CÓDIGO:

SGC.DI.505
GUIA PARA LAS PRÁCTICAS DE VERSIÓN: 2.0
FECHA ULTIMA REVISIÓN:

LABORATORIO, TALLER O CAMPO. 12/04/2017

Ciencias de la Vida y de la
DEPARTAMENTO: CARRERA: Biotecnologia
Agricultura
PERíODO Octubre 2018
ASIGNATURA: Inmunologia NIVEL: 7mo
LECTIVO: Febrero 2019
DOCENTE: Marbel Torres, PhD NRC: 5303, 5304, 5509 PRÁCTICA N°: 2

LABORATORIO DONDE SE DESARROLLARÁ LA PRÁCTICA Laboratorio de docencia de Biotecnología

TEMA DE LA
OBTENCION DE LINFOCITOS Y SU VIABILIDAD CELULAR
PRÁCTICA:
INTRODUCCIÓN:

La sangre se compone de una suspensión de células especiales en

líquido llamado plasma. Un linfocito es un pequeño glóbulo blanco,
normalmente de 7 a 8 micrómetros de longitud presente en la sangre.
Son las únicas células sanguíneas que pueden transformarse en
células que proliferan activamente. Los linfocitos se originan a partir
del tejido linfático en todo el cuerpo. Estos linfocitos recogidos de la
sangre han estado en uso frecuente en el campo de la inmunología.
Ayuda a proteger el cuerpo de enfermedades, invasión de cuerpos
extraños, tumores e infecciones. Por ejemplo, se utilizan linfocitos
para estudios inmunológicos dirigidos a antígenos de
histocompatibilidad e inmunidad celular. Los linfocitos también se
usan para determinar la blastotransformación de linfocitos o para
determinar la proporción de células T en células B, y para tratar de
separar células T auxiliares y células T supresoras de células T.
El proceso típico para llevar a cabo la separación de linfocitos es la
centrifugación por gradiente de densidad. La centrifugación es el
método comúnmente usado para procesar la sangre de modo que las
células y partículas del mismo tamaño, forma y densidad sedimenten como zonas separadas sin convección. La sangre
entera puede fraccionarse de forma fácil y reproducible en diferentes componentes mediante centrifugación diferencial y
extracción selectiva. Los componentes sanguíneos separados pueden utilizarse posteriormente para sus respectivas
aplicaciones clínicas y científicas e investigaciones. Se han utilizado medios de densidad acuosos con centrifugación
para separar y aislar diferentes tipos de células sanguíneas. La separación de linfocitos de sangre entera usando
HISTOPAQUE-1077 se basa en un método descrito por primera vez por Boyumina en 1968. El medio de separación,
HISTOPAQUE-1077, es una solución acuosa de un polisacárido de alto peso molecular y diatrizoato de sodio,
compuesto aniónico no iónico, ajustado a un Densidad de 1,077 ± 0,001. Este medio facilita la recuperación rápida de
linfocitos viables a partir de pequeños volúmenes de sangre.

OBJETIVOS:

Aislar los linfocitos de la sangre entera mediante el método de centrifugación con gradiente de densidad

MATERIALES:
REACTIVOS: 100ML Alcohol INSUMOS: 10 Tubos tapa morada
400 ml Solución salina 5 Agujas/ vacutainer
 CÓDIGO: SGC.DI.505
GUIA PARA LAS PRÁCTICAS DE VERSIÓN: 2.0
FECHA ULTIMA REVISIÓN:

LABORATORIO, TALLER O CAMPO. 12/04/2017

400 ml PBS 1X 10 Jeringas/ Torundas
25 ml Ficoll histopque 5 Torniquete
25 ml Limphoprep 10 Tubos de ensayo de 15ml plásticos
1 ml Azul de trypan 10 Tubos de ensayo de 50ml plásticos
10 Pipetas 10ML desechables
10 Pipetas Pasteur
5 Gradillas de tubos de 15mL y de 50ml
5 cajas Puntas para todas la micropipetas 1000ul, 200ul, 10ul
20 Tubos de 2ML
EQUIPOS:
1 Centrifuga para tubos de 15ML, 14 microscopios, 6 Camaras de Nuebauer, 5 Juegos de Micropipetas todas medidas , pipeteador
automatico,
MUESTRA:
Sangre venosa con anticoagulante EDTA (tubo morado)
INSTRUCCIONES:

ACTIVIDADES POR DESARROLLAR:

1. Se recogen 10 ml de sangre de la vena del paciente con heparina
2. pasar 4ml de sangre a tubos de 15ml
3. Realizar una dilución 1: 1 de sangre entera con 1X PBS
4. Cuidadosamente subyacente 3 ml de histopaque-1077. Y 6 ml de
sangre diluida se transfiere a un tubo de 15 ml.
5. Centrifugar inmediatamente a 1800 rpm [700 g] durante 20 min en una
centrífuga de enfriamiento (4ºC).
6. Retire cuidadosamente el tubo de la centrífuga, observando las tres
capas: la parte superior es sobrenadante claro, el medio es líquido
opaco que contiene las PBMC, y el fondo es RBC.
7. Eliminar cuidadosamente y descartar el sobrenadante dentro de 15 ml
de la capa opaca de las PBMC. Rápidamente transfiera la capa de
capa blanda de PBMC (alrededor de 3 ml) en un nuevo tubo de 15ml.
8. Añadir 1x PBS a la suspensión de PBMC para obtener un volumen final de 5 ml. Mezclar bien y centrifugar a
1800 rpm durante 10 min en una centrífuga de enfriamiento (4 ° C).
9. S desecha el sobrenadante y resuspende en 1ml y pasar a un tubo 2ML
10. Tomar una alícuota para conteo de linfocito en cámara de Neubaeur con una dilución de trypan Blue para
verificar viabilidad celular
11. Resto del tubo centrifugar eliminar sobrenadante y congelar el precipitado bine etiquetado.
12. Opcional. Alícuota 1ml de suspensión celular por vial (vial criogénico). Almacenar a 80 ° C durante la noche.
Transferencia del día siguiente en el cryofreezer líquido del nitrógeno. opcional
 CÓDIGO: SGC.DI.505
GUIA PARA LAS PRÁCTICAS DE VERSIÓN: 2.0
FECHA ULTIMA REVISIÓN:

LABORATORIO, TALLER O CAMPO. 12/04/2017

RESULTADOS OBTENIDOS:
Desarrolle el siguiente cuestionario:
1. Otra técnica de separación de linfocitos
2. Explique la centrifugación zonal y isopicnica
3. Medidas de bioseguridad en tomas de sangre en humanos y en animales, así como el transporte de
muestras.
4. Métodos de criogenización y medios usados para ese fin
Par que nos sirve hacer la diferenciación de células?? Con que otras sustancias o quimicos se realizan estos procesos
CONCLUSIONES:
Se extrajo los linfocitos y se congelaran para uso posterior como cuantificacion y viabilidad

RECOMENDACIONES:
Cuidado del manejo de muestras de sangre y su respectivo desecho biologico
Equilibrar bien los tubos den la centrifuga
No mezclar las fases despues de la centrifugación
No mezclar las fases en la primera etapa
FIRMAS

F: ……………………………………………. F: ………………………………………………. F: ……………………………………………………

Nombre: MARBEL TORRES,PHD Nombre: VALERIA OCHOA Nombre: Patricia Jiménez, PhD
COORDINADOR DE ÁREA DE COORDINADOR/JEFE DE LABORATORIO DE
DOCENTE RESPONSABLE CONOCIMIENTO DOCENCIA