Roberto BrunaSampaio D PDF

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS
BRUNA SAMPAIO ROBERTO
ESTUDO DO EFEITO DE POLIFENÓIS DE CHÁS

BIOTRANSFORMADOS POR TANASE IMOBILIZADA NA
INIBIÇÃO DE DIABETES E OBESIDADE: MODELOS IN VITRO
STUDY OF THE EFFECTS OF BIOTRANSFORMED TEAS

POLYPHENOLS BY IMMOBILIZED TANNASE ON INHIBITION
OF DIABETES AND OBESITY: IN VITRO MODELS
CAMPINAS
2017
BRUNA SAMPAIO ROBERTO
ESTUDO DO EFEITO DE POLIFENÓIS DE CHÁS

BIOTRANSFORMADOS POR TANASE IMOBILIZADA NA
INIBIÇÃO DE DIABETES E OBESIDADE: MODELOS IN VITRO
STUDY OF THE EFFECTS OF BIOTRANSFORMED TEAS

POLYPHENOLS BY IMMOBILIZED TANNASE ON INHIBITION
OF DIABETES AND OBESITY: IN VITRO MODELS
Tese apresentada à Faculdade de Engenharia

de Alimentos da Universidade Estadual de
Campinas como parte dos requisitos exigidos
para obtenção do título de Doutora em
Ciência de Alimentos.
Thesis presented to the Faculty of Food

Engineering of the University of Campinas in
partial fulfillment of the requirements for the
degree of Doctor in Food Science.
Orientadora: Dra. GABRIELA ALVES MACEDO

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À
VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA
ALUNA BRUNA SAMPAIO ROBERTO E
ORIENTADA PELA PROFA. DRA. GABRIELA
ALVES MACEDO
CAMPINAS
2017
BANCA EXAMINADORA
______________________________________________
Profa. Dra. Gabriela Alves Macedo
Orientadora
______________________________________________
Profa. Dra. Alessandra Gambero
FCM – USF
Membro titular
______________________________________________
Profa. Dra. Joelise de Alencar Figueira Agelotti
IQ – UNIFAL
Membro titular
______________________________________________
Profa. Dra. Solange Guidolin Canniatti Brazaca
USP - ESALQ
Membro titular
______________________________________________
Profa. Dra. Vânia Battestin Wiendl
IFSP
Membro titular
* A ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica da aluna.
Dedico este trabalho àquela que incansavelmente me ensina
que a maior herança é o estudo e àquela que deixou um
grande legado sobre o amor de ensinar e a importância de
estudar, minha mãe e minha vó (in memoriam).
A vocês dedico o meu melhor!
AGRADECIMENTOS
Primeiramente, a Deus, pela minha vida cheia de sáude que me permitiu ter
determinação e persistência para ir atrás de todos meus sonhos. Obrigada por me amparar e
mostrar o caminho nas horas incertas. Com certeza, os trabalhos aos quais me dediquei foram
profícuos graças a Tua proteção.
À minha orientadora, Drª. Gabriela Alves Macedo, que nesses anos todos foi minha
referência científica. Obrigada por dividir comigo o teu conhecimento, que me fez dar tantos
passos e amadurecer como profissional. Obrigada pela sensibilidade, em vários momentos,
que me trouxe conforto ao saber que eu não estava sozinha. Obrigada pela confiança e sempre
acreditar no meu trabalho. Obrigada pela amizade, paciência, incentivo, pelos inúmeros
conselhos e pelo carinho transmitidos nesses anos.
À minha mãe, Beatriz, pelo amor sempre incondicional. És a grande responsável por
esta enorme experiência vivida. Este título só é meu por todo alicerce que tu construíste. Serei
eternamente grata pela dedicação diária, pela preocupação que mais de 1.000km implicam,
pelo exemplo de profissional, pela inspiração nos dias difíceis, pelo apoio nas diversas fases
dessa caminhada, por me ensinar a ser forte e a ter coragem a cada nova escolha. Obrigada
pelos princípios e valores a mim transmitidos, que nenhuma escola ensina e que sempre me
guiaram pelo bom caminho. Ao mesmo tempo, agradeço por sempre me transmitir o enorme
valor da escola, do professor e de um livro. Nunca cansarei de agradecer por fazer do meu
sonho o teu sonho, vivê-lo comigo, sem medir esforços, sendo pai e mãe por natureza, opção
e amor!
À minha querida avó Zilda Sampaio Roberto (in memorian) que mesmo sem sua
presença física se faz presente a cada pensamento, lembrança, sonhos e realizações. Seu
desejo de me ver crescendo com sucesso sempre esteve vivo em mim e me faz sempre mais
forte. Obrigada pelo amor puro e incentivador, pela atenção dedicada no início dos meus
estudos, obrigada por me abençoar e iluminar em todos os dias da minha vida.
Ao meu orientador do período sanduíche, Dr. Gordon McDougall, do The James
Hutton Institute, em Dundee, na Escócia, por ter me recebido de portas abertas, fazendo de
tudo para que eu tivesse uma adaptação fácil e rápida. Obrigada pelo tempo dedicado a me
orientar, pela preocupação com meu aprendizado e aproveitamento. Obrigada por oferecer
esta enorme possibilidade de crescimento acadêmico e pessoal. Não posso deixar de agradecer
pelo carinho e zelo, pois estava sempre preocupado com minha segurança e bem estar.
7

Ao meu namorado e agora noivo, André Luís, por todo o amor e compreensão dos
meus momentos de ausência decorrente da dedição na realização deste trabalho. Muito
obrigada por não me deixar desistir e me mostrar ser capaz de chegar onde desejo, sem dúvida
tu foste um incentivo fundamental. Obrigada por apoiar os meus sonhos e compartilhar as
minhas esperanças.
Ao Departamento de Ciência de Alimentos da Faculdade de Engenharia de Alimentos
da Universidade Estadual de Campinas pela oportunidade oferecida para a realização deste
trabalho.
A todos os amigos que fiz no Laboratório de Bioquímica de Alimentos e no
Laboratório de Bioprocessos, Ruann, Joelise, Amanda, Débora, Fernanda, Ricardo, Camilo,
Gilberto, Jéssica, Marcela, Liege, Léo, André, Dani, Débora, Erica, Fabiano, Fabíola, Paula,
Tauan, Vânia, Lívia e Amanda Ruviaro. Obrigada pelas risadas, conversas, dividirem
bancada, almoços, angústias, tristezas, alegrias, filmes, experiências e muito carinho. À Val e
Bia, que sempre estiveram dispostas em ajudar durante todos os meus experimentos. Ao
grande amigo José Valdo que me recebeu em Campinas e no laboratório com tanto carinho e
que fez o processo de adaptação ser mais fácil. Um agradecimento especial às minhas
queridas amigas e companheiras Isa, Lívia, Paulinha e Aninha, vocês foram essenciais! Vocês
foram a força, a alegria, o alívio, a risada alta, a mudança necessária em mim, a amizade que
pulsa... aquelas pessoas a quem eu nunca vou cansar de agradecer por esses anos de convívio
e por terem me feito uma pessoa melhor.
Aos amigos que fiz em Dundee, os quais tornaram minha estadia fora mais leve e
tranquila. Em especial à Silvia, Alex, Thales, Henrique, Laís, Fred, Mohit, Moacir, Mauro,
Raíssa e Mariana, pessoas incríveis que amenizaram a saudade de casa.
À minha “housemate” e amiga Laurence, que me acolheu de braços abertos em sua
casa. Obrigada por toda a ajuda com minha dificuldade com a língua “escocesa”, por cozinhar
tantas coisas gostosas, além dos passeios, dicas e toda a paciência com minhas diferenças
culturais.
Aos membros da banca examinadora pelas valiosas e detalhistas sugestões e
contribuições que tornaram minha tese melhor.
À CAPES pela bolsa de estudos durante 4 anos do doutorado no Brasil.
Ao CNPq (programa Ciência sem Fronteiras) que me oportunizou a experiência ímpar
de fazer o doutorado sanduíche, me concedendo uma bolsa de doutorado sanduíche e taxa de
bancada, que foram essenciais para a realização dos meus experimentos na Escócia.
8

Durante esta caminhada, buscando resposta para algumas de minhas inquietações e

para os problemas deste extenso trabalho, contei com a colaboração de muitas pessoas, as
quais tornaram esse sonho possível e o percurso mais agradável, em razão de sua torcida,
companhia, apoio, incentivo e oração. Enfim, meu agradecimento sincero à todos aqueles que
não foram mencionados aqui, mas que tiveram, de alguma forma, partipação nesse trabalho.
“A glória da amizade não é a mão estendida, nem o sorriso carinhoso, nem mesmo a delícia
da companhia. É a inspiração espiritual que vem quando você descobre que alguém
acredita e confia em você.”
(Ralph Waldo Emerson)
RESUMO
Chás branco, preto, verde e mate contém polifenóis que são compostos bioativos presentes em
abundância em nossa dieta e tem apresentado efeitos benéficos no sobrepeso, obesidade e
suas complicações, como diabetes mellitus tipo 2. Entretanto, muitos polifenóis não podem
ser absorvidos em sua forma nativa e seus efeitos estão associados à biodisponibilidade.
Enzimas glicosídicas adicionadas ao processamento podem hidrolisar os compostos fenólicos
dos alimentos, aumentando sua bioacessibilidade, biodisponibilidade, bioeficácia e,
consequentemente, incrementar sua atividade funcional. Assim, o objetivo deste estudo foi
avaliar a eficiência e estabilidade de um biorreator com a enzima tanase imobilizada em
alginato de sódio, definir parâmetros operacionais do processo, assim como, caracterizar os
extratos de chá branco, preto, verde e mate biotransformados, avaliar seus potenciais
antiobesidade in vitro e a bioacessibilidade dos polifenóis após processo de digestão in vitro.
As melhores condições operacionais do biorreator para a hidrólise enzimática foram:
utilização de tanase imobilizada em alginato de sódio na concentração de 5%, 300 rpm de
agitação, temperatura de 60ºC e concentração do imobilizado enzimático de 0,75%. Em
análise por HPLC-DAD e ESI-MS foi verificado que houve hidrólise dos polifenóis,
principalmente do ácido clorogênico, epigalocatequina galato (EGCG), galocatequina galato
(GCG), epicatequina galato (ECG) e rutina. A análise quantitativa foi realizada por HPLC-
DAD e o resultado mais significativo foi o aumento do ácido gálico 16 vezes no chá verde e
13 vezes no chá branco. Após a hidrólise do chá verde pela tanase imobilizada foi verificada a
diminuição de 75% do teor de EGCG e 95% do teor de ECG, e aumento de 70% do teor de
EGC e, cerca de 2,7 vezes o conteúdo de EC. Nos chás preto e branco biotransformados com
tanase imobilizada houve a hidrólise de 91% e 75% de ECG, respectivamente. No chá mate a
hidrólise de ácido clorogênico (54%) resultou no aumento do ácido cafeico em 4,3 vezes. A
modificação no perfil fenólico dos chás pela tanase imobilizada resultou no aumento da
atividade antioxidante, avaliados pelo método ORAC e DPPH. Os chás branco e verde
também apresentaram maior atividade oxidante através do método FRAP. Os compostos
fenólicos dos chás exibiram estabilidade às condições digestivas gástricas simuladas,
entretanto baixa estabilidade após as condições intestinais, demonstrando a importância do
consumo dos polifenóis já na porção aglicona ou em moléculas menores, facilitando a
absorção dos bioativos antes da degradação no trato gastrointestinal. Adicionalmente, a
biotransformação forneceu extratos de chás com maior potencial contra obesidade. O
conhecimento dessas relações é importante e permitiu a identificação de algum dos efeitos
10

relacionados ao consumo de chás, assim como comprovou que chás biotransformados são
alternativas com maior benefício que os chás originais, podendo ser utilizados como
adjuvantes no tratamento padrão de pessoas com sobrepeso, obesas e suas comorbidades
como o diabetes tipo 2.
Palavras-chave: Chás, Camelia sinensis, Ilex paraguariensis, tanase, polifenóis, obesidade.

ABSTRACT
White, black, green and mate teas contain polyphenols which are bioactive compounds
present in abundance in our diet and have shown beneficial effects on overweight, obesity and
its complications, such as type 2 diabetes mellitus. However, many polyphenols can not be
absorbed in their native form and their effects are associated to bioavailability. Glycosidic
enzymes, added to the processing, can hydrolyse the phenolic compounds of food increasing
their bioaccessibility, bioavailability, bioefficacy and, as a consequence, increase their
functional activity. Therefore, the purpose of this study was to measure the efficiency and
stability of a bioreactor with the immobilized tannase enzyme in sodium alginate, to define
operational parameters of the process, as well as characterize biotransformed white, black,
green and mate tea extracts, to evaluate the antiobesity potential in vitro, and the
bioaccessibility of polyphenols after digestion process in vitro. The best bioreactor
operational conditions to enzymatic hydrolysis were: Tannase immobilized with alginate at a
5% concentration, 300 rpm stirring, temperature of 60 °C and enzymatic immobilized at a
0.75% concentration. The analyses from HPLC-DAD and HPLC/ESI-MS showed that there
was polyphenols hydrolysis, mainly chlorogenic acid, of catechins: epigallocatechin gallate
(EGCG), gallocatechin gallate (GCG), epicatechin gallate (ECG) and rutin. The quantitative
analysis was determined using HPLC-DAD and the most significant result was the increase of
gallic acid in 16 fold on green tea and 13 fold on white tea. After green tea hydrolysis by
immobilized tannase, a 75% decrease in EGCG content and 95% ECG content was observed,
with an increase of 70% in EGC content and 2.7 fold the EC content. In biotransformed black
and white teas by immobilized tannase there were hydrolysis of 91% and 75% of ECG,
respectively. In mate tea the hydrolysis of chlorogenic acid (54%) resulted in increased
caffeic acid by 4.3 fold. The modification in polyphenol profile of teas by immobilized
tannase resulted in increase of an antioxidant activity evaluated by both ORAC and DPPH
assays. The white and green teas also showed a higher antioxidant activity by FRAP assay.
The polyphenolic compounds of teas exhibited stability to the simulated gastric digestive
conditions, but low stability after intestinal conditions, evidencing the importance of phenolic
consumption in aglycone portion or in smaller molecules, facilitating the bioactives
absorption before gastrointestinal tract degradation. Additionally, the biotransformation
process provided teas extracts with higher potential against obesity. The knowledge of these
relations is important and allowed the identification of some of the effects related to the tea’s
consumption, as wells as proved that the biotransformed teas are an alternative with greater
12

benefits, as they can be used as adjuvants, without standard treatment of overweight, obese
people and their comorbidities like type 2 diabetes.
Keywords: Teas, Camelia sinensis, Ilex paraguariensis, tannase, polyphenols, obesity

13

LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO I - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA - Efeito da biotransformação de

polifenóis de chás por tanase imobilizada em alginato: bioacessibilidade e atividade
antiobesidade.
Tabela 2.1 Classificação dos flavonoides e fontes alimentares. ............................................... 36
Tabela 3.1 Atividades antiobesidade relacionadas aos polifenóis de Camellia sinensis (chá
branco, chá verde e chá preto) e Ilex paraguariensis (erva mate e chá mate).......................... 47
CAPÍTULO II - Imobilização de tanase e caracterização cinética da hidrólise de taninos.
Tabela 2.1 Variáveis e níveis utilizados. .................................................................................. 84
Tabela 2.2 Matriz do delineamento contendo valores decodificados e codificados (entre
parênteses) das variáveis. ......................................................................................................... 85
Tabela 3.1 Parâmetros cinéticos para hidrólise de ácido tânico pela tanase livre e imobilizada,
produzidas por Paecilomyces variotii....................................................................................... 89
Tabela 3.2 Parâmetros cinéticos obtidos para o processo de inativação da tanase. ................. 91
Tabela 3.3 Avaliação da atividade específica e eficiência relativa após 6 ciclos de hidrólise
com tanase imobilizada em 2 concentrações de alginato. ........................................................ 93
Tabela 3.4 Estabilidade da atividade da enzima imobilizada durante o processo de
armazenagem. ........................................................................................................................... 94
Tabela 3.5 Delineamento composto central rotacional para estudo do efeito das variáveis
temperatura, concentração de enzima, concentração de alginato e agitação na atividade
enzimática utilizando tanase imobilizada em processo em batelada. ....................................... 95
Tabela 3.6 Coeficientes de regressão do DCCR para determinação da atividade enzimática
após 30, 60 e 90 minutos de reação. ......................................................................................... 96
Tabela 3.7 Coeficientes de regressão do DCCR 24 para Eficiência Relativa de imobilização
após 30, 60 e 90 minutos de reação. ......................................................................................... 97
Tabela 3.8 Eficiência Relativa (%) avaliada através da mensuração da proteína transferida
para o meio reacional, em estudo univariado com 5 concentrações de imobilizado
enzimático. .............................................................................................................................. 100
CAPÍTULO III - Hidrólise de fenólicos de variados tipos de chás por tanase imobilizada
e efeito no perfil fenólico, atividade antioxidante e estabilidade em ambiente
gastrointestinal simulado.
Tabela 3.1 Alterações do perfil de compostos fenólicos após hidrólise enzimática do extrato
de chá branco. ......................................................................................................................... 122
de chá verde. ........................................................................................................................... 123
de chá preto. ............................................................................................................................ 124
de chá mate. ............................................................................................................................ 126
14

Tabela 3.5 Efeito do tratamento da tanase imobilizada no teor dos principais polifenóis
encontrados nos chás através da quantificação por HPLC/DAD............................................132
Tabela 3.6 Atividade antioxidante………………………………………………..…………133
CAPÍTULO IV - Immobilized tannase treatment alters polyphenolic composition in teas
and their potential anti-obesity and hypoglycemic activities in vitro.
Table 3.1 Total phenol content of tea extracts........................................................................ 170
Table 3.2 Major changes in phenolic compounds after tannase treatment of teas. ................ 172
Tabela 3.3 Half maximal inhibitory concentration (IC50) values for α-amylase activity...... 173
Table 3.4 Half maximal inhibitory concentration (IC50) values based on total phenols content
of tea extracts on α-glucosidase activity. ................................................................................ 173
Table 3.5 Lipase activity using ρNP substrate. Half maximal inhibitory concentration (IC50)
values based on total phenols content of tea extracts on lipase inhibition. ............................ 176
Table 3.6 Lipase activity using olive oil as a substrate. Half maximal inhibitory concentration
(IC50) values based on total phenols content of tea extracts on lipase inhibition.. ................. 178
15

LISTA DE FIGURAS

antiobesidade.
Figura 2.1 Estrutura genérica dos flavonoides. ........................................................................ 34
Figura 2.2 Estrutura básica das diversas classes de flavonoides. ............................................. 35
Figura 2.3 Estrutura de um trímero de proantocianidina.. ........................................................ 37
Figura 3.1 Planta Camellia sinensis. ........................................................................................ 39
Figura 3.2 Planta Ilex paraguariensis....................................................................................... 43
Figure 4.1 Atividade esterásica e depsidase da tanase. ............................................................ 48
Figura 4.2 Principais métodos de imobilização de enzimas. CLEA: cross-linked enzyme
agregates. CLEC: cross-linked enzyme agregates.. .................................................................. 51
Figura 4.3 Estrutura dos blocos homopoliméricos GG e MM e dos blocos heteropoliméricos
GM, que constituem a molécula de alginato. ........................................................................... 53
Figura 4.4 Formação da estrutura “eggbox” a partir da interação iônica dos blocos G com
cátions de cálcio........................................................................................................................ 55
Figura 4.5 Modelo "egg-box" de gelificação do alginato e rearranjo das cadeias de alginato
com cálcio.. ............................................................................................................................... 56
Figura 4.6 Gráfico esquemático da formação de micropartículas de alginato de sódio via
interação com íons cálcio.. ....................................................................................................... 57
CAPÍTULO II - Imobilização de tanase e caracterização cinética da hidrólise de taninos.
Figura 2.1 Imobilização de tanase por encapsulação em alginato de sódio. ............................ 80
Figura 2.2 Modelo esquemático do biorreator testado: Esquema de operação de um biorreator
de mistura perfeita. A cesta contendo a enzima é representada pela estrutura fixada em b, Ci é
a concentração de substrato, VR é o volume do biorreator e A é o sistema de agitação
magnética. ................................................................................................................................. 83
Figura 2.3 Ilustração do biorreator utilizado. ........................................................................... 83
Figura 3.1 Atividade enzimática da tanase imobilizada e livre. Médias seguidas por letras
diferentes diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05). ........................................................ 86
Figura 3.2 Resultados da avaliação da porcentagem de atividade imobilizada e eficiência de
imobilização. Médias seguidas por letras diferentes diferem entre si pelo teste t (p<0,01). .... 87
Figura 3.3 Diagrama de Lineweaver-Burk aplicado aos dados experimentais para a tanase
livre. .......................................................................................................................................... 89
Figura 3.4 Diagrama de Lineweaver-Burk aplicado aos dados experimentais da tanase
imobilizada em duas concentrações: 3,6% e 5% ...................................................................... 90
Figura 3.5 Estabilidade operacional na reutilização da tanase imobilizada em alginato em
ciclos sucessivos. Os valores representam a média ± desvio padrão. * = diferem
estatisticamente pelo teste t (p<0,05). ...................................................................................... 92
16

Figura 3.6. Comportamento da atividade específica em estudo univariado com 5

concentrações de imobilizado enzimático no meio reacional. ................................................. 98
Figura 3.7 Comportamento da hidrólise de ácido tânico em ácido gálico em estudo univariado
com 5 concentrações de imobilizado enzimático no meio reacional........................................ 99
CAPÍTULO III - Hidrólise de fenólicos de variados tipos de chás por tanase imobilizada
e efeito no perfil fenólico, atividade antioxidante e estabilidade em ambiente
gastrointestinal simulado.
Figura 3.1 Análise HPLC-MS do (A) chá branco (B) chá verde (C) chá preto. Os traços dos
chás originais estão em azul e dos chás biotransformados estão em vermelho.. .................... 120
Figura 3.2 Análise HPLC-MS do chá mate. Os traços dos chás originais estão em azul e dos
chás biotransformados estão em vermelho.. ........................................................................... 121
Figura 3.3 Áreas médias dos picos (HPLC/MS) a partir de três amostras. (A) Chá branco -
CB= chá branco original, CBT= chá branco biotransformado. (B) Chá verde - CV= chá verde
original, CVT= chá verde biotransformado. (C) Chá preto - CP= chá preto original, CPT= chá
preto biotransformado, EC = epicatequina, CAT= catequina, EGC= epigalocatequina, GC=
galocatequina, GQA= ácido 5-galoil quinico, CGA= ácido clorogênico, 3CGA= ácido 3-O-
cafeoilquinico, 4CGA= ácido 4-O-cafeioilquinico, ECG = epicatequina galato, EGCG=
epigalocatequina galato, DCQA= ácido dicafeoil quínico, PDBG= Prodelfinidina B 2-3'-O-
galato. * = P <0,05, ** = p <0,01, sem anotação = NS através do teste t. ............................. 127
Figura 3.4 Média da área do picos (HPLC/MS) do ácido cafeico a partir de três amostras de
chá mate. ** = significativamente diferentes através do teste t, p <0,01. .............................. 129
Figura 3.5 Média das áreas dos picos de cafeína e teobromina (HPLC/MS) a partir de três
amostras. * = p <0,05, ** = p <0,01, sem anotação = NS através do teste t. ......................... 130
Figura 3.6 (A) HPLC-MS de chá branco original (azul) e chá branco biotransformado
(vermelho) após a digestão gástrica (B) HPLC-MS de chá branco original (azul) e chá branco
biotransformado (vermelho) após a digestão pancreática.. .................................................... 136
Figura 3.7 (A) Análises de HPLC-MS de chá verde (azul) e chá verde biotransformado
(vermelho) após digestão gástrica. (B) Análises de HPLC-MS de chá verde (azul) e chá verde
biotransformado (vermelho) após digestão pancreática. ........................................................ 137
Figura 3.8 (A) Análises de HPLC-MS de chá preto (azul) e chá preto biotransformado
(vermelho) após digestão gástrica. (B) Análises de HPLC-MS de chá preto (azul) e chá preto
Figura 3.9 (A) Análises de HPLC-MS de chá mate (azul) e chá mate biotransformado
(vermelho) após digestão gástrica. (B) Análises de HPLC-MS de chá mate (azul) e chá mate
Figura 3.10 Porcentagem de recuperação do ácido cafeico no chá mate biotransformado após
digestão gástrica e pancreática após análise de HPLC-MS. ................................................... 143
CAPÍTULO IV - Immobilized tannase treatment alters polyphenolic composition in teas
and their potential anti-obesity and hypoglycemic activities in vitro.
Figure 3.1 UV traces of tea extracts before and after tannase treatment. Samples were
analysed at 1mg/mL and originals are in blue and tannase-treated in red. (A) Black tea (B)
Green tea (C) White tea. (D) Mate tea. Traces are shown overlaid at 280 nm. ..................... 171
17

Figure 3.2 Effect of white tea (a) and green tea (b) extracts on lipase activity. The dose
response for phenols content of extracts on lipase inhibition was assessed. Values are
expressed as % control activity and were triplicates ± standard deviation. ........................... 177
Figure 3.3 Effect of tea extracts on 3T3-L1 cell viability. Two concentrations of tea extracts
(250 and 500 µg of TPC/mL) were applied. Results are means of three replicate experiments
± standard deviation. Values different from control group at *p< 0.05 are shown. ............... 179
Figure 3.4 Effect of Black tea (A); Green tea (B); White tea (C) and Mate tea (D) on lipid
accumulation in 3T3-L1 cells.. Results are means of three replicate experiments ± standard
deviation. We used analysis of variance, followed by Tukey’s test. *p< 0,05 compared with
control group. Same letters represent p>0.05; different letters represent p<0.05. ................. 181
18

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AE Atividade específica (U/mg de proteína)

AG Ácido gálico
APPH 2,2'-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride
ARE Elemento de resposta antioxidante
BSA Albumina sérica bovina
BSA Albumina sérica bovina
CAT Catequina
CB Chá branco
CBT Chá branco biotransformado
CGA Ácido clorogênico
CP Chá preto
CPT Chá preto biotransformado
CV Chá verde
CVT Chá verde biotransformado
DCCR Delineamento Composto Central Rotacional
DCQA Ácido dicafeoil quínico
DMEM Dulbecco's Modified Eagle's medium
DNA Ácido desoxirribonucleico
DPPH 2,2-difenil-1-picril-hidrazila
EC Epicatequina
ECG Epicatequina galato
EF Eficiência relativa
EGC Epigalocatequina
EGCG Epigalocatequina galato
FRAP Ferric reducing antioxidant power
GC Galocatequina
GCG Galocatequina galato
GQA Ácido 5-galoil quinico
HDL High density lipoprotein
HPLC High performance liquid chromatography
IC50 Concentração responsável por 50% da inibição
IL-6 Interleucina-6
19

LDL Low density lipoprotein

mRNA Ácido ribonucleico menssageiro
MTT Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio
NF-E2 Fator nuclear eritróide 2
ORAC Oxygen Radical Absorbance Capacity
PDBG Prodelfinidina B 2-3'-O-galato
PPO Polifenol oxidase endógena
SNC Sistema Nervoso Central
TNF-α Fatores de necrose tumoral alfa
UV Ultravioleta
20

SUMÁRIO
RESUMO
ABSTRACT
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO GERAL ....................................................................................................... 24

antiobesidade........................................................................................................................... 28
1. Introdução ....................................................................................................................... 31
2. Compostos fenólicos ....................................................................................................... 32
3. Chás ................................................................................................................................. 39
3.1 Chá Branco, Chá Preto e Chá Verde ..................................................................... 39
3.2 Chá Mate................................................................................................................ 42
3.3 Chás e a obesidade ................................................................................................. 44
4. Tanase ............................................................................................................................. 47
4.1 Imobilização de enzimas........................................................................................ 49
5. Conclusão ........................................................................................................................ 58
6. Referências ...................................................................................................................... 60
CAPÍTULO II - Imobilização de tanase e caracterização cinética da hidrólise de

taninos ...................................................................................................................................... 73
1. Introdução ....................................................................................................................... 77
2. Materiais e Métodos ........................................................................................................ 79
2.1 Materiais ................................................................................................................ 79
2.2 Produção e imobilização da tanase ........................................................................ 79
2.3 Determinação da atividade enzimática e eficiência de imobilização .................... 80
2.4 Determinação de Km, Vmáx, Tempo de meia vida e Kd ...................................... 81
2.5 Estabilidade operacional e preservação da atividade durante armazenamento ..... 82

21

2.6 Estudo da hidrólise de ácido tânico em biorreator pela tanase imobilizada em

alginato por meio de planejamento de experimentos. .............................................................. 82
2.6.1 Biorreator utilizado ........................................................................................... 82
2.6.2 Delineamento composto central rotacional ....................................................... 84
2.6.3 Planejamento univariado ................................................................................... 85
2.7 Análise Estatística .................................................................................................. 86
3. Resultados e Discussão ................................................................................................... 86
3.1 Atividade Enzimática e Eficiência de imobilização .............................................. 86
3.2 Determinação de Km, Vmáx, Tempo de meia vida e Kd ...................................... 88
3.3 Estabilidade operacional e preservação durante armazenamento .......................... 92
3.4 Estudo da otimização da hidrólise de ácido tânico por delineamento composto

central rotacional ...................................................................................................................... 94
3.4.1 Delineamento composto central rotacional ....................................................... 94
3.4.2 Planejamento univariado ................................................................................... 98
4. Conclusão ...................................................................................................................... 100
5. Referências .................................................................................................................... 102
CAPÍTULO III - Hidrólise de fenólicos de variados tipos de chás por tanase

imobilizada e efeito no perfil fenólico, atividade antioxidante e estabilidade em ambiente
gastrointestinal simulado ..................................................................................................... 106
1. Introdução ..................................................................................................................... 112
2. Materiais e Métodos ...................................................................................................... 113
2.1 Materiais .............................................................................................................. 113
2.2 Chás e preparação dos extratos ............................................................................ 114
2.3 Imobilização da tanase e biotransformação enzimática....................................... 114
2.4 Caracterização do perfil de fenólicos dos chás por HPLC-ESI/MS e quantificação

dos principais compostos fenólicos por HPLC-DAD............................................................. 115
2.4.1 Caracterização do perfil de fenólicos dos chás por Cromatografia Líquida de

alta eficiência acoplada ao espectometro de massas - (HPLC/ESI-MS) ................................ 115
22

2.4.2 Quantificação de compostos fenólicos por cromatografia líquida de alta

eficiência acoplada a um detector de arranjo de diodos (HPLC-DAD) ................................. 116
2.5 Atividade Antioxidante ........................................................................................ 117
2.5.1 Capacidade de sequestrar o radical DPPH ...................................................... 117
2.5.2 Teste de capacidade antioxidante do radical oxigênio – ORAC (Oxygen

Radical Antioxidant Activity) ................................................................................................ 117
2.5.3 Poder redutor do íon ferro – FRAP ................................................................. 117
2.6 Digestão in vitro .................................................................................................. 118
2.7 Análise estatística ................................................................................................ 119
3. Resultados e Discussão ................................................................................................. 119
3.1 Detecção, identificação e quantificação dos compostos extraídos de chás ......... 119
3.1.1 Caracterização dos chás através da detecção e identificação por Cromatografia

Líquida de alta eficiência acoplada ao espectometro de massas - (HPLC/ESI-MS) .............. 119
3.1.2 Quantificação de compostos fenólicos por cromatografia líquida de alta

eficiência acoplada a um detector de arranjo de diodos (HPLC-DAD) ................................. 131
3.2 Atividade antioxidante ......................................................................................... 133
3.3 Estabilidade dos polifenóis após digestão in vitro ............................................... 135
4. Conclusão ...................................................................................................................... 143
5. Referências .................................................................................................................... 145
CAPÍTULO IV - Immobilized tannase treatment alters polyphenolic composition in

teas and their potential anti-obesity and hypoglycemic activities in vitro ....................... 155
1. Introduction ................................................................................................................... 159
2. Materials and Methods .................................................................................................. 161
2.1 Materials and Chemicals...................................................................................... 161
2.2 Immobilized tannase ............................................................................................ 162
2.3 Preparation of tea extracts ................................................................................... 163
2.4 Biotransformation ................................................................................................ 163
2.5 Total Phenols ....................................................................................................... 163

23

2.6 Liquid chromatography–mass spectrometry (LC–MS) analysis ......................... 163
2.7 α - Amylase assay ................................................................................................ 165
2.8 α - Glucosidase assay ........................................................................................... 166
2.9 Lipase Assay (ρNP substrate) .............................................................................. 166
2.10 Lipase activity assay using olive oil as the substrate ........................................... 167
2.11 Cell culture and differentiation ............................................................................ 168
2.12 Oil Red O staining ............................................................................................... 168
2.13 Statistical analysis ................................................................................................ 169
3. Results and Discussion.................................................................................................. 169
3.1 Total Phenolic Content and Phenolic Profile....................................................... 169
3.2 Effects on α-Amylase and α-Glucosidase inhibition ........................................... 172
3.3 Lipase inhibition effects ...................................................................................... 175
3.4 3T3-L1 Cell Culture and adipogenesis ................................................................ 179
4. Conclusions ................................................................................................................... 182
5. References ..................................................................................................................... 183
DISCUSSÃO GERAL .......................................................................................................... 190
CONCLUSÃO GERAL ....................................................................................................... 199
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA.................................................................................. 200
ANEXOS................................................................................................................................ 207

24

INTRODUÇÃO GERAL
A obesidade é fator de risco para diversas doenças crônicas não transmissíveis como
diabetes mellitus tipo 2, hipertensão arterial, doenças cardiovasculares, acidentes vasculares
cerebrais, hiperlipidemia, distúrbios músculo-esqueléticos e diversos tipos de câncer (OPAS,
2003; WHO, 2016). O excesso de massa corporal e a obesidade são reconhecidos como
problemas de saúde pública mundial e estão entre os cinco principais fatores de risco para as
causas de morte globais. Na literatura, existe um consenso de que a etiologia da obesidade é
bastante complexa, apresentando um caráter multifatorial. Dentre os diversos fatores, o
aumento da ingestão de alimentos altamente energéticos, ricos em gordura, associado ao
sedentarismo e à susceptibilidade genética seriam determinantes para o crescimento da
obesidade no mundo (FRANCISCHI et al. 2000; JEBB, 1997; OPAS, 2003; WHO, 2016).
Embora haja inúmeros fatores envolvidos, nota-se na literatura científica que os estudos sobre
obesidade são centrados nos fatores biológicos, relacionados ao estilo de vida, especialmente
no que diz respeito ao binômio: dieta e atividade física. Há crescente busca por alterações dos
fatores de risco contribuintes para a obesidade, seja utilizando fármacos, como também
através de mudanças comportamentais, como exercícios físicos frequentes e dieta. A inclusão
de alimentos com antioxidantes que desfavoreçam a ação de radicais livres ou quem atuem no
metabolismo de lipídeos e glicose para prevenir as complicações da obesidade sem, contudo,
apresentar efeitos adversos têm mostrado bons resultados (AUVICHAYAPAT et al., 2008;
HURSEL; VIECHTBAUER; WESTERTERP-PLANTENGA, 2009; HUANG et al., 2014;
BUCHHOLZ; MELZIG, 2016; CASTRO-ACOSTA et al., 2016; CHEN et al., 2016; PAN et
al., 2016; YANG et al., 2016). A partir disso, alterações da dieta impedindo o curso da
obesidade, ou seja, agindo na perda de peso ou na diminuição do ganho de peso é de suma
importância e interesse.
Vários estudos epidemiológicos têm demonstrado os efeitos benéficos do chá e seus
compostos bioativos sobre a obesidade (HUANG et al., 2014; MIYOSHI et al., 2015;
BUCHHOLZ; MELZIG, 2016; PAN et al., 2016; YANG et al., 2016). Estudo realizado na
Holanda mostrou que a alta ingestão de flavonas, flavonois e catequinas foi inversamente
associado com o índice de massa corporal (IMC) em mulheres (HUGHES et al., 2008). Outro
estudo epidemiológico realizado com 6472 participantes descobriu que o consumo de chá
quente foi inversamente associado com a obesidade; consumidores de chá quente tinham
cintura inferior e IMC mais baixo do que os não consumidores (VERNARELLI; LAMBERT,
2013). A planta Camellia sinensis (C. sinensis) é usada como chá de diversas maneiras, de
25

acordo com os níveis de fermentação, sendo principalmente classificado como: branco e verde
(não fermentados), oolong (parcialmente fermentado) e preto (fermentado) (YANG; CHEN;
WU, 2014; HAYAT et al., 2015; SUZUKI et al., 2016). O poder antioxidante do chá é mais
elevado nos processos onde há pouca fermentação (CHENG, 2000). A planta Ilex
paraguariensis é usada como chá mate (torrado), chimarrão e tererê (infusão da erva verde em
água quente e fria, respectivamente) (MARTINS et al., 2009; MEINHART et al., 2010). Estes
chás são ricos em polifenóis cujos impactos na saúde ainda necessitam ser totalmente
esclarecidos, devido a inexistência de mecanismos de ação conclusivas e pouca pesquisa com
ensaios clínicos.
Polifenóis são compostos bioativos abundantes em nossa dieta e há evidências de seu
papel na prevenção de doenças degenerativas como câncer e doenças cardiovasculares. Os
efeitos dos polifenóis na saúde dependem da quantidade consumida e da sua bioacessibilidade
e biodisponilbilidade (SCALBERT et al., 2005). No entanto, a maioria dos polifenóis está
presente em alimentos sob a forma de ésteres, glicosídeos ou polímeros, não sendo absorvidos
na sua forma nativa. Estas substâncias precisam ser hidrolisadas pelas enzimas intestinais ou
pela microflora do cólon para serem absorvidas (MANACH; DONOVAN, 2004). Estas
enzimas podem ser obtidas de outras fontes como o próprio alimento ou serem adicionadas
durante o processamento (SCALBERT; WILLIAMSON, 2000). A hidrólise enzimática de
polifenóis resulta, além do aumento da absorção, no aumento da atividade antioxidante,
quando comparado com o composto original não biotransformado. Macedo et al. (2011)
estudaram extratos de chá verde e erva mate, substratos ricos em compostos fenólicos,
avaliando as propriedades antioxidantes potenciais antes e após a reação de biotransformação
enzimática catalisada por tanase de Paecilomyces variotii. Os autores verificaram que o poder
antioxidante dos substratos aumentou quando submetidos ao tratamento enzimático. Esses
resultados encontrados fornecem dados relevantes sobre o potencial da aplicação de tanase em
várias fontes de polifenóis a fim de aumentar o poder antioxidante de bebidas.
Apesar de todo potencial da aplicação de catalisadores biológicos, sua utilização
industrial pode ser limitada devido a diversos fatores, como: alto custo de produção, alta
solubilidade em água, menor estabilidade, baixa atividade a temperaturas elevadas e não ser
viável sua recuperação após a utilização, quando comparadas com catalisadores químicos.
Para minimizar esses problemas, técnicas de imobilização dessa enzima foram desenvolvidas
e monstraram bons resultados de eficiência e atividade enzimática, possibilitando o seu uso
em processos em batelada, oferecendo menor custo e facilitando a recuperação da enzima
com maior pureza do produto final (SCHONS et al., 2011; SCHONS, 2012).
26

Muitos trabalhos realizados com compostos fenólicos são centrados sobre sua
bioacessibilidade, biodisponibilidade, bioeficácia e estabilidade em diferentes matrizes. É
importante considerar que alguns polifenóis presentes em chás, que têm atividade biológica in
vitro e, in vivo, podem não ser biodisponiveis, ou serem rapidamente metabolizados e
excretados, tornando-se ineficazes. Além disso, apesar de estudos epidemiológicos indicarem
uma correlação entre a ingestão de alimentos ricos em compostos fenólicos e a redução do
risco de doenças crônicas, estudos intervencionais em seres humanos nem sempre tem
confirmado os efeitos benéficos desses compostos observados in vitro. É bem conhecido que
os flavonoides e ácidos fenólicos são altamente metabolizados após a ingestão e absorção
gastrointestinal, sendo geralmente transformados em metabólitos com diferente atividade
antioxidante da molécula precursora (MANACH et al., 2004). Ou seja, uma das razões para
tais discordâncias pode ser a falta de dados a respeito do processo que ocorre do momento da
sua ingestão até exercer seus efeitos biológicos.
Portanto, a elucidação do processo de digestão dos polifenóis constitui um passo
importante para uma abordagem completa sobre a atividade biológica dessas substâncias e
certamente, somente parte dos alimentos e compostos bioativos foi adequadamente estudada
desse ponto de vista. Juntamente com essa falta de dados há o uso crescente de novas
tecnologias que atendam a crescente necessidade de um melhor aproveitamento pelo corpo
dos compostos bioativos provenientes de fontes naturais, de forma que contribuam com a
melhoria da qualidade de vida.
A partir do exposto, o presente trabalho foi dividido em quatro capítulos. O Capítulo I
consiste em uma Revisão Bibliográfica que visou aliar o conhecimento da tanase e seu
potencial uso em chás, a imobilização de enzimas com foco na encapsulação em alginato de
sódio, chás como fonte de compostos fenólicos, sua bioacessibilidade, além das ações
antioxidantes e antiobesogênica.
No Capítulo II foram abordados aspectos de caracterização da tanase imobilizada em
alginato de sódio. Neste capítulo também teve o objetivo de realizar um estudo dos fatores
relevantes para a construção de um biorreator utilizando tanase imobilizada. Os parâmetros
avaliados incluíram a combinação mais adequada de imobilizado/substrato, a influência da
concentração de alginato, frequência de agitação e temperatura, sendo analisado também o
tempo de hidrólise na produção de ácido gálico.
Os Capítulos III e IV abordaram o estudo da utilização do biorreator em chás. O
objetivo foi primeiramente avaliar o perfil de fenólicos dos chás branco, preto, verde e mate,
antes e após a biotransformação, e posteriormente o impacto da hidrólise da tanase
27

imobilizada na atividade antioxidante dos chás, avaliada pelos ensaios de ORAC, FRAP e
DPPH. Através da digestão in vitro o objetivo foi identificar a estabilidade dos compostos
fenólicos dos chás. O impacto dos chás biotransformados na obesidade foi avaliado através da
inibição das enzimas gástricas in vitro e da adipogênese em células 3T3-L1.
28

CAPÍTULO I - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Efeito da biotransformação de polifenóis de chás por tanase imobilizada em alginato:

bioacessibilidade e atividade antiobesidade
29

RESUMO
Os polifenóis são encontrados amplamente em fontes vegetais, incluindo frutas, legumes e

cereais e em bebidas como chás e suco de frutas. Atuam na prevenção de doenças
degenerativas e cardiovasculares, no entanto, podem ter seu efeito diminuído devido à sua
complexação com outros compostos, sendo sua absorção diminuída em sua forma nativa.
Como estratégia tecnológica, enzimas adicionadas ao processamento podem hidrolisar estes
compostos desempenhando um papel essencial no aumento da biodisponibilidade e
bioeficácia destes compostos. A revisão bibliográfica aborda estratégias de imobilização de
enzimas que possam ser utilizadas na biotransformação por tanase para o aumento da
bioacessibilidade de polifenóis em chás, de forma que o precesso apresente viabilidade para
aplicação industrial.
Palavras-chave: polifenóis, tanase, imobilização, biotransformação, chás.

30

ABSTRACT
Polyphenols are found widely in plant sources, including fruits, vegetables and cereals and
inbeverages such as teas and fruit juice. They act in the prevention of degenerative and
cardiovascular diseases; however, they can have their effect diminished due to its
complexation with other compounds, being its absorption diminished in its native form. As a
technological strategy, enzymes added to the processing can hydrolyse these compounds by
playing an essential role in increasing the bioavailability and bioefficacy of these compounds.
The literature review approaches strategies for immobilization of enzymes that can be used in
biotransformation by tannase to increase the bioaccessibility of polyphenols in teas so that the
process presents viability for industrial application.
Keywords: polyphenols, tannase, immobilization, biotransformation, teas.

31

1. Introdução
O chá é uma das mais populares bebidas consumidas no mundo. Os inúmeros estudos
in vitro, em animais e em humanos evidenciam que seu abundante conteúdo de polifenóis
possui bioatividade para afetar a patogênese da obesidade e suas comorbidades. Os efeitos dos
polifenóis na saúde dependem da quantidade consumida e da sua bioacessibilidade e
biodisponibilidade (SCALBERT et al., 2005). Os polifenóis que não estão bioacessíveis na
sua forma nativa, em especial aqueles encontrados na forma de ésteres, glicosídeos e
polímeros, apresentam a necessidade de biotransformação no trato gastrointestinal
(SCALBERT; WILLIAMSON, 2000). A hidrólise enzimática de polifenóis resulta, no
aumento da absorção e atividade antioxidante, quando comparado ao composto original não
biotransformado. A biodisponibilidade de um dado composto ou de seu metabólito depende
de fatores, como a complexidade da matriz, a estrutura química do composto de interesse e o
tempo de trânsito intestinal (HOLST; WILLIAMSON, 2008). Assim, os polifenóis mais
abundantes na dieta humana não são necessariamente os mais ativos, pois eles podem possuir
menor atividade intrínseca, serem pouco absorvidos no intestino, altamente metabolizados ou
ainda, rapidamente eliminados. Além disso, o teor de polifenóis das plantas pode diferir entre
as variedades de espécies e também com a maturação na época da colheita, fatores
ambientais, processamento e armazenamento (MANACH et al., 2004).
A enzima tanino acil hidrolase, conhecida como tanase (E.C. 3.1.1.20) é uma esterase
que tem capacidade de catalisar a reação de hidrólise das ligações ésteres presentes nos
taninos hidrolisáveis e ésteres de ácido gálico, assumindo inúmeras aplicações em alimentos,
medicamentos, bebidas e indústria química (BATTESTIN; MACEDO, 2007b). Macedo et
al. (2011) estudaram a atividade de tanase em extratos de chá verde e erva mate, substratos
ricos em compostos fenólicos, demonstrando maiores propriedades antioxidantes potenciais
do chá verde e extrato de erva-mate após a reação de biotransformação enzimática catalisada
por tanase de Paecilomyces variotii. Os resultados encontrados fornecem dados relevantes
sobre o potencial da aplicação de tanase em chás, fontes de polifenóis, para aumentar o poder
antioxidante de bebidas.
Apesar de todo potencial da aplicação de catalisadores biológicos, sua utilização
industrial pode ser limitada devido a diversos fatores, como: custo de produção, alta
solubilidade em água, menor estabilidade, baixa atividade a temperaturas elevadas e não ser
viável sua recuperação após a utilização, quando comparadas com catalisadores químicos
(CANILHA; CARVALHO; SILVA, 2006; SHELDON; PELT, 2013). Para minimizar esses
32

problemas, técnicas de imobilização podem reduzir os custos envolvidos na útil ização de

enzimas, permitindo também a reutilização do biocatalizador nas reações de aplicadas,
mostrando fundamental importância. Considerando a ampla variação nas quantidades de
antioxidantes fenólicos disponíveis por meio da alimentação, em combinação com a reduzida
biodisponibilidade, estratégias que permitam liberar os compostos fenólicos dos seus
conjugados e consequentemente, melhorar a atividade funcional dos alimentos são
alternativas promissoras (GEORGETTI et al., 2009). Esta revisão aborda a utilização de
tanase imobilizada empregada com o objetivo de melhorar a bioacessibilidade e
biodisponibilidade dos compostos fenólicos em chás, bem como técnicas que permitem essa
avaliação. A revisão aborda também o potencial do uso da técnica em chás a fim de melhorar
seu potencial antioxidante e antiobesidade.
2. Compostos fenólicos
Os compostos fenólicos são polifenóis presentes nos vegetais, na forma livre ou

ligados a açúcares (glicosídeos) e proteínas, e são metabólitos secundários cuja estrutura
química possui um anel aromático com um ou mais substituintes hidroxílicos, incluindo seus
derivados funcionais como ésteres, metoxilas, glicosídeos e outros (KING; YOUNG, 1999;
LEE et al., 2005).
Atualmente são de amplo consenso os benefícios para saúde dos polifenóis. Estes são
antioxidantes naturais altamente eficazes, sugerindo-se que um aumento do consumo destes
em nossas dietas é benéfico na prevenção de danos oxidativos associados à várias doenças
humanas (GU et al., 2003). Há também afirmação de que os polifenóis podem atuar de forma
independente das suas atividades antioxidantes. Eles podem ter efeitos de drogas tal como a
modulação de sistemas de transdução de sinal, presumivelmente, através de interações com
receptores ou membranas e pela inibição direta das enzimas envolvidas na progressão da
doença (HANCOCK; MCDOUGALL; STEWART, 2007). Mais ainda, diversos trabalhos
apontam aos polifenóis capacidade de estimular a vasodilatação, melhorar a secreção de
insulina e inibir as atividades das enzimas fosfolipase A2, ciclooxigenase, lipoxigenase e
xantina oxidase que estão envolvidas em processos inflamatórios (MANACH et al., 2004;
HAN; SHEN; LOU, 2007; HEO et al., 2007; BOUAYED, 2010; BOUAYED; HOFFMANN;
BOHN, 2011; LEOPOLDINI; RUSSO; TOSCANO, 2011; PALAFOX-CARLOS; AYALA-
ZAVALA; GONZÁLEZ-AGUILAR, 2011). Diversos polifenóis, têm ainda sido destacados
devido à possibilidade de se ligarem a receptores celulares e transportadores de membranas e
33

assim influenciarem a expressão gênica, a sinalização e a adesão celular e modularem a

atividade de uma vasta gama de enzimas e receptores celulares (HEO et al., 2007;
BOUAYED; HOFFMANN; BOHN, 2011).
Os compostos fenólicos podem ser classificados em três grandes grupos (flavonoides,
ácidos fenólicos e taninos) e englobam desde moléculas simples até moléculas com alto grau
de polimerização (ANGELO; JORGE, 2007; SCHONS, 2009).
Os ácidos fenólicos são distribuídos por todo o reino vegetal. Muitas pesquisas têm
sido realizadas devido ao potencial papel destes compostos na proteção do organismo
humano. O consumo dos ácidos fenólicos tem sido indicado para proteger contra danos
oxidativos que ocorrem em muitas doenças, tais como a doença coronária cardíaca, acidente
vascular cerebral, obesidade, diabetes e câncer (SCALBERT; WILLIAMSON, 2000). Os
ácidos fenólicos são responsáveis por cerca de um terço do consumo total de polifenóis e
podem subdividir-se em derivados do ácido hidroxibenzóico e derivados do ácido
hidroxicinâmico.
Os ácidos hidroxibenzóicos tem uma estrutura de C6-C1 e são amplamente
encontradas em alimentos vegetais particularmente como glicosídeos (KROLL; RAWEL;
ROHN, 2003). Seus derivados incluem o ácido gálico (vinho e chás), elágico (morango, romã,
amora), salicílico (amendoim, trigo e pimenta), siríngico (açaí) e vanílico (baunilha). Os
ácidos gálico e elágico são importantes por serem precursores de taninos hidrolisáveis,
hidroxicinamatose estilbenos (SCHONS, 2009). Os ácidos hidroxicinâmico são comuns e
abundantes em muitas plantas e têm uma estrutura esquelética de C6-C3. Seus derivados
incluem o ácido cafeico (café, chá mate e mirtilo), ferúlico (farelo de milho e arroz), p-
cumárico (característico da uva e do vinho) e sinápico (feijão). Os ácidos fenólicos, além de
se apresentarem sob sua forma natural, podem também se ligar entre si ou com outros
compostos. A combinação mais importante destes ácidos ocorre com o éster de ácido caféico,
o qual, associado a um álcool-ácido cíclico, denominado ácido quínico, origina o ácido
clorogênico (chá mate, morangos, abacaxi, café, girassol e mirtilo). Raramente são
encontrados na forma livre, exceto em alimentos processados que sofreram congelamento,
esterilização, ou fermentação. Quando em outras formas, são derivados glicosilados ou ésteres
de ácido quínico, ácido chiquímico e ácido tartárico. (MANACH et al., 2004; HAN; SHEN;
LOU, 2007; LEOPOLDINI; RUSSO; TOSCANO, 2011). Os ácidos clorogênico e cafeico
mostraram ser antioxidantes e exercer efeito inibitório sobre a reação de N-nitrosação in vitro,
inibindo, deste modo, a formação de compostos N-nitrosos potencialmente mutagênicos e
carcinogênicos (HAN; SHEN; LOU, 2007). O ácido cafeico é geralmente o ácido fenólico
34

mais abundante nos frutos representando, na maior parte dos casos, entre 75 % a 100 % do
conteúdo total de ácidos hidroxicinâmicos. Os ácidos hidroxicinâmicos são encontrados em
todas as partes do fruto, embora as concentrações mais elevadas sejam encontradas nas partes
exteriores do fruto maduro (MANACH et al., 2004).
Todos os flavonoides tem em comum a estrutura C6-C3-C6, que consiste em dois
anéis aromáticos, denominados anel A e B, unidos por três carbonos que formam um anel
heterocíclico, denominado anel C, possuindo hidroxilas e glicosídeos distribuídas ao redor
(Figura 2.1).
Figura 2.1 Estrutura genérica dos flavonoides.
Existem muitas classes de flavonoides que diferem no grau de oxidação do anel

fenólico. Para efeitos da presente revisão, a classificação do grupo de flavonoides se
concentra em flavonóis, flavonas, isoflavonas, flavanonas, flavanóis e antocianidinas (Figura
2.2). A Tabela 2.1 apresenta os principais grupos de flavonoides com seus componentes e
onde são encontrados em maior abundância nos alimentos.
A capacidade antioxidante dos flavonoides está diretamente associada ao aumento dos
grupos hidroxilas e diminuição das glicosilações. Essas moléculas estão associadas com o
comportamento ecológico de algumas plantas. A radiação UV nos vegetais é necessária à
fotossíntese, porém pode produzir espécies reativas de oxigênio (ERO). Os flavonoides agem
sequestrando esses radicais, resultando em efeito protetor para as células vegetais (WINKEL-
SHIRLEY, 2001).
35

Figura 2.2 Estrutura básica das diversas classes de flavonoides (MANACH et al., 2004).
Nos últimos anos tem crescido o número de pesquisas que sugerem que os flavonoides
protegem o DNA do dano induzido por radicais livres através do mecanismo scavenger. Esses
compostos podem reduzir a incidência de quebra da cadeia dupla, assim como o dano de base
residual através do rápido reparo químico. Suas propriedades permitem também atuar como
agentes quelantes de íons metálicos, responsáveis pela geração de (ERO) e consequentemente,
inibir o inicio da reação de lipoxigenação (ANDERSON et al., 2000; RIETVELD;
WISEMAN, 2003). Além disso, estudos têm demonstrado que os flavonoides podem inibir e
até induzir uma grande quantidade de enzimas que estão relacionadas em importantes
processos reguladores, como a divisão e proliferação celular, agregação plaquetária,
detoxificação, resposta inflamatória e resposta imune do organismo humano (WILLIAMS;
SPENCER; RICE-EVANS, 2004; JOHNSON; MAHER; HANNEKEN, 2009; DAI;
MUMPER, 2010; LEE et al., 2011).
36

Tabela 2.1 Classificação dos flavonoides e fontes alimentares.

Subclasse Compostos Alimentos
Flavonol Quercetina, miricetina, kaempferol Chás, Cebola, vinho,
gengibre, maçã, uva, cereja,
couve.
Flavanonas Naringenina, hesperidina, eridictiol Frutas cítricas, ameixa
vermelha.
Flavona Apigenina, luteolina, tangeritina Camomila, aipo, salsa,
tomilho e tangerinas
Flavanols Catequinas, galocatequinas, epicatequina, Chás (Camellia sinensis),
epigalocatequina, epicatequina galato, uva, vinho, maçã, cacau.
epigalatocatequina galato, teaflavina,
teaflavina galato, teaflavina digalato,
tearubiginas
Antocianinas Cianidina, Delfidina, Peonidina, Vinho tinto, frutos
Petunidina, Pelargonidina, Malvidina vermelhos, azuis ou roxos.
Isoflavonas Genisteína, daidzeína, gliciteína Soja, grão de bico, amendoim

e outras leguminosas.
Adaptado de Nijveldt et al. (2001) e Egert e Rimbach (2011)
Taninos são encontrados em muitos alimentos e bebidas e são os únicos compostos

fenólicos de elevado peso molecular com capacidade para complexar fortemente com os
carboidratos e proteínas. São divididos em dois grandes grupos: taninos hidrolisáveis e
taninos condensados ou proantocianidinas. Os taninos hidrolisáveis consistem em um núcleo
de carboidrato (na maioria das vezes a D-glicose) que é parcialmente ou totalmente
esterificado com grupos fenólicos, tais como o ácido gálico ou ácido elágico. Elagitaninos
podem ser hidrolisados em ácido elágico no corpo, um antioxidante muito eficaz. Elagitaninos
(ou o seu componente ácido elágico) parecem ter propriedades anti-cancerígenas in vitro
(ROSS; MCDOUGALL; STEWART, 2007) e propriedades antiobesidade por inibir a enzima
digestiva, lipase (MCDOUGALL; KULKARNI; STEWART, 2009). Já os polímeros
galotaninos são formados quando os monômeros de ácido gálico são esterificados de núcleos
de carboidratos. Estudos sugerem que o ácido gálico tem propriedades de proteção contra o
dano oxidativo em certas doenças neurológicas (PEREIRA et al., 2009).
37

Os taninos condensados ou proantocianidinas são os polímeros que são formados pela

condensação de flavonoides. Estes taninos não contêm resíduos de açúcar (Figura 2.3) e são
mais amplamente distribuídos do que os taninos hidrolisáveis. Possuem propriedades
antioxidantes fortes e têm sido reconhecidos por desempenharem um papel na manutenção da
elastina no tecido conjuntivo (KU; MUN, 2008). Estes compostos têm sido associados a
benefícios relacionados com diabetes, doenças cardiovasculares e níveis elevados de
colesterol (JIMÉNEZ et al., 2008). Estudo realizado por Steigerwalt et al. (2009) constatou
que pacientes que receberam Pycnogenol (um suplemento dietético rico em taninos
condensados) em fase precoce da retinopatia diabética, melhoraram a circulação sanguínea e
tiveram redução do edema, o que resultou em melhora da visão.
OH
OH
HO O
OH
HO OH
OH
HO O
OH
HO OH
OH
HO O
HO
OH
Figura 2.3 Estrutura de um trímero de proantocianidina. Adaptado de Taylor et al. (2005).
Entretanto, a estrutura química dos compostos fenólicos pode afetar sua propriedade
biológica tais como a biodisponibilidade, bioacessibilidade, a atividade antioxidante e as
interações com receptores celulares específicos e enzimas (MACEDO et al., 2012). É
importante observar que a bioacesibilidade é definida como a quantidade de cada composto
ingerido que fica disponível para absorção no intestino após digestão. Por outro lado, a
biodisponibilidade inclui também na sua definição a bioatividade de um nutriente, está
inserida no contexto de ação fisiológica mais específica. Portanto, pode ser definida como a
fração de nutriente ou composto ingerido que é absorvido, atinge a circulação sistêmica, é
38

então distribuído aos tecidos, chegando ao tecido alvo e exercendo seu efeito sobre a saúde.
Em geral, a biodisponibilidade inclui digestão gastrointestinal, absorção, metabolismo,
distribuição de tecidos e bioatividade (PARADA; AGUILERA, 2007; FERNÁNDEZ-
GARCÍA; CARVAJAL-LÉRIDA; PÉREZ-GÁLVEZ, 2009; BOUAYED et al., 2012).
A maioria dos compostos fenólicos encontrados na natureza está associada com
açúcares, que compreende uma diversidade de conjugados, incluindo glicosídeos,
galactosídeos, rutinosídeos, arabinosídeos e xilosídeos, reduzindo a sua capacidade
antioxidante. Tais glicosídeos conjugados são, em sua maioria, não absorvidos no intestino
delgado, mas aqueles com porção de glicose podem ser sujeitos a desconjugação, catalisada
por uma hidrolase do epitélio intestinal, produzindo agliconas que são mais lipofílicas e, por
conseguinte, absorvida por difusão passiva (AURA, 2008; HOLST; WILLIAMSON, 2008).
No entanto, a maior parte dos compostos fenólicos não é eficientemente absorvida no
intestino delgado, e uma porção substancial passa para o cólon (GONZÁLEZ-BARRIO et al.,
2010). Uma vez no intestino grosso, estes componentes são sujeitos à degradação pela
microflora do cólon formando metabólitos incluindo fenólicos simples e ácidos aromáticos
(JENNER; RAFTER; HALLIWELL, 2005; AURA, 2008). Portanto, é razoável inferir que o
epitélio do cólon está em contato direto com os compostos fenólicos de origem e seus
produtos de degradação (JOHNSON, 2004).
Tanto a bioacessibilidade como a biodisponibilidade dos polifenóis dependem das
características dos compostos e da matriz alimentar em que estão inseridos e, ainda, de fatores
de variabilidade individual, como por exemplo, a acidez do estômago ou as concentrações e
atividades enzimáticas, o estado fisiológico, a dose de cada composto e a natureza dos outros
componentes da refeição. Em muitos casos, a biodisponibilidade e bioacessibilidade dos
polifenóis são regidas pelas propriedades físicas da fonte alimentar, que afetam a eficiência do
processo de digestão (PARADA; AGUILERA, 2007; BOUAYED et al., 2012). A baixíssima
biodisponibilidade de antocianinas pode ser atribuída, pelo menos parcialmente, à elevada
instabilidade destas moléculas nas condições alcalinas do intestino delgado. A partir de
estudos sobre a simulação da digestão gastrointestinal humana verificou-se que as
antocianinas, embora sejam estáveis nas condições ácidas do estômago, são menos estáveis ao
pH elevado do intestino delgado (MCDOUGALL et al., 2007; TAGLIAZUCCHI et al.,
2010). Essas mudanças estruturais podem afetar tanto a sua posterior absorção como a sua
bioatividade (BOUAYED et al., 2012). Além disso, mais efeitos indiretos da dieta em vários
parâmetros da fisiologia do intestino podem ter consequências sobre a absorção dos polifenóis
(pH, fermentações intestinais, excreção biliar, tempo de trânsito, etc.). As enzimas
39

transportadoras envolvidas na absorção e metabolismo dos polifenóis também podem ser

induzidas ou inibidas pela presença de alguns micronutrientes ou xenobióticos (MANACH et
al., 2004).
3. Chás
3.1 Chá Branco, Chá Preto e Chá Verde
Chás obtidos de Camellia sinensis é uma das bebidas mais antigas, foi descoberto
cerca de 2700 aC (HOFFMAN; MANNING, 2002; MAHMOOD; AKHTAR; ALI KHAN,
2010). Hoje está disponível para consumo em seis variedades principais (verde, preto, branco,
amarelo e vermelho), com base na técnica de oxidação e fermentação aplicada. Este chá tem
requisitos agro-climáticos específicos que só estão disponíveis nas regiões tropicais e
subtropicais (FAO, 2015).
A Camellia sinensis é consumida principalmente na forma de chá verde, preto e
branco. Esta planta é comumente cultivada em países com clima ameno e úmido, no entanto,
a planta de melhor qualidade é a proveniente da China. A planta Camellia sinensis é um
arbusto que pode atingir até 15 metros, com folhas simples, lanceoladas, coriáceas de 4 a 7
centímetros de comprimento, possui flores brancas, solitárias ou em grupos de duas ou três
nas axilas foliares (Figura 3.1). Os frutos são cápsulas deiscentes e oblongas possuindo uma
ou três sementes (LORENZI; MATOS, 2002).
Figura 3.1 Planta Camellia sinensis. (Fonte: http://www.lideragronomia.com.br)

40

O diferente processamento da Camellia sinensis leva aos diversos tipos de chás

produzidos a partir da planta e aos diferentes constituintes flavonoides dos mesmos. Para
produção do chá verde a planta é tratada termicamente (vapor), para inativar a polifenol
oxidase endógena (PPO), e então é laminada e seca. Em contrapartida, na produção do chá
preto, não há calor para a inativação de PPO, a planta sofre uma fermentação ou “fase de
oxidação” após a laminação. Esse processo permite a conversão em grande escala, catalisada
pela PPO, de compostos fenólicos simples para formas mais complexas, formando teaflavinas
e tearubiginas que tem coloração escura e típica do chá preto (HILAL; ENGELHARDT,
2007; MIZUKAMI; SAWAI; YAMAGUCHI, 2007; WANG; HO, 2009). Em contraste com o
chá verde e preto, o chá branco só é produzido a partir dos brotos jovens de folhas, cobertas
por pequenos filamentos prateados, colhidos apenas na primavera. O broto pode ser protegido
da luz solar durante seu crescimento para reduzir a formação de clorofila, dando às plantas
jovens uma aparência branca e conservando ainda mais as catequinas (ALCÁZAR et al.,
2007). Os brotos são cozidos no vapor e secos, este processo deve ser realizado logo após a
colheita para evitar a oxidação (RUSAK et al., 2008). Como resultado, os chás branco, verde
e preto diferem em suas propriedades sensoriais e têm composições químicas muito diferentes
(RIO et al., 2004; HILAL; ENGELHARDT, 2007; MIZUKAMI; SAWAI; YAMAGUCHI,
2007; WANG; HO, 2009).
Pesquisas realizadas com chás demonstram que a Camelia Sinesensis possui amplos
benefícios fisiológicos e farmacológicos. As principais classes de compostos fenólicos
encontrados nestes chás são os ácidos fenólicos e os flavonoides. Sendo os representantes dos
ácidos fenólicos, os ácidos hidroxicinâmicos e hidroxibenzóicos, e dos flavonoides, os
flavanóis (catequinas), flavonóis (quercetinas e kaempferol), proantocianidinas e flavonas
(RUSAK et al., 2008). Além dos compostos fenólicos, os chás podem apresentar
metilxantinas em sua composição. Por exemplo, C. sinensis é rica nos teores de cafeína,
teobromina e teofilina que apresentam em sua estrutura um esqueleto de purina, com
diferenciação entre o tipo e posição dos radicais na molécula (MARIA; MOREIRA, 2007;
RUSAK et al., 2008).
Estudos epidemiológicos relacionam o consumo de chás desta planta com resultados
favoráveis em relação a doenças cardiovasculares, inflamações, obesidade e diabetes tipo 2
(GONDOIN et al., 2010). Um número crescente de evidências pré-clínicas sugere que a
epigalocatequina galato (EGCG), a principal catequina encontrada nos chás, tem impacto
potencial em uma variedade de doenças humanas (SINGH; SHANKAR; SRIVASTAVA,
2011), ação antitumoral e antiangiogênica, possui funções antioxidantes (evitando danos
41

oxidativos em células saudáveis) e modulação da resposta de células tumorais à

quimioterapia. Estas propriedades quimiopreventivas, mediadas pela EGCG, induz a apoptose
e promove a interrupção do crescimento celular por meio da alteração da expressão de
proteínas reguladoras do ciclo celular e suprimindo fatores de transcrição oncogênicas
(SINGH; SHANKAR; SRIVASTAVA, 2011).
Aproximadamente 21% da produção total de chá é consumida como chá verde. O chá
verde possui sabor agradável, aroma floral e coloração verde clara com um tom verde oliva.
Contém grandes quantidades de catequinas (epigalocatequina, epigalocatequinagalato,
epicatequinagalato e epicatequina) como também contém cafeína, teanina e vitaminas
(TAKEO, 1992; NAGALAKSHMI, 2003; MACEDO et al., 2011). As catequinas são
reconhecidas por suas atividades antioxidantes, antimutagênica e anticarcinogênica, além dos
seus benefícios na obesidade e doenças cardiovasculares como já foi citado anteriormente.
Estudos com catequinas do chá verde relataram efeito hipocolesterolêmico e supressão da
absorção intestinal de colesterol (MURAMATSU; FUKUYO; HARA, 1986; IKEDA et al.,
1992). Além disso, a EGCG teve um efeito inibidor sobre a acetil-CoA carboxilase in vitro¸
enzima que é essencial para a biossíntese de ácidos graxos, e efeitos antiobesidade em doses
elevadas em ratos (WATANABE; KAWABATA; NIKI, 1998; KAO; HIIPAKKA; LIAO,
2000). A fim de confirmar os efeitos desta catequina (EGCG) do chá verde na inibição da
adipogênese e indução da apoptose em adipócitos, Lin; Della-Fera e Baile (2005) incubaram
pré-adipócitos e adipócitos maduros por diferentes tempos e em diferentes concentrações de
EGCG. Os resultados deste estudo mostraram que esta catequina inibiu a adipogênese e
causou apoptose em células adiposas maduras. Estudos em humanos também sugerem que o
chá verde pode contribuir para promover benefícios à saúde, tais como efeito hipoglicemiante,
controle do peso corporal ao reduzir o apetite e aumentar o catabolismo de gorduras (CHOO,
2003; KOO; NOH, 2007).
Em relação à composição do chá branco, as concentrações de EGCG e também de
metilxantinas (tais como cafeína) são maiores em comparação com o chá verde ou preto
(HILAL; ENGELHARDT, 2007). Dentre os estudos utilizando chá branco é interessante
relatar que este apresentou ação antimutagênica e antitumoral significativamente maior que o
chá verde (SANTANA-RIOS et al., 2001). Dashwood, Orner e Dashwood (2002) destacaram
que EGCG age na inibição da atividade do receptor catenina/TCF4 em células HEK293
devido à diminuição da expressão da catenina. Sugerindo a possibilidade de intervenção do
chá contra os estágios iniciais do câncer colorretal humano, envolvendo a via catenina/APC e
a alteração do gene alvo Wnt. O chá branco diminuiu a formação de tumores intestinais
42

também pela regulação negativa da β-catenina (DASHWOOD; ORNER; DASHWOOD,

2002; ORNER, 2003). Adicionalmente, abordando a ação antioxidante salienta-se que chá
branco gelado (comercial) apresentou boa capacidade antioxidante, com melhores valores em
relação à sucos de laranja e maçã e a outros chás gelados, como o chá verde e preto
(SEERAM et al., 2008).
Quando testado o poder do chá branco frente à adipogênese em culturas de adipócitos
e pré-adipócitos humanos, verificou-se que o chá branco foi capaz de diminuir a incorporação
de triglicerídeos durante a adipogênese de forma dose dependente, sem afetar a viabilidade da
célula (SÖHLE et al., 2009). Estes pesquisadores constataram que o chá branco diminuiu a
expressão mRNA de fatores relacionados à adipogênese e aumentou a atividade lipolítica dos
adipócitos.
Ao contrário do chá verde, cujos maiores compostos incluem catequinas EGCG, EGC,
ECG e EC, no chá preto, as catequinas monoméricas sofrem oxidação de polimerização,
levando a sua dimerização, para formar teaflavinas, tearubiginas e outros oligômeros.
Flavonóis (quercetina, kaempferol e miricetina) estão presentes na forma dos seus O-
glicosideos. Pelo menos 14 diferentes glicosídeos foram detectados no chá (SCHARBERT;
HOLZMANN; HOFMANN, 2004; JIANG et al., 2015). Há mono, di e tri glicosideos
presentes no chá preto, quando frequentemente a quercetina-3-ramnoglucosídeo está na
concentração mais elevada. Scharbert; Holzmann e Hofmann (2004) afirmam que os
flavonóis são responsáveis pela adstringência no chá preto e não teaflavina ou catequinas e
que o conteúdo destes compostos não é muito afetado pela fermentação da produção do chá.
3.2 Chá Mate
Ilex paraguariensis, conhecido popularmente como erva mate (Figura 3.2), é uma
planta sul-americana bastante cultivada no nordeste da Argentina, sul do Brasil e leste do
Paraguai (FILIP et al., 2001). Das folhas da erva-mate prepara-se uma bebida muito apreciada
pelo sabor amargo característico e propriedades estimulantes, conhecida por chimarrão ou
tererê (preparada com água quente ou fria, respectivamente), outra bebida que pode ser
preparada é o chá mate, obtido a partir do mate torrado. O chimarrão é uma bebida consumida
há centenas de anos pelos indígenas, antes mesmo da chegada dos europeus na América do
Sul. Alternativamente, seguindo o hábito de alguns apreciadores de erva-mate, o chá mate
surgiu no mercado brasileiro, em 1938, um produto suave e de aroma agradável obtido a partir
da “queima” da erva-mate verde. Foi introduzida, assim, uma opção revolucionária para o uso
43

de erva-mate enquanto chimarrão no Brasil. Desde então, o chá mate, como passou a ser
conhecido, foi incorporado à cultura nacional e desde então é a forma principalmente
consumida deste vegetal. Em outras regiões brasileiras, particularmente naquelas de clima
quente, é crescente o consumo de chá mate, na forma de bebida refrescante pronta para beber
(DIAS, 2006; MEINHART et al., 2010).
Figura 3.2 Planta Ilex paraguariensis. (Fonte: http://www.jardimdeflores.com.br/ e

http://ervateiraseleme.com.br/a-erva-mate/)
As bebidas de erva-mate são reconhecidas por suas propriedades estimulantes, devido

à presença das xantinas, cafeína e teobromina (BASTOS et al., 2007; HECK; MEJIA, 2007).
Outros constituintes de importância da Ilex paraguariensis são as saponinas, que
demonstraram efeito hipocolesterolemiante (STEIN, 2005), alguns ácidos fenólicos (ácidos
clorogênico, caféico e gálico) e flavonoides como quercetina, rutina, luteolina e kaempferol
(BASTOS et al., 2005, 2006), entretanto existem estudos que afirmam que a rutina é perdida
após o processo de torrefação da erva-mate (BASTOS et al., 2007). Vale salientar também
que a erva mate possui aminoácidos, minerais (fósforo, ferro e cálcio), e vitaminas (C, B1, e
B2) (POMILIO; TRAJTEMBERG; VITALE, 2002; JACQUES et al., 2007; MIRANDA et
al., 2008). Diante de tantos compostos bioativos, o consumo das bebidas a partir da erva mate
44

podem ser benéficas à saúde, visto sua comprovada atividade antioxidante e outros efeitos
terapêuticos como: antiinflamatório, antiobesidade, anti-hipertensivo, colerético, eupéptico,
hepatoprotetor (BASTOS; TORRES, 2003; BRAVO; GOYA; LECUMBERRI, 2007;
GUGLIUCCI; BASTOS, 2009).
Vários estudos corroboram estes benefícios, como na avaliação do efeito protetor da
erva-mate contra danos oxidativos ao DNA, que indicaram intervenção significativa após 60
dias de consumo de chá mate, quando comparados aos níveis observados anteriormente à
ingestão da bebida. O mecanismo de ação proposto relaciona-se com elevados níveis dos
ácidos cafeico e clorogênico presentes na erva-mate (BASTOS et al., 2006). Silva et al.
(2009) mostraram que o consumo de mate por ratos pode diminuir os níveis de danos ao DNA
em leucócitos e a carcinogênese esofágica induzida por lesão térmica e dietilnitrosamina.
Carini et al. (1998) e Silva et al. (2008) demonstraram que os compostos fenólicos presentes
no extrato aquoso de Ilex paraguariensis atuam como antioxidantes não só, isoladamente,
mas também de forma sinérgica. Mosimann; Wilhelm-Filho e Silva (2006) verificaram que
coelhos hipercolesterolêmicos tratados com extrato aquoso de erva mate não tiveram alteração
nos níveis de lipídeos no soro, porém ocorreu redução das lesões ateroscleróticas e
diminuição da quantidade de colesterol, ambos na aorta. Estes autores sugeriram a existência
de outros mecanismos de atuação do extrato de Ilex paraguariensis como alteração da
agregação plaquetária, inibição da expressão de moléculas de adesão ou indução de produção
de óxido nítrico. Entretanto a suplementação com extrato de erva mate e dieta
hipercolesterolêmica em ratos diminuiu o ganho de peso dos animais, a concentração
plasmática de LDL e a gordura acumulada em tecidos viscerais.
Pode-se constatar que as informações sobre o chá mate são pequenas quando
comparada às das bebidas que utilizam erva mate verde e principalmente quando comparado
às informações dos chás verde ou preto. Sendo incipientes estes estudos e levando em
consideração que há estudos que comprovam que o chá mate tem um poder antioxidante tão
ou mais elevado do que os extratos de erva mate verde (BASTOS et al., 2007). São
promissoras as pesquisas que tenham como perspectivas a utilização do chá mate a fim de
comprovar essas teorias existentes e melhorar seu conteúdo bioativo, possibilitando a
elaboração de extratos coadjuvantes da manutenção da saúde humana.
3.3 Chás e a obesidade

45

A obesidade e o sobrepeso são definidos como acúmulo excessivo ou anormal de

gordura que apresenta um risco para a saúde. A obesidade é uma doença multifatorial que
envolve fatores genéticos, endócrinos e comportamentais. Dentre os comportamentais
destacam-se a ingestão excessiva de dietas ricas em gorduras e açúcares e o baixo nível de
atividade física (OPAS, 2003). O aumento da ingestão energética pode ser decorrente tanto da
elevação quantitativa do consumo de alimentos como de mudanças na dieta que se
caracterizam pela ingestão de alimentos com maior densidade energética, ou pela combinação
dos dois.
Os mecanismos moleculares relacionados ao desenvolvimento da obesidade são
complexos e ainda contraditórios, no entanto já está bem estabelecido que esta condição está
associada a uma inflamação crônica na qual o tecido adiposo desempenha papel importante.
Consequentemente, sabe-se que este tecido não é apenas um fornecedor e armazenador de
energia, mas também um órgão dinâmico e endócrino exercendo importantes funções no
metabolismo e na regulação homeostásica (KERSHAW; FLIER, 2004; AILHAUD, 2006;
ŁAGOWSKA; JESZKA, 2011; MOTIE et al., 2014).
Os adipócitos produzem a maior parte das citocinas envolvidas no processo
inflamatório, tais como as adipocinas pró-inflamatórias interleucina 6 (IL-6), inibidor do
ativador de plasminogênio (PAI-1), angiotensina e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e
ainda, a citocina anti-inflamatória, adiponectina. A produção dessas moléculas
biologicamente ativas encontra-se em desregulação durante a obesidade, levando ao
estabelecimento de um perfil inflamatório, caracterizado pelo aumento do infiltrado de
macrófagos nesse tecido, aumento da produção de citocinas pró-inflamatórias, e baixos níveis
de anti-inflamatórias (MONTAGUE et al., 1998; NTAMBI; KIM, 2000; ENGSTROM et al.,
2003).
O consumo energético excessivo leva a um aumento da síntese de triglicerídeos (TGs)
nos adipócitos e com isso ocorre uma expansão do tecido adiposo em tamanho (hipertrofia) e,
em algumas situações, em número (hiperplasia) dos adipócitos, gerando uma disfunção
nestes. A hipertrofia dos adipócitos maduros ocorre em resposta às suas ações metabólicas
típicas, que são a lipogênese e a lipólise. Já a hiperplasia do tecido adiposo, por sua vez,
depende da diferenciação dos pré-adipócitos em adipócitos maduros, processo denominado
adipogênese que caracteriza o ciclo de vida dos adipócitos (HAUSMAN et al., 2001;
DEFRONZO, 2004; AVRAM; AVRAM; JAMES, 2007; RAYALAM; DELLA-FERA;
BAILE, 2008; RODEHEFFER; BIRSOY; FRIEDMAN, 2008). O ciclo inclui proliferação de
pré-adipócitos, a diferenciação de células de gordura (adipogênese), atividade lipolítica, bem
46

como a apoptose de pré-adipócitos ou adipócitos maduros. A seqüência complexa de

diferenciação de pré-adipócitos é inicialmente desencadeada por transcrição ativada por fator
de vias de sinalização que desempenham um papel fundamental na cascata transcricional
(GREGOIRE, 2001). A cascata que leva à adipogênese inicia-se com a expressão de dois
fatores de transcrição adipogênicos fundamentais, os quais estimulam a cascata e, logo, a
diferenciação: o receptor gama ativado por proliferadores de peroxissomas (PPARγ) e as
proteínas ligantes ao amplificador CCAAT (C/EBPs). Estes fatores são responsáveis por
promover uma cadeia de crescimento sucedida então por uma diferenciação terminal dos
adipocitos. Ainda que estes sejam os principais fatores de regulação da adipogênese, outros
fatores transcricionais influenciam no processo, como a proteína 1C ligadora do elemento
regulado por esteróis (SREBP-1c), além de proteínas secretadas por células amadurecidas
como parte da sua função endócrina (HAN et al., 2003).
O estado inflamatório da obesidade é acompanhado de um aumento do estresse
oxidativo (FURUKAWA et al., 2004). O processo inflamatório crônico juntamente com o
estresse oxidativo predispõe o organismo ao aumento de problemas cardiovasculares e a
diversas alterações metabólicas, como a síndrome metabólica, que inclui a dislipidemia
(elevação dos triglicerídes, HDL baixo, hiperlipidemia), hipertensão arterial sistêmica,
acúmulo excessivo de gordura visceral e a resistência insulínica. Fatores estes que aumentam
o risco para complicações na obesidade, como derrames, doença coronariana, apneia do sono,
aterosclerose, acúmulo ectópico de gordura, esteatose hepática e a diabetes mellitus tipo 2
(ENGSTROM et al., 2003; RASOULI; KERN, 2008; MOTIE et al., 2014).
Admitir o alto risco da obesidade e estando o aumento do estresse oxidativo
relacionado à obesidade e nas doenças resultantes dessa condição, a busca por intervenções
nutricionais com ação antioxidante e que promovam a diminuição da absorção de lipídeos, se
torna de grande interesse. Várias estratégias podem ser utilizadas visando à redução de peso
corporal, como a inclusão de chás de Camellia sinesis e Ilex paraguariensis. Compostos
fenólicos dos chás verde, branco, preto e mate, têm sido sugeridos como antiobesidade e
antidiabéticos (SOOD; BAKER; COLEMAN, 2008; ONAKPOYA et al., 2011; KANG et al.,
2012; KIM; HOON, 2014; XIE et al., 2014; ONAKPOYA; SULLIVAN; HENEGHAN,
2015; LI et al., 2016; YONEKURA et al., 2016; LUNCEFORD; GUGLIUCCI, 2005; KAO et
al., 2006; MIRANDA et al., 2008; ARÇARI et al., 2009; MARTINS et al., 2009; KANG et
al., 2012). Algumas pesquisas comprovaram estes efeitos biológicos positivos a partir dos
compostos fenólicos presentes em chás verde, branco, preto e mate (Tabela 3.1).
47

Tabela 3.1 Atividades antiobesidade relacionadas aos polifenóis de Camellia sinensis (chá
branco, chá verde e chá preto) e Ilex paraguariensis (erva mate e chá mate).
Amostra Atividade biológica Referência
Chá Branco Inibe adipogênese e estimula atividade lipolítica dos adipócitos Söhle et al. (2009)
Chá branco Redução do estresse oxidativo associada à obesidade e melhora Teixeira et al. (2012)
da hipertrigliceridemia.
Chá Verde Menor ingestão energética, diminuição dos triglicerídeos hepático Murase et al. (2002)
e do colesterol e glicose plasmáticos e diminuição de enzimas
relacionadas ao metabolismo de lipídeos.
Chá Verde Inibe adipogênese e induz a apoptose em pré adipócitos (3T3 L1) Lin; Della-Fera e Baile
(2005)
Chá Preto Reduziu o colesterol total e LDL colesterol, além de reduzir o Fujita e Yamagami
peso em humanos. (2008)
Chá Preto Prevenir a obesidade induzida por dieta por inibir a absorção de Uchiyama et al. (2011)
lipídeos intestinal
Chá Preto Supressão da formação e acumulação de gordura agindo na Wu et al. (2016)
prevenção da obesidade.
Erva Mate Reduziu lesão aterosclerótica Mosimann; Wilhelm-
Filho e da Silva (2006)
Erva Mate Redução significativa no peso corporal, glicemia, resistência à Arçari et al. (2009)
insulina, concentração de colesterol e triacilglicerol.
Chá Mate Resultou na diminuição da peroxidação lipídica do plasma e no Matsumoto et al. (2009)
aumento da expressão gênica de enzimas antioxidantes, indicando
que seu consumo regular melhora a defesa oxidativa por múltiplos
mecanismos.
4. Tanase
Tanino acil hidrolase (E.C.: 3.1.1.20), comumente referida como tanase, é uma enzima
descoberta acidentalmente em 1867 em uma experiência de formação de ácido gálico em uma
solução aquosa de taninos (AGUILAR et al., 2007). Esta enzima cliva ligações ésteres e
depsídicas, em taninos hidrolisáveis (AGUILAR; GUTIERRES-SANCHEZ, 2001),
produzindo glicose e ácido gálico (BELMARES et al., 2004), e também realiza a síntese de
ésteres de ácido gálico. O equilíbrio desta reação depende do solvente empregado no meio
reacional. Usando solventes polares (água, tampão), a enzima realiza a hidrólise, empregando
solventes orgânicos (hexano, benzeno) o equilíbrio reacional é no sentido da síntese.
48

A decomposição de taninos hidrolisáveis é mediada pela atividade esterásica sobre a

ligação éster entre o grupo anel aromático e o resíduo de glicose e pela atividade depsidásica
sobre a ligação éster entre os anéis aromáticos (Figura 4.1), sendo que foi identificado que a
tanase é responsável pelas duas atividades (HASLAM; STANGROOM, 1966). Estes autores
também relataram em seu trabalho que a proporção entre duas frações podia variar de acordo
com as condições de cultivo. Estudo utilizando colunas de afinidade fracionou duas isoformas
de tanase fúngica (BEVERINI; METCHE, 1990). Ambas apresentaram as duas atividades,
contudo a Tanase I possui maior característica esterásica, enquanto na Tanase II a atividade
depsídica é mais pronunciada.
Inicialmente, a Tanase rompe as ligações depsídicas da molécula de ácido tânico
liberando, 1,2,3,4,6-pentagaloilglicose e quatro moléculas de ácido gálico. Em seguida, os
demais resíduos galoil, ligados ao núcleo glicosídico, são seqüencialmente removidos até a
liberação da molécula de glicose e de outras cinco moléculas de ácido gálico (LEKHA;
LONSANE, 1997; PINTO et al., 2005).
Figure 4.1 Atividade esterásica e depsidase da tanase (PINTO et al., 2005).
Tanases são enzimas extracelulares produzidas por fungos, leveduras e bactérias, na

presença de ácido tânico (AGUILAR et al., 2007), e é uma glicoproteína formada por um
mistura de esterase e depsidade. O conteúdo de carboidratos pode variar de 25,4 a 66,2% do
peso total da enzima, e o papel exato desses elevados conteúdos de carboidratos não é
conhecido. Suspeita-se que seja a maneira de proteger o núcleo protéico da ação desnaturante
dos taninos hidrolisáveis e de direcionar o substrato ao centro ativo da enzima para
possibilitar a quebra desse em seus respectivos componentes, glicose e ácido gálico
(AGUILAR; GUTIERRES-SANCHEZ, 2001). A tanase apresenta pH de estabilidade na faixa
de 4,0 – 7,5, com pH ótimo de atividade a 6,5, temperatura de estabilidade entre 20ºC e 70ºC,
e atividade ótima a 70ºC. Sua atividade é inibida por íons metálicos Ba2+, Ca2+, Zn2+, Mn2+ e
49

Ag2+, tiossulfato, carbonato, bissulfito de sódio, EDTA, 2- mercaptoetanol, ácido 4-

aminobenzóico, azida sódica, n-bromo succinato, cisteína, tween 80 e tween 20
(BATTESTIN; PINTO; MACEDO, 2007).
A enzima em questão tem sido caracterizada principalmente pelo estudo de suas
atividades em complexos fenólicos (BATTESTIN; PINTO; MACEDO, 2007). É usada
industrialmente na produção de ácido gálico, cujo éster é utilizado como agente conservante,
na indústria de ração animal, no tratamento de efluentes de curtumes, na produção de chás,
vinhos, processamento da cerveja e clarificação de sucos (LEKHA; LONSANE, 1997). Nosso
grupo de pesquisa desenvolveu estudos relacionados à quimio seletividade da tanase livre de
Paecilomyces variotii frente aos substratos epicatequinagalato, epigalocatequinagalato,
galotanino e elagitanino, como também, quanto ao efeito benéfico da hidrólise enzimática de
chá verde frente às melhorias do potencial nutracêutico do extrato.
Tanase de P. variotii tem sido purificada, caracterizada bioquimicamente, imobilizada
e, sua capacidade de reutilização estudada (BATTESTIN; MACEDO, 2007a; BATTESTIN;
PINTO; MACEDO, 2007; SCHONS, 2012). Uma vez que as enzimas são extraídas e
eventualmente purificadas, podem ser aplicadas várias estratégias de imobilização para
reutilizar em preparações enzimáticas. Agarose, quitosana, alginato e diferentes derivados de
silício podem ser utilizados para imobilização (BELMARES et al., 2004).
4.1 Imobilização de enzimas
Imobilização é um termo genérico empregado para descrever a retenção de uma

biomolécula em um sistema analítico (CARDOSO, 2009). Mais especificamente, a
imobilização enzimática mantém o biocatalisador fisicamente confinado ou localizado numa
certa região do espaço com retenção de sua atividade catalítica, podendo ser usado repetida e
continuamente (GROSOVÁ; ROSENBERG; REBROŠ, 2008). A ideia de utilização de
enzimas imobilizadas apareceu no século XX como uma alternativa interessante para superar
inconvenientes dos biorreatores clássicos (CHIBATA, 1978). O objetivo era garantir a
localização de catalisador biológico em uma área de espaço definido, a preservação da sua
atividade e reutilização.
Entre diversos benefícios possíveis, essa retenção permite a facilitada separação das
biomoléculas de interesse do meio reacional, solucionando uma das principais dificuldades
em usá-las de modo livre. Quando a enzima está em solução seu comportamento é igual ao de
qualquer soluto em que há uma dispersão na solução e os movimentos são livres, porém
50

quando imobilizadas estes movimentos são restritos (GIORNO; DRIOLI, 2000). O emprego
de enzima livre acarreta a inevitável presença do biocatalisador como parte integrante do meio
(se não houver uma etapa de separação da enzima) o que em muitos casos pode gerar
alteração de flavor e ainda a necessidade de uma nova batelada de biocatalisador
(SANGEETHA; RAMESH; PRAPULLA, 2005). Traços de enzima no produto final, em
alimentos ou medicamentos, podem ainda, ser um fator de risco, ao desencadear reações
alérgicas em seus usuários finais. Outro fator relevante para a utilização de enzimas
imobilizadas é que se estabelece um maior controle sobre o processo, pois se torna possível
parar a reação quando necessário alterando algum parâmetro de reação ou fechando-se a
vazão do biorreator.
Uma das razões para a grande expansão da tecnologia da imobilização está ligada ao
material de suporte, que pode agir sobre a estabilidade e a eficiência da enzima imobilizada. É
necessário que a enzima, quando imobilizada, mantenha máxima atividade catalítica, uma vez
que a ligação com o suporte pode ocasionar o comprometimento do sítio ativo por ligação
intra-sítio ou deformação deste, promovendo conformações não ativas. Através destes estudos
envolvendo imobilização, tem-se proporcionado melhor entendimento sobre as vantagens da
sua utilização, como exemplo o aumento da atividade da proteína, a capacidade destas de
aumentar a taxa de reação, controle e manipulação da seletividade, e reações multi-
enzimáticas, o que tem impulsionado ainda mais o desenvolvimento e aplicação de enzimas
imobilizadas em processos industriais (BRADY; JORDAAN, 2009).
Cada enzima é única em suas características e isto influencia na escolha do
procedimento de imobilização. Entretanto, a obtenção de um biocatalizador imobilizado com
estabilidade operacional é governado pela interação das propriedades da enzima e do material
usado como suporte para imobilização, assim como depende da estabilidade do suporte e do
tipo de amostra onde o substrato está contido, a qual pode conter diferentes ativadores e/ou
inibidores. Como não existe um método ideal ou procedimento geral para a imobilização do
componente biológico, a diversidade de métodos existentes permite a escolha de um que
promova uma melhor imobilização e menor perda da atividade enzimática (MATEO et al.,
2000).
Segundo Sheldon e Pelt (2013) os métodos para a imobilização são divididos em três
categorias: ligação a um suporte, encapsulamento e reticulação. Estas são combinações de
métodos químicos que envolvem a formação de, no mínimo, uma ligação covalente entre os
resíduos terminais de uma enzima e um grupo funcional do suporte, ou entre duas ou mais
moléculas de enzima; métodos físicos que envolvem as forças físicas como adsorção,
51

interações eletrostáticas; métodos de encapsulação ou microencapsulação em matrizes

poliméricas (FERNÁNDEZ-FERNÁNDEZ; SANROMÁN; MOLDES, 2013). A Figura 4.2
apresenta esquematicamente a classificação dos métodos utilizados para imobilização das
enzimas.
Figura 4.2 Principais métodos de imobilização de enzimas. CLEA: cross-linked enzyme

agregates. CLEC: cross-linked enzyme agregates. Adaptado de Nisha e Gobi (2012).
Assim como outras enzimas, a tanase na forma imobilizada, para aplicações

industriais, pode apresentar diversas vantagens, incluindo a melhoria da estabilidade da
enzima, o uso repetido da mesma, a facilidade de separação do produto e a possível operação
contínua em reatores de leito empacotado. Dentre os inúmeros métodos de imobilização o
encapsulamento em alginato tem se mostrado um método altamente adequado, pois este
polissacarídeo é um material biocompatível e biodegradável, sua encapsulação é uma técnica
simples, não tóxica e barata. O hidrogel das cápsulas de alginato tem sido proposto para
controlar a liberação de pequenas e macromoléculas, como enzimas (SUKSAMRAN et al.,
2009), além de ser uma técnica reprodutível que utiliza condições suaves durante o processo
52

de imobilização (HULST; TRAMPER, 1989; OGBONNA; AMANO; NAKAMURA, 1989) e

ter mostrado os melhores resultados dentre inúmeras técnicas de imobilização testadas
(SCHONS, 2012). Schons et al. (2011) imobilizaram tanase semipurificada produzida por
Paecilomyces variotii em cápsulas de alginato de sódio, utilizando o suporte para hidrólise de
ácido tânico. A eficiência da enzima imobilizada foi igual a da enzima livre em 3 rodadas de
utilização sucessiva para hidrólise de ácido tânico. Schons (2012) observou que as cápsulas
apresentaram maior estabilidade quanto ao pH, temperatura e inibidores, comparando com a
tanase livre.
Os alginatos comerciais podem ser extraídos de diversos tipos de algas, principalmente
de três espécies de algas marrons, Laminaria hyperborean, Ascophyllum nodosum e
Macrocystis pyrifera, nas quais o alginato compreende até 40% do seu peso seco. As algas da
espécie Macrocystis pyrifera são tidas como as principais produtoras desse polímero natural.
Além disso, o alginato pode ser produzido como um polímero exocelular por bactérias como
Azotobacter vinelandii e várias espécies de Pseudomonas através de fermentação em batelada
com frutose e glicose como fonte de carbono (SMIDSRØD; SKJÅK-BRAEK, 1990; CONTI
et al., 1994; REMMINGHORST; REHM, 2006). A obtenção do alginato envolve lavagem e
maceração das algas, seguido pela extração do alginato utilizando solução de carbonato de
sódio ou hidróxido de sódio. O extrato é filtrado e o alginato é isolado por precipitação
através da adição de cloreto de cálcio ou cloreto de sódio ao filtrado (HAUG et al., 1963;
RINAUDO, 2006). Os alginatos são talvez o componente mais estudado e utilizado para
encapsulação. Este composto é uma mistura complexa de dois tipos de ácidos, o ácido β-D-
manurônico e o ácido α-L-gulurônico. Os ácidos β-D-manurônico e α-L-gulurônico são
estereoquimicamente diferentes devido a uma diferença no C-5 (QIN, 2008).
O alginato é constituído por três tipos de blocos. Os blocos MM, contendo unidades de
ácido manurônico, com conformação linear e flexível; os blocos GG, com unidade de ácido
gulurônico, gerando um polímero denso e rígido, e os blocos GM, com unidades alternadas de
ácido gulurônico e manurônico formando estruturas de flexibilidade intermediária. Os
monômeros se dispõem de forma que seja estabelecida uma estrutura energeticamente
favorável. Para GG, é a conformação cadeia 1C4 ligada por ligação glicosídica α (1-4); para
M-M é a conformação em cadeia 4C1 por ligação glicosídica β (1-4). O grupo carboxílico é
responsável pela ligação glicosídica equatorial/equatorial no M-M, a ligação glicosídica
axial/axial em G-G e a ligação equatorial/axial em M-G (GACESA, 1988; NUSSINOVITCH,
1997). As geometrias de M, G e blocos alternados dependem de formas particulares de
monômeros e seu modo de ligação no polímero. A Figura 4.3 apresenta uma representação
53

esquemática da estrutura estereoquímica dos blocos GG, MM e GM. As propriedades físicas e

químicas do alginato dependem das proporções dos ácidos gulurônico e manurônico em sua
cadeia, as proporções relativas dos três tipos de blocos, a distribuição desses blocos, o
comprimento da cadeia e as configurações espaciais que os blocos M e G adotam, bem como
seus diferentes pesos moleculares. Esses fatores por sua vez dependem da espécie e da idade
da alga, do local e época do ano a partir da qual o alginato foi isolado (DRURY; DENNIS;
MOONEY, 2004; AVELLA et al., 2007) e todos estes fatores determinarão a flexibilidade da
cadeia, influenciando na solubilidade e na estabilidade do gel que será formado.
Figura 4.3 Estrutura dos blocos homopoliméricos GG e MM e dos blocos heteropoliméricos

GM, que constituem a molécula de alginato (QIN, 2008).
O alginato é insolúvel em água à temperatura ambiente, não sendo simples o preparo

de sua solução para formação do gel. Ele deve ser disperso em água, sob alta taxa de
cisalhamento (agitação) ou com aquecimento (NUSSINOVITCH, 1997). Soluções aquosas de
alginato apresentam diminuição de viscosidade com o aumento da taxa de cisalhamento,
54

podendo ser classificadas como fluido não newtoniano. O alginato pode ser preparado em
uma larga variedade de massas moleculares, variando entre 50 a 100.000 kDa (AUGST;
KONG; MOONEY, 2006). A viscosidade da solução de alginato diminui com o aumento de
temperatura. Com relação ao pH, em pH abaixo de 5 os grupos -COO- começam a ser
protonados, diminuindo a repulsão eletrostática entre eles, o que permite a formação de pontes
de hidrogênio, aumento de viscosidade e, consequentemente, possibilita a formação de gel
(QIN, 2008).
O alginato forma géis em temperatura ambiente, estáveis ao calor, através de reação
com cátions divalentes. Para uso alimentício, o cálcio é o íon mais apropriado por não ser
tóxico. Smidsrød e Draget (1997) relataram que a alta seletividade de alginatos com íons
divalentes, como metais alcalinos terrosos (Mg<<Ca<Sr<Ba), indica que as interações entre
alginatos e esses íons não são puramente eletrostáticas, mas ocorre também através de
complexação nos blocos G. A gelificação ocorre através da ligação iônica de íons cálcio com
dois grupos carboxila presentes em resíduos adjacentes. A ligação química ocorre nos
resíduos de ácido poligulurônico, que devem estar presentes em certa proporção e devem
ocorrer em série. A formação de géis de alginato pela adição de íons cálcio envolve os blocos
GG também devido sua estrutura em zig-zag, que apresenta cavidade e que são importantes na
ligação de íons, formação e resistência mecânica do gel. Quando as cadeias de blocos G se
alinham lado a lado formando um “berço” em forma de diamante, o qual tem a dimensão ideal
para acomodar em seu interior um íon cálcio gerando uma estrutura dimérica. Portanto,
quanto maior for o conteúdo de blocos GG em sua cadeia, maior será a rigidez e resistência
deste gel (ØSTGAARD et al., 1993; SMIDSRØD; DRAGET, 1997; QIN, 2008; RINAUDO,
2008; VOS et al., 2014). Essa estrutura, em que os íons localizam-se nos interstícios entre as
cadeias de alginato, interagindo com o ânion carboxilato e com os grupos hidroxila, é
chamada de egg-box, apresentado na Figura 4.4, neste modelo os íons Ca+2 representam os
ovos, dispostos nos espaços que existem entre os blocos G emparelhados, que fazem o papel
da caixa. De acordo com este modelo podemos verificar a importância das unidades G na
gelificação do alginato. O alginato contendo uma maior fração de blocos GG possui uma
habilidade maior de formar géis mais resistentes, enquanto que o alginato rico em blocos MM
formarão géis mais frágeis (Figura 4.5) (GRANT et al., 1973; BRACCINI; PÉREZ, 2001).
55

Figura 4.4 Formação da estrutura “eggbox” a partir da interação iônica dos blocos G com
cátions de cálcio. Adaptado de Braccini e Pérez (2001) e Avella et al. (2007).
Segundo Peniche et al. (2004), a reticulação do alginato com íons cálcio é estabelecida
pelas unidades gulurônicas, sendo que a força e a porosidade das partículas formadas
dependem da origem e da massa molar do polímero, da concentração do cloreto de cálcio e da
dispersão do alginato (PENICHE et al., 2004). Dependendo da quantidade de cálcio presente
no sistema, a associação inter cadeias pode ser temporária ou permanente, ou seja, níveis
reduzidos de cálcio induzem ao aumento da viscosidade e uma associação temporária, já em
níveis altos de cálcio resulta em precipitação, favorecendo uma associação permanente
(GEORGE; ABRAHAM, 2006).
Em valores de pH baixos, alginatos de alta massa molecular protonados podem formar
géis ácidos fracos. Nestes géis, a maior parte são cadeias homopoliméricas as quais formam
junções, mas a estabilidade depende do conteúdo de cadeias G. Géis com grande quantidade
de unidades G exibem alta porosidade, baixo encolhimento durante a formação do gel e menor
inchamento após secagem, no entanto, têm maior propensão em apresentar sinerese. Com o
aumento da quantidade de unidades M, os géis tornam-se mais macios, fracos, elásticos e
apresentam poros de menor tamanho (GACESA, 1992). Os blocos (MG)n formam cadeias
mais flexíveis e são mais solúveis em pH ácidos.
56

Figura 4.5 Modelo "egg-box" de gelificação do alginato e rearranjo das cadeias de alginato
com cálcio. Adaptado de George e Abraham (2006) e Bressel (2007).
A rede de gel pode ser formada pelo método de reticulação interna, em que se adiciona
diretamente à solução de alginato um sal insolúvel de cálcio. Neste caso, após a formação de
partículas de alginato, por exemplo, por emulsão, adiciona-se uma solução ácida que
solubiliza o sal de cálcio, tornando os íons Ca2+ disponíveis para efetuar interação iônica e
consequentemente, reticular o alginato (PONCELET et al., 1999). Alternativamente, a
formação de gel de alginato pelo uso de íons Ca+2 pode ser realizada por procedimentos
simples e rápida como o gotejamento da solução polissacarídica diretamente em soluções
ricas neste cátion (Figura 4.6).
Ao utilizar esse processo de difusão simples na imobilização em alginato, uma
suspensão com a enzima é misturada a uma solução de alginato de sódio, suficiente para
formar um gel firme. Essa mistura é submetida à extrusão com auxílio de mangueiras e
bomba peristáltica, sendo gotejada em solução contendo sais de íons bivalentes como cloreto
de cálcio formando grânulos. Após gelificação a enzima é aprisionada dentro do gel. Durante
a permanência na solução salina, os íons cálcio são transportados para o centro da esfera e um
estado de equilíbrio é atingido variando de 15 min a 12 horas (HULST; TRAMPER, 1989). O
tempo depende das condições experimentais como temperatura, concentração do sal, diâmetro
da esfera, tipo e concentração de alginato, concentração da suspensão. O procedimento de
57

maturação do encapsulado, em solução de cloreto de cálcio, pode ocorrer um aumento que

pode chegar a 40% comparado ao tamanho original (KLEIN; STOCK; VORLOP, 1983a;
OGBONNA; AMANO; NAKAMURA, 1989).
Figura 4.6 Gráfico esquemático da formação de micropartículas de alginato de sódio via

interação com íons cálcio. Adaptado de Juárez et al. (2014).
A formação deste gel, além da imobilização, é uma técnica muito utilizada como
agente espessante e estabilizante em alimentos, e também na produção de adesivos, tintas,
brinquedos e papéis. A gelificação do alginato permite a encapsulação de várias substâncias, e
quando modificado quimicamente, é utilizado na liberação controlada de proteínas que
promovem a regeneração do tecido mineralizado e como carregador de células transplantadas.
O alginato de sódio vem sendo estudado para usos como matriz para suporte de culturas
celulares específicas, encapsulação de drogas, imobilização de microorganismos e enzimas,
excipiente para medicamentos, material para impressão dental e curativo para ferimentos
(LEE et al., 2004; AUGST; KONG; MOONEY, 2006; AVELLA et al., 2007; QIN, 2008;
KO; SFEIR; KUMTA, 2010). Além disso, a técnica de imobilização tem elevado seu uso
quando associada a reatores, devido a alta eficiência que a técnica apresenta associado a
vantagens do uso de biorreatores (GABARDO, 2011).
As aplicações de enzimas em reações de transformação estão em crescimento em
diferentes segmentos industriais, sendo utilizadas no campo alimentício, farmacêutico e
ambiental, por exemplo. Os reatores utilizados para o cultivo de células imobilizadas podem
58

ser divididos em três categorias, de acordo com o padrão de fluxo: Reatores de mistura,
reatores de leito empacotado e reatores de leito fluidizado; que podem ainda serem
modificados para melhorar as características de transferência de massa e a capacidade de
controle das condições de cultivo ou para minimizar o estresse imposto ao suporte de
imobilização. A maior parte das reações é realizada em reatores de batelada clássicos, a
temperatura controlada. No final da reação a enzima (vegetal, animal ou de origem
microbiana) é inativada para recuperação dos produtos finais. A utilização desse tipo de reator
é relativamente simples em qualquer escala, os principais parâmetros que devem ser
controlados são temperatura e pH e a sua operação em modo contínuo é adequada em casos
de inibição pelo substrato. No entanto, este tipo de biorreator apresenta desvantagens, como a
tensão de cisalhamento imposta a matrizes sensíveis e quando se trata de produtos com
grandes quantidades de matéria prima bruta, como é frequentemente o caso na prática
industrial, acarretando em baixa produtividade, perda de atividade catalítica devido à
inativação, grande variabilidade da qualidade dos produtos, dentre outros (FUKUDA, 1994;
GROBOILLOT et al., 1994; RIOS et al., 2004; CARVALHO; CANILHA; SILVA, 2006).
Uma alternativa existente para a desvantagem desse método simples e prático é o
reator de cesto. O reator de cesto fornece uma boa mistura e é fácil de ser mantido sob
condições isotérmicas. Este tipo de reator tem a vantagem que o biocatalisador não sofre atrito
pelo agitador, sendo que o catalisador encontra-se contido em uma estrutura semipermeável,
em forma de uma cesta. Em alguns casos o biocatalisador é fixado em uma cesta estática
anular em torno do impulsor (GOTO; SAITO, 1984) ou em um cesto rotativo movido pelo
eixo (TESHIMA; OHASHI, 1977; GOTO; SAITO, 1984). O reator de cesto tem se mostrado
vantajoso, pois proporciona bons rendimentos, maiores produtividades, devido as
características do biocatalisador não ter contato direto com o agitador ajudando a evitar a
perda prematura da atividade catalítica, e por permitir sua reutilização, diminuindo assim o
custo de operação (ALVARADO-HUALLANCO; FILHO, 2012).
5. Conclusão
Os processos de hidrólise enzimática de chás e sua aplicação em reator mostraram ser

um atraente meio para promover a biotransformação de compostos fenólicos conjugados e
aumentar a concentração de compostos fenólicos livres nessas matrizes, sendo ainda capazes
de melhorar a absorção, capacidade antioxidante e efeito anti-adipogênico destes compostos.
Algumas ferramentas são utilizadas para tentar aumentar a estabilidade da enzima, a
59

utilização da imobilização enzimática possui vantagens, como maior estabilidade e

reutilização, abrindo porta para um aumento da eficiência de produção de produtos
potencialmente comerciais. A imobilização em alginato é uma opção atrativa ao setor
industrial devido à sua segurança toxicológica, eficiência de imobilização, facilidade de
aplicação e a viabilidade econômica. Neste sentido, ainda são necessárias pesquisas que
explorem novos substratos, enzimas e biorreatores que potencializem essas aplicações e que
avaliem o potencial de utilização para obtenção de produtos biotransformados como
antioxidantes naturais e como suplementos alimentares.
60

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73

CAPÍTULO II
Imobilização de tanase e caracterização cinética da enzima imobilizada na hidrólise de

taninos
(Artigo a ser submetido à revista Bioresource Tecnology)
74

Imobilização de tanase e caracterização cinética da enzima imobilizada na hidrólise de
taninos
Tannase immobilization and kinetic characterization of immobilized enzyme in tannins
hydrolysis
Bruna Sampaio Roberto1*; Isabela Mateus Martins1; Ruann Janser Soares de Castro1; Gabriela
Alves Macedo2
1 Food Science Department, College of Food Engineering, Campinas State University,

Campinas, SP, Brazil.
2 Food and Nutrition Department, College of Food Engineering, Campinas State
University, Campinas, SP, Brazil
*
Corresponding author: sampaior.bruna@gmail.com
75

RESUMO
As tanino acil hidrolases, conhecidas como tanases (E.C: 3.1.1.20) são esterases que
hidrolisam ligações éster e ligações depsídicas em substratos como ácido tânico, epicatequina
galato, epigalocatequina galato em meio aquoso, tendo vasta aplicação na indústria de
alimentos. O desenvolvimento de técnicas de imobilização tem sido importante. A aplicação
da tanase pode ser potencializada se for imobilizada, por proporcionar a reutilização das
enzimas, facilitar a separação dos produtos e aumentar a estabilidade em solventes orgânicos,
diminuindo custos e facilitando o uso em reatores. Com o intuito de aumentar a escala
produtiva do processo de biotransformação enzimática do ácido tânico e de polifenóis, este
trabalho teve como objetivo definir as características cinéticas da enzima microencapsulada
em alginato. Além disso, avaliar a sua utilização em biorreator de forma a minimizar uma
possível “lixiviação” das enzimas imobilizadas, aumentando a estabilidade operacional da
mesma, e selecionar as condições mais adequadas para a utilização do biorreator com
matrizes alimentares. Os resultados indicaram que a tanase imobilizada em alginato 5% reteve
86% da sua atividade específica original após 5 ciclos de reutilização, enquanto que a tanase
imobilizada em alginato 3,6% reteve 83%. O planejamento experimental utilizando DCCR
demonstrou os fatores relevantes para utilização do imobilizado em biorreator, e assim o
subsequente estudo univariado permitiu a obtenção das condições mais adequadas para o
processo: tanase imobilizada com alginato na concentração de 5%, 300 rpm de agitação,
temperatura de 60ºC e concentração das enzimas microencapsuladas de 0,75%. Os resultados
demonstraram promissor uso industrial destes microencapsulados, podendo ser utilizado em
sistemas alimentares.
Palavras-chave: tanase imobilizada, microencapsulação, biorreator, alginato de sódio.

76

ABSTRACT
The tannin acyl hydrolases, known as tannases (E.C: 3.1.1.20), are esterases that hydrolyse
ester bonds and depsides bonds in substrates such as tannic acid, epicatechin gallate,
epigallocatechin gallate inan aqueous medium, having wide application in the food industry.
The development of immobilization techniques has been important. The tannase application
can be potentiated if immobilized, providing there use of the enzymes, facilitating the
products separation and increasing the stability in organic solvents, reducing costs and
making it easier to use in reactors. In order to increase the productive scale of the enzymatic
biotransformation process of tannic acid and polyphenols, this work aimed to define the
kinetic characteristics of the enzyme microencapsulated in alginate. In addition, evaluate its
use in a bioreactor inorder to minimize a possible "leaching" of the immobilized enzymes,
increasing the operational stabilityof the same, and select the most suitable conditions for the
use of bioreactor with food matrices. The results indicated that 5% alginate immobilized
tannase retained 86% of its original specific activity after 5cycles of reuse, while alginate
immobilized tannase 3.6% retained 83%. The experimental design using DCCR demonstrated
the relevant factors for the use of the immobilized in a bioreactor and the subsequent
univariate study allowed to obtain the most suitable conditions for the process: tannase
immobilized with alginate in the concentration of 5%, 300 rpm of stirring, temperature of
60°C and microencapsulated enzymes concentration of 0.75%. The results showed a
promising industrial use of these microencapsulated and can be used in food systems.
Keywords: immobilized tannase, microencapsulation, bioreactor, sodium alginate.

77

1. Introdução
Tanase (tanino acil hidrolase, EC 3.1.1.20) é uma enzima induzível, que catalisa a
hidrólise de ligações éster e dipeptidase em galotaninos, elagitaninos, taninos complexos e
hidrolisáveis e ésteres de ácido gálico, favorecendo a liberação de glicose e ácido gálico
(RAMÍREZ et al., 2008; RODRÍGUEZ et al., 2009). A literatura traz relatos das suas
consideráveis aplicações para clarificação em vinho, cerveja, sucos de fruta e refrigerantes, na
elaboração de chá instantâneo, assim como síntese de ésteres de ácido gálico usados como
antioxidantes na indústria de alimentos (LEKHA; LONSANE, 1997; AGUILAR;
GUTIERRES-SANCHEZ, 2001; AGUILAR et al., 2007; ARIAN; ANWAR; ARTIKA,
2007). Além disso, tanase é também amplamente utilizada para o tratamento de efluentes
industriais e estudos da última década abordam a aplicação de tanase de Paecilomyces variotii
em chás, analisando a capacidade da enzima em hidrolisar EGCG em epicatequina e ácido
gálico e a atividade antioxidante dos compostos formados (KAR; BANERJEE, 2000;
BATTESTIN; MACEDO; DE FREITAS, 2008).
Os fatores limitantes apresentados pelas enzimas livres são a baixa resistência a
temperaturas elevadas; solubilidade em água, dificultando a separação e reutilização;
incompatibilidade do uso em solventes orgânicos devido ao poder desnaturante de vários
destes; e estarem presentes em baixas concentrações. A fim de ultrapassar ou até mesmo
eliminar alguns, faz com que as enzimas imobilizadas tornem-se bastante atrativas e estimula
o estudo de desenvolvimento de novos métodos analíticos para imobilizar a enzima em uma
matriz adequada (ABDEL-NABY et al., 1999; CHANG et al., 2006; MAHENDRAN;
RAMAN; KIM, 2006; HOTA; DUTTA; BANERJEE, 2007; SHARMA; AGARWAL;
SAXENA, 2008; SRIVASTAVA; KAR, 2010; FLORES-MALTOS et al., 2011; YAO et al.,
2014). Enzimas imobilizadas são mais fáceis de manipular e separar do produto, minimizando
assim ou eliminando a contaminação do produto pela enzima, como também possibilita alta
densidade celular por unidade de volume do biorreator, levando ao aumento da produtividade,
à diminuição do tempo de reação e à redução dos riscos de contaminação (PRADELLA,
2001; ZHANG; FRANCO, 2002). Através da imobilização é possível obter maior
estabilidade da enzima e menor interferência de compostos indesejáveis (MATEO et al.,
2007; SHELDON, 2007; CAMPANELLA et al., 2008). No entanto, a ideia de reutilização da
enzima implicitamente significa que a estabilidade da preparação de enzima final deve ser
suficientemente elevada para permitir a reutilização. Além disso, tendo em conta que o intuito
do uso final será como catalisador industrial, o processo de imobilização do componente
78

biológico também é uma etapa crucial na construção de um biorreator, pois a escolha da

técnica de imobilização, bem como, do suporte a ser utilizado é de extrema importância para o
bom desempenho deste instrumento, sendo que os processos de imobilização ideais devem
limitar a utilização de reagentes tóxicos ou altamente instáveis e processos muito complexos
(MAHENDRAN; RAMAN; KIM, 2006; MATEO et al., 2007; SHARMA; AGARWAL;
SAXENA, 2008; FLORES-MALTOS et al., 2011; YAO et al., 2014). Assim, embora existam
centenas de protocolos de imobilização, como os já mencionados neste trabalho, a concepção
de protocolos que permitam melhorar as propriedades da enzima e possam ser utilizados em
maior escala ainda é pouco alcançado e é uma meta que chama atenção .
Adicionalmente, o uso de enzimas relativamente dispendiosas como a tanase requer a
sua recuperação e reutilização para fazer um processo economicamente viável e ampliar a sua
utilização. A utilização de uma enzima imobilizada permite simplificar grandemente a
concepção do biorreator e o controle da reação (CHEETHAM, 1993; KATCHALSKI-
KATZIR, 1993; BICKERSTAFF, 1997). A simples filtração da enzima do meio reacional
possibilita a utilização em qualquer tipo de reator. Assim, a imobilização é geralmente um
requisito para a utilização de uma enzima como um biocatalisador industrial, e é a solução
mais simples para o problema da solubilidade destes interessantes biocatalisadores.
Não foram encontrados dados na literatura sobre as características cinéticas da tanase
de Paecilomyces variotii imobilizada em alginato de cálcio, embora Flores-Maltos et al.
(2011) tenham relatado fatores cinéticos da tanase imobilizada obtida de Apergillus niger. As
propriedades das enzimas imobilizadas são influenciadas tanto pelas propriedades da enzima
como pelo material do suporte, logo, a interação entre esses dois componentes proporciona
um derivado imobilizado com propriedades químicas, bioquímicas, mecânicas e cinéticas
específicas (TISCHER; KASCHE, 1999; ZANIN; MORAES, 2014). Estes fatores
influenciam no desempenho do suporte, na conformação da enzima, na velocidade de
transferência de massa e de reação intrínseca e, portanto, afetam o comportamento da enzima
imobilizada (VILLENEUVE et al., 2000; DALLA-VECCHIA; NASCIMENTO, 2004).
Baseado nos resultados interessantes e promissores do extenso trabalho realizado pelo
grupo de pesquisa, o qual otimizou a imobilização da tanase obtida de Paecilomyces variotii
(SCHONS et al., 2011; SCHONS, 2012), o objetivo deste estudo foi reproduzir o processo
otimizado por SCHONS (2012) a fim de caracterizar a cinética de hidrólise da tanase
microencapsulada em alginato, bem como obter um processo em biorreator em maior escala
que possibilitasse uma boa hidrólise de matizes alimentares e que possa ser futuramente
utilizada em processos industriais.
79

2. Materiais e Métodos
Os experimentos foram realizados no Laboratório de Bioquímica de Alimentos

(Departamento de Ciência de Alimentos) e Laboratório de Bioprocessos (Departamento de
Alimentos e Nutrição), localizados na Faculdade de Engenharia de Alimentos, UNICAMP,
Campinas - SP.
2.1 Materiais
Para a microencapsulação de tanase em alginato foi utilizado alginato de sódio (sal

sódico do ácido algínico, viscosidade >25cps) obtido da Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA),
assim como o Cloreto de Cálcio utilizado para reticulação do alginato de sódio, ácido tânico,
rodanina e ácido gálico. Também foram utilizados hidróxido de sódio (Merck KGaA,
Darmstadt, Germany), sulfato de amônio (Ecibra, São Paulo, Brasil). Coomassie Brilhante G-
250 obtido da Vetec (Química Fina Ltda, Brasil). A água utilizada em todo o trabalho foi
destilada e deionizada em sistema MilliQ da Millipore e os demais reagentes utilizados foram
de grau analítico.
2.2 Produção e imobilização da tanase
A tannase de Paecilomyces variotii foi produzida de acordo com procedimento

previamente publicado por Battestin e Macedo (2007). O meio de fermentação para produção
da enzima continha 20 g de farelo de trigo, 20 mL de água destilada e 10% de ácido tânico (p
/ p). Neste meio foi adicionado a suspensão de esporos (2,5 mL) do Paecilomyces variotii
contendo 1,6 X 107 esporos/mL. Após fermentação, extração e filtração, a tanase foi
parcialmente purificada por precipitação com sulfato de amônio (80% de saturação) e
dialisada, eliminando algumas impurezas. O extrato de tanase semipurificado foi congelado à
-18°C para posteriormente ser liofilizado e imobilizado.
A imobilização da tanase utilizando alginato de sódio foi feita seguindo técnica já
otimizada com algumas modificações (SCHONS, 2012) na utilização do alginato de sódio
com viscosidade >25cps e inclusão de maiores concentrações de alginato. Logo, nessa fase do
processo foi utilizado 15 mL de alginato de sódio, homogeinizados por 1 hora a 200rpm,
foram misturados com 54 mg de extrato semi-purificado de tanase de P. variotii (3,6mg de
80

tanase/mL de alginato) em temperatura ambiente. Em seguida a suspensão foi gotejada, a uma

altura de 10 cm, em 90 mL de solução de cloreto de cálcio (CaCl2, 0,1M), com o auxílio de
uma bomba peristáltica. Após o gotejamento as cápsulas permaneceram em repouso, sob-
refrigeração (7ºC), na solução de CaCl2 durante 6h obtendo-se pérolas de alginato de cálcio de
aproximadamente 20mm de diâmetro. As pérolas foram peneiradas e lavadas sucessivamente
com 200 mL de água destilada a 10 ºC para remoção do excesso de íons cálcio e da enzima
não ligada. Na Figura 2.1 está ilustrado as enzimas imobilizadas obtidas. Amostras controle
foram obtidas pelo gotejamento da solução de alginato, sem a adição de enzima, no cloreto de
cálcio. As características cinéticas da enzima imobilizada foram determinadas utilizando
condições determinadas por Schons (2012) e a enzima imobilizada em pequenos volumes de
reação.
Figura 2.1 Imobilização de tanase por encapsulação em alginato de sódio.
2.3 Determinação da atividade enzimática e eficiência de imobilização
Foi avaliada através do método definido por Sharma; Bhat; Dawra (2000) com
algumas modificações: utilização do ácido tânico em tampão acetato como substrato em
substituição ao metil galato em tampão citrato; e utilização da temperatura ótima, 60ºC para
enzima imobilizada e 40ºC para enzima livre (SCHONS et al., 2011; SCHONS, 2012). O
método tem como princípio avaliar a capacidade da enzima em produzir ácido gálico a partir
da hidrólise de ácido tânico. O ensaio é colorimétrico mensurando a formação de um
81

complexo entre a rodanina e o ácido gálico formado na reação de hidrólise enzimática pela
enzima imobilizada com absorção máxima a 520 nm. A concentração de ácido gálico foi
definida através de uma curva de calibração de ácido gálico em tampão fosfato 0,02M pH 5,5.
A partir da concentração de produto no meio reacional a atividade enzimática foi expressa
como U, considerando-se 1U como a quantidade de enzima que libera um µmol de ácido
gálico/min/mL do meio reacional de ácido tânico. A atividade específica foi expressa através
do número de unidade de enzimas por miligrama de proteína (U/mg de proteína).
A porcentagem de atividade enzimática (%AE) da tanase imobilizada foi expressa em
relação à atividade específica da tanase livre como mostrado na equação 1.
𝒂𝒕𝒊𝒗𝒊𝒅𝒂𝒅𝒆 𝒆𝒔𝒑𝒆𝒄í𝒇𝒊𝒄𝒂 𝒅𝒂 𝒕𝒂𝒏𝒂𝒔𝒆 𝒊𝒎𝒐𝒃𝒊𝒍𝒊𝒛𝒂𝒅𝒂

𝑨𝑬 (%) = 𝑿 𝟏𝟎𝟎
𝒂𝒕𝒊𝒗𝒊𝒅𝒂𝒅𝒆 𝒆𝒔𝒑𝒆𝒄í𝒇𝒊𝒄𝒂 𝒅𝒂 𝒕𝒂𝒏𝒂𝒔𝒆 𝒍𝒊𝒗𝒓𝒆
(Equação 1)
A determinação da porcentagem da eficiência de imobilização de tanase de

Paecilomyces variotii foi realizada mensurando a concentração de proteína na solução de
cloreto de cálcio após o tempo de cura (BRADFORD, 1976). Retirou-se alíquota de 100µL da
solução contendo a enzima que não foi imobilizada e adicionou-se 2,5mL do reagente de
Bradford. Agitou-se e mediu-se a absorbância após 5 minutos em espectrofotômetro a 595nm.
A porcentagem da eficiência de imobilização foi determinada pela equação 2.
𝒎𝒈 𝒑𝒓𝒐𝒕𝒆í𝒏𝒂 𝒆𝒏𝒄𝒂𝒑𝒔𝒖𝒍𝒂𝒅𝒂
𝑬𝑰 % = ×𝟏𝟎𝟎
𝒎𝒈 𝒑𝒓𝒐𝒕𝒆í𝒏𝒂 𝒆𝒎𝒑𝒓𝒆𝒈𝒂𝒅𝒂
(Equação 2)
2.4 Determinação de Km, Vmáx, Tempo de meia vida e Kd
Para calcular as constantes cinéticas, os dados foram representados graficamente a

partir da determinação da taxa de reação com concentrações de substrato variando de 0,1 à
1g/L e ensaiados sob condições padronizadas (pH 5,5, 40ºC para a enzima livre, e pH 5,5,
60°C para a enzima imobilizada (SCHONS et al., 2011)) e assim com esses dados foi obtida a
equação de Michaelis-Menten. Os cálculos de Km e Vmáx da enzima imobilizada foram
realizados utilizando o método de transformação linear de Lineweaver e Burk (1934). As
82

constantes de inativação térmica (kd) foram determinadas plotando um gráfico ln A (atividade

enzimática) versus tempo sendo que os coeficientes angulares de cada curva foram as
constantes de inativação (kd). A meia-vida aparente (t½) das partículas de tanase imobilizada,
definido como o tempo em que a atividade residual chega a 50% do seu valor inicial, foi
estimada conforme a equação 3:
𝐥𝐧(𝟎, 𝟓)
𝐭½ =
−𝑲𝒅
(Equação 3)
2.5 Estabilidade operacional e preservação da atividade durante armazenamento
O estudo da estabilidade operacional através da tanase imobilizada foi realizado pela

hidrólise do ácido tânico em regime de bateladas consecutivas fazendo o reuso das partículas
de tanase imobilizada. O poder catalítico da tanase imobilizada foi determinado pela hidrólise
do ácido tânico conforme descrito no item 2.3 após cada batelada de duração de 30 minutos.
Nesse processo também foi verificado possível fuga da enzima para o meio. A tanase
imobilizada foi removida do meio por filtração, lavada e reutilizada na reação de hidrólise do
ácido tânico, este procedimento foi feito todos os dias até o sexto reuso, baseado nos
resultados de Shons (2012).
Em paralelo foi avaliado a estabilidade da enzima imobilizada frente ao tempo de
armazenamento. A preservação da atividade foi medida armazenando a enzima à temperaturas
de refrigeração, embalando-as em placas de petri cobertas por filme plástico e então,
analisando suas atividade a cada 15 dias por 90 dias, pois .
2.6 Estudo da hidrólise de ácido tânico em biorreator pela tanase imobilizada em

alginato por meio de planejamento de experimentos.
2.6.1 Biorreator utilizado
Biorreator de vidro, operando em batelada, no modo mistura, foi utilizado para avaliar
as condições da hidrólise de ácido tânico e resistência física média das esferas de alginato. Foi
constituído por um béquer e o sistema de agitação mostrado na Figura 2.2 (apenas
esquemático). Este sistema foi projetado para minimizar a fragmentação das partículas
83

imobilizadas, sendo então encamisados e a manutenção da temperatura por uma chapa de

aquecimento (Figura 2.3).
Figura 2.2 Modelo esquemático do biorreator testado: Esquema de operação de um biorreator

de mistura perfeita. A cesta contendo a enzima é representada pela estrutura fixada em b, Ci é
a concentração de substrato, VR é o volume do biorreator e A é o sistema de agitação
magnética.
Figura 2.3 Ilustração do biorreator utilizado.

84

2.6.2 Delineamento composto central rotacional
Após os estudos realizados com a tanase imobilizada em alginato de sódio para

caracterização da cinética enzimática, os parâmetros de hidrólise do ácido tânico em
biorreator de mistura foram avaliados utilizando um delineamento composto central
rotacional (DCCR). O DCCR foi composto por 16 pontos fatoriais (p.f.), 8 pontos axiais (p.a.)
e 4 pontos centrais (p.c.) totalizando 28 ensaios (24 p.f. + 8 p.a. + 4 p.c. = 28). As quatro
variáveis independentes em estudo foram: concentração de alginato, temperatura,
concentração enzimática (expressa em porcentagem de imobilizado em relação ao volume de
substrato), e frequência de agitação (expressa em rpm) no tempo de 30, 60 e 90 minutos. As
variáveis dependentes (respostas) foram atividade enzimática da tanase e eficiência da
imobilização (calculada utilizando a equação 2). As variáveis e os níveis em estudo estão
descritos na Tabela 2.1. e a matriz do delineamento experimental contendo todos os ensaios e
os valores reais utilizados está apresentada na Tabela 2.2.
Tabela 2.1 Variáveis e níveis utilizados.

Níveis
Variáveis
-α* -1 0 +1 +α*
Alginato (%) 2,9 3,6 4,3 5 5,7
Temperatura (ºC) 30 40 50 60 70
Enzima (%) 0,05 0,5 1 1,5 2
Agitação (rpm) 300 400 500 600 700
*α = 1,41
Após avaliar os efeitos das variáveis independentes, a hidrólise do ácido tânico pela
tanase imobilizada em alginato de cálcio foi estudada através da combinação dos efeitos
significativos utilizando ensaios univariados, quando as condições selecionadas foram:
concentração de alginato de 5%; agitação de 300rpm; temperatura de 60ºC e tempo de reação
de 60 minutos.
85

Tabela 2.2 Matriz do delineamento contendo valores decodificados e codificados (entre

parênteses) das variáveis.
Ensaios Alginato (%) Temperatura (ºC) Enzima (%) Agitação (rpm)
1 3,6 (-1) 40 (-1) 0,5 (-1) 400(-1)
2 3,6 (-1) 40 (-1) 0,5 (-1) 600 (+1)
3 3,6 (-1) 40 (-1) 1,5 (+1) 400 (-1)
4 3,6 (-1) 40 (-1) 1,5 (+1) 600 (+1)
5 3,6 (-1) 60 (+1) 0,5 (-1) 400 (-1)
6 3,6 (-1) 60 (+1) 0,5 (-1) 600 (+1)
7 3,6 (-1) 60 (+1) 1,5 (+1) 400 (-1)
8 3,6 (-1) 60 (+1) 1,5 (+1) 600 (+1)
9 5 (+1) 40 (-1) 0,5 (-1) 400 (-1)
10 5 (+1) 40 (-1) 0,5 (-1) 600 (+1)
1 5 (+1) 40 (-1) 1,5 (+1) 400 (-1)
12 5 (+1) 40 (-1) 1,5 (+1) 600 (+1)
13 5 (+1) 60 (+1) 0,5 (-1) 400 (-1)
14 5 (+1) 60 (+1) 0,5 (-1) 600 (+1)
15 5 (+1) 60 (+1) 1,5 (+1) 400 (-1)
16 5 (+1) 60 (+1) 1,5 (+1) 600 (+1)
17 2,9 (-α) 50 (0) 1 (0) 500 (0)
18 5,7 (+α) 50 (0) 1 (0) 500 (0)
19 4,3 (0) 30 (-α) 1 (0) 500 (0)
20 4,3 (0) 70 (+α) 1 (0) 500 (0)
21 4,3 (0) 50 (0) 0,05 (-α) 500 (0)
22 4,3 (0) 50 (0) 2 (+α) 500 (0)
23 4,3 (0) 50 (0) 1 (0) 300 (-α)
24 4,3 (0) 50 (0) 1 (0) 700 (+α)
25 4,3 (0) 50 (0) 1 (0) 500 (0)
26 4,3 (0) 50 (0) 1 (0) 500 (0)
27 4,3 (0) 50 (0) 1 (0) 500 (0)
28 4,3 (0) 50 (0) 1 (0) 500 (0)
2.6.3 Planejamento univariado
Os novos ensaios foram conduzidos em triplicata a partir de cinco concentrações de

enzima, sendo que os níveis das variáveis anteriormente analisadas foram fixados. Foi
utilizada a concentração de alginato de sódio de 5%, temperatura de 60ºC e agitação de
300rpm. A variação da concentração da enzima imobilizada no meio reacional foi o fator
estudado. Foram utilizadas as concentrações de 0,1%; 0,25%; 0,5%; 0,75% e 1%. Em todos
os ciclos de hidrólise a reação foi paralisada em banho de gelo a fim de garantir que possíveis
resíduos que fossem transferidos para o meio não superestimassem os resultados.
86

2.7 Análise Estatística
A análise estatística dos resultados foi realizada através de software STATISTICA,

utilizando-se Experimental Design.
3. Resultados e Discussão
3.1 Atividade Enzimática e Eficiência de imobilização
Durante testes preliminares de imobilização foi verificado que reações ultrapassando 3

horas de reação provocavam a ruptura das cápsulas de alginato. A fim de elevar a vida útil,
minimizando a fragmentação das partículas imobilizadas, a imobilização da enzima em
alginato de sódio 5%foi incluída no estudo.
As partículas de alginato produzidas através da encapsulação foram caracterizadas em
termos da eficiência da imobilização (%EI), que avalia o potencial da técnica em manter a
enzima imobilizada; atividade enzimática e % da atividade enzimática (%AE) que reproduz a
atividade da enzima livre que foi mantida no sistema (Figura 3.1 e Figura 3.2). Os resultados
mostram que houve a imobilização da enzima com melhor %EI e valores muito próximos ao
%AE encontrados por Schons (2012).
1.00 a
0.90
0.80
Atividade enzimática (U)
0.70
0.60
0.50
0.40 b
0.30 c
0.20
0.10
0.00
3,6% alginato 5%alginato enzima livre
Figura 3.1 Atividade enzimática da tanase imobilizada e livre. Médias seguidas por letras
diferentes diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).
87

Para a determinação da atividade foi utilizado o princípio estabelecido por Sharma et

al. (2000) que avalia a quantidade de produto formado e Schons (2012) estabeleceu a
atividade enzimática através da mensuração quantitativa do substrato após a reação
(MONDAL et al., 2001). Ainda que tenha sido utilizado princípios de métodos diferentes para
a avaliação da atividade enzimática percebeu-se que o método otimizado por Schons (2012)
pode ser reproduzido.
80%
a
70%
b
60%
50%
3,6% alginato
40%
5%alginato
30% a 3,6% alginato (Schons, 2012)
a
20%
10%
0%
%Atividade Imobilizada %Eficiência de Imobilização
Figura 3.2 Resultados da avaliação da porcentagem de atividade imobilizada e eficiência de

imobilização. Médias seguidas por letras diferentes diferem entre si pelo teste t (p<0,01).
A imobilização por encapsulação através de gelificação iônica em alginato de sódio

forma uma membrana porosa em torno da enzima que é capaz de controlar o tamanho das
moléculas que entram e saem das células. Em outras palavras, a preservação da enzima no
encapsulado e a %AE estão altamente relacionadas com as características do agente de
encapsulação. As proteínas por apresentarem alta massa molecular ficam mantidas no interior
da cápsula, já substratos desta enzima, bem como os produtos desta hidrólise podem passar
livremente pelos poros da membrana, ou seja, as massas moleculares do substrato enzimático
e do produto formado estão diretamente relacionadas à limitação difusional e ao impedimento
esteárico do sítio ativo da enzima. Ainda que a maior concentração de alginato de sódio tenha
apresentado maior aprisionamento da enzima, isso não foi convertido em %AE,
possívelmente devido à limitação difusional do substrato pela cápsula. Os alginatos são
heteropolímeros lineares de ácidos carboxílicos compostos de subunidades monoméricas de
β-D-ácido manurônico (M) e α-L-ácido gulurônico (G) interligados por ligações 1,4-
glicosídicas. Estes monômeros podem ser organizados em cadeias consecutivas de resíduos G
88

(G)n, de resíduos M (M)n, ou alternando resíduos M e G (MG)n. Diferenças na relação M/G

impactam na configuração molecular e consequentemente na funcionalidade, viscosidade,
capacidade e força de geleificação (KLEIN; STOCK; VORLOP, 1983; ERTESVÅG;
VALLA, 1998; CHAN; LEE; HENG, 2002) o que pode ter impactado na %EI deste estudo,
uma vez que o alginato utilizado possui maior viscosidade (>25cps) que o utilizado por
Schons (2012) (25cps).
Alginatos contendo maiores concentrações de resíduos GG formam géis mais rígidos e
resistentes. Os resíduos M também formam ligações intermoleculares, apesar de mais fracos,
mais macios e mais elásticos. Ou seja, quanto maior o conteúdo de blocos G, maior é o
potencial de formação de gel e maior é sua força (LIU et al., 2004). Sabe-se que os íons cálcio
têm mais afinidade por resíduos G (SHILPA; AGRAWAL; RAY, 2003) formando uma rede
polimérica mais rígida, logo essa interação pode ter influenciado nos diferentes imobilizados.
As configurações espaciais que os blocos M e G adotam, juntamente com a proporção,
distribuição e comprimento destes blocos, determinam as propriedades físicas e químicas do
alginato (SMIDSRØD, 1974). Outro fator que deve ser avaliado é a homogeneização do
alginato em água, quando há melhor homogeneização facilita as interações eletrostáticas entre
o polímero de alginato e a enzima a ser encapsulada e entre o alginato e os íons cálcio.
Foi observado (dados não apresentados) que há baixa dispersão em água se o alginato
for adicionado muito rapidamente, formando grumos sem hidratação completa e que
consequentemente prejudicam a interação dos resíduos de alginato com os íos cálcio. Além
disso, estudos anteriores demonstraram que a capacidade de retenção de proteínas em
matrizes de alginato era maior com o aumento da concentração do polímero
(VANDENBERG et al., 2001).
3.2 Determinação de Km, Vmáx, Tempo de meia vida e Kd
A caracterização desses parâmetros é importante para avaliar o potencial

biotecnológico do catalizador. O estudo das propriedades cinéticas pode ser utilizado para
direcionar a aplicação destas enzimas em processos industriais, dando suporte para manter o
nível desejado de atividade. Km e Vmáx foram calculados a partir dos gráficos de
Lineweaver-Burk (Figura 3.3 e Figura 3.4) e estão apresentados na Tabela 3.1.
89

Tabela 3.1 Parâmetros cinéticos para hidrólise de ácido tânico pela tanase livre e imobilizada,
produzidas por Paecilomyces variotii.
Enzima Km (µmol) Vmáx (U.mg-1)
Ezima livre 0,6 3,17
Imobilizada - alginato 3,6% 1,02 0,78
Imobilizada - alginato 5% 3,23 1,15
O valor de Km de uma enzima fornece uma indicação da força de ligação entre a

enzima ao seu substrato, assim, um Km baixo indica uma maior afinidade para o substrato
(MOTTA, 2006). O Vmáx pode ser definido como a produção máxima com a quantidade total
de enzima participando da reação. Esta medição é teórica e tem um valor aproximado de um
determinado momento, uma vez que exigiria que todas as moléculas de enzima estivessem
ligadas firmemente aos seus substratos (LINEWEAVER; BURK, 1934; BERG;
TYMOCZKO; STRYER, 2002; MOTTA, 2006).
0.8
0.7
0.6
0.5
y = 0.1903x + 0.3158
0.4 R² = 0.97124
1/v
0.3
0.2
0.1
0
-2 -1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2
-0.1
-0.2
1/[S]
Figura 3.3 Diagrama de Lineweaver-Burk aplicado aos dados experimentais para a tanase
livre.
Nos dois casos de enzima imobilizada, os valores de Km foram maiores do que o valor
de Km da enzima livre, para 3,6% alginato foi 1,7 vezes superior e 5% alginato foi 5,4 vezes.
Este aumento de Km implica a utilização de maior concentração de substrato para atingir a
90

mesma taxa de reação obtida com as enzimas livres. O incremento em Km pode ser devido os
efeitos de transferência de massa, onde a resistência influencia o transporte de substrato a
partir de uma solução para o sítio catalítico e também a difusão dos produtos da reação de
volta para a solução. Por outro lado, a fixação da enzima na matriz de imobilização pode levar
a uma diminuição na flexibilidade da molécula de enzima como também pode levar à
mudanças conformacionais na sua estrutura terciária que resultam na dificuldade de acesso do
substrato ao seu sitio ativo, que são normalmente refletida na diminuição da atividade
catalítica (CAO, 2005), fator que também pode explicar o valor da Vmax da enzima
imobilizada mostrar-se inferior à livre. Resultados semelhantes no Vmáx e Km para enzimas
imobilizadas foram reportados por Bayramoğlu et al. (2008); El-tanash; Sherief e Nour (2011)
e Flores-maltos et al. (2011). No entanto analisando a diferença entre as diferentes tanases
imobilizadas, percebe-se que embora 5% alginato tenha sido negativo para a resistência do
substrato a matriz, possivelmente por sua estrutura mais rígida, este não afetou tão
intensamente a conformação da enzima apresentando melhores valores de Vmáx que a reação
que utilizou 3,6% de alginato.
7
y = 2.8249x + 0.872
6
R² = 0.95166
5
3
1/v
2 alginato 3,6%
alginato 5%
1
0
-1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2
-1
-2 y = 1.3072x + 1.2845
R² = 0.95183
-3
1/[S]
Figura 3.4 Diagrama de Lineweaver-Burk aplicado aos dados experimentais da tanase

imobilizada em duas concentrações: 3,6% e 5%
O tempo de meia vida e a constante de inativação da tanase admitindo duas

temperaturas, 40ºC temperatura ótima da tanase livre e 60ºC temperatura ótima da tanase
91

imobilizada, estão demonstrados na Tabela 3.2. Pode-se notar que a atividade enzimática
manteve-se mais estável na menor temperatura, 40ºC.
Tabela 3.2 Parâmetros cinéticos obtidos para o processo de inativação da tanase.

Temperatura Enzima livre Enzima imobilizada – Enzima imobilizada -
alginato 3,6% alginato 5%
Kd (h-1) t ½ (h) Kd (h-1) t ½ (h) Kd (h-1) t ½ (h)
40ºC 0,91 0,76 0,4 1,75 0,39 1,78
60ºC 1,35 0,51 0,57 1,21 0,5 1,48
O tempo de meia-vida (t½) de uma enzima, em determinada temperatura, é o tempo

que leva para a atividade desta enzima reduzir à metade de sua atividade original / inicial.
Valores mais elevados destes parâmetros são importantes e desejáveis para aplicações
industriais, pois indica a resistência da enzima à inativação térmica. O processo de
imobilização aumentou os valores de tempo de meia vida para as temperaturas estudadas,
demonstrando que o processo aumenta a estabilidade térmica relativa a enzima livre. A
enzima imobilizada com alginato 5% apresentou ligeiramente maior resistência térmica
quando em comparação com a enzima imobilizada em alginato 3,6%. É importante destacar
que essa diferença foi mais perceptível quando avaliado à temperatura ótima para a atividade
de tanase imobilizada em alginato (60°C), apresentando valor de t ½ estimado em 1,21h e
1,48h, respectivamente. Observou-se que a constante de desnaturação (Kd) aumentou com o
aumento da temperatura para todas as tanases. Através dos dados apresentados observou-se
que o valor para essa constante é inversamente proporcional a estabilidade da enzima, ou seja,
quanto menor o valor de Kd maior é a estabilidade da enzima. Seguindo esta afirmação,
enquanto os valores de Kd foram de 0,91 h-1 a 40 ° C e 1,35 h-1 a 60 ° C para a enzima livre,
para as enzimas imobilizadas variaram entre 0,39 h-1 e 0,4 h-1 a 40 ° C e 0,5 h-1 e 0,57 a 60 ° C,
para a concentração de 5% e 3,6%, respectivamente. EL-Tanash et al. (2011) estudaram a
cinética de desnaturação térmica de uma tanase de Aspergillus aculeatus imobilizada em
gelatina com reticulante glutaraldeído e obtiveram tempo de meia-vida de 312,3; 47,4 e 27,5
min a 60, 70 e 80 ° C, respectivamente.
Todas as afirmações apresentadas quanto a cinética demonstram que as propriedades
das enzimas imobilizadas são influenciadas tanto pelas propriedades intrínsecas da enzima
como pelo agente de encapsulação. Se, por um lado, o suporte pode aumentar o tempo de
meia-vida da enzima imobilizada, por outro, uma escolha imprudente pode afetar
92

adversamente não só o tempo de meia-vida, mas o desempenho global do sistema (YAHYA;

ANDERSON; MOO-YOUNG, 1998; TISCHER, 1999). Isso demonstra a importância do
conhecimento da técnica de imobilização e das características do imobilizado para melhorar o
seu uso como catalizador de reações.
3.3 Estabilidade operacional e preservação durante armazenamento
A estabilidade operacional da tanase imobilizada é o fator que afeta a liberação de

ácido gálico na bioconversão de taninos em processos sequencias afetando diretamente suas
possíveis aplicações industriais em alimentos, bebidas e sucos. A estabilidade operacional da
tanase imobilizada foi avaliada em processos descontínuos repetidos. Depois de cada
batelada, a tanase imobilizada foi lavada e reutilizada em condições ótimas para a reação. A
porcentagem de atividade residual foi determinada para 6 bateladas sequênciais. Conforme
Shons (2012) o procedimento otimizado permite a reutilização da tanase imobilizada em
alginato de sódio por até 5 ciclos, mantendo 60% de sua atividade catalítica. Já os resultados
da Figura 3.5 indicam que neste trabalho a tanase imobilizada em alginato 5% reteve 86% da
sua atividade específica original após 5 ciclos, enquanto que tanase imobilizada em alginato
3,6% reteve 83%, confirmando promissor uso industrial destes imobilizados.
120
100
* * *
Atividade residual (%)
80
60 Alginato 5%
Alginato 3,6%
40
20
0
1 2 3 4 5 6
Ciclos de reutilização
Figura 3.5 Estabilidade operacional na reutilização da tanase imobilizada em alginato em
ciclos sucessivos. Os valores representam a média ± desvio padrão. * = diferem
estatisticamente pelo teste t (p<0,05).
93

Resultados semelhantes foram encontrados com tanase de Aspergilus niger em

microencapsulados de alginato de sódio que foram usados repetidamente durante 7 ciclos com
77% eficiência (SRIVASTAVA; KAR, 2010). Na Tabela 3.3 podemos observar os resultados
de atividade específica e a eficiência relativa do imobilizado, que mediu a capacidade da
cápsula em manter a enzima imobilizada após os ciclos sucessivos de hidrólise, medida
através da mensuração da proteína residual no meio de reação.
Tabela 3.3 Avaliação da atividade específica e eficiência relativa após 6 ciclos de hidrólise
com tanase imobilizada em 2 concentrações de alginato.
Concentração de alginato
Alginato 3,6% Alginato 5%
Eficiência
56,38 70,65
inicial (%)
Atividade específica Eficiência Atividade específica Eficiência
(U/g proteína) relativa (%) (U/g proteína) relativa (%)
1 0,49 98,55 0,57 98,81
2 0,49 98,55 0,59 96,42
3 0,46 94,1 0,56 95,2
4 0,42 84,00 0,52 89,7
5 0,41 65,00 0,51 68,3
6 0,38 52,00 0,48 57,3
A partir desse parâmetro podemos observar que o método mesmo após 6 bateladas não
teve perda acima de 50%. Supõe-se que essa perda de proteína para o meio seja devido à
desestabilização do imobilizado que ocorre ao passo que a solução pode conter substâncias
sequestradoras de cátions como fosfatos, que sequestram o íon Ca+2 desestabilizando a
configuração do gel de alginato (KING, 1983). O último parâmetro de caracterização
analisado, mas não menos importante, é o tempo de vida útil e durabilidade frente às
condições de armazenamento que devem ser considerados quando se quer desenvolver um
imobilizado enzimático. Normalmente as enzimas imobilizadas mantêm sua atividade em
condições de estocagem quando não são expostas a condições adversas de pH e temperatura
(GÓMEZ et al., 2006). As enzimas foram estocadas em placas de petri, embaladas em filme
plástico de pvc e armazenadas a 5ºC. A determinação da atividade da tanase imobilizada
durante o processo do armazenamento pode ser observado na Tabela 3.4.
94

Foi verificado que após 60 dias de estocagem a atividade hidrolítica da tanase

imobilizada manteve-se estável, apresentando valores de atividade relativa (comparado à
atividade inicial) superior à 84%. Quando comparada a tanase imobilizada estudada por
Srivastava e Kar (2010), que reteve 71,7% da atividade enzimática após 60 dias, pode-se
observar que o procedimento de imobilização desta enzima teve melhor resistência ao
armazenamento, mantendo por mais tempo a atividade hidrolítica da enzima.
Tabela 3.4 Estabilidade da atividade da enzima imobilizada durante o processo de

armazenagem.
Dias Alginato 3,6% Alginato 5%
Ativ. Específica Ativ. Relativa Ativ. Específica Ativ. Relativa
0 0,49 100 % 0,57 100%
15 0,5 100% 0,55 96%
30 0,46 93% 0,54 95%
60 0,42 85% 0,5 88%
90 0,29 60% 0,36 63%
3.4 Estudo da otimização da hidrólise de ácido tânico por delineamento composto

central rotacional
3.4.1 Delineamento composto central rotacional
Para a avaliação do comportamento do complexo enzimático em um biorreator, vários

parâmetros físicos e químicos, relacionados entre si ou não, podem influenciar na resposta
enzimática. Ainda que a resposta de maior relevância seja a atividade enzimática, uma vez
que somente manter imobilizada a enzima sem que ela retenha atividade catalítica não é
interessante industrialmente, a eficiência relativa (ER) (%) foi também avaliada. No intuito de
verificar as condições mais adequadas para manutenção da atividade enzimática sem
prejudicar a ER do imobilizado, o delineamento composto central rotacional avaliou os efeitos
de 4 variáveis do processo de hidrólise do ácido tânico pela enzima tanase imobilizada em
alginato: concentração de alginato (%), concentração de enzima na reação (%), agitação (rpm)
e temperatura (ºC). Os valores de atividade enzimática e eficiência relativa da imobilização,
foram determinados nos tempos de 30, 60 e 90 minutos, encontram-se na Tabela 3.5 com os
valores decodificados das variáveis independentes.
95

Tabela 3.5 Delineamento composto central rotacional para estudo do efeito das variáveis
temperatura, concentração de enzima, concentração de alginato e agitação na atividade
enzimática utilizando tanase imobilizada em processo em batelada.
Nº de Alginato Temp Enzima Agitação AE ER AE ER AE ER
ensaios (%) (ºC) (%) (rpm) 30 minutos 60 minutos 90 minutos
1 3,6 40 0,5 400 0,37 98,0 1,35 97,7 0,68 96,9
2 3,6 40 0,5 600 0,38 97,7 1,49 97,4 0,69 97,1
3 3,6 40 1,5 400 0,14 97,6 0,52 97,2 0,26 96,9
4 3,6 40 1,5 600 0,18 97,2 0,66 96,5 0,38 96,3
5 3,6 60 0,5 400 0,47 98,1 2,04 97,4 1,16 97,2
6 3,6 60 0,5 600 0,50 98,5 2,18 97,7 1,19 96,9
7 3,6 60 1,5 400 0,30 97,7 1,01 97,2 0,54 96,9
8 3,6 60 1,5 600 0,32 97,1 1,21 96,5 0,65 95,7
9 5 40 0,5 400 0,47 98,9 2,11 98,4 1,18 97,8
10 5 40 0,5 600 0,51 98,5 2,32 98,0 1,21 97,8
11 5 40 1,5 400 0,21 98,3 0,63 97,8 0,28 97,3
12 5 40 1,5 600 0,20 97,9 0,69 97,5 0,39 96,9
13 5 60 0,5 400 0,53 98,8 2,85 98,2 1,32 97,7
14 5 60 0,5 600 0,57 98,5 3,05 98,0 1,47 97,3
15 5 60 1,5 400 0,27 98,2 1,06 97,6 0,54 97,3
16 5 60 1,5 600 0,32 97,7 1,41 97,2 0,68 96,8
17 2,9 50 1 500 0,54 54,4 2,52 54,2 1,38 51,1
18 5,7 50 1 500 0,25 99,5 1,05 99,1 0,53 98,8
19 4,3 30 1 500 0,16 98,2 0,66 97,5 0,37 97,1
20 4,3 70 1 500 0,41 97,7 2,26 97,3 1,25 96,6
21 4,3 50 0,05 500 0,36 98,4 1,34 98,0 0,71 97,1
22 4,3 50 2 500 0,26 97,8 1,04 97,2 0,54 96,8
23 4,3 50 1 300 0,25 98,1 0,92 97,5 0,41 96,8
24 4,3 50 1 700 0,36 97,9 1,15 97,5 0,54 96,8
25 4,3 50 1 500 0,25 97,9 0,87 97,6 0,62 97,0
26 4,3 50 1 500 0,38 98,1 1,24 97,5 0,64 97,1
27 4,3 50 1 500 0,49 98,0 1,62 97,7 0,68 97,0
28 4,3 50 1 500 0,27 98,0 0,81 97,6 0,50 97,0
AE (U/mg de proteína); Eficiência Relativa (% proteína mantida)
As análises estatísticas comprovaram que para a atividade enzimática apenas os

termos lineares de concentração de enzima e temperatura foram estatisticamente significativos
96

(p-valor < 0,05) (Tabela 3.6). A avaliação destes parâmetros mostrou que, dentro dos
intervalos avaliados, é possível o uso de qualquer concentração de alginato e agitação sem
comprometer negativamente a relação atividade enzimática/produto.
Além disso, pelos coeficientes não significativos das interações entre as variáveis
(p menor que o nível de significância α = 0,05) pode-se estimar que de forma geral o efeito
dos parâmetros operacionais e suas interações na atividade enzimática não são dependentes
para a resposta da atividade enzimática no biorreator dentro da faixa estudada. Logo, para
obter informações mais concisas das reações enzimáticas em biorreator, foram analisados os
resultados deste planejamento e fixados parâmetros para dar sequência ao estudo utilizando
ensaios univariados avaliando a concentração de enzima na reação.
Tabela 3.6 Coeficientes de regressão do DCCR para determinação da atividade enzimática

após 30, 60 e 90 minutos de reação.
Coficientes Erro Padrão T(14) P
Tempo de reação 30’ 60’ 90’ 30’ 60’ 90’ 30’ 60’ 90’ 30’ 60’ 90’
Média 0,349 1,133 0,61 0,06 0,284 0,140 6,27 3,987 4,356 0,008 0,001 0,001
Alginato (L) -0,007 0,030 -0,008 0,023 0,116 0,057 -0,31 0,255 -0,131 0,771 0,802 0,898
Alginato (Q) 0,017 0,191 0,098 0,023 0,116 0,057 0,746 1,643 1,720 0,510 0,124 0,109
Temp(L) 0,054 0,343* 0,177* 0,023 0,116* 0,057 2,398 2,955* 3,090 0,096 0,011* 0,009*
Temp (Q) -0,009 0,110 0,062 0,023 0,116 0,057 -0,401 0,948 1,086 0,715 0,360 0,297
Enzima(L) -0,086* -0,45* -0,23* 0,023* 0,116* 0,057* -3,8* -3,88* -4,023 0,032* 0,002* 0,001*
Enzima (Q) -0,004 0,041 0,016 0,023 0,116 0,057 -0,18 0,357 0,277 0,867 0,727 0,786
Agitação (L) 0,018 0,080 0,04 0,023 0,116 0,057 0,809 0,688 0,7 0,478 0,503 0,496
Agitação (Q) -0,005 0,003 -0,022 0,023 0,116 0,057 -0,239 0,027 -0,379 0,827 0,978 0,711
AlgXTemp -0,014 0,013 -0,036 0,028 0,142 0,070 -0,522 0,093 -0,518 0,638 0,928 0,613
AlgXEnzima -0,019 -0,180 -0,088 0,028 0,142 0,070 -0,674 -1,265 -1,250 0,549 0,228 0,233
AlgXAgit 0,0002 0,013 0,01 0,028 0,142 0,070 0,009 0,094 0,143 0,993 0,927 0,889
TempXConc 0,009 -0,042 -0,018 0,028 0,142 0,070 0,330 -0,293 -0,250 0,763 0,774 0,806
TempXAgit 0,004 0,021 0,010 0,028 0,142 0,070 0,14 0,149 0,143 0,899 0,884 0,889
ConcXAgit -0,002 0,005 0,016 0,028 0,142 0,070 -0,066 0,033 0,232 0,952 0,974 0,820
*valores significativos a um intervalo de confiança de 95%.
Os valores destacados são significativos a um intervalo de confiança de 95%,

constatando que, quase em sua totalidade, os parâmetros estudados não foram significativos.
A partir das variáveis significativas, efetuou-se análise de variância (ANOVA) obtendo como
R2 o valor de 0,41 (30 minutos), 0,56 (60 minutos) e 0,46 (90 minutos), indicando assim que,
respectivamente, apenas 41%, 56% e 46% da variabilidade na resposta podem ser explicadas
pelo modelo. Este valor é considerado insatisfatório para obtenção de um modelo válido e útil
para fins preditivos.
97

Foi mensurado o teor de proteína nos meios de reação para verificação do

comportamento de fuga (Eficiência Relativa) e os dados estão apresentados na Tabela 3.7
apenas a concentração de alginato foi significativa nessa resposta.
Tabela 3.7 Coeficientes de regressão do DCCR 24 para Eficiência Relativa de imobilização

após 30, 60 e 90 minutos de reação.
Coficientes Erro Padrão T(14) P
Tempo de 30’ 60’ 90 30’ 60’ 90’ 30’ 60’ 90’ 30’ 60’ 90’
reação
Média 98,02 97,58 97,01 3,91 3,88 4,14 25,1 25,15 23,45 0,00 0,00 0,00
Alginato (L)* 3,95 3,95 4,19 1,59 1,58 1,69 2,48 2,49 2,48 0,03 0,03 0,03
Alginato (Q)* -4,38 -4,36 -4,58 1,59 1,58 1,69 -2,75 -2,75 -2,71 0,02 0,02 0,02
Temp(L) -0,02 -0,06 -0,10 1,59 1,58 1,69 -0,01 -0,04 -0,06 0,99 0,97 0,96
Temp (Q) 0,86 0,82 0,91 1,59 1,58 1,69 0,54 0,52 0,54 0,60 0,61 0,60
Enzima(L) -0,28 -0,29 -0,23 1,59 1,58 1,69 -0,17 -0,18 -0,14 0,87 0,86 0,89
Enzima (Q) 0,90 0,88 0,92 1,59 1,58 1,69 0,56 0,55 0,55 0,58 0,59 0,59
Agitação (L) -0,12 -0,11 -0,13 1,59 1,58 1,69 -0,08 -0,07 -0,08 0,94 0,94 0,94
Agitação (Q) 0,89 0,85 0,89 1,59 1,58 1,69 0,56 0,54 0,53 0,59 0,60 0,61
AlgXTemp -0,08 -0,04 -0,02 1,95 1,94 2,07 -0,04 -0,02 -0,01 0,97 0,98 0,99
AlgXEnzima 0,01 0,01 0,00 1,95 1,94 2,07 0,01 0,01 0,00 1,00 0,99 1,00
AlgXAgit -0,03 0,01 0,04 1,95 1,94 2,07 -0,02 0,00 0,02 0,99 1,00 0,99
TempXConc -0,05 -0,02 -0,01 1,95 1,94 2,07 -0,03 -0,01 -0,01 0,98 0,99 1,00
TempXAgit 0,03 0,04 -0,09 1,95 1,94 2,07 0,02 0,02 -0,05 0,99 0,99 0,96
ConcXAgit -0,08 -0,10 -0,13 1,95 1,94 2,07 -0,04 -0,05 -0,07 0,97 0,96 0,95
*valores significativos a um intervalo de confiança de 95%.
Apesar dos resultados obtidos não proporcionarem a geração de um modelo

matemático, a fixação dos parâmetros foi possível analisando a tendência dos resultados e
fatores como custos, facilidade na execução do processo e preservação máxima das
características do imobilizado. Podemos observar que nos intervalos superiores de
temperatura foram detectados os maiores valores de atividade enzimática, como no ensaio 20,
13 e 14. Já em relação à concentração de enzima, podemos observar que menores
concentrações de enzima em maiores temperaturas, como no ensaio 13 e 14 resultaram em
valores maiores de atividade enzimática, como por exemplo, o ensaio 1 e 2. No entanto, o
estudo já abordado sobre as condições mais adequadas para a imobilização de tanase
(SCHONS, 2012) demonstrou que este imobilizado apresenta maior estabilidade a 60°C, logo,
para o estudo univariado a temperatura foi fixada nesta faixa.
O alginato não teve efeito significativo sobre a atividade da enzima imobilizada. A
partir de estudos anteriores do grupo com a imobilização da tanase (SCHONS, 2012), quando
foram estudadas concentrações de alginato de até 3,6%, foi constatado que a maior
concentração era a de melhor resposta nos parâmetros testados. Observando estes dois fatos, o
98

valor de concentração de alginato foi fixado em 5% devido ser tecnicamente mais resistente,
com boa viscosidade para a imobilização da tanase e ter apresentado boa resposta quanto à
eficiência em todo delineamento experimental.
A atividade enzimática não teve influência significativa da agitação, então foi fixada
na menor agitação, 300 rpm, diminuindo o risco de danos físicos ao imobilizado e podendo
aumentar a vida útil do mesmo. Notou-se também que em 90 minutos já houve grande queda
da atividade enzimática, então foi optado por utilizar 60 minutos de reação de hidrólise no
biorreator.
3.4.2 Planejamento univariado
A partir do estudo DCCR com quatro parâmetros experimentais independentes e

críticos para a observação da hidrólise em biorreator, possibilitou que algumas condições
fossem fixadas e apenas a concentração de enzima imobilizada no biorreator fosse estudada
utilizando um estudo univariado, almejando-se encontrar sinais mais intensos e condições
mais favoráveis para as determinações das melhores condições para serem admitidas em um
biorreator.
Os resultados da atividade enzimática no estudo univariado podem ser visualizados na
Figura 3.6.
5
4.5
4
Atividade específica
3.5
(U/mg proteína)
3 0,1%
2.5 0,25%
2 0,5%
1.5 0,75%
1 1%
0.5
0
0 10 20 30 40 50 60 70
Tempo (minutos)
Figura 3.6. Comportamento da atividade específica em estudo univariado com 5

concentrações de imobilizado enzimático no meio reacional.
99

De acordo com o conjunto de resultados obtidos, o efeito negativo da concentração de

imobilizado enzimático visualizado anteriormente em relação à atividade enzimática se
manteve até a concentração de 0,75%, já concentrações menores apresentaram, também,
menor atividade enzimática, ou seja, concentrações menores de 0,75% no biorreator implica
em menor concentração do complexo enzima/substrato, diminuindo a conversão enzimática.
Como podemos visualizar na Figura 3.7, a maior conversão de ácido tânico em ácido
gálico ocorreu na concentração de 0,75% em que foi obtido 152µmol de ácido gálico em 300
mL de meio reacional (0,50 µmol/mL) e atividade específica de 4,35 (U/mg de proteína). Nos
demais ensaios a conversão em ácido gálico variou entre 23 à 91 µmol e a atividade específica
variou entre 1,98 à 3,91, exceto no ciclo de hidrólise utilizando 1% de imobilizado
enzimático, em que foi obtido 149µmol de ácido gálico, resultados de ácido gálico bem
próximos utilizando concentração menor de enzima, ou seja, menor custo, com melhor
atividade enzimática.
180
160
140
µmol de ácido gálico
120
0,1%
100
0,25%
80 0,5%
0,75%
60
1%
40
20
0
0 10 20 30 40 50 60 70
Tempo (minutos)
Figura 3.7 Comportamento da hidrólise de ácido tânico em ácido gálico em estudo
univariado com 5 concentrações de imobilizado enzimático no meio reacional.
Outro fator que foi avaliado e que também mensura a qualidade do sistema enzima
imobilizada/biorreator é a eficiência relativa (Tabela 3.8). Esse parâmetro avalia qual a
porcentagem de enzima é perdida para o meio reacional e qual percentual é mantida nas
cápsulas de alginato.
100

Tabela 3.8 Eficiência Relativa (%) avaliada através da mensuração da proteína transferida
para o meio reacional, em estudo univariado com 5 concentrações de imobilizado enzimático.
Concentração de alginato Eficiência Relativa (%)
0,1% 99,90 ± 0,259a
0,25% 99,88 ± 0,097a
0,5% 99,66 ± 0,083a
0,75% 99,80 ± 0,77a
1% 99,70 ± 0,057a
Resultados expressos como média ± desvio padrão.
Letras iguais em uma mesma coluna não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey (p≤0.05).
Foram obtidos promissores resultados, demonstrando que o sistema foi capaz de

manter a enzima imobilizada em cápsulas de alginato, portanto a eficiência não é um
parâmetro limitante na escolha da concentração enzimática. A partir desses dados foi admitido
que a melhor concentração a ser utilizado no biorreator é de 0,75%.
4. Conclusão
Os resultados obtidos neste trabalho indicam o potencial da utilização da tanase

imobilizada em biorreator de batelada como processo viável para obtenção de hidrolisados
fenólicos.
A tanase imobilizada em alginato apresenta propriedades catalíticas interessantes e
diferentes da enzima livre. Estas diferenças podem estar relacionadas com o coeficiente de
difusão de massa através das células imobilizadas e alterações conformacionais da proteína,
bem como a interação do substrato com a matriz polimérica. Foi possível estimar parâmetros
cinéticos da enzima imobilizada de regressão linear com altos coeficientes de correlação. A
enzima imobilidada em alginato 5% apresentou melhores propriedades cinéticas: Km=
3,23µmol, Vmáx = 1,15 U.mg-1. A partir dos dados obtidos de Kd (0,5h-1) e t½ (1,48h) pode-
se constatar que a imobilização da tanase em alginato 5% permitiu boa estabilidade quanto à
temperatura de 60ºC. Outras propriedades obtidas das cápsulas de enzima como a
possibilidade de recuperação e utilização em bateladas consecutivas comprovam que a tanase
imobilizada de Paecilomyces variotii é um biocatalisador interessante, com potencial
aplicação em processos industriais.
101

O desenvolvimento do modelo de biorreator foi capaz de produzir, em maior escala,

ácido gálico a partir da hidrólise de ácido tânico, podendo ser utilizado em matrizes
alimentares sem que necessite a permanência da enzima no produto final. O DCCR
apresentou baixa correlação, com R2 de 0,41 (30 minutos), 0,56 (60 minutos) e 0,46 (90
minutos), porém foi importante no auxilio da melhor estratégia para dar sequência à
construção do biorreator com o estudo univariado. Os estudos do biorreator com tanase
imobilizada permitiram selecionar as condições mais adequadas para a hidrólise utilizando
ácido tânico como substrato: alginato na concentração de 5%, 300 rpm de agitação,
temperatura de 60ºC e concentração do imobilizado enzimático de 0,75%. O trabalho permitiu
encontrar um processo em biorreator para hidrólise utilizando tanase imobilizada com alta
produtividade e eficiência.
102

5. Referências
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106

CAPÍTULO III
Hidrólise de fenólicos de variados tipos de chás por tanase imobilizada e efeito no perfil
fenólico, atividade antioxidante e estabilidade em ambiente gastrointestinal simulado
(Artigo a ser submetido à revista Food Chemistry)
107

Hidrólise de fenólicos de variados tipos de chás por tanase imobilizada e efeito no perfil
fenólico, atividade antioxidante e estabilidade na digestão gastrointestinal simulada
Phenolics hydrolysis of various types of tea by immobilized tannase and phenolic profile,
antioxidant activity and stability under simulated gastrointestinal digestion effect
Bruna Sampaio Roberto1*; Gordon J. McDougall3; J. William Allwood3; Derek Stewart3;
Livia Dias de Queirós; Isabela Mateus Martins1; Gabriela Alves Macedo2
1Food Science Department, College of Food Engineering, Campinas State University,

3 Environmental and Biochemical Sciences Group, Enhancing Crop Productivity and
Utilisation Theme, The James Hutton Institute, Dundee, United Kingdom.
*
108

RESUMO
Os polifenóis, ou compostos fenólicos, amplamente encontrados em chás, estão relacionados

à prevenção de câncer e doenças crônicas. No entanto, os polifenóis ocorrem frequentemente
como glicosídeos ou outros conjugados, minimizando a biodisponibilidade e os efeitos
benéficos destes compostos à saúde, sendo necessária a biotransformação destes conjugados
no trato gastrointestinal. Como alternativa tecnológica, a biotransformação enzimática dos
polifenóis ou de suas fontes vegetais, fora do trato gastrointestinal também pode liberar estes
compostos de seus conjugados e consequentemente, melhorar a atividade funcional de tais
antioxidantes. O objetivo deste trabalho foi avaliar o perfil fenólico e atividade antioxidante in
vitro bem como elucidar a recuperação de compostos fenólicos após a simulação da digestão
in vitro de chás biotransformados por tanase imobilizada. O estudo da eficiência da enzima
imobilizada em hidrolisar polifenóis em chás branco, preto, verde e mate foi avaliado por
HPLC-ESI-MS e a quantificação dos principais polifenóis foi realizada por HPLC-DAD. As
alterações na atividade antioxidante dos chás biotransformados foram avaliadas pelos
métodos in vitro ORAC, DPPH e FRAP e a estabilidade dos polifenóis foi avaliada a partir de
métodos padronizados da simulação de digestão in vitro. Os resultados demonstraram que a
enzima imobilizada é capaz de hidrolisar principalmente ácido clorogênico, as catequinas
EGCG, GCG e ECG e a rutina. A quantificação permitiu visualizar que o aumento mais
significativo foi de ácido gálico, 16 vezes no chá verde e 13 vezes no chá branco. No chá
verde também se observou a diminuição em 75% do teor de EGCG, com consequente
aumento de EGC (70%) e 95% de hidrolise de ECG com o conteúdo de EC aumentando mais
que 2 vezes. Já no chá preto e chá branco houve a hidrólise de 91% e 75% da ECG,
respectivamente. O chá mate apresentou relevante hidrólise de ácido clorogênico (54%)
resultando no aumento do ácido cafeico (4,3 vezes). Essa modificação no perfil fenólico dos
chás pela tanase imobilizada resultou também no aumento da atividade antioxidante avaliados
pelo método ORAC e DPPH e nos chás branco e verde também através do método (FRAP).
Os compostos fenólicos dos chás exibiram estabilidade às condições digestivas gástricas
simuladas embora tenha apresentado pobre estabilidade após a simulação das condições
intestinais, demonstrando a importância do consumo dos fenólicos já na porção aglicona ou
em moléculas menores. Os resultados indicaram que a tanase mesmo imobilizada foi eficaz
para transformar o perfil fenólico dos chás e aumentar o poder antioxidante mostrando ser
possivelmente utilizada para modificar o perfil de bioativos e até mesmo aumentar a extração

109

comercial dos polifenóis de matrizes complexas. Além disso, os resultados sugerem que é
mais desejável seguir o modelo de hidrólise com tanase imobilizada para fornecer fontes de
bioativos com potencial de bioacessibilidade melhorado.
Palavras chave: polifenóis, chás, biotransformação, tanase imobilizada, bioacessibilidade.

110

ABSTRACT
Polyphenols, or phenolic compounds, widely found in teas, are related to the prevention of
cancer and chronic diseases. However, polyphenols often occur as glycosides or other
conjugates, minimizing thebioavailability and beneficial effects of these compounds on
health, requiring the biotransformation of these conjugates in the gastrointestinal tract. As a
technological alternative, the enzymatic biotransformation of the polyphenols or their plant
sources outside the gastrointestinal tract can alsorelease these compounds from their
conjugates and consequently improve the functional activity of such antioxidants. The
objective of this work was to evaluate the phenolic profile and antioxidant activity in vitro as
well as to elucidate the recovery of phenolic compounds after the biotransformed
teas byimmobilized tannase in vitro digestion simulation. The study of the enzyme
immobilized efficiency in hydrolyzing polyphenols in white, black, green and mate teas was
evaluated by HPLC-ESI-MS and the quantification of the main polyphenols was performed
by HPLC-DAD. The changes in the antioxidant activity of the biotransformed teas were
evaluated by the in vitro methods ORAC, DPPH and FRAP and the stability of the
polyphenols was evaluated using standard in vitro digestion simulation methods. The results
demonstrated that the immobilized enzyme is capable of hydrolyzing mainly chlorogenic
acid, the catechins EGCG, GCG and ECG and the routine. The quantification showed that the
most significant increase was gallic acid, 16 times in green tea and 13 times in white tea.
Green tea also showed a 75% decrease in EGCG content, with a consequent increase in EGC
(70%) and 95% ECG hydrolysis with EC content increasing more than 2-fold. In black tea
and white tea, there was hydrolysis of 91% and 75% of ECG, respectively. Mate tea showed a
significant chlorogenic acid hydrolysis (54%) resulting in an increase in caffeic acid (4.3
times). This teas’ phenolic profile modification by the immobilized tannase also resulted in
antioxidant activity’s increase evaluated by the ORAC and DPPH method and in the white
and green teas also through the FRAP method. The teas’ phenolic compounds exhibited
stability to the simulated gastric digestive conditions, although they presented poor stability
after the intestinal conditions’ simulation, demonstrating the importance of the phenolic
consumption in the aglycone portion or in smaller molecules. The results indicated that the
same immobilized tannase was effective to transform the teas’ phenolic profiled to increase
the antioxidant power, showing that it is possibly used to modify the profile of bioactive and
to even increase the commercial extraction of polyphenols from complex matrices. In

111

addition, the results suggest that it is more desirable to follow the hydrolysis model with
immobilized tannase to provide bioactive sources with improved bioavailability potential.
Keyword: polyphenols, teas, biotransformation, immobilized tannase, accessibility.

112

1. Introdução
Os fitoquímicos têm sido extensivamente estudados devido sua importância como

compostos bioativos e seus efeitos positivos na saúde, seja por mecanismos complementares
ou sinérgicos, podem estar relacionados com suas propriedades em nível do trato
gastrointestinal, atividade antiviral, antibacteriana, anti-inflamatória, antialérgica,
antimutagência/anticarcinogênica, anticolesterolêmica e atividade antioxidante (CHENG;
LIN; LIN, 2002). Muitos desses estudos químicos foram realizados em chás de Camellia
sinensis, por conterem vários antioxidantes, incluindo os polifenóis catequina, monômeros de
flavonoides e compostos análogos como epigalocatequina galato, epigalocatequina,
epicatequina galato e epicatequina, teaflavina e grupos poliméricos tearubiginas (VARILEK
et al., 2001; RAHMAN; BISWAS; KIRKHAM, 2006). Estudos biológicos têm indicado que
EGCG, um dos principais componentes fenólicos do chá, é o mais benéfico para a saúde
humana, embora muitos dos outros componentes fenólicos também tenham demonstrado
benefícios à saúde (MURASE et al., 2002; RAMÍREZ et al., 2008). Erva Mate (Ilex
paraguariensis), espécie de planta nativa da região subtropical da América do Sul, é um
importante alimento vegetal rico em compostos antioxidantes, que podem agir como
adjuvantes na prevenção e evolução de alguns tipos de câncer. Várias propriedades
farmacológicas desta planta foram atribuídas à presença de compostos fenólicos,
principalmente o ácido clorogênico. A literatura está bem documentada sobre seus efeitos
antioxidantes (BRAVO; GOYA; LECUMBERRI, 2007; MARTINS et al., 2009;
MATSUMOTO et al., 2009; BOAVENTURA et al., 2012, 2013a, 2013b; CRISTINA et al.,
2015), antiobesidade (ARÇARI et al., 2009, 2011, 2013; GOSMANN et al., 2012) e suas
propriedades quimiopreventivos (RAMIREZ-MARES; CHANDRA; MEJIA, 2004; MEJIA et
al., 2005; MIRANDA et al., 2008). No entanto, fatores limitantes dos efeitos biológicos são a
má absorção, transporte transcelular pobres e metabolismo rápido, seguida de excreção
(MANACH; DONOVAN, 2004).
Tanase (acilo hidrolase tanino, E.C 3.1.1.20) é uma importante hidrolase que tem
muitas aplicações potenciais, entre as quais uma é facilitar a biotransformação de catequinas
de chá, podendo aumentar sua atividade antioxidante. Ao hidrolisar a ligação '' éster '', assim
como ligações '' depsidase '' de fenólicos em chás podem liberar agliconas e compostos
fenólicos simples, flavonoides (quercetina, miricetina) e ácidos fenólicos, que são capazes de
serem diretamente absorvidos através da mucosa do intestino delgado (BRAVO, 1998;

113

MANACH; DONOVAN, 2004). Apesar dessa importante aplicação da tanase, a sua

utilização em larga escala é limitada devido aos altos custos de produção e conhecimentos
insuficientes da enzima. A imobilização de enzimas é um método utilizado para superar as
limitações do emprego de enzimas livres e várias tentativas têm sido feitas para imobilizar
tanase em uma matriz adequada (BOADI; NEUFELD, 2001; HOTA; DUTTA; BANERJEE,
2007; EL-TANASH; SHERIEF; NOUR, 2011; FLORES-MALTOS et al., 2011; YAO et al.,
2014). Considerando que a tanase pode fornecer bioativos mais biodisponíveis, é interessante
saber a estabilidade destas moléculas no trato gastrointestinal uma vez que os polifenóis da
dieta tem que estar disponíveis após a digestão para então serem absorvidos. A atividade
antioxidante dos compostos bioativos e a sua estabilidade dependem de muitos fatores, tais
como a matriz do alimento, pH, temperatura, presença de inibidores ou potencializadores de
absorção, a presença de enzimas, metabolismo individual, e outros fatores relacionados
(TAGLIAZUCCHI et al., 2010). Por conseguinte, a capacidade de liberar os fitoquímicos da
matriz alimentar e sua resistência à digestão podem ser o primeiro passo para determinar a
absorção destes compostos. No entanto, há poucas informações disponíveis sobre a
biodisponibilidade e a permeabilidade intestinal de compostos fenólicos dos chás de Camellia
sinensis e Illex paraguariensis. O objetivo deste trabalho foi verificar se a hidrólise dos
polifenóis de diferentes chás pode aumentar a atividade antioxidante e a bioacessibilidade
destes fenólicos através da simulação da digestão in vitro.
2. Materiais e Métodos
2.1 Materiais
Todos os reagentes utilizados foram grau analítico ou de grau HPLC. A água utilizada
foi água ultrapurificada grau HPLC, obtida do sistema de purificação de água Milli-Q
(Millipore Merck, Darmstadt, Alemanha). O cloreto de cálcio, acetona, metanol, cloreto
férrico hexa-hidratado, fosfato de sódio, alginato (sal de sódio do ácido algínico), a pepsina,
pancreatina, sais biliares, carbonato de sódio, ácido fórmico, 2,2-difenil-1-picrilhidrazil
(DPPH), 2,2'- azobis (2-amidinopropano) (AAPH), 4,6-tripryridyl-s-triazina (TPTZ) foram
adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA); fosfato de sódio monobásico e dibásico,
cloreto de cálcio obtidos da LabSynth (Diadema, Brasil); fluoresceína e acetato de sódio da
Ecibra (São Paulo, Brasil); 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico (Trolox) da

114

Acros Organics (Geel, Bélgica); Acetonitrila e ácido fórmico para análise HPLC-MS foram
comprados da Optima ™ (Fisher Scientific Ltd., Loughborough, Leicestershire, Reino Unido)
e os padrões de polifenóis foram obtidos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA) com
exceção do ácido clorogênico e epigalocatequina galato utilizados da Extrasynthèse S.A.
(Genay, França).
2.2 Chás e preparação dos extratos
Chá preto (CP), chá verde (CV), chá branco (CB), chá mate (CM): da marca Leão®
foram adquiridos no mercado local (Campinas, SP, Brasil).
Em béqueres foram pesados 30g de cada amostra de chá e em seguida foram
adicionados 450 mL de tampão fosfato 20 mM, pH 5,5. A extração de compostos de chá
preto, verde, mate e branco foi realizada num banho de água a 100 ° C durante 30 min. Para
obter extratos antes e após biotransformação, as extrações foram realizadas em duplicata.
Depois dos extratos serem filtrados em papel filtro, os extratos originais foram liofilizados e o
extrato seco resultante foi chamado de extrato de chá original e utilizado em análises futuras,
a respectiva duplicada foi utilizada na biotransformação dos polifenóis. Este modelo permite
comparar os dados da atividade antioxidante de chás biotransformadas usando enzima livre
(MACEDO et al., 2011).
2.3 Imobilização da tanase e biotransformação enzimática
A imobilização utilizando tanase de Paecilomyces variotii obtido de acordo com

procedimento publicado anteriormente (BATTESTIN; MACEDO, 2007). A encapsulação foi
realizada utilizando o método modificado descrito por Schons et al. (2011). Uma solução de
alginato de sódio a 5% foi preparada utilizando um agitador orbital (200 rpm durante 1 hora),
em seguida, 54 mg de tanase foi misturado em 15 mL de alginato de sódio 5% (3,6 mg de
tanase/mL). A suspensão foi adicionada gota a gota com auxílio de uma seringa a uma
distância de 12 cm da solução contendo 90 mL de cloreto de cálcio (0,1 M). As cápsulas
obtidas foram estabilizadas por armazenamento na solução de cloreto de cálcio durante a noite
a 7ºC, em seguida, separados por peneira, lavou-se com 200 mL de água destilada a 10°C e
então foram mantidas em placas de Petri cobertas com filme plástico e sob-refrigeração.

115

Para o tratamento enzimático dos extratos de chá (300 mL de extrato em tampão

fosfato 20 mM, pH 5,5) foram biotransformados com 0,75% de tanase imobilizada a 60 ° C
durante 2h, com agitação magnética a 300 rpm. No final da reação, a enzima imobilizada foi
recolhida por filtração e os extratos de chá biotransformados foram liofilizados e usados em
análises futuras.
2.4 Caracterização do perfil de fenólicos dos chás por HPLC-ESI/MS e

quantificação dos principais compostos fenólicos por HPLC-DAD
As amostras controle e biotransformadas dos chás antes e após digestão tiveram sua
composição avaliada por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a um espectrômetro
de massas (HPLC-MS). A quantificação dos principais fenólicos presentes nos chás foi
realizada com base em curvas de calibração do padrão analítico avaliados por cromatografia
de alta eficiência acoplada a um detector de arranjo de diodos (HPLC-DAD).
2.4.1 Caracterização do perfil de fenólicos dos chás por Cromatografia

Líquida de alta eficiência acoplada ao espectometro de massas - (HPLC/ESI-MS)
Os extratos foram transferidos para frascos analíticos equipados com filtro PTFE de
0,45µM e com tampas de silicone com septos previamente cortados (Thomson Ltd.
Oceanside, Califórnia, EUA). As amostras foram armazenadas no injetor automático a 6°C e
analisadas em ambos os modos negativos e positivos de ionização por eletrospray (ESI). As
análises por HPLC foram realizadas com um sistema de HPLC da Thermo 600 Accela
acoplado à um detector de PDA Accela (Thermo Fisher-Ltd. Hemel Hempstead U.K.). O
HPLC foi operado a uma velocidade de fluxo de 300 µL / min, a coluna (C18 Synergi Hydro-
RP 80A, 150x2.0mm, 4µm de dimensão de partícula; Phenomenex Ltd., Macclesfield, Reino
Unido) foi mantida a temperatura de 30ºC. O solvente A, água deionizada (ELGA-PureLab
option-Q, Elga Ltd., High Wycombe, Reino Unido), e solvente B, acetonitrila de grau HPLC
foram acidificados com ácido fórmico 0,1% grau de espectrometria de massa. O gradiente
utilizado foi o seguinte: 98% de A (0-2 min), 98-95% de A (2-5 min), 95-55% de A (5-25
min), 55% de A - 100% de B (25-26 min), mantido 100 % B (26-29 min), 100% B - 98% A
(26-30 min), manteve-se 98% A (30-35 min). O eluente da coluna foi monitorado pelo
detector Accela PDA onde espectros foram coletados no comprimento de onda de 200 à

116

600nm e então transferidos para o sistema de espectrometria de massa Thermo LTQ-Orbitrap

XL operado pelo software Xcalibur (Thermo-Fisher Ltd. Reino Unido). Os espectros de
massa foram coletados principalmente em modo para verificação completa (m/z 80-2000)
com resolução de massa de 30000 (FWHM definido para m/z 400), posteriormente a
verificação secundária foi aplicada para obter os dados de MS2, que corresponde ao espectro
de fragmentação com base em um único íon mais intenso, definido na verificação completa
preliminar, ambas verificações geraram perfis com dados espectrais. A presença de compostos
fenólicos foi confirmada com base na comparação dos dados de m/z e MS2 com os valores na
literatura e em relação aos padrões (DUNN et al., 2008; BROWN et al., 2009).
2.4.2 Quantificação de compostos fenólicos por cromatografia líquida de

alta eficiência acoplada a um detector de arranjo de diodos (HPLC-DAD)
As análises individuais dos principais fenólicos foram realizadas utilizando um HPLC

DionexUltiMate 3000 (Alemanha), equipado comamostrador automático (WPS-3000(T)SL
Analytical), bomba quaternária (LPG-3400SD) e uma coluna C18 Atlantis® (Waters, 5 µm,
4.6 x 150 mm) acoplada a um detector UV/VIS (DAD-3000). A eluição em gradiente teve,
como fase móvel solvente A, água/ácido fórmico (99,9:0,1, v/v) e solvente B, metanol/ácido
fórmico (99,9:0,1, v/v). O gradiente linear obedeceu a condição de concentração de solvente
A de 95 % (0-5 min), 95-85% (5-20 min), 85-60% (20-50 min), 60-30% (45-65 min), 30-20%
(65-72 min), 20-95% (72-75), 95-100% (110-120 min). A velocidade de fluxo foi ajustada
para 0,5 mL / min. A identificação de compostos individuais foi realizada comparando o
tempo de retenção e espectro. Os compostos foram quantificados utilizando os picos a 280
nm, sendo os teores calculados utilizando curvas construídas com os padrões autenticados. Os
compostos dos extratos de chás (1g) foram diluídos em metanol 80%, extraídos por 40ºC em
ultrassom e então filtrados em filtros Millipore 0,45µm e injetados (20 µL) diretamente no
sistema cromatográfico. ara os padrões fenólicos, 1mg das amostras foram diretamente
dissolvidos em 800µL de metanol e 200 µL de água ultrapura e então filtrados em filtros
Millipore 0,45µm.
Os polifenóis analisados foram: Chá branco, preto e verde – ácido gálico,
epigalatocatequina galato, epigalocatequina, catequina, epicatequina galato, epicatequina,
quercetina e rutina. Chá mate – ácido gálico, ácido clorogênico, ácido cafeico, quercetina e
rutina.

117

2.5 Atividade Antioxidante
2.5.1 Capacidade de sequestrar o radical DPPH
A atividade antioxidante potencial do extrato de chá foi avaliado com base na

atividade captadora do estável radical livre 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH), de acordo com
Brand-Williams et al. (1995) e Macedo et al. (2011). O ensaio foi conduzido em triplicata, e a
atividade antioxidante foi calculada usando a equação de regressão linear determinada
representando graficamente a atividade antioxidante de soluções de concentrações conhecidas
de Trolox. A redução do radical DPPH é monitorada pela redução da absorbância no
comprimento de onda específico, quando em contato com uma substância que pode doar
hidrogênio. A atividade antioxidante foi expressa como µmol de Trolox equivalente/mg de
extrato de chá.
2.5.2 Teste de capacidade antioxidante do radical oxigênio – ORAC (Oxygen

Radical Antioxidant Activity)
Os ensaios ORAC realizados utilizaram fluoresceína (FL) como indicador

fluorescente, tal como descrito por Macedo et al. (2011). O teste ORAC automatizado foi
realizado num leitor de microplacas NOVOSTAR (BMG LABTECH, Alemanha) com filtros
de fluorescência para um comprimento de onda de excitação de 485nm e um comprimento de
onda de emissão de 520 nm. As medições foram feitas em uma placa COSTAR 96. A reação
foi realizada a 37 ° C e iniciada por decomposição térmica de AAPH e consequente produção
de radicais livres em tampão de fosfato 75 mM (pH 7,4), devido à sensibilidade de FL ao pH.
As medições foram realizadas em triplicata. Valores de ORAC foram definidos como a
diferença entre a área sob a curva de decaimento FL e o branco (AUC líquida). Equações de
regressão entre AUC líquida e concentração antioxidante foram calculados para todas as
amostras. Valores de ORAC-FL foram expressos como µmol equivalente Trolox/g de extrato
de chá (CAO; SOFIC; PRIOR, 1996).
2.5.3 Poder redutor do íon ferro – FRAP

118

O ensaio FRAP foi realizado de acordo com o procedimento do (BENZIE; STRAIN,

1996). O ensaio foi realizado em triplicata e as absorbâncias medidas a 593 nm a 37 ° C,
sendo monitorado em uma cinética de 4 min. Os resultados estão expressos como µmol de
Trolox equivalente/g de extrato de chá.
2.6 Digestão in vitro
Este procedimento in vitro é similar a digestão no trato digestivo superior e foi

adaptado a partir do método descrito por (MCDOUGALL et al., 2005). O método consiste em
dois passos sequenciais: pepsina/HCl iniciam a digestão, durante 2 h a 37 ° C para simular as
condições gástricas, seguido por uma digestão com sais biliares e pancreatina durante 2 h a 37
° C para simular as condições do intestino delgado.
Os extratos de chá foram diluídos com água destilada até o volume de 20 mL, para
obter uma concentração de 2 mg / mL. As amostras tiveram o pH de 1,7 ajustado com HCl 1
M, e assim 100µL de pepsina (315U/ml) foi adicionado, para em seguida, serem incubadas a
37 ° C em banho-maria durante 2 h, com agitação a 100 rpm. Depois de 2 horas, alíquotas de
2 mL foram removidos e congelados, representando amostras pós digestão gástrica (IVG). O
restante foi colocado em béquer de 250 mL, e foi adicionado 4,5mL da mistura de pancreatina
(4 mg/mL) e sais biliares (25 mg/mL). Tubo de diálise de celulose (massa molecular de 12
kDa) contendo NaHCO3 suficiente para neutralizar a acidez titulável da amostra foi
adicionado em cada amostra, e o bequer foi selado com parafilme. A quantidade de NaHCO3
0,1M necessária para a neutralização de 18 mL do conteúdo pós digestão gástrica mais 4,5
mL de sais biliares/pancreatina foi definida como a acidez titulável. Após 2 h de incubação a
37 ° C, as amostras foram removidas da incubação. O filme foi removido, retirado o tubo de
diálise e despejado seu conteúdo no béquer. O pH de todas as soluções foi diminuido para
cerca de 1-2 utilizando HCl 1M.
As amostras, após digestão in vitro (IVD) foram submetidas ao procedimento de
extração em fase sólida (SPE) utilizado para concentrar as frações ricas em fenóis.
Resumidamente, as unidades de SPE (Strata C18-E, unidades GIGA, capacidade de 10 g)
foram sensibilizadas utilizando 80% de acetonitrila/20% de água ultrapura contendo 0,1% de
ácido fórmico, e depois equilibrada em ácido fórmico 0,1% em água ultrapura. Cada amostra
foi aplicada ao sistema e o material não ligado foi descartado. As unidades de SPE foram
lavadas 2 vezes com ácido fórmico 0,1%. Os extratos ligados, ricos em polifenóis, eluiram-se

119

com acetonitrila. Após a medição do teor de fenóis, os extratos foram evaporadas até à secura
em Speed Vac. As amostras foram congeladas para análise posterior em HPLC.
2.7 Análise estatística
Todas as medições foram realizadas em triplicata. Os resultados são apresentados

como médias ± desvio padrão. O efeito significativo do tratamento enzimático em chás foram
avaliados utilizando oneway ANOVA, seguido de um teste Post hoc que melhor avaliou cada
dado coletado. As análises estatísticas foram realizadas utilizando software STATISTICA
versão 8.0 (StatSoft. Inc. (2007), Tulsa, OK, EUA).
3. Resultados e Discussão
3.1 Detecção, identificação e quantificação dos compostos extraídos de chás
3.1.1 Caracterização dos chás através da detecção e identificação por

Cromatografia Líquida de alta eficiência acoplada ao espectometro de massas -
(HPLC/ESI-MS)
Os resultados obtidos por cromatografia líquida de alta eficiência para analisar a

biotransformação em chás branco, verde e preto estão ilustrados na Figura 3.1. E o resultado
cromatográfico do perfil fenólico resultante da biotransformação da tanase em chá mate está
na Figura 3.2.

120

013_wt_01 24/04/2015 03:04:50
RT: 0,07 - 24,40

100
FSD = 1.08E6 NL:
1,08E6
A Channel A
90 UV
4 008_Wo_0
80 1
24 NL:
1,09E6
70 Channel A
28
UV
013_wt_01
60
uAU
50
40 27
17 46-53
30 35-40
12+14 41
21-23
20 1 55-63
32
5 8 9
3 30 34 66
10 2 65
42
0
017_gt_02 2 4 6 8 1024/04/2015
1205:27:36 14 16 18 20 22 24
Time (min)
RT: 0,00 - 24,40
100 NL:
B FSD = 1.08E6 1,08E6
Channel A
90 28
24 UV
018_go_02
80 NL:
1,08E6
70 4 Channel A
UV
017_gt_02
60
uAU
50
43-53
40
27
17 41
35-40
30
32 55-63
20 1 5
21-23
2 30 34 42 65
3 14 66
10 8 9
0
023_bt_02 24/04/2015 09:01:46
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Time (min)
RT: 0,00 - 24,50
100 NL:
C FSD = 1.08E6 1,08E6

Channel A
90 UV
022_Bo_02
24
80 NL:
1,08E6
Channel A
70
UV
023_bt_02
60
50
4 20
40
16
30 26 28
54-63
41
9 37-38 45
20 5 10-14 17 51
32 64
2 23 27 66
10
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Time (min)
Figura 3.1 Análise HPLC-MS do (A) chá branco (B) chá verde (C) chá preto. Os traços dos
chás originais estão em azul e dos chás biotransformados estão em vermelho. Os traços estão
sobrepostos para identificar as diferenças no conteúdo fenólico.

121

RT: 0.11 - 22.32

100 NL:
FSD = 1.08E6 5.10E5
Channel A
90 UV
010_Mate_
80 01
NL:
5.10E5
70 Channel A
UV
60 015_mate_t
_01
50
40
30
20
10
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
Time (min)

Figura 3.2 Análise HPLC-MS do chá mate. Os traços dos chás originais estão em azul e dos
chás biotransformados estão em vermelho. Os traços estão sobrepostos para identificar as
diferenças no conteúdo fenólico.
O uso de espectrometria de massa, juntamente com a cromatografia líquida de alto

desempenho permitiu caracterização detalhada das alterações observadas através da
identificação dos compostos descritos nas tabelas 3.1, 3.2, 3.3, 3.4 baseadas nos dados de
fragmentação MS, juntamente com caracterizações em estudos anteriormente publicados e no
nível dos traços. Nesta tabela estão listados os picos identificados, os tempos de retenção
(TR), moléculas desprotonada/protonada ([M-H] - / [M + H] +), e o maior íon fragmentado
(NI/PI). Na figura 3.3 podemos analisar a comparação da área dos picos dos compostos com
maior expressividade.
Para fins biológicos, os mais importantes flavonoides dos chás obtidos de Camellia
sinensis são as catequinas e os seus produtos de fermentação, as teaflavinas. Elas têm sido
objeto de muitos estudos analíticos com cromatografia para otimizar a sua separação,
identificação e quantificação. Catequinas são os principais componentes fenólicos de chás,
especialmente o chá verde e branco, e (-)- epigalocatequina galato e (-)- epicatequina galato
são os mais proeminentes, como mostrado por Lin et al. (2008) e suportado neste estudo. (-)-
Epicatequinas e (-)-epigalocatequinas são os principais compostos fenólicos e catequina,
galocatequina, catequina galato, galocatequina galato estão presentes em concentrações
relativamente baixas.

122

de chá branco.
Pico nº Identificação do composto TR M/Z (M-H) MS2 Alteração
1 Ácido quínico 1.49 191 traços é
2 Ácido chiquímico 1.97 173 155 é
3 Galoil glicose 3.5 331 169, 271, 211 ê
4 Ácido gálico 4.5 169 125 é
5 Ácido 5-galoilquínico 6.1 343 191,169 é
8 Galocatequina 8.9 305 261, 279, 179, 174 é
9 Teobromina 9.1 +181 traços ó
11 Ácido 4-O-cafeoilquínico 9.1 353 174, 191, 112 ó
12 Ácido 3-O-cafeoilquínico 9.9 353 191 é
14 Dímero de galocatequina 10 609 traços é
17 EGC 11.2 305 287, 261, 179 ó
20 Prodelfinidina B 2-3’-O-galato 11.7 761 591, 609, 423, 305 ê
21 Catequina 11.7 289 245 é
22 Estrictinina 11.9 633 463, 301 ê
23 Ácido clorogênico 12.0 353 191, 179, 173 é
24 Cafeína 12.5 +195 138, 109 ó
27 EC 13.2 289 245, 205 é
28 EGCG 13.5 457 169, 331 ê
30 GCG 14.2 457 331, 305, 169 ê
32 Apigenina arabinosídeo glicosídeo 14.3 563 443, 473, 353 ê
34 Miricetina 3-O ramnosilglicosídeo 14.6 625 316, 271, 607 é
35 Miricetina 3-O- galactosídeo 14.7 479 316 é
37 Quercetina galactosil rutinosídeo 15 771 609, 301 ê
39 Quercetina glucosil rutinosídeo 15.2 771 301, 609 ê
40 Quercetina diramnosilglicosídeo 15.5 755 609, 301, 463 é
41 ECG 15.7 441 289, 169, 331 ê
42 Quercetina-3-O-rutinosídeo (Rutina) 15.7 609 301, 271 ê
46 Kaempferol 3-O-glicosilrutinosídeo 16.2 755 593, 285 é
48 Kaempferol 3-O- ramnosilgalactosídeo 16.8 593 285; 447 é
49 Kaempferol 3-O-galactosídeo 16.9 447 284 é
51 Kaempferol 3-O-glicosídeo 17.3 447 285 ê
53 Miricetina 18.3 317 traços é

123

55 Quercetina hexose ramnose coumaroil pentose 19.3 1049 903, 887, 745, 301 ê
hexose
56 Ácido dicafeoilquínico 19.38 516 443, 353 ó
57 Quercetina 3-O-acilglicosídeo 19.38 1033 887, 301 é
58 Dihidroquercetina 3-O-ramnosídeo 19.6 450 377, 301 é
59 Kaempferol glucosil ramnosil p-coumaroil 19.6 901 755, 828, 285 é
hexosil hexoside
60 Quercetina ramnose coumaroil pentose hexose 19.7 887 741, 301 é
62 Quercetina 3-O- acilglicosídeo 19.9 1033 887, 741, 301 ê
63 Kaempferol tri glicosídeo acilado 20.6 871 725, 585, 431, 285 é
65 Quercetina 21 301 traços é
66 Kaempferol 23.6 285 traços é
Os dados se referem aos resultados de LC-MS. A última coluna mostra se há aumento do composto conforme estimado pela área do pico
PDA (teste t, p<0,05). Os símbolos representam: éaumento; ê diminuição; ó nenhuma mudança; e + modo positivo.
de chá verde.
1 Ácido quínico 1.49 191 traços é
3 Galoil glicose 3.5 331 169, 271, 211 ó
5 Ácido 5-galoilquínico 6.1 343 191,169 ó
8 Galocatequina 8.9 305 261, 279, 179, 174 é
9 Teobromina 9.1 +181 traços ó
12 Ácido 3-O-cafeoilquínico 9.9 353 191 é
17 EGC 11.2 305 287, 261, 179 é
20 Prodelfinidina B 2-3’-O-galato 11.7 761 591, 609, 423, 305 ê
21 Catequina 11.7 289 245 é
22 Estrictinina 11.9 633 463, 301 ê
23 Ácido clorogênico 12.0 353 191, 179, 173 é
24 Cafeína 12.5 +195 138, 109 ó
27 EC 13.2 289 245, 205 é
28 EGCG 13.5 457 169, 331 ê

124

30 GCG 14.2 457 331, 305, 169 ê

34 Miricetina 3-O ramnosilglicosídeo 14.6 625 316, 271, 607 é
35 Miricetina 3-O- galactosídeo 14.7 479 316 é
39 Quercetina glucosil rutinosídeo 15.2 771 301, 609 ê
40 Quercetina diramnosilglicosídeo 15.5 755 609, 301, 463 é
41 ECG 15.7 441 289, 169, 331 ê
42 Quercetina-3-O-rutinosídeo (Rutina) 15.7 609 301, 271 ê
43 Catequina galato 16.1 441 289, 169, 331 ê
44 Quercetina 3-O-galactosídeo 16.1 463 301 ê
46 Kaempferol 3-O-glicosilrutinosídeo 16.2 755 593, 285 ê
48 Kaempferol 3-O- ramnosilgalactosídeo 16.8 593 285; 447 ó
49 Kaempferol 3-O-galactosídeo 16.9 447 284 ê
53 Miricetina 18.3 317 traços é
55 Quercetina hexose ramnose coumaroil 19.3 1049 903, 887, 745, 301 é
pentose hexose
58 Dihidroquercetina 3-O-ramnosídeo 19.6 450 377, 301 é
59 Kaempferol glucosil ramnosil p-coumaroil 19.6 901 755, 828, 285 ó
hexosil hexoside
60 Quercetina ramnose coumaroil pentose 19.7 887 741, 301 é
hexose
62 Quercetina 3-O- acilglicosídeo 19.9 1033 887, 741, 301 ó
63 Kaempferol tri glicosídeo acilado 20.6 871 725, 585, 431, 285 ó
65 Quercetina 21 301 traços é
66 Kaempferol 23.6 285 traços é
de chá preto.

125

5 Ácido 5-galoilquínico 6.1 343 191,169 ê

8 Galocatequina 8.9 305 261, 279, 179, 174 é
9 Teobromina 9.1 +181 traços ê
10 Hidroxiteaflavina 9.1 581 563, 545, 395, 257 ê
12 Ácido 3-O-cafeoilquínico 9.9 353 191 ê
13 Metil éster de ácido gálico 10 183 168, 139, 124 é
16 Teasinensina 10.8 761 591, 609, 623 ê
17 EGC 11.2 305 287, 261, 179 é
20 Prodelfinidina B 2-3’-O-galato 11.7 761 591, 609, 423, 305 é
21 Catequina 11.7 289 245 é
22 Estrictinina 11.9 633 463, 301 ê
23 Ácido clorogênico 12.0 353 191, 179, 173 ê
24 Cafeína 12.5 +195 138, 109 ê
26 Teasinensina A ou D 12.7 913 743, 573 ê
27 EC 13.2 289 245, 205 é
28 EGCG 13.5 457 169, 331 ê
38 Vitexina – 4’-O-glicosídeo 15.1 593 413, 293 é
41 ECG 15.7 441 289, 169, 331 ê
45 Quercetina 3-O-glicosídeo 16.2 463 301 ê
54 Quercetina 3-O-acilglicosídeo 18.9 1063 917, 301 ê
58 Dihidroquercetina 3-O-ramnosídeo 19.6 450 377, 301 ê
59 Kaempferol glucosil ramnosil p-coumaroil 19.6 901 755, 828, 285 ê
hexosil hexoside
61 Teaflavina 19.9 563 545, 379, 241 ê
62 Quercetina 3-O- acilglicosídeo 19.9 1033 887, 741, 301 ê
64 Teaflavina – 3,3 – digalato 20.8 867 715, 697, 527, 389 ê
66 Kaempferol 23.6 285 traços ê

126

de chá mate.
4 Ácido gálico 4.5 169 125 ó
6 Ácido coumaroilchiquímico 7.4 319 341, 174, 371 é
7 Ácido cis-4-O-cafeoilquínico 8.4 353 174, 179, 191 é
9 Teobromina 9.1 +181 traços ê
11 Ácido 4-O-cafeoilquínico 9.1 353 174, 191, 112 é
12 Ácido 3-O-cafeoilquínico 9.9 353 191 ê
15 Ácido cafeoilquínico 10.4 353 179, 174, 191 é
18 Ácido cis-5-o-cafeoilquínico 11.4 353 707, 191, 135, 126 é
19 Ácido cis-3-o-cafeoilquínico 11.6 353 191, 179, 174, 135 é
23 Ácido clorogênico 12.0 353 191, 179, 173 ê
24 Cafeína 12.5 +195 138, 109 ê
25 Ácido cafeico 12.7 179 135 é
29 Ácido Feruloilquínico 14 367 174, 112, 191 ê
31 Ácido cafeoilchiquímico 14.3 335 174, 191, 112, 179 ê
33 Ácido cafeoil chiquímico 14.5 335 174, 161, 191,112 ê
36 Ácido Feruloilquínico 15 367 163, 191 é
47 Ácido dicafeoilquínico 16.6 515 353, 191, 179 ê
50 Ácido dicafeoilquínico 17.1 515 353, 174, 191 ê
52 Ácido dicafeoilquínico 17.8 515 353, 174, 187, 112 ê
A análise de HPLC / ESI-MS mostrou a presença de um pico significativo de EGCG

nas amostras originais. O espectro de massa revelou íons [M-H]- com m/z 457 e 169 e MS2
331 consistente com a estrutura de EGCG comparada com íons produzidos por padrão.
Entretanto, nos chás biotransformados por tanase, foi detectado o aumento da sua forma de
aglicona. O espectro de massa revelou um íon de massa consistente com a estrutura de EGC
(PM: 306 g/mol) detectado pelo íon de m/z 305, e ainda detectando o íon fragmentado que
corresponde à perda de CO2 (m/z 261) e C6H6O3, (m/z 179) devido à cisão do anel
heterocíclico (GU et al., 2003; ZHAO et al., 2011). Este resultado é consistente com os

127

resultados apresentados por Macedo et al. (2011), estudo que mostra que a tanase pode
hidrolisar a epigalocatequina galato em epigalocatequina e ácido gálico.
5.0E+08
A 4.5E+08
**
4.0E+08 CB
3.5E+08 ** ** CBT
Área (mUA.s)
3.0E+08
2.5E+08 ** **
2.0E+08
** *
1.5E+08
1.0E+08 ** ** **
5.0E+07 **
0.0E+00
5.0E+08
B 4.5E+08
**
4.0E+08 * ** CV
3.5E+08 *
Área (mUA.s)
CVT
3.0E+08
2.5E+08
**
*
2.0E+08
1.5E+08 **
1.0E+08 **
5.0E+07 * ** **
0.0E+00
4.0E+08
C **
3.5E+08 CP
3.0E+08 CPT
Área (mUA.s)
2.5E+08
2.0E+08
1.5E+08
** **
** ** **
1.0E+08 **
5.0E+07 * * * **
0.0E+00
Figura 3.3 Áreas médias dos picos (HPLC/MS) a partir de três amostras. (A) Chá branco -
CB= chá branco original, CBT= chá branco biotransformado. (B) Chá verde - CV= chá verde
original, CVT= chá verde biotransformado. (C) Chá preto - CP= chá preto original, CPT= chá
preto biotransformado, EC = epicatequina, CAT= catequina, EGC= epigalocatequina, GC=
galocatequina, GQA= ácido 5-galoil quinico, CGA= ácido clorogênico, 3CGA= ácido 3-O-
cafeoilquinico, 4CGA= ácido 4-O-cafeioilquinico, ECG = epicatequina galato, EGCG=
epigalocatequina galato, DCQA= ácido dicafeoil quínico, PDBG= Prodelfinidina B 2-3'-O-
galato. * = P <0,05, ** = p <0,01, sem anotação = NS através do teste t.

128

O ECG foi identificado com base na comparação do espectro de absorção, tempo de

retenção, e maior íon de fragmentação ([M - H]- com m/z 441 e os fragmentos de MS2 com
m/z 331, 289 e 169) e notavelmente os extratos originais apresentaram os níveis mais
elevados enquanto que naqueles biotransformados pela tanase o pico diminuiu
significativamente. Esse comportamento pode ser analisado pela representação gráfica da
média da área dos picos dos principais compostos detectados acompanhados da análise
estatística. Além disso, o pico 27, identificado como (-)-EC (fragmentação MS-MS [M - H]-
com m/z 289 e o principal fragmento MS2 de m/z 245 e 205) e o pico 3, ácido gálico (m/z
169), apresentaram níveis mais elevados em chás preto, verde e branco biotransformados.
Outras mudanças ocorreram nos extratos de chá devido ao tratamento enzimático, chá
branco e verde biotransformados mostraram níveis mais elevados de GC (pico 8),
acompanhado pela diminuição GCG (pico 30) bem como a hidrólise de rutina (quercetina-
rutinoside- pico de 37) e aumento da sua forma aglicona, quercetina (pico 65) foi observado.
O aumento do pico da miricetina (picos 53 - CVT e CBT) e kaempferol (pico 66 -
CPT, CVT e CBT) após o tratamento com tanase imobilizada sugere que houve a hidrólise
dos derivados de miricetina e kaempferol, de forma análoga a estrictinina diminuiu (pico 22-
CVT e CBT) sugerindo que pode ter ocorrido a quebra do tanino em ácido elágico (não
detectado). Os resultados são consistentes com Battestin et al. (2008), He et al. (2006),
Macedo et al. (2011), Ni et al. (201) e Ferreira et al. (2013) e indicam que a tanase
imobilizada a partir de P. variotii também é capaz de hidrolisar as ligações éster de substratos
naturais.
Análise por HPLC/MS do extrato de chá mate revelou a presença de vários derivados
de ácido hidroxicinâmico sendo a principal alteração pelo tratamento da tanase o aumento de
ácido cafeico (Figura 3.4) e alguns isômeros de ácido cafeoilquínico seguido da diminuição
de ácido clorogênico e isômeros e ácido dicafeoilquínico.

129

Chá mate
Original
6.0E+07
Biotransformado
5.0E+07
Área (mUA.s)
4.0E+07
3.0E+07
2.0E+07
1.0E+07
0.0E+00
Ácido cafeico
Figura 3.4 Média da área do picos (HPLC/MS) do ácido cafeico a partir de três amostras de
chá mate. ** = significativamente diferentes através do teste t, p <0,01.
Resultados semelhantes foram detectados com tratamento de tanase livre (MACEDO

et al., 2011). A identificação do ácido clorogênico (pico 23) foi confirmada por análise de íon
majoritário MS-MS, que revelou a presença do íon negativo [MH]- com m/z = 353. A
fragmentação MS2 com m/z 191 e 179 foram consistentes com ácido quínico e ácido cafeico,
bem como a fragmentação com m/z 173 indica a saída de uma molécula de água do ácido
quínico. Em contraste aos achados deste estudo e de Bastos et al. (2007), Filip et al. (2001)
descreveu a presença de quercetina, kaempferol e miricetina em extratos de chá mate.
Além da caracterização extensa dos chás, esta análise cromatográfica confirmou com
sucesso o aumento na presença de compostos, tais como EC, AG, EGC, ácido cafeico para os
quais estudos tem relatado ter maior biodisponibilidade (OLTHOF; HOLLMAN; KATAN,
2001; MANACH; DONOVAN, 2004; MACEDO et al., 2011). A cromatografia ainda
detectou a diminuição da cafeína após a transformação pela tanase (Figura 3.5). Em 2005 e
2006, pesquisadores descobriram que a cafeína aumenta a secreção de cortisol. Além disso,
indivíduos mais velhos ou com maior percentagem de gordura corporal apresentaram maior
nível de excreção de cortisol quando a cafeína foi adicionada à sua dieta (LOVALLO et al.,
2005, 2006). Alguns estudos sugerem ainda que a cafeína é capaz de aumentar a resistência à
insulina (KEIJZERS et al., 2002). Fato importante uma vez que o risco de diabetes está
diretamente relacionado ao grau de resistência a insulina e a biotransformação, por sua vez,
foi capaz de diminuir esse composto.

130

Original
Cafeína
Biotransformado
3.5E+09
**
3E+09
2.5E+09 *
Área (mUA.s)
2E+09
1.5E+09
**
1E+09
500000000
0
Chá verde Chá branco Chá preto Chá mate
Original
Teobromina Biotransformado
1.8E+08 **
1.6E+08
1.4E+08 **
1.2E+08 **
Área (mUA.s)
1.0E+08
8.0E+07
6.0E+07
4.0E+07
2.0E+07
0.0E+00
Chá verde Chá branco Chá Preto Chá mate
Figura 3.5 Média das áreas dos picos de cafeína e teobromina (HPLC/MS) a partir de três
amostras. * = p <0,05, ** = p <0,01, sem anotação = NS através do teste t.
Foi identificado também o incremento no conteúdo de teobromina após a

biotransformação do chá branco. Não está claro o mecanismo que acarretou no aumento, nem
a razão deste comportamento ter ocorrido apenas no chá branco. Horžić et al. (2009)
confirmaram que naturalmente o chá branco possui maior teor de teobromina que o chá verde
por ser encontrada em folhas mais jovens. Os autores demonstraram também que diferentes
procedimentos de extração podem refletir no teor de liberação da matriz, ou seja, o tratamento
enzimático pode ter agido na extração do conteúdo de teobromina existente nas folhas do chá
branco. Especula-se que durante o processo de biotransformação pode ter ocorrido quebra de
ligações hidrofóbicas do complexo metilxantina-taninos liberando moléculas de

131

teobromina/cafeína (ALONSO, 2004) e/ou a quebra do grupo metil na posição 1 da cafeína

possibilitando a predominância de teobromina.
A teobromina é uma metilxantina primária encontrada principalmente no Theobroma
cacao. Como uma metilxantina, é bloqueadora de receptores de adenosina, inibindo a
fosfodiesterase capaz de hidrolisar o AMPc em AMP e seus efeitos celulares são centrados
neste aumento do AMPc intracelular (MARTÍNEZ-PINILLA; OÑATIBIA-ASTIBIA;
FRANCO, 2015). A fisiologia do cérebro é dependente de variações na concentração de
adenosina nos neurônios. Sugimoto et al. (2014) afirmaram ser um composto bioativo eficaz
na prevenção de glioblastoma. No entanto as evidências mostram que as metilxantinas,
cafeína e teobromina, tem ações psicoativas qualitativamente diferentes. Pesquisadores
concluíram que a cafeína tem efeitos mediados pelo SNC no estado de alerta, enquanto que a
teobromina atua principalmente em alterações periféricas como diminuição da pressão arterial
(MITCHELL et al., 2011; BAGGOTT et al., 2013). Embora seja um composto que os
pesquisadores tenham dado menor atenção, podemos encontrar grandes achados também em
relação ao suporte a obesidade. Em 2015, os dados de Jang et al. (2015) sugeriram que a
teobromina inibe a diferenciação de adipócitos durante os estádios iniciais da adipogênese em
pré-adipócitos 3T3-L1 e Neufingerl et al. (2013) concluiu que a teobromina é capaz de
aumentar o HDL sérico.
3.1.2 Quantificação de compostos fenólicos por cromatografia líquida de

alta eficiência acoplada a um detector de arranjo de diodos (HPLC-DAD)
As mudanças nas concentrações dos principais fenólicos antes e após a

biotransformação de todos os chás pode ser vista na Tabela 3.5. As visíveis mudanças na
quantificação de alguns compostos reafirmam a eficiência da tanase imobilizada na hidrólise
de chás uma vez que obtivemos resultados de hidrólise próximos aos estudos de Lu; Chen,
(2008), Macedo et al., (2011) e Raghuwanshi; Misra; Saxena, (2013) que utilizaram tanase
livre em chás.
Dentre os vários resultados interessantes, como o aumento de deglicosilados e
diminuição da cafeína, o aumento mais significativo é claramente o aumento de ácido gálico,
quando houve aumento de 16 vezes para o chá verde e 13 vezes no chá branco. O chá preto
apresentou aumento menos significativo, o que pode ser explicado já pelo seu menor teor de
moléculas que pudessem hidrolisar resultando na liberação da molécula de ácido gálico, como

132

EGCG e ECG. Conforme Zeng et al. (2016) o chá verde possui altos teores de EGCG devido
ao seu processo de obtenção ser brando, evitando degradação de suas catequinas. Podemos
confirmar estes achados, pois a tanase foi capaz de diminuir em 75% o teor de EGCG e
aumentando em 70% seu produto de hidrólise EGC. Além disso, ocorreram 95% de hidrólise
da ECG, acarretando em aumento de aproximadamente 2,7 vezes o conteúdo de EC, o que
demonstra alta afinidade da enzima por este substrato. Estes achados foram corroborados com
a hidrólise de 91% e 75% da EGC no chá preto e chá branco, respectivamente.
Tabela 3.5 Efeito do tratamento da tanase imobilizada no teor dos principais polifenóis
encontrados nos chás através da quantificação por HPLC/DAD.
Chá verde Chá branco Chá Preto Chá mate
Composto Tratamento
mg/g
Original 3,26 ± 0,24b 4,81 ± 0,59b 11,95 ± 1,33b nd
Ácido Gálico a a a
Biotransformado 54,18 ± 5,30 65,26 ± 2,85 25,44 ± 1,22 0,8 ± 0,03
Original 13,58 ± 1,52b 10,64 ± 1,68b 2,81 ± 0,30b nd
EGC a a a
Biotransformado 23,23 ± 2,08 16,44 ± 0,49 6,42 ± 0,12 nd
b b b
Original 0,73 ± 0,04 0,67 ± 0,038 0,20 ± 0,03 nd
Catequina
Biotransformado 1,66 ± 0,12a 1,24 ± 0,07a 0,58 ± 0,02a nd
a a b
Original 126,51 ± 2,00 115,8 ± 1,22 16,27 ± 1,51 nd
EGCG b b a
Original 18,59 ± 0,52b 20,78 ± 0,74b 6,45 ± 0,29b nd
EC a a a
a a a
Original 36,64 ± 1,77 33,38 ± 3,30 11,71 ± 1,68 nd
ECG b b b
a a
Original 0,85 ± 0,015 0,75 ± 0,026 Nd 4,12 ± 0,25a
Rutina
Biotransformado 0,24 ± 0,016b 0,13 ± 0,024b Nd 0,30 ± 0,02b
Original 0,03 ± 0,007a 0,054 ± 0,01b Nd nd
Quercetina b a
Biotransformado 0,28 ± 0,045 0,81 ± 0,21 Nd 1,04 ± 0,17a
Original nd nd Nd 1,07 ± 0,03b
Ácido Cafeico
Biotransformado nd nd Nd 4,65 ± 0,01a
Original nd nd Nd 24,48 ± 0,48a
Ácido
Clorogênico Biotransformado nd nd Nd 13,26 ± 0,08b
Os resultados são apresentados como a média (n = 3) ± DP. Médias com letras sobrescritas diferentes são significativamente diferentes em
relação ao tratamento analisados através do teste One-way ANOVA seguido pelo teste de Tukey (p<0,01). Nd = não detectado.
O significativo aumento do ácido cafeico foi confirmado pela quantificação a partir de

curva padrão realizada com padrão. O ácido cafeico é conhecido pelas atividades
antioxidantes, imunomoduladora, anti-proliferativas, indutoras da apoptose e anti-

133

inflamatórias (PARK et al., 2004; GAMARO et al., 2011; ZHANG et al., 2014; VINI;
SREEJA, 2015). Bezerra et al. (2012) publicaram um artigo que demonstrou o potencial do
ácido cafeico como agente terapêutico na obesidade ao restaurar parcialmente o metabolismo
normal de ratos obesos tratatos com ácido cafeico.
Além disso, ainda que em baixas concentrações, o aumento de quercetina e ácido
gálico podem contribuir para o aumento da bioatividade do chá mate. Quercetina tem
apresentado recentes avanços na elucidação de seus efeitos. Porras et al. (2017) mostraram em
seus resultados a adequação da quercetina com uma abordagem terapêutica para doença
hepática gordurosa não alcoólica associada a obesidade através de mecanismos que incluem
resposta anti-inflamatória, antioxidante e prebiótica integrativa.
3.2 Atividade antioxidante
Análise de ORAC, FRAP e DPPH dos extratos de chás originais e biotransformados

por tanase imobilizada são mostrados na Tabela 3.6.
Tabela 3.6 Atividade antioxidante

Tratamento P-valor**
Efeito do
Chás Original Biotransformado Todos chás
tratamento
Preto* 1080.3 ± 159.2d 1639,5 ± 84.6c 0,005
* b a
Verde 2391.0 ± 216.7 3021,3 ± 240.8 0,028
DPPH < 0,0001
Branco* 1749.7 ± 221.0c 3429,4 ± 61.0a 0,0002
Mate* 481.8 ± 3.9e 1614,4 ± 27.4c <0,0001
* c a,b
Preto 1863.7 ± 181.8 2739.5 ± 434.3 0,021
Verde* 2673.4 ± 159.7a,b 3525.6 ± 320.5a 0,014
ORAC * c a,b
<0.0001
Branco 2304.3 ± 76.6 3248.0 ± 536.6 0,0039
Mate* 2438.78 ± 388.14b,c 3466.9 ± 205.3a 0,0025
Preto 2618.8 ± 115.6d,e 3708.1 ± 861.4c,d -
* d,e b
Verde 2871.6 ± 645.4 5614.7 ± 70.5 0,0018
FRAP * b,c a
<0.0001
Branco 4614.1 ± 501.6 7198.2 ± 67.7 0,0009
Mate 2397.0 ± 181.1e 2722,2 ± 395.2d,e -
*Diferença significativa estatisticamente entre chás biotransformados e originais (p≤0,05)
a, b, c, d, e valores (média ± dp) de cada analito com letras diferentes diferem significativamente (p≤0,05)
** Análise utilizando ANOVA, seguido pelo teste Tukey (p≤0.05).

134

O fator decisivo para explicar esses resultados da atividade antioxidante pode ser a
composição fenólica de cada extrato e não simplesmente o conteúdo fenólico total (BASTOS
et al., 2007). Ainda que a catequina com maior atividade antioxidante ainda é assunto
controverso, (BATTESTIN; MACEDO; DE FREITAS, 2008; MACEDO et al., 2012)
comprovaram que os fenólicos deglicosilados apresentam maior atividade antioxidante, então
é relevante observar as relações estabelecidas entre estrutura e potencial de redução. O
tratamento da tanase em todos os extratos gerou uma complexa mistura de estruturas
diferentes com ação antioxidante significativamente superior, avaliando as três técnicas
utilizadas (≤0.05). À medida que a atividade antioxidante é influenciada por ácidos fenólicos
e flavonoides monoméricos, e que alterações nos arranjos dos grupos hidroxilas e
substituições por glicosilação acabam diminuindo a atividade antioxidante (RICE-EVANS;
MILLER; PAGANGA, 1997), espera-se que os fenóis com pequenas moléculas e agliconas
aumente a atividade antioxidante. Nesse sentido nossos resultados concordam com estudos
prévios de Macedo et al. (2011), Macedo et al. (2012), Ni et al. (2015) quando a tanase ajudou
a aumentar a atividade antioxidante, indicando que a tanase imobilizada tem aplicações
práticas no processamento de chás.
O primeiro ensaio de avaliação antioxidante mensurou o poder da amostra em
sequestrar o radical DPPH e chá verde e branco, mostraram maior atividade antioxidante,
aumentando 1,26 e 1,95 vezes após o tratamento enzimático, respectivamente. Os resultados
estão de acordo com estudo de (HONG et al., 2013), mostrando que o tratamento enzimático
aumenta a atividade antioxidante, e supõe-se estar relacionado com o aumento de AG, cafeína
e catequinas, porém neste estudo não foi possível elucidar o(s) mecanismo(s) pelo qual o trata
mento com enzimas aumenta a atividade de DPPH.
Não há diferença significativa de atividade antioxidante incidindo sobre a eliminação
do radical peroxil (ORAC) entre os tipos de chás biotransformados, embora o aumento
mediado pelo tratamento com enzima nos seus valores tenha sido foi relevante, com o
aumento médio de 1,39 vezes. Dávalos et al. (2004) mostraram que a quercetina e catequina
foram os valores mais altos de ORAC, 10,5 e 14,9 Trolox equivalente/mol de composto puro,
respectivamente, o ácido cafeico foi mais ativo do que o ácido ferúlico e a sua esterificação
com o ácido quínico (ácido clorogênico) apresentou atividade reduzida. Essas moléculas
antioxidantes podem explicar diretamente nossos resultados ORAC significativos em chás
biotransformados. Neste estudo, a quelação de íons ferrosos por chás com ou sem tratamento
de tanase foi examinada por FRAP. Amostras de chá branco biotransformadas apresentaram

135

os maiores valores de FRAP, mostrando melhor capacidade de catalisara transferência de

elétrons, levando a inibição da peroxidação lipídica. Embora chás de Camellia sinensis
biotransformados enzimáticamente tenham apresentado magnitude de atividade, podemos ver
a grande melhoria do chá mate após a biotransformação, 3,35 vezes para DPPH, 1,42 vezes
para ORAC e 1,13 para FRAP. Embora a relação estrutura-atividade seja mais complexa e,
vários fatores devem ser analisados, os resultados desses ensaios apoiam o princípio de que as
estruturas com mais grupos hidroxila exercem maior atividade antioxidante, uma vez que a
hidrólise pela enzima reestabelece a molécula com mais uma OH livre, como por exemplo, os
ésteres de catequina galato que refletem na liberação do antioxidante catequina mais o ácido
gálico (RICE-EVANS; MILLER; PAGANGA, 1996).
3.3 Estabilidade dos polifenóis após digestão in vitro
Uma vez que estudos in vitro avaliando a biodisponibilidade cada vez mais têm
ganhado importância devido aos custos e implicações éticas que envolvem estudos in vivo
(SOLER et al., 2010), optou-se por realizar ensaios in vitro para avaliar a disponibilidade dos
compostos fenólicos e a sua estabilidade através do processo digestivo. As figuras 3.6, 3.7,
3.8, 3.9 mostram os picos cromatográficos dos polifenóis após a digestão gástrica e duodenal
de todos os chás avaliados nesse estudo, mostrando a estabilidade destes compostos. A
bioacessibilidade representa a razão de fenóis disponíveis após a digestão. O método de
digestão in vitro não pode imitar o transporte ativo que ocorre no estômago (PASSAMONTI
et al., 2003) ou o transporte dos flavonoides por meio de interação com o transportador de
sódio dependente de glicose (SGLT1) no intestino delgado (GEE et al., 1998). No entanto, a
estabilidade sob condição gastrointestinal é crucial para potencial bioacessibilidade, o que irá
definir quais os polifenóis estão acessíveis para mecanismos de transporte eficiente. A
estabilidade dos polifenóis dos extratos de chás originais e biotransformados foi avaliada
utilizando um modelo de sistema que imita o processo digestivo humano. Os extratos
utilizados nesse modelo tiveram os compostos já identificados anteriormente confirmados em
relação a sua estabilidade através da confirmação dos seus picos identificados por dados
característicos de MS/MS.
Os cromatogramas obtidos das amostras pós-digestão puderam demonstrar que as
etapas do processamento do chá podem, potencialmente, influenciar a bioacessibilidade de
polifenóis bioativos. Através dos gráficos obtidos por cromatografia pode ser verificado que

136

os picos de ácido gálico, ácido cafeico, prodelfinidina B 2-3'-O-galato (PDBG), EGC e EC

são capazes de resistir à digestão gástrica e se não forem absorvidos até o momento em que
atingem o intestino, podem ser facilmente absorvidas pelos enterócitos. Observamos também
que estrictinina teve picos mais altos em amostras biotransformadas após a digestão,
comportamento que não havia sido observado antes da digestão in vitro. Fato relevante uma
vez que Gondoin et al. (2010) atribuiu a essa
gastric_white_t_neg_01
molécula o poder inibidor da lipase pancreática.
15-Jun-15 23:03:59
RT: 0.00 - 24.44

100 NL:
A 1.30E6
FSD = 1.08E6
90 Channel A
UV
Gastric_Wh
80 ite_neg_01
NL:
70 1.08E6
Channel A
Ácido gálico UV
60
EC gastric_whit
e_t_neg_01
uAU
50
40 EGC
Strictinin
Estrictinina
30 Ácido 5-galoilquinico
Teobromina
20
Galocatequina
10
pancreatic_white_t_neg_02 16-Jun-15 15:07:22

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
RT: 0.00 - 24.44 Time (min)
100 NL:
B
FSD = 1.08E6 1.30E6
90 Channel A
UV
pancreatic_
80 white_neg_
01
70 NL:
1.08E6
60 Channel A
UV
pancreatic_
uAU
50 white_t_neg
_02
40 Strictinin
Estrictinina
30 Teobromina
Ácido gálico
20 EGC
EC
10
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Time (min)
Figura 3.6 (A) HPLC-MS de chá branco original (azul) e chá branco biotransformado
(vermelho) após a digestão gástrica (B) HPLC-MS de chá branco original (azul) e chá branco
biotransformado (vermelho) após a digestão pancreática. Os traços de chá branco são
sobrepostos para identificar diferenças no conteúdo fenólico.

137

Os resultados mostram que a degradação dos polifenóis através da digestão

gastrointestinal in vitro ocorreu principalmente durante a fase da simulação dos processos
bioquímicos no intestino duodenal assim como os resultados obtidos por Green et al. (2007).
É importante ressaltar que os principais compostos incrementados através da
biotransformação apresentaram boa recuperação nas amostras de chá verde e chá branco,
como podemos observar na Figura 3.6 e 3.7 mostrando o efeito positivo da biotransformação
em aumentar a bioacessibilidade dos polifenóis.
gastric_green_t_neg_01 15-Jun-15 21:16:57
RT: 0.07 - 22.87

100 NL:
A FSD = 1.08E6 1.08E6
90 Channel A
UV
gastric_gre
80 en_neg_01
NL:
70 1.08E6
Ácido gálico Channel A
60 UV
gastric_gre
en_t_neg_0
uAU
50 1
40
EC
30
EGC
20
10
gastric_green_t_neg_01 15-Jun-15 21:16:57

pancreatic_green_t_neg_02 16-Jun-15 13:20:17
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
RT: 0.07 - 22.87 Time (min)
RT: 0.00 - 22.52
100 NL:
100 NL:
1.08E6
FSD = 1.08E6 1.82E6
Channel
90
90 B ChannelAA
UV
UV
gastric_gre
pancreatic_
80
80 en_neg_01
green_neg_
NL:
01
70
70 1.08E6
NL:
Channel
1.88E6 A
60 UV
Channel A
60
gastric_gre
UV
en_t_neg_0
pancreatic_
uAU
uAU
50
50 1green_t_ne
g_02
40
40
30
30
Ácido gálico EC
20
20 EGC
10
10
0
0 2
2 44 66 88 10
10 12
12 1414 1616 1818 2020 22 22
Time (min)
Time (min)
Figura 3.7 (A) Análises de HPLC-MS de chá verde (azul) e chá verde biotransformado
(vermelho) após digestão gástrica. (B) Análises de HPLC-MS de chá verde (azul) e chá verde
biotransformado (vermelho) após digestão pancreática.

138

A estabilidade do ácido gálico nos três chás de Camellia sinensis, está de acordo com
os trabalhos sobre a biodisponibilidade do ácido gálico em seres humanos, que documentam
que este composto é extremamente bem absorvido, em comparação com outros polifenóis e é
um potente antioxidante capaz de eliminar esses radicais livres (MANACH et al., 2005;
TUNG et al., 2009; BADHANI; SHARMA; KAKKAR, 2015). Vários estudos demonstram
os grandes potenciais desse ácido fenólico, tanto in vitro como in vivo. Suas atividades
anticancerígenas são evidenciadas através de medidas pró-oxidantes de compostos galato. As
espécies reativas de oxigênio geradas por galatos têm sido relacionadas com a morte celular
apóptica e necrótica. Pesquisadores alegam que os galatos induzem apoptose seletivamente
em células tumorais de crescimento rápido, deixando as células saudáveis intactas. A
citotoxicidade seletiva é plausível uma vez que células normais apresentam capacidade em
resistir à apoptose induzida por ácido gálico pela liberação de inibidores que não são
produzidos por células cancerosas (ISUZUGAWA; OGIHARA; INOUE, 2001; FARIED et
al., 2007; CHIA et al., 2010; SOURANI et al., 2015).
Dentre outras importantes ações benéficas, como atividades anti-inflamatórias
(BENSAAD et al., 2017), cardioprotetoras (EL-HUSSAINY et al., 2016), hepatoprotetoras
(LATIEF et al., 2016; MONEIM et al., 2016), Chao et al. (2014) demonstraram que o ácido
gálico é capaz de melhorar a esteatose não alcoólica induzida por dieta rica em gordura. O
estudo mostrou que os alvos desse ativo são relacionados a distúrbios metabólicos como
metabolismo lipídico, glicólise, cetogênese, metabolismo da colina e da microbiota intestinal,
muitos destes que estão relacionados a obesidade. Doan et al. (2015) demonstraram o poder
nutrigenômico do ácido gálico. Foi relatado que o ácido gálico regula o peso corporal de ratos
obesos através da ativação da AMPK, enzima responsável por vias relacionadas a produção
de ATP e oxidação da gordura para ser consumida, como também de outros genes
relacionados com o gasto energético no tecido adiposo marrom.
As catequinas EC e EGC, que também foram incrementadas após a biotransformação
com tanase imobilizada, oscilaram entre 88% e 98,56% de recuperação após digestão ácida
para a EGC de chá branco biotransformado e EC do chá verde biotransformado,
respectivamente. O papel da biotransformação reside no fato de que estes compostos são
absorvidos na primeira porção do intestino, precisando chegar após a digestão ácida, intactos
no intestino, para então serem absorvidos (SPENCER et al., 2001; SPENCER, 2003). Já
compostos que precisam ser metabolizados pela flora intestinal, como EGCG, precisam
chegar ao cólon onde são metabolizados e absorvidos (KALE et al., 2010). Nossos resultados

139

mostraram baixa identificação de moléculas como EGCG e ECG após a simulação da

digestão que ocorre no intestino, uma vez que estes compostos precisam ser metabolizados
pela flora intestinal os estudos relatam baixa absorção desses compostos e comprava a
necessidade da biotransformação prévia destes compostos. O chá preto não apresentou dados
relevantes de recuperação desses compostos uma vez que já apresentavam baixas
concentrações antes da simulação da digestão.
gastric_black_t_neg_01 15-Jun-15 20:41:16
RT: 0.10 - 24.66

100 NL:

FSD = 1.08E6 1.08E6
90 Channel A
UV
Gastric_Bla
80 ck_neg_01
NL:
70 1.08E6
Channel A
60 UV
gastric_bla
ck_t_neg_0
uAU
50 1
40
30
20
10
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
pancreatic_black_t_neg_01 16-Jun-15 02:02:22
Time (min)

RT: 0.10 - 24.66
100 NL:

FSD = 1.08E6 1.08E6
90 nm=200.0-
600.0
PDA
80 pancreatic_
black_neg_
70 01
NL:
1.08E6
60
Channel A
UV
uAU
50 pancreatic_
black_t_ne
40 g_01
30
20
10
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Time (min)

Figura 3.8 (A) Análises de HPLC-MS de chá preto (azul) e chá preto biotransformado
(vermelho) após digestão gástrica. (B) Análises de HPLC-MS de chá preto (azul) e chá preto
Análises de HPLC com detector de espectrometria de massa (HPLC-MS) mostrou que

tanto EGC como EGCG foram as catequinas mais suscetíveis à degradação na digestão
pancreática. A instabilidade de catequinas ao pH quase neutro, bem como a sensibilidade das

140

catequinas às condições intestinais do duodeno já foram previamente relatadas (ZHU et al.,

1997; RECORD; LANE, 2001; SU et al., 2003). O pH elevado (6,0-8,0), o oxigênio residual
dissolvido, e provável presença de espécies reativas de oxigênio advindas da digestão normal
podem facilitar várias reações, incluindo a epimerização e auto-oxidação no lúmen intestinal
(ZHU et al., 1997; SU et al., 2003). Acredita-se que reações de auto-oxidação continuam
devido à vulnerabilidade dos grupos hidroxila adjacentes (radical pirogalol) no anel B da EGC
e EGCG (ZHU et al., 1997; ARTS et al., 2002) levando a desprotonação e subsequente
formação de radicais livres semiquinona no anel B (GUO et al., 1996; MIZOOKU et al.,
2003; LAMBERT; SANG; YANG, 2007). Condições de pH elevados propagam ainda mais
reações de auto-oxidação, estabilizando espécies de catequina semiquinona e permitindo que
estes intermediários reajam ainda mais, formando vários produtos finais que, potencialmente,
incluem irreversíveis produtos de dimerização homo e hetero (YOSHINO et al., 1999;
MOCHIZUKI et al., 2002). De acordo com observações de Green et al. (2007), que
realizaram estudo sobre a estabilidade das catequinas EC e ECG, esses compostos são menos
sensíveis à digestão simulada. Estudos sugeriram que próximo ao pH neutro a capacidade de
doar elétron dos grupos pirogalol para EGCG e EGC é significativamente maior do que para
os grupos catecol em EC e ECG, resultando em aumento da taxa de oxidação (MOCHIZUKI
et al., 2002), em outras palavras esta diferença na estrutura do anel B pode, portanto, ser útil
na previsão da sensibilidade intestinal de catequinas e que pode ser melhor percebida através
da recuperação destas moléculas nas amostras biotransformadas de chás após a simulação in
vitro.
Neste momento, é digno mencionar que embora uma enorme quantidade de compostos
fenólicos tenha sido perdida ao longo de todo processo de digestão, é provável que alguns
compostos se degradaram em formas mais simples ou sintetizados para criar novos produtos,
enquanto outros podem ter sofrido transformações estruturais, eventualmente não sendo
detectadas pelos métodos utilizados ou que estivessem abaixo do limite de detecção da
metodologia.
As análises da estabilidade dos polifenóis obtidos do chá mate podem ser observadas
no gráfico da Figura 3.9. Uma vez que a biotransformação foi sugerida a partir do fato que a
absorção dos ácidos clorogênicos no trato gastrointestinal proximal é inferior a dos ácidos
hidroxinâmicos livres por não possuirmos esterases capazes de hidrolisar os ácidos
esterificados, reduzindo significativamente a eficiência da absorção dos ácidos clorogênicos

141

no lúmen gástrico e no intestino delgado (MANAH, 2004; PLUMB, 1999; RECHNER,

2001), a estabilidade do produto dessa reação deve ser estável até seu sítio de absorção.
Neste trabalho foi observado que o ácido cafeico aumentado pela biotransformação foi
passível de recuperação, sendo o ácido fenólico majoritário na amostra obtida após a
simulação da digestão gástrica em comparação com a recuperação do composto após a
digestão na primeira porção do intestino (Figura 3.10). Em indivíduos com ileostomia, foi
demonstrado que 33% de um total de 2,8mmol de ácidos clorogênicos (isômeros 3,4 e 5-
CQA) foram absorvidos no estômago e intestino delgado, enquanto a absorção de ácido
cafeico, administrado na mesma dose, foi de 95% (OLTHOF et al., 2003). Resultados
semelhantes foram encontrados em experimentos com animais (AZUMA et al., 2000;
GONTHIER et al., 2003).
gastric_mate_t_neg_01 15-Jun-15 23:39:40
RT: 0.41 - 19.96

100 NL:
1.08E6
FSD = 1.08E6
90 Channel A
UV
Gastric_Ma
80 te_neg_01
NL:
70 5.08E5
Channel A
60 UV
gastric_mat
e_t_neg_01
uAU
50
40
30
Ácido cafeico
20
10
0
2 4 6 8 10 12 14 16 18
pancreatic_mate_t_neg_01 16-Jun-15 05:00:45
Time (min)

RT: 0.04 - 19.92
100 NL:
1.08E6
FSD = 1.08E6
90 Channel A
UV
pancreatic_
80 mate_neg_
01
70 NL:
8.08E5
60 Channel A
UV
pancreatic_
uAU
50 mate_t_neg
_01
40
30
20
10
0
2 4 6 8 10 12 14 16 18
Time (min)

Figura 3.9 (A) Análises de HPLC-MS de chá mate (azul) e chá mate biotransformado
(vermelho) após digestão gástrica. (B) Análises de HPLC-MS de chá mate (azul) e chá mate

142

Dessa forma foi demonstrado que a biotransformação do ácido clorogênico pode ter
efeitos positivos na biodisponibilidade de compostos bioativos uma vez que viabilizou a
disponibilidade de ácido cafeico após a digestão gástrica, o que não ocorreu com a amostra
original de chá mate original. O ácido clorogênico por sua vez não foi identificado nas duas
amostras, sugerindo que houve degradação em moléculas não identificadas. O ácido cafeico
foi previamente estudado por inúmeros grupos de pesquisa. Dentre os inúmeros efeitos
farmacológicos comprovados, através das propriedades antioxidantes, (STOJKOVIĆ et al.,
2013; GENARO-MATTOS et al., 2015) anti-inflamatórias, (ZHANG et al., 2014;
CHOUDHARY et al., 2016), antibacteriana (LUÍS et al., 2014; LIMA et al., 2016) e
anticarcinogênica (KANG et al., 2008; HONG et al., 2015; ROSENDAHL et al., 2015)
podemos ilustrar a importância desse composto para a saúde através do estudo que
comprovou que o ácido cafeico é capaz de suprimir a atividade de lipogênese e ativar a
enzima AMPK, relacionada com a β-oxidação dos ácidos graxos, indicando o potencial
significativo como agente preventivo na obesidade por supressão de enzimas lipogênicas e
acumulação de lipídeos (LIAO et al., 2013).
Após a digestão in vitro, apesar de a concentração de ácido clorogênico ter diminuído
em ambas as amostras de chá mate, continuou a apresentar considerável pico. O ácido
clorogênico pode apresentar pouca hidrólise no estômago, devido à estabilidade desta
substância em pH 2, o grau de acidez do conteúdo gástrico. Nardini et al. (2002) encontraram
apenas o ácido cafeico no plasma após a ingestão de café. Paralelamente, os resultados deste
estudo mostraram que além do ácido cafeico apresentar boa resistência ao ácido gástrico, seu
pico no cromatograma apresentou maior intensidade nas amostras submetidas à ação da
tanase (Figura 3.10).
Boaventura et al. (2015) avaliaram a estabilidade de polifenóis de erva mate e
comprovaram que apesar da diminuição do conteúdo de fitoquímicos, amostra de erva-mate
após digestão promoveram considerável atividade antioxidante celular, inibiram a
proliferação de células cancerosas do fígado humano (HepG2), comparável à amostras sem
digestão de alimentos de origem vegetal, como cranberry e framboesa e não foram observadas
alterações na citotoxicidade, sugerindo que o processo de digestão gastrointestinal não afeta o
potencial citotóxico do extrato de erva-mate. Também corroborando com os resultados deste
estudo Siracusa et al. (2011) observaram diminuição de aproximadamente 82% do teor de
ácido 5-cafeoilquínico em amostras de L. Crithmum após a simulação da digestão in vitro.
Estes autores também descobriram que o ácido 3,5-dicafeoilquínico foi completamente

143

degradado logo após a digestão gástrica in vitro. De acordo com Friedman et al. (2006),
ácidos clorogênicos não são estáveis em pH aumentado, o qual é encontrado na digestão
intestinal. É interessante notar que a biodisponibilidade varia muito de um polifenol para
outro, de modo que os polifenóis mais abundantes não são necessariamente aqueles que
conseguem maiores concentrações de metabólitos ativos no tecido-alvo (MANACH et al.,
2005).
120% Ácido cafeico

100%
Recuperação (%)
80%
Controle
60%
digestão gástrica
40% digestão pancreática
20%
0%
Ácido cafeico
Figura 3.10 Porcentagem de recuperação do ácido cafeico no chá mate biotransformado após
digestão gástrica e pancreática após análise de HPLC-MS.
4. Conclusão
Nosso estudo demonstrou por meio da identificação do perfil de polifenóis em cada

extrato de chá, que a tanase imobilizada é capaz de hidrolisar os substratos contidos em chás.
A capacidade antioxidante de extratos de chá originais e de chás que seguiram com
tratamento por tanase imobilizada, foi mensurada por ORAC, FRAP e ensaios de DPPH, o
que, em todas as análises, confirmaram que o tratamento dos extratos biotransformados por
tanase aumentou a sua potência antioxidante. Estes resultados demonstram a capacidade de
tanase para catalisar a hidrólise de vários substratos diferentes dos extratos de chá e confirma
que essa reação resulta em polifenóis com nível de capacidade antioxidante mais elevado. Os
compostos fenólicos dos chás exibiram estabilidade às condições digestivas gástricas
simuladas, mas estabilidade pobre após as condições intestinais. Ainda que os polifenóis
foram sensíveis às condições digestivas, as moléculas que atingem o intestino podem ser

144

absorvidas pela mucosa antes e/ou depois de serem hidrolisadas pelas condições do intestino e
assim ainda proporcionar considerável efeito benéfico. Portanto, enquanto estes resultados in
vitro não forem totalmente reproduzidos para as condições in vivo, estes dados fornecem
evidência de que o tratamento da tanase tem impacto positivo sobre a bioacessibilidade dos
polifenóis do chá.

145

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CAPÍTULO IV
Immobilized tannase treatment alters polyphenolic composition in teas and their

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(Publicado na revista: Food and Function)
O artigo foi publicado em 01 de agosto de 2016
Food Funct. 2016, v.7, n. 9, 3920-3932
http://dx.doi.org/10.1039/C6FO00373G

156

Immobilized tannase treatment alters polyphenolic composition in teas and their
potential anti-obesity and hypoglycemic activities in vitro
Bruna Sampaio Roberto1*; Gabriela Alves Macedo2; Juliana Alves Macedo2; Isabela Mateus
Martins1; Vânia Mayumi Nakajima2; J. William Allwood3; Derek Stewart3; Gordon J.
McDougall3
1 Food Science Department, College of Food Engineering, Campinas State University,

3 Environmental and Biochemical Sciences Group, Enhancing Crop Productivity and
Utilisation Theme, The James Hutton Institute, Dundee, United Kingdom.
*

157

ABSTRACT
The aim of this work was to assess the effect of immobilised-tannase treatment on
black, green, white and mate tea components and on their bioactivities relevant to obesity.
Tannase treatment caused predictable changes in polyphenol composition with substantial
reductions in galloylated catechins in green, white and black tea. Mate tea, which is rich in
chlorogenic acids, was much less affected by tannase treatment although some degradation of
caffeoyl quinic acid derivatives was noted. The original tea samples were effective in
inhibiting digestive enzymes in vitro. They inhibited amylase activity, some with IC50 values
~ 70 µg/mL, but were much less effective against µ-glucosidase. They also inhibited lipase
activity in vitro and they caused dose-dependent reductions in lipid accumulation in cultured
adipocytes.
The bio-transformed tea samples generally matched the effectiveness of the original
samples but in some cases they were markedly improved. In particular, tannase treatment
reduced the IC50 for amylase inhibition for green tea and white tea by 15- and 6-fold
respectively. In addition, the bio-transformed samples were more effective than the original
samples in preventing lipid accumulation in adipocytes.
These in vitro studies indicate that bio-transformed tea polyphenols could assist in the
management of obesity through improvement in energy uptake and lipid metabolism and
indicate that biotechnological modification of natural food molecules can improve the benefits
of a common beverage such as tea.
KEYWORDS
Polyphenols; anti-obesity; Camellia sinensis; Ilex paraguariensis ; tannase

158

ABBREVIATIONS
BT- black tea

EC- epicatechin
ECG- epicatechin gallate
EGC- epigallocatechin
EGCG - epigallocatechin gallate
GAE- gallic acid equivalents
GC- gallocatechin
GT- green tea
IC50 - concentration giving 50% inhibition
MT- mate tea
WT- white tea

159

1. Introduction
Obesity is a condition in which an abnormally large amount of fat is stored in the
adipose tissue, resulting in an increase in body weight and is one of the major global Public
1,2
Health problems. Obesity has been associated with comorbid metabolic and chronic
diseases, such as type 2 diabetes, heart diseases, hypertension, stroke and several forms of
3
cancer, and has added tremendous burden to health care systems. Thus, finding effective
therapies for obesity has received substantial attention and there has been a focus on
examining the massive natural variation inherent in phytochemicals for potential anti-obesity
effects.
During the last twenty years, the potential bioactivities of tea and tea polyphenols
have been intensively investigated. The action of tea polyphenols in preventing obesity may
4 5
be through stimulating hepatic lipid metabolism, stimulating thermogenesis, synergism
with caffeine and theanine, 6 inhibiting gastric and pancreatic digestive enzymes 7 and finally
8
suppressing fatty acid synthase. Several studies have demonstrated the efficacy, the
importance and the potential use of inhibition of amylase, 9 glucosidases 10 and lipases 11,12 in
the treatment of obesity and associated comorbidities and reinforce the need to search for new
sources of these inhibitors. On the other hand, adipose tissue hyperplasia is a result of
increased adipogenesis, which includes preadipocyte proliferation and adipocyte
differentiation. Thus, potential therapeutic agents that have the ability to reduce or inhibit
adipogenesis or increase cell death by apoptosis could have a profound impact as a strategy
for treating and preventing obesity and related metabolic disorders. 13
Tea is the second most widely-consumed beverage worldwide (after water) and is
rich in polyphenolic compounds. Camellia sinensis (L.) Kuntze (Theaceae) is the species of
plant used extensively in infusions, which are made from their dried fresh (white and green
teas), enzymatically oxidized (oolong and black teas) or microorganism fermented (pu-erh

160

14,15
tea) leaves. Currently, the products from primary and secondary metabolism of C.
sinensis are the focus of several chemical investigations. Green tea and white tea contains
several tea polyphenols, including epigallocatechin gallate (EGCG), epigallocatechin (EGC),

16
epicatechin gallate (ECG), and epicatechin (EC). These flavonoids have been proven to
have antioxidant, anti-mutagenic, and anti-carcinogenic properties, and they can also prevent
17
cardiovascular diseases. The oxidative process to produce black-tea leads to a
rearrangement of a series of compounds, as well as lead to compound decomposition. Thus,
black-tea contains the oxidation/condensation products of catechins, such as theaflavins and

18,19
polymeric thearubigins. It is well established that these changes in the chemical
composition of different teas may be reflected in their biological properties.
Mate tea (Ilex paraguariensis ) is a plant originally from the subtropical region of
South America and is present in the South of Brazil, the North of Argentina, Paraguay and
Uruguay. Mate beverages are rich in polyphenolic compounds (mainly caffeoyl derivatives
20
e.g. dicaffeoylquinic and chlorogenic acids) but also saponins and purine alkaloids and
several studies have identified mate tea as an excellent candidate in the struggle against
obesity. 21–25
The functional effect of the phenolic compounds depends not only on the amount
26
ingested, but on its bioavailability. Furthermore, tea phenolics, particularly those with a
galloyl moiety or their polymers and esters, are not readily absorbed in humans. 27 However,
enzymes can be used in processing to alter the phenolic profile and thereby enhance
effectiveness and potential bioavailability. Macedo et al.28 evaluated the potential antioxidant
properties of green and mate tea extract before and after enzymatic biotransformation
catalysed by the tannase from Paecilomyces variotii. The antioxidant power of the extracts
increased after enzymatic treatment. Tannases have mostly been characterised by their
activity on complex polyphenolics, and are able to hydrolyse ‘‘ester’’ bonds (e.g. galloyl ester

161

of an alcohol moiety), as well as ‘‘depside’’ bonds (galloyl ester of gallic acid) of substrates
29
such as tannic acid, epicatechin gallate, epigallocatechin gallate, and chlorogenic acid.
Despite all of the potential application of biological catalysts, their industrial use can be
limited by several factors, such as production cost, potential allergenicity, high water
solubility, lower stability, low activity at high temperatures, and unfeasibility of recycling of
activity compared with chemical catalysts. To minimize these problems an alternative
approach is the use of immobilized enzymes. Reports regarding immobilized tannases from
Paecilomyces variotii are scarce, but its immobilized form offers several advantages,
including improvement of enzyme stability, reusability of the enzyme, ease of product
separation, and a possible continuous operation in bioreactors.

4,12,13,21–25,30
Based on published evidence of anti-obesity effect of those teas and
obtained results by our group that biotransformation by tannase increases the bioactivity of
28
those beverages , the present study aims to evaluate the effect of immobilized tannase
biotransformation on the polyphenol composition of teas and the effect of biotransformed
extracts on obesity and diabetes through the inhibition of digestive enzymes and lipid
accumulation in 3T3-L1 differentiated into adipocytes.
2. Materials and Methods
2.1 Materials and Chemicals
Standard Black tea (BT), Green tea (GT), White tea (WT), Mate tea (MT), all from
the Leão® brand, were purchased in the local market (Campinas, SP, Brazil). Calcium
chloride, sodium phosphate, sodium alginate (alginic acid sodium salt), Folin–Ciocalteu,
lipase from Porcine pancreas Type II, p-nitrophenyl laurate, deoxycholate sodium salt, p-
nitrophenyl α-p-glucopyranoside, rat-intestinal acetone powder, potato starch, Porcine
pancreatic α-amylase, p-hydroxybenzoic acid hydrazide (PAHBAH), 1-methyl-3-

162

isobutylxanthine (IBMX), Dexamethasone, Oil Red O, methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium
bromide (MTT), sodium dodecyl sulphate (SDS) and insulin were purchased from Sigma–
Aldrich (St. Louis, MO, USA). Acetonitrile and formic acid for LC-MS analysis were
purchase from Optima™ (Fisher Scientific Ltd., Loughborough, Leicestershire, UK). The
standards chlorogenic acid and epigallocatechin gallate were from Extrasynthèse S.A. (Genay,
France). Tris (hydroxymethyl)-methylamine and HEPES were purchased from BDH,
Laboratory Supplies (Poole, Dorset, UK). Triton X-100 was purchased from Amersham
Pharmacia Biotech (Little Chalfont, Buckinghamshire, UK). Dulbecco’s modified medium
(DMEM), Fetal bovine serum (FBS), Phosphate-Buffered Saline (PBS), penicillin-
streptomycin were purchased from Gibco® (Invitrogen Life Technologies, Alameda, CA,
USA).
2.2 Immobilized tannase
The tannase (tannin acyl hydrolase) from Paecilomyces variotii was obtained
31
according to a previously published procedure. Immobilization was carried out using the
32
modified encapsulation method described by Schons et al. A 5% sodium alginate solution
was prepared using an orbital shaker (200 rpm for 1 hour) then 54 mg tannase was mixed in
15 ml of 5% sodium alginate (3.6 mg of tannase/mL). The suspension was added dropwise
with a syringe into a beaker containing 90 mL of solution of calcium chloride (0.1M). The
obtained capsules were stabilised by storage in the calcium chloride solution overnight at 7ºC,
then separated by sieving, washed with 200 ml of distilled water at 10 °C and retained in Petri
dishes.

163

2.3 Preparation of tea extracts
30g of each sample of tea and 450 mL of 20 mM phosphate buffer, pH5.5 were
combined in 600 ml Becker flasks. The extraction of compounds from black, green, mate and
white tea was performed in a water bath at 100o C for 30 min. To obtain extracts before and
after biotransformation, the extractions were performed in duplicate. After being filtered on
filter paper, the original extracts were freeze-dried and the resulting powder was called
original tea extract and used in future analyses. This model allows comparison of enzymatic
biotransformation data already published using the free enzyme. 28
2.4 Biotransformation
The tea extracts (300 mL of infusion in 20 mM phosphate buffer, pH 5.5) were
biotransformed with 2.25 g immobilized tannase at 60°C for 2h with magnetic stirring at 300
rpm. At the end of the reaction, the immobilized enzyme was collected by filtration and the
biotransformed tea extracts were freeze-dried and used in future analyses.
2.5 Total Phenols
Dry extracts were dissolved in ethanol 5% at 1mg/mL and the phenol content was
33
measured using a modified Folin–Ciocalteu method and quantified as gallic acid
equivalents (GAE).
2.6 Liquid chromatography–mass spectrometry (LC–MS) analysis
The extracts were transferred to Single Step 0.45 µm PTFE filter analytical vials
fitted with pre-slit silicon septa caps (Thomson Ltd. Oceanside, California U.S., P/N 35540-
500). The samples were stored in the auto sampler at 6 °C and analysed in both negative and
positive electrospray ionisation (ESI) modes. HPLC separations were performed with a

164

Thermo Accela 600 HPLC system coupled with an Accela PDA detector (Thermo-Fisher Ltd.
Hemel Hempstead U.K). The HPLC was operated at a flow rate of 300 µL/min, the column
(Synergi C18 Hydro-RP 80 Ä, 150x2.0mm, 4 µm particle size; Phenomenex Ltd.
Macclesfield U.K., P/N 00F-4375-B0) was maintained at a temperature of 30 oC. The solvent
A, 18.2 MΩ.cm deionised water (ELGA-PureLab option-Q, Elga Ltd., High Wycombe U.K.),
and solvent B, HPLC grade acetonitrile were acidified with 0.1% [v/v] mass spectrometry
grade formic acid. The gradient programme was as follows: hold 98% A 0-2 min, 98-95% A
2-5 min, 95-55% A 5-25 min, 55% A - 100% B 25-26 min, hold 100% B 26-29 min, 100% B
– 98% A 26-30 min, hold 98% A 30-35 min. The HPLC column eluent was first monitored by
the Accela PDA detector where spectra were collected in wavelength/absorbance mode from
200-600 nm before then being transfered to the Thermo LTQ-Orbitrap XL mass spectrometry
system operated under Xcalibur software (Thermo-Fisher Ltd. U.K.). Mass spectra were
primarilly colected in full scan mode (m/z 80-2000) at a mass resolution of 30,000 (FWHM
defined at m/z 400) applying the FT detector, a data-dependent secondary scan event was
applied to collect MS2 CID fragmentation spectra (NCE 45, activation time 30 ms, 0.25
Activation Q) within the LTQ based upon the single most intense ion as defined within the
preliminary full MS scan, the full scan event generated 'profile' mode spectral data, whereas
the LTQ MS2 scan events generated ‘centroid’ mode data. The presence of phenolic
compounds was confirmed based on the comparison of HPLC retention time and accurate
mass full scan m/z and nominal mass MS2 data with literature values and against
standards34,35. The LC-MS raw data profiles were first converted into an MZML centroid
format within the Proteowizard MSConvert software package. Each MZML based three-
dimensional data matrix (intensity × m/z × time – one per sample) was converted (or
deconvolved) into a vector of peak responses, where a peak response is defined as the sum of
intensities over a window of specified mass and time range (e.g. m/z = 102.1 ± 0.01 and

165

time = 130 ± 10 s). In this experiment the deconvolution was performed using the freely
available XCMS software (http://masspec.scripps.edu/xcms/xcms.php). The XC-MS
deconvolution yields an MS Excel based XY matrix. The peak area values for the compounds
of interest within each sample analysed in triplicate were assessed for significant differences
between pre- and post-tannase treatments of each respective tea variety by applying a
Students two-tailed T-test.
2.7 α - Amylase assay

36
This assay was conducted as described previously with slight modifications.
Briefly, stock starch solution was prepared by suspending 1.25 (w/v) soluble potato starch in
synthetic saliva buffer and gelatinizing the mixture for 15 min at 90 °C. Porcine pancreatic α-
amylase was dissolved in synthetic saliva buffer at 380 mg/L. The control assay contained
800 µL of synthetic saliva buffer and 100 µL of α-amylase, 100 µL of UPW, and the reaction
was started by addition of 500 µL of starch solution. The assays with tea extracts contained
the required amounts of extracts within the 100 µL volume. To estimate IC50 values (the
amount of phenols that gave 50% inhibition of amylase), assays were carried out with a range
of sample contents. A 5% (w/v) stock solution of p-hydroxybenzoic acid hydrazide
(PAHBAH) in 0.5M HCl was diluted 1:4 with 0.5 M NaOH to give the working PAHBAH
reagent. Triplicate samples (40 µL) of assays were taken at fixed times (0, 5, 10, 15 and 20
min) and added to 1.2 mL of PAHBAH reagent in a 1.5 mL tube. After heating for 10 min at
90 °C, the absorbance at 410 nm was measured. Controls lacking enzyme were used as
blanks. An assay time of 5 min was used as the rate of production of reducing termini was
linear up to this point. Percentage of control amylase activity was calculated as the difference
between the control and the + extract reactions divided by the control reaction.

166

2.8 α - Glucosidase assay
The α-glucosidase assay was adapted from the method by Whitson et al. 37 and used
to measure inhibition of α-glucosidase by tea extracts. The buffer for this assay was 100 mM
HEPES (pH 6.8) and the substrate was 2 mM ρ-nitrophenyl α-ρ-glucopyranoside. A total of
3g of rat-intestinal acetone powder was suspended in 9mL of 0.9% saline, and the suspension
was vortexed. It was then centrifuged (16,000 rpm for 5 min) and the supernatant used.
Inhibitors were added in a fixed total volume to obtain the concentration ranges required for
individual experiments. Controls lacking inhibitors were run and defined the control activity
in each experiment. Each treatment was accompanied by a treatment blank containing all
components apart from the enzyme to account for the possible absorbance of the tea
extracts/inhibitors. This assay was time and substrate sensitive therefore all components were
added in a specific order: buffer, enzyme, inhibitor then substrate. The substrate was added
last to start the reaction. The assay was linear over for 2 h at 37 oC. Then samples were
centrifuged at 16,000 rpm for 5 min and the absorbance at 410 nm read in a UV
spectrophotometer. All samples were carried out in triplicate and values were presented as %
control activity ± standard deviation.
2.9 Lipase Assay (ρNP substrate)

11
This assay was as reported previously. Lipase from porcine pancreas Type II was
dissolved in ultra-pure water at 10 mg/ml; then the supernatant was used after centrifugation
at 16,000 rpm for 5 min. The assay buffer was 100 mM Tris buffer (pH 8.2) and p-nitrophenyl
laurate (ρNP laurate) was used as the substrate. The substrate stock was 0.08% w/v ρNP
laurate dissolved in 5 mM sodium acetate (pH 5.0) containing 1% Triton X-100 and was
heated in boiling water for 1 min to aid dissolution, mixed well, then cooled to room
temperature.

167

The control assay contained 400 µL assay buffer, 450 µl substrate solution and 150µL
lipase. Tea extracts were dissolved in ultra-pure water in concentrations of 20 µg/mL to 100
µg/mL and added in 50 µL total volume. The buffer, enzyme and sample extracts were added
and then substrate was added to start the reaction. The samples were incubated at 37°C for 2h.
Then samples were centrifuged at 16,000 rpm for 2.5 min and read at 400 nm in a UV
spectrophotometer. All samples were assayed in triplicate and an inhibitor blank was prepared
for each sample. The results are expressed as % control activity.
2.10 Lipase activity assay using olive oil as the substrate

38
The olive oil assay system used was an adapted version by Wilcox et al. of the
39
method of Vogel & Zieve. The turbidimetric method measures the reduction in turbidity
that occurs following the breakdown of TAGs to free fatty acids by lipase. The olive oil was
passed through aluminium oxide (80 × 15 mm deep in a glass chromatography column –
checked) to remove free fatty acids. 10.0 g of the olive oil free from fatty acids was made up
to 100 mL with acetone giving a 10 % solution. This is turn was diluted 1 in 10 with acetone
to achieve a 1% olive oil stock solution. The stock solution was stored at 4°C and was used
over the entire series of experiments. For use in the assay, an olive oil substrate solution was
prepared by adding 4 mL of 1 % stock olive oil solution to a heated solution (70°C) of 100
mL 0.05 M Tris buffer at pH 8.3 containing 0.35% sodium deoxycholate. This solution was
maintained at 70°C and homogenised for 10 min. Once the froth had settled and the solution
had returned to room temperature, the substrate solution could be used in the assay for up to
6h. The enzyme solution contained 1.29 mg/ml lipase and 18 µg/ml colipase in deionised
water. Orlistat was added (0.4 µg/mL) to the enzyme solution as an inhibition control. Tea
extracts were added to the freshly prepared substrate solution containing the olive oil to give
50, 75, 100, 150, 200 and 250 µg GAE/mL. The samples were incubated at 37°C for 15 min.

168

After the incubation, the substrate solution was added to the solution containing the enzyme
solution or deionised water. The assay was maintained at 37°C and read every 5 min at 405
nm over 35 min.
2.11 Cell culture and differentiation
This assay was conducted as described previously with slight modifications by Moon
40
et al. For the in vitro study, we used the cell line 3T3-L1, this cell line represents a well-
established model system to study fat metabolism. The 3T3-L1 cell line (preadipocytes) was
cultured to confluence in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum and 10 mL/L
penicillin/streptomycin at 37 °C and 5% CO2. Forty-eight hours after achieving confluence
(day 0), the cells were incubated in differentiation medium (DMEM supplemented with 10%
fetal bovine serum, 1 µM dexamethasone, 10 µg/mL insulin and 0.5 µM IBMX). After 72 h
(day 4), the cells were then cultured in maturation medium DMEM supplemented with 10%
fetal bovine serum and 10 µg/mL insulin) for 10 days.
For the MTT and Oil Red O assays the cells were incubated with Black, White,
Green and Mate tea before and after biotransformation at the following concentrations: 100,
200, 400 or 500 µg GAE/mL during the differentiation period (from day 3). The group not
treated with tea was used as control. Cell toxicity was estimated by using the tetrazolium salt
reduction test (MTT assay) on 3T3-L1 cells. 40
2.12 Oil Red O staining
The cells were incubated with the compounds during the diferenciation period (from
day 3). After 10 days of differentiation, the cells were washed with 10% formaldehyde in
PBS, fixed in 10% paraformaldehyde in PBS for 1h. After this time, the cells were washed
twice with 60% isopropyl alcohol following incubated for 1h with Oil Red O solution. After

169

multiple water washes, the Oil Red O was dissolved in 100% isopropyl alcohol, and the
optical density was measured on a microplate spectrophotometer at 540 nm. The data are
presented as mean ± SD from triplicate. 40
2.13 Statistical analysis
All data were expressed as mean ± SD in triplicate using STATISTICA software
version 8.0 (StatSoft. Inc. (2007), Tulsa, OK, USA). Analysis of variance (ANOVA) was
carried out followed by Tukey’s test. The significance level of p< 0.05 was employed.
3. Results and Discussion
3.1 Total Phenolic Content and Phenolic Profile
The tannase treatment increased total phenol content of teas from between 1.2 (WT)
to 1.8 fold (MT) (Table 3.1). Tannase catalyses the hydrolysis of the ester and depside bonds
in hydrolysable tannins or gallic acid esters (such as EGCG or ECG) releasing glucose,
41
epicatechin and gallic acid respectively. It is possible that products released by tannase
react more intensely with Folin reagent and so have apparently increased the total phenolic
content of the samples. Alternatively, the tannase treatment may also have removed non-
phenolic material and thereby concentrated phenolic material. However, the recovery of dry
weight was not significantly lower after tannase treatment.
The composition of teas before and after tannase treatment were analysed by LC-MS
(Fig. 3.1; Table 3.2). The black, white, green and mate teas gave characteristic phenolic
compositions entirely consistent with previous reports. 12,16,19,42–45
GT and WT had a similar composition (Fig. 3.1) and tannase treatment caused
similar effects notably with higher amounts of gallic acid (peak 1) and epicatechin (peak 14)
and lower amounts of ECGC (peak 15) and ECG (peak 16; Table 3.2). BT also showed

170

increased levels of gallic acid and lower amounts of EGCG but the effects were less apparent
because BT has lower levels of these galloylated catechins. On the other hand, tannase
treatment of mate tea caused fewer changes but there were characteristic reductions in
chlorogenic acid isomers (e.g. peak 11), dicaffeoyl quinic acids (peaks 17-19) and the
appearance of caffeic acid (peak 13).
Table 3.1 Total phenol content of tea extracts.

Phenols Black Tea Green Tea White Tea Mate tea
(µg GAE/mL)
Original 992.2 ± 6.8b 863.3 ± 28.2b 1112.0 ± 21.2b 820.3 ± 68.4b
Biotransformed 1647.1 ± 154.6a 1472.7 ± 139.7a 1365.9 ± 38.3a 1511.7 ± 45.0a
Results are means of three replicate experiments ± standard deviation. We used analysis of variance, followed by Tukey’s
test. Same letters represent p>0.05 in column; different letters represent p<0.05 in column.
Overall, the main components that increased in WT after tannase treatment were
gallic acid, gallocatechin, catechin and epicatechin. There were also less dramatic increases in
2 of the 3 chlorogenic acids and in theobromine. In GT, gallic acid, gallocatechin, catechin
and epicatechin notably increased with less dramatic increases in 2 of the 3 chlorogenic acids.
In BT, only gallic acid, epigallocatechin, catechin and epicatechin were increased. In Mate
tea, the mainly increased component was caffeic acid. In BT and MT, there were notable
decreases in caffeine and theobromine content.
Both EGCG and ECG were effectively depleted by tannase treatment of tea extracts.
This agrees with previous work who found that tannase completely hydrolysed EGCG in tea
to epigallocatechin (EGC) and gallic acid and increased the antioxidant activity. 28,46,47 Using
46
standards, Ni et al. also proved that GCG was hydrolysed to GC and gallic acid and ECG
to EC and gallic acid. Overall, the reaction processes were consistent with previous findings
that tannase cleaves ester bonds in EGCG, ECG and chlorogenic acids.29

171

100
12
FSD = 1.30E6
90 A
80
70
60 1
8
50
40
14 15 16
30 2 4
20
10
11
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 18 19 20 21 22
Time (min)
100

FSD = 1.10E6
90
B 1 12 15
80
70
60
50
14
7 16
40
30 2 9-11
3 4
20
10
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 18 19 20 21 22
Time (min)
100
12 FSD = 1.10E6
90
C 1
80 15
70
60
50
14
16
40
7 9-11
30 2 3 4
20
10
0

0 1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12
13 14 15
16 17
18
19
20
21 22
Time (min)

100
11 12 FSD = 5.10E5
90
D
80
70
6
60
50 5
40 17 18 19
30
13
20
10
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22
Time (min)
Figure 1.3.1UVUVtraces of tea

traces of extracts beforebefore
tea extracts and after
andtannase treatment.
after tannase SamplesSamples
treatment. were were
analysed at 1mg/mL and originals are in blue and tannase-treated in red. (A) Black
are in blue and tannase-treated in red. (A) Black tea (B)
tea (B)tea
Green Green
(C) tea (C)tea.
White White
(D)tea. (D)tea.
Mate Mate tea. are
Traces Traces are overlaid
shown shown overlaid at 280 nm.
at 280 nm.

172

Table 3.2 Major changes in phenolic compounds after tannase treatment of teas.
Peak Putative identity TR m/z/ MS2 BT GT WT MT
-
(M-H)
1 Gallic acid 4.5 169 125 é é é ó
2 5-galloylquinic acid 6.1 343 191,169 ê ó ó x
3 Gallocatechin 8.9 305 261, 279, 179, é é é x
4 Theobromine 9.1 ⊕181 ínfimo ê ó ó ê
5 4-O-caffeoylquinic acid 9.1 353 174, 191, 112 ó ó ó é
6 3-O-caffeoylquinic acid 9.9 353 191 ê é é ê
7 EGC 11.2 305 287, 261 é ó ó x
8 Prodelphinidin B 2-3’O-gallate 11.7 761 591, 609, 423, 305 ê ê ê x
9 Catechin 11.7 289 245 é é é x
10 Estrictinina 11.9 633 463, 301 ê ê ê X
11 Chlorogenic acid 12.0 353 191, 179, 173 ê é é ê
12 Caffeine 12.5 ⊕195 138, 109 ê ó ó ê
13 Caffeic acid 12.7 179 135 x x x é
14 EC 13.2 289 245, 205 é é é X
15 EGCG 13.5 457 169, 331 ê ê ê X
16 ECG 15.7 441 289, 169, 331 ê ê ê X
17 Dicaffeoyl quinic acid 1 16.6 515 353, 191, 179 x x x ê
The peak annotations refer to Figure 1. The symbols represent: é increased; ê decreased; ó no change; x not identified,
⊕ = positive mode.
3.2 Effects on α-Amylase and α-Glucosidase inhibition
For comparison, the results of the α-amylase inhibition assays were expressed in IC50
values (concentration giving 50% inhibition) based on the phenolic concentration of extracts
(Table 3.3).
All tea extracts inhibited α-amylase to some extent and were ranked as BT > MT >
GT > WT for original extracts and GT > WT > BT > MT for biotransformed extracts.
Therefore, the original extracts of BT and MT were better than tannase-treated extracts but,
on the other hand, tannase-treated extracts of WT and GT were substantially better than
original extracts. In fact, tannase treatment potentiated inhibition by GT and WT by 15 and 6
fold respectively but only slightly reduced the effectiveness of BT (x1.3) and MT (x1.5).

173

Tabela 3.3 Half maximal inhibitory concentration (IC50) values for α-amylase activity.
IC50 Black Tea Green Tea White Tea Mate tea
TPC (µg GAE/mL)
Original 65.5 ± 2.7Bc 178.4 ± 5.9Ab 209.7 ± 4.2Aa 70.0 ± 0.9Bc
Biotransformed 89.5 ± 0.9Ab 11.3 ± 0.3Bd 36.6 ± 3.2Bc 105.2 ± 1.6Aa
test. Same letters represent p>0.05, uppercase in column and lowercase in row; different letters represent p<0.05, uppercase
in column and lowercase in row.
The IC50 values of the tea extracts against α-glucosidase activities are presented in
Table 3.4. None of the tea samples were particularly strong inhibitors and the original GT was
the most active sample with an IC50 at 512 µg/mL, compared to 675 µg/mL for the tannase-
treated GT sample. IC50 values could not be obtained for BT and MT as they did not reach 50
% inhibition at the concentrations used. The α-glucosidase inhibitory effect was ranked as GT
> WT > BT > MT for original extracts and as WT > GT > MT > BT for enzyme treated
extracts. The IC50 of the original WT and enzyme treated WT extracts were 662.0 and 604.7
µg/mL, respectively. Tannase treatment did not improve the effectiveness of BT (500 mg/mL
BT achieved 64% activity) but Mate was slightly more effective (i.e. 500 µg/mL achieved 84
% activity). Overall the tea extracts were much less effective against glucosidase than
amylase with IC50 values for α-amylase ~50 fold lower in some cases.
Table 3.4 Half maximal inhibitory concentration (IC50) values based on total phenols content
of tea extracts on α-glucosidase activity.
TPC (µg GAE/mL)
Original 500 511.9 ± 2.8Bb 662.0 ± 47.2Aa 500
(65% ± 0.8)* (94% ± 1.2)*
Biotransformed 500 674.7 ± 60.9Aa 604.7 ± 42.8Aa 500

(64% ± 0.9)* (84% ± 2.0)*
test. *% Activity obtained at the highest concentration tested. Same letters represent p>0.05, uppercase in column and
lowercase in row; different letters represent p<0.05, uppercase in column and lowercase in row.

174

The particular enhancement of amylase inhibition of WT (X6) and GT (X15) by
tannase treatment suggests that the reduction in galloylated components (such as EGCG and
ECG) and corresponding increases in gallic acid and free catechins may be important for
inhibition. Although to a much lesser extent, tannase treatment also increased the levels of
flavonol aglycones such as quercetin, kaempferol and myricetin in WT and GT through
hydrolysis of various glycosylated flavonols (shown in the previous chapter). Although these
differences were much less apparent than the changes in ECGC and EGC, approx ten-fold
lower by UV absorbance, they may still be relevant. Flavonols and their aglycones have been
found to inhibit a-amylase in vitro, with IC50 values at micromolar levels (equivalent to ~
6µg/mL for quercetin). Modelling suggested that these components act by binding at the
48
active site and that glycosylated flavonols were considerably less effective than their
aglycones. Therefore, relatively small increases in flavonol aglycones in biotransformed green
and white tea samples may partly account for their enhanced effectiveness in amylase
inhibition. However, some inhibition may also occur through non-specific inhibition by
interaction of phenolic hydroxyl groups with enzymes through hydrogen bonds and/or
hydrophobic bonds. 49
The teas were not very effective inhibitors of glucosidase and overall, tannase
treatment did not improve inhibition. Flavonols have been found to have high glucosidase
inhibitory activity 50 but although their levels increased after tannanse treatment, they formed
a small proportion of the total content.
Amylases and glucosidases are the main enzymes responsible for the processing of
dietary starch and producing monosaccharides for absorption by enterocytes. α-Amylase
hydrolyses α-1,4-glycosidic bonds and splits amylose and amylopectin into smaller
oligosaccharides and disaccharides, like maltose. The α-glucosidases hydrolyse disaccharides
to monosaccharides. Previous reports suggest that the inhibition of these enzymes can be an

175

important concept for management of type 2 diabetes since inhibition of the two hydrolytic
enzymes could retard the influx of glucose from the intestinal tract and modulate increases in
postprandial blood glucose. 51 α-Glucosidase inhibitors, such as acarbose, have been shown to
be effective in suppressing postprandial hyperglycemia by limiting glucose absorption and the
resulting insulin response and this drug is one of the most widely used α-glucosidase
inhibitors to treat patients with type 2 diabetes and also to reduce vascular complications such
52
as retinopathy and neuropathy. However, synthetic α-glucosidase inhibitors such as
acarbose are often associated with gastrointestinal side effects including abdominal pain,
flatulence, and diarrhoea due to bacterial fermentation of undigested carbohydrate in the

53
colon. Kwon et al. suggest that intestinal α-glucosidase and α-amylase inhibitors from
natural sources such as plant-based foods could be as effective as synthetic drugs with lesser
undesirable side effects. However, high amylase inhibition and low glucosidase inhibition
shown by the tea samples might also show these negative side effects in vivo due to survival
of starch oligomers into the colon. Biotransformation of the teas with tannase is unlikely to
have improved these side effects as it enhanced amylase inhibition in most cases and did not
increase glucosidase inhibition.
3.3 Lipase inhibition effects
All tea samples showed inhibition of lipase and using ρNP as substrate they were
ranked as MT ≥ GT ≥ WT > BT for original extracts and WT > BT = GT = MT for tannase-
treated extracts (Table 3.5). WT and GT did not show inhibition of lipase activity when tested
at 25µg/mL (Figure 3.2) but gave slight but significant activation for some teas (Figure 3.2,
12
GT). In previous work, Gondoin et al. reported IC50 values of 35 and 22 µg/mL for their
WT and GT preparations but reported no inhibition by BT at 200 µg GAE/mL. However, in
this study, BT showed effective inhibition (IC50 ~ 75 µg/mL).

176

Table 3.5 Lipase activity using ρNP substrate. Half maximal inhibitory concentration (IC50)
values based on total phenols content of tea extracts on lipase inhibition.
IC50 Black Tea Green Tea White tea Mate tea
TPC (µg/mL)
Original 75.0 ± 6.1Aa 51.2 ± 2.4Bbc 59.4 ± 4.3Ab 43.4 ± 3.7Bc
Biotransformed 68.9 ± 0.7Aa 69.9 ± 1.7Aa 55.8 ± 1.5Ab 70.0 ± 3.5Aa
test. Same letters represent p>0.05, uppercase in column and lowercase in row; different letters represent p<0.05, uppercase
in column and lowercase in row.
Overall the effects of tannase treatment were slight (e.g. changes in IC50 values of 1.6
12
– 1.0 fold). In Gondoin et al., WT was more effective than GT, but only bio-transformed
samples showed this trend when the effectiveness of GT was reduced from IC50 values of ~51
to 70. The extracts in this study were less effective but these differences probably arose
because the WT and GT were obtained from different sources and had different compositions.
Notably, although tannase-treatment did not greatly alter the IC50 value for WT
(Figure 3.2), there was a trend to greater inhibition than the original WT with higher amounts
of extract. With GT, tannase treatment reduced the IC50 value (50 – 70 µg/mL) and this lower
effectiveness was apparent at higher concentrations.

12
Gondoin et al. suggested that catechins, EGCG and estrictinina contents were
important for the inhibition of lipase. GT and WT had higher contents of these compounds
than black tea which supports this theory. Indeed, EGC, EGCG and gallic acid have been
identified as competitive inhibitors of pancreatic lipase in vitro with effectiveness, EGCG >
54,55
EGC > gallic acid. However the reduction of EGCG and ECG in biotransformed white
tea did not alter the IC50 values as the higher content of catechin, epicatechin and gallic acid
may compensate for the loss of galloylated catechins. The mate tea extract showed high levels
56
of caffeoyl quinic acid derivatives and caffeic acid. Rohn et al. reported that chlorogenic
acid inhibited amylase, trypsin and lysozyme through covalent bond formation but recent
work has suggested that chlorogenic acid may bind at the active site of pancreatic lipase as a

177

57
competitive inhibitor. This may partly explain the effectiveness of mate tea in lipase
inhibition (IC50 = 43 µg/mL) and the lower inhibition by biotransformed mate tea extract
(IC50 = 70 µg/mL), which has reduced chlorogenic acid content. However, in these mixtures,
non-specific interactions of phenolics with lipase (protein-binding) may play a part in
inhibition.
Figure 3.2 Effect of white tea (a) and green tea (b) extracts on lipase activity. The dose
response for phenols content of extracts on lipase inhibition was assessed. Values are
expressed as % control activity and were triplicates ± standard deviation.
Lipase activity was also measured by changes in turbidity of olive oil due to the
breakdown of triacylglycerol to free fatty acids and monoacylglycerols. Orlistat, a lipase
inhibitor used as a positive control, strongly inhibited lipase activity with an IC50 of 0.4
µg/mL (data not shown). The extent of inhibition using the olive oil substrate were lower than
that shown with the synthetic substrate (ρNP-laurate) with GT, MT and BT approaching 60 %
activity at 200-250 µg/mL with no significant increases up to ~ 500 µg/mL (Table 3.6). Only
WT gave an IC50 value (~ 110 µg/mL) but this was which was 2 fold higher than the IC50
value noted for the ρNP laurate assay. The apparent order of effectiveness was WT > GT, MT
& BT, which was different from the order with ρNP-laurate. Overall, tannase-treatment

178

improved inhibitory performance in BT, GT and MT but slightly reduced the effectiveness of
WT but still gave an order of WT ≥ GT ≥ MT > BT. The tannase-treated teas also began to
plateau in effectiveness at higher concentrations so inhibition at 350 µg/mL was often only
35-45% (results not shown).
Table 3.6 Lipase activity using olive oil as a substrate. Half maximal inhibitory concentration
(IC50) values based on total phenols content of tea extracts on lipase inhibition.
TPC (µg/mL)
Original 250 200 112.0 ± 2.8B 200
(60.3% ± 2.6)* (61.8 ± 6.1)* (63.7 ± 5.0)*
Biotransformed 243.0 ± 9.6a 146.5 ± 12.5b 125.9 ± 4.7Ab 189.0 ± 10.6b

test. *Activity(%) from the best inhibition. Different letters represent p<0.05, uppercase in column and lowercase in row.
The ρNP-laurate is a synthetic substrate whereas olive oil is a natural mixture of

38
different triacylglycerols with varying acyl chain length, of differing affinity for lipase.
Lipase has to act on triglyceride substrates twice for there to be a detectable change, as
diacylglycerol is not solubilised and does not therefore reduce turbidity. This could explain
the lower levels of inhibition seen using olive oil compared to the synthetic substrate which
only requires one cleavage event. Also, pancreatic lipase has two domains, the N-terminal
catalytic domain (AA residues 1-336) and a C terminal domain (residues 337-449) which
binds to colipase which allows formation of the substrate-lipase complex, anchors the lipase
on the oil surface and stabilizes it in the active conformation. 58 The oil assay, but not the pNP
assay, requires added colipase and therefore tea components could also influence activity by
affecting colipase-lipase stability.

59
The observed inhibitory effect of teas on lipase activity agrees with He, et al.
where the effect on pancreatic lipase was less severe than with amylase. Pancreatic lipase is
essential for digestion of dietary fats in the intestinal lumen. It removes the fatty acids in
60
positions 1 and 3 of triglycerides releasing 2-monoacylglycerol and fatty acids. Inhibition

179

of lipase is one of the most studied mechanisms for determining the potential efficacy of
natural products as anti-obesity agents. Limiting lipid digestion reduces fatty acid absorption,
60
lowers caloric utilization and may influence weight loss. Tetrahydrolipstatin (Orlistat) is
currently approved for the treatment of obesity and, taken with a suitable diet, this drug has
been proven to promote weight loss and reduce weight recovery in obese patients over a
61
period of 2 years. However use of Orlistat has been associated with adverse and
discomforting side effects and there has been a drive to discover natural alternatives which
has highlighted different classes of compounds such as saponins, polyphenols and terpenes
from plants. 62
3.4 3T3-L1 Cell Culture and adipogenesis
Most original and tannase-treated tea extracts were not cytotoxic to 3T3-L1 cells
(Figure 3.3) but certain samples (BT, BT-treated and MT) gave up to 20% non-viable cells.
However, this level has been suggested to be non-cytotoxic in previous studies 63.
140 250µg/mL 500µg/mL

87.3 112.8 106.2
107.1
120 106.9 * *
Cell viability %
98.9 102.5 96.7 * 82,8 100.7 *

97.3 88,7 * 98.0
100 87,7 88,7
80,0
80
60
40
20
0
White Tea Biotransf. Green Tea Biotransf. Black Tea Biotransf. Mate tea Biotransf.
White Tea Green Tea Black Tea Mate Tea
Figure 3.3 Effect of tea extracts on 3T3-L1 cell viability. Two concentrations of tea extracts
(250 and 500 µg of TPC/mL) were applied. Results are means of three replicate experiments
± standard deviation. Values different from control group at *p< 0.05 are shown.

180

The effects of tea samples on adipogenesis were assessed by prevention of lipid
accumulation in 3T3-L1 cells as measured by Oil Red O staining. Previous studies have
shown that polyphenols as well as various natural extracts induce apoptosis, decrease lipid
40,64,65
accumulation and stimulate lipolysis in pre-adipocytes and adipocytes. All original tea
samples significantly inhibited adipogenesis compared to controls in a dose-dependent
manner (Figure 3.4). The order of effectiveness was WT >MT >GT> BT. In all cases, the
tannase-treated tea samples were more effective than the original samples, albeit in BT this
only became significant at 400-500 µg/mL. However, the order of effectiveness did not
change. Biotransformed WT was the most effective treatment reducing lipid content to ~40%
control at 500 µg/mL. However, tannase-treated MT was more effective at lower
concentrations e.g. at 100 µg/mL tannase-treated MT gave ~65 % control lipid levels.
In BT, although tannase treatment enhanced gallic acid, epicatechin, catechin and
gallocatechin, prodelphinidin B2-3’-O-gallate levels were reduced. Prodelphinidin B2 is a

66
dimer of gallocatechin units and prodelphinidin B2-3’-O-gallate is capable of forming
complexes with proteins and polysaccharides, and may interact with enzymes and
transcription factors involved in adipogenesis. 67 Kuo et al. 68 showed that prodelphinidin B-2
3’-O-gallate inhibited the proliferation of A549 cells and had no detectable toxic effects on
normal WI-38 cells.
Biotransformed WT inhibited adipogenesis at all concentrations tested. Increasing
doses reduced lipid accumulation over the control, reaching levels of 42% at a concentration
of 500 µg GAE/mL. This was significantly different from the original extract which reached
30
53% at this dose. However, Söhle et al. noted that a related WT extract reduced lipid
accumulation up to 70%. The improvement of both GT and WT by biotransformation
suggests that reducing EGCG levels and increasing gallic acid and catechins may aid in

181

restricting adipogenesis. 13,69 It is also possible that catechins act in synergy with the surviving
caffeine to have a greater effect on adipogenesis as suggested by Dulloo et al.69
The effectiveness of the tannase-treated Mate tea may be explained by increased
relative amounts of the caffeoyl quinic acid isomers and caffeic acid.
150 Original Biotransformed Control

A
*a *a *a *a *a *b *a *b
% Lipid content
100
50
0
Control 100 µg 200 µg 400 µg 500 µg

B *a *b *a *b *a *b *a *b
%Lipid content
100
50
0
C *a *b *a *b *a *b *a *b
% Lipid content
100
50
0
D
% Lipid content
100 *a *b *a *b *a *b *a *b
50
0
Figure 3.4 Effect of Black tea (A); Green tea (B); White tea (C) and Mate tea (D) on lipid
accumulation in 3T3-L1 cells.. Results are means of three replicate experiments ± standard
deviation. We used analysis of variance, followed by Tukey’s test. *p< 0,05 compared with
control group. Same letters represent p>0.05; different letters represent p<0.05.

182

4. Conclusions
The tannase-mediated biotransformation of tea extracts caused predictable changes in
polyphenolic composition (increased gallic acid, caffeic acid, flavonol aglycones) and the
transformed extracts retained or improved their ability to inhibit the crucial starch hydrolysing
enzymes, α-glucosidase and amylase. However, the biotransformed teas inhibited α-amylase
most effectively, showing the greatest potential in use as an effective complementary therapy
for post prandial hyperglycemia linked to type 2 diabetes. Although biotransformed samples
had different behaviors, in general, the biotransformation was beneficial in lipase inhibition.
Furthermore, our data demonstrated that biotransformed tea extracts were more effective in
inhibiting adipogenesis than the originals. The results suggest that biotransformed teas are,
therefore, a suitable source to modulate the adipocyte life cycle and to induce hypolipidemic
action due to high inhibitory action of lipase and have therefore the potential to influence
body weight and obesity.
Scarce information is available with respect to enhanced functional properties of tea
extracts after tannase treatment; therefore, it appears reasonable to suggest that our findings
may be useful for the extension of existing applications of tannase in relation to tea
improvement.

183

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190

DISCUSSÃO GERAL
Estudos centrados em tecnologias que facilitem processos para obtenção de alimentos

com maior poder nutracêutico e no aumento da biodisponilibidade de compostos bioativos
tem aumentado consideravelmentemente. Estratégias nutricionais que proporcionem
prevenção e adjuvantes no tratamento de doenças crônicas são cada vez mais necessárias e
procuradas pela população. Logo, torna de suma importância que a comunidade científica
elucide cada vez mais o poder dos alimentos e formas que potencializem seus benefícios.
Nesse sentido, esse estudo proporcionou a encapsulação da enzima tanase com adequada
eficiência de imobilização (%EI) e boa porcentagem de atividade enzimática (%AE). A
estabilidade operacional da tanase imobilizada foi avaliada em processos descontínuos
repetidos. Depois de cada batelada, a tanase imobilizada foi lavada e reutilizada em condições
ótimas para a reação. A porcentagem de atividade residual foi determinada para 6 bateladas
sequenciais, indicando que a tanase imobilizada em alginato 5% reteve 86% da sua atividade
específica original após 5 ciclos, enquanto que tanase imobilizada em alginato 3,6% reteve
83%. Este é um resultado que demonstra promissor uso industrial destes imobilizados.
Através desse estudo foi possível o desenvolvimento de um modelo de biorreator
capaz de produzir, em maior escala, ácido gálico a partir da hidrólise de ácido tânico, podendo
ser utilizado em matrizes alimentares sem que necessite a permanência da enzima no produto
final. O planejamento adotado foi do tipo DCCR e as respostas foram obtidas através das
análises de atividade enzimática e eficiência de imobilização. A avaliação estatística do
planejamento mostrou até dois parâmetros significativos, porém, a análise de variância
mostrou que os resultados foram considerados insatisfatórios para geração de um modelo
preditivo (R2 < 0,5). Entretanto, os resultados individuais dos ensaios indicaram a tendência
dos parâmetros analisados e permitiram fixar os valores da concentração de alginato,
temperatura e agitação no ensaio subsequente do biorreator. O estudo univariado permitiu
atingir as condições mais adequadas para a hidrólise utilizando ácido tânico como substrato
(alginato na concentração de 5%, 300 rpm de agitação, temperatura de 60ºC e concentração
do imobilizado enzimático de 0,75%). O trabalho mostrou as condições para a construção de
um biorreator com tanase imobilizada de forma a obter alta produtividade e alta eficiência.
Após esses resultados foi utilizado o biorreator para a biotransformação de 4 chás,
sendo eles: chá verde, branco, preto e mate. O tratamento com tanase imobilizada aumentou o
teor de polifenóis totais de 1,2 a 1,8 vezes. O tratamento enzimático permitiu a hidrólise das

191

ligações éster ou depsídicas dos taninos hidrolisáveis e ésteres de ácido gálico, como por
exemplo, EGCG e ECG (LEKHA; LONSANE, 1997). Esse aumento pode ser explicado por
uma maior reação dos produtos da reação enzimática com o reagente utilizado na técnica para
determinação de fenólicos (Follin Cecaulteau) e também é importante destacar que a enzima é
capaz de remover o material não fenólico contido nas amostras de chás e assim liberar os
compostos fenólicos ligados a fibras e outros complexos (CHAMORRO et al., 2012).
A análise por cromatografia líquida permitiu além da detecção de inúmeros
compostos, a quantificação dos principais polifenóis presentes nos chás. A catequina EGCG
foi confirmada por comparação da massa dos íons do pico padrão. O pico deste composto
apresentou maior área nas amostras originais, entretanto, em chás biotransformados por
tanase, foi detectado o aumento da sua forma de aglicona. Outra catequina detectada através
de seu espectro de massa revelou um íon de massa consistente com a estrutura de EGC (PM:
306 g/mol) detectado pelo íon de m/z 305, e ainda detectando o íon fragmentado que
corresponde à perda de CO2 (m/z 261) e C6H6O3, (m/z 179), resultado da cisão do anel
heterocíclico (GU et al., 2003; ZHAO et al., 2011). Este resultado é consistente com os
resultados apresentados por Macedo et al. (2011), estudo que comprovou que a tanase pode
hidrolisar a epigalocatequina galato em epigalocatequina e ácido gálico.
O ECG foi identificado com base na comparação do espectro de absorção, tempo de
retenção, e maior íon de fragmentação e notavelmente os extratos originais apresentaram os
níveis mais elevados, enquanto que naqueles que sofreram modificação de seu perfil fenólico
pela tanase o pico diminuiu significativamente. Os picos identificados como (-)-EC e ácido
gálico apresentaram níveis mais elevados em chás preto, verde e branco biotransformados.
Outras mudanças ocorreram nos extratos de chá devido ao tratamento enzimático: CVT e
CBT mostraram níveis mais elevados de GC, catequina e ácido clorogênico, acompanhado
pela diminuição de GCG, bem como a hidrólise da rutina e aumento da sua forma aglicona, a
quercetina, foi observado. No chá preto a tanase imobilizada resultou no aumento de ácido
gálico, epigalocatequina, catequina e epicatequina. O aumento do pico da miricetina e
kaempferol após o tratamento com tanase imobilizada, ainda que tenha sido muito discreto,
sugere que houve a hidrólise dos derivados de miricetina e kaempferol. Os resultados são
consistentes com Battestin et al. (2008), He et al. (2006), Macedo et al. (2011), Ni et al.
(2015) e Ferreira et al. (2013) e indicam que a tanase a partir de P. variotii na forma
imobilizada também é capaz de hidrolisar as ligações éster de substratos naturais.

192

A análise por HPLC/MS do extrato de chá mate revelou a presença de vários

derivados de ácido hidroxicinâmico, sendo a principal alteração pelo tratamento da tanase o
aumento de ácido cafeico, seguido da diminuição de ácido clorogênico e ácido
dicafeoilquínico. Resultados semelhantes foram detectados com tratamento de tanase livre
(MACEDO et al., 2011). A identificação do ácido clorogênico foi confirmada por análise do
íon majoritário, que revelou a presença do íon negativo [MH]- com m/z = 353. A
fragmentação MS2 com m/z 191 e 179 foram consistentes com ácido quínico e ácido cafeico,
bem como a fragmentação com m/z 173 indica a saída de uma molécula de água do ácido
quínico. Em contraste aos achados deste estudo e de Bastos et al. (2007), Filip et al. (2001)
descreveu a presença de quercetina, kaempferol e miricetina em extratos de chá mate.
Além da caracterização extensa dos chás, 66 compostos foram identificados através da
análise cromatográfica. As mudanças nas concentrações dos principais fenólicos antes e após
a biotransformação também foram mensuradas, confirmando o aumento de compostos para os
quais estudos têm relatado ter maior biodisponibilidade (OLTHOF; HOLLMAN; KATAN,
2001; MANACH; DONOVAN, 2004; MACEDO et al., 2011). Dentre os vários resultados
interessantes, como o aumento de deglicosilados e diminuição da cafeína, o aumento mais
significativo foi claramente o aumento de ácido gálico, quando houve aumento de 16 vezes
para o chá verde e 13 vezes no chá branco. O chá preto apresentou aumento menos
significativo, o que pode ser explicado por já apresentar menor teor de moléculas que
pudessem hidrolisar e liberar moléculas de ácido gálico, como a EGCG e ECG. No chá verde
foi demonstrado que a tanase foi capaz de diminuir em 75% o teor de EGCG, aumentando em
70% seu produto de hidrólise EGC, além disso, ocorreram 95% de hidrólise da ECG,
acarretando num aumento de aproximadamente 2,7 vezes o conteúdo de EC, comprovando
alta afinidade da enzima por este substrato. Estes achados foram corroborados com a hidrólise
de 91% e 75% da ECG no chá preto e chá branco, respectivamente. Estas constatações
reafirmam a eficiência da tanase imobilizada na hidrólise de chás, uma vez que obtivemos
resultados de hidrólise próximos a estudos que utilizaram tanase livre em chás (LU; CHEN,
2008; RAGHUWANSHI; MISRA; SAXENA, 2012).
O tratamento da tanase em todos os extratos gerou uma complexa mistura de
estruturas diferentes, com ação antioxidante significativamente superior (métodos DPPH,
ORAC e FRAP (≤0.05)). O fator decisivo para explicar esses resultados da atividade
antioxidante pode ser a composição fenólica de cada extrato e não simplesmente o conteúdo
fenólico total (BASTOS et al., 2007). A catequina com maior atividade antioxidante ainda é

193

assunto controverso, então é relevante considerar as relações estabelecidas entre estrutura,

potencial de redução e as interações do conjunto dos compostos. À medida que a atividade
antioxidante é influenciada por ácidos fenólicos e flavonoides monoméricos, e que alterações
nos seus arranjos dos grupos hidroxilas e substituições por glicosilação acabam diminuindo a
atividade antioxidante (RICE-EVANS; MILLER; PAGANGA, 1997), espera-se que os fenóis
com moléculas menores e as agliconas aumentem a atividade antioxidante. Nesse sentido os
resultados deste estudo concordam com os estudos de Macedo et al. (2011), Macedo et al.
(2012) e Ni et al. (2015) quando a tanase ajudou a aumentar a atividade antioxidante,
corroborando a tese de que a tanase imobilizada tem aplicações práticas no processamento de
chás. Embora chás de Camellia sinensis biotransformados enzimaticamente tenham
apresentado melhora na atividade antioxidante, observou-se grande melhoria do chá mate
após a biotransformação, 3,35 vezes para DPPH, 1,42 vezes para ORAC e 1,13 para FRAP.
Ainda que a relação estrutura-atividade seja mais complexa e, vários fatores devem ser
analisados, os resultados desses ensaios apoiam o princípio de que as estruturas com mais
grupos hidroxila exercem maior atividade antioxidante, uma vez que a hidrólise pela enzima
reestabelece a molécula com mais uma OH livre, como por exemplo, os ésteres de catequina
galato, que ao serem hidrolisados resultam na liberação dos antioxidantes catequina e ácido
gálico (RICE-EVANS; MILLER; PAGANGA, 1996).
Ao realizar o estudo in vitro para avaliar a disponibilidade dos compostos fenólicos e a
sua estabilidade através do processo digestivo em um modelo de sistema que simula o
processo digestivo humano, os cromatogramas das amostras pós-digestão puderam
demonstrar que as etapas do processamento do chá podem, potencialmente, influenciar a
bioacessibilidade de polifenóis bioativos. Embora a proporção de polifenóis recuperados após
digestão in vitro foi mais elevada nas amostras originais do que nas de chás biotransformados,
através dos gráficos obtidos por cromatografia pode ser analisado que os picos de ácido
gálico, ácido cafeico, PDGB, EGC e EC são capazes de resistir à digestão gástrica e se não
forem absorvidas até este momento, atingem o intestino, onde por serem moléculas simples
podem ser facilmente absorvidas pelos enterócitos. Em acordo com o princípio proposto por
Green et al. (2007) de que processos tecnológicos melhoram a recuperação dos compostos
fenólicos, ainda que o estudo não tenha substancialmente aumentado a recuperação dos
polifenóis, a biotransformação trouxe uma abordagem que permite a disponibilidade de
moléculas que são mais facilmente absorvidas e tem potencial de serem biodisponíveis e
bioacessíveis, ou seja, a melhora foi qualitativa e não quantitativa. É importante ressaltar que

194

os principais compostos incrementados através da biotransformação apresentaram boa

recuperação nas amostras de chá verde e chá branco, como por exemplo, o ácido gálico. A
estabilidade do ácido gálico nos três chás de Camellia sinensis, está de acordo com os
trabalhos sobre a biodisponibilidade do ácido gálico em seres humanos, que documentam que
este composto é extremamente bem absorvido, em comparação a outros polifenóis, fato
importante uma vez que é um potente antioxidante e possui uma ampla variedade de estudos
comprovando sua eficácia na prevenção e como adjuvante no tratamento da obesidade
(MANACH et al., 2005; TUNG et al., 2009; CHAO et al., 2014; BADHANI; SHARMA;
KAKKAR, 2015; DOAN et al., 2015).
Análises em cromatografia líquida com detector de espectrometria de massa (HPLC-
MS) mostraram que tanto EGC como EGCG foram as catequinas mais suscetíveis à
degradação na digestão pancreática. A instabilidade de catequinas ao pH quase neutro, bem
como a sensibilidade das catequinas às condições intestinais do duodeno já foram
previamente relatadas (ZHU et al., 1997; RECORD; LANE, 2001; SU et al., 2003). O pH
elevado (6,0-8,0), o oxigênio residual dissolvido, e provável presença de espécies reativas de
oxigênio advindas da digestão normal podem facilitar várias reações, incluindo a
epimerização e auto-oxidação no lúmen intestinal (ZHU et al., 1997; SU et al., 2003).
Acredita-se que reações de auto-oxidação continuam devido à vulnerabilidade dos grupos
hidroxila adjacentes (radical pirogalol) no anel B da EGC e EGCG (ZHU et al., 1997; ARTS
et al., 2002) levando a desprotonação, subsequente formação de radicais livres semiquinona
no anel B (GUO et al., 1996; MIZOOKU et al., 2003; LAMBERT; SANG; YANG, 2007) e
permitindo que intermediários reajam ainda mais, formando vários produtos finais que,
potencialmente, incluem irreversíveis produtos de dimerização homo e hetero (YOSHINO et
al., 1999; MOCHIZUKI et al., 2002). De acordo com observações de Green et al. (2007), que
realizaram estudo sobre a estabilidade das catequinas EC e ECG, esses compostos são menos
sensíveis à digestão simulada. Estudos sugeriram que próximo ao pH neutro a capacidade de
doar elétron dos grupos pirogalol para EGCG e EGC é significativamente maior do que para
os grupos catecol em EC e ECG resultando em aumento da taxa de oxidação (MOCHIZUKI
et al., 2002), em outras palavras estas diferenças na estrutura do anel B podem, portanto, ser
útil na previsão da sensibilidade intestinal de catequinas e que pode ser melhor percebida
através da recuperação destas moléculas nas amostras biotransformadas de chás após a
simulação in vitro.

195

O ácido cafeico aumentado pela biotransformação foi passível de recuperação, sendo o

ácido fenólico o composto majoritário na amostra de chá mate obtida após a simulação da
digestão gástrica em comparação com a recuperação deste composto após a digestão na
primeira porção do intestino. Em indivíduos com ileostomia, foi demonstrado que 33% de um
total de 2,8 mmol de ácidos clorogênicos (isômeros 3,4 e 5-CQA) foram absorvidos no
estômago e intestino delgado, enquanto a absorção de ácido cafeico, administrado na mesma
dose, foi de 95% (OLTHOF et al., 2003). Resultados semelhantes foram encontrados em
experimentos com animais (AZUMA et al., 2000; GONTHIER et al., 2003). Dessa forma
salienta-se como a biotransformação do ácido clorogênico pode ter efeitos positivos na
biodisponibilidade de compostos bioativos realmente potentes, uma vez que viabilizou a
disponibilidade de ácido cafeico após a digestão gástrica, o que não ocorreu com a amostra de
chá mate original. O ácido clorogênico por sua vez não foi identificado nas duas amostras,
sugerindo que houve degradação em moléculas não identificadas. Dentre os inúmeros efeitos
farmacológicos comprovados do ácido cafeico, propriedades antioxidantes (STOJKOVIĆ et
al., 2013; GENARO-MATTOS et al., 2015), anti-inflamatórias (ZHANG et al., 2014;
CHOUDHARY et al., 2016), antibacteriana (LUÍS et al., 2014; LIMA et al., 2016) e
anticarcinogênica, (KANG et al., 2008; HONG et al., 2015; ROSENDAHL et al., 2015)
podemos ilustrar a importância desse composto para a saúde com os resultados do estudo em
que o ácido cafeico suprimiu a atividade de lipogênese e ativou a enzima AMPK. A enzima
AMPK está relacionada com a β-oxidação dos ácidos graxos, indicando o potencial
significativo do ácido cafeico como agente antiobesidade por supressão de enzimas
lipogênicas e acumulação de lipídeos (LIAO et al., 2013).
Nesse estudo também foi avaliado o poder dos chás originais e após biotrasformação
enzimática na inibição de enzimas gástricas. Todos os extratos apresentaram algum poder
inibitório da enzima α-amilase e foram ranqueados como CP > CM > CV > CB entre as
amostras originais e CVT > CBT > CPT > CMT entre as amostras que sofreram a ação da
tanase, mostrando que a tanase trouxe especialmente significativos benefícios para os chás
verde e branco, aumentando a inibição em 15 e 6 vezes, respectivamente.
Particularmente o aumento da inibição da amilase através do tratamento enzimático
sugere que a redução de componentes ligados ao grupamento galoil e consequente aumento
do ácido gálico e catequinas livres podem ter importante papel na inibição. Adicionalmente, a
tanase foi capaz de hidrolisar vários flavonols glicosilados, aumentando as formas agliconas
de quercetina, miricetina e kaempferol, que já tem sua maior ação sobre a inibição de enzimas

196

documentada (PIPARO; NESTLÉ, 2008). Portanto, os aumentos relativamentes pequenos de

flavonols agliconas em amostras de chá verde e branco biotransformadas pode explicar
parcialmente a sua eficácia aumentada na inibição da amilase. Amilase e glicosidases são as
principais enzimas responsáveis pela digestão do amido, produzindo monossacarídeos para a
absorção pelos enterócitos. Estudos sugerem que a inibição dessas enzimas podem ser uma
importante maneira de apoiar a manutenção de diabetes tipo 2, retardando assim a absorção de
glicose pelo trato gastrointestinal e modulando o aumento da glicose sérica pós-prandial
(APOSTOLIDIS; LEE, 2010).
Ao testar a inibição da enzima α-glucosidase não houve amostras com grande
atividade inibitória, no entanto amostras de CV apresentaram maior inibição, com IC50=
512 µg/mL, comparado a 675 µg/mL das amostras após tratamento com tanase. Já o IC50 das
amostras originais e biotransformadas de chá branco foram 662,0 e 604,7 µg/mL,
respectivamente. Não foi obtido IC50 das amostras de chá preto e mate, pois não atingiram
50% da inibição. O tratamento com tanase imobilizada não foi capaz de aumentar o poder do
chá preto, ensaio com 500 µg/mL de CP apresentou 65% e com CPT 64% da atividade de α-
glicosidase, enquanto o chá mate após sofrer a hidrólise da tanase foi capaz de diminuir a
atividade de 94% para 84% com 500 µg/mL.
Todas as amostras de chás apresentaram inibição da lipase usando ρNP-laurato como
substrato. Enquanto que para as amostras originais o chá com maior ação inibitória sobre a
enzima foi o chá mate e os menores foram chá preto e branco, após o tratamento com tanase o
comportamento foi o inverso. Gondoin et al. (2010) sugeriram que as catequinas, EGCG e
estrictinina são importantes nesse mecanismo de ação. Chá verde e chá branco apresentaram
maior conteúdo desses compostos que o Chá preto, suportanto essa teoria.
De fato, EGCG, EGC, e ácido gálico têm sido identificados como inibidores
competitivos da lipase pancreática in vitro (RAHIM; TAKAHASHI; YAMAKI, 2015; ZHU
et al., 2015), entretanto, a redução de EGCG e ECG no chá branco biotransformado não
prejudicou valores de IC50. O maior teor de catequina, epicatequina e ácido gálico pode
compensar a perda de catequinas com a molécula de galato. O extrato de chá mate apresentou
altos níveis de derivados de ácido cafeoilquínico e ácido cafeico. Rohn, Rawel e Kroll (2002)
relataram que o ácido clorogênico inibiu a amilase, tripsina e lisozima através da formação de
ligações covalentes, mas trabalhos recentes sugeriram que o ácido clorogênico pode se ligar
ao local ativo da lipase pancreática como um inibidor competitivo. Isto pode explicar em parte
a eficácia do CM na inibição da lipase (IC50 = 43 µg / mL) e a menor inibição pelo CMT

197

(IC50 = 70 µg / mL), que tem reduzido teor de ácido clorogênico. Contudo, nestas misturas,
interações não específicas de fenólicos com lipase (ligação a proteínas) podem desempenhar
um papel na inibição.
Quando a atividade da lipase foi avaliada utilizando como substrato o azeite e como
controle positivo o orlistat, medicamento comumente utilizado para diminuir a absorção de
lipídeos, percebeu-se que a extensão da inibição foi menor que a mostrada com o substrato
sintético (ρNP-laurato) com CV, CM e CP. O ρNP-laurato é um substrato sintético, enquanto
que o azeite é um substrato natural, resultado de uma mistura de diferentes triacilgliceróis
com comprimento de cadeia acila variáveis, que terão afinidade diferente pela enzima
(ROGALSKA; RANSAC; VERGER, 1990; JEMEL et al., 2009). A enzima teria também de
atuar sobre o substrato duas vezes para que houvesse alteração detectável na densidade óptica,
uma vez que a atividade da lipase foi medida por alterações na turbidez da solução de azeite
devido à degradação do triacilglicerol em ácidos graxos livres e monoacilglicerol. Nessa ação
de hidrólise primeiramente forma-se o diacilglicerol, que não foi tão solubilizado e, portanto,
não reduziu tão fortemente a densidade óptica. Outro fator que deve ser avaliado é que a
cadeia polipeptídica da lipase pancreática é dividida em duas unidades, o domínio terminal N
compreende os resíduos de aminoácidos 1-336 e o domínio terminal C com os resíduos 337-
449 (TILBEURGH et al., 1992). O terminal N é o domínio catalítico e o terminal C liga-se à
colipase, um cofactor necessário para a atividade da enzima. A colipase liga-se à lipase,
tornando-se um intermediário que permite a formação do complexo substrato-lipase e
contribui para ancorar a lipase na superfície e estabilizá-la na conformação ativa
(BROCKMAN, 2000). No ensaio utilizando o substrato natural utilizou-se colipase, uma vez
que os compostos de chás também podem interagir com colipase e ao desestabilizar a
conformação enzimática o efeito inibidor pode ser aumentado ou caso contrário, se esta
interação não ocorrer a enzima pode tornar-se mais estável. Por outras palavras, a interação
inibidor-complexo enzimático é diferente da interação inibidor-lipase utilizadas nos ensaios.
A maioria dos extratos de chás originais e biotransformados mostrou não ser
citotóxicos para células 3T3-L1. Ainda que alguns (CP, CPT e CM) tenham apresentado até
20% de células não viáveis, este valor não é preocupante e tem sido sugerido como não
citotóxicos em estudos anteriores (SIMÕES; AMOROS; GIRRE, 1999). Os efeitos das
amostras de chá sobre a adipogênese foram avaliados pela prevenção da acumulação de
lípideos em células 3T3-L1, tal como medido pela coloração com Oil Red O. Estudos
anteriores mostraram que os polifenóis, assim como vários extratos naturais, induzem a

198

apoptose, diminuem a acumulação de lipídeos e estimulam a lipólise em pré-adipócitos e

adipócitos. Todas as amostras originais de chá inibiram significativamente a adipogênese em
comparação com os controles de uma forma dependente da dose. Em todos os casos, as
amostras de chá tratadas com tanase foram mais eficazes do que as amostras originais, mesmo
que em pequenas proporções. O CBT foi o tratamento mais eficaz reduzindo o teor de
lipídeos para ~ 40% em relação ao controle na concentração de 500 µg / mL. Contudo, CMT
foi a amostra mais eficaz quando avaliado em concentrações mais baixas.
Em CP, embora o tratamento com tanase tenha aumentado o ácido gálico,
epicatequina, catequina e galocatequina, os níveis de PDBG foram reduzidos. A
prodelfinidina B2 é um dímero de unidades de galocatequina (SEVERINE; HOSTE, 2006) e a
PDBG é capaz de formar complexos com proteínas e polissacarídeos, podendo ainda interagir
com enzimas e fatores de transcrição envolvidos na adipogênese, explicando resultados tão
aproximados entre CP e CPT (OKUDA, 2005). Nos chás branco e verde a melhoria pela
biotransformação sugere que a redução dos níveis de EGCG e o aumento do ácido gálico e
das catequinas agliconas podem ajudar a restringir a adipogênese (DULLOO et al., 1999;
LIN; DELLA-FERA; BAILE, 2005). Também é possível que as catequinas agliconas ajam
em sinergia com a cafeína remasnescente para ter maior efeito sobre a adipogênese
(DULLOO et al., 1999).
A eficácia do CMT pode ser explicada por quantidades relativamente aumentadas de
isômeros de ácido cafeoilquínico e ácido cafeico. Juman et al. (2011) detectaram que o
tratamento de ácido cafeico em células 3T3-L1 diminuiu a deposição de triglicerídeos
semelhante ao resveratrol, que é conhecido por ter efeito inibitório na diferenciação de
adipócitos, da supressão da produção e secreção de adipocitocinas a partir de adipócitos
maduros. Esses resultados mostram que além da biotransformação permitir a presença de
moléculas mais bioacessíveis e biodisponíveis, os extratos ainda mantém sua atividade na
diferenciação de adipócitos, podendo ser utilizado como tratamento adjuvante na obesidade.

199

CONCLUSÃO GERAL
Primeiramente este trabalho possibilitou a comprovação do potencial da utilização da

tanase imobilizada em biorreator de batelada como processo viável para obtenção de
hidrolisados fenólicos com maior valor biológico.
Através da identificação do perfil de polifenóis em cada extrato de chá, pode-se
identificar que a tanase imobilizada é capaz de hidrolisar os substratos contidos em chás,
apresentando principalmente ácido gálico, EGC, EC, ácido cafeico e agliconas de flavonol
aumentados. A análise da capacidade antioxidante permitiu observar que o tratamento com a
tanase aumentou a sua potência antioxidante, mostrando que essa reação resulta em polifenóis
com nível de capacidade antioxidante mais elevado. Os polifenóis dos chás exibiram melhor
estabilidade às condições digestivas gástricas simuladas, ou seja, a biotransformação dos
polifenóis em moléculas menores pode possibilitar que os bioativos sejam absorvidos antes da
degradação no trato gastrointestinal.
Os chás biotransformados inibiram a α-amilase de forma mais eficaz, mostrando o
maior potencial como uma terapia complementar eficaz para hiperglicemia pós-prandial
ligada ao diabetes tipo 2. Embora as amostras biotransformadas tivessem comportamentos
diferentes, em geral, a biotransformação foi benéfica na inibição da lipase. Além disso, os
nossos dados demonstraram que os extratos de chá biotransformados eram mais eficazes na
inibição da adipogênese do que os originais. Esses resultados sugerem que os chás
biotransformados são uma fonte alimentar adequada para modular o ciclo de vida dos
adipócitos e para induzir ação hipolipidêmica podendo influenciar no peso corporal e na
obesidade. Portanto, parece razoável sugerir que este estudo é útil para a extensão de
aplicações existentes de tanase imobilizada em relação à melhoria de chás vizando seu
potencial uso como adjuvantes em tratamentos de obesidade e diabetes mellitus tipo 2.

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207

ANEXOS
ANEXOS

208

1. Comprovante da autorização da utilização de artigos já publicados

209

210

211

Roberto BrunaSampaio D PDF

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS

BRUNA SAMPAIO ROBERTO

ESTUDO DO EFEITO DE POLIFENÓIS DE CHÁS

STUDY OF THE EFFECTS OF BIOTRANSFORMED TEAS

ESTUDO DO EFEITO DE POLIFENÓIS DE CHÁS

STUDY OF THE EFFECTS OF BIOTRANSFORMED TEAS

Tese apresentada à Faculdade de Engenharia

Thesis presented to the Faculty of Food

Orientadora: Dra. GABRIELA ALVES MACEDO

Durante esta caminhada, buscando resposta para algumas de minhas inquietações e

Palavras-chave: Chás, Camelia sinensis, Ilex paraguariensis, tanase, polifenóis, obesidade.

Keywords: Teas, Camelia sinensis, Ilex paraguariensis, tannase, polyphenols, obesity

CAPÍTULO I - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA - Efeito da biotransformação de

CAPÍTULO I - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA - Efeito da biotransformação de

Figura 3.6. Comportamento da atividade específica em estudo univariado com 5

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AE Atividade específica (U/mg de proteína)

LDL Low density lipoprotein

CAPÍTULO I - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA - Efeito da biotransformação de

2. Compostos fenólicos ....................................................................................................... 32

3.1 Chá Branco, Chá Preto e Chá Verde ..................................................................... 39

3.2 Chá Mate................................................................................................................ 42

3.3 Chás e a obesidade ................................................................................................. 44

4.1 Imobilização de enzimas........................................................................................ 49

CAPÍTULO II - Imobilização de tanase e caracterização cinética da hidrólise de

2. Materiais e Métodos ........................................................................................................ 79

2.1 Materiais ................................................................................................................ 79

2.2 Produção e imobilização da tanase ........................................................................ 79

2.3 Determinação da atividade enzimática e eficiência de imobilização .................... 80

2.4 Determinação de Km, Vmáx, Tempo de meia vida e Kd ...................................... 81

2.5 Estabilidade operacional e preservação da atividade durante armazenamento ..... 82

2.6 Estudo da hidrólise de ácido tânico em biorreator pela tanase imobilizada em

2.6.1 Biorreator utilizado ........................................................................................... 82

2.6.2 Delineamento composto central rotacional ....................................................... 84

2.6.3 Planejamento univariado ................................................................................... 85

2.7 Análise Estatística .................................................................................................. 86

3. Resultados e Discussão ................................................................................................... 86

3.1 Atividade Enzimática e Eficiência de imobilização .............................................. 86

3.2 Determinação de Km, Vmáx, Tempo de meia vida e Kd ...................................... 88

3.3 Estabilidade operacional e preservação durante armazenamento .......................... 92

3.4 Estudo da otimização da hidrólise de ácido tânico por delineamento composto

3.4.1 Delineamento composto central rotacional ....................................................... 94

3.4.2 Planejamento univariado ................................................................................... 98

4. Conclusão ...................................................................................................................... 100

5. Referências .................................................................................................................... 102

CAPÍTULO III - Hidrólise de fenólicos de variados tipos de chás por tanase

1. Introdução ..................................................................................................................... 112

2. Materiais e Métodos ...................................................................................................... 113

2.1 Materiais .............................................................................................................. 113

2.2 Chás e preparação dos extratos ............................................................................ 114

2.3 Imobilização da tanase e biotransformação enzimática....................................... 114

2.4 Caracterização do perfil de fenólicos dos chás por HPLC-ESI/MS e quantificação

2.4.1 Caracterização do perfil de fenólicos dos chás por Cromatografia Líquida de

2.4.2 Quantificação de compostos fenólicos por cromatografia líquida de alta

2.5 Atividade Antioxidante ........................................................................................ 117

2.5.1 Capacidade de sequestrar o radical DPPH ...................................................... 117

2.5.2 Teste de capacidade antioxidante do radical oxigênio – ORAC (Oxygen

2.5.3 Poder redutor do íon ferro – FRAP ................................................................. 117

2.6 Digestão in vitro .................................................................................................. 118

2.7 Análise estatística ................................................................................................ 119

3. Resultados e Discussão ................................................................................................. 119

3.1.1 Caracterização dos chás através da detecção e identificação por Cromatografia