Genética – 05/05

Citogenética Molecular e Citogenômica

Técnicas para a visualização de pequenas alterações, que não são
possíveis de ser detectadas na técnica de cariotipagem por coloração
convencional e bandamento G.
FISH – Hibridação in Situ por Fluorescência
É uma técnica que trabalha, juntamente com a cariotipagem, em nível
celular.
A partir de uma cópia de material genético fabricado industrialmente, ou
seja uma sonda, marcada com fluorescência que fixa-se com a sequência
complementar de uma região do genoma na célula do paciente, após ser
estimulada por uma fonte luminosa, emite uma luz visível apenas em
microscopia de fluorescência.
A técnica de FISH pode ser realizada em células em culturas, sem
necessidade de estarem em metáfase, em preparações diretas ou cortes
histológicos.
Vantagens e Desvantagens
É possível detectar alterações gênicas em níveis cromossômicos, ou
seja, as pequenas alterações.
Existe uma diversidade de tipos de sondas para diferentes regiões do
genoma humano, sendo muito especificas.
Os resultados são confiáveis, além de ser uma técnica
consideravelmente rápida de realizar.
Porém o custo da técnica é alto, considerando as sondas, o microscópio
de fluorescência, a estrutura adequada do laboratório, e a necessidade de um
sistema de fotodocumentação, considerando que a durabilidade das sondas
também é muito curta.
A especificidade também é uma limitação da técnica, pois faz-se
necessário uma hipótese de diagnóstico fundamentada.
Procedimento
A lâmina com a amostra do paciente passa por uma denaturação com
calor, para romper a dupla fita de DNA.
Logo após, é adicionado as sondas, que vão ligar-se a parte do DNA
que for compatível, e essa amostra é levada para a estufa de um dia para o
outro.
Posteriormente, é feito uma sequência de lavagens, para a retirada do
excesso de sondas que não se ligaram, e a lâmina é corada com um corante
chamado DAPI, para especificar as áreas com material genético.
 Por fim, a amostra é analisada no microscópio de fluorescência.
Tipos de Sondas
 Centroméricas
São as sondas complementares da sequência de DNA presente próximo
aos centrômeros dos cromossomos, ou seja, só coram aquela região
pericentromérica.
 Pintura Cromossômica
São as sondas complementares de várias regiões do DNA, dando a
impressão de cromossomo totalmente corado, exceto o centrômero (DNA
repetitivo).
 Sequência Única
São sondas complementares de uma única região especifica do DNA, que
servem para diagnosticar síndromes de microdeleções.

MLPA – Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification

Técnica citogenômina que necessita de extração de DNA da célula em
excelente qualidade.
Pode ser utilizado a extração de DNA do sangue, de tecido fresco ou
parafinado.
A MLPA pode analisar até 50 sequências de DNA em uma reação,
portanto é considerada uma técnica alvo-específica.
Sua aplicação varia entre pequenos rearranjos até rearranjos maiores,
regiões subteloméricas e alterações no número de cromossomos.
Nesta técnica também são utilizadas sondas que serão amplificadas
pela técnica de PCR, e posteriormente o resultado é sequenciado.
Nos gráficos, os pontos que estão acima do padrão normal são os
ganhos e os que estão abaixo são as perdas.

Array
A técnica de Array também necessita da extração de DNA de excelente
qualidade.
Analisa perdas e ganhos de partes cromossômicas submicroscópicas,
presentes no genoma do paciente.
Vantagens e Desvantagens
Possui uma alta resolução, portanto é possível detectar alterações muito
pequenas.
Pode ser utilizada em diversas patologias, como câncer, anomalias
congênitas, entre outras.
Além de avaliar as CNV’s, que são perdas ou ganhos de partes
cromossômicas, e as SNP’s, que são variações de nucleotídeos.
Porém a técnica de Array não é capaz de detectar alterações
cromossômicas equilibradas, como uma translocação sem ganho ou perda de
material genético, e mosaicos de baixa frequência.
O custo da técnica também é considerado alto, e não possui cobertura
pelo SUS.
Procedimento
Técnica de Array-CGH:
Nesta técnica é utilizado a amostra do paciente, como sangue, e um
controle.
O DNA da amostra do paciente e do controle são marcados com
fluorocromos, que garantem a fluorescência.
Após a realização da hibridação, a lâmina com a amostra é lavada. E,
por fim, os dados são extraídos e analisados.
Se o paciente sofrer de alguma perda, a fluorescência do controle vai
sobressair-se a da amostra do paciente (cor verde), agora se o mesmo sofrer
de algum ganho, a fluorescência da amostra vai sobressair-se a do controle
(cor vermelha).
As regiões com cores amarelas, são sinais de equilíbrio entre o material
genético do paciente e do controle.
As imagens escaneadas são transformadas em gráficos por softwares
especializados.
Nos gráficos, os pontos que aparecem do lado esquerdo do padrão
normal são as perdas e os pontos que aparecem do lado direito são os ganhos.