3.

Tcnicas Experimentais

O presente trabalho experimental foi desenvolvido basicamente pela

aplicao de tcnicas espectroscpicas, em particular, de espectroscopia de
fluorescncia no estado estacionrio e resolvida no tempo. A espectroscopia de
fluorescncia tem sido desde muito tempo uma das tcnicas mais utilizadas nos
estudos de estrutura e funo de molculas biolgicas, em particular protenas e
biomembranas. A fluorescncia um mtodo muito sensvel para estudos de
mudanas conformacionais, interaes e localizao de stios de ao de
molculas de interesse biolgico em macromolculas e biomembranas.
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A espectrometria de massas foi tambm usada em nosso trabalho, sobretudo

na identificao das massas moleculares das espcies (ou fotoprodutos) formadas
na fotodegradao.

Descrevemos brevemente neste captulo os princpios fsicos em que esto

baseadas nossas medidas. As sees referentes a fluorescncia foram escritas com
base nos excelentes textos escritos por Lakowicz (2006), Valeur (2005) .

3.1.
Conceitos bsicos de espectroscopia

A espectroscopia o estudo da interao da radiao com a matria,

consistindo na absoro, emisso ou espalhamento da radiao por tomos ou
molculas. A luz uma radiao eletromagntica, numa faixa restrita de
comprimentos de onda ( ~ 180 nm, ultravioleta, a ~ 900 nm, infravermelho). As
ondas eletromagnticas so caracterizadas por uma frequncia () e um
comprimento de onda (), sendo essas grandezas fsicas relacionadas pela equao
= c, onde c a velocidade da luz para um determinado meio.
As ondas eletromagnticas tambm possuem propriedades de partcula e se
comportam como partculas (ftons) com energia bem definida E=h, onde h a
 38

constante de Planck. Portanto, uma radiao eletromagntica de comprimento de

onda formada de ftons com energia E = hc/.
Muitos dos processos fsico-qumicos que acontecem no mundo
microscpico das molculas s so explicados com base na mecnica quntica.
Ela nos d informaes sobre os estados de energia que uma molcula pode
ocupar e os mecanismos pelos quais uma molcula pode mudar de um estado de
energia a outro. O estado de uma molcula ou sistema quntico descrito por
meio de uma funo de onda que , em geral, funo das coordenadas espaciais
e dos spins dos eltrons e ncleos, e dos campos externos. Esta funo de onda
2
nos d uma distribuio de probabilidade ( a densidade de probabilidade).
A mecnica quntica mostra que uma molcula s pode ter energias num
conjunto discreto de valores. Estas quantidades so chamadas nveis de energia da
molcula. Os nveis principais de energias so determinados pelas possveis
distribuies espaciais dos eltrons e so chamados nveis eletrnicos de energia;
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esses nveis so desdobrados em nveis vibracionais, que indicam os vrios

modos de vibrao da molcula. H ainda subdivises menores chamadas de
nveis rotacionais. O nvel de mais baixa energia chamado de estado
fundamental e nele as energias eletrnica e dos movimentos internos tm seus
valores mnimos. Os outros estados de energia da molcula so chamados de
estados excitados.
Geralmente as molculas se encontram em seu estado fundamental e, ao
serem irradiadas, podem ser excitadas at outro nvel energtico quando a energia
da radiao incidente corresponde exatamente diferena de energia entre os dois
nveis. Podemos excitar a molcula submetendo-a a um campo externo, por
exemplo, o campo eltrico da radiao incidente, que interage com as partculas
carregadas da molcula. O potencial eltrico externo capaz de ocasionar uma
probabilidade de transio entre os estados da molcula. Esta pode ser descrita em
funo do operador dipolo eltrico da molcula (que descreve a distribuio de
carga de uma molcula) e da amplitude do campo eltrico oscilante da luz. A
amplitude da probabilidade de transio o momento de dipolo da transio,
descrevendo a habilidade da luz em distorcer uma molcula obrigando-a a fazer
uma transio para outro estado (Hollas, 2004).
 39

3.2.
Espectroscopia de absoro

Em geral, uma transio eletrnica consiste em promover um eltron de um

orbital de uma molcula no estado fundamental para um orbital desocupado por
absoro de um fton. As transies eletrnicas de orbitais mais externos
correspondem espectroscopia de absoro na regio do ultravioleta e visvel. O
orbital molecular formado por dois orbitais atmicos s ou de um orbital
atmico p e um orbital atmico s. O orbital molecular se forma por dois orbitais
atmicos p. O orbital molecular n consiste de eltrons no ligantes localizados em
heterotomos tais como oxignio ou nitrognio. Para ilustrar os nveis de energia
de uma molcula e as transies entre os trs tipos de orbitais moleculares, a Fig.
3.2 mostra o formaldedo como exemplo.
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Figura 3.1. Nveis de energia de orbitais moleculares do formaldedo (HOMO: orbital

molecular ocupado de mais alta energia; LUMO: orbital molecular desocupado de mais
baixa energia) (Valeur, 2001).

Na espectroscopia de absoro e fluorescncia de uma molcula, so

importantes os seguintes orbitais: o orbital molecular ocupado de mais alta energia
(HOMO) e o orbital molecular desocupado mais baixa energia (LUMO). Por
exemplo, no formaldedo, o HOMO o orbital n e o LUMO o orbital *.
As transies * podem ser observadas em todos os compostos
insaturados, em geral aparecendo na faixa do espectro com > 220 nm at o
infravermelho prximo. Se no forem proibidas por regras de seleo de spin ou
simetria, as transies * tm altos coeficientes de absoro molar
(extino), aproximadamente 104 105 M-1 cm-1. As transies n * tm
 40

coeficientes de absoro menores, cerca de 102 M-1 cm-1, e, frequentemente,

aparecem como ombro na faixa de comprimentos de onda maiores nos espectros
de absoro. Para medidas em soluo, as transies *, n * e *
so geralmente escondidas pela absoro do solvente (< 190 nm).

Lei de Beer - Lambert

A lei de Beer - Lambert relaciona a quantidade de luz absorvida por uma

amostra com sua espessura e concentrao, expressa da seguinte forma:

I = I 0 10 c l 3.1
onde I a intensidade da luz transmitida, I0 a intensidade de luz incidente, c a
concentrao da amostra em mols por litro, l a espessura da amostra em cm e
o coeficiente de absoro molar, que um parmetro caracterstico de cada
espcie molecular num dado solvente e comprimento de onda observado.
A razo I/I0 a frao de luz incidente que transmitida, e chamada
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transmitncia (T). A absorbncia (A) dada por

A = log ( I 0 / I ) 3.2
Logo,
A = cl 3.3
Densidade ptica a absorbncia para uma espessura da amostra igual a
1 cm. A falha em obedecer dependncia linear da absorbncia com a
concentrao, segundo a lei de Beer-Lambert, pode ser devida a altas
concentraes, formao de agregados ou presena de outras espcies
absorvedoras.

O princpio de Frank-Condon

Os movimentos dos eltrons so muito mais rpidos do que os do ncleo,

muito mais pesado. Assim, quando h uma transio eletrnica para um estado
excitado por absoro de um fton (durao de ~10-15 s), que muito rpida
comparada com tempos associados a vibraes moleculares (10-10 10-12 s), os
ncleos no tm tempo de se reacomodar na nova posio de equilbrio
(aproximao de Born-Oppenheimer). Esta observao a base do princpio de
Franck-Condon: uma transio eletrnica em geral ocorre sem mudana nas
posies dos ncleos tanto da molcula que absorveu o fton quanto das
 41

molculas vizinhas. O estado resultante chamado estado de Franck-Condon, e a

transio chamada de transio vertical, como se observa na Fig. 3.2, onde as
curvas de energia potencial em funo da configurao nuclear (ou distncia
internuclear, no caso de uma molcula diatmica) so apresentadas como
potenciais de Morse.
Na Fig. 3.2 so observadas, alm da transio eletrnica pura, 0 0, outras
transies vibrnicas cujas intensidades dependem da posio relativa e da forma
das curvas de energia potencial.
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Figura 3.2 Acima: diagrama da energia potencial com transies eletrnicas

verticais (princpio de Franck-Condon); abaixo: forma das bandas de absoro (linhas
tracejadas, observadas em vapor; linhas contnuas, espectro alargado esperado em
soluo. (modificado de Valeur, 2001).

3.3.
Espectroscopia de fluorescncia

A fluorescncia um fenmeno que envolve a perda de energia de uma

molcula no estado excitado por emisso de luz. Quando a molcula absorve um
 42

fton de luz, por exemplo, um eltron promovido do estado fundamental para

um estado excitado. Ocorre ento, um relaxamento para o nvel vibracional
fundamental do estado excitado atravs da converso interna (processo no
radiativo) e, ento, o retorno para o estado eletrnico fundamental com emisso de
luz. A Fig. 3.3 (Diagrama de Jablonski) mostra, competindo com a emisso,
vrios outros processos com diferentes constantes de velocidade (k) que
contribuem para a perda de energia do estado excitado.
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Figura 3. 3 Diagrama de Jablonski (modificado de Lakowicz, 2006).

Os processos no radiativos de relaxamento que competem com a

fluorescncia (kF) so: converso interna (kIC); cruzamento intersistema (kIS) e
supresso de vrios tipos [kq(Q)]. Portanto a frao que representa a desexcitao
atravs da fluorescncia dada por:
kF
F = 3.4
k F + k IC + k IS + k q [Q ]

onde a frao F o rendimento quntico de fluorescncia. Podemos observar

desta equao que, se todos os processos no radiativos fossem infinitamente
desprezveis ento F = 1, ou seja, o rendimento quntico de fluorescncia seria
100%, isto , o nico mecanismo de relaxamento seria a fluorescncia.
Uma propriedade importante da fluorescncia que o mesmo espectro de
emisso geralmente observado, independente do comprimento de onda de
excitao. Na excitao, a molcula vai para nveis vibracionais mais altos de um
determinado nvel eletrnico, o excesso de energia rapidamente dissipado,
levando o fluorforo para o nvel vibracional fundamental do singleto excitado,
S1. Por causa desta relaxao rpida, ao redor de 1012 s, que o espectro de
emisso independente do comprimento de onda de excitao, e que todos os
espectros de fluorescncia estaro deslocados para comprimentos de onda maiores
 43

(menor energia) do que os da banda de absoro. A banda de emisso ser

aproximadamente uma imagem especular da banda de absoro cujo mximo est
centrado em comprimentos de onda maiores que o da banda de absoro. Este
deslocamento conhecido como deslocamento de Stokes.

3.3.1.
Medidas de fluorescncia estacionria

Espectros de excitao: o espectro de excitao representa as intensidades de

fluorescncia em funo do comprimento de onda da luz de excitao, e obtido
mantendo-se o detector num nico comprimento de onda, em geral no pico de
emisso. No caso de uma soluo homognea de um cromforo, o espectro de
excitao corrigido corresponder ao espectro de absoro desde que o
relaxamento radiativo ocorra do nvel vibracional fundamental do estado
eletrnico excitado. Este parmetro ir mudar se a energia potencial relativa entre
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os estados excitado e fundamental for modificada por alguma perturbao.

Espectros de emisso: o espectro de emisso representa as intensidades da
fluorescncia em funo do comprimento de onda de emisso, e obtido fixando-
se o comprimento de onda da luz de excitao. Ele representa a transio do nvel
vibracional mais baixo do primeiro estado excitado S1 para o estado fundamental
S0 .
Rendimento quntico: o rendimento quntico, F, definido como a razo entre o
nmero de ftons emitidos pelo nmero total de ftons absorvidos. As medidas de
F nos podem dar idia da contribuio da fluorescncia para reaes do estado
excitado, enquanto que o espectro de absoro fornece informaes
principalmente sobre reaes do estado fundamental.
Arranjo experimental: a Fig. 3.4 mostra um diagrama esquemtico de um
espectrofluormetro para medidas de fluorescncia. Da forma como est
configurado, o espectrofluormetro pode ser usado de duas maneiras: se variarmos
o monocromador de emisso mantendo-se fixo o monocromador de excitao,
temos um espectro de emisso. Por outro lado, podemos ter fixo o monocromador
de emisso e o monocromador de excitao variando, para produzir o espectro de
excitao.
 44
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Figura 3. 4 Diagrama esquemtico de um espectrofluormetro com geometria

perpendicular para excitao e emisso (Lakowicz, 2006).

A emisso molecular fluorescente apresenta vantagens como ferramenta

analtica quando comparada com outros mtodos de espectroscopia, pois possui
elevada sensibilidade s vizinhanas da molcula, a gama linear de anlise maior
e o erro inerente medio praticamente constante ao longo de toda a gama de
resposta. A sensibilidade da fluorescncia uma consequncia do longo tempo
que a molculas permanecem no estado excitado antes do relaxamento. Na
fluorescncia, um singleto permanece no estado excitado cerca de 109 s. Nesse
tempo vrios tipos de processos podem ocorrer, tais como reaes de protonao
ou desprotonao, mudanas conformacionais locais de protenas e interaes de
diversas drogas com sistemas biolgicos.
A principal vantagem da fluorescncia, sua dependncia de fatores
ambientais, resulta muitas vezes em desvantagem. A fluorescncia pode ser
reduzida (supresso) atravs dum processo de desativao, resultante da interao
entre o composto fluorescente e outra substncia presente no sistema, por luz
 45

ultravioleta, por efeito de temperatura, por efeito de filtro interno, oxignio e

impurezas existentes na soluo. Alm disso, para concentraes elevadas pode
ocorrer a formao de compostos constitudos por vrias molculas fluorescentes,
dmeros ou polmeros maiores, o que origina a diminuio da eficincia quntica e
a alterao dos espectros de absoro e emisso, resultando numa diminuio da
intensidade de fluorescncia. Podemos ainda nos referir ao fenmeno de
fotodecomposio, onde a luz incidente alterando as propriedades qumicas da
molcula fluorescente a converte numa outra espcie, mudando tambm o
espectro inicial de absoro e emisso.
Em solues consideravelmente diludas (absorbncias muito pequenas), a
intensidade de fluorescncia proporcional concentrao de fluorforo. Para
concentraes suficientemente baixas (absorbncia < 0.1) a luz incidente
ligeiramente atenuada ao longo da cubeta. concentrao alta, uma parte
significante da luz incidente absorvida antes de chegar ao ponto onde a
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luminescncia observada (efeito de filtro interno) e uma parte significante da luz

emitida tambm reabsorvida antes desta sair da clula (efeito de filtro interno
secundrio). O efeito de filtro interno vai levar a um aparente decrscimo da
intensidade de fluorescncia observada por absoro da fluorescncia. A
intensidade de fluorescncia observada vai depender da densidade ptica do
fluorforo no comprimento de onda de excitao e emisso. Consequentemente a
intensidade de fluorescncia de um composto proporcional concentrao
apenas para uma gama restrita de densidades pticas. Em algumas situaes
necessrio aplicar fatores de correo (Lakowicz, 2006).

3.3.2.
Fluorescncia resolvida no tempo

Tempos de vida do estado excitado

O tempo de vida , equivale ao inverso da constante de velocidade ou taxa

do processo envolvido numa relaxao eletrnica (k1). A absoro de um fton
no ultravioleta leva aproximadamente 1015 s, enquanto que o tempo de relaxao
de molculas em solventes orgnicos aproximadamente de 1011s. Por outro lado
 46

a fosforescncia caracteriza-se por tempos de vida longos que variam desde 104s
at valores na faixa de segundos.
O estudo de tempos de vida do estado excitado amplamente usado em
espectroscopia de fluorescncia e pode oferecer informaes sobre reaes
intermoleculares tais como: formao de dmeros, excmeros, transferncia de
energia, distncias moleculares e difuso rotacional. A natureza do decaimento de
fluorescncia pode revelar detalhes sobre o microambiente do fluorforo. Por
exemplo, mltiplas constantes de decaimento podem ser atribudas a um
fluorforo em microambientes diferentes ou a processos de estado excitado. O
tempo de vida estabelece a janela temporal durante a qual outros processos de
estado excitado (difuso rotacional e translacional, transferncia de energia,
relaxamento dipolar) podem alterar a emisso e serem detectados.
H dois mtodos utilizados para medir o tempo de vida de fluorescncia de
um dado fluorforo: o mtodo pulsado e o harmnico ou de modulao de
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frequncia. Neste trabalho o mtodo utilizado foi o pulsado e o detalharemos a

seguir.
Mtodo Pulsado: suponhamos que uma amostra contendo um fluorforo
excitada com um pulso de luz infinitamente curto resultando em uma populao
inicial N0 de fluorforos no primeiro estado excitado singleto. A populao no
estado excitado decai com uma taxa kr + knr de acordo a equao
d (t )
= ( k r + k nr ) (t ) 3.5
dt
onde (t) o nmero de molculas excitadas no tempo t, kr a taxa radiativa
(fluorescncia ou fosforescncia), e knr a taxa de decaimento no radiativa. A
emisso um evento aleatrio, e cada fluorforo tem a mesma probabilidade de
emitir num dado perodo de tempo. Integrando a equao 3.5, obtemos um
decaimento exponencial da populao excitada, da seguinte forma
= 0 exp( t / ) 3.6
Como a intensidade radiativa (I) proporcional a (t) a podemos expressar
tambm como
I = exp(t / ) 3.7

sendo = ( k r + k nr ) 1 o tempo de vida e a intensidade no tempo zero.

 47

O tempo de vida de fluorescncia o tempo necessrio para a intensidade

decair para 63.2%, ou (1-1/e), de seu valor inicial. Comumente, o tempo de vida
determinado do coeficiente angular do grfico log I(t) versus t (Fig. 3.5).

Figura 3.5 Descrio esquemtica de uma curva de decaimento de fluorescncia

utilizando o mtodo de pulsado.
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Para um decaimento multiexponencial com n componentes, a I(t)

representada por:
n
I (t ) = i exp(t / i ) 3.8
i =1

A intensidade fracionria da componente i, ou contribuio fracionria da

componente i para a intensidade estacionria,

I i (t ) dt
0 i i
fi =
= n
3.9
I (t ) dt i i
0 i =1

n
Com f i = 1 .
0

No caso de decaimentos de fluorescncia multiexponenciais, podemos

calcular o tempo de vida mdio como

t I (t ) dt
0
=
3.10
I (t ) dt
0
 48

n
2
i i n
i =1
= n
= fi i 3.11
i =1
i i
i =1

Nesta definio, cada tempo de decaimento ponderado pela intensidade

fracionria. Esta mdia chamada de tempo de decaimento com mdia nas
intensidades.
Outra possibilidade o uso das amplitudes (fatores pr-exponenciais) como
peso:
n
i i n
i =1
= n
= ai i 3.12
i =1
i
i =1

onde ai so as amplitudes fracionrias

i
ai = n
3.13
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i
i =1

Esta mdia chamada de tempo de decaimento com mdia nas amplitudes.

A definio usada depende do fenmeno estudado. Por exemplo, o tempo de
decaimento com mdia nas intensidades deve de ser usado para calcular uma
constante colisional mdia, enquanto, em experimentos de transferncia de
energia ressonante, o tempo de decaimento com mdia nas amplitudes deve de ser
usado em clculos de eficincia de transferncia de energia (Lakowicz, 2006).

Arranjo experimental

O equipamento de fluorescncia resolvida no tempo empregado nosso

trabalho para as medidas de tempo de vida de fluorescncia (ou parmetros de
decaimento) foram baseadas no mtodo de contagem de fton nico
correlacionado no tempo (TCSPC - Time Correlated Single Photon Counting).
Fig. 3.6 mostra um diagrama de um fluormetro de contagem de fton nico. O
princpio deste mtodo se baseia no fato de que a probabilidade de detectar um
fton nico no tempo t depois de um pulso de excitao proporcional
intensidade de fluorescncia naquele tempo. Aps a sincronizao e gravao de
ftons nicos, depois de um grande nmero de pulsos de excitao, a curva de
decaimento da intensidade de fluorescncia reconstruda.
 49
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Figura 3.6. Diagrama esquemtico de um fluormetro de contagem de fton nico

(Valeur, 2001).

A fonte de excitao pode ser uma lmpada de flash ou laser. Um pulso

eltrico associado com o pulso tico gerado e encaminhado atravs de um
discriminador para a entrada INICIAR do conversor tempo-amplitude. Por outro
lado, a amostra excitada pelo pulso tico e emite fluorescncia. Os sistemas
ticos so ajustados de modo que o fotomultiplicador detecte no mais de um
fton por cada pulso de excitao. O pulso eltrico correspondente encaminhado
atravs de um discriminador para a entrada de DETER do conversor tempo-
amplitude. Este ltimo gera um pulso de sada cuja amplitude diretamente
proporcional ao intervalo de tempo entre os pulsos INICIAR e DETER. O
intervalo de tempo convertido a um valor digital por meio de um conversor
analgico-digital. O analisador multicanal aumenta de um o contedo do canal de
 50

memria correspondendo ao valor digital do pulso detectado. Depois de um

grande nmero de eventos de excitao-deteco, forma-se o histograma dos
ftons detectados, que representa a curva de decaimento de fluorescncia.
Obviamente, quanto maior o nmero de eventos melhor a preciso da curva de
decaimento.
Geralmente, as fontes luminosas disponveis fornecem pulsos de diferentes
intervalos de durao. Como consequncia, o decaimento de fluorescncia
observado deve de ser corrigido pela largura do pulso da lmpada. Este
procedimento geralmente denominado de deconvoluo espectral. Quando a
deconvoluo necessria, o perfil temporal da lmpada do pulso de excitao
gravado sob as mesmas condies por substituio da amostra por uma soluo
dispersante. Esta dificuldade causada pela largura (durao) do pulso pode ser
minimizada pelo uso de lasers com pulsos de curta durao (picosegundos).
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3.3.3.
Supresso de fluorescncia

Denomina-se supresso de fluorescncia, qualquer processo que diminui a

intensidade de fluorescncia de uma dada espcie. Estes processos podem ser:
reaes no estado excitado, rearranjo molecular, transferncia de energia,
formao de complexos (supresso esttica) e supresso por coliso (supresso
dinmica). Tanto para a supresso de fluorescncia dinmica quanto esttica se
requer um contacto entre o fluorforo e o agente supressor e, consequentemente,
estes tipos de supresso nos fornecem informaes importantes sobre o fluorforo.
Supresso dinmica de fluorescncia: consiste na desativao da
fluorescncia do estado excitado por coliso do fluorforo com o agente supressor
durante o tempo de vida do estado excitado. Geralmente, aps o contacto entre
ambos, o fluorforo regressa ao estado fundamental sem emisso de fton e sem
qualquer alterao qumica das molculas envolvidas. A supresso de
fluorescncia dinmica, ou colisional, descrita pela equao de Stern - Volmer:
F0
= 1 + k q 0 [Q ] = 1 + K D [Q ] 3.14
F
onde F0 e F representam, respectivamente, a intensidade de fluorescncia na
ausncia e na presena do agente supressor, kq a constante bimolecular de
supresso, 0 o tempo vida na ausncia do agente supressor e [Q] a
 51

concentrao do agente supressor. A constante de Stern-Volmer, KSV, dada por

kq e representa-se tambm por KD. A constante bimolecular reflete a eficincia
da supresso ou a acessibilidade do fluorforo ao supressor.
Supresso esttica de fluorescncia: consiste na formao de um complexo
no fluorescente entre o fluorforo e o supressor. Quando este complexo absorve
luz, ele imediatamente retorna ao estado fundamental sem emisso de fton.
F0
= 1 + K S [Q ] 3.15
F
Note-se que a dependncia de F0/F em relao a [Q] linear e idntica
observada para supresso dinmica, exceto que a constante de supresso agora a
constante de associao.
Geralmente representa-se graficamente F0/F em funo de [Q] e espera-se
que F0/F varie linearmente com a concentrao do supressor. A reta obtida deste
grfico intercepta o eixo das ordenadas em F0/F = 1 e sua inclinao nos fornece a
constante KSV. O valor de 1/KSV a concentrao do supressor para a qual
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F0/F = 2, ou seja, 50% da intensidade suprimida.

Em geral, um grfico de Stern-Volmer linear indica uma nica classe de
fluorforos ou pelo menos todos igualmente acessveis ao supressor. Se existir
mais de uma classe de fluorforos, cujas acessibilidades ao supressor so
distintas, ento o grfico de Stern-Volmer j no ser linear.
importante observar aqui que apenas o grfico linear de Stern-Volmer no
prova a ocorrncia de supresso dinmica ou esttica. A medida de tempos de
vida o mtodo mais definitivo para poder distinguir a supresso esttica da
dinmica. A supresso esttica remove uma frao dos fluorforos observados.
Fluorforos complexados no so fluorescentes e observa-se apenas a
fluorescncia dos fluorforos no complexados. A frao no complexada no
perturbada, e o tempo de vida vai permanecer constante igual a 0. Portanto para
uma supresso esttica /0 = 1. Em contraste, a supresso dinmica um
processo que diminui a populao do estado excitado pela adio de uma taxa de
decaimento no radiativo, implicando no decrscimo do tempo de vida
(Fig. 3.7 A). Este decrscimo equivalente ao da intensidade de fluorescncia:
F0/F = 0/ para uma supresso dinmica.
Por outro lado, tomando em conta o coeficiente de difuso das molculas, a
supresso dinmica pode ser distinguida da esttica. A supresso dinmica
 52

depende da difuso, j que a altas temperaturas os coeficientes de difuso

aumentam, e consequentemente espera-se que as constantes de supresso
bimoleculares tambm aumentem. Em contraste, ao incrementar a temperatura
provvel que acontea uma diminuio na estabilidade do complexo, e assim os
valores das constantes de supresso esttica sejam mais baixos (Fig. 3.7 B).
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Figura 3.7. Comparao entre supresso dinmica e esttica, mediante medidas de

tempo de vida (A) e variaes de temperatura (B) (modificado de Lakowicz, 2006).

Outro mtodo adicional para distinguir entre estes dois tipos de supresso de
fluorescncia envolve a anlise dos espectros de absoro das espcies em
contato. A supresso de fluorescncia dinmica afeta apenas os estados excitados
dos fluorforos, e assim nenhuma mudana no espectro de absoro observada,
enquanto que na supresso esttica a formao do complexo no estado
fundamental frequentemente resulta em perturbao do espectro de absoro do
fluorforo.
 53

3.3.4.
Anisotropia de fluorescncia

Ao iluminar uma amostra com luz polarizada, geralmente a fluorescncia

emitida pela amostra polarizada, podendo ter uma polarizao diferente da de
excitao. A extenso de polarizao de emisso pode ser descrita em funo da
anisotropia (r0). A origem deste fenmeno est baseada na existncia de
momentos de dipolos de transio da absoro e emisso, que esto alinhados ao
longo de direes especficas dentro da estrutura do fluorforo. A Fig. 3.8, mostra
dois momentos de dipolo de transio da absoro do antraceno.
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Figura 3.8. Momentos dipolares de transio do antraceno (modificado de Valeur B.,

2001).

Em soluo homognea, as molculas fluorescentes em seu estado

fundamental so orientadas aleatoriamente. Quando expostas luz polarizada, os
fluorforos que tm seus momentos de dipolo de transio orientados numa
direo perto da direo do vetor campo eltrico da radiao incidente so
preferencialmente excitados. Se a populao dos estados excitados no est
orientada aleatoriamente, o resultado seria uma emisso polarizada.
Os momentos de dipolo de transio para absoro e para emisso tm
orientaes fixas em cada fluorforo e o ngulo entre estes momentos determinam
a anisotropia mxima medida (r0). Porm este valor pode ser diminudo por vrios
fenmenos cuja importncia depender da amostra a ser analisada.
A despolarizao da fluorescncia acontece porque o momento de transio
sofre mudanas durante o tempo de vida do estado excitado, causando um
decrscimo na anisotropia. A despolarizao de fluorescncia pode ser causada
 54

por vrios fenmenos como a difuso rotacional, que a causa mais comum na
despolarizao. Medies de anisotropia revelam o deslocamento mdio angular
do fluorforo que ocorre entre a absoro e a subsequente emisso de um fton.
Este deslocamento angular depende da velocidade e extenso da difuso
rotacional durante o tempo de vida do estado excitado. Os movimentos de difuso
interna, por sua vez, dependem da viscosidade do solvente, do tamanho e da
forma das espcies que sofrem difuso.
Para fluorforos pequenos em soluo de baixa viscosidade, a difuso
rotacional mais rpida que a emisso e, consequentemente, ela despolarizada e
a anisotropia prxima de zero.
A medida de anisotropia de fluorescncia esta ilustrada na Fig. 3.9. Neste
caso a amostra excitada com luz polarizada verticalmente e o vetor campo
eltrico de excitao est orientado paralelo ao eixo z. A intensidade da emisso
medida com o auxlio de um polarizador. Quando este est orientado
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paralelamente (||) direo da excitao, a intensidade I||. Por outro lado,

quando o polarizador est orientado perpendicularmente () excitao, a
intensidade medida chamada de I. A anisotropia de fluorescncia definida por

I I
r = // 3.16
I // + 2 I
A excitao das molculas depende do ngulo entre o plano da
polarizao da luz incidente e o momento de dipolo da transio. A probabilidade
de ocorrer uma absoro proporcional ao cos2. Para a luz completamente
polarizada I = 0 e r = 1,0. Este valor geralmente encontrado para a luz
espalhada (espalhamento de Rayleigh).
 55

Figura 3.9. Diagrama esquemtico para a medida de anisotropia de fluorescncia

(modificado de Lakowicz, 2006).

Valores de r iguais unidade, nunca so encontrados para fluorforos em

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soluo, pois como a amostra no se encontra orientada, a dependncia do cos2

resulta na excitao de um nmero significativo de molculas que no tm dipolos
de transio alinhados exatamente ao longo do plano de polarizao. Essas
molculas no alinhadas, quando emitem, podem ter componentes tanto da luz
polarizada paralelamente quanto daquela polarizada perpendicularmente. Portanto
r ter sempre um valor menor que a unidade.
Alm disto, se os dipolos de absoro e emisso fossem paralelos,
estivessem congelados, no houvesse despolarizao e a mdia sobre todos os
ngulos fosse considerada, a anisotropia teria valores caractersticos de r0 = 0,4.
Geralmente estes dipolos no so paralelos, mas tm um ngulo um em relao
ao outro, reduzindo ainda mais os valores de r0. Estes valores so chamados de
intrnsecos e so dados por:

2 3 cos2 1
r0 = ( ) 3.17
5 2
interessante notar que o valor de r0 zero quando =54,7 e, quando se
torna maior que 54,7, a anisotropia se torna negativa, alcanando o valor mnimo
de 0,20 para = 90.
Na prtica, as medidas de anisotropia de fluorescncia no estado
estacionrio e resolvida no tempo so realizadas, em geral, utilizando-se o mtodo
 56

do formato-L. Neste mtodo os fluormetros usam um nico canal de emisso. A

Fig. 3.10 mostra o diagrama esquemtico do formato-L. Os comprimentos de
excitao e emisso so geralmente selecionados por monocromadores. O
monocromador de excitao polariza parcialmente a luz incidente. Como
resultado, a rotao do polarizador de excitao para as posies horizontal (H) e
vertical (V) d origem a diferentes intensidades da luz incidente. Similarmente, o
monocromador de emisso tem eficincia diferente para transmisso da luz
polarizada horizontalmente e verticalmente. Consequentemente, a rotao do
polarizador de emisso muda a sensibilidade efetiva do canal de emisso. O
objetivo medir as intensidades I|| e I independentemente do sistema de
deteco, ou seja, os valores reais de I|| e I.
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Figura 3.10. Diagrama esquemtico para a medida de anisotropia de fluorescncia

utilizando-se o mtodo de formato-L. MC monocromador. Os grficos ao lado so as
distribuies das populaes do estado excitado (modificado de Lakowicz, 2006).

Utilizando as letras H e V para denotar orientao horizontal e vertical,

respectivamente, teramos, por exemplo, a notao IHV correspondente
intensidade da emisso obtida com o monocromador de excitao posicionado
horizontalmente e o de emisso posicionado verticalmente. Sendo SV e SH a
 57

sensibilidade vertical e horizontal do canal de emisso, respectivamente, para

excitao polarizada verticalmente, observamos intensidades polarizadas iguais a:
IVV = k SV I // 3.18

IVH = k S H I 3.19
Sendo k a constante de proporcionalidade que leva em conta o rendimento
quntico do fluorforo e outros fatores instrumentais. Dividindo-se a equao 3.18
pela equao 3.19 temos:
IVV S I I
= V // = G // 3.20
IVH S H I I

Para calcular a razo entre as intensidades I|| / I preciso calcular G que a

razo entre as sensibilidades SV e SH.
Este fator G facilmente medido utilizando-se a excitao polarizada
horizontalmente. Quando isto feito, ambas componentes polarizadas
verticalmente e horizontalmente so proporcionais a I. Isto se deve a que estas
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orientaes so perpendiculares polarizao da excitao ou que o eixo de

polarizao da excitao um eixo de simetria. Disto decorre que:
I HV
G= 3.21
I HH

Conhecendo G, pode-se calcular I||/I por:

I // 1 IVV
= 3.22
I G IVH
A anisotropia, ento, pode ser calculada por:
IVV GIVH
r= 3.23
IVV + 2GIVH

Decaimento de Anisotropia de Fluorescncia

Vamos supor que um fluorforo excitado com um pulso curto de luz

polarizada verticalmente e que ele tem um nico tempo de correlao rotacional.
O decaimento de anisotropia determinado pela medida dos decaimentos das
componentes da emisso polarizadas verticalmente (||) e horizontalmente (). Se
os momentos de transio de absoro e emisso so colineares, r0=0,4.
Assumindo que r0>0, o pulso de excitao polarizado verticalmente, produz uma
populao de fluorforos enriquecida na orientao paralela. O decaimento
 58

resultante da diferena entre I||(t) e I(t), quando propriamente normalizado pela

intensidade total, o decaimento de anisotropia.
A interpretao do decaimento de anisotropia bem entendida em termos
das componentes individuais. Os decaimentos das componentes da emisso
paralela (||) e perpendicular () so dados por:
1
I // = I (t )[1 + 2 r (t )] 3.24
3
1
I = I (t )[1 r (t )] 3.25
3
sendo r(t) o decaimento de anisotropia. Geralmente r(t) pode ser descrito como
um decaimento multiexponencial:
r (t ) = r0 g j exp( t / c ) = r0 j exp( t / c ) 3.26
j j
j j

sendo r0 = r0 j a anisotropia na ausncia de difuso rotacional, os c os

j j
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tempos de correlao rotacional individuais, e gj so as amplitudes fracionrias

associadas a cada tempo de correlao no decaimento de anisotropia ( 1 = g j ).
j

Similarmente anisotropia esttica, o decaimento de anisotropia obtido

como:
I // (t ) I (t ) I (t ) I (t )
r (t ) = = // 3.27
I // (t ) + 2 I (t ) I (t )

onde I(t) a intensidade total no tempo t, igual a I||(t) + 2I(t).

Sob iluminao constante, a anisotropia medida a estacionria rS. Usando
a definio geral para calcular a mdia de uma quantidade, com a intensidade de
fluorescncia normalizada, obtemos:

r (t ) I (t )dt
0
rS =
3.28
I (t )dt
0

Em medidas de anisotropia realizadas em condies estticas, o valor de rS

pode ser interpretado em termos da microviscosidade , aplicando-se a equao
de Perrin para decaimentos monoexponenciais:
r0
rS = 3.29
1+
c
 59

sendo r0 o valor mximo da anisotropia de fluorescncia em ausncia de qualquer

movimento de rotao, o tempo de vida da fluorescncia e, c o tempo de
correlao rotacional do fluorforo, que funo de , da temperatura absoluta T
e do volume hidrodinmico da molcula esfrica fluorescente V, conforme se
mostra na equao de Stokes-Einstein:
c = V RT 3.30

Leis do Decaimento de Anisotropia: dependendo do tamanho e da forma do

fluorforo e do meio em que est disperso, uma grande variedade de tipos de
decaimentos de anisotropia pode ser obtida. No obstante, os decaimentos de
anisotropia podem ser mais complexos se os fluorforos no forem esfricos ou se
uma molcula no esfrica est localizada em ambiente anisotrpico. Outra
origem de decaimentos complexos de anisotropia a flexibilidade interna de um
fluorforo dentro de uma macromolcula como uma protena.
Se uma molcula no esfrica, podemos imaginar a rotao da molcula
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em torno de cada um de seus eixos. Por exemplo, uma molcula tipo perileno, que
tem a forma de um disco, deve rodar em seu plano de simetria muito mais rpido
do que fora dele. Isto se deve ao fato de que fora do plano a quantidade de
molculas de solvente que o fluorforo deve deslocar maior. Molculas como
estas so conhecidas como rotores anisotrpicos (Fig. 3.11).

Figura 3.11. Representao geomtrica das sondas fluorescentes DPH e perileno, Os

coeficientes de difuso rotacional so representados pela letra D (modificado de
Lakowicz, 2006).

Decaimentos de anisotropia podem ser complexos mesmo quando o

fluorforo comporta-se como rotor isotrpico, se estas molculas esto em um
 60

meio anisotrpico. Por exemplo, para o DPH, o dipolo de emisso orientado

aproximadamente ao longo do eixo molecular mais longo. As rotaes que
decorrem deste dipolo devem ser isotrpicas devido a que a molcula
aproximadamente simtrica em torno deste eixo. Entretanto, quando o DPH est
em membrana, usualmente encontra-se um decaimento de anisotropia de
fluorescncia complexo. Os movimentos rotacionais do DPH so impedidos e sua
anisotropia no decai para zero. Devido a este impedimento, a faixa angular do
movimento rotacional limitada. Nestes casos, uma anisotropia limite (r)
observada com tempo longo quando comparado ao tempo de vida de
fluorescncia. Geralmente, em membranas lipdicas, r(t) pode ser aproximado a
uma nica exponencial que decai para um valor finito e descrito como:
r(t ) = ( r0 r ) exp( / c ) + r 3.31

O termo constante r interpretado como o resultado de uma barreira de

energia que impede a difuso rotacional do fluorforo alm de certo ngulo. O
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parmetro r serve tambm para medir a ordem orientacional dos fluorforos no

interior da membrana. A sonda fluorescente DPH uma molcula conhecida por
estar localizada profundamente na bicamada lipdica e orientar-se paralelamente
cadeia do lipdio. Portanto, esta sonda fluorescente detecta a ordem orientacional
das cadeias. Identificando o parmetro de ordem da sonda identificamos o
parmetro de ordem dos lipdios.
A anisotropia estacionria, em membrana lipdica, rS pode ser expressa em
funo de dois termos, como mostra a seguinte expresso:
r0
rS = + r 3.32
1+ c
O primeiro termo representa a contribuio cintica e o segundo a
contribuio estrutural. O parmetro c nos informa sobre as propriedades
cinticas tais como a viscosidade . Em membranas lipdicas, usando a equao
3.32, viu-se que a contribuio cintica da rS de DPH no maior do que 3 %. Isto
significa que a ordem lipdica da membrana pode ser avaliada pela anisotropia
estacionria, rS (Jhnig, 1979).
 61

3.4.
Espectrometria de massa

A espectrometria de massa uma tcnica micro analtica utilizada para obter

informao do peso molecular e de caractersticas estruturais da amostra. uma
tcnica destrutiva. A espectrometria de massa capaz de fornecer informao
sobre a composio elementar de amostras, a estrutura molecular e a composio
qualitativa e quantitativa de misturas complexas. O requisito bsico para uma
anlise por espectrometria de massa a formao de ons livres em fase gasosa. O
alcance e a utilidade do mtodo de espectrometria de massa so dependentes do
processo de ionizao. A forma do espectro de massa de uma espcie molecular
altamente dependente do mtodo de ionizao usado.
O espectrmetro de massa um instrumento que utiliza um campo
magntico ou eltrico para separar ons que se deslocam mais ou menos
rapidamente segundo sua relao massa-carga. A Fig. 3.12 mostra os principais
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componentes dos espectrmetros de massa.

Figura 3.12. Componentes de um espectrmetro de massa (modificado de Skoog et

al. 2001).

O objetivo do sistema de entrada introduzir uma quantidade muito

pequena (microgramas) de amostra na fonte de ons, onde os componentes da
amostra se convertem em ons gasosos mediante o bombardeio com eltrons,
ftons, ons ou molculas. O sinal de sada da fonte de ons um fluxo de ons
positivos ou negativos gasosos que so acelerados no analisador de massa. A
 62

funo do analisador de massa anloga de um monocromador de um

espectrofotmetro tico. No primeiro caso, no entanto, a disperso se realiza em
funo da relao massa-carga dos ons da amostra, em vez de no comprimento de
onda dos ftons. Finalmente o detector recebe os ons, transformando a corrente
de ons em sinais eltricos que so processados, armazenados num computador.
Os espectrmetros de massa requerem um complexo sistema de vcuo para
manter uma baixa presso em todos os componentes, exceto no sistema de
processamento do sinal e leitura (Skoog et al, 2001).
Os analisadores no dependem apenas da massa, mas tambm da acelerao
dos ons, por isso os separam de acordo com a relao massa-carga. As trs
principais caractersticas de um analisador so: o limite de massa, a transmisso
inica e o poder de resoluo em massa. O limite de massa significa o valor mais
alto de massa que pode ser medido; geralmente expresso em daltons (Da) para
um on de carga unitria, i.e, z = 1. A transmisso a razo entre o nmero de
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ons que chegam ao detector e os ons produzidos na fonte. O poder de resoluo

a capacidade de produzir dois sinais distintos para dois ons com uma diferena de
massa pequena (Rodrigues, 2003).
Uma variedade de tcnicas de ionizao usada para a espectrometria de
massa. A maioria das tcnicas de ionizao excita a molcula neutra da amostra
(M) a qual ento libera um eltron para formar um radical ction (M+). Outras
tcnicas de ionizao envolvem reaes qumicas entre ons e molculas neutras
(M) que produzem a adio de H+ s molculas neutras (MH+). Na Fig. 3.14
apresenta-se um resumo geral das tcnicas de ionizao utilizadas em
espectrometria de massa molecular juntamente com algumas caractersticas. A
tabela da Fig. 3.13 mostra que estas tcnicas subdividem-se em dois grupos
segundo o estado da amostra: no primeiro caso a amostra j se encontra em fase
gasosa e no segundo produz-se dessoro inica a partir da fase condensada
(slida ou lquida) da amostra.
 63

Figura 3.13. Tcnicas de ionizao para espectrometria de massa molecular.

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Em continuao, se mencionar brevemente o tipo de analisador de massa

que se utilizou em nossas medidas de espectrometria de massa, o analisador de
massa de tempo de vo.
O analisador de massa de tempo de vo. Nestes instrumentos os ons se
produzem periodicamente mediante o bombardeio da amostra com pulsos curtos
de eltrons, ons secundrios ou ftons gerados por laser. Estes pulsos podem ter
frequncias de 10 a 50 kHz e um tempo de vida de 0.25 s. Os ons produzidos
dessa maneira so acelerados por um campo eltrico, mediante um pulso de 103 a
104 V, com a mesma frequncia que o pulso de ionizao, mas defasado. As
partculas aceleradas passam ao tubo analisador de aproximadamente um metro de
comprimento e sem campo algum (Fig. 3.14). Devido a que todos os ons que
ingressam no tubo tm idealmente a mesma energia cintica, suas velocidades
dentro do tubo devem variar inversamente com a raiz quadrada de suas massas, as
partculas mais leves chegando ao detector antes do que as mais pesadas. Os
tempos de vo habituais so de 1 a 30 s.
 64

Figura 3.14. Diagrama de um espectrmetro de massa de tempo de vo. Um feixe de

ons produzido por um laser acelerado em direo do tubo analisador, onde se produz
a separao (modificado de Skoog et al. 2001).
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