Um Biologia Molecular

VÍDEO 01
Promotores: região que antecede o gene e atrai a RNA polimerase
e outras enzimas que fazem o controle da expressão gênica
Biblioteca genômica (ou de CDNA): coleção de fragmentos de DNA
do genoma de um indivíduo)
Enzimas de restrição: restringe a entrada de DNA estrangeiro em
bactérias, impedindo a infecção por vírus
Vetores: transportam o DNA que foi clonado
Sonda: segmentos de DNA conhecidos por nós, que realizam uma
busca de DNAs que não são conhecidos (que sejam complementares
as sondas em um grande pool de DNA)
 A sonda é complementar ao gene que estamos procurando, e
quando ela se liga a este gene, a sonda indica através de
alguma marcação
CDNA: DNA obtido a partir de um RNA mensageiro pela ação da
transcriptase reversa
Análise de Southern: são utilizados os mesmos tipos de sondas,
mas ao invés de se colocar em bactérias contendo os DNAs de
interesse, são colocadas em um gel de eletroforese com o DNA já
corrido (se trabalha com DNA)
 Pegaram todos os fragmentos de alta expressão e realizaram
clonagem em determinado vetor (pBluescript) e realizaram o
sequenciamento de didesoxi, e obtiveram vários genes
relacionados a vários fatores de crescimento da planta (no
caso a cana de açúcar)
Análise de Northern: se trabalha com RNA
 Verificaram novamente clones altamente expressos
Isolaram os genes que acharam mais interessantes
 Box TATAAA a menos de 172 bases do início e Box CAAT a
menos 37 bases do início, dois promotores
Com esses promotores eles fizeram plasmídeos recombinantes,
retirando os promotores dos plasmídeos e inserindo os promotores
que eles encontraram, e testaram a eficiência desses promotores
pela transformação genética através do método de micro
bombardeamento
  Colocaram um gene repórter (gus) nesses plasmídeos que
confere coloração azulada as plantas, indicando que quanto
mais azul escuro maior o nível de expressão (forma de
verificar o nível de expressão de determinado gene)
Funções essenciais do material genético

 Estabilidade física e química: qualquer coisa que sirva

como material genético deve ser estável, mas não
totalmente, deve permitir que haja alguma variação por
mutação para que haja evolução, especiação e adaptação
para novos ambientes
 Grande variedade de formas: habilidade de
estocar/expressar grande quantidade de informação
 Habilidade de transferir a informação para as células-
filhas através da replicação da sua própria estrutura
 Segurança: dentro do DNA há duas cópias complementares,
uma servindo de segurança para a outra, e da forma o DNA
se organiza forma um ambiente interno hidrofóbico que
garante proteção a esse DNA
VÍDEO 02
 Unidade básica do DNA e RNA: nucleotídeo
Ácido fosfórico: fonte de energia do DNA/RNA (três fósforos)
Açúcar: com 5 carbonos e uma ligação éster entre os carbonos 1 e
4
 Carbono 1’ ligação das bases (Adenosina, Guanina,
Timidina, Citidina e Uracila no caso do RNA)
 Carbono 2’ faz a diferenciação entre DNA e RNA
 Carbono 3’ faz a próxima ligação através da hidroxila
 Carbono 4’ faz a ligação éster
 Carbono 5’ onde se liga o ácido fosfórico
 O crescimento da cadeia é sempre de 5’ para 3’ pois as DNA
polimerases só polimerizam nesse sentido
 Essa união gera uma ligação fosfodiéster: C3-O-P-O-C5
Nucleotídeo: açúcar + base + fosfato
Nucleosídeo: açúcar + base (explorados em alguns medicamentos)
Crescimento da fita
 As 5 valências do fosfato estão preenchidas
 Oxigênios de cima tem carga negativa, então todos DNA e
RNA tem carga negativa
  A próxima união se dá pelo carbono 5’ da molécula que
entrou que se liga ao carbono 3’ da molécula que já estava
presente
 A hidroxila do carbono 3’ forma uma ligação éster com o
fosfato alfa do nucleotídeo que está entrando, gera um
pirofosfato inorgânico
Nucleotídeo didesóxi: sem a hidroxila não há crescimento de
cadeia, como esse tipo de nucleotídeo não apresenta a hidroxila,
são chamados de terminadores de cadeia pois nada se liga a ele
Dogma central: até 1970 se dizia que o fluxo de informação era
apenas DNA -> RNA -> proteína

 Transcriptase reversa: consegue reverter o fluxo de RNA

para DNA, e o DNA recebe o cDNA (DNA complementar)
Íntrons: regiões intermediárias
Éxons: regiões que são expressas

 Embaralhamento de Éxons: a partir desse gene (figura da

apostila) se for realizado o embaralhamento de Éxons irão
se obter 9 proteínas diferentes a partir de um único gene
 Recomposição de Éxons: é possível pegar o Éxon A de um
gene e o Éxon B de outro gene, formando um novo gene
 Esses dois mecanismos caracterizam a permanência desse
sistema Íntron/Éxon ao longo da evolução
VÍDEO 03
Cromossomo: molécula longa, complexada, altamente compactada
DNA helicase: quebra as pontes de hidrogênio realizando a
abertura das fitas
DNA girasse: retira a torção que essa quebra causou
Polimerase I retira os fragmentos de RNA e ligase ligando para
que a fita seja contínua e sem RNA
DNA helicase rompe as pontes de hidrogênio e SSBP mantém as
fitas abertas
9 mandamentos da replicação
1. Origem: onde começar (geralmente procariontes tem uma
única origem e em eucariontes podem ter dezenas/centenas
de origens, que geralmente são ricas em A e T pois há
apenas duas pontes de hidrogênio, em comparação a 3
ligando C e G)
2. Abertura: por meio da helicase que rompe as pontes de
hidrogênio
3. Colocação de iniciadores: por meio de RNA primase, pois as
DNAs polimerases não conseguem iniciar a síntese sem que
já haja um pedaço feito (coloca um pedaço de fragmento de
Okazaki
4. Remoção da torção: por meio da DNA girase (remove a torção
da helicase) quebra e reúne as fitas em 20.000 rotações
por minuto
5. Síntese: realizada pela DNA polimerase III
6. Correção de erros: por meio da exonuclease que remove
nucleotídeos adicionados erroneamente
7. Remoção dos iniciadores e síntese de DNA: (a polimerase I
que atua neste momento)
8. Fragmentos de Okazaki: como os fragmentos de Okazaki foram
feitos em partes, em determinado momentos é preciso reuni-
los, por meio da DNA ligase
9. Concatâmeros (pro) ou telômeros (euc): quando um DNA
circular é replicado, ficam dois elos de cadeia um dentro
do outro, e é preciso liberar um do outro. A telomerase
 atua nos telômeros que são as extremidades finais de cada
cromossomo, para que estas extremidades sejam mantidas, se
não haveria encurtamento dos cromossomos a cada replicação

 Esse processo ocorre simultaneamente, as duas enzimas

andam juntas, indo apenas para uma direção
 A fita de baixo teria que ser feita de forma invertida
 Ocorre uma inversão momentânea dessa fita

 Por conta da inversão ela está no sentido 3’ 5’

 Essa inversão permite que duas unidades de polimerase III
atuem simultaneamente
VÍDEO 4
Transcrição: primeiro passo no processo de transcrição gênica
Produz três moléculas...
 Uma molécula informacional: RNA mensageiro
 Duas moléculas funcionais (que atuam no processo de
tradução): RNAs transportadores e RNAs ribossômicos
Na transcrição, apenas um segmento curto do DNA é copiado, que é
o gene que está sendo transcrito
Obs: promotor nunca é transcrito
Na transcrição chamamos de “bolha” de transcrição, o que na
replicação chamamos de “forquilha”
 Síntese: complementar a uma das fitas onde o gene se
localiza
 Bolha de transcrição: vai “andando” a medida que o DNA é
aberto a frente e fechado novamente depois
 DNA rotacionado: pela ação de topoisomerases (na
replicação é DNA girase)
 Parte da RNA polimerase está em contato íntimo com o DNA
ainda fechado, mais ou menos 100 pares de bases
 A fita que serviu de molde (no caso a vermelha) volta a
se reunir com a fita azul (diferente da replicação, em
que as fitas nunca mais se reúnem)
O RNA mensageiro produzido difere:

 Procariontes: ele sai praticamente pronto, e irá ser

traduzido em proteína
 Eucariontes: sofre intensos processamentos, como
modificações químicas e remoção de Íntrons
Mecanismos de splicing

 Íntrons auto processantes: o próprio Íntron se remove

através de união entre as extremidades dos Éxons (indica
que alguns RNAs têm funções enzimáticas, o que levou
cientistas a proporem que o RNA surgiu anteriormente ao
DNA, pois além de conter informação ele tem capacidade de
se auto processar
 Spliceossomos: Íntrons removidos através de enzimas
Código genético: determina qual a sequência de aminoácidos a
partir da sequência de nucleotídeos do Mrna
Tradução em procariontes

 O códon de iniciação é AUG

 O ribossomo maior vai se montar em cima do menor, e começa
a “andar” em cima da mensagem, os tRNAs vão trazendo os
aminoácidos na ordem do comando dado pelos códons
 No fim do processo, quando há um códon de finalização,
entre uma proteína semelhante a DNA girase que libera esse
processo (enfatizando que tanto o mRNA, quanto os
ribossomos e tRNAs podem ser utilizados novamente para ler
esta ou qualquer mensagem, apenas os aminoácidos não são
reutilizados – só quando a proteína for degradada)
VÍDEO 05

 O controle da expressão gênica determina quem comanda

esse processo e como ele é feito
 Quanto maior o número de genes, faz mais sentido fazer
com que sejam genes “preguiçosos”, assim, é mais fácil
empurrar os genes que serão necessários em determinado
momento
  A partir do promotor, a RNA polimerase estará
transcrevendo determinado gene
 Complexidade de outros fatores estão atuando
 Operador: região onde se ligam algumas proteínas e
reprimem
 Ativador: onde se ligam alguns elementos de ativação
Podem ser proteínas, hormônios, açúcares...
Por ex: na lactose, a própria lactose é um ativador/acentuador
do gene de utilização da lactose, quando colocamos glicose no
meio, ela funciona como um silenciador do gene da lactose
(reprime a expressão)
VÍDEO 06
Mutações
 Possível mudança na composição dos aminoácidos: diz
respeito a como o código genético é arranjado
 Alguns aminoácidos são codificados por 4-6 códons, é
possível que haja uma mudança em alguma base desse códon,
que continue trazendo esse mesmo aminoácido
Mutação:

 Bem localizada (pequeno segmento)

 Geralmente indesejada
 De pequena extensão (mudança de uma única base de um único
códon)
Recombinação:

 Extensão muito maior

 Envolve a troca desejada entre material genético de
gametas (aumento na variação genética)
Quando ocorrem as mutações:

 Se durante a replicação, as enzimas não notarem

determinado erro, ele permanece e no momento em que a
replicação termina ele passa para as células seguintes
como uma mutação...
Nem toda mutação tem fenótipo

 Silenciosa: existem, mas não alteram o fenótipo – só é

visível em um sequenciamento
 Sentido trocado: mudança em um aminoácido que foi
incorporado em uma determina posição, mas é possível que
ele não seja importante na proteína ou tenha função
semelhante ao incorporado antes da mutação
 Sem sentido: insere um códon de finalização prematuramente
Mutágenos

 Brometo de etídio se insere no DNA e causa uma

perplexidade para as DNAs polimerases na hora da
replicação (quando encontram não sabem o que é) podem
pular um trecho de DNA, inserir um nucleotídeo errado...
 Luz U.V faz com que quando haja duas timinas lado a lado
se juntem formando um dímero, uma mutação que é passada a
diante
Como reparar:

 Retirada de bases erradas

 Durante o processo de replicação, a fita mãe contém uma
metilação o que faz com que ela seja reconhecida como a
fita correta, quando a fita filha é incorreta, a
polimerase utiliza a fita mãe como seu controle para
corrigir a fita filha (fita de reserva)
 Excisão de segmentos maiores 9sistema de reparo SOS) um
segmento grande de DNA é removido, e substituídos pelos
nucleotídeos corretos
VÍDEO 07
  DNA genômico (genoma total do indivíduo)
 cDNA (RNA mensageiro convertido em DNA pela ação da
Transcriptase reversa)
Método Doyle e Doyle

 Amostra
 Maceração desse material
 Centrifugação
 Adição de CIA
 Adição de etanol
 RNAse (forma de purificação da extração para que fique
somente o DNA)
  Kit de purificação

 O DNA após extraído, pode ser purificado através de

esferas magnéticas, e dois tipos de tampão
 Um tampão atrai o DNA para as esferas, e os contaminantes
ficam no meio de cultura
 Posteriormente, o DNA que estava aderido as esferas é
liberado ao meio através da troca de tampão e modificação
das condições

 FTA (protocolo de pré-estração)

  Aplicamos a amostra nesse “papel filtro” que permite que
as amostras sejam mantidas por um longo tempo, de uma
forma estável
 Depois é possível cortar um pedaço desse papel e realizar
qualquer outro protocolo, obtendo um DNA com certo grau de
pureza
 Você consegue realizar uma PCR diretamente com o pedaço de
papel cortado do cartão
Eletroforese
 Migração dos ácidos nucleicos por corrente elétrica
 Normalmente a eletroforese separa também por carga, mas
no caso do DNA e RNA, essa separação por carga não é
fundamental, pois todas as moléculas têm a mesma carga
(carga negativa)
Preparação da eletroforese

 Primeiro o tampão é fervido, e ele é vertido na cuba de

eletroforese
 É inserido um pente que permite fazer os ... onde o DNA
será disposto
 Uma vez solidificado o gel, o pente é removido e em
seguida se adiciona o tampão de corrida que faz com que o
DNA corra no gel
 O DNA é alíquotado e misturado ao tampão de carregamento
que tem um corante
 Essa mistura é semeada (disposta) nos ...
 A fonte é ligada, e o DNA faz a migração para o polo
positivo
 A marca azul indica que houve migração (corante do tampão
de carregamento)
 Uma vez feita a migração, é possível visualizar o DNA
através de diferentes corantes como o brometo de etídio
que é um agente intercalante, e quando submetido a uma
luz apropriada vemos as bandas que representam onde oo
DNA está (não vemos o DNA, mas sim o corante que se ligou
a ele)
 Quanto mais forte a banda, mais DNA
 Quanto mais longe ela migrou, menor é o DNA
  Na imagem acima na esquerda, há um corante de corrida com
três colorações diferentes, cada uma migrando com um
determinado tamanho, e podemos estimar como está indo a
corrida de eletroforese
 Marcadores de peso molecular (Ladders) onde cada um desses
marcadores nos dá exatamente o tamanho de cada banda
VÍDEO 08

 A partir desse corte, já há a possibilidade de refazer as

pontes de hidrogênios, pois há duas extremidades livres
AATT e TTAA (os dois AA de cima se agrupa com o TT de
baixo e vice e versa)
Diferença no resultado do corte:

 As duas extremidades CCC e GGG, e GGG e CCC não tem

afinidade uma com a outra
 É preciso que a DNA ligase esteja presente para que
ocorra a ligação

 O amarelo é o DNA que recém foi extraído, cortado com uma

ER, e o DNA de verde é de outra origem
 Na presença da DNA ligase, ocorre a ligação dessas duas
moléculas, e temos um DNA recombinante
Quão frequentemente queremos cortar o DNA e qual o tamanho dos
pedaços:
  As ER normalmente reconhecem sítios de normalmente 4/6/8
pares de bases
 Se temos uma enzima que reconhece um sítio com 4 pares de
base, qual a frequência com que esse sitio ocorre em um
DNA aleatório qualquer?
 Se fosse 1 base, ela ocorre em média de 1 em cada 4
 Se fossem duas 2, ¼ a cada 16 (¼ 2)
 Se fossem 3, (¼3)
 Se fossem em 4 (¼4)
 Se queremos fragmentos maiores, escolhemos enzimas que
reconhecem sítios de corte maiores
Vetores:
 Transportar: servem apenas para a clonagem, transportam a
multiplicam o DNA
 Expressão: expressam um gene que foi clonado neles (tem
um sítio de clonagem logo após um promotor)
 Transformação: inserem o DNA em um cromossomo

 Como há um promotor (P) e uma região regulatória, e

logo depois o sítio de corte para várias enzimas, se o
DNA for clonado logo após o promotor ele pode ser
expresso
 Vários sítios de corte ao longo do vetor para outras
enzimas
 Quando queremos manipular esse vetor, é preciso
escolher as enzimas adequadas
 Se queremos inserir algo depois do promotor, escolhemos
as enzimas logo depois do promotor
  Se queremos retirar o gene de ampicilina, escolhemos uma
enzima que esteja à direita do gene em vermelho, e uma
que esteja à esquerda

 Os genes seletivos codificam para resistência geralmente

ao antibiótico ou algum composto toxico
 Se o plasmídeo induziu resistência a determinado
antibiótico, o indivíduo sobrevive

 Não trabalham por vida ou morte, mas sim dão coloração

VÍDEO 09
Confecção de uma biblioteca genômica
  O DNA total de várias células é extraído
 O DNA é cortado com uma ER
 Cada pedaço é clonado com um vetor de clonagem
 Quando reunimos todos esses vetores de clonagem que foram
recolocados em bactérias e que cada bactéria passou a
reproduzir esse determinado vetor = este conjunto é
denominado biblioteca
Obs: o DNA teve que ser clivado, pois o DNA genômico é muito
grande para ser manipulado em laboratório, por isso precisamos
obter pedaços pequenos que possam ser clonados nos vetores
 A biblioteca de cDNA é menor que a genômica, pois vai
conter apenas uma pequena porcentagem do genoma (dos
genes que estavam sendo expressos quando ela foi feita)
genes não expressos não aparecem nessa biblioteca
 Duas bibliotecas de cDNA do mesmo organismo feitas em
momentos diferentes irão apresentar diferenças entre si
Confecção de uma biblioteca de cDNA

 Se copia o RNA mensageiro na presença da Transcriptase

Reversa (que reverte o fluxo da informação)
 A segunda fita de cDNA é feita, na presença de uma DNA
polimerase convencional (há enzimas manipuladas em
laboratório que realizam essas duas funções ou kits)
Sobreposição de clones
 Quando colocamos esses clones todos juntos (AAA, CCC...),
não temos condições de saber qual o genoma do organismo
 É impossível fazer um projeto genoma com uma digestão
total
 Então, se faz uma digestão que ele não corte sempre que
ocorrem os fragmentos, ou usamos outras enzimas

 Com essa conformação, é possível fazer a sobreposição de

clones
 Então vamos montando o genoma através da sobreposição de
bases, e conseguimos remontar o genoma completo na ordem
correta (digestão parcial ou com enzimas que reconhecem
sítios diferentes)
VÍDEO 10
 Alvo: desconhecido, o que queremos saber se existe
 Sonda: o que conhecemos
Por ex: temos uma mistura de vários seguimentos de DNA, e
queremos saber se nessa mistura há determinado gene, se já
tivermos informações desse gene, vamos escolher uma pequena
região desse gene de geralmente 15-20 bases (sonda) que é jogada
no alvo que é a mistura dos seguimentos de DNA, e queremos saber
se o segmento que é compatível com a nossa sonda está presente

 Normalmente o DNA alvo é extraído, clivado com enzimas de

restrição e corrido em uma eletroforese
 Fazemos a transferência doo DNA de um gel para uma
membrana, que tem muito mais durabilidade e versatilidade
que o próprio gel
Southern blot

 Inicia com o DN de dois indivíduos, é realiza uma clivagem

com ER, corremos o gel de eletroforese
 O primeiro passo da transferência é a parte central da
figura onde há uma cuba, plataforma mais elevada, uma
ponte de papel
 Vamos colocar o gel em cima dessa ponte, a membrana em
cima do gel e vai ter um tampão líquido e vamos colocar
uma pilha de papel (toalha ou filtro) e um peso
 Com o tempo, o papel atrai o tampão que atravessa o gel e
leva o DNA pela membrana (que tem afinidade por DNA) o DNA
fica retido na membrana na mesma posição que ele se
encontrava
 Na parte de baixo há a membrana que foi retirada
 Em seguida a sonda é jogada, e ela indica nos dois
indivíduos se aquilo que estamos procurando está presente,
e se estiver em qual posição
Como desenhar uma sonda

 As sondas devem ter de 15-20 bases

 Se temos o genoma do organismo, devemos selecionar uma
região, e a partir dessa seleção determinamos que ela
servirá de sonda (região única para aquele determinado
gene)
 Sintetização de uma sonda in vitro
 Se não há o ácido nucleico é possível desenhar uma sonda a
partir da proteína
 Observamos a proteína, colocamos em baixo dos aminoácidos
quais os possíveis códons para aquele aminoácido, e
desenhamos uma sonda a partir desses códons
 Mais complicado + mais de uma sonda
 Uma vez escolhida a região também mandamos sintetizar in
vitro

 Se evitam regiões com 4 ou 6 códons

 Escolhemos uma região de menor redundância e mandamos
desenhar a sonda
 Nesse caso é preciso desenhar mais do que uma sonda para
cada região escolhida (se olha quais os códons
redundantes e faz uma multiplicação, ex: GAA e GAU x GAG
e GAC)
VÍDEO 11

 Baseadas no mesmo princípio de Southern, Northen e Western

blot
 Diferença no nível tecnológico
 Southern... são técnicas facilmente construídas no
laboratório
 As técnicas FISH e biochip se baseiam em plataforma de
mais alta tecnologia e construídas em empresa

 Ao invés do DNA ser extraído, fazer aplicação em um gel e

depois a transferência (como no SB), aqui estamos lidando
com cromossomos inteiros
 O objetivo da técnica é vermos a posição da sonda no
cromossomo (em qual cromossomo e posição a sonda se liga)

 Auxiliar no prognóstico de câncer de mama pois consegue

identificar a amplificação de um determinado gene em
tecidos humanos que é associada ao surgimento de câncer
de mama

 Mesma espécie em duas fases de desenvolvimento

 Quais genes são expressos nas fases juvenis e nas fases
adultas?
 Extração do RNA mensageiro dos dois indivíduos, marcar
com cores diferentes, verter no biochip e verificar a
expressão
  Quando observamos que as sondas vermelhas se ligaram ao
chip, sabemos que esses genes foram expressos na fase
juvenil, os verdes na fase adulta, e os pintados de
amarelo são os genes expressos nas duas fases
 Poderia ser uma célula sadia e uma célula doente...
 Sondas marcadas com dois clorófilos diferentes
 A ligação da sonda ao seu alvo mostra quais genes estavam
sendo expressos em determinada fase
VÍDEO 12

 O molde enviado para a empresa que irá fazer a síntese é a

sequência da sonda ou iniciador digitalizada
 Não usa enzimas, mas sim nucleotídeos modificados
 O sentido é geralmente 3’-5’
 O primeiro passo é fixar a primeira base na superfície
sólida
 Podem ser milhares de pontes de fixação, que a primeira
base, no caso a Adenosina é fixada

 Depósito com milhares de Timidinas que são jogadas,

algumas se ligam e outras ficam excedentes
 O excesso de Timidinas é eliminado, e posteriormente
repetimos o processo para todas as bases subsequentes

 Ao final limpamos tudo que é alheio ao DNA, cortamos da

superfície sólida e enviar ao cliente
  Modificação impede que outro nucleotídeo se ligue
Processo

 Inicia com a introdução de uma base protegida DMT

 Remoção da proteção
 A próxima base vem e realiza com uma ligação
 O ciclo se repete até que no final se remove da base
sólida...