GLICEMIA ENZIMÁTICA AA 4 aminofenazona (4-AF) y buffer Good, conteniendo fenol y

Para la determinación de glucosa en suero, plasma, orina o colato de sodio.

líquido cefalorraquídeo.
Sustancias interferentes:
Fundamento Del - Excepto la heparina, los anticoagulantes comunes interfieren
Metodo en la determinación.
- Los sueros con hemólisis visible o intensa producen valores
Reactivo A: solución conteniendo glucosa oxidasa (GOD), falsamente aumentados por lo que no deben ser usados.
peroxidasa (POD), 4-aminofenazona (4-AF), buffer fosfatos pH
7,0 y 4-hidroxibenzoato. El colesterol en suero es estable por lo menos 1 semana en
refrigerador y 2 meses en congelador, sin agregado de
Aditivos: en caso de que la muestra a emplear sea plasma, se conservantes.
recomienda el uso de Anticoagulante G (EDTA / fluoruro)
para su obtención. - Longitud de onda:
505 nm en
Sustancias interferentes conocidas: no se observan espectrofotómetro.
ainterferencias por: bilirrubina hasta 10 mg/dl, triglicéridos - Tº Rx: 37ºC
hasta 500 mg/dl y hemoglobina hasta 350 mg/dl. El ácido
ascórbico interfiere en la determinación en orina en cualquier El color de reacción
concentración. final es estable 30
minutos.
La sangre debe centrifugarse dentro de las 2 horas de la
extracción. El sobrenadante límpido se transfiere a otro tubo Valores de Referencia:
para su conservación. De esta forma la glucosa es estable 4 Deseable: < 2,00 g/l Moderadamente alto: 2,00 - 2,39 g/l
horas a temperatura ambiente o 24 horas refrigerada. El LCR Elevado: ≥ 2,40 g/l
puede contaminarse con bacterias y otras células por lo que la
determinación debe realizarse de inmediato. TG COLOR GPO/PAP AA
Método enzimático para la determinación de triglicéridos
- Long. de onda: 505 nm en espectrofotómetro. en suero o plasma.
- Tº Rx: 37 ºC.
Fundamento Del
El color de Metodo
reacción final es
estable 30 Reactivo A: solución
minutos. conteniendo buffer
Good (pH 6,8), clorofenol, lipoprotein lipasa (LPL), glicerol
kinasa (GK), glicerol fosfato oxidasa (GPO), peroxidasa (POD),
adenosina trifosfato (ATP) y 4-aminofenazona (4-AF).

Suero o plasma Recolección: previo ayuno

Adultos: 74 - 106 mg/dl de 12 a 14 hrs, obtener suero
Niños: 60 - 100 mg/dl o plasma. Separar de los
Neonatos: 1 día: 40 - 60 mayor a 1 día: 50 - 80 mg/dl glóbulos rojos dentro de las
2 horas de extracción.
Orina aislada fresca: 1 - 15 mg/dl
de 24 horas: < 0,5 g/24 hs - Longitud de onda: 505 nm
LCR Niños: 60 - 80 mg/dl Adultos: 40 - 70 mg/dl - Tº de Rx: 37ºC

COLESTAT ENZIMÁTICA AA El color de reacción final es

Método enzimático para la determinación de colesterol en estable 60 minutos.
suero o plasma.
Valores de Referencia:
Fundamento Del Deseable: < 1,50 g/l
Método Moderadamente elevado a elevado: 1,50 - 1,99 g/l
Elevado: 2,00 - 4,99 g/l Muy elevado: ≥ 5,00 g/l

Reactivo A: solución conteniendo colesterol esterasa (CHE),

colesterol oxidasa (CHOD), peroxidasa (POD),
 HDL COLESTEROL FT Hemólisis visible
Reactivo precipitante (ácido fosfotúngstico) para la (concentración de
separación de las Lipoproteínas de Alta Densidad (HDL) en hemoglobina > 0,08 g/dl)
suero o plasma. interfiere.

Fundamento Del Metodo: Las HDL se separan precipitando Longitud de onda: 340 nm
selectivamente las LDL y VLDL mediante el agregado de ácido Tº de Rx: 25, 30 ó 37ºC.
fosfotúngstico en presencia de iones magnesio. Las HDL
quedan en el sobrenadante separado por centrifugación, CALCULOS:
donde se realiza la determinación del colesterol ligado a las CK U/I = ∆A/min x factor
mismas, empleando el sistema enzimático Colesterol
oxidasa/Peroxidasa con colorimetría según Trinder
(Fenol/4AF).

Reactivo A (Reactivo Precipitante): solución de ácido

fosfotúngstico 0,44 mmol/l y cloruro de magnesio 20 mmol/l.
Colestat enzimático: No provisto.

Aditivos: en caso de utilizar plasma, recogerlo únicamente con

heparina.

Sustancias interferentes conocidas: anticoagulantes distintos

de la heparina y
bilirrubinemia mayor GPT(ALT) AA
de 50 mg/l son Método UV optimizado (IFCC) para la determinación de
causas de alanina aminotransferasa (GPT/ALT) en suero o plasma.
interferencia.
Los mayores aumentos de actividad ALT en suero, se producen
Longitud de onda: como consecuencia de alteraciones hepáticas. Sus valores se
505 nm en comparan con los de otras enzimas de similar origen tisular,
espectrofotómetro. permitiendo así completar el perfil enzimático de órganos
Tº de Rx: 37ºC como el hígado.

El color de reacción Fundamento

es estable 2 horas. Del Metodo:
Decreciente
Valores de Referencia: 0,40 - 0,60 g/l
Reactivo A: viales conteniendo 2-oxoglutarato, nicotinamida
CK-NAC UNITEST Y AA adenina dinucleótido reducido (NADH) y lactato
Método UV optimizado (IFCC) para la determinación de deshidrogenasa (LDH).
Creatina Kinasa (CK) en suero o plasma. Reactivo B: solución de buffer TRIS pH 7,5 (a 30ºC)
conteniendo L-alanina.
En el caso del infarto agudo de miocardio (IAM), la actividad
sérica de CK comienza a aumentar entre 2 y 6 horas después Aditivos: en caso de
de producido el episodio y alcanza un máximo después de 18 que la muestra a utilizar
a 24 horas. sea plasma, se debe
usar heparina como
Fundamento anticoagulante.
Del Metodo:
Creciente Sustancias
interferentes
conocidas:
Reactivo B: solución de buffer imidazol pH 6,7. - Las muestras con
Reactivo A: frasco con sustrato desecado. hemólisis visible o
intensa producen
Aditivos: en caso de emplear plasma, debe usarse heparina valores falsamente
(concentración < 15 UI/ml) o EDTA como anticoagulante. aumentados por lo que
no deben ser usados.
- Las muestras de pacientes hemodializados o con Valores Referencia:
hipovitaminosis u otras patologías asociadas con deficiencia de
piridoxal fosfato producen valores falsamente disminuidos.

Longitud de onda: 340 nm Tº de Rx: 25, 30 ó 37ºC.

CALCULO DE LOS RESULTADOS: GPT (U/l) = ∆A/min x factor

Se consideran valores normales de transaminasas (GOT y GPT)

TRANSAMINASAS 200
Para la determinación de Transaminasa Glutámico
Oxalacética (GOT(AST) y Transaminasa Glutámico Pirúvica
(GPT/ALT)
Las transaminasas GOT y GPT son enzimas ampliamente
difundidas en el organismo con elevada concentración en
corazón, hígado, músculo esquelético, riñón y eritrocitos.
Fundamento
Del Metodo:
El piruvato
formado (el
oxalacetato es inestable y se transforma en piruvato),
reacciona con la 2,4-dinitrofenilhidracina produciéndose, en
medio alcalino, un compuesto coloreado que se mide a 505
nm.
Reactivo A: solución con 100 mM de l-aspartato y 2 mM
de α-cetoglutarato en buffer fosfatos 100 mM, pH 7,4.
- Transaminasas 200 GPT provee:
Reactivo A: solución con 200 mM de dl-alanina y 2 mM
de α-cetoglutarato en buffer fosfatos 100 mM, pH 7,4.
hasta 12 U/l. Si bien se han hallado individuos normales con
valores hasta 18 U/l, los niveles de transaminasas que se
encuentren entre 12 y 18 U/l deben considerarse sospechosos.
BILIRRUBINA
Para la determinación de bilirrubina directa y total
FUNDAMENTOS DEL METODO: La bilirrubina reacciona
específicamente con el ácido sulfanílico diazotado
produciendo un pigmento color rojo-violáceo (azobilirrubina)
que se mide fotocolorimétricamente a 530 nm. Si bien la
bilirrubina conjugada (directa) reacciona directamente con el
diazorreactivo, la bilirrubina no conjugada (indirecta)
requiere la presencia de un desarrollador acuoso (Reactivo A)
que posibilite su reacción. De forma tal que, para que
reaccione la bilirrubina total (conjugada y no conjugada)
presente en la muestra, debe agregarse benzoato de cafeína
al medio de reacción.
Reactivo A: solución acuosa de benzoato de cafeína0,13mol/l,
tamponada y estabilizada.
Reactivo B: solución de ácido sulfanílico 29 mmol/l y ácido
clorhídrico 0,17 mol/l.
Reactivo C: solución de nitrito
de sodio 0,07 mol/l.
Suero, plasma o líquido
amniótico

Además, ambos equipos proveen: Recolección: obtener suero o

Reactivo B: solución conteniendo 1 mmol de 2,4 plasma de la manera usual.
dinitrofenilhidracina (2,4-DNFH) en ácido clorhídrico 1 mol/l. Proteger de la luz natural o
Reactivo C: solución artificial, envolviendo el tubo
de hidróxido de sodio con papel negro.
4 mol/l.
Aditivos: en caso de que la
Long. onda: 505 nm muestra a emplear sea plasma,
Tº de Rx: 37ºC. debe usarse heparina para su
obtención.
El color de la reacción
es estable durante 30 Sustancias interferentes
minutos. conocidas: hemólisis
moderada o intensa inhibe la
reacción directa, obteniéndose
valores de bilirrubina total
falsamente aumentados.
La acción de la luz es capaz de destruir en una hora hasta un
50% de la bilirrubina presente en la muestra.
Longitud de onda: 530 nm Tº Rx: temperatura ambiente
Calculo de Resultados:
Bilirrubina total (mg/l) = (T - B) x f
Bilirrubina directa (mg/l) = (D - B) x f
Bilirrubina libre (indirecta) = BRB total - BRB directa
VALORES DE REFERENCIA
Bilirrubina en suero o plasma
Adultos: Directa: hasta 2 mg/L Total: hasta 10 mg/L
Los valores comienzan luego a disminuir para alcanzar el nivel
promedio del adulto al mes del nacimiento. En los prematuros,
los niveles de bilirrubina tardan más en alcanzar la normalidad,
dependiendo del grado de inmadurez hepática.
ALBÚMINA AA
Método colorimétrico para la determinación de
albúmina en suero
La hipoalbuminemia ocurre en condiciones patológicas tales
como pérdida excesiva de proteínas en el síndrome nefrótico,
desnutrición, infecciones prolongadas, quemaduras severas.
Otras causas son disminución en la síntesis por una dieta
deficiente, enfermedad hepática o malabsorción.
FUNDAMENTOS DEL METODO: La albúmina reacciona
específicamente (sin separación previa) con la forma aniónica
de la 3,3',5,5'-tetrabromo cresolsulfonftaleína (BCF). El
aumento de absorbancia a 625 nm respecto del Blanco de
reactivo, es proporcional a la cantidad de albúmina presente
en la muestra.
Reactivo A: solución de BCF 0,3 mmol/l, buffer acetato 0,1
mol/l y polioxietilén lauril éter 0,9 g/l.
Longitud de
onda: 625 nm
Tº Rx: 15 - 28ºC
El color es estable
20 minutos.
Calculos:
Valores Referencia: Albúmina: 3,5 a 4,8 g/dl
Relación A/G: 1,2 a 2,2
PROTEINAS TOTALES AA
Método colorimétrico para la determinación de proteínas
totales en suero.
La determinación de proteínas totales es útil para el monitoreo
de cambios ocasionados por diversos estados de enfermedad.
En condiciones patológicas como pérdidas renales,
desnutrición, infecciones prolongadas, etc., suelen
presentarse hipoproteinemias, mientras que en otras como
mieloma múltiple, endocarditis bacteriana y
hemoconcentración de diversos orígenes, (ej.: deshidratación)
se observan hiperproteinemias.
FUNDAMENTOS DEL METODO: Los enlaces peptídicos de las
proteínas reaccionan con el ión cúprico en medio alcalino,
para dar un complejo color violeta con máximo de absorción a
540 nm, cuya intensidad es proporcional a la concentración de
proteínas totales en la muestra.
Reactivo A: complejo
EDTA/Cu 13 mmol/l
en hidróxido de sodio
875 mmol/l y alquil
aril poliéter (AAP).
Longitud de onda:
540 nm Tº Rx: 37ºC
El color de la reacción es estable durante 12 horas.
Calculo De Los
Resultados
Valores de Referencia: Proteínas totales: 6,1 a 7,9 g/dl
Relación A/G: 1,2 a 2,2
UREA/BUN – COLOR
UREASA/SALICILATO
Se encuentran concentraciones elevadas de urea en plasma
como consecuencia de una dieta hiperproteica, aumento del
catabolismo proteico, después de una hemorragia
gastrointestinal, ligera deshidratación, shock e insuficiencia
cardíaca o tratamiento con glucocorticoides (uremia
prerrenal). La uremia postrenal está causada por condiciones
que obstruyen el flujo urinario: nefrolitiasis, tumor o
hipertrofia prostática. La utilidad de la urea como indicador de
la función renal está limitada por la variabilidad de su
concentración plasmática como consecuencia de factores no
renales.
 Reactivo B: solución conteniendo buffer Good pH 7,8, 4-
FUNDAMENTO aminofenazona (4-AF), uricasa (UOD), peroxidasa (POD), y
DEL MÉTODO: ferrocianuro de potasio.

Reactivo A: Salicilato sódico 62 mmol/L, nitroprusiato sódico Las sustancias fuertemente reductoras, tales como el ácido
3,4 mmol/L, tampón fosfatos 20 mmol/L, pH 6,9. ascórbico (vitamina C), la Buscapina (butil bromuro de
Reactivo A2: hioscina), etc. en dosis
Ureasa > 500 elevadas interfieren. Por
U/mL. tal razón debe
Reactivo B: suspenderse la
Hipoclorito sódico medicación, siempre que
7 mmol/L, sea posible, 24 horas
hidróxido sódico antes de la toma de
150 mmol/L. muestra.

Muestras: Suero, Long de onda: 505 nm

plasma u orina recogidos mediante procedimientos estándar. Tº Rx: 37ºC o 18-25ºC
Diluir la orina 1/50 con agua destilada antes del ensayo.
El color de reacción final
VALORES DE REFERENCIA es estable 30 minutos.
Suero y plasma: 15-39 mg/dL urea = 7-18 mg/dL BUN = 2,5-6,5
mmol/L urea. VALORES DE REFERENCIA
Orina: 26-43 g/24-h urea = 12-20 g/24 h BUN = 428-714 Hom: 2,5-6,0 mg/dl. Muj: 2,0-5,0 mg/dl.
mmol/24-h urea
FOSFATEMIA AA
CALCIUM liquicolor Método UV para la determinación de fósforo inorgánico (Pi)
Prueba fotométrica colorimétrica para calcio Método CPC en suero, plasma u orina

FUNDAMENTO DEL MÉTODO: Los iones de calcio reaccionan
con o-cresolftaleína-complexona en un medio alcalino, para
formar un complejo de color púrpura.
BUF: Buffer Lisina, Azida de sodio
RGT: 8-hidroxiquinolina, o-cresolftaleína-complexona, Acido
clorhídrico
Niveles elevados de fósforo sérico son encontrados en el
hipoparatiroidismo, mientras que el hiperparatiroidismo
conduce a la situación contraria. También puede encontrarse
hiperfosfatemia por hipervitaminosis D y diversos trastornos
renales, mientras que la hipofosfatemia se relaciona con
deficiencias de vitamina D y defectos en la reabsorción de
fósforo a nivel renal.

Muestra: Suero FUNDAMENTOS DEL METODO

o plasma El fósforo inorgánico (Pi) reacciona en medio ácido con el
heparinizado. molibdato para dar un complejo fosfomolíbdico que se mide
espectrofotométricamente a 340 nm.

Valores de Referencia: Reactivo A: solución de molibdato de amonio 2 mmol/l en

Suero/plasma: 8,1 – 10,4 mg/dl ácido sulfúrico 1%.
ó 2,02 – 2,60 mmol/l
Muestra: Obtener suero de la manera usual o plasma con
EDTA o citrato. También puede realizarse la determinación en
orina. En este caso, recoger orina de 24 horas en un recipiente
que contenga 2 ml de ácido clorhídrico concentrado.
URICOSTAT ENZIMÁTICO AA
Para la determinación de ácido úrico en suero, plasma u orina Interferencias: La hemólisis o lipemia son causa de resultados
erróneos.
FUNDAMENTO
DEL MÉTODO: Estabilidad de la muestra: El fósforo inorgánico es estable en
el suero 8 horas a temperatura ambiente. En caso de no
procesarse dentro de ese lapso, se puede refrigerar (2-10ºC)
Reactivo A: solución conteniendo buffer Good pH 7,8 y la sal hasta 7 días. La orina de 24 horas es estable 7 días refrigerada
sódica de 3,5 diclorohidroxibenceno sulfónico (DHS). (2-10ºC).
Long de onda: 340
nm
Tº Rx: temperatura
ambiente.

La reacción final es
estable 20 minutos.

VALORES DE REFERENCIA
Suero o plasma
Adultos: 2,5 - 5,6 mg/dl Niños: 4,0 - 7,0 mg/dl
Orina 0,3 - 1,0 g/24 horas

CREATININA DIRECTA Tecnica de Cinetica no la hicimos en el Lab es informativo

Métodos para la determinación de creatinina en suero y orina Long Onda: 500 nm en
espectrofotómetro.
La determinación de creatinina sérica es más utilizada como Tº Rx: 25ºC El control de
índice de funcionalismo renal. la temperatura no es
crítico, pudiendo oscilar
FUNDAMENTOS DEL METODO: La creatinina y otros entre 22 y 30ºC.
compuestos de la muestra reaccionan con el ácido pícrico en
medio alcalino dando un complejo color rojo que se cuantifica
mediante lectura fotométrica. La determinación de creatinina
puede llevarse a cabo por medio de una técnica de punto
final, o por una técnica cinética eliminándose en ambas el
color que se debe a los cromógenos no creatinina. En el primer
caso, la adición de ácido al medio, destruye el picrato de Valores de Referencia:
creatinina pero no el color formado por los demás Suero: 8 - 14 mg/l
compuestos. Por lo tanto la diferencia entre la lectura Orina: 0,9 - 1,5 g/24 hs
fotométrica antes y después del agregado de ácido, permite D.C.E.: 80 - 140 ml/min (promedio
cuantificar la creatinina en forma específica. En la técnica 125 ml/min) para adultos de
cinética, los cromógenos no creatinina, reaccionan dentro de hasta 60 años.
los primeros 30 segundos de iniciada la reacción, que se
comporta como cinética de primer orden para la creatinina.
De manera que entre los 30 segundos y los 5 minutos MAGNESIO LIQUICOLOR
posteriores al inicio de la reacción, el incremento de color se Prueba fotométrica para el magnesio con factor aclarante de
debe exclusivamente a la creatinina. lipidos (LCF)

Reactivo A: solución de ácido pícrico 41,4 mmol/l. FUNDAMENTO DEL METODO: Los iónes de magnesio en
Reactivo B: solución 0,4% de polioxietilén lauril éter (PLE) en medio alcalino forman un complejo azul coloreado con el azul
buffer alcalino, pH 12,4. de xilidil. El ácido glicoleterdiamina-N,N,N1,N1-tetraacético
Reactivo C: ácido acético al 20%. (GEDTA) es usado como agente bloqueador para el calcio.

Estabilidad de la muestra: la Muestra: Suero, plasma,

creatinina en suero es líquido cefalorraquídeo
estable hasta 24 horas y en y orina.
orina hasta 4 días, en Interferencias: No usar
refrigerador sin agregado de EDTA.
conservadores.
La prueba es lineal hasta
Tecnica de Punto Final concentraciones de magnesio de 5
mg/dl o 2.05 mmol/l.
Longitud de onda: 510 nm.
Tº Rx: 37ºC

El color de la reacción es
estable durante 6 horas.

SODIUM RAPID
Determinación fotométrica de sodio en suero
Método Mg acetato de uranilo, prueba colorimétrica.
FUNDAMENTO DEL METODO: El sodio se precipita con Mg
acetato de uranilo, los iones de uranilo que permanecen en
suspensión forman un complejo de color café amarillosos con
ácido tioglicólico. La diferencia entre el blanco del reactivo(sin
precipitación de sodio) y la muestra es proporcional a la
concentración de sodio.
Longitud de onda: 410 nm Temperatura: 20-25ºC
El ajuste cero del
fotometro se efectua
con agua destilada.
Los resultados de DO
deben ser corregidos
por el blanco de
reactivo (BR).
Valores Referencia
Suero: 135-155 mmol/L
SISTEMA DE PRUEBA TIROXINA TOTAL (tT4)
Determinación cuantitativa de Concentración total de Tiroxina
en Suero o plasma mediante un inmunoensayo enzimático en
microplaca.
De acuerdo con este método, la referencia sérica, la muestra
del paciente o el control es primero adicionado a un pozo de
microplaca. El conjugado de enzima T4 es adicionado y luego
los reactivos son mezclados. El resultado es una reacción de
competencia entre el conjugado de enzima y la Tiroxina
nativa para un número limitado de anticuerpos que combinan
sitios inmovilizados en el pozo.
Fundamento del metodo: Inmunoensayo competitivo de
Enzima (TIPO 5). Los reactivos esenciales requeridos para un
inmunoensayo enzimático de fase sólida incluyen anticuerpos
inmovilizados, conjugado de enzima-antígeno y el antígeno
nativo.
Después de
la mezcla
se obtiene
una
reacción
de competencia entre el antígeno nativo y el conjugado
enzima-antígeno para un número limitado de sitios de unión
insolubilizados. La fracción unida al anticuerpo es separada del
antígeno no unido mediante decantación o aspiración. Al
utilizar varias referencias séricas diferentes de valores de
antígenos conocidos, se puede generara una curva de
respuesta de dosis a partir de la cual se establece la
concentración de antígeno de una sustancia desconocida.
Reactivo T4 enzima: conjugado de tiroxina -peroxidasa de
rábano picante (HRP) en una matriz estabilizante de albúmina
de bovina.
Buffer conjugado T3/T4: buffer, tinta roja.
Placa recubierta con anticuerpo T4.
Sustrato A: Tetrametil bencidina (TMB) en buffer.
Sustrato B: Peróxido de hidrógeno (H2SO2) en buffer.
Solución stop: Ácido fuerte (1.0N HCl).
Evite la exposición prolongada al calor y a la luz.
La sangre se recolecta en tubo para punción venosa de banda
roja en la sección superior sin aditivos ni anticoagulantes
(para el suero) o tubo (s) evacuado que contenga EDTA o
heparina.
Preparación de Reactivos
Reactivo A de trabajo = Solución de conjugado T4-enzima
Diluir el conjugado T4-enzima en una relación de 1:11 con
buffer de conjugado total T3/T4 en un recipiente adecuado.
Por ejemplo, diluir 80µl de conjugado con 0.8 ml de buffer para
8 pozos (se forma un exceso ligero de la solución).
Buffer para Lavado: Diluir los contenidos del Concentrado de
Lavado a 1000 ml con agua destilada o desionizada en un
contenedor de almacenamiento adecuado.
Solución de Substrato de Trabajo: Verter el contenido del vial
color ámbar marcado como Solución ”A” dentro del vial
transparente Solución “B”, colocar la tapa amarilla en el vial
transparente para una fácil identificación.
Procedimiento:
1. Formatear los pocillos de a microplaca para cada suero de
referencia, control y espécimen de paciente que deba
ensayarse en duplicado.
2. Pipetear 0.025 ml (25μl) del suero de referencia apropiado,
control o espécimen dentro del pocillo asignado.
3. Adicionar 0.100ml (100μl) del reactivo de trabajo A,
Reactivo de enzima T4 en todas las pozos.
4.Agitar suavemente la microplaca durante 20-30 segundos
para mezclar y tapar.
5. Incubar durante 60 minutos a temperatura ambiente.
6. Eliminar el contenido de la microplaca mediante
decantación o aspiración.
7.Adicionar 350μl de buffer de lavado, decantar, secar o
aspirar. Realizar un total de tres (3) lavados.
8. Adicionar 0.100 ml (100μl) de solución sustrato de trabajo
a todos los pozos.
9. Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.
10. Adicionar 0.050ml (50µl) de solución de parada de
reacción a cada pozo y mezclar suavemente durante 15-20
segundos.
11.Leer la absorbancia en cada pozo a 450nm (utilizando una
longitud de onda de referencia de 620-630 nm para minimizar
las imperfecciones de los pozos) en un lector de microplacas.
Los resultados deberán ser leídos dentro de los 30 minutos
siguientes a la adición de la solución de parada.
Nota: Para reensayar muestras con concentraciones
superiores a 25 ug/ml, pipetear 12.5µl de la muestra y 12.5µl
de la referencia de suero 0 dentro del pozo de la muestra (este
procedimiento mantiene una concentración uniforme de
proteínas). Multiplicar el valor de lectura por 2 para obtener la
concentración de tiroxina.
Calculos: Una curva dosis respuesta es usada para determinar
la concentración de Tiroxina en especímenes desconocidos.
Valores Referencia:
TRIYODOTIRONINA TOTAL (tT3)
Determinación cuantitativa de la Concentración de
Triyodotironina en Suero Humano o plasma por ensayo
inmunoenzimométrico con microplacas.
Fundamento del metodo: Es el mismo que T4.
Reactivo de Enzima- T3 total: conjugado de T3- peroxidasa de
rábano (HRP) en una matriz estabilizada con albúmina.
Buffer de Conjugado T3/T4: contiene buffer, colorante rojo,
preservante e inhibidores de unión a proteínas.
Microplaca cubierta de Anticuerpo T3: Una microplaca de 96
pozos cubiertas con suero anti-T3 de oveja y empacada en una
bolsa de aluminio con un agente desecante.
Concentrado de Solución de Lavado: Contiene un surfactante
en suero salino tamponado.
Sustrato A: Tetrametil bencidina (TMB) en buffer.
Sustrato B: Peróxido de hidrógeno (H2SO2) en buffer.
Solución stop: Ácido fuerte (1.0N HCl).
Evite la exposición prolongada al calor y a la luz.
La sangre se recolecta en tubo para punción venosa de banda
roja en la sección superior sin aditivos ni anticoagulantes
(para el suero) o tubo (s) evacuado que contenga EDTA o
heparina.
Reactivo de Trabajo A- Solución de Conjugado T3- Enzima:
Diluir el conjugado T3-enzima 1:11 con el buffer del conjugado
T3/T4 total en un contenedor adecuado. Por ejemplo, diluir
80µl de conjugado con 0,8 ml de buffer para 8 pozos.
Buffer para Lavado: Diluir los contenidos del Concentrado de
Lavado a 1000 ml con agua destilada o desionizada.
Solución de Substrato de Trabajo: Vierta los contenidos del
vial ámbar marcada con “A” dentro del vial claro marcado
como solución “B”.Colocar la tapa amarilla al vial claro para
fácil identificación.
Procedimiento:
1. Marque los pozos para cada suero de referencia control y
suero de pacientes para ser procesadas por duplicado.
2. Pipetear 0.050 ml (50µl) del suero de referencia apropiado,
control o muestra dentro del pozo asignado.
3. Adicionar 0.100ml (100µl) de Reactivo de trabajo A, solución
de conjugado T3 Enzima a todos los pozos.
4. Agitar la microplaca ligeramente por 20-30 segundos para
mezclar y cubrir.
5. Incubar 60 minutos a temperatura ambiente.
6. Descartar los contenidos de la microplaca por decantación
o aspiración, si decanta, utilice papel absorbente para extraer
el exceso de humedad.
7. Adicionar 350µl de buffer de lavado, decante o aspire.
Repita 2 veces mas para un total de 3 lavados.
8. Adicione 0.100 ml (100µl) de solución de substrato de
trabajo a todos los pozos.
9. Incube a temperatura ambiente por 15 minutos.
10. Adicione 0.050 ml (50µl) de solución de parada para cada
pozo y mezcle ligeramente (por 15-20 segundos).
11. Lea la absorbancia en cada pozo de cada pozo a 450 nm
(usando una longitud de onda de 620-630 nm para minimizar
las imperfecciones del pozo) en un lector de microplaca.
Los resultados deberán ser leídos dentro de los 30 minutos
siguientes a la adición de la solución de parada.
Nota: Para reprocesar muestras con concentraciones mayores
de 7.5 ng/ml, pipetear 25µl de muestra y 25µl del suero de
referencia 0 dentro del pozo de la muestra (esto mantiene una
concentración uniforme de la proteína). Multiplicar el valor
leído por 2 y obtendrá la concentración de Triyodotironina.
Calculos: Una curva dosis respuesta es usada para determinar
la concentración de Tiroxina en especímenes desconocidos.
Valores de Referencia: 0.52 - 1.85 ng/ml