05/06/13

NAS AULAS ANTERIORES...

UTILIZAÇÃO DOS MARCADORES

Como avaliar a diversidade genética?
GENÉTICOS III:

ESTRUTURA POPULACIONAL e
Cromossomos
FRAGMENTAÇÃO DE HABITAT
Proteínas

Disciplina:
DNA
Fundamentos de Genética da Conservação Animal

Prof. Fernando P. Rodrigues

NAS AULAS ANTERIORES... NA AULA DE HOJE

● Ferramentas utilizadas na prospecção de marcadores moleculares ● Ferramentas utilizadas na prospecção de marcadores moleculares

● Eletroforese ● Eletroforese
● Enzimas de Restrição ● Enzimas de Restrição
● Clonagem ● Clonagem
● PCR ● PCR
● Sequenciamento do DNA ● Sequenciamento do DNA

● Marcadores Moleculares ● Marcadores Moleculares

● Isoenzimas ● Isoenzimas
● RFLP ● RFLP
● Minissatélites ● Minissatélites
● RAPD ● RAPD
● Microssatélites ● Microssatélites
● PCR – RFLP ● PCR – RFLP
● Dados de Seqüência (SNPs) ● Dados de Seqüência (SNPs)

Isoenzimas e Microssatélites Isoenzimas e Microssatélites

DADOS OBTIDOS:
São marcadores codominantes
● Freqüência dos alelos em cada população

● Teste do Equilíbrio de Hardy-Weinberg

● Índices de Diversidade Genética (Na, A, Hm)

É possível identificar todos os alelos
e ● Endogamia
● Migração e Fluxo Gênico
os indivíduos homozigotos e heterozigotos ● Diferenciação e Estrutura Populacional (FST e outros)
● Identificação Individual/Paternidade (microssatélites)
● Sistemas de Acasalamento (microssatélites)
● Outros...

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ISOENZIMAS Análise de marcadores isoenzimáticos

Múltiplas formas de uma mesma enzima

Alelos

A
B
● Primeiro método para se medir a diversidade genética (1966). C
D

● Permite distinguir as diferentes formas (alelos) da proteína

produzida por um loco → É possível medir a variação existente
naquele loco.

Análise de marcadores isoenzimáticos Análise de marcadores isoenzimáticos

Alelos Alelos

A A
B B
C C
D D

Genótipos AA CC AA AD AB AA Genótipos AA CC AA AD AB AA

As isoenzimas são marcadores codominantes

Homozigotos # Heterozigotos

Análise de marcadores isoenzimáticos Análise de marcadores isoenzimáticos

Alelos Alelos

A A
B B
C C
D D

Genótipos AA CC AA AD AB AA Genótipos AA CC AA AD AB AA

As isoenzimas são marcadores codominantes As isoenzimas são marcadores codominantes

Homozigotos # Heterozigotos Homozigotos # Heterozigotos

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ISOENZIMAS MICROSSATÉLITES

Consistem de pequenas seqüências com 1 a 6 nucleotídeos de

● Vantagens comprimento, repetidas lado a lado (em tandem)

Codominante
Baixo custo Ø Mononucleotídeos: TTTTTTTTT

Ø Dinucleotídeos: ACACACAC

● Desvantagens Ø Trinucleotídeos: GTTGTTGTTGTT

Baixo nível de polimorfismo Ø Tetranucleotídeos: ATCGATCGATCG

Obtenção das amostras
Cuidados no armazenamento
Ø Pentanucleotídeos: AATCCAATCCAATCC

Ø Hexanucleotídeos: ATTCGTATTCGTATTCGT

MICROSSATÉLITES MICROSSATÉLITES

Consistem de pequenas seqüências com 1 a 6 nucleotídeos de

comprimento, repetidas lado a lado (em tandem)

Alto Polimorfismo

Variação no número de
blocos de repetição

Análise dos Marcadores

Análise dos Marcadores Microssatélites
Microssatélites

Indivíduo 1 → 206 / 216

Indivíduo 2 → 212 / 216

Indivíduo 3 → 208 / 208

Indivíduo 4 → 212 / 220

Indivíduo 5 → 212 / 212

Indivíduo 6 → 206 / 206

Indivíduo 7 → 220 / 220

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MICROSSATÉLITES Índices de Diversidade Genética

● Número de alelos por loco (Na)

● Vantagens

Alto nível de polimorfismo

Marcador codominante ● Número médio de alelos por loco (A)
Detecção por PCR – pouco DNA
→ Pode ser calculado incluindo locos monomórficos ou não

número total de alelos em todos os locos

A=
● Desvantagens número total de locos

Desenvolvimento do primer para novas espécies → Calculado para a população ou para a espécie como um todo
Ocorrência de alelos nulos (alelos não amplificados)
→ Sensível ao tamanho populacional – há formas de se corrigir estatisticamente
(Riqueza Alélica - AR)

Índices de Diversidade Genética Índices de Diversidade Genética

● Heterozigosidade observada (HO)

● Porcentagem de locos polimórficos (P)
→ Número de heterozigotos registrados em um determinado loco em relação ao
total de indivíduos analisados
número de locos polimórficos
P=
número total de locos Ho = número total de heterozigotos no loco i
número total de indivíduos
→ Pode-se adotar algum critério para considerar um loco polimórfico.
Ex: Frequência do alelo mais comum < 0,95
● Heterozigosidade observada média (ĤO)
→ Na literatura:
Em geral, um loco é considerado polimórfico quando exibe qualquer nível de → Número de heterozigotos registrados em relação ao número total de locos
analisados
variação

Somatória de Ho
Ĥo=
Número total de locos estudados

Índices de Diversidade Genética Índices de Diversidade Genética

Também é bastante utilizado na literatura:

● Heterozigosidade esperada (HE)

→ Pode ser calculado com base no Teorema de Hardy-Weinberg ● Diversidade Gênica (Nei 1973)

= Heterozigosidade esperada para o total da espécie (HT)

HE = 2pq

i=k _
H T = 1 - ∑ p i2
i=1
● Heterozigosidade esperada média (ĤE)
_
p = freq. média do iésimo alelo no total de populações analisadas
Somatória de HE
ĤE =
Número total de locos estudados

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Índices de Diferenciação Genética Índices de Diferenciação Genética

Estatística F de Wright Estatística F de Wright

Distingue 3 níveis de estruturação populacional (FIS – FST – FIT)
→ Descreve os níveis de estruturação populacional

→ Baseado em 3 níveis de variação: indivíduo, população e população total

● FIS (Coeficiente de endogamia)

Descreve a divergência entre a heterozigosidade observada e a

Valores utilizados: heterozigosidade esperada dentro das populações, assumindo panmixia.

HT = heterozigosidade esperada total (na população total)

HS = heterozigosidade esperada média (dentro das populações)
HI = heterozigosidade observada média (por indivíduo) FIS = (HS – HI) / HS

+ → déficit de heterozigotos
FIS pode apresentar valor
- → excesso de heterozigotos

Índices de Diferenciação Genética Índices de Diferenciação Genética

Estatística F de Wright Estatística F de Wright

Distingue 3 níveis de estruturação populacional (FIS – FST – FIT) Distingue 3 níveis de estruturação populacional (FIS – FST – FIT)

● FST (Índice de fixação) ● FIT (Coeficiente de endogamia geral)

Descreve a redução na heterozigosidade dentro das populações em Descreve a redução da heterozigosidade dentro dos indivíduos em
relação à população total, devido ao efeito da subdivisão (devido à seleção e relação à população total devido à não ocorrência de acasalamentos ao acaso
deriva). dentro das subpopulações (FIS) e subdivisão populacional (FST).

FST = (HT – HS) / HT FIT = (HT – HI) / HT

FST varia entre 0 e 1 (pode ocorrer valores negativos devido à tamanho + → déficit de heterozigotos
FIT pode apresentar valor
amostral diferentes) - → excesso de heterozigotos

Análise da estrutura populacional utilizando os Análise da estrutura populacional utilizando os

índices de diferenciação (estatística F) índices de diferenciação (estatística F)
População 1
Avaliar a distribuição da variabilidade genética dentro e entre populações AA → 60
Aa → 40 f (A) = 0,8
aa → 0 f (a) = 0,2

Total f (A) = 0,51

f (a) = 0,49
População 2
AA → 60 AA → 13 AA → 13
Aa → 18 f (A) = 0,22
Aa → 40 Aa → 18 f (a) = 0,78
aa → 0 aa → 69 aa → 69

f (A) = 0,8 f (A) = 0,22 População Heterozigosidade Heterozigosidade Heterozigosidade

Pop. 1 Pop. 2
f (a) = 0,2 f (a) = 0,78 observada esperada total
1
2

F(A)= (2x73)+58/400=0,51 Média

Total (Pops. 1 + 2)
F(a)= (2x69)+58/400=0,49

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Análise da estrutura populacional utilizando os Análise da estrutura populacional utilizando os

índices de diferenciação (estatística F) índices de diferenciação (estatística F)
População 1
AA → 60 População Heterozigosidade Heterozigosidade Heterozigosidade
Aa → 40 f (A) = 0,8 observada esperada total
aa → 0 f (a) = 0,2 1 0,40 0,32

f (A) = 0,51 2 0,18 0,34

Total
f (a) = 0,49 Média HI = 0,29 Hs = 0,33 HT = 0,50
População 2
AA → 13 f (A) = 0,22
Aa → 18 f (a) = 0,78
aa → 69 (Hs - Hi ) 0, 33 - 0,29
FIS = = = 0,12
Hs 0, 33
População Heterozigosidade Heterozigosidade Heterozigosidade
observada esperada total (Ht - Hi ) 0, 50 - 0,29
FIT = = = 0, 42
1 40/100=0,40 2(0,80 x 0,20)= 0,32 Ht 0, 50
2 18/100=0,18 2(0,22 x 0,78) = 0,34
Média HI = 0,29 Hs = 0,33 HT = 2(0,51 x 0,49) = 0,50
(Ht - H s ) 0, 50 - 0, 33
FST = = = 0, 31
Ht 0, 50

Outros Índices de Diferenciação Genética... Avaliação da estrutura populacional através de

análises Bayesianas

● Permitem inferir a subdivisão mais provável da população

● GST (Nei 1973)
● Pode-se utilizar ou não informações sobre a localização geográfica dos
● Ө, f e F (Weir & Cockerham 1984)
indivíduos (informação a priori)
● RST (Slatkin 1995)
● São conhecidos como “assignment tests” (teste de afiliação)
● Rho (Michalakis & Excoffier 1996)

Softwares mais utilizados:

Structure
BAPS
Geneland

Avaliação da estrutura populacional através de Avaliação da estrutura populacional através de

análises Bayesianas análises Bayesianas

● Permitem inferir a subdivisão mais provável da população ● Permitem inferir a subdivisão mais provável da população

Exemplo: População não estruturada – Clyomys bishopi Exemplo: População estruturada – Micoureus paraguayanus
-1500,0

-1550,0

-1600,0
ln P(D)

-1650,0

-1700,0

-1750,0
0 2 4 6 8 10

Simulação K = 2 K

1 2 3 4 5

Simulação K = 12

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Estimativa do fluxo gênico Estimativa do fluxo gênico

n  O que se espera quando existe fluxo gênico?

● Pode ser obtida utilizando-se os valores obtidos pela análise da
estrutura populacional (Wright 1951)

FST = 1 / (1 + 4Nm)

ou

Nm = (1 – FST) / 4FST

DISTRIBUIÇÃO DO CERVO-DO-PANTANAL

Cervos-do-Pantanal nas várzeas do Rio Paraná

Usina Hidroelétrica de Porto Primavera

população 1

população 2

população 3

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Captura de Cervo-do-Pantanal Captura de Cervo-do-Pantanal

(Rio Paraná – UH Porto Primavera) (Rio Paraná – UH Porto Primavera)

Captura de Cervo-do-Pantanal Captura de Cervo-do-Pantanal

(Rio Paraná – UH Porto Primavera) (Rio Paraná – UH Porto Primavera)

Captura de Cervo-do-Pantanal Captura de Cervo-do-Pantanal

(Rio Paraná – UH Porto Primavera) (Rio Paraná – UH Porto Primavera)

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Captura de Cervo-do-Pantanal Captura de Cervo-do-Pantanal

(Rio Paraná – UH Porto Primavera) (Rio Paraná – UH Porto Primavera)

Captura de Cervo-do-Pantanal Captura de Cervo-do-Pantanal

(Rio Paraná – UH Porto Primavera) (Rio Paraná – UH Porto Primavera)

Diversidade genética nos 3 grupos de B. dichotomus

Sistemas isoenzimáticos estudados
estudados
Locos Polimórficos = 6

No. de alelos por loco (Na)

No. médio de alelos (A) = ?

A = 2,34 (só polimórficos)
A = 1,47 (polimórficos + monomórficos)
Qual a Proporção de Locos Polimórficos (P)? P = 6/17 = 35,29%

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Diversidade genética nos 3 grupos de B. dichotomus Heterozigosidade nos 3 grupos de B. dichotomus

estudados estudados

Resumo da estatística F de B. dichotomus

Utilização de marcadores microssatélites para a

análise da diversidade e estrutura genética em
populações fragmentadas

Nm = 4,8 animais / geração

DESTRUIÇÃO E FRAGMENTAÇÃO DE HABITAT

POPULAÇÕES PEQUENAS SÃO MAIS
PROPENÇAS À EXTINÇÃO

POR QUÊ?

São mais vulneráveis às conseqüências de

REDUÇÃO NA CAPACIDADE DE SUPORTE processos estocásticos
↓
REDUÇÃO NO TAMANHO DAS POPULAÇÕES

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Destruição
PROCESSOS ESTOCÁSTICOS dos Habitats

Isolamento
Fragmentação
Demográficos Ambientais das Populações
Deriva Genética

Redução do
Tamanho
Populacional

População

Genéticos

DERIVA GENÉTICA Mudanças nas freqüências alélicas devido à deriva

genética em populações de diferentes tamanhos.

Dois possíveis resultados da deriva genética em

Destruição
populações com tamanho igual a 25 e p0 = 0,5 dos Habitats

Isolamento
Perda da
Fragmentação
Deriva Genética Variabilidade
das Populações
Genética
Redução do
Tamanho
Populacional

Aumento da
Consanguinidade

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FREQUÊNCIAS GENOTÍPICAS EM: Freqüências genotípicas em uma população com

freqüências alélicas p = 0,4 e q = 0,6
sob acasalamento aleatório ou completamente endogâmica
Populações em Equilíbrio de Hardy-Weinberg
0,6
A 1A 1 A 1A 2 A 2A 2
0,5
p2 2pq q2
0,4
A1A1
0,3
A1A2
Populações Endogâmicas 0,2
A2A2

0,1
A 1A 1 A 1A 2 A 2A 2
0
p2 + Fpq 2pq – 2Fpq q2 + Fpq F=0 F=1

FATORES ENVOLVIDOS NA DIFERENCIAÇÃO DE POPULAÇÕES

Destruição
FRAGMENTADAS
dos Habitats

● Tamanho populacional
Isolamento
Perda da - Fragmentos com diferentes tamanhos
Fragmentação
Deriva Genética Variabilidade - Qualidade e estrutura de habitat
das Populações
Genética ● Isolamento
Redução do
Tamanho - Habilidade de dispersão/deslocamento das espécies
Populacional - Composição da matriz
- Distância entre os fragmentos
● Histórico da fragmentação : tempo x espaço
Aumento da Homozigosidade Depressão ● Intervalo entre gerações
Consanguinidade Heterozigosidade Endogâmica

X X

ÁREA DE ESTUDO: PONTAL DO PARANAPANEMA

EFEITO DA FRAGMENTAÇÃO DE HABITAT SOBRE A ESTRUTURA
GENÉTICA DE PEQUENOS MAMÍFEROS

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Rodrigues et al. (2006) Mol. Ecol. Notes, 6: 686-688

ÁREA DE ESTUDO: PONTAL DO PARANAPANEMA Isolamento e caracterização de locos microssatélites para

a cuíca Micoureus paraguayanus

Digestão do DNA
genômico

Microssatélite

ÁREA Área (ha) Distância (km)

1 – PEMD 37000 ---
2 – Tucano 1990 9,00
3 – Santa Teresa 83 0,32
4 – Ponte Branca 1195 7,90
5 – Santa Maria 441 13,20
6 – Santa Mônica 584 23,00
7 – São Sebastião 30 3,00
Clonagem e Sequenciamento
TOTAL

MARCADORES UTILIZADOS Diversidade Genética

Marcadores Microssatélites

Autor / Primers Espécie original M. paraguayanus

Marcadores
Microssatélites Rodrigues et al. (2006)

Mpa01 – Mpa02 – Mpa03 M. paraguayanus ●

Mpa04 – Mpa05 M. paraguayanus ●

Rodrigues et al. (não publicados)

Mpa06 - Mpa07 - Mpa08 - Mpa09 M. paraguayanus ●

Dias et al. (2008)

Mdem01 – Mdem06 – Mdem08 M. paraguayanus ●
Mdem09 – Mdem11 – Mdem12 M. paraguayanus ●
Mdem15 M. paraguayanus ●

Marcadores
D-loop ----- ●
Mitocondriais

Diversidade Genética Região Controle do DNA mitocondrial (D-loop)

Marcadores Microssatélites

A AR Ho He FIS P r
PEMD 4.00 3.85 0.609 0.576 -0.085 0.873 0.018
Tucano 4.25 4.03 0.594 0.607 0.022 0.445 0.017
Santa Teresa 3.87 3.11 0.426 0.450 0.052 0.235 0.037
Ponte Branca 3.75 2.92 0.409 0.448 0.087 0.095 0.033
Santa Maria 4.75 4.00 0.524 0.625 0.067 0.197 0.032
Santa Mônica 3.87 3.12 0.560 0.517 0.019 0.355 0.019

0,7
0,6 -  Número de locos analisados = 08
0,5 -  Número de alelos (Na) = 51
0,4
0,3
-  Na/loco = 4 – 10 (<)
0,2 -  A = 6,1
0,1
-  A/pop = 3.75 – 4.75 (média = 4,08) (<)
0 - Número de haplótipos = 25
PEMD Tucano Santa Ponte Santa Santa - ĤO = 0,52
Teresa Branca Maria Mônica - Diversidade haplotípica = 0,848
-  ĤE = 0,54 - Diversidade nucleotídica = 0,006
Heterosigozidade Observada Heterosigosidade Esperada

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Estrutura Genética e Diferenciação Populacional Estrutura Genética e Diferenciação Populacional

Santa Ponte Santa Santa

PEMD Tucano
Teresa Branca Maria Mônica
PEMD - 0.7868 0.0022 0.0021 0.0265 0.0017
Tucano -0.005 - 0.0000 0.0001 0.0003 0.0000
Santa Teresa 0.059* 0.090* - 0.0000 0.0000 0.0000
Ponte Branca 0.023* 0.052* 0.081* - 0.0000 0.0000
Santa Maria 0.035 0.058* 0.110* 0.088* - 0.0000
Santa Mônica 0.024* 0.034* 0.083* 0.060* 0.059* -
* Significant FST values (α = 0,006 – after Bonferroni correction)

1 2 3 4 5

Forero-Medina e Vieira (2009)

ANÁLISE COMPARATIVA ENTRE ESPÉCIES COM Análise da Diversidade e Estrutura Genéticas de Jaguatiricas
DIFERENTES HISTÓRIAS DE VIDA (Leopardus pardalis) no Corredor de Biodiversidade do Rio
Paraná

PE Morro do Diabo
(SP)

PN Iguaçu
(PR)

Anael A. Jacob (2002)

Análise da Diversidade e Estrutura Genéticas de Jaguatiricas ANÁLISE COMPARATIVA ENTRE ESPÉCIES COM
(Leopardus pardalis) no Corredor de Biodiversidade do Rio DIFERENTES HISTÓRIAS DE VIDA
Paraná
Análise com 9 locos
microssatélites:

A = 5,8
PE Morro do Diabo
(SP) Ho = 0,72
Indício de gargalo populacional

PN Iguaçu
A = 5,9
(PR)
Ho = 0,60

?
FST = 0,027 (P=0,064) Structure → K=1

Anael A. Jacob (2002)

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Análise da Diversidade e Estrutura Genéticas de Onça-pintada Valores de FST (diagonal superior) e RST (diagonal inferior)
(Panthera onca) no Corredor de Biodiversidade do Rio Paraná
Iguaç u Morro do Diabo Ivinhema Porto Primavera
(Haag & Eizirik, 2009)
Iguaçu - 0,198*** 0,122*** 0,048***
Morro do Diabo 0,112** - 0,120*** 0,073***
Ivinhema 0,081** -0,010 - 0,060***
Porto Primavera 0,036* -0,007 0,024 -

Valores significativos: *P,0,05 / **P<0,01 / ***P<0.001

Análise Bayesiana

ANÁLISE COMPARATIVA ENTRE ESPÉCIES COM

DIFERENTES HISTÓRIAS DE VIDA

Jacob (2002)

?
Cullen Jr. (2006)

15