ESTUDOS MOLECULARES DAS VIAS DE SINALIZAÇÃO mTOR E TAU NAS DISPLASIAS CORTICAIS FOCAIS

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
MARCELLA GONÇALVES MAZUTTI
“ESTUDOS MOLECULARES DAS VIAS DE

SINALIZAÇÃO mTOR E TAU NAS DISPLASIAS
CORTICAIS FOCAIS”
CAMPINAS
2015
“ESTUDOS MOLECULARES DAS VIAS DE

SINALIZAÇÃO mTOR E TAU NAS DISPLASIAS
CORTICAIS FOCAIS”
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da

Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos
para a obtenção do título de Mestra em Ciências.
Orientadora: Profa. Dra. Iscia Teresinha Lopes Cendes

Coorientador: Prof. Dr. Fabio Rossi Torres
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL

DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO DEFENDIDA PELA
ALUNA MARCELLA GONÇALVES MAZUTTI E ORIENTADA
PELA PROFA. DRA. ISCIA TERESINHA LOPES CENDES.
CAMPINAS
2015
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE MESTRADO
ORIENTADOR: PROF. DRA. ISCIA TERESINHA LOPES CENDES
COORIENTADOR: PROF. DR. FABIO ROSSI TORRES
MEMBROS:
1. PROFA. DRA. ISCIA TERESINHA LOPES CENDES
2. PROF. DR. FABIO ROGERIO
3. PROFA. DRA. ANA LUCIA BRUNIALTI GODARD
Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Médica da Faculdade de Ciências

Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora

encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
Data: DATA DA DEFESA 20/10/2015

AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, que esteve sempre me dando forças e guiando o

meu caminho.
A minha orientadora, Drª Iscia Lopes Cendes, pela confiança e oportunidade de
aprender com uma grande equipe e fazer parte de um laboratório de excelência.
Ao meu coorientador, Dr. Fabio Rossi Torres, por ter me passado seu enorme
conhecimento, pela sua confiança, paciência e atenção.
Aos Drs. Benilton Carvalho e Rodrigo Secolin, por toda a ajuda e suporte na
realização das etapas de bioinformática.
A Simoni e a Patrícia Aline por todos os ensinamentos, apoio e paciência.
As equipes de neurocirurgia e patologia do Hospital das Clínicas da Unicamp, as

quais nos ajudaram com a obtenção das amostras e nos deram todo o suporte
necessário.
Aos pacientes e familiares, que concordaram em participar da pesquisa, permitindo
que esse trabalho fosse realizado.
A FAPESP pelo apoio financeiro durante a realização deste mestrado.
A minha mãe e minha avó, Roseli e Leda, por serem sempre tão essenciais,
caminhando junto comigo, me apoiando, incentivando e sempre acreditando em
mim. Ao meu namorado, Pedro, por sempre ter estado ao meu lado, por todos os
conselhos, apoio, carinho, compreensão e por ter sido sempre tão importante pra
mim durante essa etapa.
As amigas que ganhei no laboratório, Amanda Donatti, Amanda Canto e Camila,
com as quais partilhei muitas conversas e bons momentos.
A todos os outros amigos e companheiros dos Laboratórios de Genética Molecular,
Citogenética, Zebrafish e Bioinformática, por terem sido sempre tão especiais.
Muito obrigada!
Marcella G. Mazutti
RESUMO
As epilepsias constituem um dos grupos de doenças neurológicas graves

mais frequentes, afetando de 1,5 a 2% da população mundial. Diversos tipos de
malformações do desenvolvimento cortical (MDC) podem causar epilepsia e estão
associadas à ocorrência de crises refratárias, incluindo a Displasia Cortical Focal
(DCF). Esta se caracteriza por alterações citoarquiteturais, também observadas em
outras MDC, como na Esclerose Tuberosa (ET) e na Hemimegaencefalia (HME).
Semelhanças histológicas sugerem mecanismos patológicos comuns entre esses
três distúrbios. A DCF, a ET e a HME também compartilham características
relacionadas com uma sinalização anômala da via mTOR. Além da mTOR, há
associação da via Tau com a DCF, decorrente da presença dos agregados de Tau,
os quais também são identificados na doença de Alzheimer. Desta forma, sugere-se
que a compreensão dos mecanismos patogênicos da DCF pode ser obtida através
dessa relação com distúrbios similares. Já foi comprovada a relação entre ET, HME
e mutações em mosaicismo. Além das alterações de sequência no DNA genômico,
também tem sido descritas alterações genômicas estruturais, denominadas de Copy
Number Variations (CNV), estas variações estão associadas com diversos distúrbios
neurológicos, que vão desde transtornos psiquiátricos até malformações do córtex
cerebral, como a DCF. Alguns estudos já identificaram variações estruturais em
pacientes com DCF e HME. . Portanto, o objetivo principal deste trabalho foi
investigar se mutações em mosaicismo nos genes das vias mTOR e Tau, além
de alterações estruturais (CNVs) que se localizam nestes e em outros
genes, estão envolvidas com os mecanismos patológicos da DCF. Para tal,
utilizamos como estratégia de sequenciamento o Deep Sequencing por next
generation sequencing tecnology (NGS), sendo sequenciado o DNA genômico de
tecidos cerebrais provenientes de cirurgia e do sangue periférico dos pacientes com
DCF, para aferir se o mosaicismo é restrito ao Sistema Nervoso Central. Para a
identificação de CNVs, utilizamos o kit CytoScan HD (Affymetrix). As análises, foram
realizadas com o software Chromosome Suite (Affymetrix). Pelo sequenciamento de
quatro pacientes (sangue x tecido), identificamos um total de 758 alterações na via
mTOR, sendo destas, 30 alterações em mosaicismo – 13 presente apenas no tecido
displásico e 17 presente apenas no sangue. Na via Tau, identificamos um total de 38
alterações, e destas, 7 estão em mosaicismo – 4 presente apenas no tecido
displásico e 3 presente apenas no sangue. Além disso, investigamos a presença de
CNVs em seis pacientes, tanto no tecido cerebral contendo a DCF como no sangue.
Foram identificados um total de 131 CNVs. Deste total, 13 CNVs ainda não foram
descritas no banco de dados Database of Genomic Variants (DGV). Portanto,
podemos concluir que nossos resultados demonstram claramente que mutações em
genes da via mTOR e TAU estão presentes em estado de mosaico no tecido com
DCF. Apesar de estudos adicionais que confirmem a relação causal entre essas
mutações e a etiologia da DCF serem necessários, nossos resultados acrescentam
dados importantes que apoiam as evidências atuais apontando a participação das
vias mTOR e TAU na fisiopatogênese das DCFs.
ABSTRACT
Epilepsy is one of the most common neurological diseases, affecting 1.5 -2.0 %
of the world population. Several types of malformations of cortical development
(MCD), including Focal Cortical Dysplasia (FCD), cause epilepsy and are associated
with the occurrence of refractory seizures. FCD is characterized by cortical
architecture abnormalities observed in other MCDs, such as Tuberous Sclerosis (TS)
and Hemimegalencephaly (HME). FCD, TS and HME also show aberrant expression
of genes belonging to mTOR signaling pathway. Potential involvement of Tau
pathway has also been reported in patients with FCD, due to the presence of tau
aggregates, which are also identified in Alzheimer's disease. Therefore, the similarity
in histological features and molecular pathways suggests that pathogenic
mechanisms could be common to these three disorders. Furthermore, somatic
mosaic mutations have been identified in patients with TS and HME. In addition to
sequence variants , genomic structural variations called Copy Number Variations
(CNV) have also been reported as a source of DNA variation which could be
associated to disease. These variations are associated with many neurological
disorders ranging from psychiatric disorders to malformations of the cerebral cortex,
such as DCF. Some studies have identified structural variations in patients with DCF
and HME.. Therefore, the main objective of this project is to investigate whether
somatic mosaic mutations in genes belonging to the mTOR and Tau pathways, as
well as, structural variations (CNVs) located in these and other genes could be
involved in the molecular mechanisms leading to FCD. Deep Sequencing by
NGS was performed in genomic DNA of both, FCD resected brain tissue and
peripheral blood of patients in order to assess whether the somatic mutations are
restricted to the central nervous system. CytoScan HD Kit (Affymetrix) was used for
the identification of CNVs and Chromosome Analysis Suite (Affymetrix) was used for
data analyzes. DNA sequencing was performed in four patients with FCD in both,
samples resected brain tissue and peripheral blood. We identified a total of 758
variants in genes belonging to the mTOR pathway, 30 of these variants were found in
a mosaic state - 13 were exclusively present in brain tissue and 17 were present only
in blood DNA. In genes belonging to Tau pathway, we identified a total of 38
variants,seven of them were in a mosaic state - four were only present in brain tissue
and three were present only in the blood DNA. In addition, we investigated the
presence of CNVs in six patients in both, FCD resected brain tissue and peripheral
blood. We identified a total of 131 CNVs and 13 CNVs have not yet been described
in the Database of Genomic Variants (DGV). Therefore, we conclude that sequence
variants in a mosaic state, as well as putative CNVs are indeed present in tissue
resected from patients with FCD. Although additional studies are needed in order to
unequivocally determine that these DNA variations are indeed causative of the
molecular abnormalities which ultimately lead to FCD, the present work have
contributed significantly by adding additional evidence supporting the involvement of
mTOR and Tau pathways in the mechanisms leading to FCD.
LISTA DE ABREVIATURAS
MDC: Malformação do desenvolvimento cortical DCF: Displasia Cortical Focal
ET: Esclerose Tuberosa HME: Hemimegaencefalia
CNV: Copy Number Variations
NGS: Next Generation Sequencing

LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Relação de todos os pacientes que foram sequenciados.
Tabela 2. Parâmetros de qualidade dos DNAs de tecido cerebral e sangue antes de

iniciar o preparo das bibliotecas.
Tabela 3. Resultados da concentração em ng/ul da quantificação fluorométrica do

DNA pelo Qubit. Essa quantificação se realiza após a etapa de Clean up da PCR e
antecede a etapa na qual fazemos o pool de todas as amostras.
Tabela 4. Relação das médias dos valores de cobertura de todos os genes

analisados, das vias mTOR e Tau, incluindo regiões de íntron e exon e das médias
dos valores de cobertura de todas as variantes identificadas somente nos exons.
Tabela 5. Tabela detalhada de todas as 13 variantes que apareceram na forma de

mosaicismo na via mTOR – presentes apenas no tecido cerebral, estando ausentes
no sangue.
Tabela 6. Tabela detalhada de todas as 17 variantes que apareceram na forma de

mosaicismo na via mTOR – presentes apenas no sangue, estando ausentes no
tecido cerebral.
Tabela 7. Tabela detalhada de todas as quatro variantes que apareceram na forma

de mosaicismo na via Tau – presentes apenas no tecido cerebral, estando ausentes
no sangue.
Tabela 8. Tabela detalhada de todas as três variantes que apareceram na forma de

mosaicismo na via Tau – presentes apenas no sangue, estando ausentes no tecido
cerebral.
Tabela 9. Tabela contendo todos os genes da via mTOR nos quais foram
identificadas variantes em mosaicismo, especificando para cada gene qual a região
ou consequência em que a variante se enquadra. (A) sobre as variantes que foram
identificadas apenas no tecido cerebral. (B) sobre as variantes que foram
identificadas apenas no sangue.
Tabela 10. Tabela contendo todos os genes da via Tau nos quais foram identificadas
variantes em mosaicismo, especificando para cada gene qual a região ou
consequência em que a variante se enquadra. (A) sobre as variantes que foram
identificadas apenas no tecido cerebral. (B) sobre as variantes que foram
identificadas apenas no sangue.
Tabela 11. Relação de todos os pacientes que foram utilizados para a análise de
CNVs e para a análise do sequenciamento. Observando que os quatro primeiros
pacientes foram utilizados tanto para a análise de CNVs como do sequenciamento, e
os dois últimos foram adicionados posteriormente, sendo assim utilizados somente
para a análise de CNVs.
Tabela 12. Relação de todos os pacientes que foram analisados para CNVs.
Podemos notar o registro de DNA das amostras de tecido cerebral e de sangue
periférico que se pareiam. Para cada paciente, temos a informação do sexo e do tipo
histopatológico de Displasia Cortical Focal.
Tabela 13. Todas as alterações estruturais, denominadas Copy Number Variations,

que foram identificadas em seis pacientes, pareando amostras de tecido cerebral e
sangue para um mesmo paciente. Os registros de DNA que aparecem na mesma
cor, simbolizam que são amostras do mesmo paciente, uma delas proveniente de
tecido cerebral e a outra de sangue.
Tabela 14. Apresentação dos cálculos das CNVs da tabela 11. As médias e o range
foram calculados a partir do tamanho dos fragmentos (kbp).
Tabela 15. Relação de todas as alterações estruturais (CNVs) identificadas e que
não são descritas no banco de dados DGV, especificando o tipo de alteração, sua
localização, seu tamanho e os genes abrangidos. As cores iguais simbolizam
amostras de tecido e sangue dos mesmos pacientes. As setas indicam as alterações
que aparecem na forma de mosaicismo, somente no tecido cerebral.
Tabela 16. Relação de todas as alterações que foram analisadas em 104 indivíduos
controles da população brasileira, especificando os detalhes da alteração e o código
do paciente.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. DNAs de sangue (A) e DNAs de tecido (B) testados em gel de agarose 1%
para verificar a integridade dos mesmos.
Figura 2. Gráficos obtidos como resultado do bioanalyser. No eixo X podemos

observar a quantidade de pares de base (pb) e no eixo Y, a quantidade de moléculas
que obtivemos.
Figura 3. Gráfico obtido como resultado do bioanalyser. Essa técnica nos permite
analisar o tamanho dos fragmentos obtidos pela biblioteca já finalizada. No eixo X
podemos observar a quantidade de pares de base (pb) e no eixo Y, a quantidade de
moléculas que obtivemos. Neste caso, temos como tamanho médio, 351pb.
Figura 4. Cascata da via mTOR retirada do KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes

and Genomes. Todos esses genes foram escolhidos para serem analisados após o
sequenciamento. Os genes em amarelo são aqueles nos quais já foram identificadas
mutações em mosaicismo na HME e os genes em vermelho são aqueles nos quais
já foram identificadas mutações na ET.
Figura 5. Cascata da via Tau retirada do KEGG: Kioto Encyclopedia of Genes and
Genomes. Dentre todos os genes dessa via, os genes em amarelo foram aqueles
escolhidos para serem analisados, em decorrência de estes serem os genes
relacionados com a doença de Alzheimer, a qual compartilha com as DCFs a
presença dos agregados de Tau.
Figura 6. Esquema simplificativo das variantes identificadas na via mTOR.
Figura 7. Esquema simplificativo das variantes identificadas na via Tau.

Figura 8. Análise de predição pelo programa Human Splicing Finder, comparando a
sequência de referência com a sequência mutada do gene ULK2, na qual podemos
observar a mudança do nucleotídeo que dá início à região codificante como
consequência da alteração do sítio de splicing.
Figura 9. Regiões do gene ULK2 consideradas como sendo potenciais sítios de

splicing, pelo programa Humam Splicing Finder. A região na qual se encontra a
variante identificada está destacada em vermelho.
Figura 10. Comparação das proteínas geradas a partir da sequência do gene ULK2
normal e do ULK2 com a variante identificada (deleção de um nucleotídeo T). Pela
comparação das figuras, podemos observar o stop códon gerado como
consequência da variante, originando uma proteína truncada.
Figura 11. Análise de predição pelo programa Human Splicing Finder, comparando
a sequência de referência com a sequência mutada do gene EIF4E, na qual
podemos observar a mudança do nucleotídeo que dá início à região codificante
como consequência da alteração do sítio de splicing.
Figura 12. Regiões do gene EIF4E consideradas como sendo potenciais sítios de
splicing, pelo programa Humam Splicing Finder. A região na qual se encontra a
variante identificada está destacada em vermelho.
Figura 13. Comparação das proteínas geradas a partir da sequência do gene EIF4E
normal e do EIF4E com a variante identificada (deleção de um nucleotídeo T). Pela
comparação das figuras, podemos observar o stop códon gerado como
consequência da variante, originando uma proteína truncada.
Figura 14. Resumo de todas as variantes identificadas no paciente 541/12 – P19,

nos genes: ULK2, EIF4E, TSC1.
Figura 15. Resumo de todas as variantes identificadas no paciente 44/11 – P13, nos
genes: ULK2, EIF4E e ULK1.
Figura 16. Visualização dos produtos de PCR em gel de agarose 2%. Amostras
aleatórias. Nas laterais podemos ver o marcador de peso molecular de 100pb.
Figura 17. Visualização dos produtos da fragmentação em gel de agarose 2%.

Amostras aleatórias. Nas laterais, o marcador de peso molecular 50bp. A última
canaleta corresponde ao controle positivo.
Figura 18. Análise de alta resolução da alteração estrutural no cromossomo 1 do

indivíduo P16. Essa mesma alteração também aparece nos indivíduos P13 e P19.
Notar na parte superior da figura a barra em vermelho que representa a variação no
número de cópias do indivíduo, vermelho representando alteração de perda e azul
de ganho. Logo abaixo podemos observar barras em vermelho e azul que são as
variações já descritas em bancos de dados e não associadas a quadros patológicos.
Também na parte inferior, encontramos os genes englobados pela variação:
C1orf63, RHD, TMEM50A, RHCE, TMEM57.
Figura 19. Alteração estrutural encontrada no banco de dados ISCA que se

sobrepõe a alteração estrutural de uma deleção de 187kbp identificada neste
trabalho.

indivíduo P3. Notar na parte superior da figura a barra em vermelho que representa
a variação no número de cópias do indivíduo, vermelho representando alteração de
perda e azul de ganho. Logo abaixo podemos observar que não existem variações
que já são descritas em bancos de dados e não associadas a quadros patológicos.
Também na parte inferior, encontramos os genes englobados pela variação: BMP7,
MIR4325, SPO11, RAE1

indivíduo P3. Notar na parte superior da figura a barra em azul que representa a
variação no número de cópias do indivíduo, azul representando alteração de ganho
e vermelho de perda. Logo abaixo podemos observar que não existem variações
que já são descritas em bancos de dados e não associadas a quadros patológicos.
Também na parte inferior, encontramos os genes englobados pela variação: CRTC1,
COMP, UPF1.
Figura 22. Nesta figura podemos observar, na barra em azul, a alteração estrutural
descrita no Decipher , uma duplicação de 188,06 kbp com um fenótipo que inclui
crises generalizadas e a qual se sobrepõe a alteração estrutural identificada neste
trabalho, que se trata de uma duplicação de 140 kbp. Mais a cima podemos observar
todos os cinco genes que essa alteração descrita abrange, sendo três deles em
comum com a alteração que nós identificamos: CRTC1, COMP e UPF1.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO. ..................................................................................... 19
1.1 Epilepsias e Malformações do Desenvolvimento Cortical...... 19
1.2 Displasias Corticais Focais ...................................................... 20
1.3 Malformações do Córtex Cerebral e Vias mTOR e Tau ........... 21
1.4 Displasias Corticais Focais: Estudos Genéticos e Vias
Moleculares .. 23
1.5 Displasia Cortical Focal e Mutações em mosaicismo nas
vias mTOR e Tau. 24
2. OBJETIVOS .......................................................................................... 27
2.1 Objetivos gerais ........................................................................... 27
2.2 Objetivos específicos ............................................................... 27
3. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................ 28
3.1 Pacientes e Amostras................................................................ 28
3.2 Extracão de DNA........................................................................ 29
3.2.1 Extração de DNA de sangue periférico ................................ 29
3.2.2 Extração de DNA de tecido cerebral congelado ..................30
3.3 Preparação da Biblioteca de Genes candidatos utilizando
Nextera® Expanded Kit (Illumina®) ................................................ 30
3.3.1 Tagmentação do DNA genômico ........................................ 31
3.3.2 Purificação do DNA genômico tagmentado ........................ 31

3.3.3 Amplificação por PCR .......................................................... 32
3.3.4 Purificação da PCR ................................................................. 32
3.3.5 Primeira Lavagem ................................................................... 33
3.3.6 Primeira Hibridação ................................................................ 33
3.3.7 Segunda Hibridação ...............................................................35
3.3.8 Segunda Lavagem ..................................................................35
3.3.9 Amplificação por PCR ..........................................................35
3.3.10 Validação da Biblioteca Enriquecida...................................36
3.3.11 Clusterização e Sequenciamento de Nova Geração .......... 37
3.4 Bioinformática................................................................................ 38
3.5 Análise de predição ................................................................... 38
3.6 Detecção de Copy Number Variations (CNVs) ......................... 39
3.6.1 Purificação das amostras de DNA......................................... 39
3.6.2 Digestão das amostras de DNA com a enzima NspI............39
3.6.3 Reação de ligação com adaptadores .................................... 40
3.6.4 Amplificação dos fragmentos por PCR .................................40
3.6.5 Purificação .................................................................................. 40
3.6.6 Quantificação ..............................................................................41
3.6.7 Fragmentação ............................................................................. 41
3.6.8 Marcação do DNA ...................................................................41
3.6.9 Hibridação ................................................................................... 42
3.6.10 Lavagem .................................................................................... 42
3.6.11 Escaneamento .......................................................................... 42
3.6.12 Análises .....................................................................................42

4. RESULTADOS ............................................................................................. 44
4.1 Next Generation Sequencing .................................................... 44
4.1.1 Variantes em Mosaicismo ...................................................... 52
4.1.2 Variantes Germinativas Relevantes ...................................... 65
4.1.3 Resumo das variantes encontradas ...................................... 66
4.1.3.1 Paciente 541/12 – P19 .......................................................... 66
4.1.3.2 Paciente 44/11 – P13 ............................................................ 68
4.2 Análise de Copy Number Variations (CNVs) ............................ 69
4.2.1 Pacientes P13, P16 e P19 ....................................................... 76
4.2.2 Paciente P3................................................................................ 79
5. DISCUSSÃO ................................................................................................ 83
5.1 Alterações Pontuais .................................................................. 83
5.1.1 Paciente 541/12 – P19 ............................................................. 83
5.1.2 Paciente 44/11 – P13 ............................................................... 87
5.2 Alterações Estruturais (CNVs) .................................................. 88
5.2.1 Pacientes 44/11 – P13 ; 541/12 – P19 e 193/13 – P16 ........... 89
5.2.2 Paciente 9/14 – P3 ................................................................... 90
6. CONCLUSÃO .............................................................................................. 92
6.1 Alterações de Sequência .......................................................... 92
6.2 Alterações Estruturais ............................................................... 93
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................ 94
ANEXOS .......................................................................................................... 99
19
1. INTRODUÇÃO
1.1 Epilepsias e Malformações do Desenvolvimento Cortical
As epilepsias constituem um dos grupos de doenças neurológicas graves mais

frequentes, afetando de 1,5 a 2% da população mundial [1]. São consideradas como
um distúrbio crônico caracterizado pela presença de crises epilépticas recorrentes
que são resultantes de descargas elétricas neuronais excessivas e anormais em
determinada área do encéfalo [2;3]. As epilepsias possuem grande variedade de
manifestações clínicas, etiologias, graus variados de morbidade e prognóstico [4].
Em 1996, o termo malformações do desenvolvimento cortical (MDC) foi
introduzido para designar um grupo comum de desordens em crianças com retardo
no desenvolvimento e em indivíduos com epilepsia [5]. Desde então, muitos estudos
foram realizados e hoje sabemos que as MDC englobam um amplo espectro de
distúrbios, com diversas etiologias e manifestações clínicas. As malformações
corticais compreendem uma importante causa de epilepsia, estimando-se que esteja
presente em até 40% das crianças com epilepsia refratária. [6].
Para compreender as MDC, é importante entender as bases da embriologia do
córtex cerebral. O desenvolvimento cortical envolve um conjunto de eventos
complexos e organizados que normalmente são divididos em três grandes estágios:
proliferação neuronal, migração e diferenciação. A interrupção ou anormalidades
nestes diversos estágios podem resultar em MDC [7]. Portanto, existem pelo menos
três ocasiões principais pelas quais as MDC podem se desenvolver e que refletem
as etapas embriológicas de formação do córtex: (1) anormalidades da proliferação e
diferenciação de neurônios e da glia; (2) anormalidades na migração neuronal e (3)
distúrbios na organização cortical [8]. A etiologia dessas malformações, muitas vezes
multifatorial, pode ser resultante de mutações genéticas ou influências ambientais
que ocorrem na fase de desenvolvimento cortical no ambiente intraútero. O tempo, a
gravidade e o tipo de influência ambiental, bem como de fatores genéticos,
determinarão o tipo e a extensão da síndrome. [9; 10]
20
1.2 Displasias Corticais Focais
Vários tipos de malformações corticais podem ser causa de epilepsia, desde

anormalidades difusas e multifocais, até lesões focais e isoladas, grupo da qual
fazem parte as displasias corticais focais (DCFs) [11; 12]. As DCFs podem ocorrer
em qualquer parte do cérebro, no entanto é mais comum localizar-se no lobo frontal
e temporal [13].
A incidência de DCF pode variar entre 2 a 36% em grupos de pacientes
submetidos à cirurgia para tratamento da epilepsia. Esse distúrbio se associa
com crises refratárias, que acometem de 70 a 90% dos pacientes [14]. Também
tem sido reconhecida como causa de refratariedade das crises em crianças, sendo
identificada em até 25% dos casos [11]. Para a maior parte dos pacientes, as crises
se iniciam até os 11 anos de idade. Esse distúrbio representa uma das maiores
causas de epilepsia focal de difícil controle e uma das causas mais graves de
epilepsia na infância [15; 16].
As DCFs são caracterizadas como uma malformação heterogênea e
resultante de várias causas [17]. Disfunções tanto na fase de proliferação, como de
diferenciação podem ocorrer. Patologicamente, as DCFs apresentam uma gama de
alterações citoarquiteturais, que vão desde sutis deslaminações corticais com
posicionamento errôneo dos neurônios, até profundas áreas de desorganização que
podem resultar na ausência de laminação cortical [18; 19]. Em casos de DCF do tipo
I, a arquitetura laminar é rompida em padrões radiais ou tangenciais, sendo que em
casos de DCF do tipo II ocorre tanto uma laminação anormal ou ausente, como
também é marcada pela desorganização do citoesqueleto [20], com a presença de
células gigantes (citomegalia) na qual a célula é 1,5-2 vezes maior do que as células
neuronais normais. Estes tipos de células incluem neurônios dismórficos - os quais
caracterizam as DCFs dos subtipos IIA e IIB - e as células em balão, que exibem
uma forma ovóide, com o núcleo lateralmente deslocado e projeções dentríticas ou
axonais limitadas, as quais caracterizam somente a DCF do subtipo IIB. Esses tipos
celulares que definem as DCFs IIA e IIB – neurônios dismórficos e células em balão -
também são observados em outras malformações corticais, como nos tubérculos
corticais da Esclerose Tuberosa (ET) e na Hemimegaencefalia (HME) [21, 22, 23].
21
Essas semelhanças histológicas apontam para mecanismos

patológicos provavelmente compartilhados entre a DCF (tipo IIA e IIB), ET e HME.
1.3 Malformações do Córtex Cerebral e Vias mTOR e Tau
A via da rapamicina em mamíferos (mTOR) é caracterizada por uma cascata de

reações cuja funções são essenciais para as células, tais como proliferação,
crescimento, migração e morte celular. A via mTOR é altamente conservada entre
muitas espécies, incluindo fungos, Drosophilla, Caenorhabditis elegans, roedores e
humanos. A cascata de sinalização da mTOR está envolvida na manutenção da
homeostase celular e metabolismo energético (disponibilidade de nutrientes e
estresse oxidativo), proliferação e sobrevivência (fatores de crescimento),
diferenciação e migração (sinalização Wnt e organização do citoesqueleto) e
inflamação [24; 25; 26].
A via mTOR é dividida em duas subvias não sobrepostas: mTOR complexo 1
(mTORC1) e mTOR complexo 2 (mTORC2) [27]. A via mTORC1 está relacionada
com moléculas efetoras de fatores de crescimento. A via mTORC2 desempenha um
papel de regulação indireta sobre a mTORC1 e também está associada a actina,
responsável pela organização do citoesqueleto [28].
A sinalização da via mTOR tem sido identificada como um dos principais
fatores regulatórios do desenvolvimento cortical e da diferenciação neuronal,
sendo que ela continua funcionalmente ativa durante a vida adulta, mantendo o
metabolismo celular, a reorganização sináptica e o processo de autofagia celular [29-
32].
A descoberta de que a DCFIIB tem a via mTOR anormalmente ativa, forneceu
a primeira evidência de que mecanismos moleculares durante o desenvolvimento
cerebral estão atuando para o desenvolvimento da DCFIIB. Esse aumento da
sinalização da via mTOR foi primeiramente descrito por Baybis et al. [29], sendo
posteriormente confirmada por outros estudos [31-33].
Além da DCFIIB, acredita-se que diversas malformações corticais focais
podem estar associadas a uma sinalização anômala da via mTOR, incluindo a ET e
22
a HME. [31-33]. Essas MDCs focais são agrupadas em um conjunto de

fisiopatologias da via mTOR, que tem como características comuns a ocorrência de
epilepsia e crises de difícil controle, um espectro de déficits neurológicos, alterações
na arquitetura cortical e evidências de ativação da sinalização da mTOR [30].
Estas características em comum fortalecem a ideia de que a DCF pode
ter mecanismos moleculares em comum com a ET e a HME.
Além da via mTOR, existem evidências de que a ativação anormal de

mecanismos essenciais para o desenvolvimento neurológico, pode contribuir em
processos de neurodegeneração [34]. A doença de Alzheimer e outros distúrbios
neurodegenerativos são caracterizados por um processo de hiperfosforilação de
proteínas da via Tau. A fosforilação patológica em Tau é um mecanismo crítico na
neurodegeneração e pode ser mediado por cdk5 e GSK3B, elementos essenciais
em etapas do desenvolvimento cortical [35; 36]. Estudos atuais apontam que o
processo de hiperfosforilação na via Tau é também observado na DCF, sendo que a
região displásica pode ser mais propensa a fosforilação da Tau e a perda de
densidade neuronal. A partir de comparações histológicas de tecidos displásicos em
DCF com tecidos de um córtex normal, foi possível analisar que a hiperfosforilação
de Tau somente se encontrava em neurônios presentes em regiões displásicas. Em
outro experimento do mesmo estudo, neurônios displásicos apresentaram um
aumento de imunorreatividade para os compostos cdk5 e GSK3B, mediadores da
hiperfosforilação. Foi demonstrado, também, que neurônios displásicos têm uma
maior propensão à neurodegeneração relacionada com a idade [37]. Esses
neurônios displásicos são encontrados tanto na DCF do subtipo IIA como do subtipo
IIB [20]. Os mecanismos que predispõem os neurônios displásicos a uma formação
de agregados de Tau são incertos. É sugerido que um possível aumento da
liberação de glutamato - do mesmo modo em que ocorre em casos de crises
epilépticas - resulte em citotoxidade e morte celular. Há também relatos de que as
vias que levam a hiperfosforilação de Tau na doença de Alzheimer também têm um
componente de citotoxidade [38].
Portanto, existem evidências que apontam para uma convergência

entre distúrbios do desenvolvimento do córtex cerebral e doenças
neurodegenerativas, abrindo a possibilidade de que mutações em genes
pertencentes à via de Tau possam estar associadas à DCF IIA e IIB.
23
1.4 Displasia Cortical Focal: Estudos Genéticos e Vias Moleculares
Poucos estudos têm apontado mecanismos genéticos como causa da DCF.

No entanto, como citado anteriormente, trabalhos recentes descreveram uma
atividade anormal de sinalização da via mTOR na DCF, ET e HME. Aumento de
sinalização da mTOR foram primeiramente identificadas em DCF do tipo IIB e em
túberos corticais [29; 31], e subsequentemente em HME [32; 39]. Há também a
potencial associação da via Tau com a DCF, já descrita no item anterior [37].
Ao longo das últimas duas décadas, mecanismos patogênicos têm sido
propostos para DCF, incluindo mutações em mosaicismo, hipóxia isquêmica no
útero, ou toxidade durante o desenvolvimento cerebral intra-uterino, embora
nenhuma causa tenha sido identificada como determinante [41]. Dessa forma, a
compreensão dos mecanismos patogênicos da DCF pode ser obtida pela relação
com outros distúrbios similares e que possuem fisiopatologias mais esclarecidas. A
ET é um distúrbio genético associado com mutações nos genes TSC1 ou TSC2.
Esses genes estão envolvidos com as lesões multifocais (túberos) que possuem
características celulares e histopatológicas muito semelhantes com alguns tipos de
DCF [42]. O papel da via mTOR nos processos moleculares da ET já são claramente
definidos. Os genes TSC1 e TSC2, respectivamente, codificam as proteínas
Hamartina e Tuberina [43], sendo que ambas formam um complexo que tem um
papel inibitório na via mTOR. Como a via mTOR está envolvida em processos
regulatórios de crescimento celular e proliferativos, uma mutação patogênica nos
genes TSC1 e TSC2 pode acarretar em um excessivo crescimento e proliferação
das células, devido a perda ou diminuição da atividade das proteínas codificadas e
da consequente hiperativação da via mTOR [44; 45; 46].
Portanto, a estreita semelhança entre processos anormais de sinalização na
via mTOR e a histopatologia entre DCF e ET, sugere um mecanismo comum
entre esses dois distúrbios. Apesar de nenhuma mutação nos genes TSC1 e TSC2
ter sido identificada na DCF, é possível a ocorrência de mutações deletéria em um
estado de mosaicismo somático [41], tanto nesses genes como em outros
pertencentes à via mTOR e que não foram identificadas pelo método de
sequenciamento de Sanger por limitações inerentes ao método, poderia estar
associada a etiologia da DCF.
24
1.5 Displasia Cortical Focal e Mutações em mosaicismo nas vias mTOR e

Tau
Geralmente, as doenças genéticas podem ser causadas por três tipos de

mutações: (1) mutações herdadas, (2) mutações “de novo”, (3) mutações somáticas.
As mutações “de novo” são aquelas que estão presentes na prole, mas não são
identificadas nos pais. Estas surgem esporadicamente no esperma ou no óvulo, mas
não são detectáveis no sangue dos pais, e uma vez transmitidas para o
embrião, estarão presentes em todos os seus tecidos. Outro tipo de mutação que
pode levar ao desenvolvimento de uma fisiopatologia surge durante a divisão
mitótica das células do embrião, aquelas que irão gerar um novo indivíduo. Essas
mutações conduzem a formação de uma conformação em mosaico, pois apenas
algumas das células irão carregar a mutação. Esse tipo de mutação também pode
ser considerado como “de novo”, ao passo que também não são detectáveis nos
pais dos indivíduos afetados, mas são mais especificamente chamadas de mutações
somáticas ou mutações em mosaicismo [47]. Estima-se que a carga de mutações
somáticas nas células de um indivíduo é bastante elevada e diversos estudos
apontam que o cérebro pode abrigar uma variedade delas [48-52]. Esse tipo de
mutação tem sido alvo de muitos estudos em doenças genéticas, estima-se que de 5
a 10% de pacientes com distúrbios do desenvolvimento cerebral estão associados
com mutações em mosaicismo [53; 54]. Muitas MDC focais, como a DCF, ET e HME,
estão sendo estudadas partindo da hipótese de que esses distúrbios podem
ocorrer devido a mutações somáticas surgidas durante o desenvolvimento cerebral
[55].
A HME é uma malformação altamente epileptogênica na qual ocorre o

aumento de apenas um hemisfério do cérebro [56]. Um estudo realizado por Aronica
et al. [39] identificou uma elevação na sinalização da via mTOR em HME, em
neurônios dismórficos e células em balão, porém intrigantemente, essa elevação era
observada em apenas algumas células que caracterizavam esses tipos celulares,
levantando a hipótese de que houve a ocorrência de mutações em estado de
mosaicismo somático em genes regulatórios da mTOR, durante o desenvolvimento
cerebral [39, 30]. Além deste, outro estudo realizado por meio de tecidos cerebrais
obtidos na cirurgia de pacientes com HME levou a identificação de mutações
25
somáticas no AKT3 da via mTOR, um gene altamente expresso durante a

corticogênese. A HME também pode ser resultante de mutações somáticas em
outros genes da via mTOR, incluindo PIK3CA e o próprio MTOR [57;58]. Os
genes PIK3CA, AKT3 e MTOR estão envolvidos nos processos de
crescimento e metabolismo celular [59; 60]. Diversos estudos apontam que a HME
pode ser um distúrbio causado por mosaicismo genético, o qual provavelmente, gera
um aumento na atividade de sinalização PI3K – AKT3 – MTOR, na via mTOR [57;
58].
As mutações em mosaico são dificilmente detectadas pela técnica de
sequenciamento de Sanger. Um exemplo dessa limitação ficou claro em um estudo
que analisou o exoma de três famílias com síndromes de HME. Em um determinado
ponto dos experimentos, foram sequenciados exons de indivíduos afetados que já
haviam sido dados como negativos para mutações, bem como de indivíduos
portadores de mutações conhecidas e indivíduos controles. Esse experimento,
realizado pela estratégia de Deep Sequencing por seqüenciamento de nova geração
confirmou as mutações que já haviam sido identificadas e detectou duas mutações
adicionais, presentes em forma de mosaico e que não foram detectadas pela técnica
de Sanger [57]. Levando em conta que mutações em mosaicismo, especialmente
aquelas que acometem células do cérebro, podem contribuir para o desenvolvimento
de doenças complexas com fatores genéticos envolvidos, a possibilidade de detectá-
las representa um grande desafio e toda uma gama de novas perspectivas para a
utilização das tecnologias de sequenciamento de nova geração [47].
Além das mutações pontuais, outro tipo de variação no genoma também é
bastante relevante. As variações do número de cópias (Copy Number Variations –
CNV) são as alterações estruturais que mais prevalecem no genoma humano, tendo
sido frequentemente encontradas na população [61]. A literatura apresenta alguns
trabalhos que relacionam as CNVs com distúrbios do sistema nervoso central (SNC),
sendo que CNVs patogênicos são encontrados em 14-18% de pacientes com
retardo mental e outros distúrbios relacionados ao SNC [62]. Conti et al identificaram
um paciente com DCF que carregava uma trissomia da região cromossômica
1q21.1-q44. A trissomia foi identificada em tecido cerebral, mas se encontrava
ausente no sangue ou saliva, sugerindo uma forma de mosaicismo somático. Esse
estudo foi realizado por meio da técnica de microarray, utilizada para a identificação
26
de variações estruturais [63]. Coincidentemente, outro estudo identificou uma

trissomia no cromossomo 1q que abrangia diverso genes, entre eles o AKT3 da via
mTOR, em um paciente com hemimegaencefalia, e também, apenas presente no
tecido cerebral [64]. Em sequencia, análises de himunohistoquímica em tecido
cerebral displásico, revelaram hiperativação da via PI3K/AKT/mTOR em neurônios.
Esse fato sugere que CNVs em mosaico do gene AKT3 podem desempenhar um
importante papel na causa de malformações do desenvolvimento cortical, tanto focal,
como aquelas que abrangem todo o hemisfério [63].
Portanto, como já visto anteriormente, o compartilhamento das vias
moleculares entre a DCF, ET e HME pode fornecer pistas importantes sobre a
etiologia das mesmas. Através da comparação de vias e busca de similaridades
funcionais, genes interessantes podem surgir como candidatos a estarem
associados com determinadas condições patológicas.
Sendo assim, as evidências demonstradas realçam a hipótese de
que mutações somáticas em genes que fazem parte da via mTOR podem estar
associadas com o desenvolvimento de outros distúrbios relacionados com
epilepsia, como é o caso da DCF. Além disso, a convergência da DCF com os
mecanismos da via Tau, envolvida em doenças neurodegenerativas, adiciona a
possibilidade de que a DCF pode também estar relacionada com mutações em
mosaicismo na via Tau.
Portanto, seria interessante testar os genes candidatos destas vias pela
estratégia de Deep Sequencing por NGS, e também se existem CNVs envolvidas em
pacientes com DCF utilizando a estratégia de Microarray. A estratégia proposta por
nosso grupo de pesquisa e por este projeto pode revelar novos mecanismos
patogênicos para esta importante malformação do córtex cerebral, que
frequentemente é refratária ao tratamento com drogas anti-epilépticas (DAEs).
27
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivos gerais:
Investigar duas importantes vias de sinalização - mTOR e Tau - nas displasias

corticais focais.
2.2 Objetivos específicos:
Os objetivos específicos foram:
i) Investigar a presença de variantes em mosaicismo, através de Deep Sequencing por

Next Generation Sequencing (NGS).
ii) Investigar a presença de variações estruturais, Copy Numbers Variations, pela

técnica de SNP-Microarray.
28
3. MATERIAIS E MÉTODOS
Para a realização deste trabalho, foi feito o sequenciamento de todos os exons

do genoma (exoma), com a finalidade de analisar, primeiramente, genes das vias
mTOR e Tau. Entretanto, outros genes podem estar envolvidos, desencadeando as
mutações dessas vias e outras mutações, e por esse motivo, a importância de
efetuar o sequenciamento de todos os exons, a fim de gerar dados relevantes para
análises futuras. Primeiramente, foi necessário capturar e enriquecer a sequencia
genômica dos exons (preparação da biblioteca com kits Nextera® Expanded Kit
(Illumina®). As bibliotecas foram feitas a partir do tecido cerebral retirado de cirurgias
e do DNA proveniente de linfócitos. Isso foi necessário para comparar tecido e
sangue, detectando primeiramente, um tipo de mosaicismo mais geral, ou seja, entre
tecidos. Também, queríamos investigar se existiam mutações confinadas apenas no
tecido displásico. O sequenciamento foi realizado em aparelhos Next-Generation
Illumina Hiseq 2500. As sequencias geradas (reads) foram alinhadas com o genoma
de referência e as alterações candidatas foram identificadas e filtradas através de
ferramentas de bioinformática. Posteriormente, aplicamos a técnica de Microarray,
com as mesmas amostras citadas anteriormente, acrescentando amostras de mais
dois pacientes, tanto de tecido cerebral como do DNA proveniente de linfócitos.
Abaixo segue uma descrição detalhada das etapas que foram desenvolvidas:
3.1 Pacientes e Amostras
Todos os pacientes participantes do projeto foram analisados clinicamente por

neurologistas para que tivessem o diagnóstico de DCF sugerido por exames de
ressonância magnética de alta resolução que são interpretados por profissionais com
grande experiência na área de neuroimagem das malformações corticais e
epilepsias (Prof. Dr. Fernando Cendes e equipe, colaboradores desse projeto). As
amostras de tecido displásico foram obtidas durante a cirurgia para controle de
epilepsia refratária e foram congeladas em nitrogênio liquido, sendo posteriormente
encaminhadas ao nosso laboratório. Parte do tecido, foi também retirado à parte e
29
encaminhado para análise histológica e de imunohistoquímica para confirmação e

classificação histológica das displasias (procedimento realizado de rotina como parte
do cuidado clínico aos pacientes operados com epilepsia refratária). Essa parte do
tecido é denominada fragmento espelho, o qual possui as mesmas características do
fragmento que foi encaminhado ao nosso laboratório para análise do DNA. Esta
etapa do projeto foi realizada pelo Laboratório de Técnica Histológica e
Imunohistoquímica do Departamento de Anatomia Patológica da Faculdade de
Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
Até a realização dos experimentos deste trabalho, possuíamos 8 amostras de
pacientes com DCF, sendo quatro provenientes de tecido cerebral (2 do tipo IIA e 2
do tipo IIB) e 4 de sangue periférico (2 IIA e 2 IIB). Posteriormente, obtivemos mais
quarto amostras, sendo 2 delas do tipo IIA e 2 do tipo IIB. Os detalhes desses
pacientes serão descritos mais adiante. Todos os indivíduos cujo material genético
foi utilizado nesse estudo assinaram um formulário de consentimento autorizando a
utilização do material pós- cirúrgico para análise molecular, aprovado pelo Comitê de
Ética da Faculdade de Ciências Médicas da Unicamp (parecer do CEP para projeto
de pesquisa Biorrepositório: Estudos de Genética Molecular em Doenças
Neuropsiquiátricas Fase I (Número do Parecer: 257.020).
3.2 Extração do DNA
3.2.1 Extração do DNA de sangue periférico
O DNA genômico dos pacientes foi extraído através do protocolo manual de

extração por fenol e clorofórmio. Primeiramente, 20 a 30mL de sangue venoso foram
colhidos dos indivíduos. As amostras foram centrifugadas por 10 minutos a 630G e a
parte intermediária, onde se localizam os leucócitos, foi transferida para um tubo de
propileno de fundo cônico. Em seguida foram adicionadas as soluções de RSB 1x
até completar o volume de 11mL e 60µL de Nonidet. Após ser homogeneizada, a
solução foi centrifugada por 10 minutos a 630G e o sobrenadante foi descartado.
Adicionou-se 0,5mL de RSB 1x , 3mL de solução SDS a 10% e 80µL de proteinase
K (100mg/mL). As amostras foram incubadas a 37°C por 24h. Após a incubação,
foram acrescentados 3mL de fenol, seguido de homogenização e centrifugação a
30
630G por 10 minutos. A parte inferior do tubo foi descartada e acrescentou-se 1.5mL
de fenol e 1.5mL de solução de clorofórmio álcool isoamílico, seguidos de
homogenização e centrifugação a 630G por 10 minutos, sendo a parte inferior do
tubo descartada. Este processo foi repetido com 3mL de solução de clorofórmio
álcool isoamílico. O DNA genômico foi então precipitado com 6mL de etanol
absoluto. Em seguida o DNA foi transferido para tubos cônicos de 1.5mL e diluídos
em aproximadamente 200µL de TE 1x.
3.2.2 Extração do DNA de tecido cerebral congelado
Essa extração foi realizada com o protocolo Fenol – Clorofórmio. Os

fragmentos de tecido cerebral displásico foram macerados em Nitrogênio líquido,
acondicionados em microtubos e ressuspendidos em 500μL de tampão de lise (10
mM Tris-HCl pH 8,0, 25 mM EDTA, 100mM NaCl e SDS 1%) e 20μL de proteinase K
(20mg/mL). Posteriormente, foram incubados em banho-maria a 56ºC por duas
horas. Então, o DNA foi purificado com uma solução de Fenol – Clorofórmio (1:1) e
uma vez somente com Clorofórmio. A precipitação foi feita em Isopropanol absoluto
gelado que permaneceu overnight a -20ºC. Em seguida, o Isopropanol foi retirado
por centrifugação e inversão de tubos, e foi possível observar o pellet de DNA, o
qual foi lavado com Etanol 70%, secado a temperatura ambiente e ressuspendido
em 30μL de TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA), as amostras foram tratadas
com 30μg/mL de RNAse, incubadas em banho-maria a 37°C por 60 minutos e
armazenadas a -20°C.
3.3 Preparação da Biblioteca de Genes candidatos utilizando Nextera®

Expanded Kit (Illumina®)
O protocolo para enriquecimento dos exons e preparação das bibliotecas tem
a duração de três dias. No primeiro dia foram realizadas as etapas de tagmentação
do DNA genômico, purificação do DNA tagmentado, amplificação por PCR,
purificação do PCR e a primeira hibridação. No segundo dia foram realizadas a
primeira lavagem e a segunda hibridação. No terceiro dia foram realizadas a
segunda lavagem, uma nova reação de PCR e a validação da biblioteca.
31
Qualidade do DNA genômico
O kit Nextera® Expanded (Illumina®) é otimizado para 50ng de DNA

genômico total. A taxa de absorbância 260/280nm que mede a pureza da amostra
deve estar entre 1.8 e 2.0.
3.3.1 Tagmentação do DNA genômico
Nesta etapa o DNA genômico foi fragmentado e, de forma simultânea, foram

adicionadas sequencias adaptadoras (tags) ao mesmo. Ambas as reações são
catalisadas pela enzima Nextera transposoma, permitindo a amplificação dos
fragmentos por PCR nas etapas subsequentes. Foram adicionados 20ul de DNA
genômico (2.5ng/ul) a 25ul de tampão TD e 5ul da enzima TD (enzima de
tagmentação do DNA). A reação foi transferida para um termociclador onde foi
submetida à incubação a 55°C durante cinco minutos.
3.3.2 Purificação do DNA genômico tagmentado
O DNA tagmentado é purificado das sobras da reação anterior com a enzima

Nextera transposoma. Esta é uma etapa crítica porque a enzima pode se ligar nas
extremidades do DNA, interferindo negativamente nas etapas posteriores. A
purificação foi realizada através de esferas magnéticas com o kit
Agencourt
®AMPure® XP Beads (Beckman Coulter). O tampão ST foi adicionado (15ul) para
cada amostra de DNA tagmentado. Em seguida a reação foi incubada a temperatura
ambiente (20-25°C) por cinco minutos. A solução foi transferida para uma nova
placa, na qual será adicionada 52ul de SPRI (as esferas magnéticas do kit
Agencourt
®AMPure® XP Beads) seguida por incubação por 10 minutos. As amostras foram
centrifugadas a 280g por um minuto e transferidas para uma placa magnética por
32
dois minutos, até que o sobrenadante ficasse com um aspecto claro. O

sobrenadante foi descartado e, mantendo as amostras ainda na placa magnética,
duzentos microlitros de etanol 80% foram adicionados a cada amostra que foi
incubada por 30 segundos. O etanol foi totalmente descartado, e a placa
permaneceu por 10 minutos a temperatura ambiente para assegurar que todo etanol
fosse evaporado. As amostras foram então removidas da placa magnética, e foram
adicionados 22.5ul de RSB (tampão de resuspensão), recolocando novamente a as
amostras na placa magnética por mais dois minutos, até que a solução se tornasse
clara. Foram transferidos 20ul do sobrenadante para tubos de PCR.
3.3.3 Amplificação por PCR
O objetivo desta etapa foi de amplificar o DNA tagmentado e purificado

através de um programa de PCR em um termociclador. A reação de PCR inseriu
indexadores (índex 1 e 5) e adaptadores comuns (P5 e P7), necessários para a
geração de clusters e sequenciamento da amostra. Para a reação foram adicionadas
a cada amostra 20ul de LP#-PMM (PCR mastermix) e cinco microlitros dos primers
de indexação 1 e 2 (i7 – N7xx e i5 – E5xx) para um volume total de 50ul. As
amostras foram transferidas para um termociclador e submetidas ao seguinte
programa: incubações por 72°C por três minutos e 98°C por 30 segundos, seguidos
de 10 ciclos de 98°C por 10 segundos, 60°C por 30 segundos e 72°C por 30
segundos e incubação final a 72°C por cinco minutos.
3.3.4 Purificação da PCR
Foram utilizadas novamente as esferas magnéticas do kit Agencourt

®AMPure® XP Beads (Beckman Coulter). As esferas purificaram a biblioteca de
DNA, além de removerem fragmentos muito pequenos da população total de
moléculas. A reação de PCR foi transferida para uma nova placa na qual foram
adicionados 45ul de SPRI (as esferas magnéticas do kit Agencourt ®AMPure® XP
Beads). A reação foi incubada por 10 minutos em temperatura ambiente, após isto
foi transferida para placa magnética por dois minutos. O sobrenadante foi removido
33
e, mantendo as amostras ainda na placa magnética, duzentos microlitros de etanol

80% foram adicionados a cada amostra que foi incubada por 30 segundos. O etanol
foi totalmente descartado, e a placa permaneceu por 15 minutos a temperatura
ambiente para assegurar que todo etanol fosse evaporado. As amostras foram então
removidas da placa magnética, e foram adicionados 40.0ul de RSB (tampão de
resuspensão), recolocando novamente a as amostras na placa magnética por mais
dois minutos, até que a solução se tornasse clara. Foram transferidos 38ul do
sobrenadante para novas placas.
3.3.5 Primeira Hibridação
Este processo permite que as regiões que queremos capturar e enriquecer

(exoma) liguem-se as sondas de captura. Nesta etapa também é possível combinar
várias bibliotecas com diferentes indexadores em apenas um pool de amostras,
característica que maximiza o experimento e reduz custos. Para realizar o pool
foram utilizados 500ng de cada biblioteca quantificada pelo Qubit Fluorometric
Quantitation System. Até 12 bibliotecas podem fazer parte do pool com um único
indexador (i7 index).
Foram adicionados 40ul da biblioteca a 50ul de NCT1 (tampão de captura I do
kit Nextera) e a 10ul de CTO (oligos de captura de exoma). A reação foi transferida
para um termociclador e foi submetida ao seguinte programa: incubação a 95°C por
10 minutos, seguido de 18 ciclos de 93°C por um minuto (com decréscimo de 2°C
por ciclo) e 58°C overnight.
3.3.6 Primeira Lavagem
Nesta parte do protocolo foram utilizadas esferas magnéticas com

estreptavidina para capturar as sondas contendo as regiões enriquecidas de
interesse. Três etapas de purificação removeram os ligantes inespecíficos das
esferas. A biblioteca enriquecida foi então eluída das esferas e preparada para uma
segunda hibridação. Para tal, as amostras foram removidas do termociclador (onde
34
foram submetidas à primeira hibridação) e transferidas para uma nova placa. Foram
adicionados 250ul de SMB (esferas magnéticas com estreptavidina) a cada amostra
e após isto a reação será incubada a temperatura ambiente por 30 minutos. Após o
período de incubação as amostras foram colocadas na placa magnética por dois
minutos até que o liquido se tornasse claro. Todo sobrenadante foi descartado e as
amostras foram removidas da placa magnética. Foi então realizada a primeira
purificação adicionando-se 200ul de WS1 (solução de lavagem I) a cada amostra,
transferindo as mesmas para a placa magnética por dois minutos até que o líquido
se tornasse claro, em seguida o sobrenadante foi descartado e as amostras
removidas da placa magnética. A segunda purificação se iniciou com adição de
200ul de WS2 (solução de lavagem II) a cada amostra, transferindo as mesmas para
a placa magnética por dois minutos até que o líquido se tornasse claro, em seguida
o sobrenadante foi descartado e as amostras removidas da placa magnética. Foram
adicionados mais 200ul de WS2 a cada amostra, em seguida todo o volume de
reação foi transferido para uma nova placa que foi incubada em um termociclador a
42°C por 30 minutos. As amostras foram removidas imediatamente do termociclador
e colocadas na placa magnética por dois minutos até que o líquido se tornasse claro,
o sobrenadante foi removido e descartado. Foram adicionados novamente 200ul de
WS2, foram repetidas as incubações no temociclador e purificação em placa
magnética. A terceira purificação se iniciou com a adição de 200ul de WS3 (solução
de lavagem III) a cada amostra, transferindo as mesmas para a placa magnética por
dois minutos até que o líquido se tornasse claro, em seguida o sobrenadante foi
descartado. Todas as etapas da terceira purificação foram repetidas mais uma vez.
A eluição teve inicio com o pré-mix de eluição, onde foram adicionados 28.5ul de
ET1 (Tampão de Eluição I) e 1.5ul de HP3 (2N de NaOH) por amostra. Um total de
23ul do pré-mix de eluição foi adicionado a cada amostra que foi incubada por cinco
minutos a temperatura ambiente, sendo transferida para placa magnética por dois
minutos. Foram pipetados 21ul do sobrenadante de cada amostra para uma nova
placa, em seguida foram adicionados quatro microlitros de ET2 (Tampão de Eluição
2) para neutralizar o processo de eluição.
35
3.3.7 Segunda Hibridação
Nesta etapa ocorreu a captura da biblioteca de DNA eluída pelas sondas

específicas para as regiões de interesse (exoma). A segunda hibridação assegura
que as regiões correspondentes aos exons sejam enriquecidas. Para tal foram
adicionados à 25ul da biblioteca eluída, 50ul de NCT1 (tampão de captura Nextera
I), 10ul de CTO (oligos de captura para exoma) e 15ul de H20 ultrapura. A reação foi
transferida para um termociclador e submetida ao programa: incubação a 95°C por
10 minutos, seguido de 18 ciclos de 93°C por um minuto (com decréscimo de 2°C
por ciclo) e 58°C overnight.
3.3.8 Segunda Lavagem
Nesta etapa também utilizamos esferas magnéticas com estreptavidina para

capturar sondas contendo as regiões enriquecidas de interesse (exoma). Três
etapas de purificação removeram os ligantes inespecíficos das esferas. Todas as
etapas são idênticas às descritas na etapa de Primeira Lavagem.
3.3.9 Amplificação por PCR
O objetivo desta etapa foi utilizar a PCR para amplificar a biblioteca

enriquecida de DNA. A biblioteca amplificada foi utilizada nas reações de
sequenciamento. Foram adicionados à reação os seguintes componentes: 20ul da
biblioteca eluída, 20ul de LP#-PMM (PCR mastermix) e cinco microlitros de PPC
(coquetel de primers para PCR) para um volume total de 50ul. As amostras
foram transferidas para um termociclador e submetidas ao seguinte programa:
incubação a 98°C por 30 segundos, seguidos de 10 ciclos de 98°C por 10
segundos, 60°C por 30 segundos e 72°C por 30 segundos e incubação final a 72°C
por cinco minutos. Após a PCR, foram adicionados 90ul de AMPure XP Beads a
cada amostra que foi incubada a temperatura ambiente pelo período de 15 minutos.
Em seguida, as amostras foram transferidas para a placa magnética onde
permaneceram por cinco minutos. Foram descartados 140ul do sobrenadante de
cada amostra e após isto, foram adicionados 200ul de etanol 80% (com as amostras
36
ainda na placa magnética). Após incubação por 30 segundos o sobrenadante foi

descartado. Foram realizadas mais duas purificações com etanol 80% e, em
seguida, as amostras ficaram mais 15 minutos na placa magnética para que todo
etanol 80% fosse evaporado. As amostras foram retiradas da placa magnética,
resuspendidas com 30ul de RSB (tampão de resuspensão), incubadas por dois
minutos a temperatura ambiente e transferidas para placa magnética por cinco
minutos até que a solução se tornasse clara. Em seguida foram transferidos 28ul do
sobrenadante de cada amostra para novos tubos ou para uma placa de PCR.
3.3.10 Validação da Biblioteca Enriquecida
O objetivo desta etapa é realizar o controle de qualidade e a quantificação da

biblioteca de DNA. Para que dados de alta qualidade sejam obtidos nas plataformas
de sequenciamento Illumina é necessário que se atinja uma densidade ideal de
clusters em cada linha da flow cell. Isto requer uma quantificação precisa das
bibliotecas de DNA.
Foram adicionados 198ul de Tween 20 0.1% a dois microlitros de uma
biblioteca controle para que se obtivesse uma diluição de 1:100. Em seguida foi
adicionado 100ul de Tween 20 0.1% a 100ul da biblioteca diluída para que fosse
feita uma curva de titulação com sete diluições (2x cada) seriais variando de 20 a um
picomolar. Esta etapa foi realizada em triplicata. Em seguida, dois microlitros
das bibliotecas foram diluídas com 998ul de Tween 20 0.1%, obtendo-se uma
diluição de 1:500 e concentração final aproximada de 4pM. Três diluições
independentes foram realizadas, pois os resultados de qPCR em triplicata são
importantes para as análises subsequentes.
A próxima etapa é o experimento de qPCR que foi realizado com o kit KAPA
SYBR FAST Master Mix Universal e primers específicos qPCR Primer 1.1 e qPCR
Primer 1.2. O experimento foi realizado em placas de 48 wells, sendo que nas
primeiras três linhas foram pipetadas as amostras experimentais (em triplicata) e nas
outras três linhas foram pipetados os controles diluídos serialmente (triplicatas de um
a 20pM). Em seguida as amostras em placa foram transferidas para um
termociclador específico para qPCR (7500 Real Time PCR System, Applied
Biosystem) e submetidas a uma etapa de hot start (95°C por 10 minutos) e 40 ciclos
37
de desnaturação a 95°C por 10 segundos seguido por anelamento e extensão a

60°C por 30 segundos.
Para análise é necessário checar se houve uma amplificação eficiente das
bibliotecas controles e remover as amostras da triplicata que apresentaram valores
de Cq > 0.5. Foi gerada uma curva padrão das amostras controle formada pelos
valores de Cq (eixo Y) contra os valores do log da concentração inicial das amostras
(eixo X). A eficiência de amplificação dos controles deve ficar entre 90-110% (slope
de -3.6 a - 3.1) e o R2>0.99. Em seguida foram checadas as amplificações das

bibliotecas experimentais, as amostras com valores de Cq>0.5 devem ser
eliminados das triplicatas. O calculo da concentração inicial das amostras
experimentais foi baseado na curva padrão gerada a partir das diluições das
amostras controle. As bibliotecas quantificadas foram diluídas a uma concentração
padrão para a etapa de clusterização.
3.3.11. Clusterização e Sequenciamento de Nova Geração
Estas etapas foram realizadas no Laboratório Central de Tecnologias de Alto

Desempenho (LaCTAD) da UNICAMP. A clusterização foi realizada com o TruSeq™
PE Cluster Kit v3 no equipamento c-Bot instalado no Laboratório Central de
Tecnologias de Alto Desempenho (LaCTAD). Um volume de 10ul de DNA molde
(2nM) foi combinado com 10ul de NaOH 0.1N e incubado durante cinco minutos,
esta etapa serviu para desnaturar as fitas. Em seguida 20ul de DNA desnaturado foi
transferido para um tubo contendo 980ul de tampão de hibridação (HT1). O DNA
desnaturado foi então diluído com HT1 para um volume final de 1000ul em cinco
concentrações diferentes (10pM, 12pM, 15pM, 18pM e 20pm). Foram transferidos
120ul da amostra DNA + HT1 e da biblioteca controle Phix para oito tubos. As
amostras foram submetidas à clusterização no c-Bot. Após a etapa de clusterização
as amostras foram sequenciadas em um Sequenciador HiSeq 2500 (Illumina). As
amostras foram multiplexadas para que pudessem ser submetidas ao
sequenciamento na mesma “lane". O sequenciamento foi realizado em 2x100pb
(paired ends) com cobertura mínima de 70x (como a cobertura média normalmente é
50x, colocamos um valor um pouco acima pelo fato de que a identificação de
variantes em mosaicismo requer uma maior cobertura).
38
3.4 Bioinformática
Os sequenciadores de nova geração podem gerar dados na ordem de

gigabases por dia de corrida. Geralmente as sequencias são curtas, portanto há a
necessidade de softwares de analise com grande poder de processamento que
aliem precisão e velocidade. A primeira etapa da análise de bioinformática foi alinhar
as sequencias (reads) geradas pelo Hiseq 2500 com o genoma de referência (Homo
Sapiens, hg19 - Genome Reference Consortium GRCh37), para tal foi utilizado o
software BWA, o qual aceita o formato SAM, a extensão padrão que é
reconhecida pela maioria dos programas de alinhamento, (Li et al., 2008; Langmead
et al., 2009). Para identificação de SNP (single nucleotide polimorphisms) e
pequenos indels (inserções/deleções) foi utilizado o programa GATK. As variantes
identificadas que apresentaram Phred-like variant quality score menores que 40 (ou
30 quando em ambos os alelos) foram excluídas.
Esta etapa do projeto foi realizada com o auxílio da equipe do Laboratório de
Biologia Computacional e Bioestatística do Departamento de Genética Médica, FCM-
UNICAMP com a supervisão do Prof. Dr. Benilton Carvalho, que tem vasta
experiência nesse tipo de análise.
3.5 Análises de predição
Para analisar as variantes identificadas em região codificante quanto à

patogenicidade, foram utilizados programas de predição: o SIFT e o Polyphen.
Essas análises levam em consideração as diferenças físico-químicas entre o
aminoácido original e o alterado, a posição da alteração e o nível de conservação
entre sequências homólogas (101).
 SIFT: http://sift.bii.a-star.edu.sg/
 Polyphen: http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2
Para analisar as variantes identificadas em região de splicing, foi utilizado um

39
programa de predição de splicing: o Human Splicing Finder. Esse programa nos

fornece as regiões do gene de interesse que são sítios de splicing em potencial, e
além disso, também oferece ferramentas para analisar se irá ocorrer alguma
modificação no fenômeno de splicing, por meio da comparação da sequência de
referência com a sequência mutada.
http://www.umd.be/HSF3/HSF.html
3.6 Detecção de Copy Number Variations (CNVs)
A técnica de Microarray requer DNA de alta qualidade, sendo assim o DNA de

todos os pacientes foi selecionado e purificado. Na primeira etapa, os DNAs foram
analisados após eletroforese em gel de agarose 1.5% e marcados por SYBR® Safe.
As amostras de DNA muito fragmentadas não foram submetidas à análise.
Os DNAs foram quantificados em um Epoch (Biotek). O grau de pureza dos
DNAs foi aferido pelas razões de absorbância A260/280, A260/230 e A320.
Consideramos como aceitáveis as amostras com valores de absorbância A260/280
entre 1.7 e 2.0, A260/230 com valores maiores que 1.1 e A320 com valores menores
que 0.1.
3.6.1 Purificação das Amostras de DNA
Os DNAs selecionados foram purificados em colunas da Millipore para

remoção de impurezas e traços de fenol-clorofórmio. Para tal, o DNA foi transferido
para uma coluna acoplada a um tubo coletor, completando-se o volume para 500µL
com água ultrapura. As amostras foram centrifugadas por 12 minutos a 14000G.
Após a centrifugação, um novo tubo coletor foi colocado e a coluna foi invertida. As
amostras foram novamente centrifugadas por 2 minutos a 1000G. As amostras
captadas no tubo coletor foram diluídas com tampão low TE-EDTA 1x (Affymetrix®)
para concentração final de 45ng/µL a 60ng/µL.
3.6.2 Digestão das amostras de DNA com a enzima NspI
Cada amostra de DNA, a 50ng/µL, foi submetida a uma reação de digestão

40
composta por 1µL de enzima NspI, 2µL de tampão da enzima, 0,2µL de tampão BSA
e 11,55µL de água. As reações foram transferidas para um termociclador
(Mastercicler Gradiente Eppendorf®) onde permaneceram incubadas a 37°C por 120
minutos, seguida por nova incubação a 65°C por 20 minutos.
3.6.3 Reação de ligação com adaptadores
Para a reação de ligação, foram adicionadas às amostras de DNA digeridas

com NspI, 0,75µL de solução com adaptadores (50µM); 2,5µL de tampão T4 DNA
Ligase 10x e 2µL de enzima T4 DNA Ligase. Em seguida, as reações foram
transferidas para um termociclador (Mastercicler Gradiente Eppendorf®) para
ciclagem a 16°C por 180 minutos e 70°C por 20 minutos.
3.6.4 Amplificação dos fragmentos por PCR
As amostras de DNA que foram digeridas e ligadas a adaptadores foram

diluídas com 75µL de água. Para cada amostra, quatro alíquotas de 10µL foram
transferidas para uma nova placa. Estas alíquotas foram submetidas a uma reação
de PCR seguindo o protocolo: 39,5µL de água, 10 µL de tampão TITANIUM Taq
PCR 10x, 20µL de reagente GC-Melt, 14µL de dNTP (2,5mM), 4,5µL de primer e
2µL de enzima TITANIUM Taq DNA Polimerase 50x. A reação foi transferida para
um termociclador (Mastercicler Gradiente Eppendorf®) sendo submetida ao seguinte
programa: 94°C por 3 minutos; trinta ciclos de 94°C por 30 segundos, 60°C por 45
segundos e 68°C por 15 segundos e uma extensão final a 68°C por 7 minutos. A
reação foi avaliada por eletroforese em gel de agarose 2% para verificação do
padrão de amplificação dos fragmentos. Foram considerados aceitáveis os DNAs
que apresentaram a maioria dos fragmentos entre 150pb e 2000pb.
3.6.5 Purificação
Para a purificação das amostras, as quatro alíquotas foram transferidas para

um único tubo de 2,0 mL. Foram adicionados 720µL de beads magnéticas e a
41
reação foi mantida a temperatura ambiente por 10 minutos. Os tubos foram

centrifugados por três minutos a 16100G e em seguida encaixados em um suporte
magnético (MagnaRackTM). O sobrenadante foi descartado e, em seguida
adicionou-se 1.0 mL do tampão de lavagem em cada amostra. Os tubos foram
vortexados por dois minutos e depois centrifugados por três minutos a 16100G. Os
tubos foram novamente encaixados no suporte magnético e o sobrenadante foi
totalmente descartado. Após a completa secagem das beads, 52µL do tampão de
eluição foram adicionados e os tubos foram vortexados por 10 minutos. Os tubos
foram centrifugados por três minutos a 16100G e encaixados no suporte magnético.
Após 10 minutos, 47µL do sobrenadante foram transferidos para uma nova placa.
3.6.6 Quantificação
As amostras purificadas foram avaliadas quanto à concentração ideal (acima

de 3000 ng/µL) e sua pureza foi observada pelas relações de absorbância
(A260/280 entre 1,8 e 2,0 e A320 < 0,1). As quantificações foram realizadas no
aparelho Epoch (BioTek®).
3.6.7 Fragmentação
Os produtos da purificação foram fragmentados utilizando-se para cada

amostra: 123.8µL de água, 158.4 µL de tampão de fragmentação e 5.8µL de enzima
de fragmentação (2.5U/µL). Tais volumes podem variar de acordo com a
concentração da enzima utilizada e o número do lote do produto. A reação foi
transferida para um termociclador (Mastercicler Gradiente Eppendorf®) e incubada a
37°C por 35 minutos e 95°C por 15 minutos, respectivamente. Em seguida, o padrão
de fragmentação foi avaliado por eletroforese em gel de agarose 3%. Foram
considerados aceitáveis os DNAs que apresentaram a maioria dos fragmentos entre
25pb e 125pb.
3.6.8 Marcação do DNA
O próximo passo foi adicionar aos 51µL da reação de fragmentação para

42
cada amostra, 14µL de tampão TdT 5x, 2µL de DNA Labeling Reagent 30mM e
3.5µL de enzima TdT. A reação foi incubada a 37°C por quatro horas e a 95°C por
15 minutos em um termociclador (Mastercicler Gradiente Eppendorf®).
3.6.9 Hibridação
Ao DNA marcado foram adicionados: 165µL de Hyb Buffer Part I, 15µL de Hyb Buffer
Part II, 7µL de Hyb Buffer Part III, 1µL de Hyb Buffer Part IV e 2µL de Oligo Control
Reagent 0100. Em seguida, os fragmentos de DNA foram desnaturados em um
termociclador (Mastercicler Gradiente Eppendorf®) a 95°C por 10 minutos e
posteriormente mantidos a 49°C. Foram aplicados 200 µL de cada amostra em cada
chip. Os chips foram incubados em um forno de hibridação por 16 horas a
temperatura de 50°C e rotação de 60rpm (Genechip® Hibridization Oven 645,
Affymetrix®).
3.6.10 Lavagem
Após a hibridação, os chips passaram pela estação de lavagem (GeneChip
Fluidics Station 450, Affymetrix®) que realiza automaticamente um processo de
injeção de soluções para a lavagem dos chips.
3.6.11 Escaneamento
Os chips foram escaneados pelo GeneChip® Scanner 3000 7G (Affymetrix®)
do nosso próprio laboratório.
3.6.12 Análises
A análise dos resultados das alterações estruturais foi realizada pelo software
Chromosome Analysis Suite (Affymetrix®).
Para a análise dos CNVs com possível potencial patogênico foram consultados
bancos de dados disponíveis na internet: DGV, ISCA e DECIPHER.
43
 DGV (Database of Genomic Variants) contém variações estruturais

identificadas em indivíduos sadios e consideradas como normais.
 ISCA (International Standards for Cytogenomic Arrays Consortium) e o
DECIPHER (Database of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans
using Ensembl Resources) são bancos de dados públicos que possuem
informações de citogenética molecular e reúne dados de CNVs com
importância clínica já relatada.
44
4. RESULTADOS
4.1 Next Generation Sequencing

Foram sequenciadas oito amostras pelo sequenciamento de nova geração
(NGS), sendo estas pertencentes a quatro pacientes. Destas oito amostras, quatro
são de tecido cerebral proveniente de cirurgias e quatro são de sangue periférico
(Tabela1). Como já citado, fizemos este pareamento tecido cerebral x sangue, de
um mesmo individuo, a fim de poder identificar um mosaicismo mais geral. Neste
caso, consideramos como um mosaicismo mais geral aquele que aparece entre
tecidos, comparando sangue e tecido cerebral, ou seja, variantes que se encontram
presente em um e ao mesmo tempo ausente em outro. Mosaicismos mais
específicos – os quais aparecem apenas no tecido cerebral – serão estudados
posteriormente. Portanto, neste caso, consideramos como casos de mosaicismo, as
variantes (mutação) que estavam presentes no tecido cerebral e ausentes no
sangue (ou vice- versa), em amostras de um mesmo paciente.
Registro de DNA do paciente Sexo Tipo de DCF

Tecido Sangue
P19 541/12 Feminino IIA
P13 44/11 Masculino IIA
P16 193/13 Masculino IIB
Tabela 1. Relação de todos os pacientes que foram sequenciados.
Para o preparo das bibliotecas é necessário extrair um DNA íntegro, de boa

qualidade, com os parâmetros de pureza dentro da margem exigida e com uma
concentração adequada. A extração do DNA proveniente de linfócitos já havia sido
realizada anteriormente. A extração do DNA de tecido cerebral foi realizada por meio
do método descrito em Sambrook ET.al 2001. Após a realização de todo o
procedimento do protocolo de extração, testamos os DNAs, tanto de tecido cerebral
como sanguíneo, para confirmar se os parâmetros de qualidade e de concentração
estavam dentro da normalidade. O parâmetro que mede o comprimento de onda
260/280, indica a presença de proteínas na amostra, sendo negativo para
45
valores maiores do que 1,8. O comprimento de onda 320 indica a presença de

resquícios de reagentes da extração, sendo negativo para valores abaixo de 0,1. A
concentração de DNA foi medida em ng/ul. (Tabela 2). Também testamos os DNAs
em gel de agarose 1% para verificar a integridade dos mesmos (Figura1).
Registro de DNA 260/280 320 []ng/ul

P19 – tecido 1,82 0,05 203,3
P16 - tecido 1,81 0,07 62,9
P13 – tecido 1,83 0,05 115,1
P20 - tecido 1,87 0,06 67,4
541/12 - sangue 1,86 0,07 813
193/13 - sangue 1,81 0,08 234,1
44/11 - sangue 1,84 0,07 545
742/12 - sangue 1,80 0,08 916
Tabela 2. Parâmetros de qualidade dos DNAs de tecido cerebral e sangue antes de iniciar o preparo das bibliotecas.
As mesmas cores dos números de registro de DNA indicam que são o mesmo paciente, pareado tecido
– sangue.
A B
Figura 1. DNAs de sangue (A) e DNAs de tecido (B) testados em gel de agarose 1% para verificar a
integridade dos mesmos.
Após verificar que todos os DNAs estavam com uma boa qualidade,
começamos o protocolo da preparação de bibliotecas com o Nextera® Expanded Kit
(Illumina®). No decorrer do protocolo, existem pontos de checagem para verificar se
até aquele ponto os procedimentos ficaram de acordo com o esperado. Após a etapa
do primeiro Clean up da PCR, nós analisamos um dos pontos de checagem por
bioanalyser, o qual analisa o tamanho dos fragmentos que foram amplificados e que
precisam estar com tamanho molecular entre 150pb-1kb. Podemos observar
46
na Figura 2 que todos eles ficaram dentro da margem esperada.

Também quantificamos cada amostra por meio de um Qubit que realiza uma
quantificação fluorométrica (Tabela3). Essa etapa da quantificação, além de ser um
ponto de checagem para verificar se os fragmentos amplificaram corretamente, é
uma etapa crítica, pois irá determinar a quantidade de cada amostra que iremos
colocar no pool de amostras, o qual precisa ter uma totalidade de 500ng de todas as
amostras; não sendo alcançada essa concentração, completamos com um tampão
específico do kit.
P13 tecido 44/11 sangue
Figura 2. Gráficos obtidos como resultado do bioanalyser. No eixo X podemos observar a quantidade
de pares de base (pb) e no eixo Y, a quantidade de moléculas que obtivemos.
47
Registro do DNA [] ng/ul

P13 6,1
P16 6,4
P19 6,6
P20 6,3
541/12 9,7
193/13 6,1
44/11 24,4
742/12 6,2
Tabela 3. Resultados da concentração em ng/ul da quantificação fluorométrica do DNA pelo Qubit.

Essa quantificação se realiza após a etapa de Clean up da PCR e antecede a etapa na qual fazemos
o pool de todas as amostras.
Para finalizar, fazemos outro bioanalyser, o qual vai nos dizer novamente qual
o tamanho médio da biblioteca (Figura3). Além disso, precisamos obter uma
medição precisa da concentração da biblioteca, a qual foi realizada pela técnica de
Real Time. Esses dois parâmetros – tamanho médio e concentração – são
necessários para calcularmos a quantidade da biblioteca em nM, que por sua vez
será convertida para pM, sendo que 1nM é igual a 1000pM. Deixamos as amostras a
2nM e as levamos ao Lactad, onde por sua vez, foram colocados 16pM em cada
lane.
Figura 3. Gráfico obtido como resultado do bioanalyser. Essa técnica nos permite analisar o
tamanho dos fragmentos obtidos pela biblioteca já finalizada. No eixo X podemos observar a
quantidade de pares de base (pb) e no eixo Y, a quantidade de moléculas que obtivemos. Neste
caso, temos como tamanho médio, 351pb.
48
Os resultados do sequenciamento foram, então, enviados para o nosso grupo

de bioinformática. O Hiseq 2500 nos fornece a sequência de milhões de fragmentos
curtos (reads), os quais precisam ser alinhados com o genoma de referência (Homo
Sapiens, hg19 - Genome Reference Consortium GRCh38) para obter a sequencia de
todo exoma. O alinhamento foi realizado por meio do software BWA, o qual possui
um grande poder de processamento que alinha precisão e velocidade.
Posteriormente, foi utilizado o software GATK, o qual realiza a identificação dos
SPNs por meio da comparação de um genoma de referência, que neste caso foi o
GRCh38.
Para obtermos resultados significantemente confiáveis, necessitamos de
uma boa cobertura do sequenciamento. Quando falamos em cobertura de
determinada região, queremos dizer quantas vezes aquela região foi sequenciada,
portanto, quanto maior o valor de cobertura, mais chances do resultado de
sequenciamento estar correto. Para a identificação de variantes germinativas,
normalmente considera-se um valor de cobertura confiável de 30x a 50x [58],
entretanto pelo fato de estarmos analisando variantes em mosaicismo,
consideramos um valor de cobertura de 70x. Esse valor foi estipulado levando em
consideração que variantes em mosaicismo estão presentes somente em algumas
células do indivíduo, e sendo assim, se torna mais difícil de detectá-las,
necessitando de uma maior cobertura do que aquela utilizada para variantes
germinativas, portanto, estipulamos o valor de 70x.
Para o exoma, utilizamos um kit que cobre tanto regiões codificantes, como
uma parte das regiões de íntron. Entretanto, como uma característica do kit
estipulada pelo fabricante, os íntrons não possuem uma boa cobertura. Conforme
descrito a seguir (Tabela 4), o valor médio de cobertura de todos os genes
analisados das vias mTOR e Tau, dos quatro pacientes, é de 28,6x. Esse valor é a
média de cobertura do gene inteiro, isso inclui que dentro deste número temos
também a cobertura de regiões de íntron, o que acaba por diminuir o valor da
média, já que os íntrons normalmente não são bem cobertos, como citado
anteriormente. Porém, obtivemos uma ótima cobertura das regiões de exons que
foram sequenciadas, sendo que a média de cobertura de todas as variantes
identificadas em exons, tanto em mosaicismo como germinativas, nas vias mTOR e
Tau é de 111,6x.
49
Média dos valores de cobertura
Genes Variantes identificadas em exons
28,6x 111,6x
Tabela 4. Relação das médias dos valores de cobertura de todos os genes analisados, das vias
mTOR e Tau, incluindo regiões de íntron e exon e das médias dos valores de cobertura de todas as
variantes identificadas somente nos exons.
Após essas etapas de alinhamento e identificação de SNPs, foi gerado um

arquivo com todas as variantes encontradas no exoma e nas regiões próximas
aos exons. No preparo das bibliotecas, foi utilizando o Nextera® Expanded Kit
(Illumina®), o qual possui uma captura expandida, ou seja, a captura não é
somente dos exons, mas também das regiões próximas, incluindo região de
intron, 3’UTR, 5’UTR e região de splicing.
Neste arquivo, foram aplicados filtros para que pudéssemos analisar a
enorme quantidade de dados que foi gerada. Desta forma, foram aplicados
quatro tipos de filtros. Primeiramente, filtramos por genes, pois queríamos
analisar os genes das vias mTOR e Tau. Tivemos como prioridade a análise
dessas duas vias, em decorrência de todas as evidências relatadas
anteriormente, as quais demonstram a importância dessas vias. Entretanto, o
restante de todos os outros genes do exoma será analisado futuramente, para
investigarmos se outras vias moleculares estão envolvidas, ou até mesmo, se
outros genes estão atuando junto com as vias mTOR e Tau nos processos
etiológicos das DCFs. As vias mTOR e Tau, com a relação de todos os genes
analisados, seguem abaixo nas Figuras 4 e 5 e mais detalhadamente, nos
Anexos 1 e 2.
50
Figura 4. Cascata da via mTOR retirada do KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes.
Todos esses genes foram escolhidos para serem analisados após o sequenciamento. Os genes em
amarelo são aqueles nos quais já foram identificadas mutações em mosaicismo na HME e os genes
em vermelho são aqueles nos quais já foram identificadas mutações na ET.
51
Figura 5. Cascata da via Tau retirada do KEGG: Kioto Encyclopedia of Genes and Genomes. Dentre todos os
genes dessa via, os genes em amarelo foram aqueles escolhidos para serem analisados, em decorrência de
estes serem os genes relacionados com a doença de Alzheimer, a qual compartilha com as DCFs a presença
dos agregados de Tau.
52
Após a primeira filtragem por genes, aplicamos o segundo filtro, o qual

consistiu em descartar as variantes que estavam com uma cobertura menor do que
70x. Porém, como analisamos amostras pareadas (tecido e sangue), se somente
uma delas se encontrava com a cobertura acima de 70x, consideramos utilizá-la com
a condição de a outra amostra pareada estar com cobertura acima de 60x.
Dessa forma, após ter filtrado somente os genes das vias mTOR e Tau e
somente as variantes com uma cobertura de 70x, aplicamos outros dois filtros a fim
de detectar as variantes em mosaicismo. Decidimos primeiramente analisar a
existência de macro-mosaicismos, o qual consiste em um tipo de mosaicismo mais
geral, ou seja, que ocorre entre tecidos, e no nosso caso, entre tecido cerebral
displásico e sangue. Portanto, um dos filtros foi para identificar variantes que
estavam presentes no tecido cerebral e ao mesmo tempo ausentes no sangue, e
posteriormente, o outro filtro foi para identificar variantes que estavam presentes no
sangue e ao mesmo tempo ausentes no tecido cerebral. Esses dois filtros foram
realizados para cada um dos quatro indivíduos separadamente.
4.1.1. Variantes em Mosaicismo
Seguindo essa análise, após aplicar os dois primeiros filtros (por genes e
cobertura acima de 70X), nós identificamos um total de 758 variantes na via mTOR e
38 na via Tau. Posteriormente, ao aplicar os outros dois filtros, pudemos identificar
as variantes que se encontravam na forma de mosaicismo. Na via mTOR, do total de
758 variantes, 30 apareceram na forma de mosaicismo, ou seja, se encontravam
presentes no tecido cerebral e ausentes no sangue ou vice-versa. Destas 30, 13
variantes apareceram apenas no tecido cerebral, estando ausentes no sangue
(Tabela 5) e 17 apareceram somente no sangue, estando ausentes no tecido
cerebral (Tabela 6 e Figura 6). Dentre as 30 variantes identificadas na forma de
mosaicismo, 18 são variantes ainda não descritas no banco de dados do Ensembl*.
* www.ensembl.org
53
Figura 6. Esquema simplificativo das variantes identificadas na via mTOR.
Cromossomo Localização Referência Alteração Consequência Gene

193 - P16
12 102397210 GA G 3_prime_UTR_variant IGF1
19 53875323 CAT C downstream_gene_variant MYADM
19 53875849 CA C upstream_gene_variant PRKCG
1 46131824 CT C intron_variant PIK3R3
1 243504623 TA T,AA intron_variant AKT3
8 38060167 G A non_coding_transcript EIF4EBP1
44 - P13
16 2603088 CT C downstream_gene_variant PDPK1
8 38060117 A G non_coding_transcript EIF4EBP1
541 - P19
10 87965536 CT C 3_prime_UTR_variant PTEN
17 19841552 TA T splice_region_variant ULK2
17 19849711 T A intron_variant ULK2
5 38966791 A T intron_variant RICTOR
742 - P20
1 243504623 TA T,AA intron_variant AKT3
Tabela 5. Tabela detalhada de todas as 13 variantes que apareceram na forma de mosaicismo

na via mTOR – presentes apenas no tecido cerebral, estando ausentes no sangue.
54

193 -
P16 12 131913710 AC A upstream_gene_variant ULK1
193 –
P16 17 19849711 T A intron_variant ULK2
5 38966791 A T intron_variant RICTOR
5 38978656 TA T downstream_gene_variant RICTOR
6 43786439 TA T downstream_gene_variant VEGFA
X 84148140 CA C intron_variant RPS6KA6
44 - P13 17 19841552 TA T splice_region_variant ULK2

RP11-
17 59936156 GA G upstream_gene_variant 178C3.1
4 98881149 GA G splice_region_variant EIF4E
541 -
P19 16 2603088 CT C downstream_gene_variant PDPK1
RP11-
17 59936156 GA G upstream_gene_variant 178C3.1
4 98881149 GA G splice_region_variant EIF4E
4 98929328 G A upstream_gene_variant EIF4E
742 -
P20 12 102398799 CT C downstream_gene_variant IGF1
8 38060102 C T non_coding_transcript EIF4EBP1
Tabela 6. Tabela detalhada de todas as 17 variantes que apareceram na forma de mosaicismo na via
mTOR – presentes apenas no sangue, estando ausentes no tecido cerebral.
55
Na via Tau, do total de 38 variantes, sete apareceram na forma de

mosaicismo, ou seja, se encontravam presentes no tecido cerebral e ausentes no
sangue ou vice- versa. Destas sete, quatro variantes apareceram apenas no tecido
cerebral, estando ausentes no sangue (Tabela 7) e três apareceram somente no
sangue, estando ausentes no tecido cerebral (Tabela 8 e Figura 7). Dentre as sete
variantes identificadas na forma de mosaicismo, três são variantes ainda não
descritas no banco de dados do Ensembl*.
Figura 7. Esquema simplificativo das variantes identificadas na via Tau.

56

193 -
P16 2 118847727 T G upstream_gene_variant EN1
44 –
P13 - - - - - -
541 -
P19 - - - - - -
742 -
P20 17 46029955 CT C downstream_gene_variant KANSL1
2 118847727 T G upstream_gene_variant EN1
2 118847741 T G upstream_gene_variant EN1
Tabela 7. Tabela detalhada de todas as quatro variantes que apareceram na forma de mosaicismo
na via Tau – presentes apenas no tecido cerebral, estando ausentes no sangue

193 -
P16 - - - - - -
44 - P13 - - - - - -
541 -
P19 21 25880942 A C 3_prime_UTR_variant APP
2 118847725 T TG upstream_gene_variant EN1
742 -
P20 17 46030147 G GT non_coding_transcript KANSL1
Tabela 8. Tabela detalhada de todas as três variantes que apareceram na forma de

mosaicismo na via Tau – presentes apenas no sangue, estando ausentes no tecido cerebral.
57
Todos os genes envolvidos nas variantes em mosaicismo das vias mTOR e Tau,
junto com a consequência ou região em que cada variante se encontra, seguem
abaixo, nas Tabelas 9 e 10.
(A)
Presentes apenas no tecido
cerebral
(B)
Presentes apenas no
sangue
Tabela 9. Tabela contendo todos os genes da via mTOR nos quais foram identificadas
variantes em mosaicismo, especificando para cada gene qual a região ou consequência em que
a variante se enquadra. (A) sobre as variantes que foram identificadas apenas no tecido
cerebral. (B) sobre as variantes que foram identificadas apenas no sangue.
58
(A)
Presentes apenas no tecido cerebral
(B)
Presentes apenas no sangue
Tabela 10. Tabela contendo todos os genes da via Tau nos quais foram identificadas
variantes em mosaicismo, especificando para cada gene qual a região ou consequência em que a
variante se enquadra. (A) sobre as variantes que foram identificadas apenas no tecido cerebral. (B)
sobre as variantes que foram identificadas apenas no sangue.
Tanto na via mTOR como na via Tau, podemos observar que nenhuma das
variantes identificadas se encontra em região codificante. Entretanto, duas variantes
identificadas na via mTOR se encontram em região de splicing, uma no gene ULK2
e outra no gene EIF4E. A partir desse momento, o foco do trabalho concentrou-se
nessas duas variantes da via mTOR, com a finalidade de investigar se iria ocorrer
uma modificação do sítio de splicing, como consequência dessas variantes, e se
essa modificação poderia ocasionar efeitos deletérios.
A variante no gene ULK2, que se trata da deleção de um nucleotídeo (T), foi
identificada em um paciente, 541 – P19, apenas no tecido cerebral. A cobertura
dessa variante possui um valor elevado, o que aumenta significantemente a
confiabilidade da ausência de erros – a cobertura do tecido cerebral com o valor de
256x e a cobertura do sangue com o valor de 188x. Entretanto, em outro paciente,
44 – P13, essa mesma variante aparece apenas no sangue, se encontrando ausente
no tecido cerebral. Neste caso, os valores de cobertura também são elevados – do
59
tecido cerebral é de 226x e do sangue é de 107x. Essa alteração já é descrita no

banco de dados COSMIC (Catalogue of somatic mutations in cancer), também na
forma de mosaicismo, em casos de câncer de fígado, sendo encontrada apenas em
células tumorais. A variante no gene EIF4E, se trata também da deleção de um
nucleotídeo (T), foi identificada em dois pacientes, 541 – P19 e 44 – P13, apenas no
sangue, estando ausente no tecido cerebral. No primeiro paciente, a cobertura do
tecido cerebral é de 329x e do sangue é de 338x. No segundo paciente, a cobertura
do tecido cerebral é de 364x e do sangue é de 224x. Essa alteração também já é
descrita no banco de dados COSMIC (Catalogue of somatic mutations in cancer), na
forma de mosaicismo, em casos de câncer de fígado, identificada apenas em células
tumorais.
Posteriormente, utilizamos um programa de análise de predição de splicing, o
Human Splicing Finder, para podermos observar se o sítio de splicing iria ser
alterado.
Para a variante no gene ULK2, fizemos uma comparação da sequência de
referência com a sequência mutante, e dessa forma observamos que com a deleção
do nucleotídeo T, a região codificante passa a começar com um C, sendo que na
sequência de referência, a qual possui o T intacto, a região codificante começa com
um G. Portanto, isso nos mostrou que essa deleção alterou o sítio de splicing,
causando uma modificação no fenômeno de splicing (Figura 8).
60
Figura 8. Análise de predição pelo programa Human Splicing Finder, comparando a sequência
de referência com a sequência mutada do gene ULK2, na qual podemos observar a mudança do
nucleotídeo que dá início à região codificante como consequência da alteração do sítio de
splicing.
Esse programa também oferece uma ferramenta que nos mostra todas as
regiões do gene as quais são consideradas como potenciais sítios de splicing, sendo
que a região em que identificamos a variante está entre elas (Figura 9).
Figura 9. Regiões do gene ULK2 consideradas como sendo potenciais sítios de splicing, pelo
programa Humam Splicing Finder. A região na qual se encontra a variante identificada está
destacada em vermelho.
61
Assim, tendo em vista o que observamos nessa análise de predição, utilizamos o

programa Expasy - o qual nos mostra a proteína que irá ser formada a partir de uma
sequência de interesse – a fim de compararmos a proteína que se forma a partir da
sequência normal e aquela que se forma a partir da sequência mutante do gene
ULK2, com a deleção de um T. Com essa ferramenta, observamos ue a variante
identificada acaba por gerar um stop códon prematuro, interropendo a continuidade
de formação da proteína normal, formando uma proteína truncada (Figura 10).
ULK2 normal
ULK2 mutado
Figura 10. Comparação das proteínas geradas a partir da sequência do gene ULK2 normal e do
ULK2 com a variante identificada (deleção de um nucleotídeo T). Pela comparação das figuras,
podemos observar o stop códon gerado como consequência da variante, originando uma proteína
truncada.
62
Para a variante no gene EIF4E, também fizemos primeiramente uma análise de

predição de splicing, realizando a mesma comparação anteriormente citada, da
sequência de referência com a sequência mutada, no programa Human Splicing
Finder. Neste caso, a variante identificada também se trata da deleção de um
nucleotídeo T, a qual irá fazer com que a região codificante passe a começar com
um A, sendo que na sequência de referência, com o nucleotídeo T intacto, ela
começa com um G. Portanto, nessa variante também observamos uma alteração no
sítio de splicing, o que faz com que o fenômeno de splicing seja modificado (Figura
11).
Figura 11. Análise de predição pelo programa Human Splicing Finder, comparando a sequência de
referência com a sequência mutada do gene EIF4E, na qual podemos observar a mudança do
nucleotídeo que dá início à região codificante como consequência da alteração do sítio de splicing.
63
Também investigamos, com a outra ferramenta do programa, quais as regiões

do EIF4E são sítios de splicing em potencial, observando que a região na qual se
encontra a variante identificada aparece com sendo uma delas (Figura 12).
Figura 12. Regiões do gene EIF4E consideradas como sendo potenciais sítios de splicing, pelo
programa Humam Splicing Finder. A região na qual se encontra a variante identificada está
destacada em vermelho.
Posteriormente, com o programa Expasy, também analisamos qual seria o impacto

dessa variante na proteína a ser formada. Comparando a proteína formada a partir
da sequência de referência com a proteína formada a partir da sequência mutada
do EIF4E, observamos que, como acontece no gene ULK2, essa variante no EIF4E
também acaba por gerar um stop códon prematuro, originando uma proteína
truncada (Figura13).
64
EIF4E normal
EIF4E mutado
Figura 13. Comparação das proteínas geradas a partir da sequência do gene EIF4E normal e do
EIF4E com a variante identificada (deleção de um nucleotídeo T). Pela comparação das figuras,
podemos observar o stop códon gerado como consequência da variante, originando uma proteína
truncada.
Tendo em vista os resultados das análises in silico e com a finalidade de

investigar se essas variantes poderiam ocasionar algum efeito deletério, decidimos
analisar se elas estavam presentes também em indivíduos controles. Essa análise
foi realizada em um total de 24 indivíduos controles, os quais fazem parte de um
banco de dados pertencente ao nosso grupo de pesquisa. Infelizmente, não
possuíamos dados de amostras de tecido cerebral de controles, portanto
investigamos somente amostras de sangue. Deste total de 24 indivíduos controles,
com amostras provenientes de sangue periférico, nós identificamos a variante no
gene ULK2 em 10 deles; a variante no gene EIF4E foi identificada em sete controles.
65
4.1.2 Variantes Germinativas Relevantes
Além dessas variantes que foram identificadas na forma de mosaicismo –

presentes apenas no tecido cerebral ou presentes apenas no sangue – nós
realizamos uma breve análise das variantes germinativas, portanto que não se
encontravam na forma de mosaicismo, e desta forma, estavam presentes tanto no
tecido cerebral como no sangue. Essa breve análise foi realizada com o intuito de
verificar se dentre todas as alterações germinativas, existia alguma que tivesse
maior relevância. Assim, analisando todos os genes das vias mTOR e Tau,
identificamos duas variantes germinativas que consideramos significativas, ambas
em genes pertencentes à via mTOR: uma delas no gene TSC1 e a outra no gene
ULK1.
O gene TSC1 está relacionado com a Esclerose Tuberosa, que é outro tipo de
malformação cortical e que possui similaridades histológicas com as DCFs. A
variante identificada neste gene foi encontrada em apenas um paciente, 541 – P19,
e se caracteriza por ser uma variante missense – quando é codificado um
aminoácido diferente do normal – da substituição de um nucleotídeo A por um T.
Além disso, também se caracteriza por ser uma variante ainda não descrita. A
cobertura do sequenciamento para essa variante é elevada, o que nos fornece maior
confiança – o valor da cobertura do tecido cerebral é de 91x e do sangue é de 61x.
A variante identificada no gene ULK1 também foi encontrada em apenas um
paciente, 44 – P13. Ela se caracteriza por ser uma variante sinônima – quando a
alteração do nucleotídeo não implica em mudança do aminoácido – caracterizada
por uma substituição de um nucleotídeo G por um A. Esta também é uma variante
ainda não descrita. Os valores de cobertura se encontram elevados, passando maior
confiabilidade: do tecido cerebral é de 227x e do sangue é de 106x. Entretanto, por
se tratar de uma variante sinônima, não ocorre modificação no aminoácido, e sendo
assim, ela só seria significativa para o nosso trabalho se o local onde a variante se
encontra fosse um sítio de ancoragem para microRNA. Fizemos essa análise
através do Software para busca in sílico de regiões de microRNA “DNA Intelligent
Analysis – microT v5.0” (diana.cslab.ece.ntua.gr). Como resultado, observamos que
o local da variante no ULK1, não se trata de um sítio de ancoragem para microRNA.
Posteriormente, essas duas variantes, nos genes TSC1 e ULK1, foram
66
analisadas quanto à possível patogenicidade que poderiam carregar. Isso foi

realizado por meio de dois programas: SIFT e Polyphen. Para a variante no gene
TSC1, o programa SIFT apontou como sendo uma variante tolerável, já o Polyphen
apontou como sendo uma variante provavelmente prejudicial. Para a variante no
gene ULK1, nenhum dos dois programas apontou resultados, provavelmente por se
tratar de uma variante sinônima, na qual não ocorre mudança no aminoácido.
Para essas duas variantes germinativas, também realizamos análises em
indivíduos controles. Como resultado, as variantes nos genes TSC1 e ULK1 não
foram identificadas em nenhum dos 24 controles analisados.
4.1.3. Resumo das variantes encontradas
Um breve resumo de todas as alterações identificadas pelo sequenciamento

de nova geração segue descrito abaixo, dividido por paciente.
4.1.3.1 Paciente 541/12 – P19
Paciente do sexo feminino portador de DCF do tipo IIA. Identificamos nesse

paciente, três variantes consideradas como significativas, nos genes: ULK2, EIF4E e
TSC1 (Figura 15).
67
ULK2 EIF4E
 Presente apenas no tecido  Presente apenas no

cerebral sangue
- Variante já descrita em casos - Variante já descrita em casos

de câncer; de câncer;
- Identificada em 10 de 24 - Identificada em 7 de 24
controles (amostras de sangue); controles (amostras de sangue);
- g.26374delT (NC_000017.11); - g.49486delT (NC_000004.12) ;
- Cobertura tecido: 256x; - Cobertura tecido: 329x;
- Cobertura sangue: 188x. - Cobertura sangue: 338x.
TSC1
 Presente no tecido
cerebral e no sangue
- Variante não descrita ;
- Missense ;
-A T ;
- Cobertura tecido: 91x ;
- Cobertura sangue: 61x ;
- Gene relacionado com

a Esclerose Tuberosa.
Figura 14. Resumo de todas as variantes identificadas no paciente 541/12 – P19, nos genes: ULK2, EIF4E, TSC1.
68
4.1.3.2 Paciente 44/11 – P13
Paciente do sexo masculino portador de DCF do tipo IIA. Neste paciente

também foram identificadas três variantes consideradas como significativas,
nos genes: ULK2, EIF4E e ULK1 (Figura 16).
ULK2 EIF4E
 Presente apenas no  Presente apenas no

sangue sangue
- Variante já descrita em casos de - Variante já descrita em casos de

câncer ; câncer ;
- Identificada em 10 de 24 - Identificada em 7 de
controles (amostras de sangue); 24 controles;
- g.26374delT (NC_000017.11) ; - g.49486delT (NC_000004.12) ;
- Cobertura tecido: 226x ; - Cobertura tecido: 329x ;
- Cobertura sangue: 107x. - Cobertura sangue: 338x.
ULK1
 Presente no tecido e no
sangue
- Variante não descrita ;
- Sinônima ;
- G A;
- Cobertura tecido: 227x ;
- Cobertura sangue: 106x.
Figura 15. Resumo de todas as variantes identificadas no paciente 44/11 – P13, nos genes: ULK2, EIF4E e ULK1.
69
4.2 Análise de Copy Number Variations (CNVs)
As mesmas amostras que fizemos a extração de DNA para o

sequenciamento, também foram utilizadas para a análise de CNVs,
acrescentando mais dois pacientes, os quais suas amostras foram obtidas
posteriormente (Tabela 10). Dessa forma, realizamos a análise de seis
pacientes, totalizando 12 amostras - seis amostras de tecido cerebral displásico
e seis de sangue periférico - fazendo o pareamento tecido- sangue da mesma
maneira que foi realizado no sequenciamento (Tabela 11). Também
queríamos identificar alterações em mosaicismo, as quais estavam presentes
no tecido cerebral e ausentes no sangue.
CNVs Sequenciamento
Registro de DNA do paciente Registro de DNA do paciente

Tecido Sangue Tecido Sangue
P19 541/12 P19 541/12
P13 44/11 P13 44/11
P16 193/13 P16 193/13
P20 742/12 P20 742/12
P2 814/10
P3 9/14
Tabela 11. Relação de todos os pacientes que foram utilizados para a análise de CNVs e para a análise do
sequenciamento. Observando que os quatro primeiros pacientes foram utilizados tanto para a análise de CNVs
como do sequenciamento, e os dois últimos foram adicionados posteriormente, sendo assim utilizados somente
para a análise de CNVs.
Registro de DNA do paciente Sexo Tipo de DCF

Tecido Sangue
P19 541/12 Feminino IIA
Tabela 12. Relação de todos os pacientes que foram analisados para CNVs. Podemos notar o registro de DNA
das amostras de tecido cerebral e de sangue periférico que se pareiam. Para cada paciente, temos a informação
do sexo e do tipo histopatológico de Displasia Cortical Focal.
70
Para a identificação dessas alterações estruturais, denominadas CNVs,

utilizamos como estratégia a técnica de Microarray, pelo kit CitoScanHD da Afimetrix.
Neste protocolo, podemos observar diversos pontos de checagem, nos quais
verificamos se até aquele momento, o experimento saiu como esperado. As etapas de
digestão, ligação dos adaptadores e PCR foram realizadas com sucesso. Podemos
visualizar abaixo um gel de agarose que representa a etapa de PCR com o padrão de
amplificação dos fragmentos genômicos entre 2000 e 150pb (Figura 17).
Figura 16. Visualização dos produtos de PCR em gel de agarose 2%. Amostras aleatórias. Nas laterais
podemos ver o marcador de peso molecular de 100pb.
Posteriormente, seguimos com as etapas de purificação com beads magnéticas,

quantificação e fragmentação do material amplificado. Todas essas etapas também
foram realizadas com sucesso e ao final da fragmentação, todas as amostras se
apresentaram com o padrão de fragmentos entre 125 e 25pb (Figura 18). Por fim foram
realizadas as etapas de marcação, hibridação, lavagem e escaneamento dos
microarranjos.
71
Figura 17. Visualização dos produtos da fragmentação em gel de agarose 2%. Amostras
aleatórias. Nas laterais, o marcador de peso molecular 50bp. A última canaleta corresponde ao
controle positivo.
Após o término dos experimentos, foi realizada a análise dos microarranjos

utilizando o programa Chromosome Analysis Suite. Para este trabalho, analisamos
somente alterações >100Kb, pois estas têm uma maior probabilidade de serem
patogênicas [61].
Como podemos visualizar abaixo (Tabela 13), diversas deleções e duplicações
foram encontradas. A maior parte delas já é descrita no banco de dados DGV, o qual
reúne informações de alterações estruturais identificadas em indivíduos sadios e
portanto, consideradas como normais. Entretanto, algumas são consideradas como
inéditas e ainda não foram descritas no DGV, sendo que estas possuem um
potencial patogênico a ser considerado.
72
73
74
Tabela 13. Todas as alterações estruturais, denominadas Copy Number

Variations, que foram identificadas em seis pacientes, pareando
amostras de tecido cerebral e sangue para um mesmo paciente. Os
registros de DNA que aparecem na mesma cor, simbolizam que são
amostras do mesmo paciente, uma delas proveniente de tecido cerebral
e a outra de sangue.
75
Em todos os pacientes analisados foram identificadas uma totalidade de 131

CNVs. O tamanho das CNVs variaram entre 100 kbp e 1.237 kbp, apresentando
tamanho médio de 261,8 kbp. Destas, 118 CNVs já eram descritas e 13 ainda não
foram descritas no DGV (banco de dados que abrange CNVs consideradas como
normais). Essas alterações estruturais podem ser tanto variações de perda, como de
ganho. Assim, dentre as 131 CNVs, 70 são variações de perda e 61 de ganho. A
média das CNVs encontradas que possuíam alteração de perda foi de 164 kbp, e
a média de todas aquelas que possuíam alteração de ganho foi de 359,6 kbp. A
média dos genes envolvidos nas alterações de perda foi de 8 genes, e nas
alterações de ganho foi de 14 genes. Portanto, houve maior predominância de
ganhos de regiões em relação às perdas (Tabela 13).
Total CNVs 131
Total CNVs de ganho 61
Total CNVs de perda 70
CNVs já descritas 118
CNVs não descritas 13
Range das CNVs 100 - 1.237 kbp
Média de tamanho de todas as CNVs 261,8 kbp
Média das CNVs de ganho 359,6 kbp
Média das CNVs de perda 164 kbp
Média dos genes envolvidos CNVs ganho 14 genes
Média dos genes envolvidos CNVs perda 8 genes
Tabela 14. Apresentação dos cálculos das CNVs da tabela 11. As médias e o range foram
calculados a partir do tamanho dos fragmentos (kbp).
Todas as 13 CNVs que ainda não foram descritas no DGV, tanto de tecido
como de sangue, seguem abaixo. Das 13 CNVs não descritas, seis aparecem na
forma de mosaicismo, ou seja, aparecem somente no tecido cerebral (Tabela 15).
76
Registro de CN State Tipo Cromossomo Tamnaho (kbp) Genes

DNA
P16 - tecido 1 perda 1 187 C1orf63, RHD, TMEM50A,
RHCE, TMEM57
P16 - tecido 2 ganho Y 157 RBMY3AP, TTTY8B, TTTY8
193/13 - 2 ganho Y 155 RBMY3AP, TTTY8B, TTTY8
sangue
RHCE, TMEM57
44/11 - 1 perda 14 543 -----
sangue
P19 - tecido 1 perda X 209 -----

RHCE, TMEM57
814/10 - 3 ganho 1 171 FLJ42875, PRDM16, MIR4251
sangue
814/10 - 3 ganho 16 183 GALNS, TRAPPC2L, PABPN1L,

sangue CBFA2T3
814/10 - 3 ganho 3 113 IFT122, RHO, H1FOO, PLXND1
sangue
814/10 - 3 ganho 1 330 PRDM16, ARHGEF16, MEGF6,
sangue MIR551A, TPRG1L, WDR8
P3 - tecido 1 perda 20 100 BMP7, MIR4325, SPO11,

RAE1
P3 - tecido 3 ganho 19 140 CRTC1, COMP, UPF1
Tabela 15. Relação de todas as alterações estruturais (CNVs) identificadas e que não são
descritas no banco de dados DGV, especificando o tipo de alteração, sua localização, seu
tamanho e os genes abrangidos. As cores iguais simbolizam amostras de tecido e sangue dos
mesmos pacientes. As setas indicam as alterações que aparecem na forma de mosaicismo,
somente no tecido cerebral.
Todas as alterações estruturais ainda não descritas no DGV e que aparecem

somente no tecido cerebral, possuindo assim um possível potencial patogênico,
podem ser observadas nas figuras abaixo, as quais foram dividas por paciente.
4.2.1 Pacientes P13, P16 e P19
Os indivíduos em questão possuem uma deleção de 187 kbp no cromossomo 1.

Essa CNV envolve os genes: C1orf63, RHD, TMEM50A, RHCE, TMEM57.
77
Também podemos notar que nessa mesma região, existem outras CNVs de ganho e
de perda já descritas no DGV, porém nenhuma delas abrangendo todos os genes
dessa alteração que encontramos. (Figura 18). Abaixo segue uma curta descrição
dos pacientes com esta deleção.
P13: Trata-se de um paciente do sexo masculino portador de Displasia Cortical
Focal do tipo IIA.
P16: Trata-se de um paciente do sexo masculino portador de Displasia Cortical
Focal do tipo IIB.
P19: Trata-se de um paciente do sexo feminino portador de Displasia Cortical
Focal do tipo IIA.
Figura 18. Análise de alta resolução da alteração estrutural no cromossomo 1 do indivíduo P16.
Essa mesma alteração também aparece nos indivíduos P13 e P19. Notar na parte superior da
figura a barra em vermelho que representa a variação no número de cópias do indivíduo, vermelho
representando alteração de perda e azul de ganho. Logo abaixo podemos observar barras em
vermelho e azul que são as variações já descritas em bancos de dados e não associadas a
quadros patológicos. Também na parte inferior, encontramos os genes englobados pela variação:
C1orf63, RHD, TMEM50A, RHCE, TMEM57.
78
Investigamos cada um dos genes os quais essa alteração estrutural abrange,

para relacioná-los com algum fenótipo semelhante ao das DCFs ou a algum
processo que seja essencial na formação da patologia. Dentre todos os genes,
aquele que consideramos como sendo o mais significativo é o TMEM57, o qual é
expresso durante a diferenciação neuronal.
Posteriormente, utilizamos outros dois bancos de dados, o ISCA e o Decipher,
os quais reúnem informações sobre alterações estruturais que possuem uma
importância clínica já relatada. Essa etapa foi realizada a fim de investigar nesses
bancos de dados a existência de alterações estruturais que se sobrepõem,
inteiramente ou em parte, à alteração identificada no trabalho.
No Decipher não obtivemos nenhum resultado. Entretanto, no ISCA
encontramos uma alteração já descrita, com um tamanho de 183,05kbp, o qual é
bem próximo ao tamanho da alteração que identificamos, que possui 187kbp. Esta
alteração sobreposta também se trata de uma deleção e é relacionada com um
fenótipo de atraso intelectual. Contudo, sua interpretação é incerta (Figura 19).
Figura 19. Alteração estrutural encontrada no banco de dados ISCA que se sobrepõe a alteração
estrutural de uma deleção de 187kbp identificada neste trabalho.
79
4.2.2 Paciente P3
Trata-se de um paciente do sexo masculino portador de Displasia Cortical Focal

do tipo IIB. O indivíduo em questão possui uma deleção de 100 kbp no cromossomo
20. Essa CNV envolve os genes: BMP7, MIR4325, SPO11, RAE1 (Figura 20).
Esse indivíduo também possui uma duplicação de 140 kbp no cromossomo 19. Essa
CNV envolve os genes: CRTC1, COMP, UPF1 (Figura 21). Nos dois casos, também
notamos que não existem descritas no DGV outras CNVs abrangendo todos esses
genes.
Notar na parte superior da figura a barra em vermelho que representa a variação no número de
cópias do indivíduo, vermelho representando alteração de perda e azul de ganho. Logo abaixo
podemos observar que não existem variações que já são descritas em bancos de dados e não
associadas a quadros patológicos. Também na parte inferior, encontramos os genes englobados
pela variação: BMP7, MIR4325, SPO11, RAE1
80
Notar na parte superior da figura a barra em azul que representa a variação no número de cópias
do indivíduo, azul representando alteração de ganho e vermelho de perda. Logo abaixo podemos
observar que não existem variações que já são descritas em bancos de dados e não associadas a
quadros patológicos. Também na parte inferior, encontramos os genes englobados pela variação:
CRTC1, COMP, UPF1.
Para essas alterações, também investigamos cada um dos genes que elas
abrangem. No caso da deleção de 100kpb no cromossomo 20, dentre todos os
genes envolvidos, consideramos o BMP7 como o mais relevante. Este gene está
relacionado com processos de proliferação e diferenciação celular, além de ser
atuante durante a morfogênese neuronal. No caso da duplicação de 140 kbp no
cromossomo 19, dentre todos os genes os quais essa alteração abrange,
consideramos o CRTC1 como sendo o mais relevante. Este gene está envolvido em
mecanismos de plasticidade sinaptica, desempenhando um papel na consolidação
da memória e na manutenção de neurônios.
Após essa análise acerca dos genes, também investigamos nos bancos de
dados ISCA e Decipher se existia neles alguma alteração já descrita se sobrepondo
às alterações que nós identificamos. Para a deleção de 100 kbp no cromossomo 20,
não obtivemos nenhum resultado, em ambos os bancos de dados. Para a duplicação
de 140 kbp no cromossomo 19 obtivemos um resultado apenas no Decipher. A
81
alteração descrita que se sobrepõe à nossa, também se trata de uma duplicação,

com um tamanho de 188,06 kbp. Ela abrange um total de cinco genes, sendo que
destes, três são genes em comum com a nossa alteração (Figura 22). Além disso, é
considerada como uma alteração possivelmente patogênica, com os fenótipos de
crises generalizadas, atraso intelectual e macrocefalia.
Figura 22. Nesta figura podemos observar, na barra em azul, a alteração estrutural descrita no
Decipher , uma duplicação de 188,06 kbp com um fenótipo que inclui crises generalizadas e a qual
se sobrepõe a alteração estrutural identificada neste trabalho, que se trata de uma duplicação de
140 kbp. Mais a cima podemos observar todos os cinco genes que essa alteração descrita
abrange, sendo três deles em comum com a alteração que nós identificamos: CRTC1, COMP e
UPF1.
Todas essas alterações citadas anteriormente – não descritas no banco de dados

DGV e identificadas na forma de mosaicismo, apenas no tecido cerebral displásico -
também foram analisadas em indivíduos controles da população brasileira, os quais
fazem parte de um banco de dados proveniente do nosso grupo de
pesquisa.Investigamos a presença dessas alterações em um total de 104 indivíduos
controles. Os resultados seguem abaixo na Tabela 16.
82
Análise em Indivíduos
Paciente CNV - Tipo CNV - Tamanho Genes
Controles
P13 C1orf63, RHD,

Alteração descrita em
P16 Deleção 187 kbp TMEM50A, RHCE,
três controles
TMEM57
P19
BMP7, MIR4325,
Deleção 100 kbp
SPO11, RAE1 Alterações não
P3
CRTC1, COMP, descritas em controles.
Duplicação 140 kbp
UPF1
Tabela 16. Relação de todas as alterações que foram analisadas em 104 indivíduos controles da
população brasileira, especificando os detalhes da alteração e o código do paciente.
83
5. DISCUSSÃO
As Displasias Corticais Focais compreendem um importante foco de estudo,

primeiro por estarem associadas a crises epilépticas refratárias de difícil controle, e
também, por se tratar de um distúrbio de difícil diagnóstico. Portanto, uma melhor
compreensão dos processos que envolvem as DCFs é de extrema significância.
Já sabemos que as DCFs se assemelham histologicamente com outras
malformações corticais: a Esclerose Tuberosa e a Hemimegaencefalia. Dessa forma,
buscamos compreender as DCFs convergindo todos os mecanismos já elucidados
dessas outras duas patologias. Assim, nos decidimos por estudar, como prioridade,
duas importantes vias moleculares: mTOR e Tau.
Neste trabalho investigamos duas classes de alterações genômicas que podem
causar modificações nessas vias e se relacionar com a etiologia das Displasias
Corticais Focais, que são: alterações pontuais e alterações estruturais.
As alterações pontuais se caracterizam pelos polimorfismos de nucleotídeo
simples (SNPs) e pelas pequenas inserções e deleções (Indels). Existem três tipos
de alterações pontuais: as mutações herdadas, as mutações “de novo” e as
mutações em mosaicismo. O nosso foco foi nas mutações em mosaicismo, devido
às evidências já relatadas anteriormente.
As alterações estruturais, denominadas Copy Number Variations (CNVs), são
alterações as quais diferem do número de variações de cópias do genoma de
referência. Neste caso, também nos focamos em alterações estruturais que
aparecem na forma de mosaicismo.
5.1 Alterações Pontuais
5.1.1 Paciente 541/12 – P19
O caso em questão se trata de um paciente do sexo feminino portador de

Displasia Cortical Focal do tipo IIA.
84
 Variantes em mosaicismo – Genes ULK2 e EIF4E
Primeiramente, essas duas variantes em genes pertencentes a via mTOR

foram consideradas como relevantes por se encontrarem em região de splicing.
A variante no gene ULK2 é uma deleção de um nucleotídeo (T) que aparece
na forma de mosaicismo, identificada apenas no tecido cerebral, estando ausente no
sangue. A variante já é descrita em casos de cancer de fígado, nos quais ela
também se encontra como mosaico. Isso sugere que da mesma maneira em que a
variante atua no câncer, estando presente apenas nas células tumorais, ela também
pode atuar nas DCFs, por estar presente apenas nas células do tecido displásico.
Além disso, o gene ULK2 é atuante durante o desenvolvimento cerebral. Jin
Yan, et. al. [66] relatam que realizaram um experimento de hibridação in situ em
embriões de rato, e desta forma eles detectaram transcritos do gene ULK2 durante o
desenvolvimento cerebral, sugerindo assim que este gene possui um papel
essencial no desenvolvimento do sistema nervoso. Sebastian Alers, et. al. [67]
realizaram experimentos com os quais demonstraram que a deleção dos genes
ULK2 e/ou ULK1 conduzia a formação de axônios mais curtos e o aumento de
ramificações axonais em neurônios embrionários, portanto isso evidencia que
mutações no gene ULK2 podem conduzir à formação de tipos celulares aberrantes.
Outra evidência é relatada por Stacey Lee, et. al. [68], que demonstram que o ULK2
atua no processo de dendritogênese, durante a maturação neuronal. A variante
identificada no gene EIF4E se trata também da deleção de uma timina. Ela também
aparece na forma de mosaicismo, mas neste caso, foi encontrada apenas no
sangue, estando ausente no tecido cerebral. Semelhante ao caso da variante no
gene ULK2, esta também já foi descrita em casos de câncer, nos quais a alteração
se encontrava apenas nas células tumorais. Contudo, como essa variante no EIF4E
aparece apenas no sangue e não no tecido displásico, delinear uma relação com as
DCFs se torna um pouco mais distante. Mas apesar disso, o gene EIF4E possui uma
considerável importância durante o desenvolvimento celular. Diane C. Fingar, et. al,
[69] demonstraram que uma super expressão desse gene ocasiona um aumento no
tamanho celular. Portanto, o EIF4E está relacionado com mecanismos de regulação
do crescimento celular, sendo que uma mutação neste gene poderia ocasionar a
formação de tipos celulares aberrantes.
85
Tendo em vista a importância desses genes no desenvolvimento cerebral e

celular, utilizamos ferramentas in silico para realizar testes de predição. Com essas
análises, observamos que a deleção de uma timina, tanto no gene ULK2 como no
EIF4E, ocasiona modificações no fenômeno de splicing, e também, a formação de
um stop códon prematuro, levando a uma proteína truncada.
Entretanto, apesar de diversas evidências que convergiam para uma possível
atuação dos genes ULK2 e EIF4E nos mecanismos das DCFs, essas duas variantes
também foram identificadas em indivíduos controles. Analisamos um total de 24
controles. Essa análise foi realizada a partir de amostras de sangue, pois
infelizmente ainda não possuíamos amostras de tecido cerebral de indivíduos
controles sequenciadas. A variante no gene ULK2 foi identificada em 10 dos 24
controles e a variante no gene EIF4E foi identificada em sete deles. Apesar de
termos um caso no qual a variante no ULK2 é identificada apenas no tecido cerebral
displásico, se encontrando ausente no sangue, o fato de ter sido identificada
também em amostras de sangue de indivíduos controles, diminui a probabilidade
de essa variante ser significativa. Mas apesar disso, não devemos descartar esses
genes, levando em consideração a importância de ambos no desenvolvimento
celular e cerebral, as análises in silico realizadas, as quais demonstram a origem de
proteínas truncadas decorrentes dessas variantes, e por fim, levando em conta o
fato de já terem sido descritas em casos de câncer, nos quais essas variantes foram
identificadas apenas nos tecidos tumorais. A partir deste ponto, uma alternativa de
estudos futuros é testar essas variantes em modelos animais, a fim de tentar
determinar a relevância desses genes ou então, descartá-los.
 Variante germinativa – Gene TSC1
Apesar de nos focarmos apenas em variantes em mosaicismo neste trabalho,

também fizemos uma breve análise das variantes germinativas com o intuito de
identificar variantes potencialmente significantes. Uma análise mais completa
dessas variantes germinativas será realizada futuramente. Dessa forma, com essa
breve análise, foram identificadas duas variantes germinativas, ambam em genes da
via mTOR, consideradas mais relevantes.
86
O paciente em questão, 541/12 – P19, carrega uma dessas variantes, no

gene TSC1. Essa variante se trata de uma substituição de uma adenina por uma
timina, sendo caracterizada como uma alteração missense – quando acontece troca
no aminoácido. Além disso, é uma variante ainda não descrita em bancos de dados.
O gene TSC1 codifica a proteína Hamartina [43], sendo que esse gene junto
com o gene TSC2, formam um complexo que tem um papel inibitório na via mTOR.
Como a via mTOR está envolvida em processos regulatórios de crescimento celular
e proliferativos, uma mutação patogênica no gene TSC1 pode acarretar em um
excessivo crescimento e proliferação das células, devido a perda ou diminuição da
atividade das proteínas codificadas e da consequente hiperativação da via mTOR
[44; 45; 46]. Já foi relatado que o TSC1 está envolvido com as lesões multifocais
(túberos) da Esclerose Tuberosa, a qual possui características celulares e
histopatológicas muito semelhantes com as DCFs dos tipos IIA e IIB [42]. Portanto,
na ET as mutações já identificadas nos genes TSC1 e TSC2 estão relacionadas
com a formação dos tipos celulares aberrantes, sendo que esse mesmo mecanismo,
pode também estar acontecendo nas DCFs; pelos resultados das análises de
predição, o programa Polyphen a considerou como provavelmente prejudicial.
A princípio, pensamos que este poderia ser um caso de ET, e não de DCF.
Uma importante etapa do diagnóstico desses dois distúrbios é o exame
histopatológico. A histopatologia das DCFs e da ET é praticamente idêntica, sendo
que o que difere um distúrbio do outro é a clínica, portanto, são distúrbios com
características muito próximas o que dificulta o diagnostico. Na ET identificamos dois
tipos celulares aberrantes: os neurônios dismórficos e as células em balão. Porém,
constatamos que esse paciente se trata de um caso de DCF do tipo IIA, a qual não
se caracteriza pela presença de células em balão. Poderíamos, com esse fato,
excluir a possibilidade de ser o diagnóstico de ET, entretanto para classificar as
DCFs em tipos IIA e IIB – que se diferenciam pela presença ou ausência de células
em balão – também é realizado o exame histopatológico, e neste caso, a realização
do diagnostico também é extremamente complicada. Portanto, apesar desse fato,
existe uma possibilidade de que esse paciente possua ET e não DCF, sendo
necessário rever todos os exames e a clínica do paciente com minucioso cuidado.
Outro fato relevante sobre essa variante no gene TSC1 é que ela ainda não é
descrita em bancos de dados e, além disso, ela não foi identificada em nenhum dos
87
24 indivíduos controles que foram analisados.
5.1.2 Paciente 44/11 – P13
Esse paciente é um indivíduo do sexo masculino, portador de DCF do tipo IIA.
 Variantes em mosaicismo – Genes ULK2 e EIF4E
Neste paciente, identificamos duas variantes na forma de mosaicismo, as

quais foram consideradas como sendo as mais significativas pelo fato de se situarem
em região de splicing. A variante identificada no gene ULK2 é a mesma variante que
foi identificada no paciente 541/12 – P19, relatada anteriormente. Entretanto,
enquanto que no paciente 541/12 – P19 essa variante foi encontrada apenas no
tecido cerebral, no paciente 44/1 – P13 ela foi encontrada apenas no sangue,
estando ausente no tecido cerebral. Como citado anteriormente, o gene ULK2 possui
um papel essencial durante o desenvolvimento cerebral. Além disso, os testes de
predição demonstraram que a variante causa uma modificação no fenômeno de
splicing e a formação de uma proteína truncada, devido a um stop códon prematuro.
Como essa variante já é descrita em casos de câncer, nos quais ela aparece
somente nas células tumorais, poderíamos pensar em uma possibilidade de ela
apresentar efeitos deletérios no caso de estar presente somente no tecido
displásico. Entretanto, além de ela ter sido identificada apenas no tecido, neste caso,
a identificamos somente no sangue, o que nos faz pensar que talvez um processo
distinto esteja atuando na patologia, sendo que mais estudos são necessários para a
elucidação desta questão. Apesar de essa alteração apresentar um elevado valor de
cobertura em ambos os pacientes, o que aumenta a confiabilidade no resultado,
acreditamos que será necessário uma futura validação para confirmar se não se
trata de um erro de sequenciamento. Além disso, a variante também foi identificada
no sangue de indivíduos controles. Do total de 24 controles, a identificamos em 10
deles. Esses fatos sugerem que essa variante possui uma baixa probabilidade de
apresentar efeitos deletérios.
A variante no gene EIF4E identificada neste paciente é a mesma que foi
relatada no paciente 541/12 – P19, portanto as informações sobre essa variante já
constam anteriormente.
88
 Variante germinativa – Gene ULK1
Outra variante germinativa considerada como sendo relevante foi identificada

no paciente 44/11 – P13, no gene ULK1. O gene ULK1 faz parte da mesma família
do gene ULK2, portanto existem evidências demonstrando que ele também é
atuante durante o desenvolvimento cerebral. Como já citado anteriormente, já
existem relatos de que os genes ULK1 e ULK2, quando deletados, conduzem a
formação de neurônios anormais. Além disso, o gene ULK1 interage com uma
proteína, denominada de SynGAP, a qual desempenha um importante papel no
mecanismo de sinapse [67].
Essa variante se trata de uma substituição de uma guanina por uma adenina,
sendo que ela se caracteriza como uma variante sinônima – quando não há
modificação no tipo de aminoácido. Apesar de ser uma variante sinônima e não
acarretar em mudança no aminoácido, sua importância se dá na possibilidade de ser
um sítio de ancoragem para microRNA. Além disso, nós a consideramos como uma
variante significativa pelo fato de ela ainda não ter sido descrita em banco de dados
e não ter sido identificada em nenhum dos 24 indivíduos controles que foram
analisados. Sendo assim, utilizamos o Software para busca in sílico de regiões de
microRNA “DNA Intelligent Analysis – microT v5.0” (diana.cslab.ece.ntua.gr) e
observamos que o local da variante no gene ULK1, não se trata de um sítio de
ancoragem para microRNA. Portanto, apesar dessa variante não ter sido identificada
em indivíduos controles, a chance de ela ocasionar um efeito deletério é baixa.
5.2 Alterações Estruturais (CNVs)
Neste trabalho, foram identificadas um total de 13 alterações estruturais ainda

não descritas no banco de dados DGV. Dentre elas, seis são alterações que
aparecem na forma de mosaicismo – estão presentes apenas no tecido cerebral
displásico – as quais foram o foco do trabalho e serão discutidas a seguir, divididas
por pacientes.
89
5.2.1 Pacientes 44/11 – P13 ; 541/12 – P19 e 193/13 – P16
O paciente 44/11 – P13 trata-se de um indivíduo do sexo masculino, portador de

DCF do tipo IIA, o qual carrega variantes pontuais em mosaicismo nos genes ULK2
e EIF4E e uma variante pontual germinativa no gene ULK1. O paciente 541/12 – P19
trata-se de um indivíduo do sexo feminino, portador de DCF do tipo IIA, que carrega
variantes pontuais em mosaicismo nos genes ULK2 e EIF4E e uma variante pontual
germinativa no gene TSC1. O paciente 193/13 – P16 trata-se de um indivíduo do
sexo masculino, portador de DCF do tipo IIB.
A variante estrutural que foi identificada apenas no tecido cerebral destes três
indivíduos se consiste em uma deleção de 187kbp no cromossomo 1, abrangendo
cinco genes, dentre os quais, o gene TMEM57 foi considerado como o mais
relevante. O gene TMEM57 é atuante durante o desenvolvimento neuronal. Anelia
Kuvbachieva, et. al. [70] demonstraram que o gene TMEM57 aparecia super
expresso em ratos que possuíam uma mutação no gene Reeler – que faz com que o
animal desenvolva uma migração neuronal anormal. Além disso, esse grupo
concluiu, por meio de experimentos de hibridação in situ, que esse gene é
específico do cérebro e expresso durante o desenvolvimento neuronal, o que nos
sugere que alterações envolvendo esse gene podem levar ao desenvolvimento
anormal de células neuronais.
Além dessas evidências, também constatamos que essa CNV possui
sobreposição com outra CNV a qual é descrita no banco de dados ISCA. Essa CNV
descrita no ISCA também se trata de uma deleção, possui um tamanho bem
semelhante com a CNV identificada neste trabalho e também, está relacionada com
o fenótipo de atraso intelectual, característica também observada nas DCFs;
contudo, sua interpretação é incerta e apesar de estar descrita no ISCA, o qual é um
banco de dados que reúne alterações estruturais com uma importância clínica já
relatada, não podemos concluir que ela é considerada patogênica. Também
investigamos se essa CNV estava presente em indivíduos controles, sendo que do
total de 104 controles, ela foi identificada em três deles. Apesar de três controles ser
um número extremamente baixo em relação ao total (104), o fato de essa alteração
ter sido identificada em indivíduos sadios, diminui a probabilidade de possuir algum
efeito deletério.
90
5.2.2 Paciente 9/14 – P3
Esse paciente trata-se de um indivíduo do sexo masculino, portador de DCF do

tipo IIB. Neste paciente, foram identificadas duas alterações estruturais em
mosaicismo, presentes apenas no tecido cerebral, as quais ainda não são descritas
no DGV. Uma dessas alterações é uma deleção de 100kbp no cromossomo 20,
abrangendo um total de quatro genes, dos quais consideramos como o mais
relevante o gene BMP7. A outra alteração é uma duplicação de 140kbp no
cromossomo 19, abrangendo três genes, dentre os quais consideramos como o mais
relevante o gene CRTC1.
O gene BMP7 também está envolvido no desenvolvimento do sistema nervoso.
Brigid LM Hogan [71], descreveu a importância dos genes da família BMP em
diversos processos de desenvolvimento, e descreve o gene BMP7 como sendo
atuante durante a proliferação e diferenciação celular, processos os quais são
decisivos na origem de uma desorganização cortical nas DCFs. Além disso, Monika
Podkowa, et. al. [72], também relatam a importância dos genes BMPs no
desenvolvimento neuronal, mais especificamente no controle de remodelação do
citoesqueleto durante a morfogênese neuronal.
O gene CRTC1, também conhecido como TORC1, desempenha diversas
funções no SNC. Krisztián A. Kovacs, et. al. [73] relatam que esse gene possui um
importante papel na plasticidade sináptica, na consolidação da memória e na
manutenção dos neurônios. Além disso, outros trabalhos relatam a importância do
CRTC1 durante o desenvolvimento neural, mais especificamente, durante o
desenvolvimento dendrítico, no qual atua junto com outro gene, o BDNF [74, 75].
Coincidentemente, o gene BDNF, além de atuar em conjunto com o CRTC1 durante
o desenvolvimento dendrítico, também induz a expressão do BMP7 durante a
migração neuronal, em neurônios que estão se desenvolvendo [76].
Portanto, com essas relações, podemos observar que mutações em ambos os
genes, BMP7 e CRTC1, também podem acarretar em um desenvolvimento anormal
dos neurônios, ocasionando uma desorganização na arquitetura cortical.
O gene CRTC1 é um dos principais genes que são abrangidos pela duplicação
de 140kbp no cromossomo 19. Nas análises in silico, observamos que essa CNV é
sobreposta por outra CNV descrita no banco de dados Decipher. Essa alteração
descrita, também se trata de uma duplicação, possui um tamanho similar com a
91
alteração identificada neste trabalho, é considerada como sendo possivelmente

patogênica e possui fenótipos de macrocefalia, atraso intelectual e crises
generalizadas, sendo este último, um fenótipo extremamente frequente nos casos de
DCFs.
Além disso, nenhumas dessas duas alterações foram identificadas nos 104
indivíduos controles analisados.
Esses fatos nos aproximam ainda mais da hipótese de que essa alteração
estrutural possa estar contribuindo para a formação de processos anormais que
caracterizam as DCFs.
92
6. CONCLUSÃO
6.1. . Alterações de Sequência
 Pelo sequenciamento de quatro pacientes, pareando amostras de sangue e tecido

displásico, em uma primeira análise, na qual investigamos um tipo de mosaicismo
mais geral - entre tecidos - nós confirmamos a presença de variantes na forma de
mosaicismo em genes das vias mTOR e Tau.
 Aquelas variantes que consideramos como sendo as mais relevantes se encontram
em genes da via mTOR – genes ULK2 e EIF4E – e mais especificamente, em
regiões de splicing.
 A variante no gene ULK2 foi identificada em dois pacientes – em um deles ela
estava presente apenas no tecido cerebral displásico, e no outro paciente, se
encontrava presente apenas no sangue.
 A variante no gene EIF4E foi identificada em dois pacientes, estando presente
apenas no sangue.
 Pelas análises desses dois genes, observamos que ambos estão ligados com
mecanismos de desenvolvimento celular e neural.
 Como resultado das análises de predição, confirmamos que como consequência
dessas variantes ocorre a formação de proteínas truncadas, modificando o
fenômeno de splicing.
 Essas duas variantes já foram descritas em casos de câncer, nos quais elas se
encontravam presentes apenas nas células tumorais, portanto, também na forma de
mosaicismo.
 Pela análise das amostras de sangue de 24 indivíduos controles, a variante no gene
ULK2 foi identificada em 10 deles e a no gene EIF4E foi identificada em 7 deles.
 Além das variantes em mosaicismo, foi realizada uma breve análise das variantes
germinativas das vias mTOR e Tau, pela qual identificamos duas variantes
significativas nos genes TSC1 e ULK1, ambos pertencentes a via mTOR.
 A variante no gene TSC1 se trata de uma variante missense ainda não descrita.
Pelas análises in silico, o software Polyphen a considerou como provavelmente
patogênica.
93
 A variante no gene ULK1 se trata de uma variante sinônima ainda não descrita.
 Pelas análises in silico observamos que a região dessa variante não é um sítio de
ancoragem para micro RNA.
 Essas duas variantes não foram identificadas em nenhum dos 24 indivíduos
controles analisados.
6.2 Alterações estruturais (CNVs)
 Pela análise de seis pacientes, pareando amostras de sangue e tecido cerebral

displásico, identificamos um total de 131 CNVs. Deste total, 13 não estavam
descritas no DGV,e destas, seis apareceram na forma de mosaicismo – somente no
tecido cerebral.
 Uma das CNVs que se encontrava na forma de mosaicismo, foi identificada em três
pacientes e se trata de uma deleção de 187 kpb no cromossomo 1. Havia uma CNV
sobreposta a essa que estava descrita no ISCA, entretanto sua interpretação era
incerta. Um dos genes que essa alteração abrange, o TMEM57, é atuante durante a
diferenciação neuronal. Pela análise de 104 indivíduos controles, a identificamos em
três deles.
 Identificamos no paciente P3 duas CNVs que se encontravam somente no tecido
cerebral. Uma delas se trata de uma deleção de 100 kbp no cromossomo 20. Um
dos genes que essa alteração abrange, o BMP7, está relacionado com mecanismos
de proliferação e diferenciação celular, sendo atuante durante a morfogênese
neuronal. A outra CNV se trata de uma duplicação de 140 kbp no cromossomo 19. O
CRTC1 é um importante gene o qual essa alteração abrange, sendo atuante durante
o desenvolvimento neuronal. Constatamos a existência de uma CNV descrita no
Decipher que se sobrepõe à CNV de 140 kbp que identificamos; essa alteração já
descrita possui fenótipos de crises generalizadas, atraso intelectual e macrocefalia,
além disso, é considerada como provavelmente patogênica. Nenhuma dessas duas
CNVs foram identificadas em indivíduos controles.
 Portanto, confirmamos a presença de CNVs em pacientes com DCF, as quais
aparecem somente no tecido cerebral displásico. Essas alterações abrangem genes
com importantes funções no desenvolvimento neuronal e, além disso, uma delas se
sobrepõe a outra alteração que é considerada possivelmente patogênica.
94
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99
Anexo 1. Relação de todos os genes analisados da via mTOR, detalhando o nome completo de cada gene e sua respectiva
localização.
PIK3CD phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase, catalytic subunit delta [Homo sapiens (human)] Chromosome 1
MTOR mechanistic target of rapamycin (serine/threonine kinase) [Homo sapiens (human)] Chromosome 1
RPS6KA1 ribosomal protein S6 kinase, 90kDa, polypeptide 1 [Homo sapiens (human)] Chromosome 1
RRAGC Ras-related GTP binding C [Homo sapiens (human)] Chromosome 1
PIK3R3 phosphoinositide-3-kinase, regulatory subunit 3 (gamma) [Homo sapiens (human)] Chromosome 1
PRKAA2 protein kinase, AMP-activated, alpha 2 catalytic subunit [Homo sapiens (human)] Chromosome 1
AKT3 v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 3 [Homo sapiens (human)] Chromosome 1
IRS1 insulin receptor substrate 1 [Homo sapiens (human)] Chromosome 2
CAB39 calcium binding protein 39 [Homo sapiens (human)] Chromosome 2
EIF4E2 eukaryotic translation initiation factor 4E family member 2 [Homo sapiens (human)] Chromosome 2
PIK3CB phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase, catalytic subunit beta [Homo sapiens (human)] Chromosome 3
PIK3CA phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase, catalytic subunit alpha [Homo sapiens (human)] Chromosome 3
EIF4E eukaryotic translation initiation factor 4E [Homo sapiens (human)] Chromosome 4
RICTOR RPTOR independent companion of MTOR, complex 2 [Homo sapiens (human)] Chromosome 5
PRKAA1 protein kinase, AMP-activated, alpha 1 catalytic subunit [Homo sapiens (human)] Chromosome 5
PIK3R1 phosphoinositide-3-kinase, regulatory subunit 1 (alpha) [Homo sapiens (human)] Chromosome 5
EIF4E1B eukaryotic translation initiation factor 4E family member 1B [Homo sapiens (human)] Chromosome 5
TNF tumor necrosis factor [Homo sapiens (human)] Chromosome 6
VEGFA vascular endothelial growth factor A [Homo sapiens (human)] Chromosome 6
RRAGD Ras-related GTP binding D [Homo sapiens (human)] Chromosome 6
RPS6KA2 ribosomal protein S6 kinase, 90kDa, polypeptide 2 [Homo sapiens (human)] Chromosome 6
PIK3CG phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase, catalytic subunit gamma [Homo sapiens (human)] Chromosome 7
BRAF v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B [Homo sapiens (human)] Chromosome 7
RHEB Ras homolog enriched in brain [Homo sapiens (human)] Chromosome 7
EIF4EBP1 eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1 [Homo sapiens (human)] Chromosome 8
IKBKB inhibitor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells, kinase beta [Homo sapiens (human)] Chromosome 8
RRAGA Ras-related GTP binding A [Homo sapiens (human)] Chromosome 9
RPS6 ribosomal protein S6 [Homo sapiens (human)] Chromosome 9
TSC1 tuberous sclerosis 1 [Homo sapiens (human)] Chromosome 9
DDIT4 DNA-damage-inducible transcript 4 [Homo sapiens (human)] Chromosome 10
PTEN phosphatase and tensin homolog [Homo sapiens (human)] Chromosome 10
INS insulin [Homo sapiens (human)] Chromosome 11
RPS6KB2 ribosomal protein S6 kinase, 70kDa, polypeptide 2 [Homo sapiens (human)] Chromosome 11
EIF4B eukaryotic translation initiation factor 4B [Homo sapiens (human)] Chromosome 12
IGF1 insulin-like growth factor 1 (somatomedin C) [Homo sapiens (human)] Chromosome 12
ULK1 unc-51 like autophagy activating kinase 1 [Homo sapiens (human)] Chromosome 12
CAB39L calcium binding protein 39-like [Homo sapiens (human)] Chromosome 13
HIF1A hypoxia inducible factor 1, alpha subunit (basic helix-loop-helix transcription factor) [Homo sapiens (human)] Chromosome 14
ULK3 unc-51 like kinase 3 [Homo sapiens (human)] Chromosome 15
TSC2 tuberous sclerosis 2 [Homo sapiens (human)] Chromosome 16
MLST8 MTOR associated protein, LST8 homolog (S. cerevisiae) [Homo sapiens (human)] Chromosome 16
PDPK1 3-phosphoinositide dependent protein kinase 1 [Homo sapiens (human)] Chromosome 16
PRKCB protein kinase C, beta [Homo sapiens (human)] Chromosome 16
MAPK3 mitogen-activated protein kinase 3 [Homo sapiens (human)] Chromosome 16
PIK3R5 phosphoinositide-3-kinase, regulatory subunit 5 [Homo sapiens (human)] Chromosome 17
ULK2 unc-51 like autophagy activating kinase 2 [Homo sapiens(human)] Chromosome 17
RPS6KB1 ribosomal protein S6 kinase, 70kDa, polypeptide 1 [Homo sapiens (human)] Chromosome 17
STRADA STE20-related kinase adaptor alpha [Homo sapiens (human)]
100 Chromosome 17
PRKCA protein kinase C, alpha [Homo sapiens (human)] Chromosome 17
RPTOR regulatory associated protein of MTOR, complex 1 [Homo sapiens (human)] Chromosome 17
99
100
STK11 serine/threonine kinase 11 [Homo sapiens (human)] Chromosome 19

PIK3R2 phosphoinositide-3-kinase, regulatory subunit 2 (beta) [Homo sapiens (human)] Chromosome 19
AKT1S1 AKT1 substrate 1 (proline-rich) [Homo sapiens (human)] Chromosome 19
PRKCG protein kinase C, gamma [Homo sapiens (human)] Chromosome 19
MAPK1 mitogen-activated protein kinase 1 [Homo sapiens (human)] Chromosome 22
RPS6KA3 ribosomal protein S6 kinase, 90kDa, polypeptide 3 [Homo sapiens (human)] Chromosome X
RRAGB Ras-related GTP binding B [Homo sapiens (human)] Chromosome X
RPS6KA6 ribosomal protein S6 kinase, 90kDa, polypeptide 6 [Homo sapiens (human)] Chromosome X
Anexo 2. Relação de todos os genes analisados da via Tau, detalhando o nome completo de cada gene e sua respectiva
localização.
PSEN1 presenilin 1 Chromosome 14

MAPT microtubule-associated protein tau [Homo sapiens(human)] Chromosome 17
APP amyloid beta (A4) precursor protein [Homo sapiens (human)] Chromosome 21
PSEN2 presenilin 2 [Homo sapiens (human)] Chromosome 1
101

ESTUDOS MOLECULARES DAS VIAS DE SINALIZAÇÃO mTOR E TAU NAS DISPLASIAS CORTICAIS FOCAIS

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS

MARCELLA GONÇALVES MAZUTTI

“ESTUDOS MOLECULARES DAS VIAS DE

“ESTUDOS MOLECULARES DAS VIAS DE

Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da

Orientadora: Profa. Dra. Iscia Teresinha Lopes Cendes

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL

ORIENTADOR: PROF. DRA. ISCIA TERESINHA LOPES CENDES

COORIENTADOR: PROF. DR. FABIO ROSSI TORRES

1. PROFA. DRA. ISCIA TERESINHA LOPES CENDES

2. PROF. DR. FABIO ROGERIO

3. PROFA. DRA. ANA LUCIA BRUNIALTI GODARD

Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Médica da Faculdade de Ciências

A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora

Data: DATA DA DEFESA 20/10/2015

Agradeço primeiramente a Deus, que esteve sempre me dando forças e guiando o

As equipes de neurocirurgia e patologia do Hospital das Clínicas da Unicamp, as

As epilepsias constituem um dos grupos de doenças neurológicas graves

MDC: Malformação do desenvolvimento cortical DCF: Displasia Cortical Focal

ET: Esclerose Tuberosa HME: Hemimegaencefalia

CNV: Copy Number Variations

NGS: Next Generation Sequencing

Tabela 1. Relação de todos os pacientes que foram sequenciados.

Tabela 2. Parâmetros de qualidade dos DNAs de tecido cerebral e sangue antes de

Tabela 3. Resultados da concentração em ng/ul da quantificação fluorométrica do

Tabela 4. Relação das médias dos valores de cobertura de todos os genes

Tabela 5. Tabela detalhada de todas as 13 variantes que apareceram na forma de

Tabela 6. Tabela detalhada de todas as 17 variantes que apareceram na forma de

Tabela 7. Tabela detalhada de todas as quatro variantes que apareceram na forma

Tabela 8. Tabela detalhada de todas as três variantes que apareceram na forma de

Tabela 13. Todas as alterações estruturais, denominadas Copy Number Variations,

Figura 2. Gráficos obtidos como resultado do bioanalyser. No eixo X podemos

Figura 4. Cascata da via mTOR retirada do KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes

Figura 6. Esquema simplificativo das variantes identificadas na via mTOR.

Figura 7. Esquema simplificativo das variantes identificadas na via Tau.

Figura 9. Regiões do gene ULK2 consideradas como sendo potenciais sítios de

Figura 14. Resumo de todas as variantes identificadas no paciente 541/12 – P19,

Figura 17. Visualização dos produtos da fragmentação em gel de agarose 2%.

Figura 18. Análise de alta resolução da alteração estrutural no cromossomo 1 do

Figura 19. Alteração estrutural encontrada no banco de dados ISCA que se

Figura 20. Análise de alta resolução da alteração estrutural no cromossomo 20 do

Figura 21. Análise de alta resolução da alteração estrutural no cromossomo 19 do

1.1 Epilepsias e Malformações do Desenvolvimento Cortical...... 19

1.2 Displasias Corticais Focais ...................................................... 20

1.3 Malformações do Córtex Cerebral e Vias mTOR e Tau ........... 21

1.4 Displasias Corticais Focais: Estudos Genéticos e Vias

1.5 Displasia Cortical Focal e Mutações em mosaicismo nas

vias mTOR e Tau. 24

2.1 Objetivos gerais ........................................................................... 27

2.2 Objetivos específicos ............................................................... 27

3. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................ 28

3.1 Pacientes e Amostras................................................................ 28

3.2 Extracão de DNA........................................................................ 29

3.2.1 Extração de DNA de sangue periférico ................................ 29

3.2.2 Extração de DNA de tecido cerebral congelado ..................30

3.3 Preparação da Biblioteca de Genes candidatos utilizando

Nextera® Expanded Kit (Illumina®) ................................................ 30

3.3.1 Tagmentação do DNA genômico ........................................ 31

3.3.2 Purificação do DNA genômico tagmentado ........................ 31

3.3.4 Purificação da PCR ................................................................. 32

3.3.5 Primeira Lavagem ................................................................... 33

3.3.6 Primeira Hibridação ................................................................ 33

3.3.7 Segunda Hibridação ...............................................................35