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Itajaí, 2011
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
____________________________________
Angela Malheiros, Dra.
Orientadora
____________________________________
Valdir Cechinel Filho, Dr.
Co-Orientador
__________________________________________________________
Tânia Mari Bellé Bresolin, Dra.
Coordenadora do Programa Mestrado em Ciências Farmacêuticas
______________________________________
Profa. Dra. Angela Malheiros (UNIVALI)
Presidente e Orientadora
______________________________________
Prof. Dr. Valdir Cechinel Filho (UNIVALI)
Co-orientador
______________________________________
Prof. Dr. Rivaldo Niero (UNIVALI)
Membro Interno
______________________________________
Prof. Dra. Rosi Zanoni da Silva (UEPG)
Membro Externo
AGRADECIMENTOS
realizado.
Plasmodium.
Ao Gilberto Carlos Franchi Júnior e Alexandre Eduardo Nowill
aos Pedros por terem ajudado nas análises e aos amigos cultivados ao
ABSTRACT
PHYTOCHEMICAL ANALISYS AND EVALUATION OF THE
ANTIPARASITIC AND ANTITUMOR POTENTIAL OF CHLOROFORM
EXTRACT AND COMPOUNDS ISOLATED FROM Drimys brasiliensis
MIERS (Winteraceae)
There is a growing need for studies involving medicinal plants for the treatment of
various diseases. Studies conducted with Drimys brasiliensis describe it as having
various medicinal properties, making it potentially useful in the treatment of cancer.
The study presented here evaluates the cytotoxicity and antiparasitic activities of
different extracts of stem bark, branches and leaves, as well as compounds isolated
from the stem bark of D. brasiliensis. The extract was fractionated by column
chromatography using silica gel as stationary phase and hexane, ethyl acetate and
methanol as mobile phase. The sesquiterpene drimanes polygodial, 1-β-O-p-
methoxy-E-cinnamoyl-isodrimeninol, 1-β-O-p-methoxy-E-cinnamoyl-5α-hydroxy-
isodrimeninol, 1-β-(p-methoxycinnamoyl)-polygodial, drimanial and 1-β-(p-
coumaroiloxy)-polygodial, the aromadendrane spathulenol, the lignan (-) hinokinin,
and another still being identified, were isolated, as well as unsaturated fatty acids
and a glyceride. The substances were identified by nuclear magnetic resonance of
1
H and 13C, and their structures were confirmed by comparison with the data in the
literature. The extracts of the stem bark, branches and leaves, as well as the
isolated compounds, were evaluated in vitro in tumorigenic cells of myeloid
leukemia (K562), acute lymphoblastic B (Nalm6), mammary adenocarcinome (MCF-
7) and murine melanome (B16F10) at concentrations of between 0.0001 and 1.000
µg/mL. The chloroform extract of the stem bark was the most active for all the cell
models tested, with IC50 of between 4 and 22 µg/mL. In the same cell models, four
drimanes and one aromadendrane were also tested. The drimanes were selective
for some cells, especially 1-β-(p-methoxycinnamyl)-poligodial, which was the most
active for all strains tested. The extracts and isolated compounds were evaluated in
two promastigote forms of Leishmmania and a trophozoite form of Plasmodium. The
drimanes showed satisfactory results, with IC50 of between 1 and 42 µM and of
these, 1-β-(p-cumaroiloxi)-poligodial was the most active, with IC50 of between 1
and 6 µM. The results indicate that the drimanes present in the stem bark are
responsible for the activities attributed to D. brasiliensis, confirming its popular use
in the treatment of various diseases affecting humans, and generating prospects for
future improvements as a medicine for the treatment of related pathologies.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Gênese das células sanguíneas e linfócitos. (Adaptado de: INCA, 2010).
..........................................................................................................................28
Figura 2: Leishmania, (A) forma flagelada ou promastigota; (B) forma aflagelada ou
amastigota (Adaptado de: BRASIL, 2007). ........................................................30
Figura 3: Ciclo biológico de Leishmania no vetor e no vertebrado. (Adaptado de:
BRASIL, 2007)...................................................................................................31
Figura 4: Ciclo de vida da malária no vetor e no vertebrado (Adaptado de: BRASIL,
2005). ................................................................................................................33
Figura 5: Drimys brasiliensis: aspecto geral da planta adulta. (Fonte: Autora). .......35
Figura 6: Fluxograma dos procedimentos cromatográficos do extrato clorofórmico
das cascas de D. brasiliensis. ...........................................................................52
Figura 7: Metabolização do MTT em sais de formazan em células viáveis. ............53
Figura 8: Fluxograma dos procedimentos cromatográficos do extrato clorofórmico
de D. brasiliensis mostrando o isolamento do Espatulenol. ..............................62
Figura 9: Espectro de RMN ¹H (300 MHz, CDCl 3/TMS) do DBJ-70. .......................63
Figura 10: Ampliações do espectro de RMN ¹H (300 MHz, CDCl 3/TMS) do DBJ-70:
a) de 7,5 a 3,5 ppm; b) de 2,5 a 1,5 ppm; c) de 1,4 a 0,4 ppm. .........................64
Figura 11: Espectro de RMN 13C (75 MHz, CDCl3/TMS) do DBJ-70. ......................65
Figura 12: Espectro de DEPT 135 (75 MHz, CDCl 3/TMS) do DBJ-70. ....................65
Figura 13: Esquema para obtenção dos principais grupos de sesquiterpenos
gerados a partir do precursor farnesil pirofosfato (Adaptado de: DEWICK,
2009). ................................................................................................................67
Figura 14: Provável rota biossintética do sesquiterpeno Espatulenol. (Adaptado de
CHAVES, et al., 2003). ......................................................................................68
Figura 15: Fluxograma dos procedimentos cromatográficos do extrato clorofórmico
de D. brasiliensis mostrando o isolamento do Ácido Graxo Insaturado e do
Glicerídeo. .........................................................................................................69
Figura 16: Ampliação do espectro de RMN de 1H do DBJ-100 (300 MHz,
CDCl3/TMS) de 5,5 até 0,5 ppm. .......................................................................70
Figura 17: Espectro de RMN 13C (75 MHz, CDCl3/TMS) do DBJ-100. ....................71
Figura 18: a) Espectro de RMN 1H (300 MHz, CDCl3/TMS) do DBF-1; b) expansões
de 6,0 a 3,5 ppm; c) expansões de 2,4 a 0 ppm. .............................................72
Figura 19: a) Expansão do espectro de RMN 13C (75 MHz, CDCl3/TMS) do DBF-1
de 120 a 14 ppm................................................................................................73
Figura 20: Espectro de DEPT 135 (75 MHz, CDCl 3/TMS) do DBF-1. .....................73
Figura 21: Biossíntese dos lipídeos através do precursor acetil CoA (Adaptado de:
HORNSTRA, 2002; LENINGER; NELSON; COX, 2002)...................................75
Figura 22: Representação estrutural dos ácidos graxos ω-6 e ω-3 (Adaptado de:
HORNSTRA, 2002; LENINGER; NELSON; COX, 2002)...................................76
Figura 23: Fluxograma dos procedimentos cromatográficos do extrato clorofórmico
de D. brasiliensis mostrando o isolamento da (-) Hinoquinina e da lignana DBX-
09. .....................................................................................................................78
Figura 24: Espectro de RMN ¹H (300 MHz, CDCl 3/TMS) do DBK-29. .....................79
Figura 25: Espectro de RMN ¹3C (75 MHz, CDCl3/TMS) do DBK-29. .....................80
Figura 26: Espectro de DEPT 135 (75 MHz, CDCl 3/TMS) do DBK-29. ...................80
Figura 27: Biossíntese dos lignóides (Adaptado de: SIMÕES, et al., 2004). ...........83
Figura 28: Rota biossintética provável da hinoquinina (Fonte: DEWICK, 2002)......84
Figura 29: Espectro de RMN ¹H (300 MHz, CDCl 3/TMS) do DBX-09. .....................85
10
Figura 30: Espectro de RMN ¹3C (75 MHz, CDCl3/TMS) do DBX-09. .....................86
Figura 31: Espectro de DEPT 135 (75 MHz, CDCl 3/TMS) do DBX-09. ...................86
Figura 32: Fluxograma dos procedimentos cromatográficos do extrato clorofórmico
de D. brasiliensis mostrando o isolamento dos sesquiterpenos drimanos
Poligodial, 1-β-O-p-metoxi-E-cinamil-isodrimeninol, 1-β-O-p-metoxi-E-cinamil-
5α-hidroxi-isodrimeninol, 1-β-(p-metoxicinamil)-poligodial, drimanial e 1-β-(p-
cumaroiloxi)-poligodial, e o que está em fase de identificação o DBK-17. ........87
Figura 33: Espectro de RMN 1H (300 MHz, CDCl3/TMS) do DBI-11. ......................89
Figura 34: Espectro de RMN 13C (75 MHz, CDCl3/TMS) do DBI-11........................89
Figura 35: Espectro de DEPT 135 (75 MHz, CDCl 3/TMS) do DBI-11......................90
Figura 36: Rota biossintética provável do poligodial (Adaptado de: JANSEN e
GROOT, 2004). .................................................................................................92
Figura 37: Espectro de RMN ¹H (300 MHz, CDCl 3/TMS) do DBK-17. .....................93
Figura 37: Espectro de RMN ¹H (300 MHz, CDCl 3/TMS) do DBP-44. .....................94
Figura 38: Espectro de RMN ¹3C (75 MHz, CDCl3/TMS) do DBP-44. .....................94
Figura 39: Espectro de DEPT 135 (75 MHz, CDCl 3/TMS) do DBP-44. ...................95
Figura 40: Rota biossintética provável do 1-β-(p-metoxicinamil)-poligodial
(Adaptado de: JANSEN e GROOT, 2004).........................................................96
Figura 41: Espectro de RMN ¹H (300 MHz, CDCl 3/TMS) do DBP-11. .....................98
Figura 42: Espectro de RMN 13C (75 MHz, CDCl3/TMS) do DBP-11. .....................98
Figura 43: Espectro de DEPT 135 (75 MHz, CDCl 3/TMS) do DBP-11. ...................99
Figura 43: Rota biossintética provável do 1-β-O-p-metoxi-E-cinamil-isodrimeninol.
(Adaptado de: JANSEN e GROOT, 2004).........................................................99
Figura 44: Espectro de RMN ¹H (300 MHz, CDCl 3/TMS) do DBV-25. ................... 101
Figura 45: Espectro de RMN ¹3C (75 MHz, CDCl3/TMS) do DBV-25. ................... 102
Figura 46: Espectro de DEPT 135 (75 MHz, CDCl 3/TMS) do DBV-25. ................. 102
Figura 47: Rota biossintética provável do drimanial. (Adaptado de: JANSEN e
GROOT, 2004). ............................................................................................... 103
Figura 48: Espectro de RMN ¹H (300 MHz, CDCl3/TMS) do DBP-21. ................... 105
Figura 49: Espectro de RMN ¹3C (75 MHz, CDCl3/TMS) do DBP-21. ................... 106
Figura 50: Espectro de DEPT 135 (75 MHz, CDCl3/TMS) do DBP-21. ................. 106
Figura 51: Rota biossintética provável do 1-β-O-p-metoxi-E-cinamil-5α-hidroxi-
isodrimeninol. (Adaptado de: JANSEN e GROOT, 2004; ALOUCHE, et al.,
2009). .............................................................................................................. 108
Figura 52: Espectro de RMN ¹H (300 MHz, CDCl3/TMS) do DBV-50. ................... 109
Figura 53: Espectro de RMN 13C (75 MHz, CDCl3/TMS) do DBV-50. ................... 109
Figura 54: Espectro de DEPT 135 (75 MHz, CDCl3/TMS) do DBV-50. ................. 110
Figura 55: Rota biossintética provável do 1-β-(p-cumaroiloxi)-poligodial (Adaptado
de: JANSEN e GROOT, 2004). ....................................................................... 111
Figura 56: Biossíntese do pirofosfato de dimetilalila a partir do precursor ácido
mevalônico (Adaptado de: GEISSMAN; CROUT, 1969; MAGRI, 1999).......... 113
Figura 57: Biossíntese dos sesquiterpenos pela formação do núcleo germacreno
(Adaptado de: GEISSMAN; CROUT, 1969; MAGRI, 1999)............................. 113
Figura 58: Rearranjo drimano do precursor germacreno (Adaptado de: JANSEN e
GROOT, 1991). ............................................................................................... 114
LISTA DE TABELAS
AA – Ácido Araquidônico.
AcOEt – Acetato de Etila.
ACP – Proteína Carreadora de Acila.
AITC – Alil Isotiocianato.
ALA – Ácido Alfa-Linolênico.
AO – Ácido Oléico.
AS – Anisaldeído Sulfúrico.
ATP – Trifosfato de Adenosina.
ATPase – Enzima que hidrolisa o ATP.
α-TOH – α-Tocoferol.
BCRJ – Banco de Células da Universidade Federal do Rio de Janeiro.
BK – Bradicinina.
B16F10 – Melanoma Murino.
CC – Cromatografia em Coluna.
CCD – Cromatografia em Camada Delgada.
CCDP – Cromatografia em Camada Delgada Preparativa.
CF – Cromatografia Flash.
CG – Cromatografia Gasosa.
CGAR – Cromatografia Gasosa de Alta Resolução.
CG/MS – Cromatografia Gasosa Acoplada a Espectroscopia de Massas.
CHO – Célula Ovariana de Hamster.
CIM – Concentração Inibitória Mínima.
CIPOI – Centro Integrado de Pesquisa Oncológica da Infância.
CI50 – Concentração citotóxica ou inibitória da viabilidade em 50% das células.
CLAE – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência.
CLC – Cromatografia Líquida Clássica.
δ – Deslocamento Químico.
DBF-1 – Drimys brasiliensis Coluna F (coluna do extrato bruto) fração 9-21)
identificada como Glicerídeo.
DBI-11 – Drimys brasiliensis Coluna I (junção da coluna 4-8 da coluna G (26-30)
fração 11-18) identificada como Poligodial.
13
PLC – Fosfolipase C.
PPI – Fosfatidil Inositídeo.
PS – Fosfatidilserina.
PTX – Toxina Pertussis.
q – Quarteto.
Rf – Fator de Retenção.
RMN – Ressonância Magnética Nuclear.
RMN de 1H – Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio.
RMN de 13C – Ressonância Magnética Nuclear de Carbono Treze.
ROS – Espécies Reativas de Oxigênio.
RPMI – Instituto Roswell Park Memorial.
s – Simpleto.
sl – Simpleto Largo.
SFB – Soro Fetal Bovino.
SH-SY5Y – Células de Neuroblastoma Humano.
SM – Síndrome Mielodisplásica.
SP – Substância P.
t – Tripleto.
TMS – Tetrametilsilano.
TRPA1 – Receptores Potenciais Vanilóides Transitórios 1.
TRPV1 – Receptores Potenciais Vanilóides 1.
Фi – Diâmetro Interno.
%Inh. – Percentual de Inibição.
53 RP75 – Leishmania donovani.
16
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .....................................................................................................18
2 OBJETIVOS .........................................................................................................20
2.1 Objetivo geral: ........................................................................................ 20
2.2 Objetivos específicos:........................................................................... 20
3 REVISÃO DA LITERATURA ...............................................................................21
3.1 Aspectos gerais sobre plantas medicinais ......................................... 21
3.2 Aspectos gerais sobre neoplasias....................................................... 23
3.3 Aspectos sobre doenças parasitárias ................................................. 29
3.3.1 Leishmaniose................................................................................................29
3.3.2 Malária ...........................................................................................................32
3.4 Aspectos botânicos do gênero Drimys ............................................... 34
3.5 Aspectos químicos e farmacológicos do gênero Drimys ................. 36
3.6 Técnicas de fracionamento, isolamento e identificação de produtos
naturais ......................................................................................................... 45
4 MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................................48
4.1 Coleta do material vegetal .................................................................... 48
4.2 Materiais e reagentes ............................................................................ 48
4.3 Equipamentos ........................................................................................ 49
4.4 Obtenção dos extratos de D. brasiliensis ........................................... 49
4.5 Fracionamento do extrato CHCl3 das cascas de D. brasiliensis ...... 50
4.6 Atividade biológica ................................................................................ 53
4.6.1 Avaliação da citotoxicidade ........................................................................53
4.6.2 Avaliação da atividade leishmanicida ........................................................54
4.6.3 Avaliação da atividade plasmodicida .........................................................55
4.7 Análise estatística ................................................................................. 56
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...........................................................................57
5.1 Extração .................................................................................................. 57
5.2 Fracionamento do extrato CHCl 3 das cascas de Drimys brasiliensis58
5.3 Identificação das substâncias isoladas de D. brasiliensis ................ 59
17
1 INTRODUÇÃO
2 OBJETIVOS
3 REVISÃO DA LITERATURA
O O
O OH O O OH
O NH O O NH O
H H
O O O O
H H
OH HO O O OH HO O O
O O O O
O N O O
N N
O
N N
HO HO
O O
O O
O
HO HO
OH O
O O
O O
O O
O O
N OH
H
N N
H
H3CO2C
OH
MeO N H OCOCH 3
R CO 2CH 3
estes dados o risco estimado foi de 56 novos casos a cada 100 mil homens e de 61
para cada 100 mil mulheres (INCA, 2010).
O câncer de pele conhecido como Melanoma Murino (B16F10) é a forma
mais agressiva de câncer de pele e que se expande mais rapidamente em termos
de incidência mundial. O melanoma é um tumor de origem neuroectodérmica
resultante da transformação dos melanócitos epidérmicos. Estes por sua vez, são
células encontradas ao longo da camada basal da epiderme cuja principal função é
a produção do pigmento melanina, importante para fotoproteção natural (DE VITA;
HELLMANN; ROSENBERG, 2005).
Apesar de o melanoma cutâneo representar apenas 4% de todos os tipos de
câncer de pele, este possui um grande potencial de metastatização, mesmo no
início de sua manifestação, razão pela qual se constitui numa das neoplasias mais
agressivas dentre as lesões cutâneas oriundas de processo tumoral, com elevado
índice de mortalidade, principalmente em casos de detecção tardia (INCA, 2010).
A Organização Mundial de Saúde (OMS) estima que anualmente ocorram
cerca de 132 mil novos casos deste câncer no mundo. Este aumento vem se
tornando expressivo nos últimos 40 anos, em principalmente, populações de pele
clara que apresentam uma maior susceptibilidade a este tipo de tumor. Quando
detectado no início é potencialmente curável, embora dados mostrem que quando
detectado tardiamente apresente letalidade elevada. A média mundial de sobrevida
é de 69% (WHO, 2008). Geralmente este tipo de tumor apresenta duas fases
distintas; na primeira a lesão se apresenta como um crescimento radial, plana e
pequena, e seu comportamento é bem menos agressivo. Na segunda fase, o
crescimento da lesão passa ser vertical, onde as células malignas se localizam
mais internamente na derme reticular podendo, inclusive invadir a camada de
tecido subcutâneo, apresentando um processo lesivo mais grave. Sua
agressividade é proporcional à sua capacidade de se infiltrar na derme na transição
de crescimento radial para crescimento vertical (ANGER, 2008).
A leucemia se caracteriza por uma proliferação neoplásica generalizada ou
acúmulo de células hematopoiéticas, com ou sem envolvimento periférico. Na
maioria dos casos, as células leucêmicas extravasam para o sangue, onde podem
ser vistas em grande número, podendo infiltrar-se no fígado, baço, linfonodos e
outros tecidos. A leucemia pode ser classificada de acordo com o grau de
27
Figura 1: Gênese das células sanguíneas e linfócitos. (Adaptado de: INCA, 2010).
29
3.3.1 Leishmaniose
conhecimento ainda limitado sobre alguns aspectos, o que a torna de difícil controle
(BRASIL, 2007).
A LTA é uma doença infecciosa, não contagiosa, causada por diferentes
espécies de protozoários do gênero Leishmania, que acomete pele e mucosas.
Primariamente é uma doença de infecção zoonótica, afetando outros animais, e
posteriormente vindo a afetar o ser humano. A Leishmania é um protozoário
pertencente à família Trypanosomatidae, sendo um parasita obrigatório das células
fagocíticas mononuclear, com duas formas principais: uma flagelada ou
promastigota (figura 2 A), encontrada no tubo digestivo do inseto vetor, e outra
aflagelada ou amastigota (figura 2 B), observada nos tecidos dos hospedeiros
vertebrados (BRASIL, 2007).
varia em média de dois a três meses, podendo variar de duas semanas a dois anos
(BRASIL, 2007).
OH
OH
H O OH
HO O OH OH OH OH O O
H
OH
H
O O H
HO OH
NH2
Anfotericina B (10)
O O
H2N NH2
NH NH
Pentamidina (11)
3.3.2 Malária
H
H
N O
HO
H O
O
H3CO HO H
N O
CF 3
Cl N N CF 3
H
HN N
N HO
CHO O CHO
CHO CHO
MeO
OH OH
OH OH
HO O HO O
OH ORamnose
OH O OH O
Taxifolina (18) Astilbina (19)
O CHO
CHO
MeO
OH
Drimanial (20)
H H H
O CHO
CHO
HO
1-β-(p-cumaroiloxi)-poligodial (24)
Num estudo mais recente realizado por Silva (2009), foi avaliada a ação
citotóxica dos extratos clorofórmicos das cascas, caules e folhas da D. brasiliensis
e os sesquiterpenos drimanos drimanial (20) e 1-β-(p-metoxicinamil)-poligodial (17),
isolados do extrato clorofórmico das cascas, em células tumorais Hela
(Adenocarcinoma Epitelial de Cérvix Humano) e não tumorogênica L929
(Fibroblasto Murino). Os resultados obtidos mostram que os extratos clorofórmicos
das folhas e do caule não apresentam elevado grau de citotoxicidade nos modelos
avaliados. O extrato clorofórmico das cascas apresentou um efeito tóxico em
células não tumorogênicas de fibroblasto L929 somente em altas concentrações
como a de 100,0 µg/mL com CI50 > 100,0 µg/mL sugerindo baixa citotoxicidade nos
tempos de 24 e 48 horas de incubação. Nas células tumorais Hela observou-se um
aumento na potência citotóxica com CI 50 de 61,2 e 18,0 µg/mL para os tempos de
24 e 48 horas, respectivamente. O drimanial (20) apresentou grau de citotoxicidade
em células L929 com IC50 26,4 µg/mL e Hela 10,0 µg/mL para 24 horas de
incubação. Houve um aumento na potência citotóxica com o tempo de 48 horas de
incubação para células L929 e Hela com CI 50 de 16,7 e 8,8 µg/mL,
respectivamente. O 1-β-(p-metoxicinamil)-poligodial (17) apresentou citotoxicidade
em células L929 e Hela após 48 horas de contato com CI 50 de 10,1 e 7,7 µg/mL,
respectivamente, sugerindo um potencial citotóxico para ambos os drimanos
avaliados.
CHO
CHO
CHO
CHO H
OH HO
O CHO
CHO
OH
H H H
OH
O
4 MATERIAL E MÉTODOS
O perfil cromatográfico por CCD dos extratos e substâncias puras obtidas foi
realizado utilizando-se placas de sílica gel 60 GF 254, de 20 µm de espessura
preparada sobre folhas de alumínio da Merck. Diferentes sistemas de eluentes
foram utilizados dependendo da polaridade das amostras. Após a eluição as
cromatoplacas foram visualizadas sob luz ultravioleta antes da revelação destrutiva
da amostra. Como revelador na CCD foi utilizado o anisaldeído sulfúrico (AS)
(identificação de terpenos e esteróides). As cromatoplacas foram vaporizadas com
AS e, em seguida, aquecidas à temperatura de 105°C.
Nos procedimentos de cromatografia em coluna, foi utilizada como fase
estacionária, sílica gel 60 (Merck) de granulometria 70-230 mesh ( = 0,063 – 0,20
mm). O diâmetro e altura das colunas foram selecionados de acordo com a
quantidade do material a ser cromatografado. A eluição foi realizada com solventes
orgânicos em ordem crescente de polaridade. Os solventes utilizados foram
hexano (Hex), acetato de etila (AcOEt) e metanol (CH 3OH) provenientes dos
Laboratórios Dinâmica, Quimex ou Vetec. As frações coletadas foram reunidas
conforme as semelhanças de fator de retenção (Rf) identificadas na CCD.
Para análise de RMN de 1H e RMN de 13
C foram utilizados solventes
deuterados (acetona, clorofórmio e metanol), provenientes da Cambridge Isotope
Laboratories Inc.
49
4.3 Equipamentos
Figura 6: Fluxograma dos procedimentos cromatográficos do extrato clorofórmico das cascas de D. brasiliensis.
53
N N N NH
+
N N N N
N N
- S S
Br
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Extração
Os extratos brutos das cascas, caules e folhas foram avaliados por CCD para
a verificação dos seus respectivos perfis cromatográficos. Foi observado que o perfil
cromatográfico dos extratos eram bem distintos entre si. Com base em estudos
anteriores utilizando o extrato das cascas, foi detectada a presença dos
sesquiterpenos drimanos, a principal classe de interesse, devido aos efeitos
farmacológicos promissores (MORTON, 1981; SIMÕES, et al., 1986; CECHINEL
FILHO, et al., 1998; MENDES, et al., 1998; CUNHA, et al., 2001; MALHEIROS,
2001; ANDRÉ, et al., 2004; JANSEN e GROOT, 2004; MALHEIROS, et al., 2005).
Neste aspecto, o extrato CHCl3 das cascas foi o selecionado para os processos
cromatográficos. Este então foi submetido a sucessivas colunas cromatográficas, e
as substâncias puras foram analisadas em RMN 1H e RMN 13C.
Para um melhor entendimento nos processos cromatográficos realizados,
optou-se apresentar um breve resumo das colunas, bem como as substâncias
isoladas, separando-as apenas por diferença de polaridade e classe estrutural.
Nas figuras 8, 15, 23 e 32 nas páginas 61, 68, 77 e 87, respectivamente,
estão demonstrados os procedimentos cromatográficos que foram realizados para o
isolamento das moléculas bioativas pertencentes a diferentes classes de metabólitos
secundários.
59
HO
H
H H
Espatulenol (33)
O
H2 O
Me
O n n
H O R
Me
COOH O
H2 O R
n n
Ácido graxo Insaturado (34) Glicerídeo (35)
O O
O O
HH
O O
11
15 CHO 12
1 9 CHO
2 10 8
3 5 7
4 6
H
13 14
Poligodial (16)
H O H O
HO HO
O O O O
H H
MeO MeO
5
OH
1-β-O-p-metoxi-E-cinamil- 1-β-O-p-metoxi-E-cinamil-5α-
isodrimeninol (39) hidroxi-isodrimeninol (40)
61
O O
O CHO O CHO
CHO CHO
MeO MeO
OH
1-β-(p-metoxicinamil)-poligodial (17) Drimanial (20)
O CHO
CHO
HO
1-β-(p-cumaroiloxi)-poligodial (24)
14
2 H
3 10 9
1
HO 4 5 8
6
15 H 7
H H
11
13 12
14
H
a) 3
2
10 9
1
HO 4 5 8
6
15 H 7
H H
11
13 12
b)
c)
Figura 10: Ampliações do espectro de RMN ¹H (300 MHz, CDCl 3/TMS) do DBJ-70:
a) de 7,5 a 3,5 ppm; b) de 2,5 a 1,5 ppm; c) de 1,4 a 0,4 ppm.
65
14
2 H
3 10 9
1
HO 4 5 8
6
15 H 7
H H
11
13 12
2 H
3 10 9
1
HO 4 5 8
DBJ-70 Espatulenol* DBJ-70 Espatulenol*
H (ppm) mult. J (Hz) H (ppm) mult. J (Hz) C / DEPT C / DEPT
6
1 1 13 13
H 7
H H
11
13 12
Posição
1 2,42, dd, (J= 14,1; 6,6) 2,39, dd, (J= 14,1; 6,3) 53,4 / CH 53,4 / CH
2 26,7 / CH2 26,7 / CH2
3 41,7 / CH2 41,8 / CH2
4 81,1 / C 81,0 / C
5 54,3 / CH 54,4 / CH
6 0,46, dd, (J = 11,3; 9,6) 0,46, dd, (J = 11,2; 9,5) 29,9 / CH 29,9 / CH
7 0,70, m 0,72, ddd, (J = 11,2; 9,5; 27,5 / CH 27,5 / CH
6,1)
8 24,8 / CH2 24,8 / CH2
9 38,9 / CH2 38,9 / CH2
10 153,5 / C 153,5 / C
11 20,3 / C 20,3 / C
12 1,25, s 1,25, s 28,7 / CH3 28,7 / CH3
13 1,28, s 1,28, s 16,3 / CH3 16,3 / CH3
14 4,69 / 4,68, d, (J = 7,2) 4,69 / 4,66, s 106,3 / CH2 106,3 / CH2
15 1,05, d, (J = 5,1) 1,06, s 26,1 / CH3 26,1 / CH3
Solvente CDCl3 CDCl3 CDCl3 CDCl3
300 MHz 200 MHz 75 MHz 50 MHz
*(LAGO; ROQUE, 2009).
Grupo
+ Germacrano
14
Grupo
E +
Humulano
7 5
8 6 4
9 3
10
13
2 E
11 1
12 15 OPP
Grupo
+
Cariofilano
Grupo
+
E
Cadinano
Z
OPP
+
Grupo
Bisabolano
+
+ Grupo
Carotano
OPP
Grupo
Drimano
Figura 13: Esquema para obtenção dos principais grupos de sesquiterpenos gerados
a partir do precursor farnesil pirofosfato (Adaptado de: DEWICK, 2009).
H OH H
H
H H H
OH
Germacreno-D Biciclogermacreno Macrocarp-11(15)-en-8-ol
HO
H
H H
Espatulenol
Me
COOH
n n
1
Figura 16: Ampliação do espectro de RMN de H do DBJ-100 (300 MHz,
CDCl3/TMS) de 5,5 até 0,5 ppm.
71
Me
COOH
n n
13
No espectro de C e DEPT 135 (Figura 19 e 20), observam-se os sinais dos
carbonos metílicos em δC 14,1; os carbonos metilênicos entre δC 22,7 e 34,1. Entre
δC 60,0 e 70,0 encontram-se os sinais característicos do glicerol. Os sinais dos
carbonos das carboxilas aparecem entre δC 174,0 e 179,0.
Tanto na família Winteraceae quanto no gênero Drimys não são relatados os
glicerídeos.
a)
O
H2 O
Me
O n n
H O R
O
H2 O R
b)
c)
O
H2 O
Me
O n n
H O R
O
H2 O R
Figura 19: a) Expansão do espectro de RMN 13C (75 MHz, CDCl3/TMS) do DBF-1 de
120 a 14 ppm.
O O
CoA S ACP
Acetil-CoA Acetil-ACP
+
O O O O O
ATP
- -
CoA O CoA O S ACP
CO2
Acetil-CoA Malonil-CoA Malonil-ACP
O O CO2
S ACP
Acetoacetil-ACP
NADPH
H O
S ACP
OH
-3 hidroxibutiril-ACP
H2 O
H O
S ACP
H
Crotonil-ACP
NADPH
S ACP
Butiril-ACP
6 Ciclos
Palmitoil-ACP
Ácido Palmítico
Figura 21: Biossíntese dos lipídeos através do precursor acetil CoA (Adaptado de:
HORNSTRA, 2002; LENINGER; NELSON; COX, 2002).
C-3 do acetoacetil-ACP num grupo metileno que produz butiril-ACP, que completa o
primeiro ciclo de alongamento. Os ciclos de alongamento continuam até formar o
palmitoil-ACP. Este intermediário não é o substrato para a enzima condensadora,
por isso ele é hidrolisado para produzir o ácido palmítico e ACP. O ácido palmítico é
o precursor dos ácidos graxos saturados e insaturados de cadeia mais longa,
através de elongases e dessaturases. Esta ocorre pela inserção de sucessivas
moléculas de malonil-CoA com acil-CoA. As reações são seguidas por reduções
associadas ao Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Phosfato (NADPH) (VANZUELA;
NIETO, 2001; 2003; GONZÁLES, 2002).
Os ácidos graxos na sua grande maioria são os constituintes estruturais das
membranas celulares, cumprindo com as funções energéticas de reservas
metabólicas. Vários estudos apontam que sua utilização traz benefícios para a
saúde humana, prevenindo enfermidades cardiovasculares, câncer de cólon,
doenças imunológicas e favorecendo o desenvolvimento cerebral e da retina.
(VALENZUELA; NIETO, 2001; 2003; GONZÁLES, 2002; HORNSTRA, 2002; SILVA,
et al., 2007). O ω-6 e o ω-3 (Figura 22) são considerados precursores dos ácidos
graxos poliinsaturados de cadeia longa: ácido araquidônico, ácido
eicosapentaenóico, e ácido docosahexaenóico (HORNSTRA, 2002). O ácido
araquidônico (série ω-6) tem grande importância nos primeiros meses de vida,
sendo constituinte de estruturas celulares e precursores de mediadores inflamatórios
(GONZÁLES, 2002). Como agentes terapêuticos, utilizam-se essas substâncias que,
por estarem frequentemente deficientes na dieta, podem atuar em diversos
desequilíbrios metabólicos.
Figura 22: Representação estrutural dos ácidos graxos ω-6 e ω-3 (Adaptado de:
HORNSTRA, 2002; LENINGER; NELSON; COX, 2002).
77
10 10'
O O
O 4 4' O
3 5 5' 3'
2 2'
6 6'
1 1'
7
HH 7'
8 8'
9 9'
O O
10 10'
O O
O 4 4' O
3 5 5' 3'
2 2'
6 6'
1 1'
7
HH 7'
8 8'
9 9'
O O
Figura 27: Biossíntese dos lignóides (Adaptado de: SIMÕES, et al., 2004).
O O O
-
OH Me
OH OH OH
HO HO HO
OH OMe
Ácido p-hidroxicinâmico Ácido Caféico Ácido Ferúlico
SCoA-
O
-
H+ OSCoA
OH OH S
CoA
O HO HO
O O OMe
Ácido Coniferílico Feriloil-CoA
O O O O O O
O O O O O O
+ H+
OH HO -
HO HO
HO HO
O O
O O
HH
O O
Hinoquinina
O
O 4
3 5
2
6
1
O
O 4
3 5
2
6
1
Figura 32: Fluxograma dos procedimentos cromatográficos do extrato clorofórmico de D. brasiliensis mostrando o isolamento dos
sesquiterpenos drimanos Poligodial, 1-β-O-p-metoxi-E-cinamil-isodrimeninol, 1-β-O-p-metoxi-E-cinamil-5α-hidroxi-isodrimeninol, 1-
β-(p-metoxicinamil)-poligodial, drimanial e 1-β-(p-cumaroiloxi)-poligodial, e o que está em fase de identificação o DBK-17.
88
11
15 CHO
12
1 9 CHO
2 10 8
3 5 7
4 6
H
14 13
11
15 CHO
12
1 9 CHO
2 10 8
3 5 7
4 6
H
14 13
Posição
1 39,5 / CH2 39,8 / t
2 18,0 / CH2 18,0 / t
3 41,7 / CH2 42,0 / t
4 33,1 / C 33,0 / s
5 1,49, m 48,9 / CH 49,0 / d
6 2,48; 2.36, m 25,2 / CH2 25,3 / t
7 7,13, m 7,15, m 154,3 / CH2 152,2 / d
8 138,3 / C 138,0 / d
9 2,83, sl 2,85, m 60,3 / CH 60,0 / d
10 36,8 / C 37,0 / s
11 9,54, d, (J= 4,5) 9,55, d, (J= 4,4) 202,0 / CH 202,0 / d
12 9,46, s 9,45, s 193,2 / CH 194,0 / d
13 0,92, s 0,8, s 33,1 / CH3 33,0 / q
14 0,94, s 0,9, s 21,9 / CH3 22,0 / q
15 0,96, s 1,0, s 15,2 / CH3 15,0 / q
Solvente CDCl3 CDCl3 CDCl3 CDCl3
300 MHz 200 MHz 75 MHz 50 MHz
*(MALHEIROS, 2001).
CHO CHO
+H2O +H2O CHO
H
Poligodial
1
15 R11CHO
12
1 9 CHO
2 10 8
3 5 7
4 6
H 2
14 13 R
três simpletos em δH 1,06, 1,00 e 0,96 e δC 32,4, 22,0 e 10,4 indicam os três grupos
metilas. Em δH 3,83 encontra-se um simpleto referente ao grupo oximetínico. As
comparações com a literatura estão dispostas na tabela 5.
O
5' 3'
11
6' 1'
4' 2' O 15 CHO
12
7'
9'
1 9 CHO
MeO 8' 2 10 8
3 5 7
4 6
14 13
O
5' 3'
11
6' 1'
4' 2' O 15 CHO
12
7'
9'
1 9 CHO
MeO 8' 2 10 8
3 5 7
4 6
14 13
O O O
-CH3 H+
OH OH -
OH
HO MeO MeO
p-hidroxicinâmico p-metoxicinâmico p-metoxicinamil
O +
O CHO CHO
CHO CHO
MeO
1--(p-metoxicinamil)-poligodial Poligodial
7'
4' 2'
1'
O 15 CHO
12 1-β-(p- 1-β-(p-
9' CHO
MeO 8' 2
1
10
9
8 DBP-44 metoxicinamil)- DBP-44 metoxicinamil)-
H (ppm) C / DEPT
3 5 7 1 13
4 6
poligodial* poligodial*
H (ppm) mult. J C / DEPT
1 13
14 13
mult. J (Hz)
Posição (Hz)
1 4,85, m 4,90, dd, (J= 11,0; 4,0) 81,3 / CH 81,4 / CH
2 1,90; 1,70, m 1,90; 1,70, m 24,4 / CH2 24,5 / CH2
3 1,55, m 1,58, m 39,1 / CH2 39,2 / CH2
4 32,6 / C 32,7 / C
5 1,39, dd, (J = 10,5; 1,40, dd, (J= 10,0; 6,2) 48,7 / CH 48,8 / CH
6,5)
6 2,45, m 2,45, m 24,0 / CH2 24,1 / CH2
7 7,07, sl 7,08, sl 152,0 / CH 152,0 / CH
8 140,2 / C 140,3 / C
9 3,32, sl 3,32, sl 59,1 / CH 59,2 / CH
10 42,2 / C 42,3 / C
11 9,80, d, (J = 2,7) 9,79, d, (J = 3,0) 200,4 / CH 200,5 / CH
12 9,32, s 9,33, s 192,3 / CH 192,3 / CH
13 1,06, s 1,06, s 32,5 / CH3 32,6 / CH3
14 1,00, s 1,01, s 22,0 / CH3 22,2 / CH3
15 0,96, s 0,96, s 10,5 / CH3 10,6 / CH3
1’ 166,3 / C 166,4 / C
2’ 6,29, d, (J = 16,0) 6,26, d, (J = 16,0) 115,1 / CH 115,2 / CH
3’ 7,58, d, (J = 16,0) 7,54, d, (J = 16,0) 145,3 / CH 145,3 / CH
4’ 126,8 / C 126,9 / C
5’, 9’ 7,47, d, (J = 8,7) 7,47, d, (J = 8,9) 129,9 / CH 130,0 / CH
6’, 8’ 6,91, d, (J = 8,7) 6,90, d, (J = 8,9) 114,2 / CH 114,3 / CH
7’ 161,4 / C 161,5 / C
OMe 3,83, s 3,83, s 55,2 / CH3 55,4 / CH3
Solvente CDCl3 CDCl3 CDCl3 CDCl3
300 MHz 200 MHz 75 MHz 50 MHz
*(MALHEIROS, 2001).
97
O
5' 3' HO 11
6'
4' 2'
1'
O 15 O
7' 12
9' 9
1
MeO 8' 2 10 8
3 5 7
4 6
14 13
O
5' 3' HO 11
6'
4' 2'
1'
O 15 O
7' 12
9' 9
1
MeO 8' 2 10 8
3 5 7
4 6
14 13
1--(p-metoxicinamil)-poligodial
O O
HO HO
O O O + -
OH
+
MeO MeO H
1--O-p-metoxi-E-cinamil-isodrimeninol
4'
3'
2'
1'
O
HO
15
11
O
1-β-(p- cinamil-6α-hidroxi- metoxi metoxi-E-
DBP-11 metoxicinamil)- isodrimeninol** DBP-11 cinamil)- cinamil-6α-
7' 12
9' 9
1
MeO 8' 2 10 8
3 5 7
anteriormente por Malheiros (2001). A substância possui sinais que podem ser
atribuídos a dois grupos aldeídos em δH 9,84 (d, J = 2,7), δC 201,4 e δH 9,35 (s), δC
192,2. Os hidrogênios aromáticos e oleifínicos estão entre δH 6,00 a 8,00 e δC 115,0 a
170,0. Os três simpletos em δH 1,23, 1,03 e 0,96 e δC 25,0, 27,2 e 13,6 indicam os
três grupos metilas. Em 3,83 ppm encontra-se um simpleto referente ao grupo
oximetínico. A principal diferença estrutural entre o drimanial e o 1-β-(p-
metoxicinamil)-poligodial é a presença da hidroxila adicional no C-5. Esta pode ser
observada pelo aparecimento do sinal em δ C 77,2.
O
5' 3'
11
6' 1'
4' 2'
O 15 CHO
12
7'
9'
1 9 CHO
MeO 8' 2 10 8
3 5 7
4 6
OH
14 13
O
5' 3'
11
6' 1'
4' 2'
O 15 CHO
12
7'
9'
1 9 CHO
MeO 8' 2 10 8
3 5 7
4 6
OH
14 13
O CHO O CHO
CHO OH- CHO
MeO MeO
OH
1--(p-metoxicinamil)-poligodial Drimanial
OH
14 13
J (Hz) (Hz)
Posição
1 5,30, m 5,49, dd, (J= 10,9, 4,0) 77,0 / CH 77,1 / CH
2 1,80; 1,70, m 24,0 / CH2 24,0 / CH2
3 2,04, m 1,90, m 34,4 / CH2 34,4 / CH2
4 38,0 / C 38,1 / C
5 78,1 / C 78,1 / C
6 2,80, 2,40, m 32,1 / CH2 32,1 / CH2
7 6,88, q 6,88 148,2 / CH 148,2 / CH
8 141,3 / C 141,3 / C
9 3,83, q 3,84 77,0 / CH 77,1 / CH
10 46,6 / C 46,6 / C
11 9,84, d, (J= 2,7) 9,84, d, (J= 2,5) 201,4 / CH 201,4 / CH
12 9,35, s 9,36, s 192,2 / CH 192,2 / CH
13 1,03, s 1,03, s 27,2 / CH3 27,2 / CH3
14 1,23, s 1,14, s 25,0 / CH3 24,1 / CH3
15 0,96, s 0,98, s 13,6 / CH3 13,6 / CH3
1’ 166,4 / C 166,4 / C
2’ 6,27, d, (J= 16,0) 6,24, d, (J= 16,0) 115,2 / CH 115,7 / CH
3’ 7,63, d, (J= 16,0) 7,60, d, (J= 16,0) 145,4 / CH 145,4 / CH
4’ 126,9 / C 126,9 / C
5’, 9’ 7,49, d, (J= 8,7) 7,48, d, (J= 8,7) 130,0 / CH 129,9 / CH
6’, 8’ 6,91, d, (J= 8,7) 6,89, d, (J= 8,7) 114,3 / CH 114,2 / CH
7’ 161,5 / C 161,5 / C
OMe 3,83, s 3,84, s 55,3 / CH3 55,3 / CH3
OH 3,83 3,84
Solvente CDCl3 CDCl3 CDCl3 CDCl3
300 MHz 200 MHz 75 MHz 50 MHz
*(MALHEIROS, 2001).
104
O
5' 3' HO 11
6'
4' 2'
1'
O 15 O
7' 12
9' 9
1
MeO 8' 2 10 8
3 5 7
4 6
OH
14 13
O
5' 3' HO 11
6'
4' 2'
1'
O 15 O
7' 12
9' 9
1
MeO 8' 2 10 8
3 5 7
4 6
OH
14 13
4'
3'
2'
1'
O
HO
15
11
O DBP-21 Drimanial* cinamil-6α-hidroxi- DBP-21 Drimanial* E-cinamil-6α-
H (ppm) mult. H (ppm) mult. C / C/
1 1 13 13
isodrimeninol** hidroxi-iso
7' 12
9' 9
1
MeO 8' 2 10 8
3 5 7
H (ppm) mult. J
4 6
1
14 13
OH
J (Hz) J (Hz) DEPT DEPT Drimeninol**
Posição (Hz) 13
C / DEPT
1 4,84,dd (J= 13,8; 5,49, dd, (J= 10,9; 4,83, dd (J= 11,4,2) 81,0 / CH 77,1 / CH 80,3 / CH
4,5) 4,0)
2 1,67 / 1,82, m 1,80; 1,70, m 1,69 / 1,86, m 24,6 / CH2 24,0 / CH2 24,6 / CH2
3 1,47; 1,67, m 1,90, m 1,45 / 1,62, m 39,5 / CH2 34,4 / CH2 40,6 / CH2
4 32,6 / C 31,1/ C 33,2 / C
5 83,6 / C 78,1 / CH 57,7 / C
6 4,31, m 2,80 / 2,40, m 4,40, dd (J= 8,7) 67,2 / CH2 32,1 / CH2 68,2 / CH2
7 6,87, m 6,88, 5,61, m 148,8 / CH 148,2 / CH 120,0 / CH
8 134,2 / C 141,3 / C 139,9 / C
9 3,82, sl 3,84, 2,46, sl 55,2 / CH 55,1 / CH 60,2 / CH
10 48,8 / C 46,6 / C 42,0 / C
11 5,80, m 9,34, d, (J= 2,5) 5,57, m 106,1 / CH 201,4 / CH 99,6 / CH
12 4,81, s 9,36, s 4,46 / 4,20, d (J= 71,7 / CH 192,2 / CH 68,1 / CH2
11,8)
13 1,21, s 1,03, s 1,19, s 32,2 / CH3 27,2 / CH3 35,2 / CH3
14 1,15, s 1,14, s 1,12, s 24,4 / CH3 24,1 / CH3 22,3 / CH3
15 0,98, s 0,96, s 1,06, s 9,4 / CH3 13,6 / CH3 10,8 / CH3
1’ 166,5 / C 166,4 / C 166,4 / C
2’ 6,40, d, (J= 15,9) 6,24, d, (J= 16,0) 6,30, d (J= 15,9) 117,4 / CH 115,7 / CH 115,9 / CH
3’ 7,59, d, (J= 16,0) 7,60, d, (J= 16,0) 7,62, d (J= 15,9) 143,2 / CH 145,4 / CH 144,1 / CH
4’ 132,2 / C 126,9 / C 127,0 / C
5’, 9’ 7,48, d, (J= 8,4) 7,48, d, (J= 8,7) 7,48, d (J= 8,6) 129,5 / CH 129,9 / CH 129,7 / CH
6’, 8’ 6,89, d, (J= 8,4) 6,89, d, (J= 8,7) 6,92, d (J= 8,6) 114,1 / CH 114,2 / CH 114,3 / CH
7’ 161,0 / C 161,5 / C 161,4 / C
OMe 3,83, s 3,84, s 3,85, s 55,2 / CH3 55,3 / CH3 55,3 / CH3
5-OH 3,82, 3,84,
6-OH 1,97, m
11-OH 4,62, m 2,63, m
Solvente CDCl3 CDCl3 CDCl3 CDCl3 CDCl3 CDCl3
300 MHz 200 MHz 600 MHz 75 MHz 50 MHz 150 MHz
*(MALHEIROS, 2001; **ALOUCHE, et al., 2009).
O O
HO HO
O O O O
OH-
MeO MeO
OH
1--O-p-metoxi-E-cinamil-isodrimeninol 1--O-p-metoxi-E-cinamil-5-hidroxi-isodrimeninol
O
5' 3'
11
1'
6'
4' 2'
O 15 CHO
12
7'
9'
1 9
CHO
HO 8' 2 10 8
3 5 7
4 6
14 13
O
5' 3'
11
1'
6'
4' 2'
O 15 CHO
12
7'
9'
1 9
CHO
HO 8' 2 10 8
3 5 7
4 6
14 13
O O
H+
-
OH OH
HO HO
p-hidroxicinâmico p-hidroxicinamil
O +
O CHO CHO
CHO CHO
HO
1--(p-cumaroiloxi)-poligodial Poligodial
9'
2' 15
12
CHO
DBV-50 cumaroiloxi)- DBV-50 cumaroiloxi
9
1 13
H δ (ppm) mult. J C δ (ppm)
1
HO 8
8' 2
3
4
5
10
6
7 poligodial)* )-
1
14 13
(Hz) H δ (ppm) mult. J poligodial)*
13
Posição (Hz) C δ (ppm)
1 4,88, dd, (J= 9,0; 3,0) 4,89, dd, (J= 10,5, 81,5 / CH 81,9 / CH
4,6)
2 1,86; 1,85, m 1,82; 1,71, m 23,3 / CH2 24,6 / CH2
3 1,57, m 1,58, m 39,9 / CH2 39,6 / CH2
4 33,4 / C 33,2 / C
5 1,43, dd, (J= 12,0, 6,0) 1,44, dd, (J= 11,0, 48,8 / CH 49,2 / CH
6,0)
6 2,49, m 2,48, m 24,9 / CH2 25,2 / CH2
7 7,16, sl 7,09, sl 153,3 / CH 154,0 / CH
8 140,9 / C 140,3 / C
9 3,29, sl 3,34, sl 58,9 / CH 59,8 / CH
10 42,3 / C 42,8 / C
11 9,75, d, (J= 3,0) 9,82, d, (J= 2,8) 200,1 / CH 201,9 / CH
12 9,32, s 9,35, s 193,2 / CH 193,5 / CH
13 1,09, s 1,09, s 32,7 / CH3 32,8 / CH3
14 1,03, s 1,03, s 22,2 / CH3 22,3 / CH3
15 0,98, s 0,98, s 10,9 / CH3 10,9 / CH3
1’ 166,6 / C 167,5 / C
2’ 6,26, d, (J= 16,0) 6,23, d, (J= 16,0) 115,9 / CH 114,6 / CH
3’ 7,62, d, (J= 16,0) 7,69, d, (J= 16,0) 145,6 / CH 148,5 / CH
4’ 127,0 / C 126,3 / C
5’, 9’ 6,85, d, (J= 8,7) 6,87, d, (J= 8,8) 131,0 / CH 130,7 / CH
6’, 8’ 7,42, d, (J= 8,7) 7,39, d, (J= 8,8) 116,6 / CH 116,3 / CH
7’ 160,6 / C 160,2 / C
Solvente CDCl3/ MeOD CDCl3 CDCl3/ CDCl3
75 MHz 200 MHz MeOD 50 MHz
300 MHz
*(MALHEIROS, 2001).
112
O OH O OH
ATP
HO OH HO OPP
Ácido Mevalônico 5-pirofosfato-mevalônico
ATP -CO2
OPP OPP
Pirofosfato de Dimetilalila Pirofosfato de Isopentenila
OPP + OPP
OPP
Pirofosfato de trans, trans-farnesila
-OPP -H+
+
OPP
Pirofosfato de trans, trans-farnesila Germacreno
Germacreno
Rearranjo Drimano
O CHO
CHO
MeO
O CHO
CHO
HO
O CHO
CHO
MeO
OH
Poligodial 0,30 ± 0,08 34,78 ± 1,74 ------- --------
CHO
CHO
H
Espatulenol 0,41 ± 0,06 205,58 ± 36,89 ------- --------
H
HO
H
H H
recentemente, Silva (2009), avaliou a ação citotóxica dos extratos clorofórmicos das
cascas, caules e folhas, além dos sesquiterpenos drimanos drimanial, 1-β-(p-
metoxicinamil)-poligodial, isolados do extrato clorofórmico das cascas, em células
tumorais Hela (Adenocarcinoma Epitelial de Cérvix Humano) e não tumorogênica
L929 (fibroblasto murino). O extrato clorofórmico das cascas e os compostos
isolados mostraram-se citotóxicos para a linhagem tumoral.
Além dos drimanos, neste trabalho, também foram isoladas do extrato
clorofórmico das cascas aromadendranos e lignanas. Estes têm apresentado
potencial citotóxico (ATAWODI; ALAFIATAYO, 2007; HELENO, et al., 2006). Para
estas classes, destacam-se ainda atividades, antifúngica, antibacteriana (LIMA;
BEATRIZ; RAMOS, 1997; MOREIRA, et al., 2003), antitripanocida, antiviral,
antialérgica e antiinflamatória (ATAWODI; ALAFIATAYO, 2007; HELENO, et al.,
2006; SIMÕES, et al., 2004).
A partir do exposto, pode-se sugerir que os drimanos contribuam com os
efeitos citotóxicos apresentados pelo extrato clorofórmico das cascas. Porém pode
haver um sinergismo, pois de maneira geral o extrato foi mais efetivo do que os
compostos isolados. As substâncias isoladas apresentam por vezes apenas um alvo
molecular e são na grande maioria mais eficazes quando estão combinados, como
por exemplo, no extrato bruto. Elas podem atuar em vários alvos simultaneamente, e
dessa forma aumentam o potencial terapêutico. Fármacos monoalvos segundo Keith
e Zimmermann (2004) não são capazes de combater de forma eficiente condições
patológicas como o câncer e doenças infecciosas. Estratégias multialvo podem ser
aplicadas no tratamento do câncer, por ele ser multigênico. O sinergismo com alvos
múltiplos pode potencializar o efeito terapêutico.
As substâncias testadas no presente estudo, isolados de D. brasiliensis, ainda
não foram plenamente investigados para a atividade biológica antitumoral em outras
linhagens de câncer, desta forma necessitando de maiores investigações a respeito
disso. Alguns testes estão sendo realizados para sanar esta lacuna, com outras
linhagens tumorais. Visto que os alvos celulares podem ser diferentes dependendo
das células avaliadas, alguns resultados que podem ser representativos para
algumas linhagens podem não ser tão significativos para outras e o inverso também
é verdadeiro. Dessa forma faz-se necessário a continuidade destes estudos com
diversas linhagens celulares para a verificação da especificidade e do grau de ação.
119
O CHO
CHO
MeO
O CHO
CHO
HO
O CHO
CHO
MeO
OH
Poligodial 41,45 ± 1,79 25,64 ± 1,12
CHO
CHO
H
Espatulenol 81,82 ± 0,63 89,10 ± 0,90
H
HO
H
H H
O CHO
CHO
MeO
O CHO
CHO
HO
6 CONCLUSÕES
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