24/08/2019 BB_poster.

htm

APRESENTAÇÃO | PROGRAMAÇÃO | FICHA TÉCNICA | RESUMOS

ATIVIDADE ANTINEOPLÁSICA DE COMPOSTOS DE COORDENAÇÃO DE ZINCO E COBRE EM LINHAGENS CELULARES

HUMANAS DE LEUCEMIA MONOCÍTICA AGUDA, LINFOMA HISTIOCÍTICO E LEUCEMIA LINFOBLÁSTICA AGUDA

Layla Janaína Hissa Borges, Mayara Souza dos Santos, Christiane Fernandes, Adolfo Horn Jr, Milton Masahiko Kanashiro

O câncer leva a óbito milhões de pessoas, sendo que a estimativa mundial para o ano de 2020 indica que poderá levar a óbito
cerca de 10,3 milhões de indivíduos. Este trabalho tem como objetivo avaliar a atividade antineoplásica do composto de
coordenação de zinco e de cobre frente a linhagem de leucemia monocítica aguda (THP-1), linfoma histiocítico (U-937) e
leucemia linfoblástica aguda (MOLT-4). As linhagens foram tratadas diferentes compostos em diferentes concentrações e
tempos e posteriormente foi avaliada a indução de apoptose na linhagem U-937. A morte celular por apoptose foi avaliada
mediante ensaio de Anexina V-FICT em citometria de fluxo. O composto ZnBE foi capaz de induzir apoptose em 92% das
células U-937 quando tratadas com 400 µM por 48 horas. Os compostos ZnBE e ZnBS foram capazes de reduzir a viabilidade
celular em todas as linhagens testadas. Os resultados demonstram que os compostos de zinco e de cobre testados
apresentam eficácia contra linhagens neoplásica humanas. A continuidade do estudo se faz necessária no sentido de estudar
novos compostos capazes de combater o câncer e minimizar os efeitos colaterais dos quimioterápicos aplicados hoje na
clínica médica.

Palavras – chave: Leucemia. Apoptose. Composto de Coordenação de Cobre e Zinco / Fomento: CAPES – FAPERJ - UENF.

AVALIAÇÃO DE POTENCIAIS EPITOPOS ALERGÊNICOS DE ALBUMINA 2S DE JATROPHA CURCAS L

Lívia Maia Crespo; Natália Deus de Oliveira; Olga Lima Tavares Machado

O pinhão-manso (Jatropha curcas L.) é uma planta de origem provável no México e América Central, apresenta algumas
semelhanças com a mamona, ambas são euforbiáceas oleaginosas. Em ambas oleaginosas, alérgenos pertencentes à família
das albumina 2S já foram caracterizados. As albuminas 2S são proteínas de reserva presentes em sementes de diversas
plantas. O reconhecimento de epitopos alergênicos é de fundamental importância para a elaboração de novas estratégias para
a desativação de alérgenos e para o desenvolvimento de novos fármacos para o tratamento da alergia. O objetivo deste estudo
foi elucidar possíveis epitopos ligantes de IgE em albuminas 2S de pinhão manso. A extração da proteína Jat c 1, um alérgeno
presente nas sementes de pinhão-manso seguiu a metodologia descrita por Maciel e colaboradores em 2009. A proteína Jat c
1 foi isolada por cromatografia de exclusão molecular (Sephadex-G-50), seguido de cromatografia de fase reversa em coluna
C2C18, sistema. A estrutura primária da proteína foi elucidada empregando o sequenciamento automático. A partir desta
estrutura peptídeos foram sintetizados (P1, P3, P5, P6 e P8). Com base nos conhecimentos prévios que as albuminas 2S de
mamona possuem aminoácidos ácidos (Glutâmico [E] ou Aspártico [D]) na constituição dos seus epitopos alergênicos,
buscamos os mesmos aminoácidos na estrutura primária de Pinhão Manso. Peptídeos foram tratados com reagente
Woodward's K (WRK), um composto que reage com o grupamento carboxílico destes aminoácidos, e o potencial alergênico
destes peptídeos foi investigado por ensaios de desgranulação de mastócitos de rato. Peptídeos foram sintetizados com
substituições de aminoácidos ácidos por leucinas (P1 Leu P3 Leu P5 Leu P6 Leu e P8Leu) Foi possível observar que os
file:///E:/BB_poster.htm 1/10
24/08/2019 BB_poster.htm
g p g g
de insetos fitófagos, sugerindo importante ação antimicrobiana e inseticida. Em decorrência deste potencial, várias dessas
proteínas estão sendo testadas como agentes terapêuticos ao tratamento de doenças fúngicas animais e em defesa vegetal
contra pestes e pragas. Este trabalho pretende isolar, caracterizar e analisar o potencial antimicrobiano de cistatinas de
sementes de C. fairchildiana. Proteínas de cotilédones das sementes foram extraídas, quantificadas e visualizadas por SDS-
PAGE. A primeira etapa de purificação foi através de cromatografia de exclusão molecular em uma matriz Sephadex G-100. As
frações coletadas foram referidas como P1, P2 e P3. O pico P2 apresentou a mais alta atividade inibitória contra papaína. Por
eletroforese, foram visualizadas em P1, bandas majoritárias de proteínas oligoméricas de reserva, tipicamente vicilinas de
espécies de leguminosas, com massas moleculares entre 66 e 45 kDa. Já em P2 a principal banda foi de aproximadamente 10
kDa e outras duas bandas entre 20 e 24 kDa. No P3 foram visualizadas duas bandas protéicas abaixo de 10 kDa. O pico P2 foi
submetido a uma cromatografia de fase reversa (HPLC) em coluna C18, que revelou uma fração não retida (NR), dois picos
majoritários e oito picos minoritários. A atividade inibitória contra papaína das frações foi determinada por ensaios in vitro e o
pico com atividade majoritária será analisado por seqüenciamento de proteínas por espectrometria de massas. Como a
relação de especificidade de ação entre cistatinas e proteases de organismos-alvo é muito alta, a proteína purificada será
analisada quanto à sua atividade biológica contra fungos e leveduras específicas.

Palavras-chave: Fitocistatinas; Clitoria fairchildiana; Proteína anti-fúngica, Cândida albicans.

Apoio: FAPERJ

PURIFICAÇÃO DE DEFENSINA RECOMBINANTE OBTIDA DA SEMENTE DE FEIJÃO-DE-CORDA E O TESTE DA SUA ATIVIDADE

INIBITÓRIA CONTRA LEISHMANIA AMAZONENSIS

Géssika Silva Souza, Viviane Veiga do Nascimento, Laís Pessanha de Carvalho, Edésio José Tenório de Melo, Keysson Vieira
Fernandes, Olga Lima Tavares Machado, Claudio Andres Retamal, Valdirene Moreira Gomes, André de Oliveira Carvalho

Peptídeos antimicrobianos (AMPs) são componentes da imunidade inata dos organismos considerados como potenciais
novas drogas. Defensinas de plantas são AMPs pequenos, básicos, ricos em cisteínas e apresentam atividade antimicrobiana.
O objetivo deste trabalho foi purificar a defensina recombinante de feijão-de-corda e testar a sua atividade inibitória contra
Leishmania amazonensis. Escherichia coli contendo plasmídeo pET-DEF foi cultivado em meio TB a 37ºC por 16h. Após a
cultura atingir uma DO600 entre 0,5-1, 1 mM de IPTG foi adicionado e incubou-se a 27 °C por 3h. Em seguida a cultura foi
centrifugada e as células sonicadas em tampão fosfato salino, 1% de Triton X-100 e coquetel de inibidores para uso geral
(Sigma). O sobrenadante foi aplicado em coluna de Ni-NTA agarose (Qiagen) para purificar a defensina recombinante. A
proteína foi clivada com enteroquinase 0.02u e aplicada a Ni-NTA agarose. A purificação foi confirmada em coluna de fase
reversa C18 (Shimadzu) e 100µg desta foi utilizada para o ensaio de inibição do crescimento do parasita, a 28°C em 24 e 48h
em meio Warren’s. Análises da morfologia da célula do parasita e da funcionalidade da mitocôndria (Rodamina 123) foram
feitas no tempo de 24h. A defensina natural foi purificada de acordo com Carvalho et al. (2001). Foram comparados o
dicroísmo circular e a atividade antiprotozoária das defensinas recombinante e natural. Foi feito um ensaio de inibição do
crescimento do parasita com 100µg de defensina recombinante monitorando os tempos de 0, 8, 16, 24, 32 e 48h. A defensina
recombinante foi purificada e apresentou o mesmo espectro circular que a natural, indicando estruturas semelhantes e, assim,
o correto enovelamento da proteína recombinante. A defensina natural inibiu 50 e 54,8% do crescimento do parasita nos
tempos de 24 e 48h, respectivamente e a recombinante 54,3 e 46,9%, para os mesmos tempos. Dados estatísticos não indicam
diferença entre as inibições. As células observadas em microscopia óptica apresentavam-se arredondadas e houve perda da
funcionalidade das mitocôndrias dos parasitas tratados com a defensina recombinante. No teste da inibição do crescimento
nos tempos 8, 16, 24, 32 e 48h, a defensina recombinante inibiu 33, 47,9, 45,6, 40 e 41,6% respectivamente. Assim, a defensina
recombinante foi produzida e enovelada corretamente, foi capaz de eliminar células do protozoário entre o tempo de 0 e 8h,
causar alterações nas células e diminuir a funcionalidade das mitocôndrias.

PURIFICAÇÃO DE UMA PROTEÍNA TRANSPORTADORA DE LIPIDEOS DE FEIJÃO-DE-CORDA (VIGNA UNGUICULATA L.

WALP.) RECOMBINANTE, TESTE DE SUA ATIVIDADE INIBITÓRIA IN VITRO E PREDIÇÃO DE SUA ESTRUTURA 3D

Flávia Camila Vieira da Silva, Viviane Veiga do Nascimento, Valdirene Moreira Gomes, André de Oliveira Carvalho.

Peptídeos antimicrobianos (AMPs) de plantas são considerados a primeira linha de defesa contra patógenos. Entre os AMPs
de plantas estão as proteínas transportadoras de lipídeos (LTP), divididas em duas famílias, sendo a família 1 composta por
peptídeos de 10 kDa e a família 2 de peptídeos de 7 kDa. Estas duas famílias apresentam características comuns como
pequeno tamanho, carga líquida positiva em pH fisiológico e são ricas em resíduos de cisteínas. As LTPs da família 1 possuem
atividade antimicrobiana e estão envolvidas na defesa e ou sinalização de plantas contra fitopatógenos, além de ação inibitória
contra α-amilase in vitro. O objetivo deste trabalho foi purificar a LTP recombinante (LTPr), originalmente obtida de sementes
de feijão-de-corda, testar sua atividade inibitória contra α-amilase salivar humana e predição da estrutura 3D da LTP por
técnica de modelagem comparativa. Cepa bacteriana contendo o clone da LTPr foram induzidas com 1 mM de IPTG e após a
extração por pulsos de sonicação foi feita a purificação da LTPr utilizando cromatografia de afinidade com coluna Ni+-NTA
agarose (Qiagen). A LTPr purificada do extrato bacteriano sofreu clivagem com enteroquinase para a remoção da cauda de
histidina. Após a clivagem foi realizada a etapa final do processo de purificação por cromatografia de fase reversa em coluna
C18 em sistema de alto desempenho num gradiente de propanol. O conteúdo proteico foi determinado por BCA e analisado
por tricina-SDS-PAGE. A determinação da atividade amilásica foi feita como descrito usando o método do ácido
dinitrosalicílico, sendo o teste de inibição da atividade amilásica feito do mesmo modo com a pré-incubação da α-amilase com
a LTPr. Para a construção do modelo da estrutura 3D da LTPr foi realizada uma busca de sequências primárias similares a
proteína com estrutura 3D resolvidas depositadas no banco de dados Protein Data Bank (PDB), a sequência escolhida como
molde apresentou alto grau de similaridade a LTP de feijão-de-corda. Para a modelagem foi utilizado o programa Modeller. A
LTPr foi purificada com sucesso e revelou-se biologicamente ativa ao término do processo de purificação. Os testes de
inibição contra a α-amilase salivar humana realizado com diferentes concentrações da LTPr mostrou que 200 µg/mL do
peptídeo recombinante inibe completamente a atividade da enzima. Um modelo de estrutura 3D da LTP de feijão-de-corda foi
gerado e este mostrou grande similaridade com as LTPs já caracterizadas.

RESPOSTA IMUNE INATA ATIVADA POR AUXINA EM RAÍZES DE ARABIDOPSIS THALIANA

Patrícia Louzada Rangel, Juliana Ferreira da Silva, Ana Lídia Soares Rangel, Yves Millet, Frederick Ausubel, Gonçalo
Apolinário de Souza Filho

Plantas vivem em ambientes complexos e, embora suas raízes estejam envolvidas por uma zona biologicamente ativa, rica em
bactérias, fungos e vírus, pouco é conhecido acerca dos mecanismos que regulam a resposta imune nestes órgãos. Os
estudos acerca da imunidade vegetal, conduzidos em folhas, demonstram que a planta, ao entrar em contato com
microrganismos, regula seu sistema imune, determinando se a interação será bem sucedida. Embora já tenha sido
caracterizado que a resposta imune é dependente do acúmulo de ácido salicílico (SA) ou jasmonatos/etileno (JA/ET),
recentemente descobriu-se que outros hormônios também atuam regulando a resposta imune, tais como auxinas, giberelinas
e ácido abscísico. A manipulação destas vias de sinalização hormonal é uma importante estratégia utilizada por bactérias
produtoras de fitormônios para subverter a resposta imune do hospedeiro. Apesar das raízes representarem o ponto de
entrada destes micro-organismos na planta hospedeira, são escassos os trabalhos que busquem compreender os
mecanismos relacionados à regulação do sistema imune nestes órgãos. Neste sentido, este trabalho teve como objetivo
file:///E:/BB_poster.htm 8/10
24/08/2019 BB_poster.htm
caracterizar a resposta imune vegetal ativada em raízes de plantas de Arabidopsis thaliana durante o tratamento com auxinas.
Em plantas tratadas com auxina foram realizados ensaios de monitoramento da ativação de genes marcadores da resposta
imune, bem como ensaios de deposição de calose em plantas selvagens e plantas mutantes para vias de resposta a auxinas, e
ensaios de multiplicação (CFU) da bactéria patogênica Pseudomonas syringae. Os resultados demonstraram que auxina
participa positivamente da ativação da resposta imune em raízes de Arabidopsis thaliana, sendo capaz de modular a interação
destes órgãos com bactérias. Nossos dados sugerem características previamente desconhecidas da resposta de plantas à
presença de bactérias em raízes, e possibilitam uma melhor compreensão acerca do envolvimento de fitormônios durante tais
associações.

SIMULTANEOUS ALLERGEN INACTIVATION AND DETOXIFICATION OF CASTOR BEAN CAKE BY TREATMENT WITH CALCIUM
COMPOUNDS

Keysson V. Fernandes, Natália Deus-de-Oliveira, Mateus G. Godoy, Viviane V. do Nascimento, Edésio J.T. de Melo, Denise M.G.
Freire, Nilgun E. Tumer and O.L.T. Machado

Ricinus communis L. is of great economic importance due to the oil extracted from its seeds. Castor oil has been used for
pharmaceutical and industrial applications, as a lubricant or coating agent, as a component of plastic products, as a fungicide
or in the synthesis of biodiesel fuels. After oil extraction, a castor cake with a large amount of protein is obtained. However,
this by-product cannot be used as animal feed due to the presence of toxic (ricin) and allergenic (2S albumin) proteins. Here,
we propose two processes for detoxification and allergen inactivation of the castor cake. In addition, we establish a biological
test to detect ricin and validate these detoxification processes. In this test, Vero cells were treated with ricin, and cell death was
assessed by cell counting and measurement of lactate dehydrogenase activity. The limit of detection of the Vero cell assay was
10 ng/mL using a concentration of 1.6 x 105 cells/well. Solid-state fermentation (SSF) and treatment with calcium compounds
were used as cake detoxification processes. For SSF, Aspergillus niger was grown using a castor cake as a substrate, and this
cake was analyzed after 24, 48, 72, and 96 h of SSF. Ricin was eliminated after 24 h of SSF treatment.
The cake was treated
with 4 or 8% Ca(OH)2 or CaO, and both the toxicity and the allergenic properties were entirely abolished. A by-product free of
toxicity and allergens was obtained.

TIONINAS DE ENDOCARPO DE CAPSICUM ANNUUM: CARACTERIZAÇÃO E ATIVIDADE SINERGÍSTICA COM FLUCONAZOL

CONTRA LEVEDURAS DO GÊNERO CANDIDA

Gabriel Bonan Taveira, Olga Lima Tavares Machado, Rosana Rodrigues, André de Oliveira Carvalho , André Teixeira Ferreira,
Jonas Perales, Ilka Maria Vasconcelos, Valdirene Moreira Gomes

Os peptídeos antimicrobianos (AMPs) são parte de um arsenal químico usado pelas plantas para se defenderem contra
patógenos. Nos últimos anos, diversos estudos têm demonstrado a função de algumas proteínas e peptídeos com atividade
antimicrobiana isoladas de diferentes espécies de plantas contra um grande número de micro-organismos. Em um trabalho
prévio realizamos o fracionamento de peptídeos de endocarpos maduros de Capsicum annuum através de cromatografia de
fase reversa em coluna C2C18 (HPLC). Sete diferentes frações foram isoladas e testadas in vitro contra leveduras e bactérias
de importância médica e veterinária, no entanto apenas as frações denominadas 1 e 3 mostraram alta atividade contra estes
microrganismos. Neste trabalho descrevemos a caracterização dos peptídeos das frações 1 e 3 através do método de
degradação de Edman, onde o único peptídeo de 7 kDa da fração 1 e o peptídeo majoritário, também de 7 kDa, da fração 3
mostraram similaridade com a família de AMPs de plantas denominadas tioninas. Realizamos ensaios de permeabilização de
membrana utilizando o corante Sytox Green. Estes ensaios demonstraram que na presença de 50 µg.mL-1 da fração 1 ou 3
ocorrem alterações na membrana de todas as leveduras testadas. Para a realização dos ensaios de sinergismo, combinamos a
fração 1, numa concentração necessária para inibir 50% o crescimento (IC50) das leveduras Candida albicans, Candida
tropicalis e Candida parapsilosis, com a concentração do fluconazol quatro vezes abaixo do IC50, o mesmo procedimento foi
realizado com a fração 3 e o fluconazol. Para ambas as combinações observamos um aumento na inibição do crescimento das
três leveduras testadas, revelando que em combinação com as frações 1 ou 3, o fluconazol tem a sua atividade microbiana
aumentada na dose quatro vezes menor que seu IC50, chegando a 100% de inibição para a levedura C. parapsilosis. Vimos
neste estudo que as frações foram capazes de causar alterações na membrana plasmática das leveduras causando
permeabilização. Assim como possuem atividade sinergística com o fluconazol, onde estas causaram maior redução do
crescimento das leveduras testadas na concentração quatro vezes abaixo do IC50 da droga comercial. Os resultados da
combinação de AMPs e drogas em uso corrente são interessantes porque abrem novas possibilidades terapêuticas para
infecções causadas por fungos e o uso desses peptídeos como novas fontes de drogas.

TRANSIÇÃO DIMÓRFICA EM YARROWIA LIPOLYTICA: MODULAÇÃO POR AUXINA E ÓXIDO NÍTRICO

Keilla dos Reis Dutra, Antônio Jesus Dorighetto Cogo, Arnoldo Rocha Façanha, Lev Alexandrovitch Okorokov, Anna Lvovna
Okorokova Façanha.

A transição dimórfica é uma característica determinante para a virulência e patogenicidade de muitos fungos fitopatogênicos e
que acometem a saúde humana. Diferentes fatores que regulam o dimorfismo tem sido descritos, incluindo disponibilidade de
carbono e nitrogênio e o pH extracelular. No presente estudo nós utilizamos o fungo, Yarrowia lipolytica, para determinar como
a cascata auxínica influencia a morfogênese, tendo o óxido nítrico como um possível mediador. Demonstramos que a auxina
(AIA) e seu precursor, triptofano (Trp), estimularam a transição dimórfica em baixas concentrações (10 pM e 40 μg/mL
respectivamente). Evidenciamos ainda que os inibidores de AIA, TIBA (inibidor de transporte) e PCIB (inibidor da sinalização),
reduziram a filamentação de Y. lipolytica em 2,5 vezes. A atividade de H+ ATPases de membrana plasmática foi examinada
como um componente da cascata de sinalização da auxina. Células cultivadas na presença de AIA/Trp exibiram um estímulo
no transporte de H+ em~2 vezes. Enquanto a adição dos inibidores de AIA, TIBA e PCIB, causaram uma redução de 3 vezes no
transporte de H+. Estes dados indicam que a via de sinalização dependente de AIA regula H+ ATPases tipo P, influenciando o
desenvolvimento hifal. Existem dados da literatura sobre a participação da cascata da MAPK e PKA na regulação da
morfogênese e crescimento polarizado. Nós analisamos o efeito do inibidor da MAPK e um intermediário na via da PKA
(cAMP). O inibidor de MAPK, (100 mM) diminuiu a morfogênese em ~ 2 vezes, enquanto cAMP (25 mM) estimulou a formação
de hifas em 1,5 vezes. Estes dados fornecem as primeiras evidências sobre as vias de sinalização relacionadas com o
dimorfismo. Avaliamos se possivelmente o óxido nítrico (NO) atuaria como um mediador na cascata da auxina. Demonstramos
que a utilização de 10 nM do doador de NO (SNP) induziu a morfogênese. Constatou-se ainda que 100 μM do seqüestrador de
NO (PTIO) foi capaz de inibir a transição levedura-hifa. Além disso, observamos que o SNP estimulou em 2 vezes a atividade
de H+ ATPases tipo P. Em contrapartida, a adição de PTIO causou um decréscimo de 1,5 vezes no transporte de H+. Esses
resultados apontam o NO como um possível mediador da filamentação auxina dependente. Nossos dados contribuem para
entendimento dos processos celulares que regulam crescimento polarizado auxina dependente e sugerem a aplicabilidade da
teoria do crescimento ácido para as células fúngicas além dos sistemas vegetais.

ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE DCR E AGO EM AEDES AEGYPTI

file:///E:/BB_poster.htm 9/10