Universidade Estadual De Campinas

Faculdade De Engenharia De Alimentos - FEA

TP 111 – Transformações Bioquímicas em Alimentos

Produção de isomaltulose a partir de sacarose

utilizando células livres de Erwinia sp. D12

Enylson Ramalho 262873

Nicolas Mazzola 263723
Paula Sampaio 261703

CAMPINAS
2019
1. Introdução

1.1. Isomaltulose na indústria de alimentos

A indústria de alimentos está constantemente procurando novos ingredientes
para melhorar os produtos existentes ou até mesmo para produzir novos produtos
para o mercado. A sacarose é o adoçante mais utilizado na produção de alimentos,
porém, devido ao seu alto valor calórico e suas propriedades cariogênicas novos
adoçantes vêm sendo pesquisados (KAWAGUTI e SATO, 2008).
Nas últimas décadas houve um grande aumento no interesse da produção de
isomaltulose como um promissor substituto da sacarose. A isomaltulose é um
dissacarídeo redutor, isômero da sacarose, obtida através da conversão enzimática
microbiana da sacarose. É conhecida também como Palatinose® ou Lylose®,
presente de forma natural no mel e na cana-de-açúcar em pequenas quantidades
(KAWAGUTI e SATO, 2008).
A isomaltulose possui baixo potencial cariogênico, sendo muito utilizada no
Japão como ingrediente e substituinte da sacarose na produção de diversos
produtos. Possui baixa velocidade de hidrólise e formação de monossacarídeos no
organismo, sendo recomendada para uso na produção de produtos para diabétidos
e esportistas. Anualmente são produzidas 60.000 t de isomaltulose mundialmente
(KAWAGUTI e SATO, 2008).
Muitos produtos derivados da isomaltulose possuem potenciais aplicações
nas indústrias, podem ser obtidos dissacarídeos intermediários, polímeros como
detergentes biodegradáveis e surfactantes de interesse industrial. Há também a
possibilidade de obtenção de oligômeros de isomaltulose que atuam como
prebióticos, que estimulam a proliferação de bifidobactérias da microbiota intestinal
(MORAES et al., 2005).

1.2. Conversão da sacarose em isomaltulose usando microrganismos

Existem muitas linhagens microbianas descritas na literatura que são capazes
de converter sacarose em isomaltulose através da glicosiltransferase. O uso de
microrganismos para produção de diversas substâncias vem sendo muito estudado,
já que possuem grande poder de multiplicação e de adaptação às variadas
situações nutricionais (MORAES et al., 2005).
 O primeiro relato de produção de isomaltulose foi em 1957, quando
Weidenhagen e Lorenz relataram a conversão de sacararose em um novo e
desconhecido dissacarídeo usando a bactéria Protaminobacter rubrum CBS 574.77,
isolada a partir de subprodutos de beterraba. A partir desse estudo vários trabalhos
foram realizados tendo como foco o isolamento e cultivo de microrganismos, a
produção e caracterização da enzima e a conversão da sacarose em isomaltulose
(KAWAGUTI e SATO, 2008).
Atualmente sabe-se que a glicosiltransferase é produzida por diversos
microrganismos como Protaminobacter rubrum, Erwinia carotovora, Erwinia sp.
D12, Erwinia rhapontici, Serratia plymuthica, Klebsiella planticola e Klebsiella sp. É
uma enzima intracelular localizada no espaço periplásmático das células,
apresentam atividade ótima na faixa de pH 5,0 a 6,5 e temperatura de 30 a 40 °C e
são citadas como termossensíveis (KAWAGUTI e SATO, 2008).
A produção de glicosiltransferase a partir de Erwinia sp. D12 se mostrou
possível na fase exponencial de crescimento, sendo que a produção máxima foi
obtida após 3 h de fermentação a 28 °C e após 4 h de incubação a 30 e 35 °C. A
enzima purificada apresentou atividade ótima em pH 6,0 a 40 °C (KAWAGUTI e
SATO, 2008).

2. Objetivo
Produção de isomaltulose a partir de sacarose em diferentes concentrações e
diferentes condições de temperatura de incubação utilizando células livres de
Erwinia sp. D12.

3. Material e métodos

3.1. Produção de massa celular de Erwinia sp. D12

A massa celular da Erwinia sp. D12 foi produzida em biorreator de 2 L Bioflo
IIC (New Brunswick Scientific, Edison, NJ, USA) por meio de fermentação submersa
durante 24 h, a 200 rpm e 30 °C, em meio de cultivo otimizado, composto de melaço
de cana-de-açúcar (150 g/L), água de maceração de milho (20 g/L) e extrato de
levedura (15 g/L) e recuperada por centrifugação a 10.000 x g, 6 °C, por 15 min. A
massa celular de Erwinia sp. D12 foi lavada duas vezes com água destilada estéril
para eliminação de impurezas.

3.2. Conversão enzimática de sacarose em isomaltulose

A produção da isomaltulose foi realizada incubando as células livres de
Erwinia sp. D12 em diferentes concentrações de substrato (15%, 25% e 35%) e
temperaturas de incubação (30 e 35 °C).

Tabela 1. Efeito da temperatura e da concentração de sacarose na conversão de

sacarose em isomaltulose.
Grupo Temperatura de Concentração de
s incubação (°C) sacarose (%)
1 30 15
1 30 25
2 30 35
2 35 15
3 35 25
3 35 35

O grupo 1 preparou 100 mL de solução 15% de sacarose em água destilada.

O grupo 2 preparou 100 mL de solução 35% de sacarose em água destilada.
O grupo 3 preparou 100 mL de solução 25% de sacarose em água destilada.
Para conversão da sacarose em isomaltulose, foi pesado 2 g de massa
celular em 2 tubos de centrífuga de 50 mL, em seguida adicionado 20 mL de solução
de sacarose nos tubos nas concentrações descritas na Tabela 1. Os tubos foram
tampados e agitados em equipamento vórtex para ressuspender a massa celular.
Os tubos foram incubados em banho-maria com agitação sob agitação lenta
durante 30 min. Após o período de incubação, a solução foi centrifugada a 10.000 x
g, 6 °C por 15 min para recuperação da massa celular. A concentração de
isomaltulose produzida foi determinada a partir do sobrenadante.

3.3. Quantificação da isomaltulose por cromatrografia líquida

A quantificação de isomaltulose produzida foi realizada em um cromatógrafo
DIONEX DX-600 (Dionex Corporation, 1228 Titan Way Sunnyvale, CA, EUA)
equipado com bomba isocrática IP25 e detector eletroquímico de ouro ED50. A
separação dos açúcares foi realizada utilizando coluna CarboPacTM PA 1 (4 mm x
250 mm), coluna de guarda CarboPacTM PA 1 (4 mm x 50 mm) e solução de
hidróxido de sódio 220 mM como fase móvel, com fluxo de 1 mL/min., a 20 °C.
Os carboidratos foram analisados pelo tempo de retenção, por comparação
com padrões de isomaltulose e sacarose (Sigma Ultra®, St. Louis, MO, EUA).
A amostras foram diluídas de 1:1000 (v:v), foram filtradas em membrana de
0,2 µm antes de serem injetadas no cromatógrafo Dionex. Para determinar a
quantidade de isomaltulose presente na amostra a área total do pico de isomaltulose
foi anotada e calculada com a seguinte equação: y = 0,6833x + 13,923, onde y
corresponde a área do pico do cromatograma e x a concentração do açúcar
analisado.
Para o cálculo de percentual de isomaltulose convertido a concentração
encontrada foi utilizada e o fator de diluição da amostra foram considerados.

4. Resultados e Discussão
A Erwinia sp. 12 é conhecida pela capacidade de produzir enzimas que atuam
na conversão de sacarose em isomaltulose. Essa reação se dá de modo intracelular,
com a sacarose penetrando a parede celular da bactéria e com isomaltulose sendo
excretada no ambiente após a conversão. A Tabela 2 mostra os resultados de
concentrações de isomaltulose medidas através do uso da área do pico de
cromatografia líquida e a equação padrão fornecida.

Tabela 2. Concentração de isomaltulose obtida através da área do pico no

cromatograma
Concentração inicial T Área do pico no Concentração Conversão
de sacarose (mg/L) (°C) cromatograma isomaltulose (mg/L) (%)
150000 30 112,49 144251 96,17
250000 30 180,21 243359 97,34
350000 30 57,86 64301 18,37
150000 35 118,23 152652 101,77
250000 35 42,20 41383 16,55
350000 35 239,00 329397 94,11

Para as amostras que foram incubadas a 30 °C, é possível verificar que a

concentração de isomaltulose produzida pela massa bacteriana aumenta quando a
concentração de sacarose sobe de 15% para 25%, porém, a 35% há uma acentuada
queda na conversão, apontando uma possível saturação do ambiente que
potencialmente reduz a atividade enzimática/produção de enzimas pela bactéria.
Já nas amostras incubadas a 35 °C, o comportamento dos níveis de
conversão é diferente. Foram encontradas altas taxas de conversão para as
amostras com 15% e 35% de sacarose, porém níveis bastante baixos a 25%. É raro
encontrar em literatura esses pontos de menor conversão para níveis intermediários
de sacarose, lembrando que esse comportamento não foi encontrado nas amostras
incubadas a 30 °C. Pode ser que a amostra de bactérias usada não estava
homogênea, ou o binômio tempo/temperatura de incubação não foi completamente
homogênea, ou mesmo que realmente se encontrou um ponto anômalo de
combinação de sacarose, bactéria e temperatura de incubação que reduz a ação
enzimática e aumenta com o aumento da concentração de sacarose. Devem ser
realizados novos estudos para confirmar essas hipóteses.

5. Referências bibliográficas

MORAES, A. L. L. et al. Produção de isomaltulose a partir da transformação

enzimática da sacarose, utilizando-se Erwinia sp. D12 imobilizada com alginato de
cálcio. Ciência e Tecnol. Alimentos, v. 25, n. 1, Campinas, 2005.

KAWAGUTI, H. Y.; SATO, H. H. Produção de isomaltulose, um substituto da

sacarose, utilizando glicosiltransferase microbiana. Quím. Nova, v. 31, n. 1, São
Paulo, 2008.