UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS:
BIOQUÍMICA

GABRIEL CONTI DALLÓ

PERFIL HIPOGLICEMIANTE E ANTI-INFLAMATÓRIO DO EXTRATO DE

PRÓPOLIS DA ABELHA SEM FERRÃO SCAPTOTRIGONA BIPUNCTATA
LEPELETIER

Porto Alegre
2019

 GABRIEL CONTI DALLÓ

PERFIL HIPOGLICEMIANTE E ANTI-INFLAMATÓRIO DO EXTRATO DE

PRÓPOLIS DA ABELHA SEM FERRÃO SCAPTOTRIGONA BIPUNCTATA
LEPELETIER

Projeto de pesquisa apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em Ciências
Biológicas: Bioquímica do Instituto de
Ciências Básicas da Saúde da
Universidade Federal do Rio Grande do
Sul como requisito parcial para a obtenção
do título de mestre em Bioquímica.

Orientador: Prof. Dr. José Cláudio Fonseca

Moreira

Porto Alegre
2019
RESUMO

Diversas variedades de própolis apresentam potencial para desenvolvimento

de medicamentos e suplementação alimentar, devido as suas propriedades
hipoglicêmicas e anti-inflamatórias. Estas são atribuidas à presença de
compostos fenólicos e flavonoides, os quais variam de acordo com a biorregião
e sazonalidade. Segundo literatura, o extrato etanólico de própolis de
Scaptotrigona bipunctata do Rio Grande do Sul apresenta alto grau de
polifenóis totais (6,6%). Diabetes mellitus é um distúrbio metabólico
caracterizado pela elevação da glicose sanguínea, ligada ao mal
funcionamento das células beta pancreáticas, responsáveis pela liberação de
insulina. Só no ano de 2015, os gastos do Brasil com a diabetes foram de R$
190 bilhões, com 1,6 milhões de mortes atribuidas diretamente a diabetes no
mundo. No Brasil, de 7% a 10% da população pode ser diabética, podendo
chegar a 14% em 2030. O objetivo deste projeto é avaliar o perfil Anti-
inflamatório e hipoglicemiante do extrato de própolis da abelha Scaptotrigona
bipunctata em ratos Wistar submetidos a indução de diabetes . Os compostos
fenólicos da propolis serão extraídos em etanol, e o extrato será administrado
via gavagem durante duas semanas em ratos de 30 dias. A suplementação
com extrato etanólico será comparada ao efeito de medicamento anti-
inflamatório em modelo de edema de pata via carragenina, e medicamento
Hipoglicêmico. O modelo de edema de pata induzido por carragenina será
investigado através do aumento no volume da pata. No sangue, serão
avaliadas citocinas pró-inflamatórias, como Interleucina-1β, interleucina-6 e
TNF-α, além da medição da glicemia.
SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ....................................................................................................................... 5
1.1. Própolis ............................................................................................................................ 5
1.2. Diabetes ........................................................................................................................... 6
1.3. Abelhas sem ferrão ........................................................................................................ 8
2. JUSTIFICATIVA .................................................................................................................... 9
3. HIPÓTESE .............................................................................................................................. 9
4. OBJETIVO ............................................................................................................................ 10
4.1 Objetivos Específicos .................................................................................................... 10
5. MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................................. 11
5.1 Animais ............................................................................................................................ 11
5.2 Própolis ............................................................................................................................ 11
5.2.1 Preparação do Extrato Etanólico de Própolis (EEP) ......................................... 11
5.2.2 Caracterização do Extrato ..................................................................................... 12
5.3 Delineamento Experimental ......................................................................................... 12
5.3.1 Potencial Hipoglicemiante ..................................................................................... 12
5.3.2 Potencial Anti-inflamatório ..................................................................................... 12
5.4.1 Edema de Pata ....................................................................................................... 13
5.4.2 Análise do Perfil Inflamatório através do sangue .............................................. 13
5.5.1 Teste oral de tolerância à glicose (OGTT) .......................................................... 13
5.5.2 Medição da glicose no sangue ............................................................................. 14
5.7.1 Gavagem ................................................................................................................. 14
5.7.2 Eutanásia ................................................................................................................. 14
6. ORÇAMENTO .................................................................................................................. 15
7. CRONOGRAMA ............................................................................................................... 16
8. CÁLCULO DO N AMOSTRAL ....................................................................................... 16
9. QUESTÕES ÉTICAS ...................................................................................................... 16
10. DESCARTE DE RESÍDUOS ........................................................................................ 18
11. BIOSSEGURANÇA ....................................................................................................... 20
12. REFERÊNCIAS ............................................................................................................. 21
 1. INTRODUÇÃO

1.1. Própolis

Há relatos históricos de que a própolis tem sido utilizada desde a

antiguidade (300 a.C.) quando os egípcios embalsamavam faraós, com uso de
própolis e ervas. O estudo de suas propriedades começou no Instituto
veterinário em Kazan (URSS), em 1947, investigando o potencial
antimicrobiano e curativo.
Própolis é uma goma recolhida por abelhas de várias plantas. É uma
substância resinosa fortemente adesiva, usada para vedar buracos em seus
favos de mel e colônia, suavizar paredes internas, bem como para cobrir
carcaças de intrusos que morreram dentro da colmeia, a fim de evitar sua
decomposição [1].
Etimologicamente, a palavra própolis, de origem grega, significa: pró =
em defesa, e polis = cidade, destaca essa importancia dela para proteção da
colônia, impermeabilizando as paredes e isolando-a de doenças devido à
eficácia antisséptica e propriedades antimicrobianas [2].
Geralmente é composta por 50% de resina e bálsamo vegetal, 30% de
cera, 10% de óleos essenciais e aromáticos, 5% de pólen e 5% de várias
outras substâncias, incluindo resíduos orgânicos [3]. Diferentes amostras de
própolis relataram mais de 160 constituintes [4, 5], enquanto outros relataram
mais de 300 compostos como aldeídos fenólicos, aminoácidos, polifenóis,
quinases sesquiterpênicas, esteroides, cumarinas e compostos inorgânicos [6].
As variações na composição química e, consequentemente, na atividade
biológica da própolis, estão associadas ao seu tipo e origem geográfica.
Atualmente, a própolis brasileira pode ser classificada em 13 tipos diferentes,
de acordo com suas propriedades físico-químicas e área geográfica onde foi
encontrado [7].
Os compostos fenólicos e os flavonoides presentes na própolis são
responsáveis por atribuir propriedades antibacterianas [8-12], antifúngicas [13],
antissépticas [14], antivirais [15], antioxidantes [16], antitumorais [17] e anti-
inflamatórias [18].

1.2. Diabetes

A Diabetes mellitus é um distúrbio metabólico que constitui uma das

principais preocupações de saúde hoje, cuja prevalência aumentou
continuamente em todo o mundo nas últimas décadas. Além disso, foi
considerada uma desordem metabólica incurável que afeta cerca de 2,8% da
população mundial. Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), a
prevalência global de diabetes entre adultos acima de 18 anos dobrou entre
1980 e 2014 no mundo – alcançando 422 milhões de pessoas. O maior
crescimento registrado em países de renda baixa e média. Estima-se que esta
enfermidade será a sétima principal causa de morte em 2030 (IDF, 2015) [19].
Só no ano de 2015, 1,6 milhões de mortes foram diretamente causadas
pela diabetes no globo. Neste mesmo ano, os gastos do Brasil com a diabetes
foram de R$ 190 bilhões e, até 2030, essas despesas podem subir para R$
406 bilhões, no pior dos cenários avaliados. No Brasil, estimativas apontam
que entre 7% e 10% da população pode ser diabética – boa parte dela sem
nem sequer ter sido diagnosticada. Segundo estudo, essa porcentagem pode
chegar a 14% em 2030, no pior dos cenários [20].
Observa-se na literatura que a maioria dos estudos sobre atividades
terapêuticas e biológicas da própolis estão associadas à espécie de abelha
denominada Apis mellifera, pertencente à subfamília Apinae, conhecida
popularmente como abelha-europeia. Recentemente, diversos estudos
relacionaram a utilização da própolis com efeitos anti-diabéticos.
O extrato etanólico de própolis apresentou efeito benéfico na redução
dos níveis de açúcar no sangue em coelhos diabéticos induzidos por aloxana
[21]. A própolis também mostrou efeito anti-hiperglicêmico em pacientes com
diabetes tipo 2 [22]. Um de seus componentes ativos demonstrou reduzir o
nível de açúcar no sangue em animais diabéticos experimentais e modulou o
metabolismo dos lipídios sanguíneos, levando à diminuição da peroxidação
lipídica e eliminando os radicais livres [21, 23].
Tais resultados fazem da própolis um promissor agente no manejo da
diabetes mellitus e suas complicações, pois nela a hiperglicemia crônica produz
múltiplas sequelas bioquímicas, e o estresse oxidativo induzido pode agravar
os sintomas e a progressão da doença e quadro patológico associado [24].

O efeito protetor da própolis contra a toxicidade da estreptozotocina

(STZ) em ratos já foi atestado. Verificou-se que o extrato aquoso da própolis
impediu a destruição das células-b. Os autores inferiram que os principais
fatores para o efeito protetor do extrato aquoso da própolis contra a toxicidade
da STZ foram a atividade sequestradora de radicais livres juntamente com
atividades inibitórias sobre a IL-1 β-sintase e o óxido nítrico sintase [25].
A fração solúvel em água da própolis brasileira e seu constituinte
bioativo demonstrou forte efeito anti-hiperglicêmico, inibindo a atividade da
maltase intestinal. Tal efeito foi mais pronunciado modulando o aumento do
nível glicêmico pós-prandial após ingestão dietética de carboidratos [26]. A
própolis apresentou potencial para evitar o desenvolvimento de reisitência à
insulina induzida por ratos que receberam solução de frutose a 15% em água
potável por 8 semanas [27].
Foram observados efeitos antidiabéticos, hipolipidêmicos e antioxidantes
do extrato etanólico de própolis em ratos tratados com STZ, com aumento
significativo da glicose sérica, triglicerídeos, colesterol total e colesterol de
lipoproteína de baixa densidade e concomitante diminuição do colesterol sérico
de lipoproteína de alta densidade [23].
Recentemente foi relatado que, em modelos de diabetes induzida por
STZ, a suplementação de própolis está associada a uma diminuição
significativa da glicose no sangue. O mesmo estudo demostrou que o
tratamento de ratos diabéticos com própolis com insulina acarretou numa
diminuição significativa nos níveis de glucagon e melhora na relação insulina /
glucagon em relação ao grupo controle (negativo) [28].
Em diversos modelos in vitro, o extrato de própolis mostrou inibir a
agregação plaquetária e a síntese de eicosanóides, apresentando propriedades
anti-inflamatórias potentes [29]. Tais propriedades foram atestadas em modelos
in vivo de edema de pata induzido por carragenina, tanto na aplicação tópica
de pomada quanto na suplementação oral, além de inibir a migração de
leucócitos polimorfonucleares e inibir o aumento da permeabilidade vascular
[30, 31]. Tais resultados demonstram o potencial da utilização da própolis no
tratamento de patologias agregadas à Diabetes, como a síndrome do pé
diabético.

1.3. Abelhas sem ferrão

Os meliponíneos caracterizam-se por serem abelhas sociais e

possuírem o ferrão atrofiado, impossibilitando seu uso, sendo conhecidas
popularmente como abelhas sem ferrão. Estas abelhas constituem um grupo
formado por mais de 500 espécies conhecidas em todo mundo, sendo muitas
destas nativas do Brasil [32].
Tradicionalmente manejadas por povos indígenas [33], as abelhas sem
ferrão são excelentes agentes polinizadores, sendo muito utilizadas com esse
fim em plantações e estufas [34], cumprindo papel essencial para manutenção
da biodiversidade e equilíbrio da maioria dos ecossistemas terrestres [35].
A abelha sem ferrão Scaptotrigona bipunctata é comumente chamada de
Tubuna, e possui ampla distribuição no território brasileiro, de ocorrência do
Rio Grande do Sul até o Peru. Os ninhos dessas abelhas apresentam, como
característica marcante, uma única entrada composta por resinas em forma de
funil [36]. A abelha apresenta também um comportamento generalista de coleta
de alimento floral em uma grande variedade de espécies vegetais, o que
contribui para variedade de compostos presentes na própolis [37].
A própolis de abelhas nativas vem recebendo mais atenção na ultima
década, com bons resultados quanto às suas propriedades terapêuticas.
Semelhante a de abelhas africanizadas, esta também parece ser muito variável
em sua composição química e dependente da flora e do clima local.
A investigação do pólen coletado pela tubuna levou a quatro agliconas
de flavonóides: miricetina, dihidromiricetina, quercetina e isoramnetina [38].
Quanto à caracterização, outro estudo enquadrou sua própolis no grupo
Diterpênico, devido à prevalência destes ácidos em sua composição, com
presença acentuada de ácido caurenóico e ácido desidroabético [39].
Os Extratos etanólicos de própolis das abelhas sem ferrão Tubuna e
Jataí (Tetragonisca angustula) foram avaliados quanto a sua atividade
antimicrobiana. Frente aos microrganismos Staphylococcus aureus e
Escherichia coli, somente a própolis de Tubuna apresentou resultado positivo
(halo de inibição), atribuído ao maior teor de polifenóis que conferem atividades
biológicas e terapêuticas à própolis [40].

Os efeitos da própolis de Scaptotrigona sp. já foram estudados em

células de tumor cerebral humano (glioblastoma) quanto à proliferação celular,
capacidade clonogênica e morte celular, bem como o tratamento combinado
com temozolomide (TMZ), uma droga quimioterápica, tendo sido observados
efeitos inibitórios na proliferação celular e sinérgico antiproliferativo, quando
usado em combinação com a droga [41].

2. JUSTIFICATIVA

No Brasil, uma em cada dez pessoas em média possui Diabetes, com índices
crescentes e mais de R$ 50 milhões em gastos anuais em tratamentos. A
investigação da própolis de diversas abelhas de diferentes biorregiões já
apresentaram resultados que podem auxiliar no tratamento e prevenção da
Diabetes mellitus e de patologias associadas. O potencial hipoglicêmico e anti-
inflamatório do extrato da própolis de tubuna podem ajudar no desenvolvimento
de novos medicamentos e ampliar a cadeia produtiva de produtos associados à
meliponicultura.

3. HIPÓTESE

Observando-se a existência de trabalhos descrevendo a atividade

hipoglicêmica e anti-inflamatória da própolis de outras espécies de abelha da
região sul do Brasil, e a participação dos flavonoides e de metabólitos
secundários na inibição das glicosidases, o extrato de própolis da abelha
Scaptotrigona bipunctata pode ter potencial hipoglicemiante em ratos
diabéticos e anti-inflamatório no modelo de edema de pata induzido por
estreptozotocina.

4. OBJETIVO

Avaliar o perfil anti-inflamatório e potencial hipoglicemiante do extrato de

própolis da abelha nativa sem ferrão em modelo in vivo.

4.1 Objetivos Específicos

• Caracterizar o extrato de própolis de Scaptotrigona bipunctata quanto ao

teor de polifenóis totais e composição de fenóis e flavonoides.
• Avaliar potencial hipoglicemiante do extrato etanólico de própolis em
ratos Wistar com Diabetes induzida por estreptozotocina.
• Avaliar o potencial anti-inflamatório do extrato no modelo de edema de
pata induzido por carragenina.
• Avaliar o perfil inflamatório do sangue pela dosagem de citocinas pró-
inflamatórias, como Interleucina-1β, interleucina-6 e TNF-α.

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5. MATERIAIS E MÉTODOS

5.1 Animais

Ratos Wistar machos de três semanas de idade serão adquiridos do

Biotério Setorial do Departamento de Bioquímica da UFRGS. A utilização dos
animais seguirá protocolo experimental aprovado pelo Comitê de Ética da
UFRGS. Em cada gaiola serão colocados quatro animais escolhidos
aleatoriamente. Os animais permanecerão no biotério recebendo os
tratamentos expressos na metodologia de acordo com as condições de
alojamento previstas pela Resolução Normativa n. 15 do Conselho Nacional de
Controle de Experimentação Animal – CONCEA, temperatura entre 20ºC e
26ºC, umidade relativa do ar entre 40% e 60%, ciclo de 12/12horas de
claro/escuro, água e ração ad libitum. Determinou-se um período de duas
semanas de aclimatação, com manipulação diária, sem qualquer tratamento
invasivo, com o intuito de habituação do animal, tornando-o mais calmo e
receptivo aos tratamentos previstos para o desenvolvimento do experimento.

5.2 Própolis

A própolis de abelha nativa será coletada de um meliponário, localizado na

Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul (PUCRS), Porto Alegre.
As abelhas foram manejadas e conservadas de acordo com os procedimentos
apresentados pela literatura [42]. A coleta será realizada através da raspagem
das áreas internas das caixas de abelha.

5.2.1 Preparação do Extrato Etanólico de Própolis (EEP)

A própolis bruta será moída fina e extraída no escuro com etanol 80% (0,1
g/ml) à temperatura ambiente e mantida por sete dias em incubadora orbital
agitadora a 150 rpm, sendo agitada em Vórtex uma vez ao dia por cinco
minutos. Em seguida será filtrada, concentrada, liofilizada e armazenada a -20
[43, 44].

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5.2.2 Caracterização do Extrato

O teor de polifenóis e polissacarídeos do extrato de própolis será

determinado pelo método de Folin-Ciocalteu [45] e pelo método do ácido fenol-
sulfúrico [46], respectivamente. A caracterização dos Flavonóides será feita por
Infusão direta em Espectrômetro de massas, via ionização por eletrospray.

5.3 Delineamento Experimental

Os animais serão mantidos por aproximadamente três meses e separados

aleatoriamente em oito subgrupos experimentais (n = 15), sendo eles
subdivididos em duas baterias de experimentos:

5.3.1 Potencial Hipoglicemiante

I) Controle Diabético (solução salina);

II) Diabético, Tratamento com suplementação de Própolis;
III) Diabético, Tratamento com medicamento Hipoglicemiante;
IV) Diabético, Tratamento com suplementação de Própolis e medicamento;

5.3.2 Potencial Anti-inflamatório

V) Controle com Edema de pata (solução salina);

VI) Tratamento com suplementação de Própolis e edema;
VII) Tratamento com medicamento Anti-inflamatório e edema;
VIII) Tratamento com suplementação de Própolis, medicamento e edema.

Todos os tratamentos serão realizados com a mesma metodologia durante

duas semanas.
A Própolis será administrada num extrato etanólico liofilizado a 13% (10 ml / kg)
e disponibilizada via gavagem diariamente.
Como controle positivo Anti-inflamatório será usado Diclofenac.
Como controle positivo Hipoglicêmico será usado Acarbose.

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5.3.3 Indução da Diabetes

Os grupos I, II, III e IV receberão uma injeção intraperitoneal de

estreptozotocina 60 mg/kg (S0130 SIGMA Streptozocin, Sigma - Aldrich),
seguida de determinação da glicose sanguínea 48h depois.

5.4 Avaliação do Potencial Anti-inflamatório

5.4.1 Edema de Pata

O edema de pata será induzido via injeção intraplantar de 300µg de

carragenina (22049 SIGMA λ-Carrageenan plant-mucopolysaccharide, Sigma-
Aldrich) em solução aquosa 1,5% na pata traseira direita. Para cada animal
será calculada a percentagem de edema, que é o aumento no volume da pata
e a área sob a curva (AUC), para avaliar o efeito anti-inflamatório.
GRAU DE SEVERIDADE: Moderado

5.4.2 Análise do Perfil Inflamatório através do sangue

As amostras de sangue serão adequadamente preparadas para

conservação a -80 ºC até sua subsequente análise. Diversas citocinas pró-
inflamatórias como Interleucina-1β, interleucina-6 e TNF-α, por exemplo, serão
dosadas no sangue ao fim do tratamento através da técnica de ELISA
(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) como já é feito pelo nosso grupo de
pesquisa [47, 48]. O sangue será coletado imediatamente após o sacrifício em
tubos Falcon de 15mL e centrifugado a 2000rpm por 5 minutos. O plasma será
retirado e transferido para outros tubos e armazenado a -20ºC para as análises
bioquímicas.

5.5 Avaliação do Potencial Hipoglicemiante

5.5.1 Teste oral de tolerância à glicose (OGTT)

Avaliação do funcionamento das células β e resistência à insulina via simulação

da glicemia. A glicemia dos animais será medida em jejum de 10 horas após
último tratamento. Logo após será administrada uma injeção intraperitoneal de

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solução glicose 20% em PBS (2mg/g), seguido pela medição da glicemia dos
animais nos tempos 15, 30, 60, 120 minutos.
GRAU DE SEVERIDADE: Leve

5.5.2 Medição da glicose no sangue

Em jejum de 10 h, nos tempos 0, 30, 60 e 120 min após a primeira

administração dos tratamentos (efeitos agudos), e similarmente em intervalos
semanais até o final do tratamento.
GRAU DE SEVERIDADE: Leve

5.6 Análises Estatísticas

A análise estatística será feita após os dados serem analisados pelo software
utilizando o teste Análise de Variância (ANOVA) seguida do teste de Tukey
para verificar se houve diferença estatística entre os controles e tratamentos.

5.7 Procedimentos

5.7.1 Gavagem

Administração de substâncias pela via subcutânea ou intraperitoneal, por

gavagem ou via intravenosa utilizando vasos sanguíneos superficiais, em que
as substâncias não tenham um impacto maior do que leve no animal e em que
os volumes estejam dentro dos limites apropriados para o tamanho e a espécie
do animal. (CEUA, Guia de Severidade)
GRAU DE SEVERIDADE: Leve

5.7.2 Eutanásia

Os ratos serão eutanasiados em uma sala específica, sendo apenas um

animal por vez, a fim de minimizar o estresse do animal por causa do odor e
som dos outros animais. Os animais serão sacrificados por decapitação com
guilhotina, evitando interferência nos paramentos bioquímicos do fígado e
sangue pela presença de anestésico, sendo considerado um método sem
recuperação, prevenindo sofrimentos posteriores aos animais [49]. Todos os
procedimentos descritos seguem todas as Diretrizes da Prática de Eutanásia
14



do CONCEA, lei 11.794 de 8 de outubro de 2008, que regulamenta o incisivo

VII do §1º do artigo 225 da Constituição Federal, que estabelece
procedimentos para o uso científico de animais em pesquisa.
GRAU DE SEVERIDADE: Sem Retorno

6. ORÇAMENTO

ITENS Valor total R$

Material de Laboratório - Tesouras, pinças, mistura de

2.500,00
gases, agulhas, diversos

- Agulhas de Gavagem (Sigma - Aldrich; 12un) 1.891,00

Reagentes - Reagentes para análises bioquímicas

Reagente fenol Folin & Ciocalteu (Sigma - Aldrich; 500ml) 717,00

Outros Reagentes 2.000,00

Anticorpos - Análise de citocinas pró-inflamatórias: Anticorpos primários e

secundários

anti - IL-1β (Sigma - Aldrich; goat - 1 MG) 2.227,00

anti-TNF-α (Sigma - Aldrich; goat - 1 MG) 2.797.00

anti - IL-6 (Sigma - Aldrich; mouse - 5 MG) 4.710,00

Tratamentos - Drogas utilizadas no tratamento dos animais

Acarbose (Sigma - Aldrich; 500mg) 350,00

Carragenina (Sigma - Aldrich; 5g) 780,00

Diclofenac (Sigma - Aldrich; 25g) 971,00

Estreptozotocina (Sigma - Aldrich; 50mg) 281,00

TOTAL (R$) 19.224,00

15



7. CRONOGRAMA

Início: 03/2019 Período - Semestres

Atividades 2019/2 2020/1 2020/2 2021/1

Pesquisa bibliográfica X X X X

Avaliação e aprovação do projeto X

Coleta e caracterização do Extrato de

X X
Própolis

Experimentos em Animais X X

Aplicação das técnicas descritas no projeto X X

Elaboração de trabalhos e artigos X X X

8. CÁLCULO DO N AMOSTRAL

Para cálculo amostral foi utilizado o software “G*Power: Statistical Power

Analyses” para assegurar tamanho adequado das amostras para avaliar os
efeitos do extrato etanólico. Aplicou-se ao cálculo parâmetros estatísticos para
o teste Anova, utilizando um nível de significância α < 5% e β = 15%,
resultando num N estimado de 60 animais [50].

9. QUESTÕES ÉTICAS

Após a aprovação deste projeto de pesquisa, será encaminhado um pedido

de ratos Wistar machos (120 animais) ao Centro de Reprodução e
Experimentação de Animais de Laboratório da UFRGS (CREAL – UFRGS). Os
animais serão encaminhados do CREAL até o biotério setorial do
Departamento de Bioquímica da UFRGS, onde ficaram alojados para a
execução da fase experimental do projeto. Este transporte será realizado por
funcionário do CREAL, em data e horário previamente agendados, em furgão
pertencente a UFRGS, estando os animais em caixas isoladas. A partir de sua
chegada, os animais passarão por um período de aclimatação no biotério

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setorial de no mínimo 72 horas, o qual é fundamental para a ambientação do

animal ao novo local e diminuição do estresse oriundo do transporte. O biotério
do Departamento de Bioquímica da UFRGS apresenta excelentes condições
de alojar ratos Wistar, garantindo espaço físico, condições de higiene e saúde
adequadas para estes animais. O biotério conta com um veterinário sempre
disponível para qualquer eventualidade ou dúvida da equipe executora. A
proteção contra predadores, vetores, vermes e outras pragas é garantida
através de barreiras sanitárias apropriadas para cada tipo de alojamento e de
modelo animal. As necessidades ambientais - temperatura, iluminação,
ventilação, interação social, higiene, controle de ruído e odor - são
perfeitamente atendidas.
Os animais serão mantidos rigorosamente sob condições padrão
especificadas pelo National Institutes of Health Guide for Care and Use of
Laboratory [51] e pelas diretrizes de bem-estar em animais de laboratório e de
biossegurança em experimentação animal da Sociedade Brasileira de
Experimentação Ciência em Animais de Laboratório (SBCAL) e de acordo com
a Lei Federal n. 11794, de 8 de outubro de 2008, que regulamenta o uso de
animais em pesquisa [52]. Os animais serão tratados com respeito e de forma
humanitária pelos executores, respeitando a resolução nº 879, de 15 de
fevereiro de 2008 [53]. A expressão facial e postura corporal são indicadores
de vários estados emocionais, portanto serão constantemente avaliados. Os
executores do projeto deverão estar cientes dos cuidados com os animais e
estarão familiarizados com os 3 “R”s da experimentação animal: replace,
reduce e refine, proposto por Goldim e Raymundo [54].
Todo o processo desde o alojamento dos animais à contenção será
cuidadoso para minimizar ao máximo o sofrimento, o medo, a ansiedade e a
apreensão destes animais. Durante todos os processos os animais terão
acesso a alimento e água até o momento da morte. Os animais receberão
nutrição adequada, não contaminada e de procedência controlada, diariamente
em quantidade e qualidade apropriadas para garantir sua saúde e bem-estar.
Em nossa pesquisa manteremos constante postura ética em respeito aos
animais, por toda a contribuição científica que eles proporcionam. Nossos
métodos de eutanásia garantem a perda da consciência de forma rápida,
irreversível e desprovida de experiência emocional ou física desagradável,

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portanto teremos o cuidado para que o animal não apresente dor, estresse,
apreensão ou ansiedade. Independente do método de eleição, a inconsciência
antecederá a parada cardiorrespiratória, seguida da perda da função cerebral,
seguindo as diretrizes da prática de eutanásia do CONCEA [55]. Os animais
serão mortos em uma sala específica do departamento de bioquímica da
UFRGS que se caracteriza por ser um ambiente silencioso, e será previamente
limpo, longe de outros animais. Um animal não assistirá a eutanásia de outro.
O cadáver será retirado do ambiente da eutanásia, bem como os objetos que
serão limpos antes da entrada do próximo animal. As carcaças dos animais
serão encaminhadas, dentro de sacos plásticos, ao biotério do Departamento
de Bioquímica, e mantidas à –20ºC até a coleta pela empresa contratada
responsável pela incineração.
No caso de algum animal adoecer e não tiver condições de participar dos
experimentos este será eutanasiado de maneira respeitosa e indolor conforme
descrito anteriormente a fim de evitar que o animal passe por qualquer tipo de
dor ocasionado por doença. Caso algum animal não seja utilizado para
experimentos do presente projeto, mesmo após tratamento, o animal será
utilizado para fins didáticos instruindo outros bolsistas de nosso laboratório [53,
56], sempre de acordo com a Lei no 11.794, de 8 de outubro de 2008 [52] e as
diretrizes brasileiras para o cuidado e a utilização de animais para fins
científicos e didáticos [57]. Todos os esforços serão feitos para minimizar o
sofrimento dos animais e usar o mínimo de ratos necessários para obter
resultados científicos confiáveis e possam contribuir para entendimento e
funcionamento do organismo humano.

10. DESCARTE DE RESÍDUOS

O lixo resultante da limpeza da sala de eutanásia, papéis sujos com sangue

e demais matérias serão acondicionados em sacos plásticos brancos
identificados como risco biológico. As luvas, ponteiras e tubos plásticos que
tiverem contato com quaisquer materiais de origem biológica (tecidos,
anticorpos, etc...) serão desprezados em sacola de plástico branca,
identificados como risco biológico. As carcaças dos animais serão
acondicionadas em sacos plásticos brancos, identificados como risco biológico

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e serão congeladas a -20°C até o recolhimento. Empresa licitada pela UFRGS

será responsável pelo transporte e tratamento dos itens listados acima,
mediante convênio estabelecido entre a empresa e a UFRGS.
Os resíduos perfurantes/cortantes serão descartados em recipientes
próprios (coletor de material, perfurantes/cortantes, cartoon Box), os quais
serão lacrados, devidamente identificados (PERIGO infectante) e
encaminhados à secretaria para descarte apropriado.
O descarte dos reagentes químicos será realizado no Departamento de
Bioquímica de acordo com a tabela oferecida pelo Centro de Gestão e
Tratamento de Resíduos Químicos (CGTRQ) da Universidade Federal do Rio
Grande do Sul. Os reagentes químicos serão separados em solvente orgânico
halogenado e benzeno, solvente orgânico não halogenado, solvente orgânico
passível de purificação, aquoso, resíduo sólido, reagente não desejável e
matéria-prima para reciclagem. Estes resíduos serão descartados dentro de
bombonas plásticas (para resíduos líquidos), caixas de papelão ou sacos
plásticos (para sólidos). Estes recipientes serão identificados utilizando o rótulo
padrão do CGTRQ (www.iq.ufrgs.br/cgtrq), onde serão descritos os solutos em
ordem crescente, constará também a data de envase do material e o local
gerador do resíduo químico (unidade, departamento, laboratório, prédio, sala,
ramal, responsável legal e responsável técnico). Os resíduos serão
conduzidos ao CGTRQ da UFRGS seguindo o Plano de Gerenciamento de
Resíduos Biológicos do Departamento, elaborado de acordo com as
orientações da Coordenadoria de Gestão Ambiental da UFRGS, seguindo as
seguintes diretrizes:
I. RDC 306/2004/ANVISA- Dispõe sobre o Regulamento Técnico para o
gerenciamento de resíduos de serviços de saúde [58];
II. Resolução nº 358/2005 - Dispõe sobre o tratamento e a disposição final
dos resíduos dos serviços de saúde e dá outras providências; CONAMA
- Conselho Nacional do Meio Ambiente [59].
III. Normas do Centro de Gestão e Tratamento de Resíduos Químicos da
UFRGS [60];
IV. Lei estadual 10.099/1994 – Resíduos de serviços de saúde [61];
V. Lei estadual n° 9921/93 – Política estadual de resíduos sólidos no Rio
Grande do Sul [62].

19



Não serão utilizados nesse trabalho reagentes radioativos ou de alta

toxicidade, bem como não serão usadas amostras de origem humana.

11. BIOSSEGURANÇA

Postura e procedimentos no interior do laboratório seguirão as

recomendações descritas nos manuais de segurança e boas práticas dos
laboratórios, no intuito de evitar qualquer tipo de imprevisto.
Utilizaremos equipamentos de proteção individual no biotério: touca, jaleco,
máscara, pro-pés e luvas. Estes equipamentos de proteção deverão ser
vestidos antes da entrada no biotério. A touca deve cobrir toda a cabeça e
cabelos. O jaleco deve estar corretamente amarrado. A máscara deve proteger
boca e nariz. Os pró-pés só poderão ser colocados após o indivíduo pisar em
talco bactericida/fungicida a fim de minimizar a entrada de vírus, bactérias ou
fungos através da sola dos calçados. Todos os materiais de proteção são
descartáveis e devem ser descartados ao sair do biotério em lixo específico
localizado na saída do biotério. Na entrada e saída deve-se proceder a
assepsia das mãos, lavagem com sabão e descontaminação com álcool 70%.

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12. REFERÊNCIAS

1. Ghisalberti, E.L., Propolis: A Review. Bee World, 1979. 60(2): p. 59-84.

2. Salatino, A., et al., Origin and Chemical Variation of Brazilian Propolis. Evid Based
Complement Alternat Med, 2005. 2(1): p. 33-38.
3. Burdock, G.A., Review of the biological properties and toxicity of bee propolis
(propolis). Food Chem Toxicol, 1998. 36(4): p. 347-63.
4. Greenaway, W.C., et al., Identification by gas chromatography-mass spectrometry of
150 compounds in propolis. 2019.
5. Marcucci, M.C., Propolis: chemical composition, biological properties and therapeutic
activity. Apidologie., 1995. 26(2).
6. Khalil, M.L., Biological activity of bee propolis in health and disease. Asian Pac J Cancer
Prev, 2006. 7(1): p. 22-31.
7. Park, Y.K., S.M. Alencar, and C.L. Aguiar, Botanical origin and chemical composition of
Brazilian propolis. J Agric Food Chem, 2002. 50(9): p. 2502-6.
8. Kalogeropoulos, N., et al., Chemical composition, antioxidant activity and antimicrobial
properties of propolis extracts from Greece and Cyprus. Food Chemistry., 2009. 116(2):
p. 452-461.
9. Gonsales, G.Z., et al., Antibacterial activity of propolis collected in different regions of
Brazil. Journal of Venomous Animals and Toxins including Tropical Diseases, 2006. 12:
p. 276-284.
10. Sawaya, A.C.H.F., et al., Analysis of the composition of Brazilian propolis extracts by
chromatography and evaluation of their in vitro activity against gram-positive bacteria.
BRAZILIAN JOURNAL OF MICROBIOLOGY., 2004. 35(1/2): p. 104-109.
11. Bianchini, L. and I.P. Bedendo, EFEITO ANTIBIÓTICO DO PRÓPOLIS SOBRE BACTÉRIAS
FITOPATOGÊNICAS. Scientia Agricola, 1998. 55: p. 149-152.
12. Bosio, K., et al., In vitro activity of propolis against Streptococcus pyogenes. Lett Appl
Microbiol, 2000. 31(2): p. 174-7.
13. Ota, C., et al., Antifungal activity of propolis on different species of Candida. Mycoses,
2001. 44(9-10): p. 375-8.
14. Simões, C.C., D.B.d. Araújo, and R.P.C.d. Araújo, Estudo in vitro e ex vivo da ação de
diferentes concentrações de extratos de própolis frente aos microrganismos presentes
na saliva de humanos. Revista Brasileira de Farmacognosia, 2008. 18: p. 84-89.
15. Huleihel, M. and V. Isanu, Anti-herpes simplex virus effect of an aqueous extract of
propolis. Isr Med Assoc J, 2002. 4(11 Suppl): p. 923-7.
16. Moreira, L., et al., Antioxidant properties, total phenols and pollen analysis of propolis
samples from Portugal. Food Chem Toxicol, 2008. 46(11): p. 3482-5.
17. Diaz-Carballo, D., et al., The contribution of plukenetione A to the anti-tumoral activity
of Cuban propolis. Bioorg Med Chem, 2008. 16(22): p. 9635-43.
18. Ramos, A.F.N. and J.L. Miranda, Propolis: a review of its anti-inflammatory and healing
actions. Journal of Venomous Animals and Toxins including Tropical Diseases, 2007.
13: p. 697-710.
19. World Health Organization. Available from: https://www.who.int/.
20. Bommer, C., et al., Global Economic Burden of Diabetes in Adults: Projections From
2015 to 2030. Diabetes Care, 2018: p. dc171962.
21. Wang, N.Z. and D. Li, Effect of combined propolis-ethanol-extract and Shaoyao-
Gancao-tang on blood sugar Levels in rabbits with alloxan induced experimental
diabetes. Vol. 13. 2004. S66.
22. Murata, K., et al., Antihyperglycemic effects of propolis mixed with mulberry leaf
extract on patients with type 2 diabetes. Altern Ther Health Med, 2004. 10(3): p. 78-9.

21



23. El-Sayed el, S.M., et al., Potential antidiabetic and hypolipidemic effects of propolis
extract in streptozotocin-induced diabetic rats. Pak J Pharm Sci, 2009. 22(2): p. 168-74.
24. Gumieniczek, A., et al., Changes in antioxidant status of heart muscle tissue in
experimental diabetes in rabbits. Acta Biochim Pol, 2002. 49(2): p. 529-35.
25. Matsushige, K., et al., Propolis protects pancreatic beta-cells against the toxicity of
streptozotocin (STZ). Phytomedicine, 1996. 3(2): p. 203-9.
26. Matsui, T., et al., Strong antihyperglycemic effects of water-soluble fraction of Brazilian
propolis and its bioactive constituent, 3,4,5-tri-O-caffeoylquinic acid. Biol Pharm Bull,
2004. 27(11): p. 1797-803.
27. Zamami, Y., et al., [Effect of propolis on insulin resistance in fructose-drinking rats].
Yakugaku Zasshi, 2007. 127(12): p. 2065-73.
28. Al-Hariri, M., et al., Glycemic control and anti-osteopathic effect of propolis in diabetic
rats. Diabetes Metab Syndr Obes, 2011. 4: p. 377-84.
29. Khayyal, M.T., M.A. el-Ghazaly, and A.S. el-Khatib, Mechanisms involved in the
antiinflammatory effect of propolis extract. Drugs Exp Clin Res, 1993. 19(5): p. 197-203.
30. Naito, Y., et al., Antiinflammatory effect of topically applied propolis extract in
carrageenan-induced rat hind paw edema. Phytother Res, 2007. 21(5): p. 452-6.
31. Park, E.H., S.H. Kim, and S.S. Park, Anti-inflammatory Activity of Propolis. Archives of
pharmacal research., 1996. 19(5): p. 337-341.
32. Michener, C.D., The Meliponini, in Pot-Honey: A legacy of stingless bees, P. Vit, S.R.M.
Pedro, and D. Roubik, Editors. 2013, Springer New York: New York, NY. p. 3-17.
33. FABICHAK, I. Abelhas indígenas sem ferrão: Jataí. 1973.
34. Palma, G., et al., Comparative efficiency of Nannotrigona perilampoides, Bombus
impatiens (Hymenoptera: Apoidea), and mechanical vibration on fruit production of
enclosed habanero pepper. J Econ Entomol, 2008. 101(1): p. 132-8.
35. STUCHI, A.L.B., M.C.C.R. TAKASUSUKI, and V.d.A.A.d. TOLEDO. Analise da genetica de
populacoes em abelhas jatai (Tegragonisca angustula Latreille) por meio de
isoenzimas. 2008.
36. Blochtein, B., Manual de boas práticas para a criação e manejo racional de abelhas
sem ferrão no RS: Guaraipo, Manduri e Tubuna. Edipucrs.
37. PACHECO, W.F., et al. Comportamento alimentar de Scaptotrigona bipunctata
(Hymenoptera, Apidae, Meliponini) em três Municípios do Estado do Ceará. 2008;
Available from: http://ainfo.cnptia.embrapa.br/digital/bitstream/CPATSA-2009-
09/40387/1/OPB2266.pdf.
38. Lins, A.C.S., et al. Flavonóides isolados do pólen coletado pela abelha Scaptotrigona
bipunctata (canudo). 2003.
39. Velikova, M., et al., Chemical composition and biological activity of propolis from
Brazilian meliponinae. Z Naturforsch C, 2000. 55(9-10): p. 785-9.
40. Fianco, A.L., et al., Determinação da atividade antimicrobiana e teor de polifenóis
totais de extratos etanólicos de própolis das abelhas sem ferrão Tetragonisca
angustula (Jataí) e Scaptotrigona bipunctata (Tubuna). Vol. 14. 2013. 21-28.
41. Borges, K.S., et al., Antiproliferative effects of Tubi-bee propolis in glioblastoma cell
lines. Genet Mol Biol, 2011. 34(2): p. 310-4.
42. WITTER, S., B. BLOCHTEIN, and C.d. SANTOS, Abelhas sem ferrão do Rio Grande do Sul:
manejo e conservação., ed. FEPAGRO. 2005.
43. Georgeta, C., et al., Propolis extract/ β -cyclodextrin nanoparticles: Synthesis, physico-
chemical, and multivariate analyses. Vol. 14. 2008. 58-70.
44. Nassar, S.A., et al., Immunostimulant effect of Egyptian propolis in rabbits.
ScientificWorldJournal, 2012. 2012: p. 901516.
45. Ainsworth, E.A. and K.M. Gillespie, Estimation of total phenolic content and other
oxidation substrates in plant tissues using Folin-Ciocalteu reagent. Nat Protoc, 2007.
2(4): p. 875-7.

22



46. DuBois, M., et al., Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related
Substances. Analytical Chemistry, 1956. 28(3): p. 350-356.
47. Gasparotto, J., et al., Anti-RAGE antibody selectively blocks acute systemic
inflammatory responses to LPS in serum, liver, CSF and striatum. Brain Behav Immun,
2017. 62: p. 124-136.
48. Gasparotto, J., et al., Increased tau phosphorylation and receptor for advanced
glycation endproducts (RAGE) in the brain of mice infected with Leishmania
amazonensis. Brain Behav Immun, 2015. 43: p. 37-45.
49. Ward, C.G. and A.W. Loepke, Anesthetics and sedatives: toxic or protective for the
developing brain? Pharmacol Res, 2012. 65(3): p. 271-4.
50. CALLEGARI-JACQUES, S.M., Bioestatística: princípios e aplicações, ed. Artmed. 2003,
Porto Alegre.
51. Animals, N.R.C.U.C.f.t.U.o.t.G.f.t.a.U.o.L., Guide for the Care and Use of Laboratory
Animals. 2011.
52. BRASIL. Lei nº 11.794, de 8 de outubro de 2008. Available from:
http://www.planalto.gov.br/ccivil_03/_ato2007-2010/2008/lei/l11794.htm.
53. Conselho Federal de Medicina Veterinária, B., RESOLUÇÃO Nº 879, DE 15 DE
FEVEREIRO DE 2008.
54. Goldim JR, R.M. Pesquisa em Saúde e os Direitos dos Animais. 1997; 2:[Available from:
https://www.ufrgs.br/bioetica/animprin.htm.
55. CONCEA. RESOLUÇÃO NORMATIVA Nº 37, DE 15 DE FEVEREIRO DE 2018 - DIRETRIZES
DA PRÁTICA DE EUTANÁSIA DO CONCEA. 2018; Available from:
http://www.mctic.gov.br/mctic/export/sites/institucional/institucional/concea/arquiv
os/legislacao/resolucoes_normativas/Resolucao-Normativa-n-37-Diretriz-da-Pratica-
de-Eutanasia_site-concea.pdf.
56. National Research Council Committee for the Update of the Guide for the Care and
Use of Laboratory, A., The National Academies Collection: Reports funded by National
Institutes of Health, in Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 2011,
National Academies Press (US)National Academy of Sciences.: Washington (DC).
57. CONCEA. DIRETRIZ BRASILEIRA PARA O CUIDADO E A UTILIZAÇÃO DE ANIMAIS PARA
FINS CIENTÍFICOS E DIDÁTICOS - DBCA. 2013; Available from:
http://pages.cnpem.br/ceua/wp-content/uploads/sites/56/2015/06/DBCA.pdf.
58. ANVISA, Resolução – RDC/ANVISA nº 306, de 7 de dezembro de 2004.
59. CONAMA, C.N.d.M.A.-. RESOLUÇÃO No 358, DE 29 DE ABRIL DE 2005. 2018.
60. CGTRQ, U.-. Regimento do Centro de gestão e Tratamentos de Resíduos Químicos.
Available from: http://www.iq.ufrgs.br/cgtrq/.
61. Estado do Rio Grande do Sul, B., LEI Nº 10.099, DE 07 DE FEVEREIRO DE 1994.
62. Estado do Rio Grande do Sul, B., LEI Nº 9.921, DE 27 DE JULHO DE 1993.

23