CRESCIMENTO MICROBIANO

em suspensão em meio líquido

 Fases da divisão celular – fissão binária (p.ex. E.coli)

Microscopia de
contraste de fase

Microscopia de fluorescência
(coloração do nucleóide
com DAPI)

Detecção das proteínas que

formam o anel FtsZ)

(combinação de colorações –
nucleóide e anel FtsZ)

- Anel proteico (~10000 moléculas FtsZ) no centro da célula, quando começa a

segregação dos dois nucleóides (DNA). Fts – “Filamentous temperature sensitive”

- Proteinas Fts do anel proteico → divisoma (no centro da célula em divisão; orquestra síntese da
membrana plasmática e da parede celular durante enlongamento da célula, seguindo-se constrição
para formar o septo e separação das células).
 Ciclo celular
(ex. Eschericia coli)

Fase C

Fase D

E. coli
Tempo de geração médio, em condições óptimas
~ 25 minutos
 EXPERIÊNCIA DE CRESCIMENTO DE UMA
POPULAÇÃO MICROBIANA EM SUSPENSÃO EM MEIO LIQUIDO
1. INOCULAÇÃO

A
B

2. INCUBAÇÃO COM AGITAÇÃO

ORBITAL CONSTANTE E
TEMPERATURA CONTROLADA

3. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE CÉLULAS, AO LONGO DO TEMPO

 CRESCIMENTO EXPONENCIAL

Imagine que arranja uma forma de manter uma população de células de E. coli em
crescimento exponencial durante 24 horas. Se partir de uma única célula, estime
quantas células obteria após esse período de 24 horas.

Escherichia coli – tempo de duplicação ~ 25 minutos

24 horas ⇒ 57 duplicações
1 célula = 140.737.488.400.000.000 células
(10-12 gramas) (~1,4 x 1017)

~ 144 Kg de biomassa
 Evolução da concentração de células da população microbiana
(http://www.e-escola.utl.pt)
CRESCIMENTO
EXPONENCIAL

[células] 1 21 22 2n (após n gerações)

[células] N0 N0. 21 N0.22 N0.2n (após n gerações)

Concentração de células após

Concentração de células no início da um periodo de tempo t de
fase de crescimento exponencial crescimento exponencial - Nt.

log Nt - log N0
Nt = N0.2n ⇒ n = n - nº de gerações ocorridas durante o
período t de crescimento exponencial
log 2

g=t/n g é o tempo de duplicação (ou, de geração) (min ou h)

Representação gráfica do crescimento exponencial
 Cinética do crescimento exponencial
Escala logaritmica
Representação matemática (fase exponencial)

Fase dNt µ -taxa específica

= µ.Nt de crescimento da
exponencial dt população microbiana

Equivalente a
µ (t-t0)
lnNt = lnN0 + µ (t-t0) (1)
Ou Nt = N0 e
N,

Crescimento exponencial equilibrado –

N0
células completamente adaptadas às
condições de crescimento
→ N pode representar:
- Concentração de células, N;
- Densidade óptica da cultura, DO;
g
- concentração de biomassa, X,
t0 - concentração de qualquer componente celular
(p.ex. proteinas)
Prescott, Harley & Klein, Microbiology, th edition,Mc GrawHill, 2002

Estimativa da taxa específica de crescimento da população, µ

A equação que representa o crescimento exponencial de uma população microbiana

corresponde à equação de uma recta ( onde y = lnNt , x = (t-t0))

ln Nt = lnN0 + µ (t-t0) (1) y = b + ax a - declive (= µ)

b – ordenada na origem (= ln N0)
µ - taxa específica de crescimento da população Unidades :
microbiana (o valor de µ corresponde ao declive tempo-1
da recta lnNt vs. (t-t0)) (h-1; min-1)

Estimativa do tempo de duplicação da população, g

Substituindo na equação (1)

ln 2
(t-t0) = g quando Nt = 2.N0 g= (h; min)
µ
OBTENÇÃO DA CURVA DE CRESCIMENTO DA POPULAÇÃO MICROBIANA

MÉTODOS PARA AVALIAR A

CONCENTRAÇÃO DE CÉLULAS NUMA POPULAÇÃO MICROBIANA

Contagem de células viáveis (N)

- Método das diluições sucessivas e espalhamento
em meio sólido

Método espectrofotométrico (DO)

• Determinação da massa celular (biomassa, X)

Contagem directa de células

– Câmaras de contagem (microscópio óptico)
– Contadores electrónicos
CONTAGEM DE CÉLULAS VIÁVEIS
[expresso em UFC (Unidades Formadoras de Colónias) por ml de suspensão]

Método das diluições sucessivas e

espalhamento em meio sólido

As placas devem ter entre

~ 20 e 300 colónias

N = 1.59 x 105 UFC / ml

 DETERMINAÇÃO ESPECTROFOTOMÉTRICA DA DENSIDADE CELULAR
(Densidade Optica – DOλ - medida a um comprimento de onda, λ, particular)

I0 – intensidade de luz incidente

( λ particular)

I – intensidade de luz transmitida

através da suspensão de células
I0 I

Transmitância (T) = (I/Io) x 100 (%)

I0 I

DO = Abs
= - log T/100
= log (I0/I)
Prescott, Harley & Klein, Microbiology,
th edition,Mc GrawHill, 2002
 Medido
Teórico
DO640nm

Medições no
espectrofotómetro
0
Concentração de células
 BIOMASSA - representado normalmente por X

Estimativa da biomassa seca (peso seco)

- Pesagem da massa de células presentes na cultura microbiana.

- Peso seco ou húmido

- É usado em circunstâncias específicas, como, por exemplo

quando se pretende obter o rendimento em biomassa do crescimento.

Em certas condições, o aumento da massa

pode não reflectir crescimento da população, mas
aumento de compostos de reserva
 Câmara de contagem

• Lâmina de vidro especial, onde

está marcado um reticulado com
dimensões conhecidas; também é
conhecida a distância da lâmina à
lamela, sendo possível estimar o
volume de suspensão de células
sobre o reticulado.

• Fácil, barato e rápido.

Observação no
Microscópio
• Útil para contar células de Óptico
eucariotas e procariotas.

• Não distingue células viáveis de Figure 6.5

Prescott, Harley & Klein, Microbiology, th edition,Mc GrawHill, 2002
mortas.
 CURVA DE CRESCIMENTO DUMA POPULAÇÃO MICROBIANA
EM DESCONTÍNUO (“BATCH”)
Cultura “batch” – sistema fechado (excepto troca de gases)
Fase estacionária

Log Optical Density (OD. ---)

Fase de morte

Fase de latência Fase exponencial

Prescott, Harley & Klein, Microbiology, th edition,Mc GrawHill, 2002

Exemplo – cálculo da taxa específica de crescimento
Variação da concentração de células duma população bacteriana
(incubação em meio de cultura líquido, a 37ºC)

(Escala logaritmica)
5  
Tempo (h) N (células / mL) 4 

x 104 N
3 
0 1.0 x 104 Latencia 2
0.5 1.0 x 104 Declive: 0,7
1 1.5 x 104 
Exponencial
2 3.0 x 104
1 
2.5 3.6 x 104
3 4.9 x 104 0 1 2 3 4
Estacionária
4 5.0 x 104 Tempo (h)
População duplica
em 1h

Estimativa da taxa específica de crescimento da população, µ

(Análise de regressão linear: ln Nt vs. t → declive = 0.7 → µ = 0.7 h-1 )

ln N2 – ln N1
µ= = ln (3.0 x 104) - ln (1.5 x 104) = 0.7 h-1
(2-1)

Estimativa do tempo de duplicação, g

g = ln2 / µ = ln2 / 0.7 = 1 h

 Valores de g e de µ dependem de:

- potencial genético da estirpe microbiana.

- composição do meio de cultura;

- condições ambientais (Temperatura, pH,
disponibilidade de água, nível de oxigénio, etc.)
Prescott, Harley & Klein, Microbiology, th edition,Mc GrawHill, 2002
 Exemplo:
Crescimento Crescimento de população de Escherichia coli
em meio de cultura com duas fontes de C e energia,
diáuxico glucose e lactose.

β-galactosidade
lactose glucose + galactose
ln [ Células viáveis]

Consumo de lactose

Glucose
esgotada

Consumo de glucose

Tempo

Glucose rapidamente metabolizada;

Repressão da expressão do operão da lactose

(Fenómeno: Repressão Catabólica)

INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DE
NUTRIENTE LIMITANTE
NO CRESCIMENTO MICROBIANO
   30
5

[Nutriente], S (---)
[Biomassa] X (mg/L)
4 
3

15
2

1

0


0 1 2 3 4
Tempo (h)

A cheio (vermelho) - Curva de crescimento expressa em termos de evolução da concentração total

de biomassa formada (escala logaritmica) em função do tempo.

A tracejado (azul) – Evolução da concentração do nutriente S ao longo do tempo de crescimento.

 The relationship between concentration of limiting nutrient,
growth rate (green curve) and growth yield (red curve)
in a batch culture (closed system).

At low nutrient concentrations both growth rate and growth yield are affected.
 A taxa específica de crescimento, µ, depende da
concentração de nutriente limitante (S) fornecida no meio de cultura

µmax

EQUAÇÃO DE MONOD
S
µ = µmax
µmax Ks + S
2

Ks ,S

Concentração → Situação raramente encontrada nos

saturante de S ambientes naturais, onde um ou mais nutrientes
estão normalmente presentes em concentrações
limitantes ( ⇒ µ < µmax )
µmax - Taxa específica máxima de crescimento
- quando concentração de S é saturante;
– sistemas de transporte transmembranar
para o nutriente S estão saturados

KS – Constante de semi-saturação
- numericamente igual à concentração de substrato
que permite uma taxa de crescimento igual a
metade da µmax;
– reflecte a afinidade dos sistemas de transporte
transmembranar para a molécula do nutriente
limitante (maior Ks ⇒ menor afinidade ⇒ menor µ)

Os valores das constantes µmax e KS dependem:

- das caracteristicas intrínsecas do microrganismo;
- do substrato limitante;
- das condições ambientais (ex. Temperatura, pH, etc.)

Microrganismo Temperatura Nutriente limitante µmax (h-1) Ks (mg/L)

Escherichia coli 37ºC Glucose 0.8-1.4 2-4

Escherichia coli 37ºC Glicerol 0.9 2
Escherichia coli 37ºC Lactose 0.8 20
Saccharomyces cerevisiae 30ºC Glucose 0.5 25
Candida tropicalis 30ºC Glucose 0.5-0.6 50-75

- Competição entre diferentes microorganismos (p.ex. S. cerevisiae e C. tropicalis)

 Inibição pelo substrato

,S

Rendimento Biomassa total formada (fase estacionária) X

do crescimento, Y = =
Massa de nutriente usada S

- Y reflecte a eficiência do crescimento microbiano relativamente ao nutriente (substrato) limitante

usado para crescimento

(fins comerciais / custos de produção)

 Biomassa produzida (g)
FACTOR DE RENDIMENTO EM ATP (YATP) =
ATP produzido (moles)
Medida da eficiência com que a célula utiliza para crescimento (i.e. biossíntese de novo
de biomassa) a energia que produz.

Conceito de ENERGIA DE MANUTENÇÃO

Exemplo:
S – fonte de C e energia, fermentiscível (p.ex. glucose) verifica-se que YATP real < YATP teórico
(i.e., admitindo que
todo o ATP sintetizado
BIOSSÍNTESE DE MATERIAL CELULAR (CRESCIMENTO) é usado para
biossíntese)
S
ENERGIA ( ATP)

Energia de MANUTENÇÃO (desvio)

(Ex. Gastos em renovação de macromoléculas (proteínas, RNA),
expulsão activa de metabolitos tóxicos, manutenção de gradientes
electroquímicos de iões e do pH intracelular em níveis óptimos, etc.

Para uma dada estirpe microbiana, o valor YATP depende das condições ambientais.

Quanto mais afastadas das condições óptimas, maiores são os gastos de energia para manutenção:

⇒ ↓ YATP
 Esquema de bioreactor (ou fermentador)
industrial para microrganismo aeróbio
(Note os sistemas para medição e controlo de
temperatura, pH, nivel de oxigénio e
para análise de metabolitos – biosensor unit)

Prescott, Harley & Klein, Microbiology,

th edition,Mc GrawHill, 2002
“Scale-up” na produção industrial de microrganismos
(exemplo- produção de células da levedura Saccharomyces cerevisiae)
TIPOS E EXEMPLOS DE
PRODUTOS DE ORIGEM
MICROBIANA
 Metabolitos primários vs. secundários
Metabolito primário
associado ao metabolismo
Crescimento
essencial do microrganismo
)

(Ex. etanol, produzido em resultado

)
Formação de da fermentação alcoólica)
(

metabolito primário
Concentração de células ou

(
de produto formado
Concentração
massa celular

Crescimento

Formação de
metabolito secundário
Metabolito secundário
após a fase de produção das
células (após o crescimento exponencial),
normalmente a partir de um metabolito
Tempo primário ou de substrato usado para
crescimento que esteja em excesso

Ex. antibióticos produzidos

por fungos miceliais ou por
bactérias)
 CULTURA CONTÍNUA DE
MICRORGANISMOS NO QUIMIOSTATO
 S0, F

Esquema de
funcionamento
de um bioreactor para a
cultura contínua de
microrganismos
(exemplo - quimiostato)

X, S, F

QUIMIOSTATO – opera por fornecimento do nutriente limitante do crescimento a uma taxa constante
(relacionada com o caudal de entrada do meio de cultura fresco), de modo que a densidade celular
(biomassa) e a taxa específica de crescimento do microrganismo se ajustam a este fornecimento.
 TAXA DE DILUIÇÃO

Caudal de alimentação do meio fresco = caudal de saída da cultura = F (Litros/hora)

Volume da cultura no quimiostato = V = constante (L)

F
D – taxa de diluição = (h-1) (inverso do tempo de retenção médio da célula
V no interior do quimiostato)

ESTADO ESTACIONÁRIO

O quimiostato permite manter a população microbiana em crescimento

equilibrado, isto é, na fase de crescimento exponencial, durante
períodos de tempo longos – i.e. em ESTADO ESTACIONÁRIO.
 Equação do estado estacionário no quimiostato

Balanço de massas à massa celular, X S0, F

(não há morte celular;
não há entrada de células do exterior, X0=0))

Variação da Massa celular

Massa celular
massa celular = produzida
- que sai no
no quimiostato efluente
V = volume de cultura
dX F no quimiostato (L)
= µ.X - .X
dt V

Estado dX
⇒ =0 X, S, F
estacionário dt
X – massa celular (g/L)
F – caudal (L/h)
F F
⇒ µ.X = .X ⇒ µ= =D S – concentração de nutriente
V V Limitante (g/L)
T – tempo (h)
µ – taxa específica de crescimento (h-1)
µ=D D – taxa de diluição (h-1)
 Estado estacionário (“steady state”) no quimiostato
Dependência da concentração de biomassa (X), da concentração de nutriente limitante (S)
e do tempo de duplicação da população microbiana no estado estacionário, em função da
taxa de diluição a que o quimiostato opera (D).

(X)
(S0)

(S)

(D)
“WASHOUT”
Exemplo: Volume cultura = 5000 mL; Caudal através do (quando D ≥ Dc
quimiostato, F = 2500 mL/hora --- D = 0,5 h-1
Dc – taxa de diluição crítica)
Nota: alteração de F → alteração da taxa de diluição, D
 Desvio ao modelo estabelecido para o quimiostato (X em função de D):

Caso - limitação do crescimento pela fonte de C

Microrganismos quimiorganotróficos hetrotróficos (p.ex., nutriente limitante S é fonte de Carbono e
de energia) → uma parte significativa da energia produzida a partir de S é desviada para gastos
energéticos de manutenção (Energia de Manutenção).

Mensurável quando a taxa de diluição a que o quimiostato opera é muito baixa

(X)
(S0)

(S)

(D)
Vantagens/aplicações do crescimento microbiano em contínuo no quimiostato
(versus crescimento descontínuo ou “batch”):

População microbiana na fase exponencial do crescimento durante períodos

longos (semanas, meses)

Culturas em crescimento exponencial com taxas específicas de crescimento diferentes

(através da (simples) modificação da taxa de diluição → útil para estudos fisiológicos)

Produto com características constantes durante períodos de tempo longos

Maiores produtividades, e eliminação de tempos mortos

Vantagens na selecção de microrganismos que sejam mais competitivos

na utilização do nutriente limitante

Vantagens no estabelecimento de culturas de enriquecimento para isolamento de

populações microbianas específicas a partir de populações mistas (por ex., amostras
ambientais)
 A afirmação (ou não) de um dado microrganismo face a outro (p.ex., se a população for mista), depende da
relação entre os coeficientes de Monod para os microrganismos em causa (depende em particular da constante de
semi-saturação para o substrato S, KS, que é inversamente proporcional à eficiência com que o microrganismo
utiliza o nutriente limitante).

EXEMPLO Microrganismo A Microrganismo B

Quimiostato a S S
operar com D = µA
D = µA = µmax A µB = µmax B
KsA + S KsB + S
µmaxA ~ µmaxB

Só o microrganismo A permanece no quimiostato

Se KSB > KSA ⇒ µB < µA ⇒ µB < D ⇒
B não permanece no quimiostato (i.e. sofre “washout”)

Se KSB < KSA ⇒ µB > µA ⇒ µB > D ⇒ B permanece no quimiostato, juntamente com A

Em cultura contínua, um microrganismo invasor (p.ex. contaminante ou mutante viável)

pode acumular no quimiostato, se for competitivo, isto é, se utilizar o nutriente limitante
eficientemente face à estirpe microbiana original ⇒ contaminação da cultura original.

Mas, se não for competitivo, é expulso do quimiostato.

NOTAS sobre crescimento microbiano
 CRESCIMENTO MICROBIANO

O crescimento microbiano é definido como o aumento coordenado de todos os constituintes celulares

(por exemplo, ácidos nucleicos, proteínas, lípidos ). Este aumento está normalmente associado ao aumento
do número de células em consequência da multiplicação celular.

É definido como o crescimento duma população de células dum microrganismo, ou seja,

o aumento do número de células do microrganismo ao longo do tempo.
É normalmente quantificado em termos do aumento no tempo de:
(i) nº de células; (ii) densidade óptica da cultura; ou, (iii) massa celular (biomassa).

Em certas condições, o aumento da massa pode não reflectir crescimento da população, mas
aumento de compostos de reserva (p.ex. glicogénio, poli-β-hidroxibutirato, etc.)

Grande parte dos microrganismos multiplica-se por fissão binária (p.ex. maior parte das bactérias) ou
por gemulação (p.ex. maior parte das leveduras). Em consequência do processo de multiplicação
celular, uma célula dará origem a duas ao fim de um certo período de tempo que é designado por
tempo de geração ou duplicação.
O tempo de duplicação (ou geração) pode repetir-se várias vezes, enquanto estiverem disponíveis no
meio de cultura nutrientes em quantidade suficiente para assegurarem os metabolismos
catabólico (bioenergético) e anabólico (biossíntese) das células e enquanto as condições ambientais
forem favoráveis.

A duração do crescimento exponencial de bactérias em meio de cultura laboratorial

depende da bactéria em causa e pode ficar limitada por falta de nutrientes, privação de
oxigénio, acumulação de produtos tóxicos, ou outros factores.

O conhecimento dos valores de µ (taxa especifica de crescimento) e de g (tempo de duplicação)

para um dado microrganismo permite:
- prever como evoluirá a concentração de células ao longo do tempo de incubação num determinado
meio de cultura e/ou em determinadas condições ambientais;

- testar o efeito de uma determinada alteração das condições ambientais sobre o

crescimento do microrganismo (p.ex. modificação do meio de cultura, da Temperatura, etc.)

⇒ OBJECTIVOS ESSENCIAIS:

seleccionar as condições de cultura óptimas para um dado microrganismo.

estabelecer métodos que permitam controlar o crescimento de microrganismos.
Contadores electrónicos
(ex. Contador coulter, citómetro de fluxo)

• São instrumentos usados para contar partículas em suspensão.

• Possuem um pequeno orifício onde é estabelecida uma corrente eléctrica
por recurso a 2 eléctrodos.
• Suspensão de células é forçada a passar pelo orifício.
• A passagem de cada partícula (célula, esporo, etc.) causa uma diminuição
momentânea da condutividade eléctrica entre os eléctrodos.
• Os períodos de interrupção da corrente eléctrica são contados,
sendo essa contagem uma medida do número de partículas presentes na
suspensão.

• Fácil e rápido
• Não permite distinguir células viáveis de mortas
• Útil para microrganismos grandes, mas não para a maior parte das
bactérias
 FASES DO CRESCIMENTO MICROBIANO EM DESCONTÍNUO

Cultura “batch” – sistema fechado (excepto troca de gases)

Fase de latencia
Não ocorre aumento mensurável do número de células. Fase de adaptação ao novo meio
(p.ex. síntese de novas enzimas) e a condições ambientais novas.
Duração da fase de latência – pode ser longa (várias horas), quando estão presentes
compostos tóxicos, substratos dificeis de metabolizar ou o inóculo é insuficiente (nº de
células viáveis ou vitalidade das células insuficientes).
Fase exponencial
Crescimento da população com taxa (velocidade) constante. Durante esta fase, em que
todos os nutrientes estão presentes em excesso, os microrganismo dividem-se e a
população cresce com uma taxa específica de crescimento máxima. O valor desta taxa
de crescimento depende do potencial genético do microrganismo, da composição do
meio de cultura e das condições de crescimento (temperatura, pH, disponibilidade de
água, etc.).
Fase estacionária
O crescimento da população pára, devido a esgotamento de nutriente essencial
ou acumulação de metabolito tóxico. Parte das células podem permanecer viáveis durante
algumas horas à custa do consumo de materiais de reserva endógenos.
Algumas espécies bacterianas exibem, nesta fase de crescimento, a produção de endósporos.

Fase de morte
Perda irreversível da capacidade de divisão celular; ocorre o decréscimo progressivo
no nº de células viáveis da população.
 NOTAS SOBRE CULTURA CONTÍNUA

QUIMIOSTATO – opera por fornecimento do nutriente limitante do crescimento a uma taxa constante
(relacionada com o caudal de entrada do meio de cultura fresco), de modo que a densidade celular
(biomassa) e a taxa específica de crescimento do microrganismo se ajustam a este fornecimento.

Meio de cultura fresco (esterilizado) é fornecido contínuamente (caudal F), o qual contém, entre outros
nutrientes, o nutriente limitante (concentração S0). Simultâneamente, parte da cultura é removida, com
o mesmo caudal F a que meio de cultura fresco entra. O efluente removido contém células do
microrganismo (biomassa, X), assim como produto(s) sintetizado(s) pelas células. A concentração de
nutriente limitante à saída (S) é, em condições operacionais adequadas, muito baixa ou
aproximadamente nula.
No estado estacionário (no quimiostato):

a taxa específica de crescimento do microrganismo (µ) é controlada pela taxa

de diluição a que o quimiostato opera (D) (i.e. é válida a equação µ = D)
e, consequentemente, pela razão entre o caudal (F) e o volume de cultura no
recipiente (V)

⇒ é possível obter populações microbianas em crescimento com taxas específicas

de crescimento diferentes através da alteração da taxa de diluição aplicada no
quimiostato

a densidade celular (biomassa, X) obtida no quimiostato é controlada pela

concentração do nutriente limitante, sendo válida a equação
X = Y (S0-S)
onde Y é o rendimento do crescimento para o substrato limitante e S representa a
concentração residual do nutriente limitante no quimiostato.

Modelo para o crescimento no quimiostato – equação de Monod

i.e., o valor da taxa de diluição, D, relaciona-se com a concentração de nutriente
limitante do crescimento com base na equação de Monod

S D. KS
D=µ → D = µmax → S=
Ks + S µmax - D
Notas sobre as representações gráficas da concentração de biomassa (X), da
concentração de nutriente limitante (S) e do tempo de duplicação da população
microbiana no estado estacionário, em função da taxa de diluição a que o
quimiostato opera (D).

 A densidade celular (biomassa, X) é igual, para uma gama larga de taxas de diluição a que o
quimiostato pode operar (consequentemente, a concentração residual de nutriente limitante, S, no
quimiostato é mantida com um valor baixo, uma vez que este nutriente está a ser consumido pelas
células da cultura em crescimento) ;

 Apesar da concentração de biomassa permanecer constante, a taxa específica de crescimento pode

variar com a variação da taxa de diluição que é aplicada no quimiostato (porque µ = D); quanto maior
a taxa de diluição, maior a taxa de crescimento da população (e, inversamente, menor é o
tempo de duplicação ou geração).

 A gama de valores de taxa de diluição, D, a que o quimiostato pode operar é limitada. O valor limite
é a taxa de diluição crítica (Dc). Para valores muito altos da taxa de diluição (D ≥ Dc), o crescimento
celular não consegue compensar a diluição da cultura, e a população de células sai do quimiostato
(“Wash-out” – “lavagem” do quimiostato) ; consequentemente, nessas condições, a concentração de
nutriente limitante aumenta, porque não é consumido ; quando D ≥ Dc ⇒ S=S0)

 A taxa de diluição torna-se crítica e ocorre o “Wash-out” quando a taxa de diluição a que o
quimiostato opera ultrapassa a taxa específica máxima de crescimento da população microbiana (µmáx)

Cultura contínua permite estabelecer condições selectivas para o enriquecimento de
amostras ambientais (populações mistas) em microrganismos específicos
Por exemplo:
 microganismos capazes de metabolizar eficientemente nutrientes tóxicos ou
dificilmente metabolizáveis (comparativamente a outros microrganismos presentes
numa amostra ambiental, p.ex. solo, água, esgoto, etc.)
P.ex. Útil para o isolamento de microrganismos capazes de biodegradar
hidrocarbonetos do petróleo, benzeno, fenol, ácido benzóico, pesticidas ou
outros compostos orgânicos, a partir de solo (população mista).

(nestes casos, o quimiostato é inoculado com a amostra ambiental; o meio de cultura fresco contém o composto em causa
como substrato limitante para crescimento e é fornecido contínuamente com taxa de diluição adequada; nestas condições,
prolifera(m) preferencialmente o(s) microrganismo(s) que seja(m) capaz(es) de metabolizar eficientemente o composto em
causa; outros microrganismos que não tenham essa capacidade (p.ex, com µ < D) eventualmente presentes na amostra
ambiental, sofrerão “washout”, sendo expulsos do quimiostato)

Em cultura contínua, mediante a selecção de taxa(s) de diluição adequada(s), é possível

seleccionar uma população de células dum microrganismo único, que seja muito competitivo
e metabolize muito eficientemente um composto orgânico face a outros microrganismos
menos competitivos eventualmente presentes numa população mista inicial.

Pelo contrário, em cultura descontínua/“batch”, todos os microrganismos, mais ou menos competitivos

na utilização do composto orgânico, permanecem no meio de cultura
⇒ cultura “batch” é menos eficiente quando se pretende seleccionar microrganismos muito eficientes
na utilização do composto em causa como substrato para crescimento.
 Se ocorrer:

1  Contaminação da cultura
Em cultura contínua, é necessário manter condições de esterilidade durante períodos longos.
A adição contínua de meio fresco e o arejamento aumentam a probabilidade de ocorrer contaminação
da cultura. Contudo, condições especiais, tais como temperaturas elevadas, valores de pH extremos
e substratos pouco usuais podem reduzir a probabilidade de ocorrer contaminação da cultura.

2  Degenerescência da cultura
Durante a multiplicação celular dum certo microrganismo pode ocorrer uma mutação expontânea, e
surgir um mutante viável na cultura.

Consequências

Em cultura contínua, um microrganismo invasor (contaminante ou mutante viável) acumula

no quimiostato se for competitivo, isto é, se utilizar o nutriente limitante eficientemente face
à estirpe microbiana original ⇒ contaminação da cultura original.

Mas, se não for competitivo, é expulso do quimiostato.

Na cultura “bacth”, todo o contaminante (ou, mutante viável) capaz de utilizar o

nutriente limitante acumula no meio de cultura, juntamente com o microrganismo
que se pretende cultivar ⇒ contaminação da cultura original.