UESB – Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia

DEBI - Departamento de Estudos Básicos e Instrumentais

Colegiado de Engenharia de Alimentos / IV Semestre – Diurno

Análise microbiológica da polpa de fruta ácida

Realizado pelas alunas: Relatório apresentado a Prof.

Daniela Moreira Dra. Lígia Menezes como

Emilly Karoline Oliveira avaliação do I crédito da

disciplina Laboratório de
Microbiologia de Alimentos.

Novembro de 2010
Itapetinga-Ba
 Resumo

O experimento seguinte foi realizado pelo método de diluição seriada, plaqueamento e

conagem padrão com o meio de cultura Ágar Batata Dextrose com ácido tartárico 10% ,
utilizado pois para o crescimento de bolores e leveduras necessita de um pH ácido.Com
a finalidade de analisar amostra de suco de fruta acida.Apos o período de incubação é
realizada a contagem, porem nesse experimento foi impossível quantificar por causa do
numero excessivo de colônias.Analisa – se também as diferentes especies de fungos
presentes na placas , espécie de coloração branca , verde e rosa.Os resultados obtidos
nos testes das amostras considerados insatisfatórios o consumo do produto.
 Introdução

Os fungos apresentam um conjunto de características que permitem sua diferenciação

das plantas: não sintetizam clorofila nem qualquer pigmento fotossintético; não tem
celulose na parede celular, exceto alguns fungos aquáticos, e não armazenam amido
como substância reserva. (TRABULSI, 1999)
Os fungos são seres vivos eucarióticos com um só núcleo, como as leveduras, ou
multinucleados, como os fungos filamentosos ou bolores e os cogumelos (fungos
macroscópicos). (TRABULSI, 1999)
Os fungos podem desenvolver-se em meios de cultivo especiais formando colônias de
dois tipos: leveduriformes e filamentosas.
As colônias leveduriformes são, de maneira geral, pastosas ou cremosas e caracterizam
o grupo das leveduras. (TRABULSI, 1999)
As colônias filamentosas, que caracterizam os bolores, podem ser algodonosas,
aveludadas ou pulverulentas, com os mais variados tipos de pigmentação. (TRABULSI,
1999)
As leveduras são microrganismos unicelulares, a própria célula cumprindo as funções
vegetativas e reprodutivas. Os bolores são constituídos, fundamentalmente, por
elementos multicelulares em forma de tubo – as hifas que podem ser continuas, não-
septadas ou cenocíticas e septadas. (TRABULSI, 1999)
Os fungos são microrganismos eucarióticos que se encontram amplamente distribuídos
no solo, na água, em alimentos, nos vegetais, em detritos em geral, em animais e no
homem, sendo em sua maioria aeróbios obrigatórios, com exceção de certas leveduras
fermentadoras anaeróbias facultativas, que podem se desenvolver em ambientes com
oxigênio reduzido ou mesmo na ausência deste elemento. Não possuem mecanismos
químicos fotossintéticos ou autotróficos para produção de energia ou síntese de
constituintes celulares. (TRABULSI, 1999)
A maioria dos fungos tolera uma ampla variação na concentração de íons de hidrogênio
e, de modo geral, um pH em torno de 5,6 é ótimo para o desenvolvimento dos mesmos.
Os fungos filamentosos podem crescer em ampla faixa de pH variando de 1,5 a 11. As
leveduras não toleram pH alcalino. A pigmentação dos cultivos, muitas vezes, esta
relacionada com o pH do substrato. (TRABULSI, 1999)
No desenvolvimento vegetativo os fungos preferem a obscuridade ou luz difusa e, no
desenvolvimento da parte reprodutiva, procuram a luz para a sua formação. A luz solar
direta, geralmente, é um fator fungicida, devido às radiações ultravioleta. (TRABULSI,
1999)
O crescimento dos fungos é mais lento que o das bactérias, e suas culturas precisam, em
média, de sete a 15 dias ou mais de incubação. Com a finalidade de impedir o
crescimento bacteriano, que pode inibir ou se sobrepor ao do fungo, é necessário
incorporar aos meios de cultura antibacterianos de largo espectro, como o cloranfenicol.
Também pode-se acrescentar ciclo-heximida para diminuir o crescimento de fungos
saprófitas contaminantes dos cultivos. (TRABULSI, 1999).

As frutas consistem em fonte nutricional de vitaminas, minerais e carboidratos solúveis,

sendo que algumas possuem teor mais elevado de um ou de outro nutriente como, por
exemplo, a acerola, que apresenta elevada quantidade de vitamina C. Outras frutas não
são ricas no fornecimento de algum nutriente específico, como é o caso do abacaxi, que
inclusive possui baixo teor de vitamina C (10 a 25 mg de ácido ascórbico por 100g de
fruto); entretanto, apresentam grande aceitação sensorial por parte dos consumidores
(MATSUURA,2002)

 O Brasil é grande produtor e consumidor de sucos de frutas. O crescimento da

produção industrial está ocorrendo principalmente devido ao surgimento de produtos
que têm o suco como ingrediente secundário, ou seja, sorvetes, iogurtes, alimentos
infantis etc.(PRATI,2005)

A maior parte da microbiota presente nas frutas reside em sua parte externa, sendo o
seu interior praticamente estéril, a menos que haja uma ruptura em alguma parte da
casca. As frutas e seus derivados são em geral alimentos ácidos e a elevada acidez
restringe a microbiota deterioradora, especialmente os microrganismos patogênicos. A
microbiota normalmente presente constitui-se em bolores, leveduras, bactérias lácticas
e outros microrganismos ácido tolerantes como bactérias acéticas, Zymomonas e
algumas espécies de Bacillus (SIQUEIRA,1997)

Sucos de frutas cítricas, principalmente de laranja, são processados em várias indústrias

de concentrados congelados e têm sido produtos de exportação do Brasil, desde a
década de 70.(PEDRÃO,1999)
Segundo OLIVEIRA et al (2006) com o objetivo de avaliar as características
microbiológicas de sucos de laranja in natura comercializados na cidade do Rio de
Janeiro. Os parâmetros analisados foram: contagem de microorganismos aeróbios
mesófilos, estritos e facultativos viáveis; bolores e leveduras; Bactérias ácido-láticas
(BAL) e coliformes totais e termotolerantes; análise da presença de E. coli e Salmonella
sp.Realizou-se o acompanhamento dessas características para 50 amostras de suco
fresco de marcas comercializadas no Rio de Janeiro. As amostras foram adquiridas e
mantidas sob refrigeração a 4ºC, até o momento das análises. Os resultados obtidos
neste estudo evidenciaram altas contagens de mesófilos, variando entre 105 e 106
UFC/mL, em 74% das amostras analisadas. Resultados semelhantes foram observados
para as contagens de bolores e leveduras e BAL. O percentual de amostras entre 104 e
105 UFC/mL foi de 41,7 e 52,1%, respectivamente. As contagens de microorganismos
mesófilos heterotróficos e BAL, para a maioria das amostras, mostraram-se em níveis
elevados. O nível de coliformes fecais em 15% das amostras foi acima do permitido
pela legislação. Os perfis de susceptibilidade a antimicrobianos de coliformes isolados
estavam dentro do previsto para amostras ambientais ou fecais não submetidas a grande
pressão seletiva Algumas amostras apresentaram altas contagens de microorganismos,
indicativas de condições inadequadas de manipulação e estocagem do produto, levando
a um risco associado à possível existência de patógenos capazes de sobreviver em
ambiente ácido.
Segundo PINHEIRO et al (2006) com o objetivo de efetuar análises químicas, físico-
químicas e microbiológicas em sucos integrais de abacaxi, caju e maracujá
industrializados de diferentes marcas, e verificar a adequação destes produtos com as
legislações federais vigentes.Quinze amostras de sucos de frutas, cinco de abacaxi,
cinco de caju e cinco de maracujá, de cinco marcas diferentes, foram analisadas através
dos parâmetros químicos, físico-químicos e microbiológicos. Todas as amostras
estavam dentro dos limites estabelecidos pelas legislações brasileiras em vigor para os
parâmetros químicos, físico-químicos e microbiológicos.

Em todas as amostras de suco de abacaxi observou-se contagem de bolores e leveduras

inferior a 10 UFC/mL, ausência de coliformes a 35ºC e a 45ºC em 50 mL de amostra,
contagem de aeróbios mesófilos menor que 10 UFC/mL e ausência de Salmonella
sp. em 25 mL de amostra. Os parâmetros químicos e físico-químicos de identidade e
qualidade dos sucos integrais de abacaxi, caju e maracujá, das diferentes marcas
comerciais, encontravam-se de acordo com aqueles estabelecidos pela legislação
brasileira em vigor.Em relação às determinações microbiológicas, todas as dez amostras
analisadas atendiam às condições higiênico-sanitárias estabelecidas pela legislação em
vigor, sendo satisfatórias para o consumo humano.
 Materiais e Métodos

 Espátula
 Vidro de relógio
 Balança analítica
 Béquer
 Ágar Batata Dextrose com ácido tartárico 10%
 Tubo de ensaio
 Placa de petri
 Pipetas
 Alça de vidro
 Água destilada
 Amostra de polpa de fruta ácida
 Água peptonada

Metodologia

O procedimento foi dividido em três etapas:

Diluição Seriada - Pesou-se 1 ml da amostra de polpa de fruta ácida em uma balança

analítica, logo após transferiu-se a amostra para um tubo de diluição contendo 9 mL de
solução peptonada (diluição 10-1).Com uma pipeta esterilizada, transferiu-se 1mL da
diluição 10-1 para um outro tubo de diluição contendo 9 mL de solução de água
peptonada (diluição 10-2) e com o mesmo procedimento foi feito a diluição 10 -3,
etiquetando todos os tubos com respeito as suas respectivas diluições.

Plaqueamento - Foram pipetadas assepticamente 1mL da diluição 10-3 e transferido para

uma placa de petri esterilizada, etiquetando a mesma. Repetiu-se esse procedimento
com os demais tubos (10-2 e 10-1) fazendo um movimento de rotação a fim de
homogeneizar com a espátula.

Contagem - Esperou-se solidificar o meio, e foram invertidas as placas para evitar a

condensação do vapor retido na tampa da placa quando forem incubadas. Leva-se as
placas para incubação a 25°C por 5 dias. Apos realiza-se a contagem das colônias com
auxilio do contador.

Resultados

Nas placas analisadas não foi possível quantificar o número de colônias presentes,
porem foi possível identificar o crescimento de 3 espécies diferentes de fungos sendo
diferenciadas pelas cores apresentadas:

 Verdes – apresenta muitos esporos e as hifas não são visíveis a olho nu, as
colônias estão bastante justapostas umas sobre as outras.

 Branca – as colônias encontram-se mais espalhadas por todo espaço da placa e o

crescimento de hifas são visíveis.

 Rosas – as colônias encontram-se mais concentradas no meio da placa mas

também apresentam-se espalhadas pela placa com menor incidência.

Com relação as diluições utilizadas , a diluição 10 -1 apresenta maior quantidade de

colônias e a diluição 10-3 menor quantidade de colônias visíveis , como o esperado.
Outra característica visível nas placas , onde a espécie de cor rosa cresce ela inibe o
crescimento das outras espécies.

Discussão

Segundo OLIVEIRA em seu experimento os resultados obtidos evidenciaram altas

contagens de bolores e leveduras o percentual de amostras entre 104 e 105 UFC/mL foi
de 41,7 e 52,1%, respectivamente. Algumas amostras apresentaram altas contagens de
microorganismos, indicativas de condições inadequadas de manipulação e estocagem do
produto, levando a um risco associado à possível existência de patógenos capazes de
sobreviver em ambiente ácido.

Segundo PINHEIRO em seu experimento Em todas as amostras de suco de abacaxi

observou-se contagem de bolores e leveduras inferior a 10 UFC/mL, ausência de
coliformes a 35ºC e a 45ºC em 50 mL de amostra, contagem de aeróbios mesófilos
menor que 10 UFC/mL e ausência de Salmonella sp. em 25 mL de amostra. Em relação
às determinações microbiológicas, todas as dez amostras analisadas atendiam às
condições higiênico-sanitárias estabelecidas pela legislação em vigor, sendo
satisfatórias para o consumo humano.
Comparando com o experimento realizado no laboratório de microbiologia constata-se
que o crescimento muito elevado de bolores e leveduras nas placas, implicando assim a
impossível quantificação das colônias, pois elas apresentam muito unidas. O
aparecimento da espécie rosa foi altamente eficiente para inibir o crescimento das outras
colônias , entretanto em algumas partes da placa apresenta bem visível as espécies verde
e branca.
Porem elas foram classificadas quanto a sua coloração, sendo pigmentação dos cultivos,
muitas vezes, esta relacionada com o pH do substrato. (TRABULSI, 1999).
Das três espécies apresentadas a de coloração rosa inibe o crescimento das outra
espécies pois ela produz micotoxinas que acabam por inibir as outras espécies.
Micotoxinas são metabólitos secundários, tóxicos, produzidos por várias espécies de
fungos. Esses microrganismos, sob condições favoráveis, podem se desenvolver sobre
diversos substratos (entre os quais os alimentos) e produzir toxinas. Tal fato representa
problemas para a saúde pública, uma vez que podem atingir o ser humano pelo consumo
do alimento contaminado, ou pelo consumo de outros organismos que as tenham
ingerido (BAPTISTA, 2004).
Os fatores mais importantes que influenciam o crescimento e a produção de micotoxinas
são a umidade relativa, a temperatura, a atmosfera de armazenamento e os agentes
competidores (BAPTISTA, 2004).
As toxinas são freqüentemente produzidas em temperaturas ótimas para o crescimento
da espécie envolvida (BAPTISTA, 2004).
Alguns microrganismos podem influenciar o crescimento fúngico, devido à competição
que se estabelece no substrato de cultivo. Este antagonismo, muitas vezes, é
conseqüência da elaboração de substâncias tóxicas. (TRABULSI, 1999)
Com a finalidade de impedir o crescimento bacteriano, que pode inibir ou se sobrepor
ao do fungo, é necessário incorporar aos meios de cultura antibacterianos de largo
espectro, como o cloranfenicol. Também pode-se acrescentar ciclo-heximida para
diminuir o crescimento de fungos saprófitas contaminantes dos cultivos. (TRABULSI,
1999).
Mesmo não existindo uma legislação específica para contagem de microrganismos
psicrotróficos no Brasil, a legislação vigente possui como contagem bacteriana máxima
permitida o valor de 106 UFC/mL (BRASIL, 2002), o que demonstra que ambas as
médias encontram-se em desacordo com a legislação. Logo, o leite estava em natureza
contaminado. A pigmentação dos cultivos, muitas vezes, esta relacionada com o pH do
substrato. (TRABULSI, 1999)
A Resolução da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA - RDC n o12), de
2 de janeiro de 2001 especifica como padrões microbiológicos para polpa de frutas
concentrada ou não, com ou sem tratamento térmico, refrigerada ou congelada.
Para avaliar a qualidade microbiológica da polpa foram consideradas, as especificações
vigentes na Portaria 451 do Ministério da Saúde de 19 de setembro de 19977 que
regulamenta os padrões microbiológicos para sucos concentrados congelados, sucos e
refrescos in natura, preparado para refresco e refrigerantes, sucos concentrados
adicionados ou não de conservantes, polpas e produtos de frutas. Os valores máximos
permitidos para bolores e leveduras estão entre 102 e 104 UFC/ml, sendo que para
polpas de frutas o valor máximo permitido é de 103 UFC/ml.
 Conclusão

A realização do experimento, através das etapas de diluição seriada, plaqueamento e

contagem das colônias permitiu concluir, que o suco de fruta acida utilizado estava em
natureza impróprio para o consumo. Devido a quantidade excessiva de crescimento de
bolores e leveduras.A contagem das colônias não foi possível por causa da excessiva
quantidade de colônias. Os resultados obtidos nos testes microbiológicos das amostras
apresentaram-se em inconformidade com os limites estabelecidos pela legislação
vigente, tendo sido considerados insatisfatórios sob o ponto de vista de qualidade global
do produto.
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