocolos
de transformao gentica cujo valor
biotecnolgico muito importante
por representar um mtodo de sele-
o geral e conveniente. Mas, alm
de marca de seleo para transforma- (Banks et al., 1993) e Botryotinia
o, esse gene tambm pode ser fuckeliana (Levis et al., 1997a) e um
utilizado para estudos de organiza- mximo de 12 ntrons para Hebeloma
o e regulao gnica, anlises cylindrosporum (Jargeat et al., 2000).
filogenticas, obteno de mutantes, Em Aspergillus fumigatus, A.
estudos de grupos de compatibilida- nidulans, A. niger, A. oryzae, A.
de vegetativa e como isca para parasiticus, Penicillium chrysogenum
deteco e isolamento de elementos e P. griseoroseum, ocorre a presena
transponveis. Baseado nesse con- de 6 ntrons que, embora possuam
texto, este trabalho tem como objeti- tamanhos diferentes, esto localiza-
vo apresentar resultados que contri- dos nas mesmas posies (Johnstone
buam para esse potencial multifunci- et al., 1990; Unkles et al., 1992;
onal do gene da nitrato redutase em Kitamoto et al., 1995; Chang et al.,
fungos filamentosos. Mesmo que, 1996; Haas et al., 1996; Amaar e
muitas vezes, dentro de uma mesma Moore, 1998; Pereira, 2001). Em
espcie, esse gene possa no ser Leptosphaeria maculans e carteri possuem 15 e 9 ntrons, res-
utilizado com toda essa potencialida- Stagonospora nodorum, esse gene
de, ele representa uma das maiores interrompido por 4 ntrons que cor-
versatilidades de uso na micologia respondem aos ntrons II, III, IV e VI
molecular. de Aspergillus e Penicillium (Williams
et al., 1994; Cutler et al., 1998), en-
Organizao dos genes de quanto em Beauveria bassiana (n-
assimilao do nitrato mero de acesso no Genbank X84950),
Fusarium oxysporum, Gibberella
O seqenciamento e a compara- fujikuroi, Metarhizium anisopliae
o das seqncias de genes que (nmero de acesso no Genbank
codificam para nitrato redutase tm AJ001141) e Neurospora crassa, ape-
contribudo para estudos de organi- nas 1 ntron est presente na mesma
zao gnica em fungos filamento- posio do ntron VI de Aspergillus e
sos, sendo esses estudos imprescin- Penicillium (Okamoto et al. 1991;
dveis para o conhecimento de carac- Diolez et al., 1993; Tudzynski et al.,
tersticas importantes como nmero 1996). O gene da nitrato redutase de
e tamanho de ntrons, seqncias H. cylindrosporum parece ser o ni-
envolvidas com mecanismo de co que possui ntrons (11 e 12) na
splicing, tamanho de regies promo- regio correspondente ao domnio
toras, ligao de genes e sentido da FAD (Jargeat et al., 2000). Pode-se
transcrio entre genes ligados. Um observar na Figura 2 que o tamanho
quadro comparativo da organizao mdio dos ntrons de, aproximada-
gnica entre os genes da nitrato mente, 58 pares de bases (pb), sendo
redutase de 16 diferentes espcies de o menor de 46 pb e o maior de 92 pb.
fungos filamentosos apresentado Na grande maioria das vezes, esses
na Figura 2. ntrons no apresentam similaridade
A anlise de seqncias do gene a no ser nas seqncias envolvidas
da nitrato redutase revela a ausncia com o processo de sua retirada
de ntrons nos fungos Ustilago maydis (splicing). Os ntrons encontrados
Figura 1 - Assimilao de nitrato em fungos filamentosos.
Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
nos genes que codificam a nitrato
redutase em eucariotos no inter-
rompem a seqncia codificadora
em xons com os respectivos dom-
nios funcionais da enzima, sendo
que a maioria deles parece estar
dentro e no entre os domnios fun-
cionais (Zhou e Kleinhofs, 1996). A
localizao dos ntrons conservada
dentro de fungos, algas e plantas
superiores, em relao a genes para
nitrato redutase, mas, mesmo assim,
difere entre esses grupos. Em algas,
os genes da nitrato redutase de
Chlamydomonas reinhardtii e Volvox
pectivamente, localizados nos dom-
nios molibdnio, heme e FAD. A
posio de 8 dos 10 ntrons em Volvox
idntica de Chlamydomonas. Os
quatro ntrons presentes em Oryzae
sativa, Phaseolus vulgaris, Lypersicon
esculentum e Nicotiana tobacum es-
to localizados, precisamente, na mes-
ma posio (Zhou e Kleinhofs, 1996).
Com base no nmero e na posio
dos ntrons presentes nos genes da
nitrato redutase de fungos filamento-
sos, algas e plantas, Zhou e Kleinhofs
(1996) no puderam afirmar se, du-
rante a evoluo, os ntrons foram
incorporados (gain hypotheses) ou
perdidos (loss hypotheses). Ento, os
ntrons podem ter sido inseridos no
gene da nitrato redutase aps a diver-
gncia entre fungos e plantas, ou o
ancestral desses grupos possua to-
dos os ntrons e esses foram perdidos
independentemente aps a divergn-
cia. Ainda, segundo esses autores, a
hiptese de embaralhamento de
xons (exon shuffling), em que as
seqncias que codificam regies es-
truturais ou funcionais da protena
estariam delimitadas por ntrons, no
parece se aplicar a esse caso, pois as
seqncias que codificam os domni-
os funcionais das protenas nitrato
redutase apenas so separadas por
ntrons em H. cylindrosporum (ntron
9 entre domnios molibdnio e heme).
Alm dos ntrons, a organizao
dos trs genes relacionados com a
assimilao do nitrato em fungos fila-
mentosos pode ser separada em, pelo
menos, quatro grupos diferentes (de
A a D). No grupo A, os trs genes
esto ligados, mas os genes da nitrato
e nitrito redutase so transcritos em
direes opostas, sendo o gene do
transportador transcrito na mesma
75
 Figura 2 - Comparao da organizao dos genes de assimilao do nitrato em fungos filamentosos. Em alaranjado, a regio
promotora intergnica dos genes nos quais foram relatadas ligao entre nitrito e nitrato redutase. As setas representam o sentido
da transcrio nesses genes. As caixas abertas indicam a regio estrutural com tamanho e posio dos ntrons em relao s regies
codificadoras dos domnios molibdnio, heme e FAD. O tamanho da regio promotora e dos ntrons dado em pares de bases.
O nmero de aminocidos das respectivas protenas dado direita.

direo da nitrito redutase. Essa orga-
nizao encontrada em A. nidulans,
A. niger, A. parasiticus, A. fumigatus
e P. chrysogenum (Johnstone et al.,
1990; Unkles et al., 1992; Chang et al.,
1996; Amaar e Moore, 1998; Haas e
Marzluf, 1995). O tamanho da regio
intergnica de 1.262 pb em A.
nidulans (Johnstone et al., 1990), 1.668
pb em A. niger (Unkles et al., 1992),
1.670 pb em A. parasiticus (Chang et
al., 1996), 1.229 pb em A. fumigatus
(Amaar e Moore, 1998) e 661 pb em P.
chrysogenum (Haas e Marzluf, 1995).
No grupo B, os trs genes tambm
esto ligados, mas o gene do transpor-
tador est entre os genes da nitrato e
da nitrito redutase, sendo transcritos
na mesma direo descrita no grupo
A. Essa organizao encontrada em
H. cylindrosporum (Jargeat et al.,
2003). No grupo C, os genes da nitrato
e da nitrito redutase esto ligados, so
transcritos na mesma direo, mas o
gene do transportador no est liga-
do, como observado em L. maculans
e S. nodorum (Williams et al., 1994;
Cutler e Caten, 1999). O tamanho da
regio intergnica de 1.438 pb em L.
maculans (Williams et al., 1994) e 829
pb em S. nodorum (Cutler e Caten
1999). No grupo D, apesar da posio
do transportador ainda no ter sido
determinada, os trs genes no pare-
cem estar ligados, como ocorre em
Neurospora crassa (Exley et al., 1993)
e em Gibberella fujikuroi (Tudzynski
et al., 1996).
Regulao do gene da
nitrato redutase
As maiores contribuies para o
conhecimento da regulao do meta-
bolismo do nitrognio em fungos
filamentosos baseiam-se nos traba-
lhos realizados com os organismos A.
nidulans e Neurospora crassa
(Caddick et al., 1994; Marzluf, 1997),
sendo que, nos ltimos anos, estudos
tambm tm sido relatados para ou-
tras espcies como, por exemplo,
Penicillium chrysogenum (Haas e
Marzluf, 1995; Haas et al., 1996).
A utilizao de fontes de nitrog-
nio secundrias controlada de ma-
neira positiva e negativa, existindo
um sistema de controle global e um

76 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003

especfico. A desrepresso de mais de
100 genes estruturais, incluindo, por
exemplo, genes que codificam trans-
portadores de aminocidos, transpor-
tadores de purinas, proteases
extracelulares e enzimas catablicas,
dependente da presena do indutor
e da ausncia de fontes preferenciais
de nitrognio (amnio e glutamina).
Essa desrepresso realizada tanto
pelo regulador global positivo areA
em A. nidulans e seus corresponden-
tes nit-2 em N. crassa e nre em P.
chrysogenum, quanto por regulado-
res especficos. O gene areA codifica
uma protena reguladora de 876 res-
duos de aminocidos que contm um
nico domnio de ligao ao DNA, o
qual reconhece e se liga a seqncias
que contm o core GATA (Kudla et
al., 1990; Langdon et al., 1995). As
protenas AREA, NIT-2 e NRE possu-
em somente 30% de homologia, mas,
considerando apenas o domnio de
ligao ao DNA, a identidade de
98% (Haas e Marzluf, 1995). Em AREA,
o domnio de ligao ao DNA cons-
titudo por um nico dedo de Zn com
quatro cistenas, seguido de um dom-
nio terminal bsico, que apresenta
uma estrutura compacta formada por
dois pares de folhas- seguidas por
uma -hlice e uma cauda no
estruturada. As cadeias laterais ao
dedo de Zn fazem contato altamente
hidrofbico no sulco maior da mol-
cula de DNA e a cauda carboxi-termi-
nal faz contato com o esqueleto de
fosfato (Scazzocchio, 2000). Elemen-
tos com, pelo menos, duas cpias de
seqncias GATA, que podem estar
na mesma direo, ou em direes
opostas, e com espao de, pelo me-
nos, 30 pb, so considerados fortes
stios de ligao para NIT-2 (Chiang e
Marzluf, 1994). Para P. chrysogenum,
Haas e Marzluf (1995) descreveram
fortes stios de ligao de NRE como
regies com, pelo menos, duas se-
qncias GATA com espaamento
entre 5 e 27 pb, configuradas na
mesma direo ou em direes opos-
tas. Elementos GATA separados por
74 ou 96 pb no demonstraram ser
fortes stios de ligao NRE (Haas e
Marzluf, 1995). Para A. parasiticus,
Chang et al. (2000) relataram a ligao
de AREA a segmentos de 42 pb da
regio promotora dos genes da nitrato
e da nitrito redutase que continham
um ou dois elementos GATA.
Outro gene importante para o
metabolismo do nitrognio o nmr
(do ingls nitrogen metabolism
repressor), que atua de maneira nega-
tiva, reprimindo a sntese de vrios
genes. O gene nmr codifica uma
protena de 54,8 KDa, que no pos-
sui domnio de ligao ao DNA, mas
capaz de se ligar a uma pequena
regio do domnio de ligao ao
DNA e regio carboxi-terminal da
protena NIT-2 (e possivelmente de
AREA), impedindo a ao dessa pro-
tena, sendo a glutamina o possvel
sinal para essa ligao (Xiao et al.,
1995). Pelo menos para AREA, ainda
existem outros dois nveis de
regulao: a transcrio de areA sendo possvel, neste caso, a
auto-regulada e a estabilidade do
mRNA de areA menor em clulas
que crescem em fontes de nitrognio
preferenciais (Platt et al., 1996). Des-
sa forma, na presena de fontes pre-
ferenciais, alm de uma menor esta-
bilidade do mRNA do gene areA, o
regulador NMR se liga protena
AREA j sintetizada e impede que
essa protena se ligue aos promoto-
res e induza a transcrio dos genes
relacionados com o metabolismo de
fontes secundrias de nitrognio. As-
sim, a clula assegura a assimilao
de nitrognio a partir de compostos
que so prontamente metabolizveis.
A induo do gene da permease
do nitrato e dos genes da nitrato
redutase (niaD para Aspergillus sp. e
P. chrysogenum ou nit-3 para N.
crassa) e nitrito redutase (niiA para
Aspergillus sp. e P. chrysogenum ou
nit-6 para N. crassa) requer sntese
de novo, sendo necessria a ausncia
das fontes preferenciais e a presena
de nitrato como indutor. Nesse caso,
alm do fator de regulao global,
necessria a presena de um fator
especfico chamado nirA em A.
nidulans e nit-4 em N. crassa
(Caddick et al., 1994; Marzluf, 1997).
A protena NIRA liga-se ao DNA a
partir de um domnio na sua regio
amino-terminal (Burger et al., 1991).
Essa protena se liga seqncia 5-
CTCCGHGG-3, sendo que foram de-
tectados stios putativos ou j com-
provados para essa protena em vri-
as espcies de ascomicetos (Punt et
al., 1995). Para o reconhecimento de
cis-elementos e expresso do gene
nit-3 em N. crassa (Feng e Marzluf,
1998), requerida uma interao
Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
especfica entre os fatores de
regulao NIT-2 e NIT-4. Em N. cras-
sa, um acmulo mximo de mRNA
de nit-3 ocorre apenas 15 minutos
aps a induo por nitrato, sendo
que o acmulo mximo de protena
ocorre aps 60 minutos, e em P.
chrysogenum transcritos de niaD so
detectados com 15 minutos de
induo, e atingem um nvel mximo
aps 60 minutos (Okamoto et al.,
1991; Haas et al., 1996). At a presen-
te data, a nica exceo o
basidiomiceto H. cylindrosporum,
onde o gene da nitrato redutase pos-
sui alto nvel de transcrio na pre-
sena de nitrato, uria, serina e glicina,
inexistncia de fatores de regulao
especficos. Entretanto, na presena
de amnio, ocorre uma forte, mas
incompleta, represso desse gene,
indicando a existncia de um sistema
de regulao geral (Jargeat et al.,
2000). Recentemente, foi reportado,
para H. cylindrosporum, que a trans-
crio dos genes da permease do
nitrato e da nitrito redutase tambm
no induzida por nitrato, mas
completamente reprimida por amnio
(Jargeat et al., 2003).
Relaes filogenticas
baseadas na protena
nitrato redutase
Apesar da protena nitrato redutase
apresentar regies comprovadamente
importantes para seu funcionamento,
outras regies parecem poder sofrer
variao sem acarretar perda de funcio-
nalidade para a protena. A regio N-
terminal e 2 regies curtas, entre os
domnios molibdnio e heme e heme e
FAD, apresentaram menor identidade
entre 17 outras protenas nitrato redutase
de plantas, algas e fungos quando fo-
ram comparadas por Zhou e Kleinhofs
(1996). Essa caracterstica de apresentar
regies conservadas que flanqueiam
regies que podem sofrer variao
interessante para estudos de filogenia.
Esses mesmos autores verificaram que
o gene da nitrato redutase pode ser
utilizado como relgio molecular, pois
genes de diferentes espcies evoluem
em uma taxa constante, e, baseados
nesse gene, estimaram o tempo de
divergncia entre fungos e plantas, em
torno de 1 bilho de anos e, entre algas
e plantas superiores, em torno de 750
77
 milhes de anos. Alm do uso como
relgio molecular, estudos filogenticos
com a protena nitrato redutase de fun-
gos filamentosos tm revelado uma
tendncia de agrupar espcies que per-
tenam a categorias taxonmicas co-
muns (Williams et al., 1994; Cutler et al.,
1998). Assim, esse gene possui caracte-
rsticas interessantes para uso em estu-
dos evolucionrios. Na Figura 3 apre-
sentada uma rvore filogentica no
enraizada baseada na seqncia de
aminocidos da protena nitrato redutase.
Para a construo dessa rvore, seqn-
cias da protena nitrato redutase de 16
fungos filamentosos e 1 planta foram
retiradas do GenBank na pgina do
National Center for Biotechnology
Information (www.ncbi.nlm.nih.gov)
por meio dos seguintes nmeros:
Aspergillus fumigatus (AF336236), A.
nidulans (M58291), A. niger (M77022),
A. oryzae (D49701), A. parasiticus
(U38948), Arabdopsis thaliana
(P11832), Beauveria bassiana
Figura 3 - rvore filogentica no enraizada, baseada em anlises pelo mtodo de
parsimnia da seqncia de aminocidos da protena nitrato redutase de vrios fungos
filamentosos. Os nmeros indicam porcentagem dos valores de bootstrap em anlise
com 1.000 rplicas.
78 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
(X84950), Botryotinia fuckeliana
(U43783), Fusarium oxysporum
(Z22549), Gibberella fujikuroi
(X90699), Hebeloma cylindrosporum
(AJ238664), Leptosphaeria maculans
(U04445), Metarhizium anisopliae
(AJ001141), Neurospora crassa
(X61303), Penicillium chrysogenum
(U20779), P. griseoroseum (AY255803),
Stagonospora nodorum (AJ009827) e
Ustilago maydis (AJ315577). O alinha-
mento de toda a seqncia de amino-
cidos foi realizado no programa
Clustal X (Thompson et al., 1997),
sendo o alinhamento resultante anali-
sado pelo mtodo de parsimnia no
programa PAUP* verso 3.1 (Swofford,
1993). Foi feita uma busca heurstica
e anlise de bootstrap com 1.000 rpli-
cas para gerar ndices de confiabilidade
para cada ramo.
Pode-se observar claramente a
tendncia de se agruparem as esp-
cies analisadas pela ordem qual
essas pertencem de acordo com a
taxonomia clssica. Dessa forma, a
seqncia de aminocidos da prote-
na nitrato redutase apresenta uma
aplicao para estudos filogenticos,
com forte reflexo da histria natural
dos fungos filamentosos.
Obteno de mutantes
deficientes na enzima
nitrato redutase
Uma das grandes vantagens na
aplicao do gene da nitrato redutase
a fcil obteno de mutantes es-
pontneos por seleo positiva via
resistncia ao clorato. Essa seleo
positiva, que favorece o crescimento
do mutante em relao ao selvagem,
baseada na similaridade entre a
molcula de nitrato e seu anlogo
txico, o clorato. Da mesma forma
que o nitrato, o clorato presente no
meio de cultura transportado para
o meio intracelular pela permease do
nitrato e reduzido a clorito pela
ao da enzima nitrato redutase. En-
tretanto, diferentemente do nitrito, o
clorito um composto txico que
promove a morte da clula. A teoria
de que o clorato por si s no
txico, mas se torna txico pela con-
verso a clorito como resultado da
ao da nitrato redutase, foi primei-
ramente sugerida por Aberg (1947) e
tem sido confirmada por uma srie
de trabalhos. Anlises do efeito do
clorito de sdio, tanto in vitro como
in vivo, sugerem que o clorito cause
estresse oxidativo em clulas de fun-
gos e, por causar oxidao de
biomolculas importantes, torna-se
txico (Ingram et al., 2003). Dessa
maneira, a clula que apresenta uma
enzima nitrato redutase funcional
morre e aquela que apresenta uma
forma no-funcional sobrevive, pois
no capaz de reduzir o clorato a
clorito.
Nesse momento, a colnia
mutante, que cresce no meio de cul-
tura, resistente ao clorato, mas no
necessariamente mutante para a
enzima nitrato redutase. Mutaes
em, pelo menos, cinco genes podem
levar ao fentipo de resistncia ao
clorato: (i) mutao no gene da
permease do nitrato (crnA), que in-
capacite a clula de absorver o clorato
do meio extracelular; (ii) mutao no
gene do regulador especfico da assi-
milao de nitrato (nirA), que impos-
Figura 4 - Obteno de mutantes nitrato redutase. 1-) Esquema do protocolo para obteno de mutantes resistentes ao clorato e
testes de crescimento para anotao da mutao; 2-) Vias metablicas envolvidas com o fentipo de resistncia ao clorato (possveis
genes mutados so mostrados em laranja); 3-) Fentipo de crescimento em placas contendo MM + nitrato (A), MM + nitrito (B) e
MM + hipoxantina (C) de mutantes de Penicillium griseoroseum resistentes ao clorato. Colnias que no crescem em A mas crescem
em B e C so mutantes nitrato redutase; S indica o tipo selvagem utilizado como controle positivo.

sibilite a clula de expressar a enzima (cnxA-J), que, no estando presente, obteno das colnias resistentes ao
nitrato redutase; (iii) mutao no gene torna ineficazes a enzima nitrato clorato, necessrio fazer uma dis-
do regulador geral da assimilao de redutase e outras enzimas depen- criminao do fentipo mutante por
nitrognio (areA), que tambm im- dentes desse cofator; e (v) mutao meio de um fcil teste de crescimen-
possibilite a clula de expressar a no prprio gene da nitrato redutase to em meio mnimo contendo as
enzima nitrato redutase; (iv) muta- (niaD), impossibilitando a clula de seguintes fontes de nitrognio: nitra-
o em algum gene envolvido na sintetizar essa enzima (Cove, 1976; to, nitrito, hipoxantina, glutamato e
biosntese do cofator molibdnio Cove, 1979). Dessa forma, aps a amnio . O crescimento ou no nes-
Tabela 1 - Testes de crescimento de mutantes resistentes ao clorato, em diferentes fontes de nitrognio.
Designao Testes de crescimento
Mutao
do mutante* Clorato Nitrato Nitrito Hipoxantina Glutamato Amnio
Nenhuma Selvagem - + + + + +
Nitrato redutase n iaD + - + + + +
Regulador especfico n irA + - - + + +
Cofator molibdnio cn xA-J + - + - + +
Regulador geral areA + - - - - +
Permease crn A + + + + + +
* denominao dos genes para Aspergillus n idulan s; + indica crescimento e - indica ausncia de crescimento.

Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003 79

 sas diferentes fontes (Tabela 1) ,
ento, correlacionado com a muta-
o em um dos cinco possveis genes
acima relacionados (Figura 4). Como
em todas as espcies de fungos
filamentosos estudadas at o mo-
mento, apenas uma cpia funcional
do gene da nitrato redutase foi en-
contrada, mutantes nitrato redutase
so reportados com alta freqncia.
A razo do teste de crescimento
em hipoxantina que, alm do re-
querimento por NAD(P)H, as
enzimas nitrato redutase so depen-
dentes de uma molcula chamada
cofator molibdnio. A ausncia des-
se cofator impossibilita a clula de
utilizar o nitrato como tambm
purinas como adenina, hipoxantina
e xantina como nica fonte de nitro-
gnio. Os mutantes incapazes de
crescer em nitrato e hipoxantina
apresentam uma perda pleiotrpica
da atividade das enzimas nitrato
redutase e xantina desidrogenase,
respectivamente. Como esses
mutantes so defectivos na sntese
de um cofator comum, tanto para a
nitrato redutase como para xantina
desidrogenase, os genes envolvidos
na sntese desse cofator foram deno-
minados cnx (do ingls common
component for nitrate reductase and
xanthine dehydrogenase) (Pateman
et al., 1964; Cove, 1979). Por meio
de testes de complementao entre
diferentes mutantes, Pateman et al.
(1964) reportaram a existncia de
vrios loci (cnx ABC, E, F, G e H)
relacionados com vrios genes res-
ponsveis pela produo do cofator
molibdnio, e Arst et al. (1982) rela-
taram a existncia de outro locus
(cnxJ). Unkles et al. (1997) compro-
varam que o locus cnxABC parte
de um nico gene que codifica uma
protena com dois domnios catalti-
cos requeridos para a sntese de um
intermedirio do cofator molibdnio.
Um protocolo para obteno de
mutantes deficientes na enzima ni-
trato redutase apresentado a seguir
e est esquematizado na Figura 4.
Esse protocolo baseia-se em espci-
es que apresentam reproduo
assexual e/ou sexual possibilitando
o uso de esporos na anlise. Como na
grande maioria das espcies de fun-
gos filamentosos os esporos so
uninucleados e contm genoma
haplide, a mutao expressa sem
80 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
efeito de dominncia. Mesmo assim,
algumas espcies de fungos no pro-
duzem esporos in vitro, e esse proto-
colo pode ser modificado para ob-
teno de mutantes por intermdio
de fragmentos de miclio, onde seto-
res resistentes ao clorato apresentam
crescimento mais vigoroso. Entretan-
to, em algumas espcies de fungos, a
resistncia ao clorato parece ser na-
tural, o que impossibilita a obteno
de mutantes por essa tcnica.
Protocolo para obteno de
mutantes nitrato redutase (segundo
Cove, 1976; Cove, 1979; Unkles et
al., 1989):
Preparar uma suspenso de
esporos em tween 80 0,05%
contendo cerca de 10 7 .ml -1
esporos;
Plaquear 0,1 ml dessa soluo
em meio mnimo (MM) slido
(Pontecorvo et al., 1953) sem
nitrato e acrescido de 470 mM
de clorato de potssio e 10 mM
de glutamato de sdio (clorato
de potssio 57,6 g; glutamato
de sdio monobsico 1,87 g;
KH2PO4 1,5 g; KCl 0,5 g; MgSO4
0,5 g; FeSO4 0,01 g; ZnSO4 0,01
g; glicose 10 g; gar 15 g; gua
destilada 1.000 ml; pH 6,8);
Incubar as placas a 25oC por
cerca de 7 a 10 dias;
Transferir as colnias resis-
tentes ao clorato para placas
contendo meio completo (MC)
slido, Pontecorvo et al. (1953)
modificado por Azevedo e Cos-
ta (1973) [meio mnimo adicio-
nado de peptona 2,0 g; casena
hidrolisada 1,5 g; extrato de
levedura 2,0 g; soluo de vita-
minas 1,0 ml; (biotina 0,2 mg;
cido p-aminobenzico 10,0 mg;
piridoxina 50,0 mg; tiamina 50,0
mg; cido nicotnico 100,0 mg;
riboflavina 100,0 mg; gua des-
tilada 100 ml); gar 15 g; gua
destilada 1.000 ml; pH 6,8];
Fazer purificao monosprica
dos mutantes;
Inocular as colnias resisten-
tes em placas de MM contendo
10 mM das seguintes fontes de
nitrognio : nitrato de sdio,
nitrito de sdio, cloreto de
amnio, hipoxantina e gluta-
mato de sdio;
Incubar a 25oC por 3 a 5 dias;
Verificar o crescimento e ano-
tar os fentipos mutantes;
Separar e identificar os
mutantes nitrato redutase.
Assim, o sistema nitrato redutase
apresenta vantagens sobre outros
sistemas, como a fcil obteno de
mutantes espontneos por seleo
positiva via resistncia ao clorato, e,
como no h emprego de mutag-
nese, a possibilidade de mutaes
secundrias que atinjam genes im-
portantes ou de interesse reduzi-
da. Tambm esses mutantes apre-
sentam um nico fentipo desej-
vel, no utilizar nitrato como nica
fonte de nitrognio, sendo que esse
fentipo dispensvel sem alterar o
crescimento ou fluxos metablicos
importantes.
Utilizao de mutantes
deficientes na utilizao do
nitrato em estudos de
grupos de compatibilidade
vegetativa
Isolados de uma espcie fngica
podem ser caracterizados pela com-
patibilidade ou incompatibilidade ve-
getativa. A compatibilidade ocorre
quando miclios de diferentes isola-
dos podem sofrer anastomoses e ori-
ginar heterocrios (hifas que contm
ncleos geneticamente diferentes),
enquanto a incompatibilidade ocorre
quando no h formao de hetero-
crios. Nem sempre possvel for-
mar essas anastomoses, principal-
mente quando os cruzamentos so
interespecficos ou intergenricos,
pois o fator determinante da intera-
o entre as clulas pode estar na
parede celular manifestando-se como
bloqueio da fuso celular (Peberdy,
1991). Os isolados que apresentem
compatibilidade podem ser coloca-
dos dentro de um mesmo grupo,
formando um grupo de compatibili-
dade vegetativa (GCV). Em fungos
de reproduo assexuada, isolados
de um mesmo GCV so mais simila-
res geneticamente que isolados de
diferentes GCV.
A heterocariose tambm a pri-
meira etapa para que fungos
assexuados troquem material genti-
co por meio de um ciclo alternativo
chamado parassexual. Nesse ciclo,
os diferentes ncleos no heterocrio
se fundem, originando diplides he-
terozigotos, e, a seguir, ocorre a pro-
duo de recombinantes por meio de
recombinao mittica e haploidiza-
o (Pontecorvo & Roper, 1952).
A deteco de heterocrios pode
ser alcanada pelo cruzamento de
indivduos portadores de diferentes
mutaes. Quando so formadas
anastomoses entre as hifas desses
diferentes mutantes, o heterocrio
pode ser visualizado j que o ncleo
de um indivduo contm o gene sel-
vagem que complementa a mutao
do outro. As diferentes mutaes
podem estar relacionadas, por exem-
plo, colorao da colnia, mas a
obteno de mutantes por tcnicas
de mutagnese tradicionais muito
trabalhosa, o que torna esse procedi-
mento difcil de ser empregado para
estudo com muitos isolados de cam-
po. Assim, vrios trabalhos reportam
o estudo de GCVs utilizando muta-
es auxotrficas que incapacitem a
clula de utilizar nitrato como nica
fonte de nitrognio (Puhala, 1985;
Correl et al., 1986; Brooker et al.,
1991). Nesses estudos, suficiente
fazer a triagem de populaes utili-
zando indivduos que contenham mu-
taes nicas em diferentes genes da
assimilao do nitrato, que possam
ser testados para a sua habilidade de
complementar as mutaes e de for-
mar heterocrio em meio contendo
nitrato como nica fonte de nitrog-
nio. Como o isolamento de mutantes
resistentes ao clorato gera mutaes
de diferentes tipos, essas mutaes
podem ser utilizadas como marcas
de seleo para a formao dos hete-
rocrios. Assim, esse sistema torna-
se simples e rpido para ser utilizado
para essa finalidade.
Estudos de compatibilidade ve-
getativa so de particular interesse
em fungos que se reproduzem
assexuadamente, j que os indivdu-
os dentro de um GCV podem trocar
informaes genticas por meio de
heterocariose e de ciclo parasexual.
Em fungos fitopatognicos, os GCVs
podem ser correlacionados com a
patogenicidade, embora essa corre-
lao no esteja sempre ligada.
Puhalla (1985) utilizou mutantes de-
ficientes na assimilao de nitrato
para testar a compatibilidade vegeta-
tiva entre 21 isolados de F. oxysporum,
reportando que membros do mesmo
GCV pertenciam mesma formae
speciales. Correl et al. (1986) tambm
utilizaram mutantes incapazes de
metabolizar nitrato em testes de com-
patibilidade vegetativa para identifi-
car F. oxysporum f. sp. apii raa 2 de
uma populao de raas de F.
oxysporum que colonizava razes de
aipo. Assim, o teste de compatibili-
dade vegetativa uma tima ferra-
menta para estudos de diversidade
gentica constituindo marcadores ge-
nticos naturais que podem ser utili-
zados para diferenciar isolados. Alm
disso, em fungos que se reproduzem
sexuadamente, esses estudos tam-
bm so importantes para determi-
nar genes relacionados com o tipo
sexual (mating type), importantes no
reconhecimento e desenvolvimento
do ciclo sexual.
Transformao gentica
baseada no gene da nitrato
redutase
Um dos principais passos no de-
senvolvimento de uma tecnologia para
manipulao e anlise molecular de
um organismo o estabelecimento de
um protocolo que permita introduzir
seqncias de DNA clonadas em uma
linhagem recipiente. A disponibilida-
de de um sistema de transformao
oferece possibilidade de adio e de
deleo de rotas metablicas em um
organismo de interesse, alterando o
fentipo selvagem para uma aplica-
o especfica. As seqncias a serem
introduzidas tm interesses distintos,
dependendo do tipo de organismo
estudado. Dessa forma, o principal
objetivo da clonagem de genes que
codificam nitrato redutase o estabe-
lecimento de protocolos de transfor-
mao baseados na complementao
de mutaes no gene da nitrato
redutase. Nesse ponto, alm das van-
tagens inerentes a esse sistema, outra
caracterstica importante ser basea-
do na complementao de uma muta-
o auxotrfica, o que evita a introdu-
o de genes de seleo baseados na
resistncia a drogas.
A transformao realizada pela
introduo do gene da nitrato redutase
em um mutante nitrato redutase por
biobalstica ou Agrobacterium
tumefaciens, sendo que o mtodo
mais comum o da transformao de
protoplastos pela tcnica do polieti-
lenoglicol (PEG)/CaCl2. Aps a trans-
Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
formao, os protoplastos so
plaqueados por pour-plate em meio
mnimo contendo estabilizador
osmtico e nitrato como nica fonte
de nitrognio. Apenas aquelas clu-
las mutantes onde o gene da nitrato
redutase se integrar, sero capazes
de crescer (Figura 5). Para tanto,
pode-se utilizar um gene da nitrato
redutase j isolado de um organismo
em uma espcie de interesse. Quan-
do o gene de uma espcie diferente
da espcie receptora, o sistema dito
heterlogo, e quando o gene foi
isolado do organismo receptor, o
sistema dito homlogo.
Nos sistemas heterlogos, geral-
mente h baixa similaridade entre o
vetor de transformao e o genoma
do organismo receptor, o que resulta
em baixa freqncia de transforma-
o, integrao aleatria e alto nme-
ro de cpias do vetor. Esse padro de
integrao aleatrio pode ser interes-
sante para obteno de mutantes pela
tcnica de REMI (do ingls restriction
enzyme-mediated integration), des-
crita por Schiestl e Petes (1991), que
uma variao da tcnica de transfor-
mao, onde enzima de restrio
adicionada mistura de transforma-
o juntamente com o plasmdeo line-
ar. Queiroz et al. (1998) verificaram
que o gene da nitrato redutase de F.
oxysporum se integrava aleatoriamen-
te no genoma de P. griseoroseum,
sendo essa caracterstica utilizada por
Soares (2002) para obteno de
mutantes de P. griseoroseum pela tc-
nica de REMI.
Mesmo assim, sistemas de trans-
formao homlogos tm sido de-
senvolvidos para vrios fungos fila-
mentosos, incluindo A. oryzae
(Unkles et al., 1989), Cephalosporium
Figura 5 - Seleo de transformantes basea-
da no gene da nitrato redutase. Placas com
meio mnimo contendo nitrato como ni-
ca fonte de nitrognio. (A) Controle neg-
ativo - protoplastos do mutante nitrato
redutase que no foram transformados;
(B) protoplastos do mesmo mutante que
foram transformados com gene homl-
ogo da nitrato redutase.
81
 acremonium (Whithead et al., 1990),
P. chrysogenum (Gouka et al., 1991),
Fusarium oxysporum (Diolez et al.,
1993), G. fujikuroi (Tudzynski et al.,
1996), B. cinerea (Levis et al., 1997a),
S. nodorum (Cutler et al., 1998) e P.
griseoroseum (Pereira, 2001). Na lite-
ratura, existem relatos para A. oryzae
(Unkles et al., 1989) e S. nodorum
(Cutler et al., 1998) de 100% de
integrao do vetor no locus da nitra-
to redutase, sendo que nesses estu-
dos foram analisados 22 transfor-
mantes para A. oryzae e 13 transfor-
mantes para S. nodorum. Para B.
cinerea (Levis et al., 1997a), a anlise
de 36 transformantes revelou 34
integraes homlogas, sendo 29
eventos de troca gnica. Mesmo que
a utilizao de genes homlogos au-
mente a probabilidade de ocorrncia
de integrao em stios homlogos,
para fungos filamentosos e outros
organismos eucariotos, parecem ser
mais comuns eventos de integrao
heterloga. Sistemas de transforma-
o homlogos, baseados na com-
plementao de mutaes nitrato
redutase, desenvolvidos para
Cephalosporium acremonium
(Whitehead et al., 1990) e P.
chrysogenum (Gouka et al., 1991)
resultam, na maioria dos transfor-
mantes, na integrao do vetor em
stios diferentes do locus da nitrato
redutase, enquanto que G. fujikuroi
(Tudzynski et al., 1996) e F.
oxysporum (Diolez et al., 1993) ocor-
reu um nmero similar de integra-
es, dentro e fora desse locus.
Um sistema de transformao com
alta incidncia de integrao homlo-
ga, especialmente troca gnica, pode
ser utilizado para estudos de regies
importantes, tanto em nvel de
regulao como em nvel estrutural.
Assim, mutaes geradas in vitro,
como alterao dos stios de ligao
de protenas reguladoras, podem ser
introduzidas e avaliadas in vivo no
exato local onde reside o gene. Alm
disso, essa alta taxa de integrao
homloga interessante em experi-
mentos de co-transformao, pois di-
minui a probabilidade de integraes
em stios heterlogos que sejam im-
portantes para o metabolismo celular
e/ou de interesse biotecnolgico.
Vrios trabalhos relatam a utili-
zao de vetores de transformao
que carregam o gene da nitrato
82 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
redutase como marcadores de sele-
o em experimentos de co-trans-
formao para introduzir genes de
interesse biotecnolgico. Por exem-
plo, Ribeiro (2001) relatou a obten-
o de transformantes com at 89%
de aumento na produo de poliga-
lacturonase quando co-transformou
um mutante nitrato redutase de P.
expansum com o plasmdeo pPE 15,
que carrega o gene homlogo de
poligalacturonase, e o plasmdeo
pNH24, contendo o gene da nitrato
redutase de F. oxysporum como
marcador de seleo. Linhagens
transformantes de A. oryzae apre-
sentaram a produo de poligalactu-
ronase aumentada em at 3,2 vezes
quando transformadas com um gene
de poligalacturonase de Penicillium
janthinellum, sendo os transforman-
tes selecionados pela complemen-
tao de uma mutao nitrato
redutase (Ishida et al. 1997). Cardo-
so et al. (2003) utilizaram o gene
homlogo da nitrato redutase de P.
griseoroseum para introduzir uma
construo do gene da pectina liase
e obtiveram transformantes com au-
mento expressivo na atividade des-
sa enzima.
Utilizao do gene da
nitrato redutase como
vetor de expresso
Uma outra perspectiva na apli-
cao biotecnolgica do gene da ni-
trato redutase sua utilizao como
vetor de expresso. Isso baseado
nas anlises de expresso onde so
observadas grandes quantidades de
transcrito do gene da nitrato redutase
apenas poucos minutos aps sua
induo por nitrato (Okamoto et al.,
1991; Haas et al., 1996), sendo esse
indutor acessvel e de baixo custo.
Essa perspectiva importante uma
vez que muitos genes de valor bio-
tecnolgico somente so expressos
na presena de um indutor especfi-
co que, muitas vezes, oneroso e
acarreta a inviabilidade da aplicao
industrial. Para tanto, a regio estru-
tural do gene de interesse pode ser
clonada sob controle do promotor do
gene da nitrato redutase, abrindo a
possibilidade para a induo do gene
por uma fonte mais acessvel e ape-
nas no momento em que o indutor
estiver presente.
Uso da nitrato redutase
para deteco e isolamento
de elementos
transponveis
Elementos transponveis so se-
qncias de DNA que podem se
mover no genoma integrando-se
em regies no homlogas, e que
constituem importantes agentes de
mutao e reorganizao gnica,
sendo tambm utilizados em siste-
mas de inativao de genes. Assim,
detectar e isolar esses elementos
um importante passo para estudos
de biologia bsica e aplicada em
um organismo. Diferentes estrat-
gias so empregadas para o isola-
mento de elementos transponveis
em fungos filamentosos. Entre es-
sas diferentes estratgias, o mtodo
de armadilha para transposons
(transposons trapping) o me-
lhor mtodo para deteco e isola-
mento de elementos transponveis
ativos. Esse mtodo requer, alm
de um sistema de seleo positiva
de mutantes espontneos, que o
gene alvo esteja clonado e caracte-
rizado. Conforme discutido anteri-
ormente, um dos melhores siste-
mas para seleo positiva de
mutantes espontneos o sistema
nitrato redutase. Dessa maneira,
esse sistema vem sendo emprega-
do com muito sucesso para o isola-
mento de vrios elementos trans-
ponveis em fungos filamentosos.
Os elementos Fot1, impala, Ant1,
Vader, Flipper e hupfer, so exem-
plos de transposons clonados pela
seleo de mutaes espontneas
no gene da nitrato redutase em
Fusarium oxysporum, Aspergillus
niger, A. fumigatus, Botrytis cinerea
e Beauveria bassiana (Daboussi et
al., 1992; Langin et al., 1995; Glayzer
et al., 1995; Amutan et al., 1996;
Levis et al., 1997b; Maurer et al.,
1997).
Para isolar esses elementos utili-
zando-se o sistema nitrato redutase,
necessrio isolar mutantes nitrato
redutase e caracterizar, por hibridiza-
o com o gene alvo, o tipo de
mutao que originou o fentipo
mutante. Nos mutantes isolados po-
dem ocorrer mutaes de diferentes
tipos no gene da nitrato redutase,
como, por exemplo, mutaes pon-
tuais, delees ou inverses. Alm
 Figura 6 - Esquema da deteco e isolamento de elementos transponveis utilizando o gene da nitrato redutase como isca.
desses tipos, tambm pode ocorrer a
insero de um fragmento de DNA,
como a insero de um elemento
transponvel. Assim, espera-se que o
resultado da hibridizao apresente
algum mutante com o fragmento do
gene alvo maior quando comparado
ao tipo selvagem (Figura 6). Aps a
obteno de um mutante com a in-
sero, pode-se fazer um teste de
estabilidade plaqueando-se esporos
do mutante em meio mnimo conten-
do nitrato como nica fonte de nitro-
gnio. Se a insero for oriunda de
um transposon ativo, esse pode sal-
tar e reconstituir o fentipo selva-
gem, apresentando maior instabili-
dade. O fragmento inserido, ou parte
dele, pode ser recuperado por meio
de bancos genmicos parciais ou de
amplificao com oligonucleotdeos
especficos e, ento, seqenciado e
caracterizado.
Mesmo que o gene da nitrato
redutase no tenha sido clonado para
uma espcie de interesse, h possibi-
lidade de usar um gene heterlogo
conforme realizado com sucesso por
Daboussi et al. (1992). Esses autores
introduziram o gene da nitrato redutase
de A. nidulans em uma linhagem
mutante para nitrato redutase de F.
oxysporum e isolaram o elemento
Fot1 inserido no gene heterlogo.
Assim, a fcil seleo de mutantes
nitrato redutase tm-se mostrado uma
tima ferramenta no isolamento de
elementos transponveis ativos em
diferentes espcies de fungos fila-
mentosos.
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Pesquisa
Estrutura e termoestabilizao
Carla M. Y. Lemos
Lab. de Bioqumica e Microbiologia aplicada
IBILCE - UNESP, Ps Graduao em Microbiologia
Aplicada IB/UNESP - Rio Claro-SP
Erica Fuchs
Department of Food Science and Human Nutrition
Iowa State University, IA-USA
Eleni Gomes
Lab. de Bioqumica e Microbiologia aplicada
Departamento de Biologia
IBILCE - UNESP - So Jos Rio Preto-SP
Roberto Da Silva
Lab. de Bioqumica e Microbiologia aplicada,
Departamento de Qumica e Cincias Ambientais,
IBILCE - UNESP - So Jos Rio Preto-SP
dasilva@qca.ibilce.unesp.br
Ilustraes cedidas pelos autores
86 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
Glucoamilase:
Estrutura e termoestabilizao de glucoamilase por tcnicas moleculares
Resumo
A glucoamilase (GA) uma
enzima hidroltica que catalisa a libe-
rao sucessiva de -D-glucose a par-
tir do amido e oligossacardeos relaci-
onados. A GA catalisa eficientemente
a reao de sacarificao do amido a molcula de substrato (James e Lee,
dentro de uma faixa estreita de tem-
peratura. A sua termoestabilidade li-
mitada afeta seu uso no processo
industrial, onde a incubao prolon-
gada em altas temperaturas necess-
ria. As estratgias tradicionais para
melhorar a termoestabilidade da GA
de Aspergillus, tais como a imobiliza-
o e modificao qumica tm falha-
do no uso industrial. Atualmente, as
tcnicas de evoluo dirigida utilizan-
do a biologia molecular proporcio-
nam uma importante ferramenta para
melhorar ou mesmo criar novas pro-
priedades nas enzimas existentes, em
um curto espao de tempo. Esta revi-
so apresenta a importncia, estrutura
e funo da glucoamilase e as recen-
tes estratgias da biologia molecular
como ferramenta para melhorar a ter-
moestabilidade desta enzima.
1. Glucoamilase de
Aspergillus
A glucoamilase (-1,4-glucan
glucohidrolase, EC 3.2.1.3), tambm
conhecida como amiloglucosidase,
uma enzima hidroltica que catalisa a
quebra das ligaes glicosdicas - dustrial, onde a atuao prolongada
1,4 a partir de uma extremidade no
redutora das molculas de amilose
ou amilopectina do grnulo de ami-
do e oligossacardeos relacionados
liberando -D-glucose. Em uma ve-
locidade menor, a glucoamilase tam-
bm atua hidrolisando as ligaes -
1,6 (Fleetwood e Weigel, 1962). Su-
gere-se, portanto, que a ao da
glucoamilase ocorra atravs de um
mecanismo multisseriado no qual a
enzima atua aleatoriamente em toda
1997).
A glucoamilase (GA) ampla-
mente usada na indstria alimentcia
para a produo de xaropes com alto
teor de glucose e tambm empre-
gada na produo de lcool e xaro-
pes com alto teor de frutose (1989;
Brumm, 1998; Mathewson, 1998).
Vrios microrganismos, plantas
e animais produzem glucoamilase.
Estas enzimas disponveis comercial-
mente so, na sua maior parte, pro-
duzidas por linhagens dos fungos
Aspergillus e Rhizopus. Dentre estas,
a glucoamilase de Aspergillus a
mais termoestvel, apresentando a
mxima atividade em torno do pH
4,5, em temperaturas de 50 a 55C,
mas ela rapidamente inativada em
temperaturas prximas a 60C
(Manjunath et al.,1983; Brumm, 1998).
A glucoamilase catalisa eficien-
temente a reao de sacarificao
dentro de um limite relativamente
estreito de temperatura, porque a
sua conformao cataliticamente ati-
va muda com o aumento da tempe-
ratura. Esta termoestabilidade limi-
tada afeta seu uso no processo in-
em altas temperaturas necessria.
Na produo de xaropes com alto
teor de glucose, uma pasta de amido
(30-40% BS) primeiro liquefeita a
105C por 5 minutos e em seguida,
 DC
Figura 1. Imagem da estrutura estendida da glucoamilase de Aspergillus niger idntica a glucoamilase de Aspergillus awamori.
No lado esquerdo o domnio cataltico (DC), ao centro o filamento ligante ou linker (L) e direita o domnio de ligao ao
substrato (amido) (DLS).
http://nte-serveur.univ-lyon1.fr/nte/heyde/www.public.iastate.edu/_pedro/glase/glase.html (10/10/03)
a 95C por 2 horas, usando a a-
amilase bacteriana termoestvel, em
pH 6.0-6.5. Finalmente, o amido
liquefeito resfriado a 60C e
hidrolisado por mais 48 a 72 horas
usando a glucoamilase (James e Lee,
1997, Brumm, 1998). Est claro que
a termoestabilidade da glucoamila-
se determina a velocidade do pro-
cesso como um todo. Trabalhar em
altas temperaturas no apenas pode
acelerar a taxa da reao e conse-
quentemente diminuir o tempo do
processo, como tambm pode pre-
venir a contaminao microbiolgi-
ca, alm de reduzir a viscosidade da
mistura de reao. Portanto, o de-
senvolvimento de uma glucoamila-
se mais termoestvel poder contri-
buir para a otimizao do processo
de sacarificao do amido. Entretan-
to, o conhecimento da estrutura da
protena e o processo de termoinati-
vao da enzima so necessrios
para elaborao de prognsticos ra-
cionais e planos efetivos de experi-
mentos de estabilizao da estrutura
proteica.
A glucoamilase de Aspergillus
codificada por um nico gene, mas
existem duas ou trs formas variveis
da enzima produzidas por protelise
limitada (Svensson et al., 1986). Pazur
et al (1971) constatou que as formas
da glucoamilases de Aspergillus niger
so glicoproteinas que possuem quan-
tidades diferentes de glicosilaes.
Como em outras protenas, aps a
sntese no citoplasma, a GA trans-
portada em um estado desdobrado
atravs da membrana do retculo
L DLS
endoplasmtico (RE). Durante o sub-
seqente processo de dobramento,
ocorre a O-glicosilao do linker,
filamento que liga o domnio cataltico
(CD) ao domnio de ligao ao subs-
trato (DLS), e pontes dissulfetos so
formadas (Pryer et al, 1992; Gaut e
Hendershot, 1993). Assim, a GA, na
sua conformao nativa estendida,
assume uma forma de alteres, onde
dois domnios volumosos, o domnio
cataltico e o domnio de ligao ao
amido, esto ligados por um filamento
fino como mostra a figura 1. Esta
uma imagem simplificada ilustrativa,
uma vez que a estrutura real da GA
completa ainda no est disponvel.
A organizao dos domnios da mo-
lcula tem sido deduzida atravs das
diferentes tcnicas biofsicas e rela-
tos disponveis (Coutinho, 1997;
Sauer, 2000).
As inmeras protenas desdo-
bradas, que entram no lmem do RE,
devem ser protegidas de quaisquer
agresses e serem mantidas em um
estado de dobramento-competente.
Dobramentos ineficientes ou muta-
es em protenas secretadas resul-
tam em enzimas com conformao
incorreta e defeito na atividade
(Bonifacino e Klausner, 1994).
Em Aspergillus awamori, o gene
codifica uma GAI de tamanho com-
pleto contendo de 615 a 616 resduos
de aminocidos (figura 2), bem como
o peptdeo sinalizador de secreo
no N-terminal. O peptdeo sinalizador
cortado aps a secreo da prote-
na pela clula. O outro maior produ-
to de protelise da GAI (diz-se da GA
Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
competente) a GAII resultante da
perda do stio de ligao ao substrato
localizado na extremidade C-termi-
nal. A GAII uma mistura de
polipeptdeos de tamanhos entre 512
e 514 resduos de aminocidos, com
atividade cataltica normal mas sem a
habilidade para se ligar ao amido no
estado natural, no gelatinizado
(Svensson et al., 1986).
As protenas originais de
Aspergillus niger e Aspergillus
awamori, cujas seqncias so idn-
ticas (Svensson et al., 1989; Nunberg
et al., 1984), consistem de trs prin-
cipais reas funcionais (Coutinho e
Reilly, 1994 a-b, Coutinho e Reilly,
1997): (1) o domnio cataltico, cons-
titudo dos resduos 1 ao 440, (2) o
filamento ligante, formado pelos re-
sduo 441 ao 512, que altamente O-
glicosilado, e (3) um domnio de
ligao ao amido no estado natural
na extremidade C-terminal, conten-
do os resduo 513 a 616 (Svensson et
al., 1986; et al., 1989). Alm da regio
de O-glicosilao do linker, dois
outros stios de N-glicosilao esto
localizados nos resduos Asn 171 e
Asn 395 (Svensson et al., 1989; Aleshin
et al., 1992). Acredita-se que os res-
duos de carboidratos desempenham
uma importante funo na estabiliza-
o da glucoamilase (Manjunath et
al.,1983, Svensson et al.,1989;
Williamson et al., 1992a). Em altas
temperaturas, a GA de A. niger, qui-
micamente desglicosilada, (Shenoy
et al., 1984) e a glucoamilase de A.
awamori, geneticamente truncada,
sem parte da regio de O-glicosilao
87
 (Evans et al, 1990), deterioraram-se
mais rapidamente do que as suas
formas selvagens. Alm disso, a GAII
em que falta apenas do domnio de
ligao ao substrato, tem termoesta-
bilidade similar a da GAI (Svensson
et al., 1986), enquanto que uma
glucoamilase especial (GAI), na qual
faltam parte da regio O-glicosilada e
o domnio de ligao ao amido,
menos estvel do que a sua forma
original (Hayashida et al., 1989). A
regio de O-glicosilao tambm fa-
cilita a secreo de GA (Evans et al.,
1990).
A estrutura da GA nativa muito
difcil de determinar em funo do
alto grau de glicosilao. Aleshin et
al (1992) determinou a estrutura cris-
talina de uma GA muito prxima da
forma nativa denominada A. awamori
var. X100 (GA) (figura 3), a qual foi
obtida por protelise limitada com
subtilisina e apresenta os primeiros
470 resduos de aminocidos da pro-
tena original. Esta seqncia de ami-
nocidos da GA 99,4% similar a
GAI de A. niger e A. awamori, com
uma deleo no resduo 102 (Aleshin
et al, 1992, 1994a). Assim, o estudo
desta estrutura cristalina elucidou a
conformao do domnio cataltico
completo e a conformao da primei-
ra metade N-terminal da regio O-
glicosilada da glucoamilase de
Aspergillus. A estrutura cristalina da
GA de A. awamori var. X100 mos-
trou que o domnio cataltico consis-
te de treze a-hlices que compreen-
dem cerca de 51% dos resduos de
aminocidos do polipeptdeo total, e
regies menores de filamentos
antiparalelos. Doze das -hlices
esto arranjadas dentro de uma estru-
tura denominada barril /, consis-
tindo de seis -hlices externas e seis
internas que envolvem o stio
cataltico em forma de funil, constitu-
do por seis segmentos / altamen-
te conservados (Sauer, 2000). O stio
cataltico da GA possui uma barreira
de resduos hidrofbicos no centro,
os quais separam o ncleo em duas
regies de volume morto (void), con-
tendo apenas gua. Uma serve como
o stio ativo propriamente dito e a
outra, tem uma funo ainda no
conhecida (Aleshin et al., 1994a). O
stio ativo contm Glu179 e Glu400
88 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
Figura 2. Seqncia de aminocidos (1 letra) da GA de A. niger. Letras vermelhas: -
helice; letras azuis: fita-; C dentro dos retngulos: resduos de cistenas envolvidos
em pontes dissulfetos; N dentro dos retngulos: sitios N-glicosilados; T e S dentro dos
retngulos: stios O-glicosilados; E dentro dos retngulos: resduos dos aminocidos
catalticos glutmico 179 e 400; seqncias sombreadas: regies conservadas S1 a S5;
seqncia sublinhada: sitio de ligao ao substrato. Fonte: Flory, 1993.
como os dois resduos de aminoci- com 2 unidades de glucoses ligadas
dos catalticos localizados no fundo N-glicosidicamente nos resduos Asn
do stio (Harris et al., 1993; Sauer, 171 e Asn 395, formam um cinto de
2000). A estrutura em barril / do glicosilaes ao redor do domnio
DC da GA de A. awamori, A. niger e cataltico (Aleshin et al, 1992). Foi
de Saccharomyces fibuligera so si- sugerido que a outra parte altamente
milares, sendo que esta ltima apre- O-glicosilada (aminocidos de 472 a
senta 14 -hlices, 12 das quais esto 512) envolva o domnio cataltico
na conformao barril / (Sevcik et como uma continuao do resduo
al, 1998; Sauer et al, 2000). Esta 471, fazendo com que o domnio de
conformao contrasta com a ligao ao amido fique prximo ao
topologia de organizao em barril stio ativo (Sauer et al, 2000). O
/ encontrada em outras enzimas segmento C-terminal do linker con-
amilolticas tais como e -amilases tm cerca de 30 aminocidos, princi-
(Buisson et al., 1987; e Mikami et al., palmente serina e treonina, sendo,
1993) e ciclodestrina glucosiltransfe- portanto, muito O-glicosilado. A esta
rases (Klein e Schulz, 1991). Obser- parte particular do linker tem sido
vou-se uma pequena similaridade atribuda papis na estabilidade, se-
entre a estrutura da GA e protenas creo e na digesto do amido cru
transportadoras de glucose. Assim, a (Libby et al, 1994; Sauer et al, 2000).
organizao das hlices na GA pode Embora algumas caractersticas como
ser relevante para a conformao de a compactao da conformao do
protenas que transportam glucose barril /, a proteo dos carboidra-
(Aleshin et al, 1994a). tos e a regio O-glicosilada, faam a
O segmento O-glicosilado est GA de Aspergillus mais estvel do
numa conformao de cinto estendi- que algumas protenas, uma maior
do em torno do barril / cataltico. estabilidade ainda requerida para
Isto sugere que este segmento serve os processos industriais, como expli-
como um elo de ligao estrutural cado anteriormente.
entre o domnio cataltico e o dom- O domnio de ligao ao amido
nio de ligao. A primeira parte (ami- possui este nome por causa da sua
nocidos 441 a 471) desta regio O- capacidade de se ligar ao grnulo de
glicosilada possui cerca de 10 resdu- amido nativo e permitir sua digesto
os de manoses expostos, que juntos pelo domnio cataltico (Svensson et

Figura 3. Esquema da glucoamilase (GA) de Aspergillus awamori var. X100 (Aleshin
et al., 1992). - hlices (H1 a H13) so simbolizadas por cilindros, stios de O-
glicosilao so representados por hexgonos simples, e stios de N-glicosilao so
simbolizados por cadeias de trs hexgonos.
al., 1983). Este domnio parece ter a
capacidade de ligar a GA parede da
clula isto porque tem afinidade por
-1,4 e -1,6 glucanos que pertencem
parede celular. Esta afinidade au-
menta a concentrao de GA prxima
da micromembrana da clula
(Neustroev et al., 1993). A GAII, na
qual faltam os resduos 513 a 616, tem
uma habilidade semelhante a GAI
para digerir amido solvel, mas pos-
sui uma habilidade drasticamente re-
duzida para se ligar e hidrolisar o
amido nativo (Svensson et al., 1989).
Recentemente, foi demonstrado que
o DLS isolado, atuando em grnulos
de amido juntamente com a GAII,
apresentaram um efeito sinergstico
na degradao do substrato insolvel,
sugerindo que o domnio de ligao
ao substrato se liga ao amido como
uma poro individual e rompe a
compacta estrutura do grnulo de
amido facilitando a hidrlise pelo
domnio cataltico (Southall et al, 1999;
Sauer et al, 2000). O domnio de
ligao ao amido da GA possui uma
significante similaridade de seqn-
cia de aminocidos com o domnio de
ligao ao amido da ciclodextrina gli-
cosiltransferase (CGTase) (Svensson
primariamente catalise a clivagem
et al., 1989). A estrutura tridimensional
da CGTase globular, contendo de 6
a 8 fitas (Klein e Schulz, 1991). A
estrutura do domnio de ligao ao
amido da GA revela uma estrutura
bem definida em fitas consistindo
de um par paralelo e 6 pares
antiparalelos que formam um barril
aberto na lateral. Dois stios de liga-
o para outros ligantes foram encon-
trados neste domnio, sendo cada um
no final da molcula em faces opostas
(Sorimachi et al., 1996). O mecanismo
proposto de ligao deste domnio
aos grnulos de amido, parece envol-
ver a formao de um complexo de
incluso entre os resduos hidrofbicos
do domnio de ligao e os grnulos
de amido (Goto et al., 1994).
Existem quatro pontes dissulfe-
tos na GA, das quais trs esto no
domnio cataltico e uma no domnio
de ligao. No domnio cataltico, as
pontes esto entre os resduos 210 e
213 (conectando o N-terminal com o
meio da hlice 7), 262 e 270 (conten-
do um filamento antiparalelo) e 222
e 449 (associando o trigsimo res-
duo O-glicosilado do cinto com o
domnio cataltico) (Aleshin et al.,
1992). Experimentos sugerem que
Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
existe uma ligao dissulfeto entre os
resduos 509 e 604 que conecta o N-
terminal com o C-terminal do dom-
nio de ligao ao substrato (Coutinho
e Reilly, 1994 b).
Existem dois resduos N-glicosi-
lados (Asn 171 e Asn 395) na GA, nos
arredores do stio ativo. Em cada
caso, o N da Asn est ligado posio
C1 do primeiro resduo de acar (N-
acetil-D-glucosamina), que est liga-
do por (14) ao segundo (N-
acetil-D-glucosamina) que por sua
vez se liga ao terceiro resduo (D-
manose) (Aleshin et al., 1992). O
nmero total de resduos de acares
para formar a cadeia glicosil ligada a
Asn 171 e Asn 395 5 e 8 respectiva-
mente (Aleshin et al., 1994 a). A
mutao Asn 395 Gln que removeu
o stio de N- glicosilao no resduo
395, diminuiu drasticamente tanto a
secreo como a termoestabilidade,
mas no alterou a atividade especfi-
ca (Chen et al., 1994 b).
Embora a GA de A. awamori
hidroltica de ligaes a (1,4) com
liberao de -glucose a partir de
uma extremidade no redutora da
cadeia de amido e oligossacardeos,
ela tambm cliva ligaes glicosdicas
a (1,6) com uma eficincia cataltica
(Kcat/ Km) por volta de 500 vezes
menor do que para as ligaes a (1,4)
(Fleetwood e Weigel, 1962).
2. Termoestabilizao da
Glucoamilase
2.1. Estratgias tradicionais
A modificao qumica e a imo-
bilizao so as duas principais estra-
tgias tradicionais que tm sido ex-
ploradas para melhorar a termoesta-
bilidade da GA.
Modificao qumica: altera um
grupo funcional especfico nas pro-
tenas, tal como um grupo carboxila,
por reao qumica. Embora esta
tcnica tenha aumentado a estabili-
zao da a -quimotripsina em 1000
vezes (Moshaev et al., 1988), ela
geralmente tem um rendimento ne-
gativo ou relativamente muito pe-
queno na termoestabilizao da GA
(Sinitsyn et al.,1978; Munch e Tritsch,
1990).
89
 Imobilizao: geralmente resul-
ta em alguma perda da atividade
enzimtica (Lee et al., 1976; Svensson
e Ottesen, 1981; Lenders e Crichton,
1988), mas apesar disso, foi usada
em GA porque ela permite o proces-
so contnuo de operao. Embora
muitas GAs imobilizadas tenham
melhor estabilidade do que as formas
solveis, elas ainda no substituram
estas ltimas no uso industrial, isto
porque as GAs imobilizadas devem
ser usadas em temperaturas operaci-
onais baixas a fim de serem preserva-
das por vrios meses, e continuarem
viveis (Lee et al., 1976). Desde que
a energia de ativao para a atividade
enzimtica deva ser menor do que
para a inativao da enzima, uma
temperatura de 38 a 40C recomen-
dada para a GA imobilizada. Entre-
tanto, o decrscimo na temperatura
operacional resulta numa baixa taxa
de reao e em contaminao
microbiolgica, que menos facil-
mente controlado em fbricas do que
em laboratrio. Lee et al., (1976)
relataram que a GA imobilizada ren-
deu xaropes com teores mais baixo
de glucose, 1,0-1,5%, e de Dextrose
Equivalente (DE), 1,0-1,5 unidades,
do que aqueles produzidos por
enzimas solveis. Isto atribudo a
limitao da difuso de partculas de
glucose, que resulta em um gradien-
te de concentrao de glucose e,
consequentemente, leva a uma mai-
or incidncia de reaes reversveis
do que se o gradiente no estivesse
presente (Lee et al., 1980). Alm
disso, numa aplicao real, as altas
concentraes do substrato estabili-
zam to bem a GA que o aumento da
termoestabilizao proporcionado
pela imobilizao torna-se relativa-
mente insignificante (Klesov e
Gerasimas, 1979).
2.2. Estratgias
moleculares (Evoluo
Dirigida de Enzimas)
O advento da engenharia de
protenas, empregando tcnicas de
biologia molecular, proporcionou
novas estratgias para a termoestabi-
lizao de enzimas. O gene da GA de
A. awamori foi clonado e expressado
em Saccharomyces cerevisiae (Innis
90 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
et al., 1985) e em Pichia pastoris
(Fierobe et al. 1997), o que permitiu
o emprego da manipulao gentica
como uma maneira de modificar a
enzima para melhorar suas proprie-
dades catalticas ou fsicas.
Estas estratgias para criar novas
ou melhoradas propriedades em
enzimas, atualmente podem ser sepa-
radas em duas estratgias comple-
mentares 1) desenho racional e 2)
evoluo dirigida. O desenho racio-
nal de protenas baseado no conhe-
cimento detalhado da seqncia pri-
maria, estrutura, funo e mecanismo
de catlise. Atravs destes conheci-
mentos, alteraes so introduzidas,
principalmente, por mutao sitio
dirigida, como ser discutido abaixo.
A evoluo dirigida, (Zhang, 1997)
no exige conhecimento da relao
estrutura-funo da enzima. A evolu-
o dirigida tambm chamada de
biotecnologia evolutiva (Arnold e
Volkov, 1999; Reetz e Jaeger, 1999;
Sutherland,2000). O termo evoluo
dirigida subtende uma srie de expe-
rimentos que reproduzem, de forma
acelerada e em tubos de ensaios, a
evoluo da diversidade natural e
adaptao ambiental. Mutaes e
recombinaes so feitas dando ao
processo uma direo no sentido de
atingir a otimizao de uma proprie- zadas. Tais estratgias sero discuti-
dade especfica (Lehman e Wyss,
2001). Muitas pistas de como melho-
rar enzimas vm dos estudos de como
as enzimas evoluem na natureza. As-
sim, esta poderosa tcnica objetiva
otimizar o processo de melhoramento
das enzimas utilizando mecanismos
envolvidos na evoluo natural (mu-
tao, recombinao e seleo natu- tros aminocidos, por alterao nos
ral). Entretanto, a evoluo dirigida
difere do processo natural no sentido
em que so os pesquisadores que
definem as propriedades a serem
otimizadas e o processo biotecnolgi-
co acontece em um perodo curto de
tempo (semanas ou meses) (Reetz,
1999).
Num experimento de evoluo
dirigida, primeiramente induzida
uma alterao no DNA visando uma
resposta especfica. Isto resulta em
uma biblioteca de populaes com
diferentes graus de possveis respos-
tas, incluindo ou no a resposta espe-
rada. O prximo passo encontrar
dentre as milhes de possibilidades,
a soluo ou as solues corretas, ou
seja, a enzima que exibe a proprieda-
de desejada (Arnold, 1996).
Em suma, este processo consiste
na combinao de tcnicas da biolo-
gia molecular apropriadas para a
mutao e expresso do gene,
acopladas a um eficiente e rpido
sistema de seleo. (Reetz e Jaeger,
2000). A idia partir de uma enzima
selvagem, realizar a mutagnese no
gene que codifica a enzima e seleci-
onar os melhores mutantes de acor-
do com a caracterstica fenotpica
desejada (Zhang, 1997). Aps a sele-
o dos mutantes, segue-se novos
ciclos de mutaes buscando melho-
res mutantes.
Quando a taxa de mutao, ta-
manho da biblioteca e o processo de
seleo so adequados, o fentipo
desejado de uma enzima geralmente
aumenta a cada ciclo de mutaes
(Zhang, 1997).
Existe um grande nmero de
diferentes estratgias de mutagnese
para criar diversidade de seqncias,
tais como a mutao pontual ao aca-
so por PCR mutagnico (error-prone
PCR), e o embaralhamento de DNA
(DNA shuffling). Combinaes des-
tas tcnicas tambm vm sendo utili-
das a seguir:
2.2.1 Mutao Stio Dirigida
(MSD)
uma poderosa tcnica na qual
apenas um ou poucos aminocidos
especficos so substitudos por ou-
correspondentes nucleotdeos no
gene codificador da protena. Quan-
do realizada com sucesso, ela tem a
vantagem de melhorar a caractersti-
ca desejada da enzima sem afetar
outras propriedades e at mesmo de
criar mutantes carregando vrias ca-
ractersticas melhoradas.
Nesta ferramenta, as mudanas
precisas, efetuadas na seqncia dos
aminocidos, so baseadas no conhe-
cimento detalhado da estrutura da
protena, funo e mecanismo (Chen,
1999). Por exemplo, um resduo par-
ticular de aminocido pode ser iden-
tificado como sendo importante para
a atividade cataltica da enzima (Reetz,
1999), sendo assim, uma substituio
individual deste aminocido poderia
provocar mudanas na estrutura se-
cundria resultando em enzimas com
caractersticas desejveis (Chen, 1999).
Entretanto, seria impossvel predizer
qual dos 19 aminocidos remanes-
centes seria o melhor alvo para a
mutao que resultaria em subsequen-
te melhoria da propriedade procurada
(Reetz, 1999). Muitas tentativas para
alterar especificamente algumas das
propriedades das enzimas atravs
desta tcnica falharam, isto porque a
introduo de aminocidos substitu-
tos tm efeitos inesperados na estru-
tura e funo da enzima. (Kikuchi,
1999). Alm disso, tem sido observa-
do que em muitos estudos de muta-
o stio dirigida, o aumento da ter-
moestabilidade est vinculada ao de-
crscimo da atividade cataltica (Carrea
e Colombo, 2000). As falhas tambm
podem ser porque este processo re-
quer conhecimento de detalhes da
estrutura tridimensional da enzima,
de seu mecanismo de catlise, bem
como um certo grau de intuio na
escolha do aminocido a ser substitu-
do (Reetz, 1997). Em muitos casos,
estas substituies foram feitas sem
levar em considerao as proprieda-
des estruturais da protena (Chen, 1999).
2.2.2. PCR mutagnico (Error-
prone PCR):
A introduo de mutaes atra-
vs desta tcnica envolve uma modi-
ficao no protocolo de PCR (Jaeger
e Reetz, 2000). Uma reao de PCR
normalmente realizada de modo a
amplificar qualquer dado DNA com
alta fidelidade. A atividade de corre-
o de erro 3 5 da DNA polime-
rase assegura que a amplificao do
DNA siga de maneira precisa. Ocasi-
onalmente, nucleotdeos errados so
incorporados durante a amplificao
levando a mutaes com uma fre-
qncia de 0,1 a 2x 10 -4 por
nucleotdeo para a DNA polimerase
termoestvel do Thermus aquaticus
(Taq polimerase). Esta baixa taxa de
erro pode ser aumentada para 7x 10-3
por nucleotdeo atravs de um ou
mais dos seguintes procedimentos:
aumento da concentrao de MgCl2,
adio de MnCl2, aumento na con-
centrao de dCTP e dTTP e aumento
na quantidade taq polimerase. Para o
propsito de evoluo dirigida de
enzima, estas condies devem ser
modificadas a fim de se obter uma
taxa mdia de 1 a 2 nucleotdeos
mutados por gene, levando a uma
mudana mdia de 1 aminocido por
enzima mutante (Reetz, 1999). A van-
tagem de tal processo que pode ser
realizado rapidamente envolvendo
qualquer protena, mesmo sem o
conhecimento preciso de sua estru-
tura (Zhang et al, 1997 e Jaeger e
Reetz, 2000).
2.2.3. Embaralhamento de DNA
(DNA shuffling)
Este poderoso processo de evo-
luo dirigida, que gera diversidade
por recombinao, baseado na com-
binao de mutaes teis de genes
individuais. Bibliotecas de genes qui-
mricos podem ser geradas por frag-
mentao aleatria de um gene, se-
guido por recombinao dos frag-
mentos em uma reao de PCR
(Crameri, 1998).
O embaralhamento de DNA
combinado com uma seleo para a
atividade pode acelerar a evoluo
dirigida das caractersticas deseja-
das. Nesta tcnica, a diversidade
introduzida a partir de uma bibliote-
ca de mutaes pontuais aleatrias
(Christians et al, 1999). Os genes
selecionados podem ser submetidos
a mais ciclos de mutaes (reemba-
ralhamento) e melhorar ainda mais a
sua mutao benfica original
(Stemmer, 1994a) simulando de for-
ma acelerada, o processo natural de
recombinao sexual (Christians et
al, 1999).
A tcnica consiste basicamente
na fragmentao de um gene com
diferentes mutaes pontuais por
DNAse I. A recombinao dos frag-
mentos aleatoriamente resulta em
moldes trocados e recombinados. Um
gene recombinante contendo 4
crossovers pode ser selecionado da
biblioteca de recombinantes basea-
do na funo melhorada. O conjunto
selecionado promove o ponto de
partida para outro ciclo de mutaes
e recombinaes. Este processo iso-
Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
lado causa um baixo nmero de
mutaes pontuais, mas se for dese-
jado, mutaes adicionais podem ser
incorporadas por PCR mutagnico
ou mutagnese por UV no pool de
genes (Stemmer, 1994a).
A tcnica de embaralhamento
pode ser realizada com mutantes do
mesmo gene e tambm com genes
homlogos de diferentes espcies
(family shuffling) (Reetz e Jaeger,
1999). Esta recente adaptao permi-
te que duas ou mais seqncias que
ocorram naturalmente sejam usadas
como material gentico iniciador.
Neste mtodo, genes similares so
misturados, fragmentados aleatoria-
mente e recombinados sob condi-
es que permitam o anelamento e a
extenso de fitas complementares
no idnticas (Christians et al, 1999).
A recombinao que ocorre nesta
tcnica causada pela incorporao
de um fragmento derivado de uma
seqncia dentro de outra, baseado
na homologia.
Anlises evolutivas de famlias
de enzimas sugerem que mudanas
drsticas na funo da enzima exi-
gem uma considervel mudana na
seqncia de aminocidos de um
polipeptdeo. Tais mudanas prova-
velmente no ocorrem durante o pro-
cesso de evoluo in vitro, no qual as
enzimas so principalmente melho-
radas por mutaes de ponto com
uma tendncia a transies e
transverses limitando o acesso a um
amplo espectro de substituies. Em
contraste, a mutao natural, tipica-
mente resultante de recombinao
sexual ou homloga, gera delees,
inseres, duplicaes ou fuses.
Neste ltimo processo, tais muta-
es alteram o espaamento entre
os resduos de aminocidos e seg-
mentos de cadeias de polipeptdeos
e pode resultar em mudanas na
especificidade e novas atividades
catalticas (Chen, 2001).
Screening e Seleo: Grandes
bibliotecas de mais de 1010 genes
mutantes podem facilmente ser cri-
adas usando as tcnicas acima. Por-
tanto, o desenvolvimento de um
sistema apropriado de seleo de
importncia chave no processo de
evoluo dirigida de enzimas (Reetz,
1999). Selees efetivas, nas quais
91
 apenas aqueles clones carregando a
caracterstica desejada sobrevivam
ou cresam mais rpido so raras
(Arnold e Volkov, 1999). No caso do
emprego de vetores (plasmdios), o
screening feito para obter os
mutantes que incorporaram o vetor
contendo o gene desejado. O vetor
geralmente carrega um gene para
resistncia a algum antibitico, por
isso utiliza-se o plaqueamento das
linhagens submetidas ao processo
de mutagnese em um meio conten-
do o antibitico. As colnias que
crescerem neste meio, certamente
incorporaram o vetor e podem ser
escolhidas para a prxima etapa. Em
outros casos, a mutao positiva
resulta em reparo de algum defeito
que poder ser usado como ferra-
menta para a seleo. Por exemplo,
a recuperao da habilidade de pro-
duo de enzimas formadoras de
halos na placa de seleo. A etapa
seguinte a escolha de colnias que
tenham a caracterstica desejada, por
exemplo, o aumento na termoesta-
bilidade enzimtica. Assim, as
enzimas das colnias positivas no
screening sero submetidas a tes-
tes de termoinativao a fim de se
isolar as colnias produtoras de
enzimas termoestveis.
2.3. Enzimas
termoestabilizadas por
estratgias moleculares
Akanuma et al (1998) introduzi-
ram o gene leuB (que codifica para a
3-isopropilmalato desidrogenase en-
volvida na biossntese de leucina) no
microrganismo termoflico Thermus
thermophilus usando tcnicas de evo-
luo dirigida de enzimas. Aps mu-
tao no gene da enzima, eles obtive-
ram uma variante termoestvel. A
estabilidade trmica da enzima
mutante foi 10C acima da observada
na enzima selvagem.
A tcnica da evoluo dirigida
foi aplicada kanamicina nucleoti-
diltransferase (KNTase), uma enzima
que confere resistncia ao antibiti-
co kanamicina. Variantes desta
enzima apresentaram resistncia a
kanamicina a uma temperatura de
63C e foram produzidas por dois
ciclos seguidos de mutaes resul-
92 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
tando em duas substituies de ami-
nocidos (Reetz e Jaeger, 1999).
Kikuchi et al (1999) aplicaram
esta tcnica nos genes xylE e nahH
que codificam para a enzima catecol
2,3-dioxigenase. Mais de 2000 clones
hbridos foram criados e posterior-
mente selecionados para estabilida-
de trmica. A melhor enzima quim-
rica selecionada foi testada a 50C e
a vida mdia foi de 70 min, muito
maior do que a enzima codificada
pelos genes selvagens xylE (2,7min)
e nahH (5,4min).
Yang et al (2000) criaram um
mutante para o gene da subtilisina E
atravs da tcnica de PCR mutagnico.
Anlises do seqenciamento revela-
ram apenas uma substituio (AG).
O tempo de vida mdio da atividade
da enzima mutante, quando encubada
a 65C, foi de aproximadamente 80
min enquanto que uma outra linha-
gem mutante (mutante original usado
no PCR mutagnico) e a linhagem
selvagem apresentaram um tempo de
13 e 15 min respectivamente.
Miyazaki et al (2000) usaram a
tcnica de embaralhamento de DNA
em uma subtilisina S41 psicroflica
com o objetivo de aumentar sua ter-
moestabilidade e atividade. Aps a
terceira gerao de bibliotecas cria-
das por PCR mutagnico, trs varian-
tes termoestveis foram identifica-
das. Das trs, uma enzima mutante
em particular teve a maior atividade
residual aps incubao a 70C. Esta
subtilisina S41 variante contm 7 subs-
tituies de aminocidos, todas con-
tribuindo para o aumento da sua
termoestabilidade.
A temperatura tima da lipase
foi aumentada em at 15C atravs
da mutagnese aleatrea utilizando a
tcnica de PCR com tendncia ao
erro (Kohno et al, 2001).
Utilizando-se da tcnica de em-
baralhamento de DNA Hayashi et al.
(2001), obtiveram quimeras de -
glucosidase com a termoestabilidade
aumentada em at 16C quando com-
paradas com a enzima original.
A evoluo dirigida foi tambm
usada para melhorar a termoestabi-
lidade da galactose oxidase (Sun et
al, 2001). Foi observado que as
enzimas mutantes obtidas, manti-
nham a atividade enzimtica e a
especificidade pelo substrato seme-
lhantes s da enzima selvagem, en-
tretanto, a termoestabilidade foi au-
mentada. O T50 (temperatura na qual
as enzimas perdem 50% da sua ativi-
dade) foi aumentado para 67C para
os dois mutantes mais termoestveis
enquanto que a selvagem no ultra-
passou 63C.
Experimentos com a GA usam
na sua grande maioria a MSD como
ferramenta para a obteno de carac-
tersticas desejadas melhoradas, uma
boa reviso neste assunto foi apre-
sentada por Ford (1999). Vrias abor-
dagens preconizadas para estabiliza-
o podem ser acessadas pela MSD,
como por exemplo, as substituies
dos resduos flexveis de glicina em
-helices, substituies de seqnci-
as susceptveis a desamidao e que-
bra Asn-Gly, alteraes em ligaes
frgeis como Asp-X, introduo de
prolina que reduz o nmero de con-
formaes no estado desdobrado,
acrscimo cistenas para aumentar o
nmero de pontes dissulfetos, alm
de combinaes destas abordagens
em mutantes mltiplos etc. (Ford,
1999; Sauer, 2000).
Libby et al (1994) testaram o
efeito de delees de aminocidos
na regio O-glicosilada da GA de
Aspergillus awamori. Foram feitas
delees para remover os resduos
de 466 a 512 (GAI), de 485 a 512
(GAII) e de 466 a 483 (GAIII). Anali-
sando as fraes intracelulares e
extracelulares, observou-se que a
regio deletada da GAIII afetou a
secreo enquanto que a deleo da
GAII contribuiu para a produo e
uma estrutura estvel da protena.
Para todos os mutantes foram encon-
tradas atividades catalticas similares
selvagem indicando que as delees
no afetaram o stio cataltico.
Chen et al. (1994) substituram
a seqncia susceptvel a desamida-
o, Asn182-Gly, por Ala182-Gly, o
que resultou em decrscimo de 2,5
vezes na taxa de termoinativao a
60 e 65C.
O efeito da substituio de res-
duos flexveis de glicina por alanina
em quatro diferentes -hlices na GA
de Aspergillus awamori foram estu-
dados (Chen et al, 1996). Substitui-
es simples de Gly137 e Gly139 e
no mutante mltiplo contendo ambas
as mutaes estabilizaram a GA con-
tra a termoinativao irreversvel.
Com o objetivo de estudar o
papel das regies conservadas na GA
de Aspergillus awamori, Sierks et al
(1993) realizaram substituies nos
resduos de Leu177, Trp178 e Asn182
por His, Arg e Ala, respectivamente.
Quando se substituiu Leu177 por His
houve um grande aumento na ener-
gia de ativao para substratos com
ligao (14) e (16); na substi-
tuio Trp178 por Arg, a energia
aumentou para substratos com liga-
es (16), mas no para (14). disponveis, associadas a considera-
Estas substituies indicaram que os
resduos de aminocidos Leu177 e
Trp178 esto localizados no substio
1 e 2 respectivamente. Por outro
lado, a substituio Asn182 por His
no alterou os valores de energia de
ativao para nenhum tipo de liga-
o do substrato, sugerindo que este
resduo no crucial para o mecanis-
mo cataltico da GA.
Fiorobe et al. (1996) substitui-
ram Ala246 por Cys, criando mais
uma ponte dissulfeto entre este res-
duo e o resduo Cys320. O mutante
apresentou maior atividade residual
e atividade cataltica por 15 minutos
comparado a linhagem selvagem.
Fiorobe et al. (1998) produziram um
mutante substituindo o Glu 400 por
Cys. A atividade do mutante, aps
oxidao da cisteina para acido
cisteinosulfnico, elevou a atividade
do mutante para 160% em relao a
linhagem selvagem. Entretanto, no
houve ganho de termoestabilidade.
Uma ponte dissulfeto foi criada
substituindo Asn20 e Ala27 por Cys
na GA de Aspergillus awamori e
observou-se um aumento na termo-
estabilidade de 1,2 kJ/mol a 65C (Li
et al, 1998).
Mutantes contendo prolina em
substituio a vrios aminocidos fo- termoestveis de fungos termoflicos
ram estudados por Allen et al. (1998).
O maior sucesso com mutao sim-
ples foi obtido no mutante Ser30Pro,
resultando em um aumento da ener-
gia livre de termoinativao de 1,6 kJ/
mol a 65C. Os autores ainda combi-
naram diferentes mutaes termoes-
tveis e obtiveram um triplo mutante
contendo Gly137Ala, Ser30Pro e
Asn20Cys/Ala27Cys que apresen-
tou aumento cumulativo de termoes-
tabilidade de 4,4 kJ/mol.
Estes experimentos, embora te-
nham como objetivo principal a me-
lhora em propriedades da enzima,
paralelamente desempenham um pa-
pel de extrema importncia, o de
elucidar as funes de inmeros seg-
mentos da cadeia polipeptdica da
protena.
3. Concluso e
perspectivas futuras
As tcnicas de evoluo dirigida
es tericas e s vrias experincias
relatadas de sucesso ou no, dispon-
veis na literatura, tm levado a uma
crescente seleo de mutaes bem
sucedidas para termoestabilizao da
GA. Todavia, este sucesso ainda no
refletiu significativamente na produ-
o de enzima industrialmente satis-
fatria, deixando o campo ainda aber-
to para novas experincias.
Os organismos atualmente dis-
ponveis para clonagem e expresso
da GA so mesoflicos, criando difi-
culdades para a seleo de enzimas
mais termoestveis. Alm disso as
linhagens de E. coli utilizadas so
deficientes em glicosilao e forma-
o de pontes dissulfetos, essenciais
para a GA ativa. Pesquisas com
bacterias termoflicas e/ou bacterias
competentes para a clonagem e ex-
presso da GA estruturalmente ativa,
podem ser alternativas viveis para
reduzir tempo e manipulao.
A maior parte das informaes
sobre seqncias de GA so dos
fungos mesoflicos, A. niger e A.
awamori. Informaes de seqnci-
as de GAs termoestveis, seriam im-
portantes para orientao racional de
desenhos de experimentos de evolu-
o dirigida. Entretanto, poucas GAs
foram relatadas. Dentre estes esto
Humicola grisea var. thermoidea
(Tosi et al. 1993), Aspergillus
fumigatus (Brandani e Peralta, 1998)
e Thermomyces lanuginosus (Li et al
1998). Informaes sobre seqncias
genticas so ainda mais raras. A
procura por novas fontes de GAs
termoestveis, bem como informa-
es sobre a protena e seu gene
Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
codificador so um campo aberto e
com enormes perspectivas futuras.
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 Marcadores Moleculares
no Melhoramento Gentico
Pesquisa
de Araucria
Valdir Marcos Stefenon
Bilogo Mestre em Biotecnologia
Depto. de Cincias Biolgicas e da Sade UNIPLAC
gene_mol@hotmail.com
Rubens Onofre Nodari
Eng. Agrnomo Doutor em Gentica
Departamento de Fitotecnia CCA UFSC
Ilustraes cedidas pelos autores
Caracterizao da diversidade gentica em Araucaria angustifolia
Introduo
A explorao florestal foi uma
importante alavanca para o desenvol-
vimento econmico do Sul do Brasil
desde o incio do sculo XX, com
intensidade crescente nas dcadas de
1950 a 1970 (Guerra et al., 2002).
A principal espcie explorada nes-
se ciclo foi a Araucaria angustifolia
(Bert.) O. Ktze., nica representante
da Famlia Araucariaceae no Brasil e
principal espcie que compe a flo-
resta ombrfila mista ou mata de
araucria (Guerra et al., 2002). No
Brasil, a distribuio natural dessa
espcie se d em amplas reas nos
estados do Rio Grande do Sul, Santa
Catarina e Paran, e em alguns pontos
mais elevados de So Paulo, Rio de
Janeiro e Minas Gerais (Reitz e Klein,
1966).
Todavia, a alta qualidade de sua
madeira para os mais diversos fins,
desde a construo civil at a produ-
o de celulose e de papel, fez com
que essa espcie fosse exaustivamente
explorada, tendo como conseqncia
uma drstica reduo das grandes re-
servas de A. angustifolia no sul do pas.
Alm dessa explorao desor-
dena-da, o avano das fronteiras agr-
colas foi outro fator responsvel pela
reduo das populaes naturais des-
sa importante espcie florestal.
Em funo desses acontecimen-
tos, a araucria encontra-se hoje na
Lista Oficial de Flora Ameaada de
Extino (IBAMA, 2002) e os rema-
nescentes de floresta ombrfila mista
esto reduzidos a fragmentos isolados
de diversos tamanhos.
Em alguns desses fragmentos, es-
tima-se que grande parte da diversida-
de gentica tenha sido perdida (Schgl,
Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
2000; Auler et al., 2002), fato que
inviabiliza a regenerao natural da
espcie, devido endogamia acentu-
ada e reduo do fluxo gnico entre
suas populaes.
Nos ltimos anos, diversas dis-
cusses a respeito desse tema vm
apontando para a necessidade de se
desenvolver o melhoramento genti-
co dessa confera, com vista a regene-
rar a Floresta de Araucria e discipli-
nar os plantios com finalidade lucra-
tiva, seja pela explorao da madeira,
seja pela venda das sementes comes-
tveis ou de outros subprodutos.
Entretanto, antes de os progra-
mas de melhoramento gentico serem
implementados, necessrio que se
conhea a diversidade gentica exis-
tente entre as populaes remanes-
centes e dentro delas. Esses estudos
so importantes para que se interprete
o efeito da fragmentao dos rema-
nescentes sobre a estrutura gentica
das populaes: informao essencial
para o planejamento de programas de
melhoramento.
Esse conhecimento, alm de re-
duzido, tem sido produzido basica-
mente a partir de marcadores morfo-
lgicos (Shimizu e Higas, 1980;
Monteiro e Spelz, 1980; Kageyama e
Jacob, 1980) e isoenzimas (Shimizu et
al., 2000; Auler et al., 2002; Mantovani
et al., 2002).
Considerando a utilizao de mar-
cadores RAPD (Williams et al., 1990;
Welsh e McClelland, 1990) e AFLP
(Vos et al., 1995) para estudos genti-
cos em diversas espcies florestais, o
objetivo deste estudo foi determinar a
capacidade informativa desses marca-
dores para a caracterizao da diver-
sidade gentica de populaes natu-
rais de A. angustifolia.
95
 Material e Mtodos:
Material vegetal e
Extrao de DNA
O material vegetal utilizado neste
estudo foi composto por amostras foliares
de trinta indivduos adultos de uma
populao natural do Parque Ecolgico
Municipal de Lages, Estado de Santa
Catarina, coletados e acondicionados
em sacos plsticos que continham slica
gel. Inicialmente, foram testados sete
protocolos para extrao de DNA vege-
tal com base na utilizao do detergente
CTAB. Com esses testes, chegou-se
concluso de que era necessrio otimizar
um protocolo especfico para a espcie,
a fim de eliminar os compostos contami-
nantes do DNA presentes nas folhas de
araucria (principalmente protenas e
polifenis) e a fim de evitar a liofilizao
do material vegetal.
Aproximadamente 150 mg de fo-
lhas foram congeladas em nitrognio
lquido e maceradas completamente em
gral de porcelana. Ao p resultante,
acrescentou-se 1,5 mL de tampo de
extrao [CTAB 2%; NaCl 1,5 M; EDTA 20
mM; Tris-HCl (pH 8,0) 100 mM; PVP 2%;
2-mercaptoetanol 1%]. O material foi
transferido para tubos eppendorf de 2 mL
e mantido em banho-maria (60C) por 40
min. A cada 15 minutos, o material foi
homogeneizado por inverso. Aps essa
etapa, o material foi deixado sobre a
bancada at alcanar a temperatura am-
biente, quando lhe foram acrescidos, em
cada tubo, 600 L de CIA [clorofrmio:
lcool isoamlico 24:1]. O material foi
homogeneizado durante trs minutos,
por inverso, e centrifugado a 13.000
RPM, por 5 min. A poro aquosa que
continha o DNA foi transferida para dois
novos tubos e foram acrescidos a ela 5 L
de RNAse A (10 g/mL). Aps 40 min, a
34C, realizou-se uma segunda extrao
orgnica com CIA. Aps a centrifugao
(13.000 RPM, por 5 min), a poro
aquosa foi transferida para novos tubos,
aos quais adicionaram-se 50 L de solu-
o de CTAB 10% [CTAB 10%; NaCl 1,4
M], a 60C. Aps a homogeneizao,
realizou-se uma terceira extrao orgni-
ca com CIA. A poro aquosa foi
transferida para novos tubos e o DNA foi
precipitado pela adio de 2/3 do volu-
me de lcool isoproplico gelado(-20C).
O material foi mantido por 30 min a -
20C e, posteriormente, centrifugado a
7.000 RPM, por 5 min . O lcool
isoproplico foi descartado e o DNA
96 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
Figura 1: Polimorfismo revelado em marcadores RAPD em A. angustifolia, entre os trinta
indivduos da populao do Parque Ecolgico Municipal de Lages, utilizando o iniciador
OPA04. Linhas 1 a 30: indivduos da populao. M= marcador de peso molecular 1kb.
desidratado novamente com 1 mL de
lcool etlico 95%. O material permane-
ceu por 10min a -20C e centrifugado a
8.000 RPM, por 5 min. O lcool etlico foi
descartado e deixou-se o precipitado
secar a temperatura ambiente. O DNA foi
diludo em 100 L de TE, a temperatura
ambiente, por um perodo de 12 a 16
horas, e armazenado a -20C.
A concentrao de DNA foi de-
terminada pela comparao com quan-
tidades conhecidas de DNA de fago
lambda (20, 50, 100 e 200 ng/L), aps
eletroforese em gel de 0,8% de agarose,
corado com soluo de 0,02% de
brometo de etdio. A leitura espectro-
fotomtrica da razo OD260/OD280
foi utilizada para determinar a pureza
das amostras frente contaminao
por protenas.
Reaes RAPD
Para reaes RAPD, foram utiliza-
dos seis iniciadores comercializados
pela Operon Technologies (OPA04,
OPA09, OPA17, OPC06, OPF16,
OPAN15). O coquetel da reao cons-
tou de tampo de PCR 1X, 3,8 mM de
MgCl2, 0,4 mM de dNTPs, 0,4 M de
iniciadores, 1 U de Taq DNA polimerase
e 1,5 ng/ L de DNA. As reaes de PCR
foram desenvolvidas em termociclador
PTC-100 (MJ Research Inc.) em um
volume de 13 L. O programa utilizado
foi composto de uma etapa inicial de
desnaturao (4 min. a 92C), seguida
de 35 ciclos de amplificao (45 s. a
92C; 45 s. a 35C; 1 min e 15 s. a 72C),
e terminada com uma etapa final de
elongao das cadeias de DNA (3 min a
72C). Os produtos amplificados foram
separados por eletroforese horizontal
submersa em tampo TBE 1X, em gel de
1,5% de agarose, corado com soluo
de 0,02% de brometo de etdio. As
bandas foram visualizadas sob luz ultra-
violeta e os gis fotografados com filme
Polaroid preto e branco.
Reaes AFLP
Sete combinaes de iniciadores
para reaes AFLP foram selecionadas
aleatoriamente no kit AFLP Analysis
System I / Life Technologies (E-
ACG+M-CAC, E-ACT+M-CAA, E-
ACA+M-CTT, E-ACG+M-CAG, E-
AAG+M-CTG, E-ACC+M-CAT e E-
ACC+M-CAC) e as reaes foram desen-
volvidas de acordo com o protocolo de
Vos et al. (1995), com pequenas modi-
ficaes. Inicialmente, realizou-se a res-
trio do DNA com as enzimas EcoRI e
MseI, durante duas horas, a 36C. A
ligao dos oligonucleotdeos adapta-
dores foi realizada por 2 horas, a 20C,
em um volume de 25 L. Na etapa
seguinte (pr-amplificao), o DNA foi
amplificado com a utilizao de inicia-
dores com uma base seletiva (EcoRI-A e
MseI-C). O DNA pr-amplificado foi
diludo em uma razo de 1:25 e ampli-
ficado novamente, utilizando-se inicia-
dores com trs bases seletivas (EcoRI-
ANN e MseI-CNN). As etapas de restri-
o enzimtica, de ligao dos adapta-
dores e de amplificaes foram realiza-
das em termociclador PTC-100 (MJ
Research Inc.). Os produtos amplifica-
dos foram separados por eletroforese
vertical em tampo TBE 1X, em gel de
6% de poliacrilamida. As bandas foram
visualizadas aps colorao com nitrato
de prata.
Para a colorao, os gis foram
fixados com soluo de 0,5% de cido
actico + 5% de etanol, por 10 min., e
com soluo de 1% de cido ntrico,
por trs minutos. Posteriormente, fo-
ram impregnados com soluo de ni-
trato de prata 0,2%, durante trinta mi-
nutos. Aps esse tempo, uma soluo
de 3% de carbonato de sdio + 0,2% de
formaldedo foi utilizada para a revela-
o das bandas, durante o tempo ne-
cessrio. As revelaes foram finaliza-
das com a utilizao de uma soluo
de 5% de cido actico. Aps cada
etapa, os gis foram lavados durante 20
segundos com gua destilada. Todos
os tratamentos foram realizados sob
leve agitao. Aps a secagem dos gis
em temperatura ambiente, as bandas
foram visualizadas sob luz branca e os
gis fotografados com mquina digital.

Caracterizao da
Diversidade Gentica e
Capacidade Informativa
Os ndices de diversidade esti-
mados foram: a similaridade gentica,
o nmero mdio de bandas, a porcen-
tagem de bandas polimrficas e a
diversidade gentica. Os padres de
bandas obtidos com os marcadores
RAPD e AFLP foram analisados e para
eles construiu-se uma matriz binria,
que identificava sua presena ou sua
ausncia, codificadas por 1 ou 0, res-
pectivamente. A partir dessa matriz
de dados, com o auxlio do software
NTSYS-pc 2.02 (Rohlf, 1990), foi de-
terminado o ndice de similaridade
gentica de Jaccard entre os indivdu-
os e pelo mtodo de agrupamento
UPGMA (mtodo das mdias das dis-
tncias), foram gerados, separadamen-
te e de maneira agrupada, os
dendrogramas para marcadores RAPD
e AFLP. Para determinao da diversi-
dade gentica, foi utilizado o ndice
de Shannon, dado pela frmula H= -
pi ln(pi), onde pi corresponde
freqncia de cada alelo (Lewontin,
Figura 2: Dendrograma de similaridade gentica entre indivduos, estimado pelo
ndice de Jaccard para a populao de A. angustifolia do Parque Ecolgico Municipal
de Lages, gerado a partir de 18 marcadores RAPD (r=0,83).
1970). Como ambos os marcadores Resultados e Discusso:
apresentam caracterstica dominante,
considerou-se cada banda amplificada A partir dos seis iniciadores utili-
como sendo um loco com dois alelos, zados para as reaes RAPD, foram
presente ou ausente no gel. obtidos dezoito marcadores polimrfi-
Para determinar a capacidade in- cos, de um total de 62 bandas
formativa dos marcadores RAPD e amplificadas, com uma mdia de 11,16
AFLP, foram utilizados para a compa- bandas amplificadas por iniciador. A
rao dados gerados a partir de mar- mdia de bandas polimrficas foi de
cadores isoenzimticos (Auler et al., 3,0 por iniciador, com uma porcenta-
2002) e PCR-RFLP (Schgl, 2000) pro- gem mdia de 26,9%. O ndice de
venientes da mesma populao. Devi- diversidade de Shannon foi igual a 0,53
do diferente natureza dos marcado- (Tabela 1). A figura 1 apresenta o
res, o ndice de diversidade de padro de bandas obtido com o inici-
Shannon foi determinado para todos ador OPA04, para reaes RAPD.
os dados e usado como parmetro de As sete combinaes emprega-
comparao. das para as reaes AFLP revelaram 62

Tab ela 1: In iciad o res u tilizad o s n as rea es R A P D e respectivo s n d ices d e d iversid ad e gen tica para a
po pu lao d e A . an gu stifo lia d o P arq u e E co l gico Mu n icipal d e Lages.
N mero to tal Ban d as po lif rmicas n d ice d e
In iciad o res
d e b an d as Qu an tid ad e % d iversid ad e (H)
OPA4 12 03 25,0% 0,58
OPA9 13 02 15,4% 0,59
OPA17 06 01 16,7% 0,58
OPC6 09 03 33,3% 0,52
OPF16 13 05 38,5% 0,56
OPAN15 09 04 44,4% 0,43
Md ias para marcad o res R A P D 11,16 3,0 26,9 % 0,53
Tab ela 2: C o mb in a es d e in iciad o res u tilizad o s n as rea es A FLP e respectivo s n d ices d e d iversid ad e
gen tica para a po pu lao d e A . an gu stifo lia d o P arq u e E co l gico Mu n icipal d e Lages.
N mero to tal Ban d as po lim rficas n d ice d e
In iciad o res d e b an d as d iversid ad e (H)
Qu an tid ad e %
E-AGC + M-CAC 90 4 4,4% 0,65
E-ACT + M-CAA 100 10 10,0% 0,45
E-ACA + M-CTT 60 3 5,0% 0,68
E-ACG + M-CAG 100 21 21,0% 0,55
E-AAG + M-CTG 80 6 7,5% 0,56
E-ACC + M-CAT 105 7 6,6% 0,55
E-ACC + M-CAC 90 11 12,2% 0,50
Md ias para marcad o res A FLP 89,3 8,8 9,8% 0,54

Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003 97

 marcadores polimrficos, em um total
de 625 bandas amplificadas. A mdia
de bandas totais amplificadas foi de
89,3 e de bandas polimrficas foi de
8,8 por combinao de iniciadores. A
porcentagem mdia de bandas
polimrficas foi de 9,8%. Para marca-
dores AFLP, o ndice de diversidade
de Shannon foi de 0,54 (Tabela 2).
Quando os dois tipos de marca-
dores foram analisados conjuntamen-
te, o total de bandas amplificadas foi
de 687, com 80 bandas polimrficas,
que correspondiam a 11,6%. As mdi-
as de bandas totais e polimrficas
amplificadas foram de 52,8 e 6,15 por Figura 3: Dendrograma de similaridade gentica entre indivduos, estimado pelo
iniciador, respectivamente. A diversi- ndice de Jaccard para a populao de A. angustifolia do Parque Ecolgico Municipal
dade gentica determinada pelo ndi- de Lages, gerado a partir de 64 marcadores AFLP (r=0,83).
ce de Shannon foi de 0,54 (Tabela 3).
Marcadores isoenzimticos (Auler
et al., 2002) empregados na mesma
populao acessaram uma diversida-
de gentica de Shannon de H=0,29, ao
passo que marcadores PCR-RFLP de
DNA de cloroplastos (Schgl, 2000)
detectaram um nico hapltipo na
populao, correspondendo a uma
diversidade virtualmente inexistente.
Nesse caso, marcadores RAPD e AFLP
mostraram-se altamente eficientes, de-
tectando uma diversidade gentica
quase duas vezes maior (1,8 x) que
aquela determinada por isoenzimas.
Apesar de caracterizar-se pela an-
lise da molcula de DNA da mesma
forma que as tcnicas RAPD e AFLP, a Figura 4: Dendograma de similaridade gentica entre indivduos, estimado pelo ndice
tcnica PCR-RFLP aplicada a genomas de Jaccard para a populao de A. angustifolia do Parque Ecolgico Municipal de Lages,
de cloroplastos no possibilitou a gerado a partir de 18 marcadores RAPD e 62 marcadores AFLP agrupados (r=0,80).
deteco de diversidade nesta popu-
lao. J as tcnicas RAPD e AFLP no tras populaes de A. angustifolia ana- ra 4). A maior similaridade gentica
demonstraram limitaes para acessar lisadas antes. entre indivduos foi de 86% (indivdu-
a diversidade gentica em populaes Por outro lado, uma criteriosa os L11 e L13), com marcadores RAPD;
altamente exploradas, como a utiliza- seleo de combinaes de iniciado- 81 % (indivduos L5 e L26), com
da nesta pesquisa. res permite que a tcnica AFLP apre- marcadores AFLP e 71% (indivduos
Quando os valores obtidos no sente um polimorfismo muito maior L6 e L7), com o agrupamento dos dois
presente trabalho so comparados a (Stefenon, 2003). tipos de marcadores. Nesse ponto,
outros estudos que utilizaram as tcni- A similaridade gentica foi anali- percebe-se que o maior nmero de
cas RAPD e AFLP, estes podem ser sada em funo dos trs dendrogramas marcadores permite uma maior discri-
considerados baixos. Contudo, h de gerados: um, a partir dos 18 marcado- minao entre os indivduos analisa-
se considerar que os estudos com res RAPD polimrficos (Figura 2), o dos.
isoenzimas e PCR-RFLP utilizados como segundo, a partir dos 62 marcadores A comparao entre os trs
parmetro para a comparao tambm AFLP polimrficos (Figura 3) e o ter- dendrogramas permite ainda perce-
apresentaram valores baixos para essa ceiro, a partir dos 80 marcadores RAPD ber que, no agrupamento dos marca-
populao, quando comparados a ou- e AFLP polimrficos agrupados (Figu- dores, o maior nmero de bandas

Tab ela 3: Md ias para o s n d ices d e d iversid ad e gen tica estimad o s para a po pu lao d e A . an gu stifo lia
d o P arq u e E co l gico Mu n icipal d e Lages, a partir d e marcad o res R A P D e A FLP.
N mero to tal Ban d as po lim rficas n d ice d e
Marcad o res
d e b an d as Qu an tid ad e % d iversid ad e (H)
Mdias para marcadores RAPD 11,16 3,0 26,9% 0,53
Mdias para marcadores AFLP 89,3 8,8 9,8% 0,54
Md ias R A P D + A FLP 52,8 6,15 11,6% 0,54

98 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003

AFLP fez com que o dendrograma
ficasse muito semelhante ao gerado
unicamente dos marcadores AFLP.
Utilizando-se um valor mximo
de 50% para a similaridade gentica
entre os indivduos, o dendrograma
gerado a partir de marcadores RAPD
(Figura 2) dividiu-se em doze grupos.
A maior similaridade gentica foi ob-
servada entre os indivduos L11 e L13,
com 86% de similaridade e o ponto de
unio de todos os grupos apresenta
30,5% de similaridade.
O dendrograma gerado de mar-
cadores AFLP (Figura 3) dividiu-se em
quinze grupos, utilizando-se 50%
como similaridade mxima; o ponto
de unio de todos os grupos apresen-
ta 24% de similaridade. Com esses
marcadores, a similaridade gentica
entre pares de indivduos variou de
24% a 81%.
Deve-se considerar que existe uma
relao entre o nmero dado a cada
planta e sua proximidade geogrfica,
sendo mais prximos geograficamente
os indivduos cujos nmeros so mais
prximos. Dessa forma, pode-se ob-
servar que os argumentos de plantas
so aleatrios, formados por indivdu-
os dispersos pelo Parque, em uma rea
de 2,34 km2. Esse dado sugere que
indivduos geograficamente, os quais
podem ser aparentados, no apresen-
tam grande similaridade gentica.
Consideraes Finais
Um aspecto importante a ser con-
siderado que a A. angustifolia prova-
velmente possua uma grande diversi-
dade gentica antes da explorao ocor-
rida durante o ciclo da madeira no sul
do Brasil (Auler et al., 2002).
Dessa forma, antes de qualquer
previso de melhoramento gentico
essencial conhecer a diversidade ge-
ntica existente nas populaes rema-
nescentes, para possibilitar a seleo
de plantas e sementes a serem utiliza-
das, tanto para a produo de mudas,
quanto para cruzamentos controlados.
A exemplo do ocorrido no Par-
que Ecolgico Municipal de Lages,
durante o ciclo da madeira, a seleo
promovida pelo homem at o mo-
mento, foi a retirada dos melhores
fentipos, em detrimento dos demais.
Devido ao acesso aleatrio a am-
plas regies genmicas praticamente
livres da ao da seleo natural, as
tcnicas RAPD e AFLP geram um gran-
de nmero de marcadores virtual-
mente neutros. Neste caso, dos resul-
tados obtidos no presente trabalho,
pode-se concluir que essas tcnicas
apresentam-se como poderosas ferra-
mentas para a caracterizao da diver-
sidade gentica dos remanescentes de
A. angustifolia, com vistas ao melho-
ramento gentico da espcie.
Agradecimentos
Ao CNPq, UNIPLAC e FUNCITEC
pelo apoio financeiro e Prefeitura
do Municpio de Lages, pelo apoio na
obteno do material vegetal.
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6535, 1990.
99

Pesquisa
Monita Fiori de Abreu
Acadmica do curso de Agronomia,
Bolsista PIBIC/BIP/CNPq - Laboratrio de
Morfognese e Bioqumica Vegetal - CCA/UFSC.
monitaf@yahoo.com
Enio Luiz Pedrotti
Ph.D., Prof. Adjunto IV , Departamento de
Fitotecnia - Laboratrio de Morfognese e
Bioqumica Vegetal -CCA/UFSC.
pedrotti@cca.ufsc.br
Ilustraes cedidas pelos autores
100 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
Micropropagao
de Macieira
Avanos nos protocolos de micropropagao
Introduo
A cultura da macieira possui pa-
pel de destaque no cenrio frutcola
brasileiro. Atualmente, a rea cultiva-
da no Brasil est estimada em 30 mil
hectares, com uma produo aproxi-
mada de 967 mil toneladas (ABPM,
2003). Visando atender s demandas
de mudas da pomicultura nacional,
faz-se necessria a aplicao de mto-
dos eficientes para garantir grande
quantidade de material vegetal de alta
qualidade gentica e fitossanitria.
A produo de mudas da maciei-
ra tradicionalmente efetuada atra-
vs de tcnicas de propagao vege-
tativa, como a enxertia de cultivares
copa sobre um porta-enxerto. Tradi-
cionalmente a muda obtida atravs
de mergulhia de cepa (Driessen &
Souza Filho, 1986). Porm, esse m-
todo restringe o nmero de mudas
obtidas, requer muito tempo, alm
de poder resultar em mudas de baixa
qualidade fitossanitria.
Diante da problemtica relacio-
nada s tcnicas convencionais de
propagao, a biotecnologia atravs
do aperfeioamento das tcnicas de
cultivo in vitro, tem sido uma exce-
lente opo para a multiplicao des-
ta frutfera (Figura 1). Possibilita a
produo de mudas de alta qualida-
de sanitria oriundas da cultura de
meristemas livres de vrus, evitando,
desta forma, os problemas de disse-
minao de vrus e outros patgenos
durante a fase de propagao.
Diversos trabalhos vm sendo
conduzidos no Laboratrio de
Morfognese e Bioqumica Vegetal
(CCA/UFSC) a partir de projetos fi-
nanciados pelo CNPq e FINEP. As
principais linhas de pesquisa foram
no sentido de desenvolver metodo-
logias que abrangem desde o isola-
mento e inoculao in vitro de
meristemas, at a aclimatizao das
plantas micropropagadas.
Metodologia
1 - Isolamento e Inoculao
in vitro
A introduo e o estabeleci-
mento de meristemas in vitro uma
das fases mais delicadas da micro-
propagao. O isolamento de
meristemas um processo oneroso
(Nunes et al., 1999) mas primordi-
al, pois uma condio que garante
a produo de brotaes livres de
patgenos. A oxidao e a contami-
nao provocam grandes perdas do
material. Os meristemas extrados
das gemas apicais apresentam taxas
de oxidao acima de 40%. A per-
centagem de contaminao cons-
tatada em cerca de 35% dos
explantes. Num trabalho conduzido
com o porta-enxerto M.9, todos os
tubos de ensaio com meio de cultura
contaminado apresentaram oxida-
o (Tabela 1). Os agentes contami-
nantes como fungos e bactrias libe-
ram compostos que causam a oxida-
o. O estabelecimento in vitro
executado segundo metodologias
consideradas clssicas para esta fase
(Pedrotti, 1993; Nunes et al. 1999).
As gemas so extradas com o aux-
lio de um bisturi e estas, so subme-
tidas lavagem com gua destilada/
autoclavada e detergente Tween
 Tabela 1. Contaminao, oxidao, nmeros de gemas e brotos e balhos conduzidos no laboratrio,
percentual de calos no porta-enxerto de macieira 'M-9' (Malus aps a transferncia dos meristemas
pumilla M.), a partir da cultura de meristemas e gemas axilares. provenientes de gemas apicais e seg-
Tratamentos mentos nodais com gemas axilares,
Parmetros Analisados no ocorrem mais problemas de con-
Meristemas Gemas CV (%)
Contaminao (%) 38,6 a 32,2 a 14,1 taminao nem oxidao.
Oxidao (%) 42,3 b 58,4 a 12,5 O crescimento e desenvolvimen-
N mdio de gemas por broto 3,0 b 5,0a 12,6 to dos meristemas e gemas axilares
N mdio de brotos formados 3,0 a 4,0 a 9,6 so normalmente lentos at 30 dias
Calos (%) 62,3 a 12,4 b 14,1 aps a inoculao, no sendo obser-
vado o crescimento de brotaes.
Aos 60 dias, possvel observar o
desenvolvimento de brotaes. Para
o porta-enxerto M.9, os meristemas e
gemas axilares introduzidos in vitro,
formam um nmero mdio de 3 e 5
gemas por broto, respectivamente
(Tabela 1).
As diferenas observadas na in-
troduo in vitro e multiplicao po-
dem ser consequncia do estado fisi-
olgico das plantas matrizes, onde
foram coletados os explantes como
salientaram Grattapaglia & Machado
(1990). Quando material vegetal co-
letado retirado das matrizes no final
do vero, possivelmente, as gemas j
iniciam o processo de entrada em
dormncia, o que diminui a sobrevi-
Figura 1: Frascos do cultivo in vitro de macieira vncia dos meristemas e gemas intro-
duzidos in vitro. Desta forma, a po-
20por 20 minutos. Em seguida, as suplementao de fitorreguladores ca mais interessante para a introdu-
gemas so imersas em soluo de (Souza et al.,2003). o in vitro aquela que correspon-
Anfotericina B(25 mg.L-1) por 10 As gemas axilares introduzidas de a um intenso crescimento
minutos. Em cmara de fluxo laminar, in vitro tm apresentado oxidao vegetativo nas condies naturais.
as gemas so imersas em etanol 70% acima de 50%, enquanto que os mei-
por 1 minuto, seguida de soluo de os de cultura contaminados com fun- 2 - Multiplicao do
hipoclorito de sdio 4%, por 10 mi- gos e bactrias so normalmente aci- material vegetal
nutos. Durante este processo os fras- ma de 30% (Tabela 1). Da mesma
cos so mantidos sob agitao con- forma, todos os tubos contendo meio A composio salina mais utili-
tnua. Posteriormente, faz-se uma de cultura contaminados apresenta- zada nos meios de cultura a MS
trplice lavagem com gua destila- ram oxidao. Quando os explantes (Murashige & Skoog, 1962), geral-
da/autoclavada e as gemas perma- no apresentam oxidao nem con- mente suplementada com regula-
necem em uma soluo de cido taminao, so transferidos de tubos dores de crescimento que permi-
ascrbico 15% por 10 minutos at de ensaio com novos meios de cultu- tem direcionar as respostas morfo-
serem inoculadas em sais e vitami- ra para eliminar resduos fenlicos genticas (George, 1996). Para a
nas de MS (Murashige e Skoog, 1962), liberados pelas plantas no meio de fase de multiplicao in vitro da
sacarose (30 g.L-1), gar (6 g.L-1) sem cultura inicial (Zanol, 1996). Nos tra- macieira, Ribas & Zanette (1992)
Tabela 2. Efeito de diferentes concentraes de BAP em meio de cultura MS sobre a resposta de na fase
de multiplicao in vitro de macieira (Malus platycarpa) aps 45 dias de cultura.
Concentrao de N de brotaes Altura das Comprimento dos
Vitrificao (%)
BAP por explante brotaes (cm) entrens (cm)
0,00 M 1,0 c 2,3 a 0,59 b 42,0 a
1,11 M 2,0 b 2,6 a 0,59 b 18,0 c
2,22 M 3,0 a 2,6 a 0,54 c 18,0 c
4,44 M 2,0 b 2,9 a 0,65 a 24,0 b
CV (%) 14,2 15,3 13,3 18,9
Mdias seguidas de mesma letra na vertical no diferem significativamente entre si, ao nvel de 5% de
probabilidade, pelo teste de Duncan.

Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003 101

 utilizaram o meio MS suplementa-
do com 1,0 mg.L-1 de BAP e 1,0
mg.L-1 de tiamina, e Modgil et al.
(1999) obtiveram a maior taxa de
multiplicao de brotaes da culti-
var Tydemans Early Worcester adi-
cionando ao meio de cultura 4,4 M
de BAP e 5,0 M de KIN. Para o
porta-enxerto Marubakaido Nunes
et al. (1999) utilizaram concentra-
es de BAP entre 1,11 e 4,44 M.
Quando se pretende estudar o
comportamento de um novo gentipo,
os explantes so repicados para tubos
de ensaio (2,5 x 15,0 cm) contendo 15
mL de sais e vitaminas de MS, suple-
mentado com diferentes concentra-
es de benzilaminopurina (BAP) (0;
0,25; 0,50 e 1.0 mg.L-1), 30,0g.L-1 de
sacarose, 6,0 g.L-1 de gar. Para um
gentipo usado com planta indicadora
de viroses, possvel verificar que as
concentraes de BAP influenciam sua
resposta in vitro (Tabela 2). O material
mantido no escuro por 48 horas, aps
este perodo, transferido para a sala
de crescimento sob fotoperodo de 16
horas e temperatura de 25 2C e 40
mol.m-2.s-1 de radiao luminosa,
fornecidas por lmpadas fluorescentes
Phillips Super 84.
3 - Microenxertia
Tendo em vista as caractersticas
da cultura, a associao das tcnicas
de micropropagao e microenxertia
permite combinar as vantagens da
rpida multiplicao in vitro, com a
unio de dois gentipos diferentes:
um clone copa, selecionado para
produzir frutos de alta qualidade, e
um clone de porta-enxerto, que con-
fere cultivar copa caractersticas
relevantes, como: vigor, produtivida-
de, qualidade de frutos, resistncia a
fatores adversos como a patgenos
do solo, alm de realizar funes
bsicas de suporte da planta, forneci-
mento de gua e nutrientes e a adap-
tao s condies de solo, clima e
doenas.
A micronexertia foi inicialmen-
te desenvolvida por Murashige et al.
(1972) e posteriormente melhorada
por Navarro et al.(1975), buscando a
produo de citrus livres de viroses.
Esta tcnica permite a obteno de
plantas livres de patgenos, aplica-
102 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
Figura 2: Fenda do microenxerto de macie-
ira., incio de brotao na copa, 30 dias aps
a microenxertia.
o de quarentena em espcies ve-
getais cuja disponibilidade seja de
apenas algumas gemas vegetativas,
separao entre viroses e outras do-
enas, alm de estudos fisiolgicos,
histolgicos e histoqumicos nas
enxertias. Porem ainda um desafio
promover com sucesso a enxertia de
um material to pequeno e frgil
como aquele proveniente de plantas
produzidas in vitro. (Obeidy & Smith,
1991). Para garantir a viabilidade do
microenxerto necessrio que as
clulas da base do microenxerto da
cultivar copa, entrem novamente em
diviso, pois so diferenciadas, ou
seja, j deixaram o ciclo celular e
no sofrem mais desdiferenciao.
Na retomada do ciclo celular pos-
svel induzir novas competncias e
diferenciar para estabelecer os teci-
dos estruturais e condutores (Taiz &
Zeiger, 1991). O estabelecimento de
novos tecidos condutores o resul-
tado do sucesso do mtodo.
Nos trabalhos desenvolvidos no
Laboratrio de Morfognese e Bio-
qumica Vegetal, como modelo, fo-
ram utilizados dois porta-enxertos
(M9 e Marubakaido) e uma cultivar
copa (Gala) de macieira. O porta-
enxerto M9 (Malus pumila Mill.) o
mais utilizado no sul do Brasil, tendo
como caracterstica principal dimi-
nuir o vigor da planta. Alm de redu-
Figura 3: Detalhes dos pontos de conexo
observados no corte histolgico do microenx-
erto de macieira, 90 dias aps a microenxertia.
zir o porte da planta, o M9 aumenta
a precocidade e um dos poucos
porta-enxertos que apresenta boa
resistncia podrido do colo
(Phytophthora cactorum) (Barrit,
1999). O porta-enxerto Marubakaido
(Malus prunifolia Borkh.) de ori-
gem japonesa, sendo bastante utili-
zado como porta-enxerto comercial
no Japo, Europa bem como no Bra-
sil (Bessho et al., 1993). vigoroso,
apresenta resistncia podrido-do-
colo, relativa resistncia a Rosellinia
sp. e muito sensvel a viroses
(Denardi, 1986). A culitvar copa Gala
(Malus domestica Borkh.) a primei-
ra em volume de produo no Brasil,
apresenta frutificao precoce, alta
produtividade e boa adaptao a al-
titudes superiores a 1000m (Denardi,
1986).
4 - Estudos histolgicos
A microenxertia realizada em
fenda simples conforme a metodo-
logia proposta por Hartmann et al.
(1990). Em cmara de fluxo laminar,
a parte apical das plntulas dos
porta-enxertos retirada e a altura
das plantas uniformizada em 5 cm
de altura. Para a variedade copa
Gala sopreparados microgarfos
com uma nica gema lateral. Atra-
vs de um corte em fenda simples
 Tabela 3. Nmero e comprimento de razes em plantas micropropagadas dos porta-enxertos de
macieira M.7, M.9 e Marubakaido, submetidos a diferentes concentraes e formas de aplicao de
cido I ndolbutrico (AI B) e ao crescimento das razes em diferentes substratos.
Nmero de razes Comprimento das razes (cm)
Tratamentos "M.7" "M.9" "Marubakaido" "M.7" "M.9" "Marubakaido"
1 4,0 1,0 c 5,0 1,0 a 10,0 2,0 a 1,7 0,1 b 2,7 0,5 a 1,8 0,4 b
2 6,0 0,5 b 3,0 1,0 b 3,0 1,0 b 1,9 0,1 ab 0,5 0,2 c 0,5 0,3 c
3 8,0 1,0 a 0,0 0,0 c 2,0 0,5 c 2,2 0,2 a 0,0 0,0 d 0,4 0,3 c
4 9,0 1,0 a 5,0 1,0 a 13,0 2,0 a 2,2 0.2 a 1,6 0,2 b 3,4 0,5 a
Mdias na coluna seguidas da mesma letra no diferem estatisticamente entre si, ao nvel de 5 % de
probabilidade, pelo teste de Tukey.
Tratamentos:
1 - Induo in vitro em 1.5 M de AIB em gar e crescimento das razes in vitro em gar;
2 - Induo in vitro em 1.5 M de AIB em gar e crescimento das razes in vitro em substrato mineral;
3 - Induo in vitro com 0,49 M de AIB e crescimento in vitro em substrato mineral;
4 - Induo ex vitro com 0,49 M de AIB e crescimento das razes em substrato mineral concomitante com a fase
de aclimatizao.
Tabela 4.Enraizamento, nmero e comprimento de razes de microestacas do porta-enxerto de
macieira M.9 (Malus pumila), tratadas com AIB e submetidas ao enraizamento ex vitro, em substrato
de casca de arroz carbonizada e vermiculita 1:1 (v/v), por um perodo de 30 dias.
AIB(mg/L) Enraizamento(%) Nmero derazes Comprimento das razes (cm)
0 64 b 3,5 b 3,5 a
500 82 a 6,0 a 4,1 a
1000 84 a 6,0 a 4,5 a
1500 30 c 7,5 a 4,7 a
* Mdias seguidas de mesmas letras nas colunas no diferem significativamente pelo teste de Duncan a 5%.
ns - no significativo.

realizado nas plntulas dos porta- conexo dos microenxertos 5 - Enraizamento de

enxertos, e um corte em bisel no
minigarfo da cultivar copa, reali-
zada a enxertia com o auxlio de
duas pinas. Os microenxertos so
ento inoculados em frascos com
meio de cultura MS (Murashige &
Skoog, 1962) e transferidos para a
sala de crescimento, com tempera-
tura de 252C, fotoperodo de 16
horas e luminosidade de 40 mol.m -
.s , onde permanecem at as cole-
2 -1
tas dos segmentos. Para os estudos
histolgicos, de ambas as combina-
es enxerto-porta-enxerto, Gala so-
bre Marubakaido e Gala sobre M9,
so realizadas 120 microenxertias,
o que diminuem os erros experi-
mentais. O material vegetal coleta-
do fixado em glutaraldedo 2,5%
em tampo fosfato de sdio 0,1M
pH7,2, desidratado em srie etlica
e emblocado em parafina (Johansen,
1940). Os cortes so corados com
azul de toluidina e montados, entre
lmina e lamnula, com blsamo do
Canad. A anlise dos cortes
histolgicos feita em microscopia
ptica e em lupa, 30 e 90 dias aps
a microenxertia (Figuras 2 e 3). A
vizualizada a partir de duas etapas.
O primeiro momento se d em pou-
cos dias e caracterizado pela mor-
te de camadas celulares da interface
do enxerto e pela formao de c-
lulas parenquimticas que preen-
chem o ponto de enxertia, resultan-
do no desenvolvimento de uma
camada necrtica na fenda. Na se-
gunda etapa, ocorre a proliferao
de um calo em associao com a
regio vascular da copa e do porta-
enxerto, formando uma ponte na
interface do enxerto. Posteriormen-
te, h a diferenciao de algumas
clulas do calo em novas clulas
cambiais. Ocorre, ento, a unio
entre os tecidos afins da copa e do
porta-enxerto resultando no esta-
belecimento de uma conexo cam-
bial contnua. Na ltima fase, a
continuidade da epiderme no pon-
to de enxertia restaurada. O pos-
terior desenvolvimento da copa pelo
alongamento e desenvolvimento de
brotaes caracteriza o sucesso da
microenxertia, observado em at
30 dias em macieira (Abreu et al.,
2003).
plantas micropropagadas
O enraizamento de microesta-
cas considerado por vrios autores
um dos estgios mais crticos do
processo de propagao massal de
plantas perenes (Wang, 1991), pois
depende do gentipo e de sua condi-
o fisiolgica no momento da
induo ao enraizamento (Martins &
Pedrotti, 2001). A emisso de razes
por uma microestaca pode ser dividi-
da em trs fases, que compreendem
a desdiferenciao celular, a induo
e a organizao dos primrdios
radiculares (Hartmann et al., 1997;
Blakesley et al., 1991). Na maioria
dos protocolos estabelecidos para a
micropropagao de plantas, o enrai-
zamento induzido in vitro, utilizan-
do meios de cultura contendo uma
auxina (Harbage & Stimart, 1996;
Deklerk et al., 1997; Ferri et al., 1998).
Para a maioria das espcies, a auxina
necessria na fase de induo das
razes enquanto que, na fase de dife-
renciao dos primrdios e no cresci-
mento das razes, a presena de
auxinas no meio de cultura pode

Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003 103

 inibir o processo (Deklerk et al.,1995).
A concentrao de auxina a ser adici-
onada ao meio de cultura para o
estgio de induo, depende da con-
centrao endgena deste hormnio
em cada gentipo utilizado (Blakesley
et al., 1991), sendo que altas concen-
traes, por perodos de exposio
prolongados, podem determinar a
formao de calos na base das micro-
estacas. Para Pasqual & Ishida (1992),
o melhor enraizamento in vitro foi
obtido em meio MS, geleificado, con-
tendo 1 mg/L de AIB.
As condies de temperatura, a
luminosidade da cmara de cresci-
mento e a disponibilidade de oxig-
nio junto base das microestacas,
alm de fatores anatmicos inerentes
ao gentipo, podem inibir a evolu-
o do processo morfogentico in-
duzido pelas auxinas. Apesar de
Harbage & Stimart (1996), Deklerk et
al. (1997) e outros autores utilizarem
o processo de induo e crescimento
das razes in vitro, McClelland et al.
(1990) ressaltam que as razes produ-
zidas in vitro no so funcionais quan-
do transferidas para a fase de aclima-
tizao. Para garantir a sobrevivncia
nesse estgio, necessrio que a
planta produza novas razes, o que
demanda um grande consumo de
reservas que deveriam ser utilizadas
para o crescimento da parte area.
Alm disto, Debergh & Maene (1981)
salientam a necessidade de desen-
volver sistemas de induo que per-
mitam a produo de razes funcio-
nais para o processo de aclimatiza-
o e para o aumento da qualidade
das plntulas.
5.1 - Enraizamento in vitro
Os resultados obtidos com a
induo in vitro de razes em porta-
enxertos de macieira, mostraram di-
ferenas em relao aos parmetros
avaliados, em funo do gentipo e
da concentrao e forma de aplica-
o da auxina (Martins & Pedrotti,
2001). (Tabela 3). Resultados seme-
lhantes foram obtidos com macieira
por Harbage et al. (1998), os quais
concluram que a capacidade de emitir
razes e de estabelecer um sistema
radicular, uma condio intrnseca
de cada gentipo
104 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
No caso do porta-enxerto M.7, o
enraizamento realizado in vitro em
gar apresentou resultados inferiores
quanto ao nmero de razes. Provavel-
mente as concentraes de AIB utiliza- plantas micropropagadas, uma srie
das no possibilitaram a induo do
mesmo nmero de razes que foi ob-
servado para o Marubakaido, j que as qumica Vegetal (Pedrotti & Voltolini,
respostas so dependentes do gentipo
(Blakesley et al., 1991). possvel que,
para este porta-enxerto, o pH do meio
de cultura no tenha favorecido a ab-
soro de auxinas pelas clulas da
base da microestaca, tendo em vista
que a penetrao de auxinas nas clu-
las depende do equilbrio entre cidos
livres e formas aninicas, que so
dependentes do pH (Harbage et al.,
1998). O maior nmero de razes obti-
do para as microestacas do M.9 e do
Marubakaido (Tabela 4), induzidas ex
vitro com o AIB dissolvido em gua e
transferidas diretamente para o subs-
trato mineral para a aclimatizao, re-
fora as concluses emitidas por Rogers
& Smith, (1992). Estes autores aumen-
taram a eficincia no enraizamento de
roseiras quando utilizaram substratos
minerais para o crescimento das razes,
comparados com meios de cultura
geleificados. Estes resultados abrem
perspectivas concretas para o uso de
substratos porosos para o enraizamen-
to in vitro, o que diminui os custos de
produo de plantas micropropaga-
das. Com esta metodologia possvel
substituir os meios de cultura conten-
do gar por substratos minerais, o que
diminui custos e produz razes de
melhor qualidade do que as produzi-
das in vitro.
Figura 4 : Crescimento de razes em
porta-enxertos de macieira, aps induo tivamente, no diferindo estatistica-
ao enraizamento
5.2 - Enraizamento ex vitro
Em funo dos custos da fase de
enraizamento e aclimatizao das
de trabalhos foram conduzidos no
Laboratrio de Morfognese e Bio-
2001). Os principais objetivos foram
de induzir o enraizamento ex vitro
em substratos porosos que servem
apenas de suporte para as plntulas
como acontece na estaquia tradicio-
nalmente usada para a propagao
de vrias espceis. Para isto, so
utilizadas miniestacas do porta-en-
xerto M.9, de 2 a 2,5 cm de compri-
mento, com dois pares de folhas,
preparadas a partir de brotaes mi-
cropropagadas. A induo ao enrai-
zamento efetuada submergindo
10mm da base das miniestacas du-
rante 10 segundos em diferentes con-
centraes de cido indolbutrico (0,
500, 1000, ou 1500 mg/L ). Em segui-
da, as miniestacas so transferidas
para bandejas alveoladas contendo o
substrato terra roxa e casca de arroz
carbonizada 1:1 (v/v.). As bandejas
so ento colocadas dentro de caixas
plsticas com uma lmina de gua de
5 mm para manter a umidade relativa
elevada. As caixas so cobertas com
uma lmina de vidro, conforme me-
todologia descrita por Pedrotti (1993).
Durante 30 dias essas caixas so
mantidas em cmara de aclimatiza-
o com temperatura de 272 C,
fotoperodo de 16 horas com intensi-
dade luminosa de 30 mol.m-2.s-1.
Aps esse perodo, as plantas so
avaliadas quanto ao percentual de
enraizamento, nmero e comprimen-
to das razes emitidas.
As maiores percentagens de en-
raizamento com 82 e 84 % so obser-
vadas nas miniestacas tratadas com
500 e 1000 mg/L de AIB, respectiva-
mente O menor percentual de enrai-
zamento (29,6%) obtido com 1500
mg/L de AIB. As microestacas-con-
trole produzem em mdia 3,4 razes.
Estes valores so inferiores
queles observados nos tratamentos
com AIB. Para os nveis de AIB de
500, 1000 e 1500 mg/L, o resultado
a produo de 5,6 a 7,6 razes respec-
mente entre si.
 Considerando que o porta-en-
xerto M.9 de difcil enraizamento
possvel sugerir que o mesmo
necessite de nveis maiores de
auxinas ou outros coofatores para
aumentar o enraizamento, j que
James & Thurnbon (1981) s obti-
veram 45% de enraizamento com
este porta-enxerto quando adicio-
naram fluoroglucinol no meio de
cultura. Possivelmente as condies
de induo in vitro, utilizadas por
estes autores dificultaram a absor-
o da auxina, como constatado
por Harbage et al. (1998). Alm
disto, a intensidade luminosa da
cmara de crescimento pode ter
contribudo para inativar parte da
auxina aplicada. Khosh-khui & Sink
(1982) obtiveram aumento no en-
raizamento de roseira com o
sombreamento da base das estacas.
Valores mais elevados no enraiza-
mento de pereira (Wang, 1991) e
em macieira (Fortes & Leite,1993)
foram obtidos com a manuteno
das plantas no escuro. A maior po-
rosidade e aerao dos substratos
utilizados tambm podem favore-
cer a induo e o crescimento de
razes, como foi observado por Jay-
Allemand et al. (1992).
Figura 5.: Desenho esquemtico da metodologia de aclimatizao de plantas micropropagadas (Pedrotti, 1993).
A e B: Induo ao enraizamento in vitro.
C: Induo ao enraizamento ex vitro.
D: Incio do processo de aclimatizao.
E: Plantas sendo mantidas em sala com nebulizao.
F: Fotoperodo sendo mantido em 16 horas de luz para evitar a entrada em dormncia.
G e H: Plantas transferidas campo para completar o crescimento.
Os nveis de AIB superiores a
500 mg/L no aumentam a percenta-
gem de enraizamento do porta-en-
xerto M.9. Estes resultados podem
estar relacionados com os teores
endgenos de auxinas produzidas
por gemas e folhas jovens, como
sugerem Hartmann et al. (1997), pois
mesmo sem aplicao de AIB, as
percentagens de enraizamento do
porta-enxerto M.9 foram de 63,5 %.
A exposio das miniestacas ao AIB
por 10 segundos suficiente para a
induo de primrdios radiculares e
o desenvolvimento e crescimento
posteriores das razes (Figura 4).
Jarvis et al. (1983) observaram um
aumento na sntese de RNA 20 horas
aps a aplicao de auxina o que
corresponde s primeiras divises
celulares.
6 - Aclimatizao
Durante a fase de aclimatizao,
as plantas micropropagadas devem
se adaptar a um ambiente completa-
mente diferente das condies em
que ela foi produzida in vitro. Duran-
te este perodo a planta deve compor
uma estrutura anatmica e fisiolgi-
ca capaz de suportar as condies de
Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
alta demanda evaporativa da atmos-
fera e de alta radiao luminosa.
Quando transferidas para condies
ex vitro, as mudas normalmente apre-
sentam altas taxas de transpirao,
em funo da alta condutividade hi-
drulica de suas folhas e a funciona-
lidade dos estmatos (Brainerd &
Fuchigami, 1981; Schakel et al., 1990),
o que, na maioria das situaes, pro-
voca elevado dficit hdrico, poden-
do provocar a morte das mudas (Daz-
Prez et al., 1995).
Apesar dos avanos nos protoco-
los de multiplicao in vitro, poucos
trabalhos foram realizados no sentido
de elucidar problemas ligados acli-
matizao das plantas (Avanzato &
Cherubini, 1993). Para Ziv (1995), a
aclimatizao pode comprometer o
processo de micropropagao por en-
volver a neoformao de um sistema
radicular e a passagem para condi-
es de cultivo ex vitro.
Durante a fase de multiplicao
das brotaes in vitro, os estmatos
apresentam-se com formas e estru-
turas anormais (Blanke & Belcher,
1989) e a densidade pode ser dife-
rente das folhas de plantas cultiva-
das ex vitro (Cappelades et al., 1990;
Sciutti & Morini, 1993). Para diver-
105

Figura 6: Crescimento e desenvolvimento de mudas de macieira aps aclimatizao.
sos autores, (Pospisilova et al., 1997),
os estmatos in vitro no so funci-
onais, permanecem contentemente
abertos ou fechados e so insens-
veis aos estmulos habituais de es-
curo, alta concentrao de CO2, ABA
e potencial hdrico. Desta forma, a
grande transpirao pode causar di-
ficuldades durante o processo de
aclimatizao.
A metodologia recomendada
por Pedrotti (1993) (Figura 5) e
utilizada no LMBV por Pedrotti &
Voltolini (2001), possibilitou bons
resultados para vrios gentipos de
macieira. Neste processo, as plan-
tas so induzidas ao enraizamento
ex vitro e transferidas para bande-
jas alveoladas.
As bandejas so colocadas em
caixas plsticas cobertas com uma
placa de vidro transparente. Esta
condio, permite a manuteno da
umidade relativa em 100%. Com
esta metodologia, a sobrevivncia
das plantas situa-se entre 70 e 95%
(Tabela 5). No que concerne ma-
tria seca produzida pelas razes e
parte area das plantas, os maiores
valores so obtidos quando as plan-
tas receberam 1000 mg/L de AIB na
fase de induo ao enraizamento. A
aclimatizao pode ser efetuada em
cmaras de nebulizao que man-
tm alta umidade relativa, o que
diminuem as possibilidades de de-
sidratao e morte das plantas. Neste
sentido, Maciel et al. (2002)
demostraram que possvel obter
altos ndices de sobrevivncia de
plantas do porta-enxerto M.7. Nes-
te processo, as bandejas so trans-
feridas para diretamente para a c-
mara de nebulizao. Aos 30 dias
aps a transferncia ex vitro, a per-
centagem de enraizamento maior
nas mudas que foram aclimatizadas
no substrato composto por casca de
arroz carbonizada, j que esta au-
menta o espao poroso como foi
observado por L & Collet (1991) e
por Avanzato & Cherubini (1993).
As altas percentagens de enrai-
zamento coincidem com as de so-
brevivncia, pois todas as plantas
que enraizaram sobreviveram, e co-
incidem com os de crescimento das
mudas (Figura 6). Maciel et al. (2002)
sugerem que a umidade relativa no
ambiente utilizado garantiu as con-
dies adequadas para a aclimatiza-
o das mudas. Esta hiptese cor-
roborada por Campostrini & Otoni
(1996), pois plntulas produzidas in
vitro no esto adaptadas ao novo
ambiente, pois no possuem meca-
nismos de proteo contra a desi-
dratao, j que seus estmatos ge-
ralmente se encontram abertos
(Schackel et al., 1990). No entanto,
segundo Pospslov et al.(1997) e
Bolar et al. (1998), durante a aclima-
tizao as mudas ativam os mecanis-
mos que permitem sua sobrevivn-
cia aps a transferncia para a casa
de vegetao. Possivelmente as con-
dies de aclimatizao utilizadas
neste trabalho possibilitaram a so-
brevivncia da planta at a entrada
em funcionamento dos estmatos, o
que permitiu um maior controle so-
bre as perdas de gua, o que est de
acordo com Sutter (1988).
Consideraes Finais
Os resultados obtidos nesse la-
boratrio corroboram com aqueles
que foram publicados por vrios
grupos de pesquisa nacionais e es-
trangeiros. As metodologias desen-
volvidas permitem a produo co-
mercial de mudas de porta-enxertos
e copa de macieira micropropagados.
Em que pese as peculiaridades de
cada gentipo a grande maioria dos
clones utilizados atualmente podem
ser produzidos seguindo protocolos
semelhantes. A perspectiva do uso
da induo ao enraizamento realiza-
do simultaneamente aclimatizao
das plantas ex vitro pode diminuir em
at 50% o custo de produo de uma

Tabela 5. Sobrevivncia, nmero e comprimento de razes altura e nmero de folhas de miniestacas do

porta-enxerto de macieira M.9 (Malus pumila), submetidas ao enraizamento ex vitro, em diferentes
concentraes de AIB, 45 dias aps a repicagem para substrato mineral.
AIB Sobrevivnciadas Nmero de Comprimento das Comprimento das Nmero de
(mg/L) plantas (%) razes razes (cm) brotaes (cm) folhas
0 85 b 10,1 ns 12,0 ns 5,3 ns 7,5 ns
500 95 a 11,5 12,5 6,3 8,0
1000 70 c 1 6, 0 11 ,6 6,9 7,5
1500 73 c 20 ,0 11 ,3 6,9 7,8
* Mdias seguidas de mesmas letras nas colunas no diferem significativamente pelo teste de Duncan a 5%.
ns - no significativo

106 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003

muda micropropagada, o que torna
vivel o uso comercial da micropro-
pagao.
A produo de mudas de alta
qualidade gentica e sanitria um
fator de extrema importncia para a
garantia da competitividade da
pomicultura nacional. Neste sentido,
a aplicao das tcnicas aqui aborda-
das abrem perspectivas para a insta-
lao de laboratrios comerciais para
atender demanda de mudas para a
renovao de pomares pouco produ-
tivos e a implantao de novos po-
mares com alta densidade.
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Pesquisa
Adriano Luiz Tonetti
Mestre em Saneamento e Ambiente - UNICAMP
atonetti@fec.unicamp.br
Bruno Coraucci Filho, Dr
Professor Associado da Faculdade de Engenharia
Civil - UNICAMP
Alexandre Patto Kanegae
Mestre em Saneamento e Ambiente - UNICAMP
Ronaldo Stefanutti, Dr
Doutor pelo CENA-USP
Ilustraes cedidas pelos autores
Mtodo Alternativo de
Tratamento de Esgotos
Reator anaerbio com recheio de bambu associado com filtros biolgicos de areia
Resumo
ste artigo apresenta os re-
sultados encontrados para
o estudo de um sistema
alternativo de tratamento
de esgotos constitudo por
reator anaerbio com re-
cheio de bambu associado a um filtro
biolgico de areia. Tal combinaao
possui baixo custo e busca minimizar
o srio problema de saneamento pelo
qual o Brasil passa.
O reator anaerbio foi alimenta-
do com uma vazo de 2 l/min e seu
efluente era aplicado em cinco cargas
hidrulicas (20, 40, 60, 80 e 100 l/m2)
sobre a superfcie de quatro filtros de
areia com diferentes profundidades
de leitos (25, 50, 75 e 100 cm).
Devido ao dos microrganis-
mos anaerbios e aerbios, que ade-
rem superfcie do bambu e da areia,
obteve-se uma excelente remoo
de matria orgnica do esgoto que,
caso fosse lanada em um corpo de
gua antes do processo de tratamen-
to, levaria ao consumo de oxignio e
a uma mortandade da fauna e flora
aquticas. Quanto ao nitrognio, ocor-
reu uma grande transformao da
sua parte orgnica em nitrato, de-
monstrando a grande adaptao das
bactrias responsveis por esta rea-
o bioqumica ao meio formado
pela areia. Os organismos patogni-
cos foram em grande medida removi-
dos, adequando o efluente a alguma
prtica de reuso.
Palavras-chave: filtro de areia,
ps-tratamento, efluente anaerbio,
baixo custo.
Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
Introduo
O Brasil um dos pases que
possuem o maior fluxo interno de
gua. Porm, h uma enorme
disparidade na distribuio deste re-
curso entre suas diferentes regies.
Enquanto que no norte existe uma
abundncia hdrica, no sul e sudeste,
industrializados e populosos, ocorre
a escassez causada pelo elevado con-
sumo e grande poluio dos rios,
resultante da precria situao do
saneamento bsico.
Este quadro alarmante acarreta
srios problemas sade pblica e
ao meio ambiente levando a mortan-
dade de um grande nmero de esp-
cies. Portanto, um dos desafios atuais
para a melhoria desta situao o
desenvolvimento de sistemas de tra-
tamento simples, eficientes e adapt-
veis s condies econmicas e es-
truturais do nosso pas.
O Tratamento Anaerbio
O tratamento anaerbio depen-
de dos microrganismos que agem na
ausncia de oxignio, transforman-
do os dejetos gerados pela ao
humana em produtos mais simples
como metano, gs carbnico e gua
(METCALF e EDDY, 1991). Estes
compostos mais simples podem
retornar ao meio ambiente sem com-
prometer o planeta e seu ecossiste-
ma. Apesar da boa eficincia deste
sistema, entre 10 e 30% da matria
orgnica no degradada, o que
impede que seu efluente atenda
109

Figura 1: Filtro anaerbio de fluxo ascen-
dente.
legislao brasileira quanto a este
parmetro, havendo necessidade de
um ps-tratamento.
O reator anaerbio caracteriza-
do pela presena de um material de
recheio estacionrio e inerte no inte-
rior de um tanque fechado. O esgoto
penetra pela parte inferior e flui at a
sua sada na rea superior. No decor-
rer do escoamento, o esgoto entra em
contato com este material. Sobre a
superfcie deste recheio ocorre a for-
mao natural de um biofilme que
degrada o substrato contido no fluxo
de esgoto (Figura 1).
O material de recheio no qual
os microrganismos aderem deve
ter as seguintes caractersticas: es-
trutura resistente, ser biolgica e
quimicamente inerte, leveza, po-
rosidade elevada e preo reduzi-
do. Tal sistema possui a vantagem
de consumir pouca energia e pro-
duzir uma quantidade mnima de
lodo, alm de no depender da
utilizao de complexos equipa-
mentos mecnicos.
Pesquisadores da UNICAMP di-
agnosticaram que o uso de anis de
bambu poderia satisfazer a tais pr-
requisitos (CAMARGO, 2000). Este
material apresenta a vantagem de
possuir um baixo custo e ser facil-
mente encontrado no Brasil. Desta
forma, construram e operaram qua-
tro reatores que possuam o bambu
como recheio e obtiveram uma re-
moo mdia de matria orgnica
(DBO) superior a 75%. Quanto ao
nitrognio orgnico, somente uma
parcela de sua concentrao foi trans-
formada em amnia.
Pode-se concluir ao final deste
110 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
trabalho inicial que, apesar dos bons
resultados, havia a necessidade de se
realizar um ps-tratamento do
efluente anaerbio gerado pelo rea-
tor de bambu, pois ele no se ade-
quava legislao brasileira. Assim,
buscando manter as caractersticas
de um tratamento alternativo e bara-
to decidiu-se aplicar o efluente gera-
do sobre a superfcie de filtros biol-
gicos de areia.
A associao do reator anaer-
bio com filtros biolgicos de areia
seria uma alternativa que preserva-
ria o baixo custo total. Outro item
importante seria a possibilidade de
dispor o efluente gerado diretamen-
te sobre os cursos dgua, ou
reutiliz-lo na irrigao, ou no con-
sumo no-humano, seguindo a ori-
entao da Organizao Mundial de
Sade (OMS, 1989).
No Brasil, esta combinao seria
aplicvel nas pequenas cidades, em
bairros isolados e condomnios fe-
chados das metrpoles, onde a insta-
lao de uma rede coletora de esgo-
tos apresentaria custo elevado.
Filtros Biolgicos de Areia
O filtro biolgico de areia um
mtodo de tratamento bastante anti-
go, inicialmente adotado na remoo
de turbidez da gua potvel. A partir
do sculo XIX, na Europa e nos
Estados Unidos, passou a ser apro-
veitado na depurao de esgotos
(MICHELS, 1996).
Figura 2: Vistas externa (esquerda) e interna (direita) dos reatores anaerbios.
O funcionamento deste sistema
baseia-se na aplicao de afluente
intermitentemente sobre a superfcie
de um leito de areia. Durante a infil-
trao do lquido ocorre a purificao
por mecanismos fsicos, qumicos e
biolgicos.
O tratamento fsico resultan-
te do peneiramento e o qumico
ocorre pela adsorso de determina-
dos compostos. A purificao de-
pende principalmente da oxidao
bioqumica que ocorre no contato
do afluente com a cultura biolgi-
ca. Devido a esta caracterstica,
Jordo e Pessoa (1995) afirmam
que este tipo de sistema incorre-
tamente chamado de filtro, pois seu
funcionamento no possui como
explicao primordial o peneira-
mento ou a filtragem. Neste mesmo
sentido, KRISTIANSEN (1981) sus-
tenta que o leito de areia, em con-
junto com os microrganismos, for-
ma um filtro vivo.
Material e Mtodos
Este projeto de pesquisa est
instalado em uma rea experimental
situada na Estao de Tratamento de
Efluentes Graminha, na cidade de
Limeira, Estado de So Paulo. O es-
goto bruto originrio de um bairro
residencial denominado Graminha.
Inicialmente esta gua residuria pas-
sa por um tratamento preliminar com-
posto por grades de reteno e caixa
de areia e em seguida, uma pequena
 Tab ela 1: Den o min ao d o s filtro s b io l gico s e pro fu n d id ad es d o Para a distribuio uniforme
leito d e areia. do afluente sobre o leito dos filtros,
P ro fu n d id ad e d o Leito empregou-se uma placa quadrada
Filtro de 20 cm de comprimento, feita de
(cen tmetro s)
F025 25 madeira e posicionada no centro da
F050 50 camada superficial (Figura 4). Aps
F075 75 o lanamento do afluente pela tu-
F100 100 bulao de distribuio, existe o
poro do seu fluxo direcionada at sua 20 cm de profundidade. Logo choque do lquido com esta placa,
quatro reatores anaerbios com re- acima estava a camada formada por distribuindo as gotculas sobre a
cheio de bambu. pedregulho, com 10 cm de profundi- superfcie.
Cada reator possui volume de dade, que objetivava sustentar a areia, Buscando-se determinar a ca-
500 l e foi construdo em ao inox impedindo que suas partculas fos- pacidade de tratamento dos filtros
tendo formato cilndrico e fundo sem arrastadas para fora da estrutura biolgicos de areia, foram aplica-
cnico, que funcionou como um do sistema. Quanto camada de das as cargas hidrulicas de 20, 40,
compartimento para a distribuio areia, buscando-se determinar qual 60, 80 e 100 l/m2 de efluente prove-
do esgoto (Figura 2). O meio supor- era a espessura ideal para a realiza- niente dos reatores anaerbios so-
te foi constitudo de anis de bam- o do tratamento, empregou-se qua- bre as superfcies. Cada carga hi-
bu da espcie Bambusa tuldoides. tro filtros com diferentes profundida- drulica foi empregada pelo pero-
O caule do bambu foi cortado em des de leito, conforme apresentado do de um ms entre as segundas e
pedaos de aproximadamente 5 cm na Tabela 1. sextas-feiras.
(CAMARGO, 2000). A areia empregada foi a popu- Na Figura 5 est apresentado de
Estes reatores anaerbios foram larmente denominada de grossa co- forma esquemtica o fluxograma de
operados com fluxo ascendente, ten- mercial, possuindo um dimetro efe- funcionamento deste sistema de tra-
do uma vazo de 2 l/min e tempo de tivo (D10) de 0,093 mm. Salienta-se tamento em estudo.
deteno hidrulica de 3 horas, con- que estes materiais foram os mais As seguintes amostras foram ob-
trolados diariamente. comumente encontrados na regio tidas semanalmente: esgoto bruto,
de desenvolvimento do projeto. efluente dos reatores anaerbios com
Filtros de Areia Na construo dos filtros, foi recheio de bambu e efluentes dos
utilizada uma caixa cilndrica com filtros de areia. Todas as anlises
Na construo do leito dos fil- estrutura de fibra de vidro e dimetro foram baseadas no Standard Methods
tros foram empregadas trs camadas de 100 cm. Na Figura 3 h um esque- for the Examination of Water and
posicionadas a partir da base. A pri- ma da disposio das diferentes ca- Wastewater (AWWA/ANHA/WEF,
meira foi constituda por brita e pos- madas que compem os filtros. 1999).
Os parmetros fsicos, qumi-
cos e biolgicos analisados foram os
seguintes: pH, demanda bioqumica
de oxignio (DBO), srie do nitro-
gnio (nitrognio orgnico e
amoniacal, nitrito e nitrato) e
coliformes totais.

Resultados

pH

O estudo deste parmetro de

extrema importncia em um sistema
biolgico. Isto porque os microrga-
nismos responsveis pelo tratamen-
to dos esgotos necessitam de um pH
que varie entre 4 e 8. Caso contrrio
existe o impedimento da formao
do biofilme responsvel pela depu-
rao do efluente.
De acordo com a Figura 6 pode-
se fazer uma diviso dos valores de
Figura 3: Esquema dos filtros de areia.

Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003 111


Figura 4: Vista externa (esquerda) e superior
(direita) de um filtro de areia, tendo ao centro
a placa de distribuio de afluente.
pH encontrados para os filtros biol- resultados esperados. De acordo com
gicos de areia em dois grupos bsi- a anlise dos compostos nitrogena-
cos. O primeiro engloba os pHs en- dos, esperava-se que a transforma-
contrados nas cargas hidrulicas de o dos nitrognios orgnico e
20, 40 e 60 l/m2 onde houve tendn- amoniacal em nitrato causasse a re-
cia para valores superiores a 7. No duo do pH. Tal fato ocorreria devi-
segundo grupo, constitudo pelas do reduo de alcalinidade
cargas de 80 e 100 l/m2 nota-se valo- provocada pelas bactrias aerbias
res inferiores ao pH neutro. no processo metablico da degrada-
A caracterstica encontrada para o da matria orgnica. Uma poss- nas de aplicao da carga de 100 l/
o primeiro grupo no se adequa aos vel explicao para esta caractersti-
Figura 5: Fluxograma do sistema de tratamento em estudo.
ca pode ser a formao de um siste-
ma tampo qumico pela areia. As-
sim, apesar do consumo de compos-
tos alcalinos, haveria o impedimento
da queda do pH do efluente dos
filtros de areia.
A formao do sistema tam-
po pelo leito de areia pode ser
comprovada pelo fato do filtro
F025, que possui o menor volume
de areia, possuir tendncia aos
menores pHs e tambm por ter
sido o primeiro a apresentar os
valores mais baixos. O filtro de 100
cm manteve valores altos de pH
ate o final da aplicao da carga de
100 l/m 2.
V-se tambm que o sistema,
mesmo sob condies temporrias
de aplicaes de pHs bastante anor-
mais, conforme encontrado na sex-
ta semana, mostrou-se capaz de
amortec-los. Isso tambm pode
ser notado nas duas ltimas sema-
m2, quando houve a gerao de um
efluente cido pelos reatores anae-
rbios de bambu. Observa-se que
nesta situao os efluentes dos qua-
tro filtros no tiveram uma tendn-
cia a acompanh-lo nesta queda
brusca.
Quando se comparam os valo-
res encontrados para o pH com aque-
les exigidos pela legislao brasileira
(CONAMA 20/86), que permite a
emisso de um efluente cujo pH
varie entre 4 e 9, nota-se que o
sistema propiciou valores bastante
satisfatrios.

Demanda Bioqumica de
Oxignio - DBO

Caso seja lanado em um cor-

po de gua uma grande quantidade
de matria orgnica, haver o con-
sumo parcial dela pelos microrga-
nismos presentes no meio. Como
conseqncia desta degradao,
esta colnia formada consome gran-
de quantidade de oxignio, levan-
do morte diversas espcies da
fauna e da flora.
No que se refere a DBO, par-
metro que determina a quantidade
Figura 6: Variao do pH durante as semanas de coleta. de matria orgnica, os reatores

112 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003

 anaerbios propiciaram uma remo-
Tab ela 2: R emo o md ia d e DBO n o sistema d e tratamen to n as o mdia de aproximadamente
cargas h id ru licas aplicad as. 48%. Este resultado est de acordo
P o n to d e R emo o md ia d e DBO (%) com as possibilidades dos micror-
C o leta 20 l/m2 40 l/m2 60 l/m2 80 l/m2 100 l/m2 ganismos anaerbios e com os da-
F025 95,3 97,3 93,7 95,8 91,3 dos encontrados para materiais de
F050 98,0 98,9 98,7 96,5 94,9 recheio normalmente empregados
F075 97,5 98,9 98,8 98,3 97,0 em estaes de tratamento de gran-
F100 97,6 98,8 99,4 99,3 98,7 de porte.
Quanto aos filtros de areia, v-
se pela Figura 7 a excelente remoo
de DBO. O maior valor encontrado
foi de somente 29 mg/l, obtido no
efluente do filtro com 25 cm de
profundidade, durante a aplicao
da maior carga hidrulica. Este resul-
tado est muito abaixo do mximo
permitido pela legislao brasileira,
que de 90 mg/l.
Outra caracterstica observada
que quanto mais profundo o leito
de areia, melhores foram os resulta-
Figura 7: DBO mdia para cada uma das cargas hidrulicas aplicadas. dos. Isto pode ser explicado pelo
fato de que quanto maior a profun-
didade, maior a quantidade de areia
revestida com biofilme. Assim exis-
te uma ampla possibilidade de con-
tato do material orgnico com os
microrganismos.
Quando se observa a Tabela 2,
que apresenta os percentuais de
remoo da DBO em todo o siste-
ma, observa-se o valor mnimo de
91,3%. O filtro com 100 cm de
profundidade nunca removeu me-
nos que 97,6%, independente da
carga de aplicao.

Nitrognio

A remoo dos compostos nitro-

genados presentes no esgoto de
extrema importncia. Caso isto no
ocorra tem-se o lanamento de um
efluente txico que pode levar
morte de micro e macrorganismos.
Tal fato ocorre devido ao nitrognio
amoniacal ou devido eutrofizao,
que acaba por criar um meio propcio
florao de algas.
Pela Figura 8 percebe-se que
tanto o esgoto bruto como o
efluente dos reatores de bambu
eram constitudos de compostos
nitrogenados pouco degradados
Figura 8: Mdia para a concentrao dos compostos nitrogenados no esgoto bru- (nitrognio orgnico e amoniacal).
to e efluente dos reatores de bambu em cada carga hidrulica. Assim, desde a produo dos

Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003 113


Figura 9: Mdia para a concentrao dos compostos nitrogenados no filtro F025 e
F050 em cada carga hidrulica.
dejetos pelo ser humano at a che-
gada estao de tratamento ocor-
reram poucas transformaes em
sua composio. Isto ocorre prin-
cipalmente devido ao fato de os
organismos responsveis pela de-
composio dos compostos nitro-
genados agirem somente em pre-
sena de oxignio.
Ao comparar-se o esgoto bruto
com o efluente dos reatores de bam-
bu, nota-se que apesar da sua carac-
terstica anaerbia, a amnia na mai-
oria das situaes superava o valor
de nitrognio orgnico. Quanto s
concentraes de nitrato e nitrito,
observa-se que foram muito peque-
nas para estes dois pontos de coleta.
Pelas Figuras 9 e 10, nota-se
que o efluente dos reatores anaer-
bios de recheio de bambu ao
infiltrar-se atravs do leito de areia
dos filtros biolgicos sofreu gran-
des alteraes no que se refere aos
compostos nitrogenados. Ou seja,
114 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
existiu uma grande transformao
do nitrognio orgnico e do
amoniacal para nitrato, indepen-
dente da carga que era empregada.
Tal modificao resultante das
nitrobactrias, que em ambientes
aerados levam tais compostos sua
forma mais oxidada.
Para os filtros F025 e F050, a
partir da carga de 60 l/m2 passa a
haver um aumento da concentrao
de nitrognio amoniacal, que foi
ampliada na de 80 l/m2. Este au-
mento pode ser explicado pelo
acrscimo de carga, que acarretou
na diminuio do tempo de contato
entre o lquido que se infiltrava e a
cultura biolgica aderida areia.
Quanto maior era a profundida-
de do leito, maior era o processo de
nitrificao, ou seja, de transforma-
o do nitrognio orgnico em nitra-
to. Assim, de acordo com a Figura 10,
nota-se que o filtro com 100 cm de
profundidade de leito propiciava uma
completa nitrificao. Assim, a
somatria das concentraes de to-
dos os compostos nitrogenados era
muito semelhante de nitrato.
Coliformes Totais
Os coliformes totais so uma
classe de organismos adotada pela
engenharia sanitria como um indi-
cador da presena de organismos
patognicos. Assim, caso esteja em
pequenas quantidades, pode-se su-
por que a gua tambm no conter
seres vivos que possam causar algum
dano a sade.
Ao analisar-se as concentraes
de coliformes totais pela Figuras 11,
v-se que o afluente sempre possua
valores superiores a 106 NMP/100 ml,
chegando em alguns casos a superar
109 NMP/100 ml. Desta forma, pode-
se constatar que os reatores anaer-
bios com recheio de bambu realmen-
te no removem estes organismos,
conforme afirma a literatura.
Quanto aos filtros de areia, nas
baixas cargas o F025 j apresentava
valores mais altos que os outros trs,
e no decorrer do desenvolvimento do
projeto, sempre possua as maiores
concentraes. Por outro lado, o filtro
com 100 cm de profundidade chegava
a gerar um efluente capaz de atender
legislao brasileira para a gua
potvel quanto a coliformes totais.
Ao observar-se a comparao
entre o afluente e o efluente do filtro
de areia apresentada na Tabela 3,
percebe-se a grande remoo de
coliformes totais que este sistema
propiciou. O filtro com menor pro-
fundidade de leito, o F025, apresen-
tou altos percentuais, sendo no mni-
mo igual a 84%. Os dois filtros mais
profundos tiveram valores superio-
res a 99% em praticamente todas as
situaes em estudo.
Concluses
A anlise destes resultados de-
monstra a grande viabilidade deste
sistema biolgico para o tratamento
de efluente de pequenas comunida-
des, utilizando materiais presentes
nas prprias comunidades.
 O efluente gerado estava em con-
formidade com o exigido pela legisla-
o brasileira para a emisso em um
corpo receptor, sendo compatvel com
aqueles produzidos nas grandes esta-
es de tratamento existentes nas gran-
des cidades brasileiras. Outro ponto
a possibilidade do reuso deste lquido
em alguma atividade humana, resguar-
dando os mananciais naturais para
usos mais nobres.

Agradecimentos

A FAPESP, CNPq, FINEP, Caixa

Econmica Federal e PROSAB pelo
apoio e financiamento na construo
do projeto e em sua manuteno.

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nitrias sobre el uso de guas
C o leta 20 l/m2 40 l/m2 60 l/m2 80 l/m2 100 l/m2
F025 97,5 89,8 84,8 84,9 87,0 residuales en agricultura e
F050 99,9 99,2 98,0 87,4 96,3 aquicultura. Sries de reporta-
F075 100,0 99,9 99,4 99,5 97,0 gens tcnicas. N 778. OMS, Gene-
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Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003 115

 Amendoim Selvagem
Pesquisa
Soraya Cristina Leal-Bertioli - PhD
Pesquisadora EMBRAPA Recursos
Genticos e Biotecnologia,
soraya@cenargen.embrapa.br
Patrcia Messenberg Guimares - PhD
Pesquisadora EMBRAPA Recursos
Genticos e Biotecnologia,
messenbe@cenargen.embrapa.br
Alessandra Pereira Fvero - MsC
Pesquisadora EMBRAPA Recursos
Genticos e Biotecnologia,
favero@cenargen.embrapa.br
Mrcio de Carvalho Moretzsohn - MsC
Pesquisador EMBRAPA Recursos
Genticos e Biotecnologia,
marciocm@cenargen.embrapa.br
Karina Proite - MsC
Estudante de doutorado da UnB,
proite@cenargen.embrapa.br
David John Bertioli - PhD
Pesquisador Universidade Catlica de Braslia
david@pos.ucb.br
Ilustraes cedidas pelos autores
116 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
Uma fonte de resistncia a pragas
amendoim cultivado,
Arachis hypogaea,
uma das leguminosas
produtoras de gros
mais plantada em todo
o mundo, devido ao seu alto conte-
do de protena e leos insaturados.
cultivado extensivamente na China,
ndia e Estados Unidos, alm de di-
versos pases da Amrica Latina e
frica (Conab, 2002). Os principais
problemas da cultura esto relacio-
nados ao ataque de fungos da parte
area e nematides, necessitando pe-
riodicamente da utilizao de defen-
sivos agrcolas (Hagan, 1998 ;
Subrahmanyam et al., 1983; Bailey,
2002). Espcies silvestres de Arachis
tm-se mostrado altamente promis-
soras como fonte de resistncia a
diversas pragas que atingem o amen- foto ilustrativa
doim e outras culturas, sendo que j
foram identificadas algumas espci- namarca) e Sainsburys Laboratories (In-
es com resistncia a trs fungos glaterra) na busca de genes de resistn-
foliares (Cercospora arachidicola, cia a fungos e nematides patognicos
Cercosporidium personatum e ao amendoim, e no desenvolvimento
Puccinia arachidis) e ao nematide de um mapa gentico para Arachis que
das galhas (Meloidogyne spp.). Bus- possibilite a utilizao destes genes.
ca-se, agora, desenvolver ferramen-
tas para a utilizao destas espcies Produo de um mapa
silvestres em programas de melhora- gentico para facilitar a
mento gentico, visando obteno seleo assistida
de cultivares de amendoim com re-
sistncia mais duradoura (Fig.1). Espcies silvestres de Arachis pos-
O projeto Identificao de resis- suem alta diversidade gentica e cons-
tncias a stress bitico em Arachis sel- tituem uma rica fonte de genes de
vagem e desenvolvimento de ferra- resistncia. Diversos trabalhos tm mos-
mentas para o melhoramento gentico trado que as espcies silvestres so
atravs de mapeamento e genmica muito mais resistentes a doenas do
comparativa combina esforos e habi- que a espcie cultivada (Arachis
lidades de pesquisadores da Embrapa hypogaea) (Holbrook et al., 2000). O
Recursos Genticos e Biotecnologia, amendoim cultivado tetraplide (tem
Universidade Catlica de Braslia, IBONE quatro conjuntos de cromossomos, dois
(Instituto Botanico del Nordeste, Ar- conjuntos do chamado genoma A e
gentina), Universidade de Aarhus (Di- dois conjuntos do genoma B), enquan-
 Fig.1 - Sementes de diferentes espcies de Arachis
to que a maioria das espcies silvestres
diplide (apenas dois conjuntos de
cromossomos). Esta diferena de
ploidia dificulta a introgresso de genes
dos parentes silvestres, uma vez que os
hbridos obtidos de maneira tradicio-
nal so triplides estreis. Por isso,
para obter hbridos frteis, necessita-se
fazer cruzamentos entre espcies sil-
vestres com genomas AA e BB. Os
hbridos obtidos (AB) so ento sub-
metidos a tratamento com colchicina
para duplicar o nmero de cromosso-
mos, obtendo-se, assim, anfidiplides
sintticos (AABB), que, em princpio,
so compatveis com o amendoim cul-
tivado. Estes hbridos so ento cruza-
dos com A. hypogaea dando continui-
dade ao programa de pr-melhora-
mento de Arachis.
Tradicionalmente, nos programas
de melhoramento de plantas que en-
volvem hibridaes seguidas de retro-
cruzamentos, grande parte do genoma
da parental doadora incorporada ao
genoma da planta receptora e, por
isso, so necessrias vrias geraes de um gene de resistncia principal
para a eliminao gradual dos genes
indesejveis, enquanto o gentipo do
parental recorrente mantido para os
demais locos. Em cada gerao so
selecionadas as plantas que apresen-
tam a caracterstica de interesse a ser
introgredida, e as demais caractersti-
cas do parental recorrente. Este pro-
cesso de seleo, aps a introgresso,
pode ser otimizado atravs da cons-
truo de mapas genticos e da iden-
tificao de marcadores moleculares
fortemente associados aos genes de
interesse. Desta forma, possvel, em
cada fase de seleo, a escolha dos
indivduos que contenham o mximo
de caractersticas do parental recor-
rente, diminuindo assim o tempo do
processo de melhoramento. Isso
particularmente importante em pro-
gramas que visam introgresso de
genes de resistncia a pragas. Neste
caso, a seleo indireta atravs de
marcadores moleculares possibilita,
alm da reduo de tempo, a identifi-
cao e seleo de gentipos resisten-
tes na ausncia do patgeno e a
transferncia e manuteno de mais
durante a seleo (piramidizao de
genes de resistncia).
Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
Para a implementao de um
esquema efetivo de seleo assistida
por marcadores em programas de
melhoramento gentico, trs reque-
rimentos so essenciais: (1) alguns
marcadores devem estar fortemente
ligados aos genes que controlam as
caractersticas de interesse; (2) os
marcadores devem estar facilmente
disponveis para a anlise de grandes
populaes e (3) as tcnicas utiliza-
das devem ser reproduzveis entre
laboratrios e com baixo custo.
Mapeamento comparativo:
Um atalho para um mapa
gentico
Espcies de Arachis tm geno-
mas muito grandes. O genoma
haplide de Arachis hypogaea tem
aproximadamente 1,74 x 109 pares de
bases. Isto dificulta a identificao e o
mapeamento direto de genes de inte-
resse. Uma outra espcie da famlia
das leguminosas, Lotus japonicus, tem
um genoma bem menor, tem um
mapa gentico de alta resoluo j
disponvel e os projetos de seqenci-
117

Fig.2 - Exemplo de estudo de sintenia: Marcadores moleculares (M1 a M4) em posies
colineares nos genomas de Lotus e Arachis.
amento de ESTs (expressed sequenced
tags) e do genoma estrutural esto
quase completos (Asamizu et al., 2000;
Sato et al., 2001). Por isso, L. japonicus
tem sido considerada uma planta-
modelo para todas as leguminosas,
auxiliando no entendimento de ou-
tras espcies de genomas mais com-
plexos. A comparao entre estes dois
gneros e a anlise da ordem dos
genes nos cromossomos possibilita a
identificao de regies correlatas
entre os dois genomas (chamada
sintenia), ou seja, o mapeamento com-
parativo. Neste processo, so identifi-
cados marcadores moleculares comuns
aos diversos genomas, chamados mar-
cadores-ncoras. Como exemplo de
transferncia de informao da planta
modelo para leguminosas cultivadas
pode-se citar o caso dos fentipos
mutantes: uma vez que o gene res-
ponsvel por um fentipo mutante
seja clonado em Lotus, a anlise
fenotpica comparativa e a informa-
o do mapa podem ser utilizadas
como base para identificar genes can-
didatos para o gene correspondente
em outras leguminosas.
No caso especfico de Arachis, a
anlise genmica comparativa pode-
r auxiliar no desenvolvimento de
marcadores para o melhoramento ge-
ntico da cultura, o que certamente
facilitar a clonagem de genes de
interesse. A explorao da colineari-
dade entre genes de Arachis e Lotus
buscando a identificao entre as duas
espcies e a identificao de regies
118 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
cromossmicas ortlogas (genes ho-
mlogos localizados em genomas de
diferentes organismos) tem sido reali-
zada atravs do desenvolvimento de
um banco de ESTs de Arachis (Gui-
mares et al., 2003 ). Este banco de
dados dever acelerar o mapeamento
do genoma de Arachis, a identificao
de resistncias e o desenvolvimento
de marcadores a serem utilizados nos
programas de melhoramento. Um be-
nefcio adicional do projeto o desen-
volvimento de um sistema gentico
unificado para a famlia das legumino-
sas, pois trabalhando com Lotus que
considerado um dos gneros mais
adaptados desta famlia e Arachis que
considerado um dos mais primiti-
vos, qualquer regio de similaridade
encontrada provavelmente existir em
todas as leguminosas. At o momen-
to, j foram encontradas homologias
entre Lotus e Arachis em vrios genes
que codificam para enzimas envolvi-
das em importantes cadeias metabli-
cas, alm da homologia entre genes
envolvidos na simbiose destas plantas
com bactrias fixadoras de nitrognio
estarem sendo estudadas (Sandal, et
al., 2003) (Fig. 2). A identificao de
tais regies pode facilitar o isolamen-
to de genes envolvidos neste proces-
so, possibilitando o desenvolvimento
de variedades de Arachis com maior
capacidade de fixao de nitrognio,
o que resultaria na reduo da utiliza-
o de fertilizantes nitrogenados, con-
tribuindo para uma produo de ali-
mentos mais sustentvel.
Estudos de expresso gnica
O estudo da expresso gnica tem
demonstrado ser uma importante ferra-
menta no entendimento dos processos
biolgicos em nvel molecular. Por exem-
plo, estes estudos podem ser utilizados
na identificao de uma rede de genes
expressos de fundamental importncia
no desenvolvimento de uma determina-
da estrutura, ou na resposta de um
organismo a um estmulo externo. O
estudo da expresso gnica diferencial
pode contribuir para a caracterizao de
resistncias, pois possibilita a identifica-
o de geneschave desta rede atravs
da comparao da expresso gnica
durante o desenvolvimento de uma es-
trutura sob condies normais e em
organismos carregando uma mutao
ou submetidos a algum tipo de stress.
Atravs do acmulo de dados da expres-
so diferencial de vrios genes sob dife-
rentes condies, pode-se reconstruir as
vias reguladas por estes genes, predizer
onde eles atuam e identificar novos
genes associados ao processo.
Para o entendimento da funo de
um gene, fundamental o estudo de
onde e quando ele expresso. Recente-
mente, vrias estratgias foram desen-
volvidas para permitir o estudo da fun-
o de vrios genes simultaneamente,
entre elas: a gentica reversa (gerao de
mutaes especficas em genes de inte-
resse), screens mutagnicos (gerao de
mutaes randmicas e screening de um
pool de mutantes para se identificar
fentipos de interesse) e bioinformtica
(a anlise dos dados gerados por todas as
estratgias acima). As estratgias acima,
associadas aos projetos genoma, que
tm como objetivo o sequenciamento do
genoma inteiro de vrios organismos,
tm possibilitado o estudo sistemtico da
expresso diferencial de genes em nvel
de genoma como um todo. A anlise da
expresso diferencial de genes em res-
posta ao ataque de um patgeno consti-
tui, portanto, uma ferramenta importan-
te no isolamento de genes de resistncia
ou de fatores envolvidos com a interao
patgeno-hospedeiro.
Neste projeto, a identificao de
genes expressos diferencialmente em
germoplasma resistente de Arachis est
sendo realizada atravs da anlise de ESTs
e de microarranjos. Para tal, vrias biblio-
tecas de cDNA foram construdas a partir
de Arachis stenosperma submetido a
diferentes situaes de stress (inoculado
com nematides e fungos) as quais esto
sendo seqenciadas de forma massal
visando construo de um banco de
dados de ESTs e dos chips de DNA.
Uma vez isolados e confirmada
sua funo, estes genes podem ser
introgredidos para o amendoim cultiva-
do ou transferidos a outras plantas de
interesse econmico, que sejam atingi-
das pelas mesmas pragas, como a soja
e feijo, para as quais j existem dispo-
nveis mtodos de transformao.
O impacto da utilizao
destas novas tcnicas no
cultivo do amendoim
O Brasil produz atualmente apro-
ximadamente 170 mil toneladas de
amendoim, sendo o maior produtor o
estado de So Paulo, com aproximada-
mente 60 mil ha plantados e 80-90% da
produo do pas (Conab, 2002). Um
dos principais problemas dos produto-
res de amendoim deste estado o
ataque de doenas fngicas de parte
area, como a mancha barrenta
(Didymella arachidicola), mancha cas-
tanha (Cercospora arachidicola), man-
cha preta (Cercosporidium personatum),
ferrugem (Puccinia arachidis) e
verrugose (Sphaceloma arachidis). A
principal cultivar plantada no pas a
cv. Tatu, com aproximadamente 80%
da rea plantada e altamente suscep-
tvel s doenas acima citadas. A ltima
cultivar de A. hypogaea lanada pelo
Instituto Agronmico de Campinas
(IAC), a IAC-Caiap, de ciclo longo
(com 130 dias) e possui resistncia
moderada s cercosporioses, mancha
barrenta e a ferrugem (Conab, 2002).
As espcies silvestres da seco
Arachis tm sido utilizadas no melhora-
mento do amendoim na ndia, Argentina,
Estados Unidos e Brasil. Vrias das esp-
cies, que, na maioria, so brasileiras,
possuem nveis de resistncia a pragas e
doenas superiores aos encontrados em
acessos de A. hypogaea (Stalker & Moss,
1987; Fvero et al., 2000 e 2001). A falta de
informaes sobre o potencial destas
espcies para o melhoramento de cultiva-
res a principal barreira para seu uso. As
69 espcies silvestres de Arachis descritas
e existentes so restritas ao Brasil, Bolvia,
Paraguai, Argentina e Uruguai, sendo 57
endmicas ao Brasil. As expedies de
coleta realizadas desde 1959 tm permiti-
do a preservao de mais de 1600 acessos
no banco de germoplasma, localizado na
Embrapa Recursos Genticos e Biotecno-
logia, atravs de seu curador e principal
coletor, Dr. Jos Francisco M. Valls. Neste
banco de germoplasma, h acessos que
representam todas as espcies de Arachis,
exceto uma, Arachis martii, considerada
extinta.
A identificao de espcies resis-
tentes a doenas e pragas e a localizao
de marcadores associados aos genes de
interesse auxiliaro sobremaneira a sele-
o de plantas com resistncia, desde as
primeiras fases do programa de melho-
ramento, at a obteno de novas culti-
vares. Acredita-se que a possibilidade da
piramidizao de genes tornar as novas
cultivares com resistncias mais dura-
douras do que se fosse utilizada apenas
a seleo baseada em avaliao agron-
mica e fitopatolgica das plantas, pois
ser possvel a identificao de marcado-
res moleculares ligados a genes de resis-
tncia localizados nos genomas A e B
oriundos de espcies silvestres e incor-
porados ao amendoim cultivado.
O projeto ir propiciar o dilogo
mais intenso entre os parceiros na coope-
rao cientfica e tecnolgica entre a
Unio Europia e Amrica Latina. Isto
tambm beneficiar o treinamento de
jovens pesquisadores em tecnologias de
ponta em genmica e citogentica. Os
mapas genticos gerados e o mapeamen-
to comparativo entre os genomas de
Arachis e Lotus podero facilitar o melho-
ramento de amendoim e, possivelmente,
os programas de melhoramento de outras
leguminosas. O desenvolvimento de va-
riedades melhoradas de amendoim adap-
tadas Amrica Latina auxiliar na redu-
o do uso de defensivos agrcolas e
poluio associada, sem perdas na produ-
tividade, contribuindo para o desenvolvi-
mento sustentvel da agricultura.
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119
 Pesquisa
Ana Paula Pacheco Clemente
Biloga, Especialista em Biotica, Direito e
aplicaes, coordenadora e professora dos cursos de
ps-graduao lato sensu e extenso em Biotica da
PUCMinas e UFLA, e do curso de extenso em
Tanatologia e Biotica do IEC-PUC Minas, membro
da diretoria do Captulo de Biotica da SBCM,
consultora da Comisso de Biotica e Biodireito da
OAB-MG, membro fundador e da Diretoria
Executiva da Sociedade Brasileira de Biotica
Regional Minas Gerais.
paulaclemente@bioconsulte.bio.br;
paulaclemente@bol.com.br
120 Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
Biotica
A rea das cincias biolgicas
a que mais privilegia o conceito de
Biotica da forma como foi concebi-
do inicialmente. Ela possui um cam-
po muito vasto de atuao para o
profissional que transita entre a rea
da sade e a do meio ambiente.
Segundo Potter, criador do termo,
que era bilogo e oncologista, a atu-
ao da Biotica seria buscar a boa
qualidade de vida, pela interao do
ser humano com o meio ambiente.
Esse conceito foi adaptado pelo Ins-
tituto Rose e Kennedy de Reprodu-
o Humana e Biotica, que tornou
assim a Biotica voltada para a
biomedicina e a biotecnologia. A
Biotica tradicional, dos EUA, ba-
seada em quatro princpios funda-
mentais, que so:
Autonomia: direito do paciente
de participar ativamente de seu trata-
mento, refutando, concordando, dis-
cutindo e decidindo junto com o
mdico a melhor conduta a ser toma-
da. Esse conceito vem da filosofia,
uma vez que o termo supramencio-
nado significa autogoverno. Entre-
tanto, para que tal acontea, o sujeito
(paciente) deve receber informaes
claras e precisas sobre seu quadro
clnico, diagnstico, tratamento e
prognstico.
Beneficncia e no-maleficncia,
as quais possuem origem hipocrtica.
A primeira pugna por sempre buscar
o bem do paciente; j a segunda
determina que, existindo dvida
quanto ao bem a ser ofertado ao
paciente e sobre os seus efeitos
Pluralidade e transdisciplinaridade
colaterais, ou seja, se estes forem
maiores que aqueles, o mdico no
deve atuar, uma vez que a atuao
mdica deve sempre buscar o bem
do paciente.
O princpio da justia prega o
livre acesso de todos a um tratamen-
to mdico de qualidade, e a livre
distribuio dos progressos da medi-
cina para todos os seres humanos.
Deve-se ressaltar a existncia,
antes de Potter, dos movimentos
pr-bioticos, tais como o Cdigo
de Nuremberg, o qual estabeleceu
regras mnimas para pesquisas clni-
cas em seres humanos, e a Declara-
o Universal dos Direitos Huma-
nos, que estipula direitos e garantias
mnimos de respeito vida humana.
Ambos buscaram impedir reincidn-
cias das atrocidades cometidas pela
humanidade nas duas grandes guer-
ras mundiais.
Hodiernamente, biotica a
parte da tica que cuida das questes
referentes vida humana, sade,
aos avanos da biotecnologia e aos
efeitos destes sobre o homem. Busca
sempre o bom e o melhor para o ser
humano, possuindo, desta forma, um
carter antropocentrista bastante
acentuado, que busca privilegiar a
interao homem/meio ambiente.
A atuao do bilogo no meio
ambiente busca a proteo da biodi-
versidade, a manuteno de espcies
em vias de extino, a preservao
do meio ambiente e da qualidade de
vida. O licenciamento ambiental e o
relatrio de impacto ambiental de
responsabilidade tcnica do bilogo
de extrema importncia para evitar
acidentes ecolgicos. O Brasil possui
uma legislao ambiental que regu-
lamenta as atividades dos profissio-
nais que atuam na rea. A Biotica
influencia nas decises medida
que analisa a interao do ser huma-
no com o ambiente e os reflexos
causados pelas aes propostas pelo
homem.
Mais recentemente temos tido
discusses sobre transgnicos e
OGMs, no s na rea de meio
ambiente, mas tambm na rea m-
dica, com a produo de animais
transgnicos para transplante de
rgos, vacinas e medicamentos
manipulados geneticamente. Temos
tambm biotecnologia na formao
de biomateriais, reproduo huma-
na assistida, que gera grandes pol-
micas por causa da doao de s-
men, vulo, tero de substituio,
que muda os pilares de filiao,
trazendo gmeos em idades diferen-
tes, crianas com at cinco pais,
crianas com material gentico de
trs pais em resultado de exame de
DNA com tcnica de rejuvenesci-
mento de vulo; gestao aps a
morte dos pais biolgicos, mudana
de paradigma quanto filiao, pri-
vilegiando a paternidade e materni-
dade scio-afetivas.
O Projeto Genoma Humana com
a descoberta de todos os genes hu-
manos , trar benefcios e proporcio-
nar, daqui a alguns anos, a cura para
vrias doenas. Nesse mbito haver
um avano na medicina preditiva
que, atravs da avaliao gentica,
pode fazer o diagnstico de vrias
doenas que poderiam se manifestar
ou no no futuro. Hoje j possvel
fazer o diagnstico de algumas doen-
as, porm no possvel cur-las, os de preservar a dignidade e a privaci-
benefcios so apresentados na
melhoria da qualidade de vida e da
adaptao do paciente.
J h algumas dcadas, a medi-
cina fetal proporciona, atravs do
diagnstico pr-natal, a possibilida-
de de diagnstico de doenas cro-
mossmicas, como a sndrome de
Down. Hoje, contamos com a biotec-
nologia por meio do diagnstico ge-
ntico pr-implantao; podemos
fazer a anlise gentica retirando um
blastmero do embrio, ou seja, uma
clula totipotente, que poder virar
outro ser humano idntico ao da
clula de onde foi retirado. Dessa
forma, o diagnstico realizado no
embrio, no havendo necessidade
de retirar nenhum material biolgico
aps a implantao, para no correr
o risco de um aborto.
Com a descoberta de doenas
genticas pela micromanipulao de
embries, possvel descartar esses
embries anormais pondo em pr-
tica a chamada Eugenia doce, que
seria o descarte de embries e fetos
com defeitos congnitos. A surge a
discusso sobre o que normal e o
que anormal. Caso do casal surdo-
mudo que recorreu ao banco de s-
men para buscar um doador de s-
men surdo para ter seu beb.
A terapia gnica vai proporcio-
nar atravs da utilizao de vetores,
como vrus e bactrias, a cura das
doenas das quais forem localizados
os genes que as causam, removendo
ou acrescentando o gene saudvel
pessoa.
Outra questo discutida pela
Biotica o direito identidade ge-
ntica nos casos em que a criana foi
adotada ou tenha nascido por inter-
mdio de material gentico doado, o
que no desfaz o vnculo de paterni-
dade; direito no para fins de heran-
a nem tampouco para negatria de
paternidade, mas, simplesmente, pelo
direito de conhecer suas origens. O
advento do exame de DNA trouxe a
certeza biolgica, mas muitos tm
utilizado tal exame de forma errnea.
Deve-se ter sempre o exame de DNA
como mais uma prova judicial a ser
juntada aos autos do processo, a fim
dade humanas. Ningum obrigado
a fornecer prova contra si mesmo.
A banalizao do exame de DNA
tem trazido conseqncias indesej-
veis no s para o Direito de Famlia
e de Sucesses, mas tambm para a
Criminalstica, porque ainda existem
peritos despreparados para coletar o
material biolgico na cena do crime.
preciso seriedade e responsabilida-
Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 31 - julho/dezembro 2003
de para utilizar tal prova; deve-se
evitar contaminao do material,
armazen-lo de forma adequada, ter
uma cadeia de custdia, solicitar au-
torizao por escrito nos casos de
investigao de paternidade ou de
maternidade.
Assim, as questes da biotica
podem ser classificadas como emer-
gentes, aquelas advindas do avano
da biotecnologia e da biocincia, e
persistentes as que possuem suas
origens na m distribuio de recur-
sos e em um sistema econmico
excludente. Por esse motivo, a
biotica deve recortar seu sujeito de
trabalho por etnia, raa, sexo e con-
dio econmica, uma vez que a
busca do que bom e melhor varia
de acordo com essas caractersticas.
Devido complexidade dos va-
lores envolvidos em sua atuao,
esse campo de discusso revela-se
como a cincia da composio, ou
seja, todos os assuntos dentro do
mbito de atuao da biotica atin-
gem toda a sociedade, logo, as deci-
ses sobre eles devem ser tomadas
com a participao de todas as par-
tes envolvidas.
A Biotica busca uma reflexo
da biotecnologia apresentada pelas
cincias biomdicas para que elas
possam ser utilizadas em benefcio
da sociedade. Busca o melhor para a
coletividade, fazendo interagir o ho-
mem com o meio ambiente, com
vistas a propiciar a ele uma melhor
qualidade de vida. O trabalho
transdisciplinar faz-se necessrio a
fim de proporcionar um atendimen-
to mais humanizado e justo na rea
das cincias da vida. Dessa forma,
buscam-se solues novas para con-
flitos novos.
Destarte, a biotica representa a
cincia do dilogo transdisciplinar, ou
melhor, prope a composio poss-
vel com os vrios estranhos morais,
pois um mdico para atuar bioetica-
mente deve respeitar a individualida-
de de seu paciente e o advogado que
abraar causa to apaixonante deve
conhecer biomedicina e os avanos
biotecnolgicos. Assim como cada
profissional, na sua rea de atuao,
deve buscar essa composio.
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