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protocolos de extrao e de
amplificao de dna por meio da tcnica
de reao em cadeia da polimerase
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria
Embrapa Pecuria Sudeste
Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento
Fundamentos terico-prticos e
protocolos de extrao e de
amplificao de DNA por meio da
tcnica de reao em cadeia da
polimerase
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Autores
Mrcia Cristina de Sena Oliveira
Mdica Veterinria, Dra., Embrapa Pecuria Sudeste, Rod. Washington Luiz, km
234, Caixa Postal 339, CEP: 13560-970, So Carlos, SP.
Endereo eletrnico: marcia@cppse.embrapa.br
Epaminondas do Patrocnio
Bacharel em Qumica, Embrapa Mandioca e Fruticultura, Rua Embrapa, s/n, Caixa
Postal 007 CEP 44380-000 Cruz da Almas, BA
Endereo Eletrnico: epami@cnpmf.embrapa.br
1. INTRODUO
1
Polimerase chain reaction, PCR.
2 Fundamentos terico-prticos e protocolos de extrao e de amplificaode DNA por meio da tcnica de Reao em cadeia
da polimerase
a) Tampo de digesto 1.
b) Soluo de fenol, clorofrmio e lcool isoamlico (25:24:1); para essa soluo, usar
fenol tamponado.
c) Acetato de amnio 7,5 M.
d) Etanol absoluto.
e) Etanol a 70%.
f) Tampo TE (trisHCl 10 mM, EDTA 1 mM, com pH 8,0; tris =
hidroximetilaminometano).
g) Soluo de dodecilsulfato de sdio (SDS) a 0,1%.
h) Nitrognio lquido.
i) Frascos e bastes esterilizados.
j) Microtubos de polipropileno.
mistura agitada, o que torna mais fcil a separao da fase orgnica e da fase
aquosa. A protena que foi desnaturada pelo tratamento com fenol e clorofrmio forma
uma camada na interface das duas fases, separando-se do DNA que se mantm na
fase aquosa. Para extrair o DNA de uma amostra, usar igual volume de soluo de
fenol, de clorofrmio e de lcool isoamlico (25:24:1). A extrao com o fenol
dependente do pH. O fenol empregado nas extraes de DNA deve ter o pH prximo
de 8,0 (fenol tamponado), j que faixas mais baixas de pH deslocam o DNA para a
interface na hora da centrifugao. Em pH 7,0 ou acima, o DNA permanece na fase
aquosa e em pH abaixo de 7,0, ele desnaturado e migra para a fase orgnica. Nesse
ltimo caso, o RNA permanece na fase aquosa. Metodologia para tamponamento do
fenol est descrita no Apndice. Aps a adio da soluo de extrao, centrifugar a
amostra por dez minutos a 1.700 g e transferir o sobrenadante para um novo tubo.
Cuidado: A manipulao de solues que contm fenol exige cuidado, pelo fato de
serem extremamente custicas, volteis e irritantes para as mucosas.
Procedimento:
Adicionar meio volume de soluo de acetato de amnio 7,5 M e dois volumes
de etanol absoluto. Centrifugar a 1.700 g por cerca de dois minutos (o tempo deve ser
ajustado de acordo com a amostra). Eliminar a soluo alcolica e preservar o pellet de
DNA. Ressuspender o pellet em etanol a 70% (para eliminar impurezas presentes na
amostra), centrifugar novamente a 1.700 g por dois minutos. Descartar o sobrenadante
e deixar secar o pellet de DNA. Ressuspender o DNA em tampo TE (ver item 6.1.f).
Para facilitar a completa dissoluo do DNA nesse tampo, as amostras podem ser
incubadas em agitador a 65C por algumas horas.
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da polimerase
ele lavado at que apresente alta pureza. No final do protocolo, o DNA eludo com
gua quente ou com tampo TE. A utilizao de kits permite a purificao do DNA nas
amostras de maneira homognea e rpida.
Procedimento:
a) Colocar 300 L de sangue e 900 L de soluo de lise, em microtubo de 1,5 mL.
b) Homogeneizar e centrifugar a 20.800 g por cinco minutos e descartar o
sobrenadante, deixando cerca de 50 L.
c) Homogeneizar a amostra e adicionar 500 L de soluo de extrao.
d) Incubar por cinco minutos, em temperatura ambiente, e transferir o contedo do
microtubo para a coluna de extrao. Acoplar a coluna de extrao ao tubo coletor.
e) Centrifugar a 5.000 g por um minuto; descartar o contedo do tubo coletor.
f) Adicionar coluna 500 L de soluo de extrao e centrifugar a 5.000 g por um
minuto; descartar o contedo do tubo coletor.
g) Adicionar coluna 500 L de soluo de lavagem e centrifugar a 20.800 g por trs
minutos; descartar o contedo do tubo coletor.
h) Transferir a coluna para um microtubo de 1,5 mL, limpo e livre de enzimas que
decomponham o DNA.
i) Adicionar 100 L de gua ultrapura, autoclavada e aquecida a 70C; incubar por um
minuto, em temperatura ambiente, e centrifugar a 5.000 g por um minuto, obtendo-
se assim a soluo de DNA. O DNA pode ser eludo em tampo TE tambm
aquecido a 70C.
Solues:
Soluo A (tampo de hemlise) para cada amostra de 25 mL:
a) TrisHCl 1 M, com pH 7,6 (concentrao final de 10 mM) 250 L.
b) MgCl2 0,5 M (concentrao final de 5 mM) 250 L.
c) NaCl 5 M (concentrao final de 10 mM) 50 L.
d) Completar com gua ultrapura (q.s.p. 25 mL).
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Obteno de leuccitos:
a) Colher 5 mL de sangue em tubos com anticoagulante EDTA. Acertar os volumes
dos tubos, completando com soluo salina (soluo de cloreto de sdio 0,9 M).
b) Centrifugar durante cinco minutos a 390 g e descartar o plasma, usando pipeta,
com cuidado, para no descartar as clulas brancas (esta etapa opcional).
c) Lisar os glbulos vermelhos com 10 mL (5 mL no tubo de colheita e 5 mL em tubo
de polipropileno com capacidade para 15 mL) da soluo A, e homogeneizar,
misturando bem por inverso ou agitando os tubos no vortex.
d) Centrifugar durante dez minutos a 700 g na temperatura de 4C.
e) Dispensar o sobrenadante. Se o pellet for muito pequeno, centrifugar novamente.
f) Ressuspender o pellet em 5 mL do tampo de hemlise. Para isso, tampar os tubos
com Parafilm e misturar bem por inverso e, se preciso, usar o vortex. Centrifugar
a 2.000 rpm por dez minutos a 4C.
g) Repetir a lavagem, at obter somente clulas brancas.
h) Ressuspender o pellet em 500 L de tampo de hemlise (soluo A) e passar para
microtubos de 1,5 mL. Centrifugar por um minuto a 16.000 g e descartar o
sobrenadante.
i) O pellet pode ser conservado a 20C ou em temperatura menor, por vrios meses.
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da polimerase
Obteno do DNA:
a) Ressuspender o pellet em 500 L de soluo B e misturar no vortex. Obs.: destruir
bem o pellet antes de incubar.
b) Incubar a 55C, at dissolver o pellet (durante quatro a seis horas ou de um dia
para o outro). De vez em quando, misturar as amostras no vortex, para que o pellet
fique bem dissolvido.
c) Ajustar o volume para 760 L com tampo TE (210 L). Acrescentar 240 L de
NaCl 5 M.
d) Incubar por quinze minutos em gelo.
e) Agitar os tubos por inverso, at formar pequenos cogulos de protena.
Centrifugar por quinze minutos a 16.000 g.
f) Dividir todo o sobrenadante em dois tubos novos (devidamente marcados), 500 L
em cada um.
g) Ligar o banho-maria a 37C. Adicionar 1 mL de etanol absoluto gelado e inverter o
tubo vrias vezes. Centrifugar por quinze minutos a 16.000 g. Descartar o
sobrenadante. Secar com papel (com cuidado).
h) Lavar com 500 L de etanol a 70%, gelado. Revolver o tubo. Centrifugar por cinco
minutos a 16.000 g. Descartar e colocar a secar (temperatura mxima de 40C).
Adicionar 250 L de tampo TE + soluo de enzima que degrada RNA (RNAse
10 g por mL de amostra) e incubar por uma hora a 37C.
Procedimento:
a) Descongelar a amostra de sangue em temperatura ambiente e adicionar igual
volume de tampo PBS.
Fundamentos terico-prticos e protocolos de extrao e de amplificaode DNA por meio da tcnica de Reao em cadeia 11
da polimerase
Procedimento:
a) Pesar 20 mg da amostra e colocar em um microtubo de 1,5 mL.
b) Macerar com a ponta cnica de um basto. As amostras podem ser mergulhadas
em pequenas quantidades de nitrognio lquido, para serem congeladas
rapidamente. O congelamento facilita a macerao das amostras, que se tornam
mais quebradias.
c) Adicionar 10 L de tampo lisozima e incubar por quinze minutos em temperatura
ambiente.
d) Adicionar 15 L de soluo de proteinase K e incubar de um dia para o outro, na
temperatura de 56C.
e) Adicionar 500 L de soluo de extrao e incubar por quinze minutos em
temperatura ambiente.
f) Centrifugar a 5.000 g por dois minutos.
g) Recolher o sobrenadante, colocar na coluna de extrao e centrifugar a 5000 g por
um minuto. Descartar o contedo do tubo coletor.
h) Novamente adicionar 500 L de soluo de extrao e incubar por quinze minutos
em temperatura ambiente. Centrifugar a 5.000 g por um minuto. Descartar o
contedo do tubo coletor.
i) Adicionar 500 L de soluo de lavagem e centrifugar novamente a 20.000 g por
cinco minutos. Descartar o tubo coletor e colocar a coluna em um microtubo de 1,5
mL, novo e livre de enzimas que possam atuar sobre DNA e RNA.
j) Para eluio do DNA, adicionar 100 L de gua ultrapura aquecida a 70C, incubar
por um minuto e centrifugar a 5.000 g por um minuto.
Procedimento:
a) Pesar 20 mg da amostra e colocar em um microtubo de 1,5 mL.
b) Macerar com a ponta cnica de um basto. A macerao pode ser feita aps
congelamento com nitrognio lquido.
c) Adicionar 10 L de tampo de digesto 2 e incubar por quinze minutos em
temperatura ambiente.
d) Adicionar 15 L de proteinase K (20 mg/mL) e incubar por quatro horas na
temperatura de 56C.
e) Adicionar 500 L de soluo de extrao, incubar por quinze minutos em
temperatura ambiente.
f) Centrifugar a 5.000 g por dois minutos.
g) Recolher o sobrenadante, colocar em coluna de extrao e centrifugar a 5.000 g por
um minuto. Descartar o material do tubo coletor.
h) Novamente adicionar 500 L de soluo de extrao e incubar por quinze minutos
em temperatura ambiente. Centrifugar a 5.000 g por um minuto.
i) Adicionar a soluo de lavagem e centrifugar a 20.000 g por trs minutos (16.000
rpm).
j) Transferir a coluna para um tubo limpo de 1,5 mL e colocar 100 L de gua a 70C
(ou tampo TE). Aps um minuto, centrifugar o tubo com a coluna a 5.000 g por um
minuto.
Procedimento:
a) Descongelar uma palheta de smen (cerca de 0,54 mL) e colocar em um microtubo
de 1,5 mL.
b) Centrifugar durante oito minutos a 16.000 g.
c) Lavar o pellet quatro vezes em 1 mL de tampo PBS (a cada lavagem passar no
vortex e centrifugar novamente).
d) Ressuspender em 100 L de tampo PBS (nesta fase, a amostra pode ser
armazenada no freezer).
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da polimerase
e) Adicionar 400 L de tampo de lise 2 e incubar por trinta minutos a 50C para
dissolver o pellet.
f) Adicionar soluo de proteinase K a 200 g/mL (100 g = 5 L da soluo de
estoque de 20 mg/mL). Agitar no vortex at dissolver. Incubar por dezesseis horas
a 50C.
g) Dividir as amostras em dois tubos, colocando 250 L em cada tubo.
h) Adicionar 80 L de NaCl 5 M por tubo. Agitar vigorosamente por inverso.
Centrifugar a 16.000 g por cinco minutos.
i) Transferir o sobrenadante para tubos limpos. Acrescentar 1 mL de etanol absoluto a
cada tubo e agitar por inverso. Centrifugar a 16.000 g por cinco minutos.
j) Desprezar o sobrenadante. Acrescentar 100 L de etanol a 70% a cada tubo (no
agitar no vortex).
k) Centrifugar a 16.000 g por cinco minutos. Desprezar o sobrenadante. Secar o pellet
e suspender em 100 L de tampo TE + enzima que atue sobre RNA (10 g/mL de
amostra).
l) Incubar por uma hora em temperatura ambiente.
A extrao de DNA de plantas envolve a lise das clulas vegetais por meio do
tratamento com detergente e posterior separao e precipitao do DNA. A
preparao do DNA das plantas pela tcnica de centrifugao em gradiente de cloreto
de csio produz DNA de alta pureza. Outro protocolo que tem sido largamente utilizado
por sua facilidade e rapidez aquele que usa o detergente CTAB (brometo de
cetiltrimetilamnio), que libera o DNA celular e se complexa a ele. Posteriormente, o
DNA separado por meio do tratamento com isopropanol e etanol. Este protocolo pode
ser adaptado de vrias maneiras, para diversos tipos e para vrias quantidades de
amostra.
Protocolo que emprega o detergente CTAB:
Solues (ver Apndice):
a) soluo-tampo de extrao vegetal.
b) Soluo de clorofrmio e lcool isoamlico a 24:1.
c) Isopropanol.
d) Etanol a 95%.
e) Tampo TE.
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Procedimento:
a) Pesar 300 mg do tecido vegetal (a quantidade de tecido vegetal pode chegar a at
3 g).
b) Macerar com auxlio de nitrognio lquido, at que a amostra esteja pulverizada.
c) Colocar a amostra em microtubo de 2 mL e adicionar 700 L de soluo-tampo de
extrao vegetal e homogeneizar durante dez minutos por inverso.
d) Incubar as amostras em banho-maria a 65C por uma hora, homogeneizando
algumas vezes.
e) Retirar do banho-maria e deixar a temperatura da amostra se igualar temperatura
ambiente.
f) Adicionar 700 L de soluo de clorofrmio e de lcool isoamlico (24:1), e
homogeneizar suavemente.
g) Centrifugar a 5.000 g por dez minutos em temperatura ambiente, para separar a
fase orgnica e a fase aquosa.
h) Remover a fase aquosa (superior) para um novo microtubo, evitando tocar a
interface com a ponta da ponteira.
i) Repetir a extrao com soluo de clorofrmio e lcool isoamlico (24:1) mais uma
ou duas vezes, considerando que maior nmero de extraes pode purificar mais o
DNA, porm com alguma perda.
j) Aps a remoo final do sobrenadante, adicionar 450 L de isopropanol (gelado),
equivalente a aproximadamente 2/3 do volume coletado. Homogeneizar
suavemente.
k) Manter a 20C por dois minutos (para evitar a precipitao de polissacardeos).
l) Centrifugar a 8.600 g por dez minutos.
m) Descartar o sobrenadante.
n) Lavar o pellet uma vez com etanol a 70%.
o) Lavar novamente o pellet com etanol a 95%.
p) Deixar secar por uma hora.
q) Ressuspender em 50 a 100 L de tampo TE (pode-se adicionar RNAse na
concentrao final de 10 g/mL de amostra).
r) Incubar a 37C por uma hora.
s) Manter a 20C.
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da polimerase
PCR
15. NESTED
A anlise quantitativa por meio do estudo cintico da PCR pode ser feita
adicionando-se um corante fluorescente reao. Com isso, conforme a reao
progride, a amplificao produz quantidades crescentes de DNA de dupla fita, que se
liga ao corante, resultando em aumento da fluorescncia. Se for colocado em um
grfico o aumento da fluorescncia em relao ao nmero de ciclos, pode-se obter o
panorama completo da PCR, inclusive a quantidade inicial do DNA-alvo. Vrios
equipamentos que realizam esse tipo de anlise esto disponveis comercialmente. As
reaes quantitativas so muito utilizadas na determinao da expresso de genes
especficos e tambm em tcnicas de diagnstico, em que se pretende saber a
quantidade inicial de DNA presente na amostra.
(em ampres). Para ocorrer migrao eletrofortica, deve haver compromisso entre a
intensidade de corrente i e a voltagem do meio V. Em resumo:
V = Ri e P = Vi ou Ri2.
V = Ri = li / S.
Procedimento:
a) Pesar a agarose.
b) Coloc-la em um erlenmayer que contenha o volume necessrio de tampo TBE 1
X.
c) Aquecer no forno de microondas, at iniciar a ebulio (aproximadamente trinta
segundos em potncia mdia para gel de 30 mL). Agitar o frasco e retornar ao forno
de microondas por mais alguns segundos.
26 Fundamentos terico-prticos e protocolos de extrao e de amplificaode DNA por meio da tcnica de Reao em cadeia
da polimerase
CUIDADOS
O brometo de etdio um potente agente mutagnico. Usar luvas e mscara
para preparar a soluo de estoque e para manipular os gis.
A luz ultravioleta produz queimaduras severas. Usar mscara e culos de
proteo adequados.
aplicao de campos eltricos elevados (100 a 500 V/cm). Isso resulta em separaes
de alta eficincia, em alto poder de resoluo e em reduzido tempo de anlise.
Em geral, um aparelho de eletroforese capilar bsico consiste de uma fonte de
alta tenso, capilares (geralmente de slica fundida), eletrodos (de platina,
normalmente), e um detector apropriado. A fonte de alta tenso aplicada nos
eletrodos de platina situados nos reservatrios com soluo eletroltica apropriada. As
extremidades do capilar so imersas nos reservatrios da soluo, para completar o
contato eltrico. As amostras normalmente so introduzidas no capilar por mtodos
eletrocinticos, nos quais uma diferena de potencial estabelecida entre o capilar e o
recipiente que contm a amostra, durante um tempo predeterminado.
O detector localiza-se em algum ponto do capilar, prximo ao reservatrio de
sada.
A eletroforese capilar em gel utilizada exclusivamente para separao de
macromolculas, tais como oligonucleotdeos, fragmentos de DNA e protenas. Essa
tcnica teve incio com a aplicao nas separaes de DNA por tamanho molecular,
por meio de colunas preenchidas com gel, denominados gis qumicos: um capilar
tratado com um reagente que estabiliza o gel junto parede do capilar, atravs de
ligaes covalentes. Esse mtodo foi descartado, dado o grande nmero de problemas
que surgiram, tais como aparecimento de bolhas (perda de condutividade), introduo
limitada de amostra, reteno de fragmentos com alto peso molecular e degradao do
gel por hidrlise. Tais problemas levaram formulao de novos sistemas e que foram
denominados gis fsicos.
Gis fsicos so matrizes polimricas hidroflicas, dissolvidas em tampo
apropriado, que no so ligados parede do capilar. Assim, eles podem ser
substitudos a cada separao, o que permite o aproveitamento do mesmo capilar por
centenas de vezes, sem perda de eficincia. A uma dada concentrao de polmero, as
fitas polimricas individuais comeam a interagir umas com as outras e formam uma
estrutura em rede dentro do capilar, o que possibilita a separao dos fragmentos de
DNA. A concentrao polimrica tima depende do tamanho do DNA a ser separado.
28 Fundamentos terico-prticos e protocolos de extrao e de amplificaode DNA por meio da tcnica de Reao em cadeia
da polimerase
Procedimento:
a) Preparar a mistura de formamida e o padro interno com fragmentos de tamanho
conhecido: para cada amostra, colocar 8,85 L de formamida Hi-Dy e 0,15 L de
padro (GS 500 ROX).
b) Aplicar esses 9 L de mistura em um poo da placa de corrida.
c) Aplicar 1 L de produto de PCR da sua amostra por poo.
d) Desnaturar as amostras (j na placa de corrida), durante cinco minutos, a 95C.
e) Colocar as amostras imediatamente no gelo aps a desnaturao e manter a por
cinco minutos.
f) Preparar a injeo das amostras no analisador e a obteno dos dados no
computador, com o software Data Collection (Applied Biosystems).
1X X
Fig. 1.
1o ciclo 34 ciclos
95,0 95,0
1 72,0 72,0 72,0
65,0 64,0
6466 30" 30 30 4
4,0
30 30
1X X
esquema da Fig. 2.
1o ciclo 34 ciclos
95,0 72 95,0
1 30" 72,0 72,0
30
64,00 68,0
00 30" 4
4,0
30 30
BiIA CATCTAATTTCTCTCCATACCCCTCC
278
PCR BiIB CCTCGGCTTCAACTCTGATGCCAAAG
BiIAN CGCAAGCCCAGCACGCCCCGGTGC
NestedPCR) 170
BiIBN CCGACCTGGATAGGCTGTGTGATG
Procedimento:
a) Pesar 0,45 g de agarose em um erlenmayer.
b) Dissolver em 30 mL de tampo trisboratoEDTA (TBE) 1 X.
c) Aquecer no forno de microondas at iniciar a ebulio (aproximadamente trinta
segundos).
d) Agitar o frasco com cuidado (a agarose em ebulio tem tendncia a transbordar).
e) Retornar ao forno de microondas por mais dois a trs segundos.
f) Aguardar a reduo da temperatura para aproximadamente 60C e adicionar
brometo de etdio (acrescentar 1 L de brometo para cada 10 mL de gel).
g) Verter no molde previamente nivelado e colocar os pentes.
h) Aps a solidificao (o gel se torna opaco), colocar na cuba de eletroforese e cobrir
com tampo TBE 1 X (tambm pode ser utilizado tampo 0,5 X).
i) Aplicar 8 L de amostra acrescidos de 2 L de loading buffer (tampo da amostra).
j) Ligar a fonte e manter a 80 V por cerca de uma hora.
k) Visualiz-lo em transiluminador sob luz ultravioleta (Fig. 3).
32 Fundamentos terico-prticos e protocolos de extrao e de amplificaode DNA por meio da tcnica de Reao em cadeia
da polimerase
CUIDADOS
O brometo de etdio um potente agente mutagnico. Utilizar luvas e mscara
para preparar a soluo de estoque e para manipular os gis.
No olhar diretamente para a luz ultravioleta.
.
Fundamentos terico-prticos e protocolos de extrao e de amplificaode DNA por meio da tcnica de Reao em cadeia 33
da polimerase
23. APNDICE
borato
Soluo de estoque TBE (tris EDTA) concentrada 10 X:
base
Tris 108 g
cido brico 55 g
EDTA 0,5 M, com pH 8,0 40 mL
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da polimerase
cido clordrico) 1 M:
Soluo-tampo trisHCl (hidroximetilaminometano
base em 800 mL de gua ultrapura.
a) Dissolver 121 g de tris
b) Ajustar o pH com HCl concentrado. Cerca de 70 mL de HCl so necessrios para
pH 7,4; e 42 mL, para pH 8,0.
c) Adicione gua ultrapura at completar 1000 mL.
d) Autoclavar a 121C por quinze minutos.
Obs.: O tris tem a funo de manter constante o pH das solues.
EDTA):
Soluo-tampo TE (tris
a) TrisHCl 10 mM, com pH 7,4, 7,5 ou 8,0.
b) EDTA 1mM.
Tampo de lise 1:
TrisHCl, com pH 8,0 10 mM
EDTA, com pH 8,0 10 mM
Dodecilsulfato de sdio (SDS) 0,5%
Soluo de RNAse (adicionar no momento do uso) 20 g/mL
Fundamentos terico-prticos e protocolos de extrao e de amplificaode DNA por meio da tcnica de Reao em cadeia 35
da polimerase
Tampo de lise 2:
2-mercaptoetanol 2%
TrisHCl, com pH 8,0 10 mM
NaCl 100 mM
EDTA, com pH 8,0 10 mM
SDS 0,5%
Obs.: Preparar no momento do uso.
Tampo de digesto 1:
NaCl 100 mM
TrisHCl, com pH 8,0 10 mM
EDTA, com pH 8,0 25 mM
SDS 0,5%
Proteinase K 0,1 mg/mL
Tampo de digesto 2:
TrisHCl 10 mM
EDTA, com pH 8,5 1mM
Triton X-100 5%
Obs.: Estocar a 4C.
36 Fundamentos terico-prticos e protocolos de extrao e de amplificaode DNA por meio da tcnica de Reao em cadeia
da polimerase
Soluo de NaCl 5 M:
NaCl 292,25 g
gua ultrapura 1.000 mL
24. REFERNCIAS
AUSUBEL, F. M.; BRENT, R.; KINGSTON, R. E.; MOORE, D. D.; SEIDMAN, J. G.;
SMITH, J. A.; STRUHL, K. Current protocols in Molecular Biology. New York: Wiley
& Sons, 1996. 4800 p.
DOYLE, J. J.; DOYLE, J. L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of
fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin, v. 191, p. 11-15, 1987.
KWOK, S.; HIGUCHI, R. Avoiding false with PCR. Nature, v. 339, p. 237-8, 1989.
MULLIS, K.; FALOONA, F. Specific synthesis of DNA in vitro via polymerase catalysed
chain reaction. Methods of Enzymology, v. 55, p. 335-350, 1987.
ZARLENGA, D. S.; CHUTE, M. B.; MARTIN, A.; KAPEL, C. M. O. A multiplex PCR for
unequivocal differentiation of six encapsulated and three non encapsulated genotypes
of Trichinella. International Journal for Parasitology, v. 29, p. 141-149, 1999.