Produção de biossurfactante por Bacillus subtilis utilizando o licor de milho

como meio de cultura

Neste trabalho, a produção de biossurfactante por Bacillus subtilis # 573 foi

avaliada
utilizando-se o licor de maceração do milho (CSL) como meio de cultura. Os
melhores resultados foram obtidos em meio de cultura constituído por 10% (v /
v) de CSL, com produção de biossurfactante de aproximadamente 1,3 g / l. Até
onde sabemos, este é o primeiro relatório descrevendo a produção de
biossurfactante por B. subtilis usando CSL como meio de cultura.
Posteriormente, o efeito de diferentes metais (ferro, manganês e magnésio) na
produção de biossurfactante foi avaliado utilizando o meio CSL 10%. Verificou-
se que, para todos os metais testados, a produção de biossurfactante foi
aumentada (até 4,1, 4,4 e 3,5 g / l para ferro, manganês e magnésio,
respectivamente). Quando o meio de cultura foi suplementado com a
concentração ótima dos três metais simultaneamente, a produção de
biossurfactante foi aumentada para 4,8 g / l. Além disso, o biossurfactante
apresentou um bom desempenho em ensaios de recuperação de óleo quando
comparado com surfactantes químicos, o que sugere sua possível aplicação
em recuperação de óleo microbiano ou biorremediação.

Introdução
Os surfactantes são uma classe importante de compostos químicos incluídos
em muitos dos produtos de uso diário que usamos. Eles podem ser
encontrados em detergentes, formulações de lavanderia, produtos de limpeza
doméstica, cosméticos, herbicidas ou pesticidas, e também são usados em
indústrias de biorremediação, agricultura, alimentos, farmacêutica, têxtil, papel
ou petróleo, entre outros (Geys et al., 2014; Rebello et al., 2014). Os
surfactantes são moléculas anfifílicas que, devido à sua estrutura, tendem a se
acumular nas interfaces entre fases fluidas com diferentes polaridades (por
exemplo, óleo-água ou ar-água), reduzindo as tensões superficial e interfacial
(Gudiña et al., 2013). A maioria dos surfactantes atualmente utilizados é
quimicamente sintetizada a partir de recursos petroquímicos e é apenas
parcialmente biodegradável, causando efeitos prejudiciais ao meio ambiente
(Vaz et al., 2012; Rebello et al., 2014).
Atualmente, devido à crescente conscientização ambiental, a demanda por
surfactantes obtida a partir de recursos de base biológica está aumentando.
Biossurfactantes, compostos tensoativos sintetizados por uma variedade de
microorganismos, estão atraindo um interesse pronunciado devido às suas
vantagens potenciais sobre suas contrapartes químicas, eles apresentam um
desempenho similar ou melhor e têm menos impacto no meio ambiente que os
surfactantes convencionais, devido a sua menor toxicidade e maior
biodegradabilidade. Além disso, os biossurfactantes são geralmente eficazes
em condições ambientais extremas e podem ser produzidos a partir de
recursos renováveis (Pereira et al., 2013; Gudiña et al., 2015). Como
consequência, os biossurfactantes podem substituir alguns dos surfactantes
sintéticos em muitos campos. No entanto, a aplicação de biossurfactantes
depende se eles podem ser produzidos economicamente em grande escala.
Atualmente, os biossurfactantes não são competitivos com os surfactantes
químicos do ponto de vista econômico, uma vez que são necessários
substratos caros para sua produção e apresentam produtividades relativamente
baixas, o que dificulta seu uso e comercialização generalizados. Como o meio
de cultura pode responder por até 30-50% dos custos totais de produção de
biossurfactantes, a substituição de meios sintéticos caros por resíduos e
subprodutos agroindustriais mais baratos pode contribuir para reduzir seus
custos de produção e aumentar sua competitividade (Henkel et al., 2012; Al-
Bahry et al., 2013; Gudiña et al., 2015).

Os biossurfactantes apresentam uma ampla variedade de estruturas químicas,

incluindo glicolipídios, lipopeptídeos, fosfolipídios, ácidos graxos ou lipídios
neutros, entre outros (Gudiña et al., 2013; Geys et al., 2014). As espécies de
Bacillus produzem um amplo espectro de biossurfactantes lipopeptídicos, que
são moléculas cíclicas consistindo de um ácido graxo de comprimento variável
(porção hidrofóbica) ligado a uma pequena cadeia peptídica (porção hidrofílica)
de sete ou dez aminoácidos. Entre eles, a surfactina, um lipoheptapeptídeo
produzido por linhagens de Bacillus subtilis, é um dos mais eficazes
biossurfactantes conhecidos até o momento; pode reduzir a tensão superficial
(ST) de água até 27 mN / m, com concentrações críticas de micela (cmc) como
baixa 0,01 g / l, e apresenta uma alta atividade emulsificante; além disso, exibe
atividades antimicrobianas, antivirais e antitumorais (Gudiña et al., 2013).
Consequentemente, a surfactina pode ser potencialmente útil em inúmeras
aplicações terapêuticas, industriais e ambientais. A fim de reduzir os custos de
produção, a produção de surfactina por cepas de B. subtilis foi estudada
usando diferentes substratos, como o melaço (Abdel-Mawgoud et al., 2008;
Joshi et al., 2008; Al-Bahry et al., 2013). ), cascas de batata (Das e Mukherjee,
2007), soro em pó (Cagri-Mehmetoglu et al., 2012), suco de caju (Oliveira et al.,
2013) ou águas residuais de mandioca (Nitschke e Pastore, 2006). Além disso,
o efeito de diferentes fatores nutricionais tem sido estudado para melhorar a
produção de surfactina pelas linhagens de B. subtilis. Entre eles, tem sido
relatado que a adição de vários metais (ferro, magnésio e manganês) ao meio
de cultura contribui para aumentar sua produção, já que esses elementos são
co-fatores de enzimas envolvidas na síntese de surfactina (Thimon et al., 1992;
Makkar e Cameotra, 2002; Wei et al., 2003).

Neste trabalho, a produção de biossurfactante por uma estirpe de B. subtilis foi

avaliada usando subproduto agroindustrial de licor de milho (CSL) como
substrato alternativo de baixo custo. Uma vez estabelecida a concentração
ótima de CSL para a produção de biossurfactante, o meio de cultura foi
otimizado suplementando-o com diferentes metais (ferro, magnésio e
manganês) em diferentes concentrações, primeiro individualmente e depois em
diferentes combinações. Finalmente, a aplicabilidade do biossurfactante
produzido na recuperação de óleo foi avaliada.

Materiais e métodos
Estirpe bacteriana
A cepa B. subtilis # 573 produtora de biossurfactante foi isolada e identificada
em nosso laboratório em um trabalho anterior (Gudiña et al., 2012). A cepa foi
armazenada a –80 ° C em meio Luria-Bertani (LB) suplementado com 20% (v /
v) de glicerol. A composição do meio LB foi (g / l): NaCl 10.0; triptona 10,0;
extrato de levedura 5,0; pH 7,0. Sempre que requerido, os estoques
congelados foram semeados em placas de agar LB e incubados a 37 ° C por
24 h. As placas de ágar foram armazenadas a 4 ° C, não mais de 3 semanas.
Produção de Biosurfactantes por B. Subtilis # 573 Usando CSL
O licor de maceração de milho foi gentilmente cedido pela COPAM [Companhia
Portuguesa de Amidos, S. A. (Portugal)], e foi avaliado como substrato para a
produção de biossurfactante por B. subtilis # 573. Os carboidratos totais e as
concentrações de proteína na CSL foram determinados usando os métodos
fenol-sulfúrico e Lowry, respectivamente (Lowry et al., 1951; Dubois et al.,
1956).

Diferentes meios de cultura foram preparados pela dissolução de CSL em água

desmineralizada em diferentes concentrações [5, 10 e 15% (v / v)].
Subsequentemente, o pH foi ajustado para 7 utilizando NaOH 1 M e os meios
foram esterilizados a 121 durante 15 min. Esses meios foram avaliados quanto
à produção de biossurfactante por B. subtilis # 573, a fim de estabelecer a
concentração ótima de CSL para a produção de biossurfactante. Os ensaios
foram realizados em frascos de 500 ml contendo 200 ml de cada meio. Os
frascos foram inoculados com 2 ml de uma pré-cultura de B. subtilis # 573
cultivada em meio LB a 37 ° C e 200 rpm durante 24 h. As pré-culturas foram
preparadas inoculando 10 ml de meio LB com uma única colónia tirada de uma
placa de agar. As culturas foram incubadas nas mesmas condições (37 ° C e
200 rpm) até atingir a produção máxima de biossurfactante. As amostras foram
coletadas em diferentes momentos durante a fermentação para determinar a
produção de biossurfactante. As amostras foram centrifugadas ( 4000 rpm, 20
min) e os sobrenadantes livres de células foram usados para medir o ST e para
determinar a atividade emulsificante (E24), conforme descrito abaixo. Sempre
que necessio, os sobrenadantes do caldo de cultura foram diluos 10 ou 100
vezes com ua desmineralizada e mediram-se a tens superficial (ST-1, ST-2) e
as actividades emulsionantes (E24-1, E24-2).
Efeito da Suplementação de Metais Metálicos na Produção de Biosurfactantes
Uma vez selecionada a concentração de CSL que levou à maior produção de
biossurfactante por B. subtilis # 573, o efeito da adição de diferentes metais
(ferro, manganês e magnésio) em diferentes concentrações na produção de
biossurfactante foi avaliado para tentar aumentar o biossurfactante produção
por este isolado. As concentrações de metais utilizadas foram selecionadas de
acordo com estudos prévios realizados por diferentes autores, conforme
apresentado na Tabela 1. Os ensaios de controle foram realizados utilizando o
meio de cultura sem suplementos. As culturas foram realizadas nas mesmas
condições descritas acima e a produção de biossurfactante foi avaliada ao
longo da fermentação. As culturas foram mantidas até que a produção máxima
de biossurfactante fosse alcançada em cada caso.
Recuperação de Biosurfactante
No final da fermentação, as culturas foram centrifugadas (4000 rpm, 20 min)
para remover as células. Os sobrenadantes livres de células foram ajustados a
pH 2 com HC1 6M e foram subsequentemente incubados durante a noite a 4 °
C para promover a precipitação com biossurfactante. Posteriormente, os
precipitados (biossurfactante bruto) foram coletados por centrifugação (9000
rpm, 20 min, 4 ° C). O biossurfactante em bruto foi dissolvido numa quantidade
m�ima de �ua desmineralizada e o pH foi ajustado a 7 utilizando NaOH
1M. As soluções de biossurfactante foram liofilizadas e os produtos obtidos
foram pesados e armazenados a –20 ° C.

Determinação da atividade superficial

Medições de tensão superficial de sobrenadantes de caldo de cultura e
soluções de biossurfactante foram realizadas de acordo com o método do Anel
descrito em outro lugar (Gudiña et al., 2012). Utilizou-se um tensiómetro
KRÜSS K6 (KRÜSS GmbH, Alemanha) equipado com um anel de platina De
Noüy de 1,9 cm. Para aumentar a precisão das medidas de ST, foi determinada
uma média de triplicatas. Todas as medições foram realizadas à temperatura
ambiente (25 ° C).

Determinação da atividade emulsificante

A actividade emulsionante foi determinada pela adição de 2 ml de n-
hexadecano ao mesmo volume de sobrenadantes isentos de células em tubos
de ensaio de vidro. Os tubos foram misturados com um vortex a alta velocidade
durante 2 min e depois incubados a 25 durante 24 h. O índice de emulsificação
(E24) foi calculado como a percentagem da altura da camada emulsionada
(mm) dividida pela altura total da coluna de líquido (mm). Todos os índices de
emulsificação foram realizados em triplicata.
Concentração Crítica de Micela (cmc)
Concentração micelar crítica é a concentração de um composto anfifílico em
solução na qual a formação de micelas é iniciada. Diferentes concentrações do
biossurfactante criodessecado produzido por B. subtilis # 573 foram preparadas
em água desmineralizada, e o ST de cada amostra foi medido a 25 ° C como
descrito acima. A cmc foi determinada plotando-se o ST em função do
logaritmo da concentração de biossurfactante e foi encontrado no ponto de
interseção entre as duas linhas que melhor se ajustam aos dados pré e pós-
cmc. Todas as medições foram feitas em triplicado.

Ensaios de Recuperação de Petróleo

A aplicabilidade do biossurfactante produzido por B. subtilis # 573 na
recuperação de óleo foi avaliada utilizando areia contaminada artificialmente
contendo 12,5% (p / p) de óleo bruto Arabian Light [gentilmente cedido pela
GALP (Portugal)]. Amostras de 40 g de areia foram misturadas com 5 g de
�eo cru em bal�s de 100 mL por agita�o e deixadas em temperatura
ambiente por 24 h. Posteriormente, 40 ml de soluções de biossurfactante em
diferentes concentrações foram adicionados a cada frasco. Os frascos foram
incubados a 90 rpm e 40 ° C por 24 h, e o óleo removido foi recuperado da
superfície e transferido para um tubo graduado. A fim de separar a água
recuperada juntamente com o óleo cru, os tubos foram centrifugados (9000
rpm, 20 min, 25 ° C) e, posteriormente, o volume de óleo bruto foi medido. A
quantidade de óleo recuperado (gramas) foi calculada de acordo com sua
densidade (0,837 g / ml). Os ensaios de controle foram realizados usando água
desmineralizada nas mesmas condições. Todas as experiências foram
realizadas em triplicado. Diferenças estatisticamente significativas dos ensaios
realizados com as diferentes concentrações de biossurfactante testadas foram
avaliadas por um one-way ANOVA (P <0,05) aplicando as comparações
múltiplas de Tukey; uma diferença significativa foi considerada se P <0,05.

Resultados
Avaliação do CSL como Substrato para Produção de Biosurfactante
Bacillus subtilis # 573 foi isolado e identificado em um trabalho anterior como
promissor produtor de biossurfactante (Gudiña et al., 2012). A aplicabilidade do
biossurfactante produzido por este isolado [identificado como uma mistura de
surfactina C13-, C14- e C15 (Pereira et al., 2013)] na recuperação de óleo
(Pereira et al., 2013) e seu antitumoral atividade (Duarte et al., 2014) também
foram demonstradas. Com o objetivo de otimizar a produção de biossurfactante
por este isolado e reduzir seus custos de produção, o CSL foi avaliado como
um meio de cultura alternativo de baixo custo. O CSL é um subproduto da
moagem úmida de milho, onde o amido é recuperado do milho e é uma
importante fonte de nitrogênio para vários processos biotecnológicos (Henkel et
al., 2012; Gudiña et al., 2015). O CSL utilizado neste trabalho continha 75 g / l
de carboidratos e 5 g / l de proteína.
A fim de estabelecer a concentração ótima de CSL para a produção de
biossurfactante por este isolado, diferentes meios de cultura foram preparados
pela dissolução de CSL em água desmineralizada em diferentes concentrações
[5, 10 e 15% (v / v)], e subsequentemente avaliados para biossurfactante.
Produção. As culturas foram incubadas a 37 e 200 rpm, e a produo de
biossurfactante foi avaliada ao longo da fermentao medindo o ST e a actividade
emulsionante dos sobrenadantes isentos de culas. As culturas foram mantidas
até que a produção máxima de biossurfactante fosse alcançada em cada caso.
Os resultados obtidos são mostrados na Tabela 2.
Embora com os três meios, valores de ST semelhantes foram obtidos nos
sobrenadantes livres de células sem diluição, foram observadas diferenças
mais pronunciadas nos sobrenadantes livres de células 10 e 100 vezes
diluídos. Com o meio CSL 5%, os melhores resultados quanto à produção de
biossurfactante foram obtidos após 24 h, enquanto para os outros dois meios
estes foram obtidos após 48 h. Na Tabela 2 pode-se observar que os menores
valores de ST e os maiores índices de emulsificação foram obtidos com o meio
CSL 10%, indicando assim uma maior produção de biossurfactante. Tendo em
conta o preço da CSL (cerca de 40 € / ton), o preço de 1 litro de CSL médio de
10% é de cerca de 0,004 €. Portanto, o uso de CSL como um meio de cultura
alternativo diminuiria muito os custos de produção deste biossurfactante em
uma escala de produção mais alta.

Os sobrenadantes de culturas livres de células realizados em CSL a 10%

durante 48 horas foram sujeitos a precipitação ácida para recuperar o
biossurfactante produzido, produzindo 1,311 ± 0,109 g de biossurfactante por
litro. A cmc calculada para este biossurfactante foi de 0,16 g / l. Tendo em vista
os resultados obtidos, o meio CSL 10% foi selecionado para realizar os
seguintes ensaios de otimização.
Efeito dos metais na produção de biossurfactantes
Ferro, manganês e magnésio são co-fatores de enzimas envolvidas na síntese
de surfactina por B. subtilis. Portanto, a concentração desses elementos no
meio de cultura desempenha um papel importante na produção de
biossurfactantes (Sen, 1997; Wei e Chu, 1998, 2002; Wei et al., 2003, 2007). O
meio CSL 10%, selecionado na fase anterior como o melhor meio para a
produção de biossurfactante por B. subtilis # 573, foi suplementado com
FeSO4, MnSO4 ou MgSO4 individualmente em diferentes concentrações
(como mostrado na Tabela 1), a fim de estudar seu efeito na produção de
biossurfactantes. As concentrações de metais utilizadas foram selecionadas
levando-se em conta trabalhos anteriores de outros autores que estudaram a
produção de biossurfactante por diferentes linhagens de B. subtilis. O meio
CSL 10% sem suplementos foi utilizado como controle. Como nos ensaios
anteriores, as culturas foram incubadas a 37 ° C e 200 rpm, e a produção de
biossurfactante foi avaliada ao longo do tempo. As culturas foram mantidas até
que a produção máxima de biossurfactante fosse alcançada em cada caso. Os
resultados obtidos estão reunidos na Tabela 3.

Para os experimentos realizados com os meios B, H e I, os menores valores de

ST foram obtidos às 48 h de crescimento, como observado anteriormente nos
ensaios realizados com o meio CSL 10%. Nos outros meios, os menores
valores de ST foram alcançados em 72 h de crescimento. Em relação ao ST
dos sobrenadantes livres de células sem diluição, valores semelhantes (entre
29,7 e 31,0 mN / m) foram obtidos para todos os meios testados. No entanto,
foram observadas diferenças maiores nos sobrenadantes isentos de células
que foram diluídos 10 e 100 vezes (Tabela 3).

Nos meios de cultura suplementados com FeSO4, o melhor resultado foi obtido
com a maior concentração testada (2,0 mM, meio C). Nesse caso, o ST-2 foi
reduzido para 46,8 ± 1,0 mN / ma 72 h, o que resultou em uma produção de
biossurfactante de 4,170 ± 0,054 g / l. Em relação ao manganês, o melhor
resultado foi obtido com MnSO4 na concentração de 0,2 mM (meio E) às 72 h.
O ST-2 foi reduzido para 46,0 ± 0,9 mN / m, e a quantidade de biossurfactante
produzida foi de 4,467 ± 0,158 g / l. Nos meios suplementados com magnésio,
resultados semelhantes foram obtidos com MgSO4 0,8 e 2,0 mM (meios G e
H). O ST-2 foi reduzido para 48,7-49,0 mN / m, e a quantidade de
biossurfactante produzida variou entre 3,4 e 3,5 g / l. Em todos os casos, foi
encontrada uma relação direta entre os valores de ST-2 e a quantidade de
biossurfactante produzida (Tabela 3).

Em relação aos índices de emulsificação, valores semelhantes (54,5-59,0%)

foram obtidos com todos os meios analisados (Tabela 3). Índices
emulsionantes superiores a 50% implicam que a fase de hidrocarbonetos
esteja completamente emulsionada. Diferenças mais pronunciadas foram
observadas para os valores E24-1. Os maiores valores de E24-1 foram obtidos
com os meios C, E e G, o que está de acordo com as quantidades de
biossurfactante produzidas em cada meio.

Como pode ser visto nos resultados obtidos, a suplementação do meio CSL
10% com os diferentes metais resultou em um aumento na produção de
biossurfactante em todos os casos quando comparado com o meio sem
suplementos, embora para cada metal, esse efeito fosse dependente na
concentração utilizada.
Tem sido relatado que a combinação de diferentes metais pode resultar em
uma interação positiva na produção de surfactina, em comparação com o seu
efeito individual (Sen, 1997; Makkar e Cameotra, 2002). Tendo em conta os
resultados obtidos com o meio CSL 10% suplementado com os diferentes
metais individualmente, este meio foi suplementado com diferentes
combinações de metais, de acordo com as concentrações que levaram aos
melhores resultados nos ensaios individuais para cada composto,
nomeadamente FeSO4 2,0 mM , MnSO4 0,2 mM e MgSO4 0,8 mM. As
diferentes combinações testadas estão resumidas na Tabela 4. Como nos
ensaios anteriores, as culturas foram incubadas a 37 ° C e 200 rpm, e a
produção de biossurfactante foi avaliada ao longo do tempo. O meio CSL 10%
sem suplementos foi utilizado como controle. As culturas foram mantidas até
que a produção máxima de biossurfactante fosse alcançada em cada caso. Os
resultados obtidos estão reunidos na Tabela 5.
Em relação às combinações ferro-magnésio (médio J) e ferro-manganês
(médio K), os melhores resultados quanto à redução de ST e produção de
biossurfactante foram obtidos em 24 h de crescimento. No entanto, a
quantidade de biossurfactante produzida (2,704 ± 0,132 e 3,933 ± 0,205 g / l,
respectivamente) foi menor que a obtida quando esses metais foram
adicionados individualmente, o que sugere uma interação negativa na
produção de biossurfactante. Em relação à combinação magnésio-manganês
(L médio), os melhores resultados foram obtidos após 48 h. Neste caso, a
quantidade de biossurfactante produzida (4.224 ± 0.157 g / l) foi ligeiramente
menor quando comparada com a obtida com a concentração ótima de
manganês, porém melhor que a obtida com a concentração ótima de
magnésio. Finalmente, uma combinação dos três metais foi testada (meio M).
Os melhores resultados foram obtidos às 72 h, e a quantidade de
biossurfactante produzida (4.829 ± 0.193 g / l) foi superior à obtida quando os
diferentes metais foram adicionados individualmente.
Ensaios de Recuperação de Petróleo
Os ensaios de recuperação de óleo foram realizados utilizando o
biossurfactante liofilizado produzido por B. subtilis # 573 no meio CSL 10%,
dissolvido em água desmineralizada em diferentes concentrações. Os
resultados obtidos são mostrados na Tabela 6.
Como pode ser visto na Tabela 6, recuperações similares de óleo foram
obtidas com o biossurfactante na concentração de 2,5 e 5,0 g / l [as diferenças
não foram estatisticamente significativas (P> 0,05)], sugerindo que o uso de
concentrações mais elevadas de biossurfactante não aumentaria a
recuperação de petróleo.

Discussão
A produção de biossurfactantes por isolados de B. subtilis utilizando substratos
de baixo custo foi estudada por diversos autores. B. subtilis B20 e B30
produziram entre 0,3 e 2,3 g / l de biossurfactante utilizando um meio mineral
suplementado com melaço de data como fonte de carbono (Al-Bahry et al.,
2013; Al-Wahaibi et al., 2014). Abdel-Mawgoud et al. (2008) relataram uma
produção de biossurfactante de 1,12 g / l por B. subtilis BS5 usando um meio
mineral contendo melaço de cana-de-açúcar. B. subtilis LAMI005 produziu 0,3
e 0,44 g / l de biossurfactante em meio contendo suco de caju (Oliveira et al.,
2013) e glicerol bruto derivado da produção de biodiesel (Sousa et al., 2012),
respectivamente. No entanto, nesses casos, outros nutrientes (por exemplo,
fontes de carbono ou nitrogênio, sais) foram adicionados à mídia, aumentando
assim seus preços. Pelo contrário, no presente trabalho, o único substrato
utilizado para preparar os meios de cultura foi o CSL. Da mesma forma, outros
autores relataram a produção de biossurfactante por diferentes isolados de B.
subtilis usando meios de cultura contendo exclusivamente subprodutos
agroindustriais (por exemplo, águas residuárias de mandioca, melaço de cana
ou soro em pó reidratado), com produtividades entre 0,3 e 3,0 g / l (Nitschke e
Pastore, 2006; Joshi et al., 2008; Cagri-Mehmetoglu et al., 2012). No entanto,
tanto quanto sabemos, este é o primeiro relatório descrevendo a produção de
biossurfactante por B. subtilis usando CSL como meio de cultura. A quantidade
de biossurfactante produzida (cerca de 1,3 g / l) foi próxima dos valores
reportados por outros autores utilizando diferentes substratos.

Tem sido relatado que a adição de ferro, magnésio ou manganês ao meio de

cultura aumentou a produção de biossurfactante por isolados de B. subtilis
(Thimon et al., 1992; Wei e Chu, 1998, 2002; Makkar e Cameotra, 2002; Al-
Ajlani et al., 2007). Mn2 + a uma concentração de 0,01 mM aumentou a
produção de biossurfactante por B. subtilis ATCC 21332 de 0,33 a 2,6 g / l (Wei
e Chu, 2002). Al-Ajlani et al. (2007) relataram um aumento na produção de
biossurfactante por B. subtilis MZ-7 de 0,22 a 0,3 g / l, suplementando o meio
de cultura com Fe2 + a uma concentração de 4,0 mM; e resultados
semelhantes foram obtidos por Thimon et al. (1992). Makkar e Cameotra
(2002) aumentaram a produção de biossurfactante por B. subtilis MTCC 2423
crescendo em um meio mineral de 0,342 a 0,814 g / l pela adição de FeSO4
(0,719 mM) e a 0,792 g / l pela adição de MgSO4 (2,43 milímetros). No entanto,
em alguns casos, concentrações mais altas desses metais inibiram a produção
de biossurfactantes (Makkar e Cameotra, 2002). No nosso caso, a quantidade
de biossurfactante produzida por B. subtilis # 573 no meio CSL 10% aumentou
até 3,2, 3,4 e 2,7 vezes devido à adição de ferro, manganês e magnésio,
respectivamente, ao meio de cultura .

Sen (1997) relatou uma interação forte e positiva entre ferro e manganês na
biossíntese de surfactina por B. subtilis. Wei et al. (2007) aumentaram a
produção de biossurfactante por B. subtilis ATCC 21332 de 1,74 para 3,34 g / l
através da otimização da composição dos oligoelementos (Mg2 +, K +, Mn2 +,
Fe2 + e Ca2 +). Makkar e Cameotra (2002) também relataram um aumento na
produção de biossurfactante por B. subtilis MTCC 2423 de 0,342 a 1,230 g / l
quando o meio de cultura foi suplementado com as concentrações ótimas de
magnésio, ferro e cálcio simultaneamente, e este efeito foi maior do que o
obtido quando os diferentes metais foram adicionados individualmente. No
nosso caso, uma combinação de FeSO4 2,0 mM, MgSO4 0,8 mM e MnSO4 0,2
mM aumentou a produção de biossurfactante 3,6 vezes em comparação com o
meio sem suplementos.

Em relação aos ensaios de recuperação de óleo, em trabalho anterior, o

biossurfactante produzido por este isolado em meio mineral (contendo
sacarose como fonte de carbono e nitrato de amônio como fonte de nitrogênio)
recuperou 18,8 ± 1,1% de óleo na concentração de 1 g / l (Pereira et al., 2013).
Esse valor é superior ao obtido no trabalho atual (15,0 ± 0,8%) nas mesmas
condições. Entretanto, a cmc calculada para o biossurfactante produzido no
meio mineral por este isolado foi de 0,03 g / l (Pereira et al., 2013), enquanto
para o biossurfactante produzido em CSL 10% foi 0,16 g / l. Isso pode explicar
as diferenças observadas nas porcentagens de óleo recuperadas em ambos os
casos. No entanto, os resultados obtidos neste trabalho são ainda melhores em
comparação com as recuperações de óleo obtidas com os surfactantes
químicos Enordet e Petrostep nas mesmas concentrações e condições (9-12%;
Pereira et al., 2013), sugerindo que este biossurfactante pode ser útil para
aplicação em recuperação de óleo aprimorada microbiana ou biorremediação.
Conclusão
A produção de biossurfactante por B. subtilis # 573 foi avaliada usando CSL
como um meio de cultura alternativo de baixo custo. O uso desse substrato
levou a uma produção de surfactina de cerca de 1,3 g / l, o que está de acordo
com os valores relatados até o momento na literatura. Para nosso
conhecimento, este é o primeiro relatório sobre o uso de CSL para a produção
de surfactina. Além disso, se uma escala industrial for considerada, o uso de
CSL como meio de cultura teria um enorme impacto nos custos de produção de
surfactina. Adicionalmente, a quantidade de biossurfactantes produzidos
usando este meio alternativo foi aumentada cerca de 3 a 4 vezes quando os
sais metálicos foram utilizados como suplementos, representando assim um
impacto ainda maior nos custos de produção. É importante mencionar que a
surfactina produzida a partir desses meios alternativos manteve todas as suas
propriedades relatadas anteriormente, incluindo seu grande potencial para
aplicações de recuperação de óleo aprimorada microbiana ou biorremediação.