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03/09/2019

Coleta
• A coleta dos espécimes clínicos é a primeira etapa do
Coleta e diagnóstico laboratorial e deve ser feita corretamente.

Processamento de • Sob pena de inutilizar todo o procedimento


laboratorial posterior, pois amostras coletadas
Amostras Micológicas inadequadamente podem redundar em resultados
falsos.

Prof. M.Sc. Lucas Bochnia Bueno

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• Então, a positividade e segurança de um exame direto


dependem da obtenção de uma amostra apropriada. • É de suma importância ressaltar que todos os
espécimes clínicos encaminhados ao laboratório de
• O paciente deve suspender o uso de qualquer micologia médica devem vir acompanhados de uma
medicamento antifúngico oral por 20 (vinte) dias ou ficha padrão, contendo todos os dados clínicos e
tópico por pelo menos 10 (dez) dias precedentes a epidemiológicos do paciente.
coleta.

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MATERIAL NECESSÁRIO

• Bisturi pequeno ou lâmina de bisturi;


• Pinça de depilação;
• Essa ficha deve conter, no mínimo, as seguintes • Estiletes;
informações: identificação, origem, residência, tempo • Tesouras;
de evolução da doença, localização e aspectos clínicos
• Lâminas de microscopia;
da lesão, possível contato com animais, uso de drogas
antifúngicas nos últimos 30 dias e suspeita clínica, • Placas de Petri;
quando informado pelo médico. • Frascos;
• Tubos de ensaio com salina esterilizada;
• Swabs;
• Fita adesiva

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PELE • Após assepsia local com álcool a 70%, as amostras de


• No dia da coleta, o paciente pode e deve fazer a lesões de pele como escamas ou crostas, devem ser
higiene corporal normal. colhidas preferencialmente com uma lâmina de bisturi
descartável ou com a borda da lâmina de vidro de
• Não é permitido o uso de cremes, loções, pomadas,
microscopia, muito limpa; deve-se colher, raspando
ou outras substâncias gordurosas, pois além de
em vários pontos da lesão, procurando as bordas das
formarem artefatos dificultando a detecção de
lesões mais recentes onde o fungo se encontra em
estruturas fúngicas, impede o isolamento dos fungos.
crescimento ativo.

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• Não é necessário fazer raspagem profunda porque o • Nas lesões cutâneas com vesículas (bolhas pequenas)
fungo se encontra na camada mais superficial da pele e pústulas (bolhas pequenas inflamadas com pus) faz-
chamada córnea, e uma amostra úmida, favorece o se punção com seringa e agulha ou pressiona-se com
desenvolvimento de bactérias e fungos o swab, dispondo a amostra em tubo contendo salina.
contaminantes.
• Nos casos em que não há escamas aparentes, • O teto das vesículas (pele que cobre as vesículas) deve
procura-se raspar bem o local e apelar para a técnica ser retirado com pinça de depilação.
da fita adesiva.

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• Se o paciente tiver “frieira” (lesão úmida) entre os • Nas lesões inguinais, inguino-crurais ou axilares, como
dedos das mãos ou pés, colher a amostra com swab são regiões de dobras, geralmente encontram-se
acondicionando em tubo com salina. úmidas, fazendo-se necessária a assepsia com álcool a
70%.
• Se a lesão for seca, descamativa fazer duas lâminas
com durex e tentar obter por raspagem, em placa as • Deixar a região secar um pouco e tentar raspar a pele.
escamas, usando lâmina de microscopia ou bisturi.

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• Colher também em salina, e fazer duas lâminas com


durex tentando obter pêlos (raros) presos na fita.

• Na lesão anal e perianal, além de colher a amostra na


salina, fazer duas lâminas com durex.

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COURO CABELUDO • A amostra deve conter tocos de cabelo, o conteúdo


dos folículos tapados e as escamas de pele.
• As amostras de lesões no couro cabeludo devem ser • Os cabelos da área também podem ser puxados com
obtidas através da raspagem do local. pinça (os cabelos infectados são facilmente
removíveis).
• Para o exame do couro cabeludo ou dos cabelos, os
• Raspam-se as escamas com bisturi cego ou lâmina de
mesmos devem estar limpos e secos.
microscopia.

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CABELOS E PÊLOS

• Se a lesão for ao longo do cabelo ou pêlo, como


nódulos, por exemplo, esses devem ser cortados com
tesoura e acondicionados em placas de Petri.

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UNHAS
• Para exame de escamas ungueais, deve-se retirar
totalmente o esmalte pelo menos 2 (dois) dias antes da
coleta.
• As regiões de onde vão ser coletadas as amostras devem
ser limpas com gaze ou algodão com álcool a 70%, para
eliminar contaminantes bacterianos superficiais.
• Os fragmentos de unhas alteradas podem ser colhidos,
raspando-os com o bisturi ou com o auxílio de uma tesoura
limpa.

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• O material que se deposita embaixo da unha pode ser • Em casos de paroníquia (lesões na região da cutícula),
retirado cuidadosamente com o bisturi, com um palito colhem-se as escamas e, se possível, o pus, com um
(tipo de manicure), previamente esterilizado, ou outro swab.
objeto pontiagudo estéril.
• Procurar penetrar bem e colher sempre na região
• Se as lesões são manchas esbranquiçadas na
limite entre a parte saudável e a afetada pelo fungo.
superfície da unha, raspar por cima com bisturi,
• Desprezar sempre as escamas mais externas ou o removendo as escamas em placa de Petri.
material mais superficial, pois se encontram
contaminados com a poeira.

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• Unhas extraídas por processos cirúrgicos não são


adequadas ao exame micológico ou com resíduos
medicamentosos ou de esmalte são consideradas
amostras inadequadas.

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MEMBRANAS MUCOSAS
• No caso de coleta vulvar/vaginal, o swab (sempre
embebido em salina ou água estéril) é o mais
• Para as infecções de boca ou vagina, o raspado com adequado.
lâmina de bisturi ou espátula, nas partes afetadas
(áreas com eritema e/ou placas brancas), é melhor do
que o swab, se o material for processado • Não esquecer que o swab tem que ser mantido úmido
imediatamente. até ser processado o exame.

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OUVIDO

• As infecções fúngicas de ouvido são geralmente secas,


exceto quanto associadas a infecções bacterianas.
• A raspagem do material é sempre melhor para o
diagnóstico laboratorial, embora o swab também
possa ser usado.

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OLHO
• Deve ser solicitado meio de cultura ao laboratório e o
material retirado das áreas de ulcerações e
supurações pelo oftalmologista deve ser inoculado
imediatamente no meio;
• Lágrima e fluídos podem se coletados com pipeta
plástica estéril – chamada de pipeta Pasteur
descartável ou pipeta de transferência.
• O swab não é adequado para este tipo de material.

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AMOSTRAS SUBCUTÂNEAS
• Pode ser raspado as escamas ou crostas da parte
superficial da lesão.
• Aspirado do pus e/ou biopsia, são mais apropriados
para o exame.
• O pus é coletado assepticamente de abscessos não
drenados com uma agulha estéril em seringa.

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• Após a coleta, retirar a agulha com uma pinça e passar


o material para um frasco estéril.
• Nas lesões ulceradas, caso o material tenha que ser
colhido com swab (o que não é recomendado), deve
ser retirado da parte mais profunda da lesão, evitando
encostar na periferia e na pele adjacente.
• Se algum grão for visível no pus, este deve ser incluído
na amostra.

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Considerações Importantes
• Todas as vezes que a coleta for com swab, este deve
ser umedecido em salina ou água estéril antes da
• Para todas as coletas descritas até aqui, colher todo o coleta.
material disponível na lesão.
• Após a coleta, deve permanecer em um frasco estéril
com salina suficiente para mantê-lo úmido até o
• Quanto mais material mais viabilidade na visualização procedimento do exame.
e no crescimento em cultura.

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URINA • A amostra deve ser a primeira urina da manhã de jato


médio, coletada em recipiente estéril, devidamente
identificado.
• O paciente deve suspender o uso de qualquer
• Solicitar três amostras de urina da manhã em dias
medicamento antifúngico oral por 20 (vinte) dias.
diferentes.
• Abstinência de água por 12h (doze horas).
• As amostras de urina têm validade de até uma hora
• Para uma coleta correta, o paciente deve fazer a após a coleta a temperatura ambiente, para serem
higiene normal com água e sabão e secar-se bem. processadas o mais rápido possível.

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• As urinas de 24h (vinte e quatro horas) são


inadequadas por apresentarem um desenvolvimento
aumentado de bactérias e fungos que fazem parte da
microbiota.

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FEZES • As amostras de fezes têm validade de até duas horas


após a coleta a temperatura ambiente, para serem
processadas o mais rápido possível.
• A amostra de fezes deve ser coletada em recipiente
adequado, devidamente identificado.
• A mesma pode ser dissolvida em solução fisiológica. • As amostras de fezes enviadas ao laboratório no final
do dia são inadequadas por apresentarem um
• Solicitar três amostras de fezes em dias diferentes.
desenvolvimento aumentado de bactérias e fungos
que fazem parte da microbiota.

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• As amostras de fezes coletadas em recipientes


contendo formol são inadequadas para o exame, em
especial para a cultura, devido à propriedade
antifúngica do formol.

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ESCARRO
• O escarro deve ser colhido de tosse profunda pela
• Preferencialmente deve ser colhido por broncoscopia: manhã, logo após o paciente despertar.
lavado ou aspirado brônquico.
• O material deve ser coletado em recipiente de boca
• Quando não for possível, o escarro deve ser colhido larga ou placa de Petri estéreis, devidamente
da mesma maneira como é colhido para o exame de identificados.
tuberculose, não esquecendo da higiene da boca
antes da coleta, para diminuir a contaminação pelos • Solicitar três amostras em dias diferentes.
saprófitas da cavidade bucal e da faringe.

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• O exame de escarro, tanto o direto como a cultura, na


maioria das vezes não é satisfatório, porque não é
confiável, já que é uma amostra muito contaminada.
• Portanto, quando houver a possibilidade do exame
sorológico, deve-se optar pelo último.
• As amostras de 24h (vinte e quatro horas) e as que
foram coletadas em recipientes não esterilizados são
inadequadas.

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SANGUE • Deve-se coletar 3 - 5ml de sangue e depositar em


tubo de ensaio esterilizado contendo EDTA 1%.
• O paciente deve suspender o uso de qualquer • A proporção utilizada é 0,1ml de EDTA 1% para cada
medicamento antifúngico oral por 20 (vinte) dias. 1ml de sangue.
• O paciente deve estar em jejum por 12h (doze horas). • Fazer extensão sanguínea.
• Deve ser feito assepsia antes da coleta, sendo a • Aquelas coletadas em tubo de ensaio não esterilizadas
amostra obtida por punção sanguínea. ou sem anticoagulante são inviáveis.

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Processamento

• Exame direto – coloração e observação direta da


amostras

• Cultura/semeadura – observação do crescimento

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SEMEADURA
EXAME MICOLÓGICO DIRETO • Materiais de sítios estéreis - fazer a
• Aguardar o tempo suficiente para o clareamento do material semeadura em cabine de fluxo. Se não for
• Evitar o uso de lamínula da mesma largura da lâmina possível, fazer a semeadura o mais próximo
• Fazer pressão sobre a lamínula antes de levar ao microscópio de uma chama de bico de Bunsen.
• Não utilizar excesso do material biológico • Adotar os seguintes cuidados:
• Cortar as biópsias em pequenos fragmentos dentro de placas de
Petri • Usar luvas
• Utilizar objetivas de aumento de 10 e 40X - nunca usar a de 100X • Abrir o tubo de meio na hora da semeadura.
quando utilizar KOH.
• Exames diretos também podem ser feitos em materiais fixados e • Após semeadura, fechar imediatamente os
corados tubos.
• Em casos suspeitos de Cryptococcus, utilizar tinta nanquim

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• Segurar a tampa do tubo enquanto semeia.


• Flambar a boca do tubo na chama antes e após a
semeadura.
• Desprezar as primeira gotas quando for semear sangue ou
Líquor, se os mesmos estiverem em seringas.
• A semeadura deve ser feita em pelo menos dois tipos de
meio de cultura diferentes. Seletivo e não seletivo.
• Fazer a assepsia da rolha da garrafa de hemocultura.
• Fragmento de tecidos devem ser cortados de maneira
homogênea.

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Candida sp em esfregaço vaginal - GRAM


• COLORAÇÃO DE GRAM
• COLORAÇÃO DE GIEMSA
• COLORAÇÃO COM TINTA NANQUIM
• CORANTE AZUL DE LACTOFENOL
• SOLUÇÃO DE KOH

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Histoplasma capsulatum - Giemsa Criptococcus sp – Tinta Nanquim

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MEIOS DE CULTURA EM MICOLOGIA


Aspergillus sp - AZUL DE LACTOFENOL • Ágar seletivo para fungos patogênicos – quando se quer
evitar oportunistas ou contaminantes
• Ágar Sabouraud com antibiótico – utilizado para todos os
fungos e evita contaminação bacteriana
• Ágar Sabouraud sem antibiótico – para quando houver
suspeição de Actinomicetos (pseudomicetomas)
• Ágar BHI e Ágar sangue – formas leveduriformes dos
termodimórficos
• Ágar uréia de Christisen - teste fisiológico para separar
gêneros e espécies quando um é ureáse positivo e outro
não

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• Ágar Batata – microcultivo em lâmina e produção do • Ágar YNB – Auxanograma de carboidratos


pigmento rubro do T. rubrum • Ágar YCB – Auxanograma de fontes nitrogenadas
• Ágar CGB – separação das espécies de Cryptococcus • Ágar de Dixon – isolamento de Malassezia sp – não
• Ágares: ALPISTE, STAIB e ÁGAR L -DOPA – separação de identifica espécies
leveduras em geral das leveduras das espécies de • Meios líquidos para hemocultura – Normalmente
Cryptococcus usados em casos de micoses sistêmicas ou
• Ágar Cornmeal ( fubá) – microcultivo de leveduras em disseminadas Ex. : Bactec™
geral e ajuda na identificação de C. albicans • Meios industrializados prontos para identificação
• Ágar Czapek – estudo das frutificações e características através de cores – muito utilizados para a
coloniais de Penicillium sp e Aspergillus sp identificação de leveduras

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MEIOS DE CULTURA UTILIZADOS DIARIAMENTE


• Ágar Sabouraud com antibiótico. MEIOS COMERCIAIS LEVEDURAS
• Ágar Sabouraud sem antibiótico. • Chromoagar Candida
• Ágar Batata • API 20C AUX (BioMérieux)
• Ágar seletivo para fungos patogênicos
(CICLOHEXIMIDA) • ID 32C (BioMérieux)
• Ágar Sabouraud seletivo. • Candifast (International Microbio)
• Ágar Mycosel. • Vitek (BioMérieux)
• Ágar Micobiótico. • Outros

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Obrigado!

lucas.buenoo@hotmail.com

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